TEMA 4: ESTRUCTURA TERCIARIA:

1.-DEFINICIÓN DE ESTRUCTURA TERCIARIA, DOMINIOS:

→ La estructura terciaria de una proteína hace referencia a su disposició n o plegamiento espacial. El término "estructura
terciaria" se refiere a la conformació n tridimensional completa de un polipéptido. Indica, en el espacio tridimensional,
có mo las características estructurales secundarias (hélices, lá minas, dobleces, giros y bucles) se ensamblan para formar
dominios y có mo estos dominios se relacionan espacialmente entre sí.

A primera vista, puede parecer que existe un nú mero casi infinito de maneras en las que pueden doblarse las proteínas
globulares. Sin embargo, cuando se analiza un gran nú mero de las estructuras conocidas, se encuentran determinados
motivos y principios comunes. Las proteínas en su mayoría está n formadas por má s de un dominio. Un dominio es una
regió n compacta, plegada localmente, de la estructura terciaria. Los dominios está n conectados entre sí mediante la cadena
polipeptídica que transcurre a lo largo de toda la molécula.

→ Algunos de los motivos estructurales o estructuras supersecundarias se combinan muy a menudo para formar
estructuras globulares compactas que se denominan dominios. Un dominio es una secció n de la estructura de la proteína
suficiente para realizar una tarea física o química particular, como la unió n de un sustrato u otro ligando.

Este concepto es introducido por Wetlaufer en 1973, a partir de estudios cristalográ ficos de proteínas (lisozima, papaína) y
de proteó lisis limitada (inmunoglobulinas). Wetlaufer definió dominio como: “unidades estructurales estables que pueden
plegarse de forma autó noma en una proteína”. Son subregiones autó nomas, en el sentido de que poseen todas las
características de una proteína globular.

La mayoría de los dominios son de naturaleza modular, es decir, contiguos tanto en la secuencia primaria como en el
espacio tridimensional. Las proteínas simples, en particular las que interactú an con un solo sustrato u otro ligando, como la
lisozima, la triosa fosfato isomerasa o la proteína de almacenamiento de oxígeno mioglobina, a menudo constan de un solo
dominio. Por el contrario, la lactato deshidrogenasa se compone de dos dominios: un dominio N-terminal de unió n a NAD+
y un dominio C-terminal de unió n a piruvato. Sin embargo, no todos los dominios se unen a sustratos: los dominios
hidrofó bicos anclan las proteínas a las membranas o les permiten atravesar las membranas.

Es importante destacar que los dominios con secuencias de AAs homó logas en diferentes proteínas presentan casi
invariablemente la misma estructura terciaria y la misma funció n.

Los dominios suelen clasificarse en dominios estructurales y dominios funcionales:

• Dominios estructurales: Son entidades geométricas diferenciadas dentro del mapa de densidades
electró nicas de una proteína globular y que por sí mismo, o en asociació n con otros, origina un dominio
funcional. Son segmentos de la cadena polipeptídica que se pliegan independientemente de otros segmentos,
es decir, son la unidad bá sica del plegamiento de la cadena polipeptídica. Por regla general, un dominio
estructural está formado por unos 150 AAs, que corresponde a un gló bulo de unos 25 Å de diá metro con una
masa molecular de 15 a 20 kDa. Por encima de estos valores pueden considerarse dominios funcionales,
formados por má s de un dominio estructural, y cuyo centro activo está localizado en la superficie entre los
dominios estructurales.

• Un dominio funcional es una regió n de la cadena polipeptídica autó noma desde el punto de vista funcional.
Si independientemente de donde se encuentre el dominio estructura realiza la misma funció n, es un dominio
funcional. Normalmente los dominios que realizan la misma funcion tienen alta homologia en la secuencia.

El hecho de que una proteína globular esté formada por distintos dominios estructurales, y de que dichos dominios
aparezcan en proteínas de distinta naturaleza, parece estar indicando que las proteínas se construyen sobre las bases de un
sistema que utiliza los dominios como mó dulos o unidades bá sicas. En el ADN, la subregió n del gen que codifica un
dominio estructural de la cadena polipeptídica corresponde a un exó n limitado de forma precisa por intrones.
El aná lisis de mapas de densidad electró nica de proteínas que contienen dominios estructurales bien diferenciados ha
permitido observar que las regiones de la cadena polipeptídica que se encuentran distantes entre sí en la estructura
primaria también se hallan distantes desde el punto de vista geométrico, es decir, pertenecen a dominios estructurales
distintos. Entonces, parece haber una tendencia de agregació n preferente entre regiones vecinas pró ximas en la secuencia a
la hora de construir un dominio estructural. Tendencia que también se observa en el proceso de formació n de estructuras
supersecundarias, y que probablemente se deba a que la barrera entró pica es menor cuanto má s pró ximas se encuentran
las regiones que se van a asociar.

2.- PROCESO DE PLEGAMIENTO:

En las proteínas globulares la cadena polipeptídica se enrolla o pliega sobre sí misma, formando una estructura má s o
menos compacta -que recuerda un ovillo-, en la que pueden coexistir secuencias al azar, regiones en a-hélice, estructuras en
hoja-b plegadas, acodamientos-b, etc.

El plegamiento proteico es un proceso en el que una molécula desorganizada naciente adquiere una estructura muy
organizada. Una molécula desorganizada (recién salida del ribosoma) se convierte en organizada, pero solo se obtiene una
molécula ú nica con un plegamiento ú nico, la conformació n de menor energía. Esta estructura que va a tener la cadena
polipeptídica al final viene determinada por la secuencia del aminoá cido.

2.1.-DESNATURALIZACIÓN DE PROTEÍNAS:

¿Qué es lo que en ú ltimo término determina la compleja mezcla de plegado secundario y terciario que caracteriza a cada
proteína globular? Muchos indicios señ alan que la mayoría de la informació n que determina la estructura tridimensional
de una proteína la lleva la secuencia de aminoá cidos de esa proteína. Esto puede demostrarse mediante experimentos en
los que la estructura tridimensional nativa, o natural, se rompe al cambiar las condiciones ambientales. Si elevamos lo
suficiente la temperatura, o hacemos que el pH sea fuertemente á cido o alcalino, o bien añ adimos al disolvente algunos
tipos de moléculas orgá nicas, como alcoholes o urea, se despliega la estructura de la proteína. Como con lo á cidos
nucleicos, este proceso se llama desnaturalizació n, porque se ha perdido la estructura natural de la proteína, junto con la
mayoría de sus propiedades específicas. La cadena desplegada es un ovillo aleatorio, con libertad de rotació n alrededor de
los enlaces, y ya no tiene una conformació n compacta ú nica, sino que fluctú a continuamente entre un gran nú mero de
conformaciones extendidas.

La desnaturalizació n genera la destrucció n de la estructura o conformació n espacial y funcional, e implica la formació n de

otras estructuras menos estables. Supone la ruptura de las interaciones débiles que estabilizan la proteína, y la pérdida de
todas las estructuras de orden superior (estructuras secundaria, terciaria y cuaternarias). Así, la proteína queda reducida a
un polímero estadístico.

Dependiendo del grado o intensidad de la desnaturalizació n ésta puede ser:

- total  pierde completamente su actividad bioló gica

- parcial  no pierde completamente su actividad bioló gica.

La desnaturalizació n puede ser también:

- irreversible: No se puede revertir el efecto desnaturalizante y volver a plegar a las proteínas en ó rdenes superiores.
- reversible: Se puede volver al estado plegado. El experimento de Anfinsen demuestra que se puede revertir este efecto.

Consecuencias:

- Disminució n drá stica de la solubilidad de la proteína, acompañ ada frecuentemente de precipitació n (ya que los
residuos hidrofó bicos del interior aparecen en la superficie)

- Pérdida de todas sus funciones bioló gicas

- Alteració n de sus propiedades hidrodiná micas (aumenta la viscosidad y disminuye el coeficiente de difusió n)
-AGENTES DESNATURALIZANTES:

• Físicos

• Calor
• Radiaciones

• Químicos: todos los agentes que rompen interacciones o enlaces débiles presentes en la estructura nativa de
la proteína:
• Detergentes
• Urea y guanidina a altas concentraciones
• Altas concentraciones de sal y extremos de pH
• Reactivos de grupos -SH
Dodecilsulfato só dico (SDS, laurilsulfato), 2-mercaptoetanol, Urea, Guanidina, Ditiotreitol (DTT).

¿Có mo podemos estudiar un proceso de desnaturalizació n proteica? Normalmente suele hacerse siguiendo la evolució n de
alguna propiedad intrínseca de la proteína, p.ej., la viscosidad. Midiendo la viscosidad frente a la temperatura podemos ver
la evolució n que sigue la viscosidad y có mo cambia con la temperatura. Se forman corpú sculos porque los residuos
hidrofó bicos se unen entre si y las proteínas precipitan. Vemos la importancia del efecto cooperativo→ Efecto cooperativo:
Todo se rompe de golpe porque se rompe un primer enlace, y lo mismo sucede en la formació n.

+EXPERIMENTO DE ANFINSEN: 1950

Esta proteína está formada por 120 aminoá cidos y a lo largo de su secuencia hay 8 cisteínas (Cys), las cuales que pueden
formar 4 enlaces disulfuro. Durante el experimento, Anfinsen sometió a la ribonucleasa a una disolució n de urea 8 M y
beta-mercaptoetanol, que hizo que la proteína se desplegase por completo perdiendo su actividad

Tomó la ribonucleasa pancreá tica de buey para degradar ARN para disminuir la viscosidad de la solució n acuosa de ARN. Al
degradar el ARN, diminuye la viscosidad. Desnaturalizó la enzima (cadena con 4 puentes disulfuro, como se observa en la
imagen) con beta-mercaptoetanol y urea 8M, generá ndose como resultado la proteína totalmente desplegada y debido a la
rotura de los enlaces disulfuro. Es decir, la proteína perdió toda funció n bioló gica. La viscosidad de la disolució n de ARN no
había disminuido.

Eliminó cuidadosamente por diá lisis los agentes desnaturalizantes y se restablecieron los puentes disulfuro entre los
mismo aminoá cidos iniciales y las demá s interacciones. La disolució n acuosa volvió a disminuir su viscosidad. Así,
descubrió que la desnaturalizació n de ciertas proteínas es reversible, o lo que es lo mismo, las proteínas se pueden
renaturalizar

Gracias a esta observació n pudo concluir que:

1. El plegamiento es espontá neo y es termodiná micamente favorable.
2. La informació n sobre el plegamiento reside só lo en la cadena lineal, o lo que es lo mismo, la configuració n estructural de
una proteína es una informació n que se encuentra codificada en la estructura primaria de una proteína.
El experimento de Anfinsen posteriormente se ha realizado de muchas otras maneras, p. ej., desnaturalizació n térmica.
Obteniéndose siempre los mismos resultados. Sin embargo, el experimento de anfinsen solo funcionan para proteínas
extracelulares con estructura terciaria, no para proteínas intracelulares, sin importar el numero de dominios.

Pero no todas las proteínas que se tratan de forma similar se renaturalizan, permaneciendo en forma desnaturalizada o
produciendo formas inactivas muy diferentes de la molécula nativa. Por lo que podríamos concluir que, al menos, en parte,
“la secuencia aminoacídica debe determinar, de alguna manera, que hasta ahora no comprendemos, el modo de
plegamiento espacial de las proteínas´´.

Por otro lado, esto podría estar indicá ndonos que ademá s de la secuencia primaria deben haber otros mecanismos
implicados.

Como hemos dicho, cada cadena polipeptídica (proteína) tiene una estructura terciaria ú nica, la estructura nativa, que
viene definida por un reordenamiento ú nico/específico de todos los á tomos de la molécula. Por supuesto que puede haber
muchos otros reordenamientos posibles, pero éstos no presentan actividad bioló gica, y colectivamente se denominan
estructuras desnaturalizadas.

2.2.-¿Qué factores son los que favorecen la formación de la estructura nativa frente a las estructuras
desnaturalizadas, bajo condiciones fisiológicas normales?

Proceso de plegamiento proteico en solució n acuosa:

Una proteína recién sintetizada posee, de manera definitiva, solamente su estructura primaria nativa. Para que sea
plenamente funcional ha de sufrir una serie de transformaciones, entre ellas plegarse correctamente en una forma
tridimensional ú nica.

En condiciones fisioló gicas este fenó meno ocurre:

1. Espontá neamente (Autoensamblamiento): La proteína se pliega sin ninguna otra ayuda

2. Ensamblamiento dirigido: La proteína se pliega gracias a la acció n de otras proteínas, como las chaperonas o
chaperoninas.

-AUTOENSAMBLAMIENTO:

El plegamiento significa, que partiendo de un polímero con una estructura al azar en agua (desnaturalizado) donde todos
los grupos polares (incluidos los grupos amida N-H y carbonilo C=O del esqueleto proteico) está n formando puentes de H
con las moléculas de H2O.
- Los grupos cargados está n solvatados con H2O
- Las cadenas hidrofobas está n rodeadas de moléculas de H2O
Y donde, ademá s, hay muchísimas conformaciones posibles para la cadena polipeptídica, tanto debido a las
conformaciones del esqueleto (ϕ y Ψ) como a las conformaciones de los grupos R.
Se llega a la formació n de una estructura mucho má s compacta (estructura nativa-activa) en la que:
- Algunos grupos en la superficie de la proteína permanecen expuestos al H2O
- Un gran nú mero de grupos, tanto polares como apolares, son “ocultados” en el interior de la proteína, estando en
contacto unos con otros pero no con el agua.
En el estado nativo-activo só lo existen muy pocas conformaciones (en realidad só lo una) para el esqueleto proteico y los
grupos R, todas ellas estructuralmente relacionadas.
2.3.-TERMODINÁMICA DEL PLEGADO:

→¿Qué fuerzas “dirigen” el plegamiento de una cadena polipeptídica para que ésta adquiera su estructura tridimensional
“nativa-activa” y no otra, en una solució n acuosa?

Energía libre de los reactivos > Energía libre del

producto

El plegado de proteínas es un proceso termodiná micamente

favorable, o lo que es lo mismo, la energía libre de Gibbs del
proceso es negativa (𝛥Gº<0). Esto se consigue mediante el
equilibrio de los siguientes factores:

• Factores entá lpicos

• Factores entró picos

2.3.1.-FACTORES ENTÁLPICOS: (𝛥H)

En termodiná mica, la entalpía es la medida de energía en un sistema termodiná mico. Es la cantidad termodiná mica
equivalente al contenido de calor total de un sistema. La entalpía se define como la suma de la energía interna E má s el
producto de la presió n p y el volumen V.

El factor entá lpico está relacionado con la formació n o rotura de

enlaces covalentes y no covalentes:

• Si la entalpía es menor de cero, es decir, negativa, ya que la

energía de los reactivos es mayor a la de los productos. El
proceso es favorable y, en nuestro caso, la formació n del
enlace.
• Si la entalpía es positiva, el proceso no es favorable y no se
forma el enlace.

Las interacciones favorables entre los grupos, en las proteínas, en su

estado nativo implican, fundamentalmente interacciones de dos tipos:
covalentes y no covalentes. Las fuerzas que mantienen la estructura
terciaria, segú n el tipo de enlace, son las siguientes:

-Covalente:

• Enlace o puente disulfuro: En proteínas exocelulares.

Relacionados con la protecció n de la estructura proteica
frente a cambios adversos de pH o concentració n salina. De
hecho, las proteínas intracelulares casi no tienen enlaces
disulfuro porque en el citoplasma hay una elevada
concentració n de agentes reductores.
• Enlace amida: amida entre cadenas laterales con grupos
carboxilo y grupos amida.

-No covalente:

• Efecto hidrofóbico: Recordar que las sustancias hidró fobas en contacto con el agua hacen que las moléculas de
agua formen estructuras parecidas a jaulas alrededor de ellas. Esta ordenació n corresponde a una pérdida de
aleatoriedad en el sistema; disminuye la entropía.
 Supongamos que una proteína contiene, en su secuencia de aminoá cidos, un nú mero sustancial de residuos con
cadenas laterales hidró fobas (por ejemplo, leucina, isoleucina y fenilalanina). Cuando la cadena polipeptídica se
encuentra desplegada, estos residuos están en contacto con el agua y producen la ordenació n de la estructura
del agua circundante. Pero cuando se pliega la cadena formando una estructura globular, los residuos hidró fobos
quedan enterrados dentro de la molécula. Las moléculas de agua que se ordenaron por la proteína cuando ésta
estaba en estado desnaturalizado se liberan en este momento, consiguiendo libertad de movimiento. En
consecuencia, a, la internalizació n de los grupos hidró fobos a través del plegado aumenta la aleatoriedad de todo
el sistema y, por consiguiente, produce un aumento de entropía al doblarse. Este aumento de entropía produce
una contribució n negativa a la energía libre del plegado y aumenta la estabilidad de la estructura proteica.
• Enlaces de hidrógeno:
Enlaces de hidró geno internos: Con respecto a los puentes de hidró geno, suelen ser entre R lejanas entre sí. Hay
cadenas laterales que actuará n como aceptores si tienen un á tomo muy electronegativo con pares de electrones
desapareados (histidina desprotonada, metionina, cisteína, glutamato, glutamina, asparagina o aspartato),
mientras que otras cadenas laterales actuará n como donadores si presentan un hidró geno unido a un elemento
muy electronegativo, concretamente en grupos hidroxilo o amino (asparagina, glutamina, arginina, lisina,
tirosina, serina o treonina).
Estabilizan tanto la estructura secundaria como la terciaria.
-Secundaria: entre á tomos del enlace peptídico (aunque estén má s o menos distantes), siendo el
aceptor el O del enlace C=O y el donador el enlace N-H).
-Terciaria: Entre cadenas laterales de grupos R de aminoá cidos distantes, actuando como
aceptores: histidina (su N del imidazol), metionina, cisteína (el S de ambos), aspartato,
glutamato, asparagina y glutamina (sus oxígenos del enlace C=O de los carboxilos); y como
donadores: tirosina, serina, treonina (sus grupos OH), lisina, arginina, asparagina y glutamina
(sus diferentes grupos NH2).
• Interacciones iónicas o salinas: Las interacciones carga-carga pueden producirse entre grupos de las cadenas
laterales cargados positivamente y negativamente. A pH neutro, un grupo se cargará positivamente y el otro
negativamente, de modo que existe una fuerza electrostá tica de atracció n entre ellos. Estos enlaces ió nicos se
rompen cuando la proteína se lleva a valores de pH lo suficientemente bajos o elevados para que una u otra de
las cadenas laterales pierdan su carga.
• Interacciones de Van der Waals: La contribució n de cualquiera de estas interacciones a la entalpía negativa del
plegado disminuye por el hecho de que cuando una molécula proteica se pliega a partir de un ovillo aleatorio
extendido, abandona algunas interacciones favorables con el agua. Una hélice a desplegada forma enlaces de
hidró geno con el agua en lugar de formar enlaces internos. No está claro en qué medida este cambio modifica el
cambio de energía global.

En la estructura nativa, las interacciones má s débiles (VdW y dipolo-dipolo inducido/dispersió n de London) son las má s
relevantes. Estas fuerzas débiles son importantes en el nú cleo o parte central de la proteína, donde la constante dieléctrica
es baja y los á tomos de las cadenas laterales está n muy pró ximos. De hecho, estas interacciones “empaquetadoras” son la
principal fuente del cambio entá lpico favorable (∆H < 0) asociado al plegamiento proteico, comparadas con los puentes
salinos o los puentes de hidró geno que, aunque juegan un papel crucial en la estabilizació n, contribuyen poco al cambio de
energía libre global. Esto se debe a que estos ú ltimos tipos de interacciones está n presentes tanto en la conformació n
desnaturalizada como en la estructura nativa; por ejemplo, los puentes de hidró geno en la proteína desnaturaliza está n
formados con el agua, y lo ú nico que cambia en la estructura nativa es con quién se forman (se forman puentes de H
específicos, como los puentes de H que forman las α-hélices, las hojas plegadas-β y aquellos que se forman en el interior de
la molécula como consecuencia del plegamiento). Como la diferencia de energía entre un puente de H formado, p.ej., por:
C=O – H2O y C=O – H-N es pequeñ a, esto no repercute en un cambio importante en la ΔG global al formarse las α-hélices y
las hojas plegadas-β y los plegamientos. Por lo que el ΔH debido a la rotura de los puentes de H con el agua y la re-
formació n de puentes de H en el interior de la proteína (α-hélices, hojas plegadas–β, etc.) es equivalente. Con los puentes
salinos, el efecto es similar: su formació n en el interior de la proteína implica la desolvatació n de los iones (efecto
desfavorable), seguida de la interacció n electrostática entre cargas opuestas en el interior de la proteína (efecto favorable),
por lo que la variació n neta de energía es pequeñ a.

Ademá s, si en el interior de la proteína no se formasen puentes de H, la pérdida de interacció n de los grupos polares con el
agua resultaría en un cambio entá lpico muy desfavorable. Así pues, para que el estado plegado sea favorable la proteína
debe maximizar la formació n de puentes de H con los grupos polares en el interior de la proteína.

ACEPTORES DONADORES
interaccion ionica

2.3.2.-FACTORES ENTRÓPICOS:

El proceso de plegado, que comporta el paso desde una multitud de conformaciones de ovillo aleatorio a una ú nica
estructura plegada, implica una disminució n de la aleatoriedad y en consecuencia una disminució n de la entropía. Este
cambio se denomina entropía conformacional del plegado. La ecuació n de la energía libre, 𝛥G = 𝛥H – T· 𝛥S, demuestra que
este 𝛥S negativo realiza una contribució n positiva a 𝛥G. En otras palabras, el cambio de entropía conformacional trabaja
contra el plegado. Para buscar la explicació n de un 𝛥G global negativo, debemos buscar las características del plegado
proteico que producen, o bien 𝛥H un negativo grande, o bien algú n otro aumento de la entropía con el plegado. Pueden
hallarse ambas cosas. La fuente principal de un 𝛥H negativo son las interacciones energéticamente favorables entre
grupos en el interior de la molécula plegada.

Para la mayoría de las proteínas la variació n de energía libre es favorable  ΔG < 0, y por tanto favorece la formació n de la
estructura nativa-activa

En el efecto entró pico (ΔS) podemos distinguir 2 componentes: ΔS hidró foba y ΔSconformacional. ΔS > 0 (favorable) cuando el
“sistema + su entorno” se hace má s desordenado.

La proteína desplegada en un medio acuoso tiene sus restos, R, hidró fobos expuestos a las
moléculas de H2O.

• ΔShidró foba: Es el cambio en entropía que se espera ver debido a que la proteína
desplegada en un medio acuoso tiene sus restos hidró fobos expuestos a las
moléculas de agua, y en la estructura nativa no los tendrá.
• ΔSconformacional: Es el cambio en entropía que se espera ver debido a que el plegamiento
implica pasar de una conformació n má s o menos libre (al azar) a una conformació n
mucho má s fija (un solo estado nativo-activo).

Si bien, aunque en la mayoría de los casos predomina el efecto entá lpico, en unos pocos
casos predomina el efecto entró pico.
2.4.-CINÉTICA DEL PLEGADO DE PROTEÍNAS: PLEGAMIENTO ASISTIDO:

Gracias a los trabajos de Anfinsen y su grupo sobre la desnaturalizació n-renaturalizació n de la ribonucleasa pancreá tica
bovina, estos investigadores concluyeron que “toda la informació n necesaria para el plegamiento correcto se halla
contenida en su secuencia de AAs”. A partir de este postulado surgió el corolario del “control termodiná mico” del
plegamiento proteico. Es decir, que la estructura nativa funcional de una proteína es termodiná micamente estable y
representa un mínimo en la energía libre de Gibbs (ΔG). Este proceso implicaría que la célula o sistema bioló gico fuera
probando cada posibilidad y elegiría finalmente la conformació n de menor ΔG. Sin embargo, si una proteína se plegara de
forma aleatoria, muestreando de manera exhaustiva cada confó rmero, localizar el confó rmero con la estructura
tridimensional correcta le llevaría una cantidad enorme de tiempo, no compatible con la vida, aun cuando cada evaluació n
fuera llevada a cabo a una velocidad extremadamente rá pida, p.ej., 1 fs (1 femtosegundo= 10-15s) por conformació n.

Ejemplo para entender esto mejor:

Supongamos que cada enlace péptidico tiene solo 3 grados de libertad, entonces una proteína de 101 AAs podrá presentar
3100 = 5·1047 conformaciones. Si la célula fuera capaz de chequear/analizar un confó rmero cada fs (10-15 s), el chequear
5·1047 confó rmeros le llevaría 5·1030 s. Teniendo en cuenta que 1 día: 86.400 s y que un 1 añ o son: 3,15·10 7s, 5·1030 s= 1,59
1023 añ os. Lo que es irreal en un contexto bioló gico, donde el tiempo de plegamiento es del orden de los segundos como
mucho.

Esta paradoja se conoce como “Paradoja de Levinthal”. Ademá s, es evidente, que la naturaleza a través de la evolució n, ha
hallado una solució n efectiva a este problema. Por lo que Levinthal propuso que la bú squeda conformacional estocá stica
(prueba-error) no era el mecanismo real del plegamiento proteico, sino que éste debería, en cierto sentido, ser un proceso
dirigido, sugiriendo que las proteínas no realizan una bú squeda al azar sino que siguen un camino concreto del
plegamiento. Dicho camino vendría determinado por un control cinético del plegamiento proteico, en contraposició n al
control termodiná mico postulado por Anfinsen. Segú n Levinthal y colaboradores, el plegamiento estaría guiado por la
formació n de interacciones locales entre AAs que actú an como nú cleos de plegamiento. A favor de esta hipó tesis está “el
descubrimiento de estados intermedios en el plegamiento de una proteína”.

Esta paradoja parece haber comenzado a resolverse tras añ os de estudios experimentales y de especulaciones teó ricas. En
primer lugar, ha quedado claro, mediante el uso de métodos cinéticos rápidos, utilizado diversas técnicas físicas para el
seguimiento de los diferentes aspectos de la estructura proteica, que el plegado se produce a través de diversos estados
intermedios; estas observaciones condujeron al modelo de plegado “de la ruta”, que se indica como sigue:

Es crítico el paso de nucleació n, ya que, por ejemplo, es mucho

má s difícil comenzar una hélice a que extenderla (obsérvese que
deben doblarse adecuadamente al menos cuatro residuos para
formar el primer enlace de H estabilizador). Por otro lado, se
acepta en la actualidad que la nucleació n puede comenzar en
diversos puntos y que todas estas estructuras plegadas
parcialmente será n “encauzadas” mediante mínimos energéticos
hacia el estado final. El modelo de encauzamiento propone que
no hay una ú nica ruta sino muchas rutas posibles desde el estado
desnaturalizado hasta el estado plegado, y cada ruta conduce a
un descenso de energía. De esta forma, cualquier molécula só lo
necesita intentar una fracció n infinitesimal de todas las
configuraciones posibles, y se evita la paradoja de Levinthal.

Durante el descenso hacia el mínimo de energía libre, puede haber pausas que corresponden a las estructuras intermedias
metaestables, que se incorporan al modelo de la ruta. Una estructura intermedia importante en el plegado de muchas
proteínas parece ser la que se ha denominado de estado de “gló bulo fundido”, una estructura compacta en la que se ha
producido ya gran parte del plegado secundario y terciario, pero donde todavía no se han asentado en su lugar final los
residuos hidró fobos que se sitú an en el interior. Es un estado nativo en el que las interacciones entre cadenas laterales aú n
no está n estabilizadas. Estos gló bulos describen la cinética de plegamiento.
Existen también pruebas de estados “fuera de la ruta” que son aquellos en los que algunos de los elementos clave está n
plegados de forma incorrecta. Estos estados pueden corresponder a mínimos locales de energía libre del cauce y pueden
atrapar temporalmente a la proteína.

Utilizando el esquema clá sico podríamos representarlo así:

El gló bulo fundido se corresponde con una conformació n con cierta estructura secundaria pero sin estructura terciaria.

Paso 1: Rá pido (ms - µs); nucleació n de la proteína a través de las zonas hidrofó bicas de la estructura, lo cual permite la
formació n de estructuras secundarias, puentes disulfuros y cis-prolinas. Hay enzimas que aceleran estos ú ltimos pasos.

Paso 2: Paso 2: Lento (s); ya está n presentes todos los elementos de estructura secundaria (hélices y lá minas) y el interior
hidrofó bico presenta una cierta movilidad, que queda “congelada” al alcanzar el estado plegado.

El panorama energético del plegamiento, pues, puede representarse como si fuera un embudo en el que cuanto má s abajo
esté la proteína, má s favorablemente energética será (embudo de Ken Dill). Esto describe bastante bien la forma en la que
un polipéptido desplegado con su propio y ú nico conjunto de fuerzas directrices y limitaciones (secuencia aminoacídica,
modificaciones postraduccionales, características del medio, ...) gestiona su camino hacia el estado plegado. Las estructuras
desplegadas se situarían sobre el borde superior. A medida que la proteína se va plegando, comienza a deslizarse, por las
paredes interiores del embudo energético, hacia el fondo hasta alcanzar conformaciones má s estables. La estructura nativa
se sitú a en el fondo del embudo.

Dicho camino podría tener lugar a través de los siguientes pasos:

1. Formació n de estructuras secundarias (α-hélice y lá mina-β). Actú an como nú cleos de plegamiento,
estabilizando otras regiones ordenadas de las proteínas.
2. Formació n de dominios: Se formarían por agregació n cooperativa de distintos nú cleos de plegamiento
3. Formació n de gló bulos fundidos: En proteínas con varios dominios, dichos dominios se agregarían formando
un gló bulo fundido.
4. Transformació n de los gló bulos fundidos en una estructura terciaria, que mediante pequeñ os cambios
conformacionales adoptaría la estructura nativa de una proteína monomérica.
5. Adquisició n de la estructura cuaternaria: Solo si la proteína es multimérica.
Se ha observado que, dependiendo del tamañ o del péptido, este puede o no formar estados intermedios que son
momentá neamente atrapados en mínimos locales de energía. Desde estos pozos es posible que los intermediarios
reviertan y sigan la ruta que conduce al estado nativo, pero si la proteína no es capaz de salir del mínimo local, el resultado
es una proteína mal plegada. Son las moléculas má s pequeñ as (< 100 aminoá cidos) las suelen plegarse sin formació n de
intermedios. Cuando emergen del ribosoma, comienzan un proceso de plegamiento rá pido y cooperativo. Las interacciones
de las cadenas laterales facilitan la formació n y alineamiento de estructuras secundarias (exclusió n del agua interior,
interacciones hidrofó bicas, VdW y puentes de H). En cambio, las cadenas polipeptídicas má s grandes requieren la
formació n de varios intermedios.

2.5.-¿CÓMO SE PLIEGAN, MECÁNICAMENTE, LAS PROTEÍNAS?

Cada vez está má s claro que el plegamiento y el direccionamiento de muchas proteínas en las células está mediado por la
participació n de un grupo de moléculas que, como ya hemos dicho, se denominan chaperonas moleculares.

Las proteínas chaperonas participan en el plegamiento de má s de la mitad de todas las

proteínas de los mamíferos. Los miembros de la familia hsp70 estabilizan las proteínas
nacientes y reactivan algunas proteínas desnaturalizadas. La familia de chaperonas hsp70 se
unen a secuencias cortas de aminoá cidos hidrofó bicos que emergen mientras se sintetiza un
nuevo polipéptido, protegiéndolos del solvente. Las chaperonas previenen la agregació n,
proporcionando así una oportunidad para la formació n de elementos estructurales
secundarios apropiados y la subsiguiente coalescencia en un gló bulo fundido.

La familia de chaperonas hsp60, a veces denominadas chaperoninas, difiere en secuencia y

estructura de hsp70 y sus homó logos. Hsp60 actú a má s tarde en el proceso de plegado, a
menudo junto con una chaperona hsp70. La cavidad central de la chaperona hsp60 en forma
de rosquilla proporciona un entorno no polar protegido en el que un polipéptido puede
plegarse hasta que todas las regiones hidrofó bicas queden enterradas en su interior, evitando
así cualquier tendencia a la agregació n.

• Las chaperonas moleculares se unen de forma transitoria a las proteínas nacientes y a las proteínas
desplegadas (desnaturalizadas por las condiciones agresivas del medio, p.ej.).
• En los péptidos má s pequeñ os, la acció n de las pequeñ as hsp70 es suficiente para estabilizarlo.
• Para proteínas de mayor tamañ o, tras la acció n de las hsp70 y con consumo energético, estas se liberan y la
proteína se introduce en el complejo de las hsp60, donde se determina la estructura final má s estable para
luego liberarla al medio ya bien plegada.
• Si no se consigue su buen plegamiento, las chaperonas moleculares ayudan también a su eliminació n
(marcaje con ubiquitina).
Finalmente, las vías de plegamiento de varias proteínas requieren dos enzimas que catalizan las reacciones de
isomerizació n. La proteína disulfuro isomerasa (PDI) es una enzima ampliamente distribuida que cataliza el intercambio o
barajado de enlaces disulfuro hasta que los enlaces de la conformació n nativa se forman. Entre sus funciones, PDI cataliza
la eliminació n de intermediarios de plegamiento con enlaces cruzados de disulfuro inapropiados. Cataliza la
interconversió n de los isó meros cis y trans de los enlaces peptídicos Pro, lo que puede ser un paso lento en el plegamiento
de las proteínas que contienen algunos enlaces peptídicos residuales Pro en la conformació n cis.

3.-ESTRUCTURA TERCIARIA DE LA MIOGLOBINA: En miocitos

La mioglobina es una hemoproteína cuyo monó mero/componente proteico, globina, es una cadena polipeptídica de 153aas
(17.053 Da), es decir, que está formada por un solo polipéptido de globina. La molécula de mioglobina plegada de forma
compacta mide 4,5 × 3,5 × 2,5 nm. Una proporció n inusualmente alta, alrededor del 75%, de los residuos está presente en
ocho hélices α dextró giras de 7 a 20 residuos. Comenzando en el extremo amino, se denominan hélices A a H. El restante
22% de la estructura está formado por giros-b y acodamientos cortos. NO tiene estructuras en hoja plegada-b.
Típico de las proteínas globulares, la superficie de la mioglobina es rica en aminoá cidos que tienen cadenas laterales
polares y potencialmente cargadas, mientras que, con dos excepciones, el interior contiene residuos que poseen grupos R
no polares (p. ej., Leu, Val, Phe y Met). Las excepciones son los residuos séptimo y octavo en las hélices E y F, His E7 y His
F8, que se encuentran cerca del hierro hemo, sitio de unió n del O2.
Los restos aminoacídicos de cada α-hélice se numeran independientemente para cada a-hélice lo que facilita la referencia a
los restos aminoacídicos concretos o a regiones conservadas entre diferentes globinas de longitudes semejantes, pero
estructuralmente diferentes. Por ejemplo, la “Histidina proximal”, implicada en la unió n del grupo hemo a la globina, en
todas las hemoproteínas conocidas, es el resto #93 en la Mb, el #87 en la Hba y el #92 en la Hbb. Sin embargo, dado que
este resto de His es el 8º resto aminoacídico en la hélice F en todas estas globinas, es costumbre referirse a él como
“HisF8”.
El hemo de la mioglobina se encuentra en una grieta entre las hélices E y F
orientadas con sus grupos propionato polares hacia la superficie de la
globina. El resto reside en el interior no polar. La quinta posició n de
coordinació n del hierro está ocupada por un nitró geno del anillo de imidazol
de la histidina proximal, His F8. La histidina distal, His E7, se encuentra en el
lado del anillo hemo opuesto a His F8. Este grupo prostético está rodeado
por His-proximal de α-hélice F, y la His-distal de α-hélice E. Dicho de otra
forma, por HisF8 e HisE7.

FUNCIÓ N DE LA HEMOGLOBINA:

La principal funció n de la mioglobina es fijar el O2 que la hemoglobina transporta a través del torrente sanguíneo, y que
libera a los tejidos. La mioglobina lo fija para:
- Almacenar O2 hasta que sea necesario – aceptor electró nico final en el metabolismo energético.
- Transportar O2 dentro de la célula, normalmente a orgánulos energéticos. “Molecular bucket bridage”: O2 que se
disocia de una molécula de Mb y se une a la siguiente.
Así, cualquier molécula de este tipo puede unirse a O2, para evitar que el O2 oxide otra sustancia y para liberar O2
almacenado en funció n de las necesidades celulares.

3.1.-EL GRUPO HEMO Y ESTRUCTURA DEL GRUPO HEMO:

→ El grupo hemo, la parte fijadora de O2 comú n a la Mb y la Hb, es una molécula de porfirina que tiene coordinado un
á tomo de hierro (Fe2+):
El grupo prostético Fe-porfirina es plano e hidrofó bico, con la excepció n de 2 grupos propionato expuestos al disolvente. El
grupo hemo constituye un componente integral de las holoproteínas de globina.
La globina sola no desempeñ a estas funciones adecuadamente. Se ayuda de metales de transició n en su estado de oxidació n
má s bajo (Fe(II), Cu(I)); tienen fuerte tendencia a unir O 2. Evolutivamente, los mamíferos han seleccionado una forma de
esta proteína en la que el Fe(II) se une a la globina, creando un sitio de unió n para el O2.
En la familia mioglobina-hemoglobina, el hierro está quelado por un sistema de anillos tetrapirró lico; protoporfirina-IX. El
complejo formado por protoporfirina-IX y Fe(II) se denomina grupo hemo. Este grupo prostético está unido a la globina
(Mb o Hb) de manera no covalente en una hendidura hidró foba de la molécula.
Tanto la mioglobina como la hemoglobina tienen un grupo hemo, un anillo tetrapirró lico, cíclico, que contiene hierro y el
cual consta de cuatro moléculas de pirrol unidas por puentes de metino. Un grupo metino o puente de metino es un grupo
funcional trivalente, = CH−, derivado del metano. Consiste en un á tomo de carbono unido por dos enlaces sencillos y un
enlace doble, donde uno de los enlaces sencillos es un hidró geno .
El ió n Fe(II) puede formar 6 enlaces coordinados, 4 coplanares con N del anillo porfirínico y 2 perpendiculares a este
plano: Uno con el N imidazó lico de la cadena R lateral de la “His-proximal”, y el otro, también perpendicular al plano
porfirínico, se forma con el O2 (cuando este está unido). El O2 (O=O) forma un enlace de coordinació n entre uno de los
á tomos de oxígeno y el Fe2+ del grupo hemo, mientras que el segundo átomo de oxígeno forma un puente de H con el HN
de la His-distal. De esta forma, el O2 se une reversiblemente al Fe2+ del grupo hemo, que no se oxida a Fe3+.
Las globinas aumentan la solubilidad en agua del grupo prostético
hemo, que de otro modo sería poco soluble e hidrofó bico. Una vez
secuestrado en el interior de un bolsillo hidrofó bico creado por el
polipéptido, el grupo hemo se encuentra en un ambiente protector
que minimiza la oxidació n espontá nea de Fe2+ (ferroso) a Fe3+ (férrico:
oxidació n) en presencia de O2. En el bolsillo hidró fobo/apolar (sitio
del grupo hemo en Mb y Hb), Fe 2+ es resistente a la oxidació n del O 2.
Este O2 sufre una reordenació n electró nica temporal, y cuando se
libera, el hierro permanece en estado ferroso, preparado para recibir
otra molécula de O2. Si se diera la oxidació n del Fe2+ de la mioglobina
o la hemoglobina a Fe3+, se destruiría su actividad bioló gica.

No obstante, cuando la Mb o Hb se almacena en contacto con el aire, fuera del ambiente celular, el hierro se oxida
lentamente (Fe2+  Fe3+) formando lo que se conoce como metamioglobina o metahemoglibina. La meta-Mb o meta-Hb
no son capaces de fijar O2, y en su lugar fijan H2O, en el sexto enlace de coordinació n.
Por otro lado, aunque el bolsillo del grupo hemo está perfectamente diseñ ado para fijar O 2, también puede fijar otras
moléculas pequeñ as, p. ej., CO. El CO tiene aproximadamente el mismo tamañ o y configuració n electró nica que el O 2. Sin
embargo, el CO se fija a la Mb y Hb con una afinidad mucho mayor que el O 2, haciendo la unió n prá cticamente irreversible.
La apomioglobina proporciona un entorno obstaculizado para el hierro hemo :
Cuando el O2 se une a la mioglobina, el enlace que une el primer y el segundo á tomo de oxígeno forma un á ngulo de 121°
con el plano del hemo, lo que orienta al segundo oxígeno lejos de la histidina distal. Esto permite una superposició n
má xima entre el hierro y uno de los pares de electrones solitarios en los á tomos de oxígeno con hibridació n sp 2, que se
encuentran en un á ngulo de aproximadamente 120° con respecto al eje del doble enlace O=O, y protege al oxígeno de ser
desplazado por el CO. El CO se une al hierro en el hemo libre 25 000 veces má s fuerte que el oxígeno. Entonces, ¿por qué el
CO no desplaza completamente al O2 del hierro hemo presente en la mioglobina y la hemoglobina?
La explicació n aceptada es que las apoproteínas de la mioglobina y la hemoglobina crean un entorno obstaculizado para
sus ligandos gaseosos. Cuando el CO se une al hemo libre, los tres á tomos (Fe, C y O) se encuentran perpendiculares al
plano del hemo. Esta geometría maximiza la superposició n entre el par solitario de electrones en el carbono con
hibridació n sp de la molécula de CO y el hierro Fe 2+. Sin embargo, en la mioglobina y la hemoglobina, la histidina distal
excluye estéricamente esta orientació n preferida de alta afinidad del CO, al mismo tiempo que permite que el O 2 alcance su
orientació n má s favorable.
3.2.-UNIÓ N DEL OXÍGENO A LA MIOGLOBINA
Para comprender y poder describir esta funció n desde un punto de vista cuantitativo, necesitamos recurrir al concepto de
“Unió n de ligando”, y comprender có mo esta unió n depende de su concentració n en el entorno.
1º-Debemos disponer de una forma de medir la concentració n de oxígeno disuelto. Podemos medir la concentració n de
oxígeno disuelto midiendo presiones parciales, pues, segú n la Ley de Henry: la concentració n de cualquier gas disuelto en
un líquido es proporcional a la “presió n parcial” de ese gas sobre el líquido. La Ley de Henry es la relació n que describe el
efecto de la presió n sobre la solubilidad de los gases.
Esta ley establece que la solubilidad de un gas en contacto con la superficie de un líquido a una temperatura determinada
es directamente proporcional a la presió n parcial de dicho gas sobre el líquido. Esto quiere decir que, mientras mayor sea
la presió n del gas sobre un líquido, mayor será la cantidad total del gas que se podrá disolver en el mismo, obteniéndose
así una mayor concentració n (es decir, mayor será la solubilidad).
En forma matemá tica, la Ley de Henry se expresa como una ley de proporcionalidad:
Aplicando esta ley o expresió n a nuestro caso:

2º- Describir la unió n de O2 a hemoglobina. Sabemos que, cuando se unen, el espectro de absorció n se modifica debido a
desplazamientos electró nicos en el anillo de porfirina. Este cambio determina espectrofotométricamente la fracció n de
moléculas de Mb oxigenadas. Se representa mediante una curva de saturació n, con forma hiperbó lica (a pH neutro).

1:

ROJO: todas con O2. // MORADO: algunas con O2. // AZUL: ningú n O2. El porcentaje de morado se puede calcular con una
regla de tres.
Expliquemos el comportamiento de la curva de saturación:
Vamos a considerar la siguiente reacció n:

Si están todos ocupados, la concentració n de mioglobina es cero, la de mioglobina oxigenada es maxima, y como
numerador y denominador son iguales, la expresió n resulta 1
¿Cuá l será la concentració n de oxígeno, [O2], para que la mitad de los sitios de la Mb estén ocupados por O2?

Experimentalmente, al llegar al valor má ximo (30mmHg),

valores superiores generará n asíntota.
El O2 que se intenta añ adir no puede unirse, es decir, que se ha
alcanzado la saturació n.
Conclusiones:
1) La ec. describe perfectamente los datos experimentales.
2) La afinidad de la Mb por el O 2 es muy alta (valor muy bajo
para [O2]0.5: 4 mm Hg)  lo que es muy bueno para una
molécula diseñ ada para almacenar O2.
3) Esta característica es muy buena para poder extraer
oxígeno de la sangre, ya que en los capilares la PO 2 = 30 mm
Hg  Mb prá cticamente saturada.
4) La Mb só lo libera O2 de manera significativa cuando los
valores de la P O2 bajan por debajo de la P50, es decir, cuando
el O2 disuelto en la célula no es suficiente para cubrir las
necesidades oxidativas del sistema.
4.-MECANISMOS IMPLICADOS EN LA FIJACIÓN Y LIBERACIÓN DE O2
El hierro de la mioglobina no oxigenada se encuentra 0,03 nm (0,3 Å ) fuera del plano del anillo hemo, hacia His F8. En
consecuencia, el grupo hemo se “arruga” ligeramente. Cuando el O2 ocupa la sexta posició n de coordinació n, el hierro se
mueve dentro de 0,01 nm (0,1 Å ) del plano del anillo hemo. Así, la oxigenació n de la mioglobina va acompañ ada del
movimiento del hierro, de His F8 y de residuos ligados a His F8.
En cuanto a los mecanismo implicados en la fijació n y liberació n del O2 en y del bolsillo hemínico, no sabemos mucho,
pero actualmente se cree que estos fenó menos está n relacionados con la flexibilidad molecular de la molécula de Mb.
Ocurre en el bolsillo hidró fobo, y está n relacionados con flexibilidad molecular de la mioglobina.
-NO LIBERACIÓ N: O2 se libera del sitio de unió n, pero rebota alrededor del bolsillo hemínico y puede volver a unirse.
- LIBERACIÓ N: O2 liberado se escapa si las zonas variantes/fluctuantes de la estructura de la Mb abren un camino hacia el
exterior.