Clemente Pérez Paula

Departamento de Bioquímica
CCDC56, una proteína esencial para la formación

de la citocromo c oxidasa en células humanas
Tesis Doctoral
Paula Clemente Pérez
Madrid 2012
Facultad de Medicina
Universidad Autónoma de Madrid

Memoria presentada por la Licenciada en Bioquímica

Paula Clemente Pérez
para optar al grado de Doctor por la Universidad Autónoma de Madrid
Directores de Tesis:
Rafael Garesse Alarcón
Catedrático de Bioquímica y Biología Molecular
Miguel Ángel Fernández Moreno
Profesor Titular de Bioquímica y Biología Molecular
Universidad Autónoma de Madrid
Instituto de Investigaciones Biomédicas Alberto Sols. CSIC-UAM
Rafael Garesse Alarcón, Catedrático de Bioquímica y Biología Molecular y Miguel Ángel Fernández
Moreno, Profesor Titular de Bioquímica y Biología Molecular, de la Universidad Autónoma de
Madrid, como Directores de Tesis,
CERTIFICAN:
Que Doña Paula Clemente Pérez con D.N.I.: 50.883.507-D, licenciada en Bioquímica ha realizado, bajo
nuestra dirección, en el Departamento de Bioquímica de la Facultad de Medicina de la Universidad
Autónoma de Madrid / Instituto de Investigaciones Biomédicas “Alberto Sols”, el trabajo titulado:

Una vez supervisado el trabajo, consideramos que reúne todos los requisitos necesarios en cuanto
a originalidad y calidad para ser presentado como Tesis Doctoral con el objeto de optar al título de
Doctor por la Universidad Autónoma de Madrid.
En Madrid, a 27 de Febrero de 2012.
Rafael Garesse Alarcón Miguel A. Fernández Moreno

Director de Tesis Director de Tesis
Departamento de Bioquímica UAM

C/ Arzobispo Morcillo s/n
28029 Madrid
Esta Tesis Doctoral ha sido realizada gracias a la concesión de un
Contrato Personal Investigador de Apoyo por parte de la Comunidad de
Madrid a Paula Clemente Pérez
A mis padres y mi hermana
con todo mi amor
.
AGRADECIMIENTOS
Agradecimientos
Durante todos estos años de tesis he estado acompañada por mucha gente, que han sido
sin duda la parte más importante de este trabajo. Sin ellos nada de lo que aquí presento habría sido
posible o por lo menos no habría sido tan entretenido. Y por eso quiero desde aquí expresaros mi
más sincero agradecimiento.
No puedo empezar estos agradecimientos por otras personas que no sean mis padres,
Marisa y Pedro. Ellos son los principales responsables de que yo haya llegado hasta aquí. Mamá,
Papá, gracias por vuestro apoyo, por vuestra paciencia infinita y por darme siempre todo lo que
necesito. Por todas las cosas que hacéis por mí cada día. Gracias por haberme hecho como soy, por
enseñarme a ser trabajadora y por demostrarme que con esfuerzo y tesón uno puede conseguir lo
que se propone. Pero sobre todo gracias por vuestro amor incondicional. Por eso esta tesis es para
vosotros.
A continuación les tengo que agradecer a los directores de esta tesis, los profesores Rafael
Garesse Alarcón y Miguel Ángel Fernández Moreno, que me dieron hace ya mucho tiempo la
oportunidad de trabajar con ellos. Rafa gracias por tu sensatez, tu paciencia y tus siempre buenos
consejos, por tranquilizarme y ayudarme siempre que lo he necesitado y por enseñarme a pensar.
Gracias por haber confiado en mí desde el primer momento en que me aceptaste como parte de
tu laboratorio y principalmente por ser un ejemplo inmejorable como científico y como persona.
A tí Miguel gracias por tu infinita paciencia, porque, aunque no me oirás repetirlo otra vez, se que
nunca fui una becaria dócil. Gracias por todas las charlas y los consejos, por tu cariño y apoyo. Y
gracias por enseñarme a trabajar, a pensar en cada momento lo que tenía en el tubo. Si a alguien le
tengo que agradecer mis habilidades técnicas es a tí, no podría haber tenido un mejor maestro en
la poyata.
Han sido muchos los años que he pasado en el laboratorio B19 y he tenido la oportunidad
de compartirlos con mucha gente que ha pasado por allí, desde que entré con Pablo, Pilar, Mari
Carmen o Cristina hasta los miembros actuales del laboratorio Mercedes, Carmen, Cristina y Milena.
Gracias Belen por tu amabilidad, tu alegría y tus ánimos. Rosana, no se me olvidarán los buenos
momentos que hemos pasado, gracias por sonreir siempre. Esther, nuestras tardes de risas siempre
hacían el trabajo mucho más ameno. Y gracias también a Sara, y especialmente Ramiro y Alberto,
las nuevas incorporaciones, que con su simpatía han conseguido que esta etapa de escritura de la
Tesis haya sido un poco menos dura.
Mucha gente pasó por el laboratorio en pequeñas estancias, Mari, Berta, Justine y
especialmente Maca que hicieron del B19 un sitio mucho más divertido. Gracias Gonzalo, nuestro
estudiante estrella, porque hiciste que los veranos fueran simplemente inigualables.
17
Agradecimientos
Pero si a alguien le tengo que agradecer su apoyo en esta tesis, su constante ayuda, su
comprension y por encima de todo su cariño y amistad es a Emiliano, Álvaro, Vero y Luci. Ha
sido un verdadero placer compartir laboratorio y experiencias con vosotros y sé que vaya donde
vaya, nunca voy a tener unos compañeros tan geniales. A Emi, mil gracias por tu ayuda, por tu
apoyo que se nota incluso estando lejos y sobre todo por el buen humor que le pones a todo lo que
haces. A Alvarito, gracias por tu paciencia, por tu comprension, por lo bien que sabes escuchar,
por aguantarnos a las tres y por hacer que aunque estés en Sheffield no se note la distancia. Verito,
se que diga lo que diga las palabras se me quedarán cortas porque no se que habría hecho sin tí.
Gracias por ser así de maravillosa, por todos los grandes momentos que hemos pasado juntas,
por las risas, por tu ayuda, por todo lo que te implicas en cada cosa que haces. Se que nunca me
lo pasaré tan bien trabajando como lo he hecho contigo. Y por último Luci, mi compañera de
aventuras durante todos estos años de tesis, no he podido tener una compi mejor. Tengo tanto que
agradecerte que necesitaría dos o tres tesis, pero sobre todo gracias por tu amistad, por tu cariño y
porque sólo con estar ahí has hecho que esta experiencia mereciera la pena.
También le tengo que dar las gracias a los “vecinos” de nuestro laboratorio por su ayuda
y por las sugerencias e ideas en los seminarios que hemos compartido. Gracias a Margarita, Juan,
Lucía, Raquel, Mari Cruz, Jorge, Bego, Pedro y Berta. A David por su fiesta en el nidito. Gracias
Leti por tu apoyo, tu amistad y por esa alegría tan contagiosa que tienes. A Luisja, nuestro apéndice,
porque desde que te fuiste el departamento no ha sido el mismo. Y sobre todo mil gracias a
Oihane que, aunque nos encontramos tarde, me ha demostrado ser una amiga increíble siempre
preocupada y dispuesta a ayudarme en todo lo que he necesitado.
No me puedo olvidar, aunque solo sea por el tiempo que he pasado allí, de agradecerles su
amabilidad y su paciencia a las chicas del Servicio de Protección Radiológica. Gracias a Mª Teresa,
Raquel y sobre todo a Sonia y Ángela porque sin ellas seguro que los marcajes no habrían sido tan
agradables.
Continuando con los agradecimientos científicos, quiero agradecerle al Dr. Antoni
Barrientos de la Universidad de Miami el haberme acogido unos meses en su laboratorio. Thanks
to Jingjing, Alex, Ileana, Darryl and specially Toni and Flavia for their ideas and suggestions, for treating me so
wonderfully well the time I spent in their lab and for teaching me to fight every experiment. Thanks very much. Y
por último quiero agradecerle a la Dra. Cristina Ugalde el haberme enseñado la maravillosa técnica
del Blue Native que tantas y tantas veces he repetido a lo largo de la tesis.
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Agradecimientos
Dejando de lado a los científicos tengo que agradecerle a mi familia que está siempre
conmigo. Por encima de todos, a mis tíos Virginia y Pablo y a mis primas María e Irene, por vuestro
cariño y por preocuparos por mí y a Ire además por la compañía tan estupenda que me ha hecho
los muchos domingos que me ha acompañado al laboratorio.
To my loving Irish family, who always treats me like one of their own, for teaching me the English I know.
A todos mis amigos de la carrera por estar siempre conmigo durante la facultad y después
de ella. A Javi, Kike, Loli y especialmente a Larita por haberme seguido tan de cerca durante esta
Tesis. A mis amigas de Biología, mis amiguitas ocupadas, Chiqui, Patty, Sara, Laura y Elvi, y las que
no son de Biología, Merry y Ana, gracias por todos los desahogos mientras nos tomamos unas
cañas. A Manu, por todos los buenos ratos que hemos pasado y por lo que nos has ayudado en todo
lo que hacemos fuera de la ciencia. A mis amigas del cole Soti y Con y también a Edu, por vuestro
cariño, por todos estos años de amistad y por los buenos momentos que hemos pasado juntas. Y
a Ro por todos estos años de amistad en los que siempre ha estado pendiente de mis progresos.
A los mejores anfitriones del mundo, María la Peque y Daniel, por todas las escapadas a
Alemania. Peque, cada día de estos 29 años que llevamos juntas me has demostrado que eres la
mejor amiga que se puede tener. Gracias Daniel por hacer que esta Tesis esté mucho más mona.
No me podía imaginar a nadie mejor para formar la familia Swoboda-Peña.
A Javi por estar siempre conmigo desde que el día que nos conocimos, por ayudarme y
darme tranquilidad, por alegrarme cada día. Por los desayunos y las meriendas. Por quererme y
querer acompañarme en todo lo que tenemos por delante. No podría tener un mejor compañero
de viaje.
Y por último a Marta, mi gordi. Sister, son tantas las cosas que tengo que agradecerte que
no acabaría nunca, pero lo resumiré en darte las gracias por tu amor incondicional de hermana, por
estar conmigo en todo lo que hago, cuando nos queremos y cuando nos peleamos, en definitiva
por hacer que todo en la vida sea mucho más divertido. I love you to pieces, to you I dedicate this Thesis.
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RESUMEN / SUMMARY
Resumen / Summary
La principal función de la mitocondria es la producción de energía química en forma de

ATP a través de la fosforilación oxidativa, un proceso llevado a cabo por los cinco complejos
enzimáticos de la cadena respiratoria. El complejo IV o citocromo c oxidasa es el complejo final
de la cadena respiratoria, el cual cataliza la oxidación del citocromo c transfiriendo sus electrones
al oxígeno. De las trece subunidades que componen el complejo IV en humanos, tres de ellas,
COX1, COX2 y COX3, están codificadas en el genoma mitocondrial y las 10 restantes, COX4,
COX5a, COX5b, COX6a, COX6b, COX6c, COX7a, COX7b, COX7c y COX8, se encuentran
codificadas en el ADN nuclear. El proceso de ensamblaje de estas subunidades para formar el
holoenzima maduro requiere la participación de un gran número de proteínas accesorias conocidas
como factores de ensamblaje.
El estudio del factor de traducción mitocondrial mtTFB1 de Drosophila melanogaster nos
ha permitido identificar a CCDC56 (“Coiled-coil domain containing 56”), una proteína de función
desconocida codificada en lo que se consideraba la región 5’ no traducida del mensajero y que se
encuentra conservada desde Drosophila hasta humanos.
El gen CCDC56 humano codifica una pequeña proteína integral de la membrana mitocondrial
de 11.7 KDa. Su caracterización funcional mediante interferencia de ARN nos ha permitido concluir
que CCDC56 es una proteína esencial para la formación de la citocromo c oxidasa en células
humanas. El silenciamiento de CCDC56 provoca un déficit aislado de la actividad del complejo IV
acompañado de una disminución de la cantidad de complejo totalmente ensamblado. El análisis
de los intermediarios de ensamblaje del complejo IV en las células con el déficit de CCDC56
mostró que el ensamblaje del mismo se encontraba bloqueado, lo que provocaba una rápida
degradación de las subunidades que lo componen. Este bloqueo en el ensamblaje va acompañado
de una disminución de la síntesis de COX1, lo que apunta a que CCDC56 está implicada en la
coordinación de la traducción de COX1 con el ensamblaje del complejo IV.
Las enfermedades mitocondriales son un grupo de enfermedades poco frecuentes que
pueden estar causadas por mutaciones en cualquiera de los genes que afectan al funcionamiento
del sistema OXPHOS, haciendo de CCDC56 un excelente candidato para analizar en pacientes
cuya enfermedad curse con un defecto del complejo IV.
23
Resumen / Summary
Mitochondria generate most of the cell’s energy supply in the form of ATP in a process
known as oxidative phosphorilation. This process is carried out by the five complexes of the
respiratory chain. Complex IV or cytochrome c oxidase is the terminal enzyme of the respiratory
chain and catalyzes the oxidation of cytochrome c transferring its electrons to molecular oxygen.
Human complex IV is composed of 13 subunits, three of which, COX1, COX2 and COX3, are
encoded on the mitochondrial genome, while the remaining ten subunits, COX4, COX5a, COX5b,
COX6a, COX6b, COX6c, COX7a, COX7b, COX7c and COX8, are encoded on nuclear DNA.
The assembly process of these subunits to form the mature holoenzyme requires the participation
of a great number of accessory proteins known as assembly factors.
The study of Drosophila melanogaster mitochondrial translation factor mtTFB1 has led us to
the identification of CCDC56 (Coiled-coil domain containing 56), a protein of unknown function
encoded on what was considered to be the 5’ untranslated region of the mRNA. This novel protein
is conserved from Drosophila to humans.
Human CCDC56 codes for a small (11.7 KDa) transmembrane protein that localizes
to the mitochondria. Its functional characterization using RNA interference has allowed us to
conclude that CCDC56 is an essential protein for cytochrome c oxidase biogenesis in human cell
lines. CCDC56 knockdown causes an isolated deficit of complex IV activity and a decrease in the
amount of fully assembled complex. Analysis of complex IV assembly intermediates in these cells
showed the assembly of the complex was impaired, causing a rapid degradation of its subunits.
Together with the block in COX assembly, CCDC56 knockdown causes a decrease in the synthesis
of COX1, suggesting CCDC56 is involved in the coordination of COX1 synthesis and complex
IV assembly.
Mitochondrial pathologies are a rare group of heterogeneous diseases which can be caused
by genetic defects in any of the genes involved in the proper function of the OXPHOS system.
CCDC56 involvement in COX biogenesis makes it an excellent candidate to analyze in patients
suffering diseases caused by complex IV defects.
24
ÍNDICE
Índice
ABREVIATURAS 31
INTRODUCCIÓN 35
1. La mitocondria 37
1.1. Origen y evolución de la mitocondria 37
1.2. Estructura, morfología y distribución de las mitocondrias 38
1.3. Función mitocondrial 39
2. Estructura y metabolismo del genoma mitocondrial 41
2.1. Estructura y herencia del ADN mitocondrial 41
2.2. Replicación del ADN mitocondrial 43
Maquinaria basal de replicación del ADN mitocondrial 43
2.3. Transcripción del ADN mitocondrial 44
2.4. Traducción mitocondrial 45
Regulación de la traducción mitocondrial 45
3. Biogénesis de los complejos de la cadena respiratoria 47
3.1. Inserción de las proteínas en la membrana mitocondrial interna 47
3.2. Ensamblaje de los complejos de la cadena respiratoria 48
3.3. Biogénesis de la citocromo c oxidasa 48
Estructura de la citocromo c oxidasa 48
Ensamblaje de la citocromo c oxidasa 49
4. Patología mitocondrial 53
5. Drosophila melanogaster como sistema modelo para el estudio de la fisiopatología
54
mitocondrial
5.1. Identificación de nuevos genes mitocondriales en Drosophila melanogaster 55
OBJETIVOS 57
MATERIALES Y MÉTODOS 61
1. Materiales 63
1.1. Reactivos, soluciones y tampones 63
1.2. Radioisótopos 63
1.3. Líneas celulares 63
1.4. Cepas bacterianas 63
1.5. Vectores 64
1.6. Oligonucleótidos 64
Oligonucleótidos para el clonaje de CCDC56 en pRSET B 64
Oligonucleótidos para el clonaje de CCDC56 en pIRESpuro2 64
Oligonucleótidos para PCR cuantitativa de los ARNm mitocondriales 64
Índice
Oligonucleótidos para la secuenciación de CCDC56 en pacientes con 65

déficit del complejo IV
1.7. siRNAs y sondas Taqman 65
1.8. Anticuerpos 66
2. Métodos 66
2.1. Clonajes 67
2.2. Secuenciación de ácidos nucleicos y análisis de secuencias 67
2.3. Aislamiento de ácidos nucleicos 67
Aislamiento de ARN de células en cultivo 67
Aislamiento de ADN plasmídico 67
2.4. RT-PCR y PCR cuantitativa (qPCR) 68
2.5. Cultivo de líneas celulares y transfección 68
2.6. Curvas de crecimiento 68
2.7. Inmunocitoquímica 68
2.8. Aislamiento de proteínas totales de células en cultivo 69
2.9. Purificación de mitocondrias 69
2.10. Fraccionamiento submitocondrial 69
2.11. Inmunodetección de proteínas unidas a membrana (Western Blot) 69
2.12. Determinación de actividad enzimática de los complejos de la cadena
70
respiratoria mitocondrial
2.13. Medida de la actividad citrato sintasa 70
2.14. Marcaje in vivo de las proteínas mitocondriales 71
2.15. Electroforesis en condiciones nativas (“Blue Native” PAGE) y ensayos de 71
actividad en gel (IGA)
2.16. Geles bidimensionales (2D BN/SDS PAGE) 72
2.17. Generación de anticuerpos policlonales frente a la proteína CCDC56 72
2.18. Inmunoprecipitación de CCDC56-Flag 72
2.19. Análisis estadístico de los resultados 73
RESULTADOS 75
1. Falta de función de CCDC56 en Drosophila melanogaster 78

2. CCDC56 se encuentra conservada en humanos 80
3. Caracterización funcional de CCDC56 en líneas celulares humanas 82
3.1. Generación de anticuerpos policlonales frente a la proteína CCDC56 humana 82
3.2. Generación de líneas estables de sobreexpresión y localización subcelular de
83
CCDC56
3.3. Interferencia de CCDC56 en células HeLa 86
Índice
Transfección transitoria de siRNAs en células HeLa y silenciamiento de

86
CCDC56
Curvas de crecimiento 87
Medida de la actividad de los complejos de la cadena respiratoria 88
Evaluación de los niveles de los complejos de la cadena respiratoria
89
totalmente ensamblados
Cuantificación de las proteínas de los complejos de la cadena respiratoria 90
Cuantificación de los mensajeros mitocondriales 91
Análisis in vivo de la síntesis de proteínas mitocondriales 92
Análisis in vivo de la estabilidad de las proteínas mitocondriales 94
Análisis del ensamblaje del complejo IV mediante BN-PAGE y 2D BN/
96
SDS-PAGE
3.4. Rescate del fenotipo mediante la sobreexpresión de CCDC56 98
3.5. Sobreexpresión de CCDC56 en células HeLa 100
Medida de la actividad de los complejos de la cadena respiratoria 100
Evaluación de los niveles de los complejos de la cadena respiratoria
101
totalmente ensamblados
Cuantificación de las proteínas de los complejos de la cadena respiratoria 102
3.6. Búsqueda de proteínas que interaccionen con CCDC56 103
4. Búsqueda de mutaciones en el gen CCDC56 en pacientes con déficit del complejo IV 105
DISCUSIÓN 107
1. Identificación de CCDC56 109

2. CCDC56 es una nueva proteína integral de la membrana mitocondrial interna 111
3. La disminución de CCDC56 provoca un déficit severo y aislado de la actividad del
113
complejo IV en la línea celular humana HeLa
4. CCDC56 es una nueva proteína esencial para la formación del complejo IV en células
116
humanas
5. CCDC56 participa en la coordinación de la síntesis de COX1 con el ensamblaje del
119
complejo IV
CONCLUSIONES 123
BIBLIOGRAFÍA 129
ANEXOS 147
ABREVIATURAS
Abreviaturas
2D BN/SDS-PAGE Geles bidimensionales BN/SDS-PAGE

ADNc ADN complementario
ADNmt ADN mitocondrial
ADNn ADN nuclear
BN-PAGE “Blue Native polyacrylamide gel electrophoresis”, Electroforesis en geles
de poliacrilamida en condiciones nativas
CI Complejo I, NADH deshidrogenasa
CII Complejo II, Succinato deshidrogenasa
CIII Complejo III, Ubiquinol:citocromo c oxidorreductasa
CitC Citocromo c
CIV Complejo IV, Citocromo c oxidasa
Cm Cloranfenicol
CoQ Coenzima Q10, Ubiquinona
CoQH2 Ubiquinol
COX Citocromo c oxidasa, Complejo IV
CTE Cadena de transporte electrónico
CuA Centro de cobre A, Grupo prostético de COX2
CuB Centro de cobre B, Grupo prostético de COX2
CV Complejo V, ATP sintasa
DAB 3,3’-diaminobenzidina
DBH2 Decilubiquinol
DCPIP 2,6-diclorofenol-indofenol
DHODH Dihidroorotato deshidrogenasa
DIC Óptica de contraste interdiferencial o Nomarski
DTNB Ácido 5-5’ ditio bis 2-nitrobenzoico
ETF-QO Flavoproteína-ubiquinona oxidorreductasa
FCLS Variante franco-canadiense del síndrome de Leigh
GatC Subunidad C de la glutamil ARNtGln amidotransferasa
GatCAB Glutamil ARNtGln amidotransferasa
33
Abreviaturas
HRP “Horseradish peroxidase”, peroxidasa de rábano

HSP “Heavy strand promoter”, Promotor de la cadena pesada del ADN
mitocondrial
IGA “In-gel activity assay”, Ensayo de actividad en gel
IPTG Isopropil-β-D-galactopiranósido
IMS Espacio intermembrana
LS Síndrome de Leigh
LSP “Light strand promoter”, Promotor de la cadena ligera del ADN
mitocondrial
MELAS Miopatía mitocondrial con encefalopatía, acidosis láctica y
accidentes cerebrovasculares
MME Membrana mitocondrial externa
MMI Membrana mitocondrial interna
ND NADH deshidrogenasa
NTB Azul de nitrotetrazolio
OH Origen de replicación de la cadena pesada
OL Origen de replicación de la cadena ligera
OXPHOS Fosforilación oxidativa
PH3 Fosfohistona 3
qPCR PCR cuantitativa
qRT-PCR RT-PCR cuantitativa
ROS Especies reactivas de oxígeno
SDH Succinato deshidrogenasa
SDS-PAGE Electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones
desnaturalizantes
SD Sedimento
SN Sobrenadante
TIM Translocasa de la membrana interna
TOM Translocasa de la membrana externa
34
INTRODUCCIÓN
Introducción
1. La mitocondria
1.1. Origen y evolución de la mitocondria

La teoría endosimbiótica del origen de las mitocondrias fue postulada en los años 70 por
F. Taylor y L. Margulis (Margulis, 1975). Esta teoría sitúa el origen de las mitocondrias hace unos
2000 millones de años, periodo en el que se produjo un drástico aumento en la concentración de
O2 de la atmósfera. En este momento tuvo lugar un fenómeno de endosimbiosis entre una célula
protoeucariota huésped con metabolismo anaerobio y una α-proteobacteria aerobia que vivían de
forma independiente. Según el denominado modelo Ox-Tox, la proteobacteria actuaba retirando
el oxígeno del citoplasma de la célula huésped, evitando así sus efectos tóxicos, mientras que ésta
le proporcionaba nutrientes, como glicerol, lípidos o aminoácidos al endosimbionte (Kurland and
Andersson, 2000, Gabaldon and Huynen, 2007). Numerosos estudios filogenéticos muestran que
dicho evento ocurrió una sola vez a lo largo de la evolución, y por lo tanto se admite un origen
único y común del conjunto de mitocondrias presentes en los distintos organismos eucariotas
(Kurland and Andersson, 2000).
A lo largo de la evolución esta proto-mitocondria fue especializándose progresivamente
en el metabolismo energético, perdiendo gran parte de su proteoma original y sustituyéndolo por
proteínas de la célula huésped. La replicación, transcripción, división celular o transducción de
señales de la α-proteobacteria quedaron así bajo el control de la célula huésped, en un proceso que
algunos autores definen como un secuestro del endosimbionte (Gabaldon and Huynen, 2007). Se
37
Introducción
considera que la transformación de este endosimbionte en orgánulo tuvo lugar al adquirir éste la
capacidad de intercambiar ATP y ADP con el citoplasma de la célula huésped, quedando integrado
en el metabolismo celular (Kurland and Andersson, 2000).
Durante los millones de años de evolución conjunta, la mayor parte de los genes de la
proteobacteria se han perdido o han sido transferidos al núcleo del huésped, hasta llegar a la situación
actual en que el genoma mitocondrial (ADNmt) codifica un número muy reducido de genes, 37
en la mayoría de los animales (Wallace, 2005). El resto de las aproximadamente 1500 proteínas que
componen el proteoma mitocondrial (Pagliarini et al., 2008) se encuentran codificadas en el núcleo,
son traducidas por los ribosomas citoplasmáticos e importadas a la mitocondria. Por tanto, la
mitocondria es un orgánulo semiautónomo, ya que para su correcta funcionalidad, mantenimiento
y arquitectura requiere de la contribución tanto del propio genoma mitocondrial como del genoma
nuclear (Garesse and Vallejo, 2001, Kelly and Scarpulla, 2004).
La mitocondria se encuentra presente en la práctica totalidad de las células eucariotas y
desempeña un papel central en el metabolismo celular, puesto que en su interior tienen lugar
procesos metabólicos esenciales como el ciclo de Krebs, la oxidación de los ácidos grasos, el ciclo
de la urea o algunas etapas de la síntesis de aminoácidos y del grupo hemo. Entre todas ellas
cabe destacar la generación de energía química en forma de ATP en el proceso conocido como
fosforilación oxidativa (OXPHOS) (Scheffler, 2001). En los últimos años esta visión se ha ido
ampliando al demostrarse la implicación de la mitocondria en un gran número de procesos celulares
fundamentales como la apoptosis (Tait and Green, 2010), la señalización por calcio (Mammucari et
al., 2011) o la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) (Starkov, 2008).
1.2. Estructura, morfología y distribución de las mitocondrias

La mitocondria es un orgánulo rodeado por una doble membrana que delimita dos
compartimentos, la matriz, situada en el interior de la membrana mitocondrial interna, y el espacio
intermembrana, localizado entre ambas membranas. La membrana mitocondrial externa separa
el orgánulo del citoplasma y es permeable a pequeñas moléculas e iones. Además, esta membrana
cuenta con un transportador, la translocasa de la membrana externa (complejo TOM), que es
la principal vía de entrada a la mitocondria para las moléculas de mayor tamaño (Schmidt et al.,
2010). La membrana mitocondrial interna es mucho menos permeable y necesita la presencia de
transportadores, como OXA1, TIM22 o TIM23, que permiten el paso de proteínas a través de
ella (Schmidt et al., 2010) y de transportadores específicos para metabolitos e iones (Arco and
Satrustegui, 2005).
La membrana mitocondrial interna se encuentra plegada sobre sí misma formando unas
invaginaciones lamelares, denominadas crestas, las cuales incrementan en gran medida su superficie
y aumentan su capacidad funcional. En la membrana mitocondrial interna se ensambla la cadena de
transporte electrónico (CTE), responsable de la síntesis de ATP, razón por la cual aquellas células
38
Introducción
con un mayor requerimiento energético tienen una mayor densidad de crestas mitocondriales.
Tradicionalmente se ha considerado a las mitocondrias como orgánulos discretos, de forma
esférica o alargada y con unas dimensiones de 3-4 μm de largo y 0.5-1 μm de diámetro. Esta visión
de la mitocondria como un orgánulo individual y estático ha ido cambiando y hoy en día está bien
demostrado que las mitocondrias forman un sistema reticular dinámico que va experimentando
cambios en su morfología y distribución mediante continuos eventos de fusión y fisión. La
morfología y la distribución de las mitocondrias en la célula no es resultado del azar, sino que se
encuentran reguladas para ir adaptándose a las necesidades energéticas de la célula (Chan, 2006).
A pesar de esta situación dinámica, la masa mitocondrial se mantiene relativamente
constante entre células del mismo tipo celular. Sin embargo, la cantidad de mitocondrias varía en
los distintos tejidos en función de la demanda energética de cada uno (Fernandez-Vizarra et al.,
2011). Es durante el proceso de biogénesis mitocondrial cuando se dota a cada tejido del número de
mitocondrias con el grado de diferenciación adecuado para satisfacer sus necesidades energéticas
(Fernandez-Moreno et al., 2000).
1.3. Función mitocondrial

Como se ha comentado previamente, en la mitocondria tienen lugar numerosas rutas
metabólicas como el ciclo de Krebs, la β-oxidación de ácidos grasos o la síntesis de aminoácidos y
del grupo hemo. Pero, sin lugar a dudas, la principal función de la mitocondria es la generación de
energía en forma de ATP, pues éste se requiere para la inmensa mayoría de los procesos fisiológicos
de la célula.
En la membrana mitocondrial interna se localiza la cadena de transporte electrónico,
formada por cinco complejos enzimáticos multiheteroméricos responsables de llevar a cabo la
fosforilación oxidativa. Este proceso permite la generación de ATP y calor gracias a la oxidación de
los cofactores reducidos NADH+H+ y FADH2, procedentes del catabolismo de los azúcares y los
ácidos grasos (Wallace and Fan, 2010).
Los electrones provenientes de la oxidación de los cofactores son transferidos a los complejos
de la CTE, concretamente al complejo I (CI, NADH deshidrogenasa) desde el NADH+H+
y al complejo II (CII, succinato deshidrogenasa, SDH) desde el FADH2. Estos electrones son
seguidamente transferidos a la ubiquinona (coenzima Q10, CoQ), que una vez reducida a ubiquinol
(CoQH2) los transfiere al complejo III (CIII, ubiquinol:citocromo c oxidorreductasa) y éste
sucesivamente al citocromo c. Finalmente los electrones llegan al complejo IV (CIV, citocromo
c oxidasa, COX) que los cede al O2 generando H2O (Wallace, 2005). Completan el sistema una
serie de complejos accesorios, como la flavoproteina-ubiquinona oxidorreductasa (ETF-QO) y la
dihidroorotato deshidrogenasa (DHODH), que suministran electrones a la ubiquinona (Smeitink
et al., 2006) (Figura 1).
39
Introducción
La transferencia de electrones de unos complejos a otros se realiza a favor de potencial

oxidorreductor y la energía liberada en el proceso es utilizada por los complejos I, III y IV para
bombear protones al espacio intermembrana, generando un gradiente electroquímico a ambos lados
de la membrana mitocondrial interna. Es la energía acumulada en este gradiente electroquímico
de protones la que se utiliza para la síntesis de ATP. Cuando estos protones regresan a la matriz
mitocondrial a través del complejo V (ATP sintasa) la disipación de energía que se produce es
utilizada por éste para fosforilar el ADP generando ATP (Figura 1) (Wallace and Fan, 2010).
Espacio intermembrana
+ + + + + +
H
H + + H + H + +
H
+ H +
+ H + H H H H H H
+ H H
H
CitC
I Q Q Q III
Q II Q
IV MMI
FTE DHODH
V
O2
FADH 2 FAD
+
H 2O
FADH 2 FAD
H
NADH NAD+ ADP ATP
Matriz mitocondrial
Figura 1. Sistema OXPHOS. Los coenzimas reducidos NADH+H+ y FADH2, provenientes del catabolismo
de los nutrientes celulares, se oxidan y ceden sus electrones a la cadena de transporte electrónico y finalmente
al O2. La energía química acumulada en el gradiente de protones que se genera es utilizada por el complejo V
para la producción de ATP. Los números I al V designan los cinco complejos de la cadena respiratoria. MMI:
membrana mitocondrial interna. FTE: flavoproteina-ubiquinona oxidorreductasa, DHODH: dihidroorotato
deshidrogenasa, CitC: Citocromo c, Q: Ubiquinona.
Por otro lado, el potencial electroquímico generado por el sistema OXPHOS está implicado
en el proceso de termogénesis que tiene lugar en el tejido adiposo marrón. Mediante la acción de la
proteína desacoplante 1 (UCP1) la energía química generada por el gradiente de protones se disipa
en forma de calor (Nicholls, 2001).
Esta energía almacenada en forma de gradiente de H+ es empleada, además, para importar
proteínas a la mitocondria o transportar, a través de la membrana mitocondrial interna, metabolitos
e iones inorgánicos como sodio, fosfato, potasio o calcio. La mitocondria desempeña un papel
fundamental en la homeostasis del calcio, secuestrando Ca2+ cuando su concentración en el
citoplasma es muy elevada (Smeitink et al., 2006).
Durante la fosforilación oxidativa una pequeña proporción de los electrones reacciona
con el oxígeno, transformándolo en ROS (anión superóxido, O2-· y peróxido de hidrógeno, H2O2)
(Jastroch et al., 2010). Aunque elevadas concentraciones de ROS pueden resultar tóxicas para la
célula, en condiciones fisiológicas desempeñan un papel importante como moléculas señalizadoras
implicadas en una gran variedad de respuestas celulares tales como la muerte celular por apoptosis
(Spierings et al., 2005) o la proliferación celular (Owusu-Ansah et al., 2008).
40
Introducción
2. Estructura y metabolismo del genoma mitocondrial
2.1. Estructura y herencia del ADN mitocondrial

Desde su identificación en células de embrión de pollo en 1963 (Nass and Nass, 1963), el
genoma mitocondrial ha sido secuenciado en numerosas especies. Esta secuenciación ha mostrado
que el tamaño y la capacidad codificante del ADNmt son variables, oscilando entre los 67 genes
de Reclinomonas americana a los 3 genes que codifica el ADNmt de Plasmodium falciparum (Gray et al.,
2001).
El genoma mitocondrial es una pequeña molécula circular de ADN de doble cadena, cuyo
tamaño en metazoos oscila entre las 16 y las 20 Kb. En vertebrados codifica exclusivamente 37
genes: 2 ARN ribosómicos (ARNr 12S y 16S), 22 ARN de transferencia (ARNt) y 13 subunidades
estructurales de los complejos OXPHOS, entre las que se incluyen siete subunidades (ND1, ND2,
ND3, ND4L, ND4, ND5 y ND6) de las 45 que forman el complejo I, una subunidad (citocromo
b, Cytb) de las 11 presentes en el complejo III, tres subunidades (COX1, COX2, COX3) de las 13
que constituyen el complejo IV y dos subunidades (ATP6 y ATP8) de las 16 proteínas que forman
el complejo V (Figura 2).
Figura 2. ADN mitocondrial humano. En esta figura se representan los 37 genes codificados por el ADNmt
humano. Los ARNt se representan por el código de una letra del aminoácido correspondiente. En el exterior
se representa la cadena pesada y en el interior la cadena ligera. Se indican las posiciones de los orígenes de
replicación de ambas cadenas (OH y OL), así como los promotores a partir de los cuales se inicia la trascripción
mitocondrial (LSP y HSP).
41
Introducción
Las dos hebras del ADNmt reciben los nombres de cadena pesada (“heavy”, H) y cadena
ligera (“light”, L), debido a la diferente densidad de ambas al ser separadas en gradientes de cloruro
de cesio. En mamíferos, la mayor parte de los genes se encuentran codificados en la cadena pesada
del ADNmt. Sin embargo, esta distribución de los genes no se ha mantenido a lo largo de la escala
evolutiva y hay variaciones en su disposición entre vertebrados e invertebrados.
La estructura del ADNmt es extraordinariamente compacta, los genes no presentan
intrones ni regiones 5’ o 3’ no traducidas (UTR), no hay apenas espacios intergénicos llegando a
solaparse algunos de los genes y, en muchos casos, las adeninas del codón de terminación de la
traducción, UAA, no están codificadas por el ADNmt sino que son añadidas por la maquinaria de
poliadenilación. La mayor región no codificante, denominada D-loop en mamíferos, contiene los
promotores a partir de los cuales se inicia la transcripción de las cadenas pesada y ligera, así como
el origen de replicación de la cadena pesada (OH). La segunda región no codificante del ADNmt
es una secuencia de apenas 30 nucleótidos que contiene el origen de replicación de la cadena ligera
(OL) (Figura 2). Revisado en (Fernandez-Silva et al., 2003).
La molécula de ADNmt se encuentra empaquetada formando parte de unidades
nucleoproteicas independientes, llamadas nucleoides por su analogía con los cromosomas
bacterianos. Los nucleoides constituyen la unidad de transmisión y herencia del ADNmt (Spelbrink,
2010). La proteína mayoritaria encargada de empaquetar y organizar los nucleoides es el TFAM
(factor de transcripción mitocondrial A), miembro de la familia de proteínas HMG (“High Mobility
Group”, dominio de alta movilidad electroforética) de unión a ADN (Kukat et al., 2011). La proteína
TFAM y su homólogo en levadura Abf2p recubren la molécula de ADNmt, uniéndose a ella cada
10-20 pb, y son esenciales para su mantenimiento y estabilidad (Larsson et al., 1998, Kanki et al.,
2004). En diferentes estudios se han identificado, además, otras proteínas asociadas al nucleoide,
principalmente proteínas de la maquinaria de replicación y transcripción mitocondrial, como la
ADN polimerasa mitocondrial (Pol γ), la helicasa mitocondrial (TWINKLE), la proteína de unión
a cadena sencilla (mtSSB) o el factor de transcripción B2 (mtTFB2) (Garrido et al., 2003), que
sugieren que es en los nucleoides donde se replica y transcribe el ADNmt.
El hecho de que el ADNmt se encuentre compartimentalizado fuera del núcleo hace que
su herencia sea diferente a la de los genes nucleares. El genoma mitocondrial es poliploide y dentro
de la misma célula pueden coexistir distintas variantes del mismo (heteroplasmia) o ser todas
idénticas (homoplasmia). Estas moléculas de ADNmt pueden replicar de manera independiente
al ciclo celular y se segregan al azar durante la mitosis, dando como resultado células hijas con
distinto contenido de ADNmt, fenómeno que se conoce como segregación mitótica. Además, en
mamíferos el ADNmt se hereda exclusivamente por vía materna, mientras que el ADNmt paterno
se pierde durante las primeras rondas de replicación del embrión (Hutchison et al., 1974).
42
Introducción
2.2. Replicación del ADN mitocondrial

La replicación del ADNmt sucede de manera continua a lo largo del ciclo celular y de
forma independiente a la replicación del ADN nuclear (ADNn) (Bogenhagen and Clayton, 1977).
En procesos como la embriogénesis o la diferenciación celular el ADNmt replica más de una
vez en cada ciclo celular, mientras que en ocasiones sólo replica una pequeña subpoblación del
ADNmt, como ocurre en la oogénesis (Wai et al., 2008). Sin embargo, trabajos recientes han
descrito evidencias que sugieren que, además, el ADNn y el ADNmt podrían replicarse de manera
coordinada (Ruiz De Mena et al., 2000, Martinez-Diez et al., 2006, Lee et al., 2007).
Maquinaria basal de replicación del ADN mitocondrial

Mientras que la maquinaria responsable de la replicación del ADN nuclear es muy sofisticada,
el número de proteínas esenciales para la replicación del ADNmt es comparativamente pequeño.
Recientemente, se ha reconstituido in vitro el replisoma mínimo necesario para la replicación
del ADNmt en mamíferos. Está constituido por la ADN polimerasa γ, la helicasa mitocondrial
TWINKLE y la proteína de unión a ADN de cadena sencilla o mtSSB, que aumenta la procesividad
de las anteriores. In vitro estas tres proteínas son capaces de sintetizar ADN de cadena sencilla
a partir de un molde de ADN de doble cadena hasta niveles similares a los observados in vivo
(Korhonen et al., 2004).
La ADN polimerasa γ es la única polimerasa encargada de la replicación, recombinación
y reparación del ADN en la mitocondria de animales (Kaguni, 2004). Pertenece a la familia A de
ADN polimerasas, compuesta por enzimas replicativas y con actividad reparadora, entre las que
se encuentra la ADN polimerasa I de Escherichia coli (Shutt and Gray, 2006a). La ADN polimerasa
γ está compuesta por una subunidad catalítica, Pol γ-α o POLG, que posee actividad polimerasa y
correctora, y una subunidad accesoria, Pol γ-β o POLG2, que aumenta la actividad catalítica y la
procesividad de la Pol γ-α. En Drosophila estas dos subunidades forman un heterodímero, mientras
que la ADN polimerasa de mamíferos es un heterotrímero formado por una subunidad catalítica
y dos accesorias (Kaguni, 2004).
La subunidad catalítica tiene un tamaño de 125-140 KDa. Además de la actividad
polimerizante, esta subunidad del enzima presenta actividad correctora 3’-5’ exonucleasa y
actividad 5’-deoxirribosa fosfato liasa, necesaria para la reparación del ADN (Longley et al., 1998).
La subunidad accesoria tiene un tamaño de 35-55 KDa y presenta una gran homología estructural
y de secuencia con las aminoacil-ARNt sintetasas de clase IIa. La unión de la subunidad accesoria
cambia la conformación de la POLG permitiendo que interaccione con una mayor región del
ADN molde, aumentando así su procesividad (Carrodeguas et al., 1999).
La helicasa mitocondrial TWINKLE comparte una gran homología de secuencia con
la proteína helicasa/primasa codificada por el gen 4 (gp4) del bacteriófago T7. Sin embargo,
43
Introducción
TWINKLE no posee el dominio N-terminal de gp4 que es el que le confiere la actividad primasa
(Spelbrink et al., 2001). La función de la helicasa es desenrollar la doble hélice del ADN, rompiendo
los enlaces de hidrógeno que mantienen apareadas las dos cadenas de la molécula de ADNmt para
permitir el paso de la ADN polimerasa sobre la cadena molde (Korhonen et al., 2003).
La mtSSB es una proteína de 13-16 KDa con una gran homología de secuencia con la SSB
de E. coli. Durante la replicación del ADN, la doble hélice se desenrolla y las dos hebras quedan
expuestas, a ellas se unen las proteínas de cadena sencilla para prevenir su renaturalización o la
degradación por nucleasas. La mtSSB, además, aumenta la actividad y procesividad de POLG y la
actividad helicasa de TWINKLE (Korhonen et al., 2003, Oliveira and Kaguni, 2011).
2.3. Transcripción del ADN mitocondrial

A diferencia del ADN nuclear o el ADN bacteriano, que son transcritos por ARN polimerasas
multiméricas, el ADNmt se transcribe por una única ARN polimerasa monomérica (POLRMT),
homóloga a las ARN polimerasas de los fagos T3 y T7 (Shutt and Gray, 2006a). En mamíferos
la transcripción del ADNmt requiere además de la presencia de dos factores de transcripción,
el factor de transcripción mitocondrial A (TFAM) y el factor de transcripción mitocondrial B2
(mtTFB2) (Litonin et al., 2010, Shutt et al., 2010).
Además de su función en el mantenimiento y la estabilidad del genoma mitocondrial,
el TFAM forma parte de la maquinaria basal de transcripción mitocondrial. TFAM se une a las
regiones “upstream” de los promotores del ADNmt y recluta al heterodímero POLRMT-mtTFB2,
activando así la transcripción (Falkenberg et al., 2002, Gaspari et al., 2004).
El factor de transcripción mitocondrial B2 presenta una gran homología con las ARNr
dimetiltransferasas de bacterias y es esencial para activar la transcripción mitocondrial tanto in vitro
como in vivo (Falkenberg et al., 2002, Matsushima et al., 2004, Adan et al., 2008). En eucariotas
superiores existe un homólogo de mtTFB2, el factor de transcripción mitocondrial B1 (mtTFB1).
Tanto mtTFB1 como mtTFB2 retienen la capacidad de metilar el ARNr in vitro, como sus homólogas
las ARNr dimetiltrasferasas procariotas, pero mtTFB1 presenta una mayor actividad metiltransferasa
que mtTFB2 (Cotney and Shadel, 2006). In vitro, mtTFB1 también estimula la transcripción del
ADNmt, aunque los niveles de activación son mucho menores que los obtenidos con mtTFB2.
Por esta razón, inicialmente mtTFB1 fue considerado como parte de la maquinaria de transcripción
del ADNmt (Falkenberg et al., 2002). Sin embargo, varios trabajos han demostrado que mtTFB1
in vivo no interviene en la transcripción del ADNmt, sino que es una ARNr metiltrasferasa esencial
para la estabilidad de los ribosomas mitocondriales (Matsushima et al., 2005, Metodiev et al., 2009).
La transcripción de las dos hebras del ADNmt se inicia en el D-loop. En esta región se
encuentran los promotores para las cadenas pesada y ligera, conocidos como HSP (“heavy strand
promoter”) y LSP (“light strand promoter”) respectivamente. La transcripción de la cadena ligera genera
44
Introducción
un único ARNm policistrónico que cubre la práctica totalidad de la molécula, mientras que la cadena
pesada se transcribe desde dos sitios de inicio muy próximos, H1 y H2, que generan dos transcritos
solapantes, un primero que incluye los dos ARNr y un segundo que, además de los ARNr, contiene
todos los genes codificados en la cadena pesada (Montoya et al., 1982, Montoya et al., 1983).
Estos ARNm policistrónicos son posteriormente procesados mediante cortes endonucleolíticos
a ambos lados de los ARNt, que actúan como puntos de reconocimiento entre los genes para su
procesamiento (Ojala et al., 1981).
La terminación de la transcripción la lleva a cabo una familia de factores de terminación
conocidos como MTERF. Esta familia de proteínas está compuesta por cuatro subfamilias,
MTERF1-MTERF4, que no sólo son responsables de la terminación de la transcripción sino que
desempeñan funciones heterogéneas que van desde la regulación de su iniciación a la represión de
la transcripción (Roberti et al., 2009).
2.4. Traducción mitocondrial

Aunque la mayor parte del proteoma mitocondrial está codificado en el ADN nuclear, 13
de sus proteínas están codificadas en el ADNmt y son sintetizadas por la maquinaria de traducción
mitocondrial. A pesar de que conserva cierta similitud con el sistema de traducción procariota, el
sistema mitocondrial de síntesis de proteínas posee características propias que lo diferencian tanto
del sistema de traducción bacteriano como del citoplásmico de las células eucariotas. En primer
lugar, el genoma mitocondrial posee un código genético propio, distinto del universal. Además, los
ARNm mitocondriales no poseen CAP ni 5’UTR y su cola de poli(A) se localiza inmediatamente
tras el codón de terminación o incluso forma parte de él (Grohmann et al., 1978, Montoya et al.,
1981, Ojala et al., 1981).
De todas las proteínas que componen la maquinaria de traducción mitocondrial, tan
solo los ARNr 12S y 16S que forman el ribosoma mitocondrial y los ARNt están codificados
en el ADNmt. El resto de componentes, incluyendo aproximadamente 80 proteínas ribosomales
(MRPs), las aminoacil-ARNt sintetasas y los factores de iniciación, elongación y terminación de la
traducción, están codificados en el genoma nuclear y son importados al interior de la mitocondria.
En mamíferos se han identificado dos factores de iniciación de la traducción, mtIF2 y mtIF3
(Ma and Spremulli, 1995, Koc and Spremulli, 2002), cuatro factores de elongación, mtEF-Tu,
mtEF-Ts, mtEFG1 y mtEFG2 (Ling et al., 1997, Xin et al., 1995, Hammarsund et al., 2001), y tres
factores de terminación mitocondriales, mtRF1, mtRF1a y mtRRF (Zhang and Spremulli, 1998,
Soleimanpour-Lichaei et al., 2007).
Regulación de la traducción mitocondrial

En la levadura Saccharomyces cerevisiae se han identificado factores que activan de modo
específico la traducción de prácticamente todas las proteínas codificadas en el ADNmt. Entre
45
Introducción
ellos se han identificado dos proteínas, Mss551 y Pet309, necesarias para la traducción de COX1,
una proteína, Pet111, necesaria para la traducción de COX2, y tres más, Pet54, Pet122 y Pet493,
implicadas en la traducción de COX3 (Towpik, 2005, Soto et al., 2011).
Los ARNm mitocondriales de levadura sí que presentan una región 5’UTR, a la cual se unen
estos activadores traduccionales, probablemente para favorecer el reconocimiento de los codones
de inicio por parte de los mitorribosomas. Todos ellos son proteínas integrales de la membrana
mitocondrial interna o se encuentran asociados a ella, sugiriendo que, además de intervenir en
la activación de la traducción, están implicadas en el anclaje de la maquinaria de traducción a la
membrana. De esta manera se facilita la inserción en la membrana mitocondrial interna de los
polipéptidos recién sintetizados y su posterior ensamblaje para formar los complejos OXPHOS
(Soto et al., 2011).
En mamíferos los mecanismos de regulación de la traducción son aún poco conocidos. Los
activadores traduccionales de levadura tienen una secuencia poco conservada, lo que dificulta la
identificación de sus ortólogos en mamíferos y, como se ha comentado previamente, los ARNm
de mamíferos no poseen región 5’UTR, sugiriendo que la regulación de la síntesis de proteínas
mitocondriales sigue un mecanismo diferente al descrito en levaduras (Smits et al., 2010, Soto et
al., 2011).
Recientemente se ha identificado el homólogo en humanos de Pet309, LRPPRC, en un
paciente con la variante franco-canadiense del síndrome de Leigh (FCLS) (Mootha et al., 2003).
LRPPRC pertenece a la familia PPR (“pentatricopeptide repeat”), cuyos miembros participan en el
procesamiento, splicing o control traduccional del ARN. LRPPRC es necesario para la estabilidad
de los ARNm mitocondriales maduros, afectando especialmente a los ARNm de COX1, COX2
y COX3, las subunidades del complejo IV codificadas en el ADNmt (Sasarman et al., 2010,
Ruzzenente et al., 2011). Además de LRPPRC, se han descrito otras proteínas pertenecientes a
la misma familia, como PTCD1, PTCD2 o PTCD3, que actuarían también como moduladores
específicos post-transcripcionales de los ARNm mitocondriales (Rackham et al., 2009, Xu et al.,
2008, Davies et al., 2009).
El primer activador traduccional específico de una proteína mitocondrial de mamíferos
se identificó en 2009 en un paciente con síndrome de Leigh (LS) y un déficit aislado en la
actividad del complejo IV (Weraarpachai et al., 2009). Esta nueva proteína, CCDC44 o TACO1
(“Translational Activator of COX1”), actúa como un activador específico de la traducción de COX1
en la mitocondria de humanos. En ausencia de TACO1, la síntesis de COX1 disminuye y aparecen
productos truncados, indicando que TACO1 podría estar asegurando un inicio correcto de la síntesis
de COX1 o estabilizando el polipéptido naciente y garantizando que se completa su traducción.
Curiosamente, el “knock-out” de YGR021W, su ortólogo en levaduras, no presenta ningún defecto
mitocondrial.
46
Introducción
La identificación de nuevas proteínas reguladoras de la traducción y la caracterización de

su mecanismo de acción permitirán un mayor conocimiento sobre la regulación de la traducción
mitocondrial de mamíferos.
3. Biogénesis de los complejos de la cadena respiratoria
Una vez traducidas las proteínas codificadas en el ADNmt, éstas tienen que ensamblarse
en la membrana mitocondrial interna junto con las proteínas codificadas en el ADNn, que han
sido importadas a la mitocondria, para formar los complejos OXPHOS. El ensamblaje del sistema
de fosforilación oxidativa es un proceso complejo en el que intervienen un gran número de
chaperonas, proteasas y factores de ensamblaje que ayudan a la correcta formación de cada uno de
los complejos (Fernandez-Vizarra et al., 2009).
3.1. Inserción de las proteínas en la membrana mitocondrial interna

Las proteínas codificadas en el ADNmt son altamente hidrofóbicas y tienden a formar
agregados en ambientes hidrofílicos. Para evitarlo, durante su síntesis en el interior de la mitocondria,
estas proteínas se insertan en la membrana mitocondrial interna de forma co-traduccional, es decir, a
medida que van siendo sintetizadas por los ribosomas. Por esta razón, los ribosomas mitocondriales
se encuentran próximos a la membrana mitocondrial interna y se ha propuesto que únicamente son
activos aquellos que se encuentran anclados (Liu and Spremulli, 2000, Smits et al., 2010).
En S. cerevisiae, se han identificado dos proteínas, Oxa1 y Mba1, responsables del anclaje de
los ribosomas a la membrana mitocondrial interna. Oxa1, miembro de la familia Alb3/Oxa1/YidC,
es una proteína integral de membrana cuyo extremo C-terminal interacciona con la subunidad
grande del ribosoma (Szyrach et al., 2003, Jia et al., 2003). Oxa1 coopera con Mba1, una proteína
asociada a la membrana mitocondrial interna, que actúa como receptor de los ribosomas y facilita
su colocación en la orientación correcta para la inserción de los polipéptidos nacientes en la
membrana (Ott et al., 2006).
Se ha identificado el homólogo en humanos de Oxa1, denominado OXA1L. La
sobreexpresión de esta proteína es capaz de complementar el defecto de COX de una cepa de S.
cerevisiae que porta mutaciones en el gen oxa1, sugiriendo que la proteína humana y la de levadura
desempeñan funciones parecidas (Bonnefoy et al., 1994).
Por otro lado, y como se ha comentado anteriormente, los activadores de la traducción
descritos en mitocondria son proteínas de membrana que se unen a los ARN que están siendo
traducidos, facilitando también el anclaje de la maquinaria de traducción a la membrana. Este
acoplamiento de la síntesis de proteínas con la inserción de los polipéptidos en la membrana
favorece la eficiencia del ensamblaje de los complejos de la cadena respiratoria.
47
Introducción
3.2. Ensamblaje de los complejos de la cadena respiratoria

Cada uno de los complejos de la cadena respiratoria tiene una ruta específica de ensamblaje,
mediante la cual se van uniendo las distintas subunidades que lo componen hasta formar el
complejo totalmente ensamblado. En el ensamblaje de cada complejo intervienen chaperonas
que no forman parte del complejo maduro, pero que son esenciales para su correcta formación:
los factores de ensamblaje.
Hasta la fecha se han identificado factores de ensamblaje para los cinco complejos y la lista
se encuentra en continuo crecimiento. En humanos se han identificado NDUFA12L, NDUFAF1,
NDUFAF2, NDUFAF3, NDUFAF4, C6ORF66, Ecsit, C8ORF38, C20ORF7, AIF o IND1 que
participan en el ensamblaje del complejo I, SDHAF1 y SDHAF2 que participan en la formación
del complejo II, BCS1L y TTC9 que participan en el ensamblaje del complejo III y ATP11 y
ATP12 que intervienen en la formación del complejo V. Entre los factores de ensamblaje del
complejo IV caracterizados hasta la fecha se encuentran SURF1, COX15, COX10, SCO1, SCO2
o COX17. Defectos en cualquiera de estas proteínas tienen como consecuencia un bloqueo en el
ensamblaje del complejo, dando como resultado una disminución del mismo y en muchos casos
una acumulación de los intermediarios de ensamblaje o subcomplejos (Fernandez-Vizarra et al.,
2009, Diaz et al., 2011).
Los complejos ya ensamblados no se encuentran distribuidos al azar en la membrana
mitocondrial interna, sino que se encuentran formando unas estructuras supramoleculares
denominadas supercomplejos (Schagger and Pfeiffer, 2000). En la mitocondria de mamíferos,
prácticamente todo el complejo I se encuentra formando parte de supercomplejos que contienen
el CI y el CIII (I1III2) o el CI, CIII y CIV (I1III2IV0-4), mientras que los complejos II y IV se
encuentran en su mayoría como entidades individuales (Schafer et al., 2006). Los supercomplejos
son unidades funcionales que llevan a cabo la respiración, probablemente dando estabilidad a
los complejos individuales y permitiendo una mayor eficiencia en el paso de los electrones de un
complejo a otro (Schafer et al., 2006, Acin-Perez et al., 2008).
3.3. Biogénesis de la citocromo c oxidasa
Estructura de la citocromo c oxidasa

Como se ha comentado previamente, la citocromo c oxidasa es el complejo de la cadena
respiratoria responsable de transferir los electrones del citocromo c al O2. La citocromo c oxidasa
bovina fue el primer complejo de la cadena respiratoria en ser cristalizado y su estructura fue resuelta
a 2.8 Å. En mamíferos, COX es un complejo de unos 200 KDa formado por 13 subunidades:
COX1, COX2 y COX3, codificadas en el ADNmt, y COX4, COX5a, COX5b, COX6a, COX6b,
COX6c, COX7a, COX7b, COX7c y COX8, codificadas en el ADNn (Tsukihara et al., 1996).
48
Introducción
COX es activa en forma de dímero y requiere varios grupos prostéticos para llevar a cabo su
función, dos grupos hemo (a y a3), dos centros de cobre (CuA y CuB) y átomos de zinc y magnesio.
Tanto el hemo a como el centro binuclear hemo a3-CuB se encuentran incluidos en COX1, mientras
que el centro de cobre CuA está incluido en COX2. COX5b contiene un átomo de Zn2+ y entre
COX1 y COX2 se localiza un átomo de Mg2+ (Tsukihara et al., 1995).
Las subunidades COX1, COX2 y COX3 constituyen el centro catalítico del enzima. COX1
y COX2 llevan a cabo las reacciones redox de transferencia de electrones desde el citocromo c al
O2, mientras que COX3 interviene en la translocación de 2 H+ al espacio intermembrana por cada
electrón transferido (Belevich et al., 2006). El resto de subunidades que componen el complejo IV
participan en la regulación de la actividad y dan estabilidad al complejo totalmente ensamblado (Li
et al., 2006, Galati et al., 2009, Pierron et al., 2011).
Ensamblaje de la citocromo c oxidasa

El ensamblaje del complejo IV es un proceso lineal que se caracteriza por la incorporación
de forma ordenada y secuencial de las distintas subunidades y cofactores que lo forman. A lo largo
del ensamblaje aparecen tres intermediarios, conocidos como S1, S2 y S3, que muy probablemente
representan los pasos limitantes del proceso (Nijtmans et al., 1998).
El primer paso en el ensamblaje de COX consiste en la inserción de COX1 en la membrana
mitocondrial interna, formando lo que se conoce como subcomplejo S1, al cual se unen los cofactores
hemo a, hemo a3 y CuB. Este paso va seguido de la incorporación de COX4 y COX5a, formando el
segundo intermediario de ensamblaje, S2 (Antonicka et al., 2003a, Antonicka et al., 2003b, Williams
et al., 2004). A continuación, COX2 unido a su grupo prostético CuA se une al subcomplejo S2.
La unión de COX2 desencadena una cascada rápida de incorporación de proteínas, empezando
por COX3, para dar lugar al subcomplejo S3. Este subcomplejo está formado por prácticamente
todas las proteínas del complejo IV excepto COX6a, COX6b y bien COX7a o COX7b (Williams
et al., 2004, Stiburek et al., 2005, Massa et al., 2008). La unión de estas subunidades completa la
formación del holoenzima monomérico, también llamado S4 (Figura 3) (Nijtmans et al., 1998).
Posteriormente, se produce la dimerización del monómero de COX. El dímero, considerado la
forma activa del enzima, está formado por dos monómeros conectados por una molécula de
cardiolipina (Fernandez-Vizarra et al., 2009).
49
Introducción
COX5b, COX6c
COX4 COX2 COX7a/b, COX6a, COX6b
COX5a COX1
S1 S2 S3 S4
COX7c, COX8 COX7a/b
COX4
Surf1 ? Surf1 ?
COX1 COX5a COX2 COX2

COX6b
COX1
COX1
COX4
COX3 COX1
COX3
COX7c
COX7c
COX6a
COX4
COX2
COX4
COX8
COX3
COX8
COX5a COX7a
CuB COX5b COX5a
Hemo a
COX monomerica
COX11
COX15 COX17
COX10
CuA
SCO1
SCO2
COX17
Figura 3. Ensamblaje del complejo IV en humanos. Las subunidades que componen el complejo IV se
van ensamblando de forma secuencial y ordenada. Están representados los tres intermediarios de ensamblaje
del complejo IV (S1, S2 y S3) así como el monómero de COX totalmente ensamblado (S4). Asimismo se han
indicado los factores de ensamblaje principales que intervienen en cada paso. Adaptado de (Fernandez-Vizarra
et al., 2009).
En S. cerevisiae se han identificado más de 20 proteínas accesorias y factores de ensamblaje

necesarios para que la formación del complejo IV se produzca de forma correcta. A pesar de que en
humanos se encuentran ortólogos para muchas de ellas, el conocimiento que tenemos del proceso
de ensamblaje del complejo IV es aún incompleto y quedan por identificar muchos factores que
intervienen en él (Barrientos et al., 2009).
El primer factor de ensamblaje identificado en humanos fue SURF1, una proteína integral
de la membrana mitocondrial interna de unos 30 KDa. Desde su identificación en 1998 se han
descrito más de 40 mutaciones patogénicas en este gen en pacientes de síndrome de Leigh con
déficit de COX (Tiranti et al., 1998, Zhu et al., 1998). Estos pacientes presentan bajos niveles de
complejo IV totalmente ensamblado y una acumulación de los subcomplejos S1 y S2. Aunque se
desconoce su función exacta, esta acumulación de S1 y S2 indica que SURF1 estaría participando
en las primeras etapas del ensamblaje de COX, probablemente antes de la incorporación de COX2
al complejo (Tiranti et al., 1999b, Coenen et al., 1999, Stiburek et al., 2005).
El homólogo de SURF1 en levaduras, Shy1p, participa en distintos pasos de la formación
del complejo IV que van desde la traducción de Cox1p, al ensamblaje de COX o la formación de
los supercomplejos III+IV (Mick et al., 2007).
Existen ortólogos de SURF1 en numerosos procariotas en los que COX únicamente está
compuesto por las tres subunidades que constituyen el centro catalítico, apoyando que SURF1
participe en la formación del mismo. En bacterias, SURF1 es capaz de unir hemo y es esencial
para el mantenimiento de éste en el centro activo de COX, por lo que se ha propuesto que SURF1
podría estar participando en la inserción del hemo a en COX1 o la estabilización del centro hemo
a3-CuB (Smith et al., 2005, Hannappel et al., 2011).
50
Introducción
Los pasos finales de la síntesis de este grupo hemo a están catalizados por los enzimas
COX10 y COX15, localizados en la membrana mitocondrial interna. COX10 es una hemo
a:farnesiltransferasa que cataliza la conversión del protohemo (hemo b) a hemo o. COX15, a su vez,
transforma este hemo o en hemo a, el grupo prostético de COX.
Se han asociado mutaciones en COX10 y COX15 a numerosos fenotipos como
leucodistrofia, tubulopatía renal, cardiomiopatía infantil severa o síndrome de Leigh (Valnot et
al., 2000b, Antonicka et al., 2003a, Antonicka et al., 2003b). Estos pacientes presentan muy bajos
niveles de hemo a y de complejo IV totalmente ensamblado y no acumulan ningún intermediario
de ensamblaje, sugiriendo que la incorporación del grupo hemo en COX1 tiene lugar antes de la
formación del subcomplejo S2 (COX1-COX4-COX5a) (Antonicka et al., 2003a, Antonicka et al.,
2003b, Coenen et al., 2004).
Además de la incorporación del grupo hemo en COX1, un paso fundamental en
la maduración de COX1 y COX2 es la formación de sus centros de cobre CuB y CuA. Para su
incorporación en COX, el cobre, que se encuentra almacenado en la matriz mitocondrial, tiene que
ser transportado hasta el espacio intermembrana (IMS, “intermembrane space”). En el IMS se localiza
COX17, una metalochaperona con un dominio CCxC de unión a cobre, que une los átomos de
Cu2+ y se encarga de transferirlos a COX11, SCO1 y SCO2, las chaperonas responsables de su
inserción en los centros de cobre de COX1 y COX2 (Horng et al., 2004, Leary et al., 2009, Leary,
2010).
Para la formación de CuB, es aceptado que COX17 transfiere los átomos de cobre a COX11
que, a su vez, facilita la inserción de los mismos en COX1. Sin embargo, el mecanismo exacto de
cómo se produce esta transferencia es aún desconocido (Figura 4) (Hiser et al., 2000).
SCO1 y SCO2 son dos metalochaperonas con una gran homología de secuencia, responsables
de la formación del centro de cobre CuA en COX2. A pesar de su gran similitud, son necesarios
ambos factores SCO para la formación del complejo IV, proceso en el que desempeñan funciones
cooperativas pero independientes. Mutaciones en cualquiera de estos genes producen un déficit
severo de COX que causa encefalocardiomiopatía neonatal, fallo hepático o coma cetoacídico. En
estos pacientes se acumula el subcomplejo S2, indicando que la unión del cobre a COX2 es esencial
para que prosiga el ensamblaje del complejo IV (Papadopoulou et al., 1999, Valnot et al., 2000a,
Leary et al., 2004).
SCO1 y SCO2 son proteínas integrales de la membrana mitocondrial interna, que presentan
un motivo Cx3C de unión a cobre expuesto hacia el espacio intermembrana. SCO1 y SCO2 reciben
el cobre de COX17 y tras su unión a COX2, le transfieren, de forma simultánea o secuencial,
los dos átomos que formarán el centro de cobre CuA (Horng et al., 2005, Cobine et al., 2006,
Banci et al., 2008). Tras la transferencia del cobre a COX2, SCO2 actúa como una tiol-disulfuro
oxidorreductasa que reoxida las cisteínas de SCO1, permitiendo así que ambos SCO vuelvan a
51
Introducción
recibir cobre de COX17 y comience un nuevo ciclo (Figura 4). Adicionalmente, se ha demostrado
que SCO2 es esencial para la síntesis de COX2 (Leary et al., 2009).
S S S S
COX2
SCO1
SCO2
S S
COX2
SCO2
S S S S
S S S S
SCO1
SCO2
COX2
SCO1
SCO2
COX1 COX11
COX17
S S SH SH
SCO1 S S SH SH
SCO2
COX2
SCO1
SCO2
SH SH S S
COX2
SCO1
SCO2
COX2
Figura 4. Formación de los centros de cobre de COX1 y COX2 en humanos. En la figura se muestran
esquemáticamente los pasos necesarios para la formación de CuA y CuB. Para la formación de CuB, COX17
transfiere el cobre (círculo naranja) a COX11 y éste a su vez, lo transfiere a COX1. La formación del centro de
cobre CuA la llevan a cabo SCO2 y SCO1 que, a través de las reacciones redox mostradas en la figura, transfieren
cada una un átomo de cobre a COX2. Adaptado de (Leary et al., 2009).
En el IMS se encuentran, además, otras proteínas con dominios Cx9C como COX19,
COX23, CMC1 y CMC2, cuyos homólogos en levadura también intervienen en el transporte de
cobre desde la matriz hasta el complejo IV, aunque su función no está aún bien caracterizada
(Longen et al., 2009, Soto et al., 2011). Recientemente, se ha identificado en dos pacientes con
cardiomiopatía neonatal una mutación en C2orf64. C2orf64 presenta dos motivos Cx9C y es el
homólogo en humanos de Pet191p, un factor de ensamblaje del complejo IV en levaduras. En
estos pacientes se acumula el subcomplejo S1, indicando que C2orf64 también es esencial para el
ensamblaje del complejo IV en células humanas (Huigsloot et al., 2011).
Además de todos estos factores, se han identificando los homólogos en humanos de otros
factores de ensamblaje de S. cerevisiae, como es el caso de COX18 y COX20, las chaperonas de
COX2, aunque su función en humanos aún no ha sido caracterizada.
A pesar de los avances, nuestro conocimiento sobre la biogénesis del complejo IV es aún
incompleto. Es de una gran relevancia la búsqueda de nuevos factores que participan en este
proceso y el estudio de sus mecanismos de regulación ya que, como se ha comentado previamente,
defectos en la formación de este complejo son la causa de un gran número de patologías humanas
(Soto et al., 2011).
52
Introducción
4. Patología mitocondrial
Dado el papel central que la mitocondria desempeña en la fisiología celular, no es de extrañar

que defectos en la función mitocondrial y, en particular, defectos en la síntesis de ATP sean la
causa de un amplio número de patologías. Las enfermedades mitocondriales son un conjunto
de patologías heterogéneas, generalmente multisistémicas, que afectan a aquellos tejidos con una
mayor demanda energética como cerebro, músculo o corazón. Entre las presentaciones clínicas
se incluyen miopatías, cardiomiopatías, demencia, disfunción renal, fallo hepático, ataxia, ceguera
o sordera. Las particulares características de la genética mitocondrial hacen que un determinado
fenotipo pueda estar causado por distintas mutaciones y a su vez, una misma mutación puede
causar distintos fenotipos (Wallace, 2010). Debido al amplio espectro de presentaciones clínicas y a
la dificultad de asociar fenotipo y genotipo es difícil calcular la prevalencia de estas enfermedades,
aunque se estima que en su conjunto afectan a uno de cada 5000 nacidos (Schaefer et al., 2008).
Debido al origen dual del proteoma mitocondrial, las enfermedades mitocondriales pueden
estar causadas por mutaciones en los genes codificados en el ADNmt o mutaciones en los genes
nucleares que codifican proteínas de destino mitocondrial. Hasta la fecha se han descrito más de 150
mutaciones que afectan a todos los genes codificados en el ADNmt, los 22 ARNt, los 2 ARNr y los 13
genes que codifican subunidades estructurales de los complejos OXPHOS (http://www.mitomap.
org). Por otro lado, las mutaciones en el ADNn pueden afectar a genes que codifican subunidades
estructurales de los complejos de la cadena respiratoria, a genes que codifican la maquinaria de
importación mitocondrial y los factores de ensamblaje, a genes implicados en el mantenimiento y
la expresión del ADNmt o a genes implicados en la dinámica y mantenimiento de las membranas
mitocondriales. Se estima que estos defectos en el ADNn constituyen aproximadamente el 80-85%
de las enfermedades mitocondriales (Calvo and Mootha, 2010).
Los déficits del complejo IV son uno de los defectos más comunes de la cadena respiratoria.
Los déficit aislados de COX se pueden deber a mutaciones en cualquiera de las subunidades
estructurales del complejo, ya estén codificadas en al ADNmt o en el núcleo, o a mutaciones en
alguno de sus factores de ensamblaje o traducción (Diaz, 2010).
Hasta la fecha se han descrito mutaciones en COX1, COX2 y COX3, las tres subunidades de
COX codificadas en el ADNmt. A pesar de que en todos los pacientes están afectados el ensamblaje
o la estabilidad del complejo IV, sus presentaciones clínicas varían desde miopatía, esclerosis lateral
amiotrófica o encefalomiopatía, hasta MELAS (miopatía mitocondrial con encefalopatía, acidosis
láctica y accidentes cerebrovasculares) o anemia sideroblástica (Manfredi et al., 1995, Gattermann
et al., 1997, Comi et al., 1998, Clark et al., 1999). La primera mutación en un gen estructural del
complejo IV codificado en el ADNn se identificó en 2008 en dos hermanos con una encefalopatía
infantil severa que portaban una mutación en COX6b1 (Massa et al., 2008).
53
Introducción
La mayor parte de las enfermedades que cursan con deficiencia aislada de COX se deben a
mutaciones en genes que intervienen en la biogénesis de este complejo. El síndrome de Leigh fue
la primera enfermedad mitocondrial en que se identificó un defecto de COX de origen nuclear. Los
pacientes de LS sufren una neurodegeneración progresiva fatal de inicio temprano. Estos pacientes
presentan lesiones necróticas en áreas subcorticales del cerebro y desarrollan oftalmoparesis,
nistagmo, ataxia, distonía y atrofia óptica. Aunque las mutaciones en SURF1 son la principal causa
de síndrome de Leigh, se han descrito también mutaciones en COX10, COX15 y el factor de
traducción TACO1 como causantes de esta enfermedad (Tiranti et al., 1998, Zhu et al., 1998,
Coenen et al., 2004, Oquendo et al., 2004, Weraarpachai et al., 2009). Mutaciones en LRPPRC, a su
vez, producen una variante menos severa de esta enfermedad, conocida como la variante franco-
canadiense del síndrome de Leigh por ser exclusiva de la región de Quebec (Mootha et al., 2003).
Como hemos comentado anteriormente, mutaciones en un mismo gen pueden ser causantes
de distintos fenotipos. Aunque las mutaciones en SURF1 producen generalmente síndrome de Leigh,
se han identificado dos casos en los que los pacientes presentaban leucodistrofia (Rahman et al.,
2001) o hipertricosis (Von Kleist-Retzow et al., 2001). Éste es también el caso de COX10 y COX15,
ya que mutaciones en estos genes han sido descritas además como causantes de cardiomiopatía,
leucodistrofia, tubulopatía o cardiomiopatía hipertrófica (Valnot et al., 2000b, Antonicka et al.,
2003b, Coenen et al., 2004).
Por otro lado, mutaciones en SCO1 y SCO2, responsables de la formación del centro de
cobre de COX2, son causantes de cardiomiopatía hipertrófica y encefalomiopatía (Papadopoulou
et al., 1999, Stiburek et al., 2009). Aunque también se ha descrito una mutación en SCO1 en un
paciente que presentaba hepatopatía y coma cetoacídico (Valnot et al., 2000a). Recientemente se
ha identificado una mutación en un nuevo factor de ensamblaje del complejo IV, C2orf64, en dos
hermanos que presentaban cardiomiopatía hipertrófica (Huigsloot et al., 2011).
A pesar de los avances alcanzados en los últimos años, aún se desconoce la causa genética
de la mayor parte de las enfermedades causadas por defectos en el complejo IV. La identificación
de nuevos genes implicados en este proceso será fundamental para el diagnóstico de estos pacientes
y para completar el conocimiento que tenemos de la formación de COX.
5. Drosophila melanogaster como sistema modelo para el estudio

de la fisiopatología mitocondrial
Drosophila melanogaster constituye un excelente modelo para el estudio de procesos biológicos

complejos ya que es fácilmente manejable tanto a nivel genético como bioquímico, fisiológico o
molecular. Presenta numerosas características que hacen que su manipulación sea muy sencilla. Entre
ellas destacan su ciclo de vida corto, la facilidad de crecimiento de los animales, la disponibilidad de
54
Introducción
la secuencia completa de su genoma o el elevado número de herramientas genéticas y moleculares

disponibles que permiten la manipulación y generación de moscas transgénicas con relativa facilidad.
Por esta razón D. melanogaster ha sido utilizada en numerosos estudios de desarrollo, diferenciación,
envejecimiento, ciclo celular, transducción de señales, respuesta a hipoxia o control transcripcional
y traduccional. Además, Drosophila presenta ortólogos de numerosos genes implicados en
enfermedades humanas que hacen de este organismo un buen modelo para el estudio de sus bases
moleculares y el descubrimiento de nuevas terapias (Sanchez-Martinez et al., 2006).
En el caso de las enfermedades mitocondriales, Drosophila ha sido estudiada como modelo
del síndrome de depleción mitocondrial, sordera, encefalopatía o déficits de coenzima Q (Lefai
et al., 2000, Toivonen et al., 2001, Zordan et al., 2006, Grant et al., 2010, Ghezzi et al., 2011). D.
melanogaster ha sido además, el primer organismo en el que se han descrito y estudiado mutaciones
patogénicas en el ADNmt, más concretamente en el gen ATP6, que reproducían el fenotipo
observado en encefalomiopatías humanas (Celotto et al., 2006).
5.1. Identificación de nuevos genes mitocondriales en Drosophila melanogaster

Drosophila ha sido de gran utilidad para el estudio de la mitocondria no solo en situaciones
patológicas, sino también fisiológicas. Durante los últimos años, una de las líneas de trabajo de
nuestro laboratorio se ha centrado en la identificación y caracterización de factores esenciales en
el proceso de biogénesis mitocondrial, utilizando D. melanogaster como sistema modelo. Entre ellos
se encuentran proteínas implicadas en replicación y transcripción del ADNmt, tales como las dos
subunidades de la ADN polimerasa mitocondrial, Pol γ-α y Pol γ-β, la helicasa mitocondrial o los
factores de transcripción y traducción mitocondrial, mtTFB2 y mtTFB1 respectivamente.
Durante la identificación del inicio de transcripción del gen pol γ-β observamos que el
mensajero que la codifica presentaba una región 5’UTR inusualmente larga. El análisis de esta
región nos permitió identificar una pauta abierta de lectura (ORF, “open reading frame”) con su
codón de terminación solapando con el de inicio de la traducción de Pol γ-β (AUGA) (Figura
5). Esta ORF codifica una proteína implicada en traducción mitocondrial, GatC. Esta proteína
es una de las subunidades que componen el enzima trimérico glutamil ARNtGln amidotransferasa
(GatCAB), implicado en la formación del Gln-ARNtGln mitocondrial mediante una reacción de
transamidación. La falta de glutaminil-ARNt sintetasa en mitocondrias es compensada por una
glutamil-ARNt sintetasa no discriminante que aminoacila de forma incorrecta el ARNtGln con
el aminoácido glutámico (Glu-ARNtGln). En un segundo paso, el enzima GatCAB se encarga de
catalizar la transferencia de un grupo amino al aminoácido glutámico del Glu-ARNtGln, dando lugar
al ARNt de glutamina correctamente cargado, Gln-ARNtGln (Nagao et al., 2009).
55
Introducción
gatC AUGA pol γ−β

447 pb 1086 pb
Figura 5. Estructura del ARNm bicistrónico gatC/pol γ-β de Drosophila melanogaster. En D.

melanogaster, los genes gatC y pol γ-β se encuentran codificados en un mensajero bicistrónico que presenta una
estructura típicamente procariota. El codón de terminación de la traducción de GatC se encuentra solapado con
el codón de inicio de la traducción de Pol γ-β (AUGA). Este ARNm no presenta región 3’ UTR. En amarillo se
representa la región 5’UTR y se encuentra indicado el tamaño en pares de bases (pb) de cada una de las ORF.
Esta disposición de gatC y pol γ-β en un mismo ARNm es típica de mensajeros policistrónicos
procariotas donde se busca un control de la estequiometría de las proteínas codificadas en ellos,
que generalmente participan en un mismo proceso. El hecho de que proteínas implicadas en la
replicación del ADNmt y en la traducción de los ARNm mitocondriales estén codificadas en el
mismo mensajero sugiere que ambos procesos deben encontrarse coordinados y que deben existir
mecanismos de regulación traduccional que establezcan el balance adecuado de estas proteínas.
Esta disposición de dos genes en un bicistrón no es exclusiva de gatC y pol γ-β. El estudio
del factor de traducción mtTFB1 de D. melanogaster nos ha permitido la identificación de una
segunda proteína, CCDC56 (“coiled-coil domain containing 56”), que se encuentra codificada en lo que
considerábamos la región 5’UTR de su mensajero (Figura 6).
CCDC56 mtTFB1
261 pb 990 pb
Figura 6. Estructura del ARNm bicistrónico CCDC56/mtTFB1 de Drosophila melanogaster. En D.
melanogaster, el gen mtTFB1 se encuentra codificado en un mensajero bicistrónico junto con CCDC56, que
codifica una proteína de función desconocida y potencial destino mitocondrial. En amarillo se representan las
regiones 5’ y 3’ UTR y se encuentra indicado el tamaño en pares de bases de cada una de las ORF.
CCDC56 codifica una nueva proteína de potencial destino mitocondrial y de función

desconocida. El gran paralelismo de este bicistrón con el ARNm gatC/pol γ-β, el papel que juega
mtTFB1 en la traducción de los mensajeros mitocondriales y el posible destino mitocondrial
asignado por las bases de datos a CCDC56 hacen de ella una excelente candidata a ser una nueva
proteína que ejerza su función en la mitocondria.
La reciente secuenciación del genoma de doce especies de Drosophila ha revelado la existencia
de al menos un centenar de bicistrones en este organismo (Clark et al., 2007, Lin et al., 2007),
haciendo de Drosophila un excelente modelo para la identificación de nuevos genes mitocondriales.
56
OBJETIVOS
Objetivos
Drosophila melanogaster ha demostrado ser un buen sistema modelo para la caracterización de

genes ortólogos a genes humanos, mostrando éstos una alta correspondencia funcional. Entre estos
genes se incluyen aquellos implicados en biogénesis mitocondrial como Pol γ-β, mtSSB, mtTFB2 o
mtTFB1.
Durante la caracterización funcional del factor de traducción mitocondrial mtTFB1 hemos
identificado la presencia de una pauta abierta de lectura, CCDC56, que codifica una proteína con
un posible destino mitocondrial y función desconocida.
Aún se desconoce la causa genética de la mayor parte de las enfermedades mitocondriales
por lo que la identificación y la caracterización funcional de nuevos genes y proteínas mitocondriales
es imprescindible para comprender la fisiopatología de este complejo grupo de enfermedades.
Por estas razones los objetivos que nos hemos planteado en este trabajo han sido:
- Identificar la presencia del gen CCDC56 en el genoma humano
- Confirmar la localización de esta proteína en la mitocondria de humanos
- Caracterizar funcionalmente las consecuencias de la falta de función de CCDC56 en células
humanas mediante silenciamiento de su expresión utilizando técnicas de interferencia de ARN.
59
MATERIALES Y MÉTODOS
Materiales y métodos
1. Materiales
1.1. Reactivos, soluciones y tampones.

Todos los reactivos utilizados en este trabajo fueron de grado analítico o de grado apto para
la Biología Molecular. La composición de las soluciones y tampones empleados en los distintos
experimentos se especifica en la descripción de los métodos o, en su defecto, en la bibliografía
correspondiente.
1.2. Radioisótopos
El aminoácido radiactivo L-[35S]-Metionina fue suministrado por Perkin Elmer.
1.3. Líneas celulares

Para los ensayos de interferencia y sobreexpresión de CCDC56 se utilizó la línea celular
humana HeLa, procedente de un carcinoma cervical.
1.4. Cepas bacterianas

Para la transformación y amplificación de plásmidos se utilizó la cepa DH5α de Escherichia
coli. Para la expresión de proteínas recombinantes en E. coli se utilizó la cepa BL21 CodonPlus
(Stratagene).
63
1.5. Vectores
Los vectores utilizados en este trabajo se detallan a continuación:
- pIRESpuro2: Vector de expresión eucariota bajo el control del promotor de CMV
(Clontech). Utilizado en la sobreexpresión de CCDC56 en células humanas.
- pRSET B: Vector para la expresión en E. coli de proteínas de fusión con una cola de 6xHis
bajo el control del promotor de T7. Se utilizó para la generación de anticuerpos.
1.6. Oligonucleótidos
Los oligonucleótidos utilizados en este trabajo fueron sintetizados por Sigma-Aldrich. En
la tabla se especifica el nombre y la secuencia en dirección 5’ 3’. La inserción de secuencias de
reconocimiento por enzimas de restricción se destaca en negrita y los cambios con respecto a la
secuencia original, en caso de haberlos, se reflejan en naranja.
Oligonucleótidos para el clonaje de CCDC56 en pRSET B

Nombre Secuencia
pRSETB CCDC56 Fw 5’ TT CCATGG CG TCT TCG GGA GCT GGT GAC CC 3’
pRSETB CCDC56 Rv 5’ AG AAGCTT TTA GGA CCC TGA CGC CCT TGC CAG AG 3’
Oligonucleótidos para el clonaje de CCDC56 en pIRESpuro2

Nombre Secuencia
HA-CCDC56 Fw 5’ TT CTTAAG ATG TAC CCA TAC GAT GTT CCA GAT TAC
GTC ATG GCG TCT TCG GGA GCT GGT GAC CC 3’
HA-CCDC56 Rv 5’ TT GCGGCCGC TTA GGA CCC TGA CGC CCT TGC C 3’
CCDC56-Flag Fw 5’ TT CTTAAG ATG GCG TCT TCG GGA GCT GGT G 3’
CCDC56-Flag Rv 5’ AT GCGGCCGC TTA CTT GTC GTC ATC GTC TTT GTA GTC
GGA CCC TGA CGC CCT TGC CAG AGC TCG 3’
Oligonucleótidos para PCR cuantitativa de los ARNm mitocondriales

Nombre Secuencia
COX1 Fw 5’ CTC TTC GTC TGA TCC GTC CT 3’
COX1 Rv 5’ ATT CCG AAG CCT GGT AGG AT 3’
COX2 Fw 5’ ACG AGT ACA CCG ACT ACG GC 3’
COX2 Rv 5’ CGG GAA TTG CAT CTG TTT TT 3’
COX3 Fw 5’ CCC ACC AAT CAC ATG CCT AT 3’
COX3 Rv 5’ GTG GCC TTG GTA TGT GCT TT 3’
ND5 Fw 5’ AAA CAA CCC AGC TCT CCC TAA 3’
64
ND5 Rv 5’ AGA AGG ATA TAA TTC CTA CG 3’

CytB Fw 5’ TGA AAC TTC GGC TCA CTC CT 3’
CytB Rv 5’ AGA ATA TTG AGG CGC CAT TG 3’
ATP6 Fw 5’ TTT CCC CCT CTA TTG ATC CC 3’
ATP6 Rv 5’ TGG GTG GTT GGT GTA AAT GA 3’
RNR1 Fw 5’ CGA TCA ACC TCA CCA CCT CT 3’
RNR1 Rv 5’ TGC TAA ATC CAC CTT CGA CC 3’
18S Fw 5’ CCA GTA AGT GCG GGT CAT AAG C 3’
18S Rv 5’ CCT CAC TAA ACC ATC CAA TCG G 3’
Oligonucleótidos para secuenciación de CCDC56 en pacientes con déficit del complejo IV

Nombre Secuencia
CCDC56 1Fw 5’ ACA ACT CCC AGA GTC CAC TG 3’
CCDC56 1Rv 5’ CTC TCC CAA ATC AGT GAT TCC 3’
CCDC56 2Fw 5’ AAG AGT GGT AGA GCA AAT CTA G 3’
CCDC56 2Rv 5’ AGC ATG AAG TGC CAT ATG CTG 3’
1.7. siRNAs y sondas Taqman

Para los ensayos de interferencia transitoria del ARN mensajero de CCDC56 humano se utilizaron
los ARNs de doble cadena (siRNAs) diseñados y sintetizados por Applied Biosystems que se detallan a
continuación (http://www5.appliedbiosystems.com/tools/sirna/):
- Silencer® Select predesigned siRNA, ID: s26294

Como control negativo en los ensayos de interferencia transitoria se utilizó el siRNA
Silencer® Negative Control #2 (Ki #2) (Applied Biosystems) que no presenta homología de
secuencia con ningún gen conocido y que ha sido validado en células humanas.
Para la cuantificación de los niveles de ARN mensajero de CCDC56 humano mediante PCR
cuantitativa se utilizaron los siguientes ensayos Taqman, obtenidos de Applied Biosystems:
- Taqman Hs00360235_m1: para la cuantificación del ARNm de CCDC56 humano.
- Taqman Hs99999901_s1: para la cuantificación del ARNr 18S, utilizado como control
endógeno.
65
1.8. Anticuerpos
Los anticuerpos utilizados en este trabajo están reflejados en las siguientes tablas.
Anticuerpos primarios
Nombre Origen Dilución Procedencia
Anti-COX1 Monoclonal de ratón 1:1000 Mitosciences
Anti-COX5a Monoclonal de ratón 1:1000 Mitosciences
Anti-NDUFA9 Monoclonal de ratón 1:1000 Mitosciences
Anti-CII 70KDa Monoclonal de ratón 1:5000 Molecular Probes
Anti-CIII Core2 Monoclonal de ratón 1:5000 Molecular Probes
Generado en el laboratorio
Anti-β-ATPasa Policlonal de conejo 1:1000
(Pena and Garesse, 1993)
Anti-Porina Monoclonal de ratón 1:1000 Mitosciences
Anti-HA Monoclonal de rata 1:1000 Roche Applied Science
Anti-Flag Monoclonal de ratón 1:1000 Stratagene
Anticuerpos secundarios
Nombre Origen Dilución Procedencia
Anti-IgG ratón
Policlonal de cabra 1:3000 Nordic
HRP
Anti-IgG conejo
Policlonal de cabra 1:3000 Santa Cruz Biotechnology
HRP
Anti-IgG rata
Policlonal de cabra 1:3000 Southern Biotech
HRP
Anti-IgG ratón
Policlonal de cabra 1:1000 Invitrogen
Alexa Fluor 488
2. Métodos
Las técnicas básicas de Biología Molecular se realizaron según se describe en Sambrook y

colaboradores (Sambrook and Russell, 2001) o de acuerdo con los protocolos especificados en las
citas correspondientes.
66
2.1. Clonajes
Las reacciones de PCR para el clonaje de secuencias se realizaron con la ADN polimerasa
PfuTurbo (Stratagene) que presenta actividad correctora. Para la comprobación de los clonajes
mediante PCR de colonias de E. coli y el resto de los casos se utilizó el enzima ADN polimerasa
termorresistente de la casa comercial Biotools.
La purificación de bandas de ADN de geles de agarosa se realizó con el kit QIAEX II Gel
Extraction (QIAGEN) siguiendo las instrucciones del fabricante.
Las enzimas de restricción necesarias para los clonajes se emplearon siguiendo las condiciones
indicadas por cada fabricante (Invitrogen, Roche, New England Biolabs). Para las reacciones de
ligación de fragmentos de ADN se utilizó la enzima T4 ADN ligasa (New England Biolabs).
La fidelidad de todos los clones se confirmó mediante secuenciación.
2.2. Secuenciación de ácidos nucleicos y análisis de secuencias

La secuenciación de los distintos fragmentos de ADN se realizó utilizando el método de
secuenciación automática en geles desnaturalizantes de acrilamida/bisacrilamida en el Servicio de
Genómica del Instituto de Investigaciones Biomédicas “Alberto Sols” (CSIC-UAM, Madrid). El
análisis de secuencias, la generación de mapas de restricción, el procesamiento de los resultados de
secuenciación y los alineamientos de secuencias se realizaron con el programa BioEdit Sequence
Alignment Editor versión 7.0.5.3.
2.3. Aislamiento de ácidos nucleicos
Aislamiento de ARN de células en cultivo

El ARN total de células en cultivo fue obtenido utilizando TRIzol Reagent (Invitrogen,
Life Technologies) siguiendo las instrucciones del fabricante. La concentración y pureza de los
ARN obtenidos se calcularon midiendo su absorbancia a 260 nm y la relación de las absorbancias
a 260 nm y 280 nm respectivamente. La integridad de los ARN se comprobó mediante chips
microfluídicos en el bioanalizador Agilent 2100 (Agilent technologies).
Aislamiento de ADN plasmídico

Para la purificación de ADN plasmídico a partir de cultivos de E. coli se utilizaron los kits
High Pure Plasmid Isolation Kit (Roche) o Genopure Plasmid Maxi Kit (Roche) para la obtención
de pequeñas y grandes cantidades de ADN respectivamente y de acuerdo con las instrucciones del
fabricante.
67
2.4. RT-PCR y PCR cuantitativa (qRT-PCR)

La retrotranscripción del ARNm se realizó utilizando High Capacity cDNA Reverse
Transcription Kit (Applied Biosystems) siguiendo las instrucciones del fabricante.
La cuantificación de los niveles de ARNm del gen CCDC56 humano se realizó utilizando
sondas Taqman específicas para CCDC56 y el ARNr 18S como control endógeno.
La cuantificación de los ARNm mitocondriales de COX1, COX2, COX3, ND5, CytB, ATP6
y ARNr 12S se realizó utilizando el reactivo SYBR Green (Applied Biosystems) y oligonucleótidos
específicos para cada uno de estos genes y para el ARNr 18S como control endógeno.
Todos los ensayos de PCR cuantitativa se realizaron siempre por triplicado en el aparato
7900HT Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems) y los resultados se analizaron utilizando
el programa SDS 2.2.
2.5. Cultivo de líneas celulares y transfección

Las células se crecieron en DMEM (Invitrogen) con 4.5 g/l de glucosa suplementado con
10% FBS, uridina, penicilina y estreptomicina en un incubador a 37°C con 5% CO2.
Para la transfección de células HeLa se utilizó Lipofectamina 2000 (Invitrogen) siguiendo
las instrucciones del fabricante. Las células se plaquearon 24 horas antes de la transfección en
medio completo. La lipofectamina 2000 se diluyó en medio sin suero (OptiMEM, Invitrogen), se
incubó 5 minutos a temperatura ambiente y se mezcló con 30 nM de una mezcla de los siRNAs o
5 μg de ADN, en el caso de las construcciones, también diluidos en OptiMEM. Las muestras se
incubaron durante 25 minutos a temperatura ambiente y se añadieron a las placas.
Para generar las líneas celulares estables de sobreexpresión de CCDC56-Flag, 48 horas
después de la transfección se añadieron al medio 1.5 μg/ml de puromicina. Las células seleccionadas
se crecieron siempre en presencia del antibiótico.
2.6. Curvas de crecimiento

Para la realización de curvas de crecimiento, se plaquearon 25.000 células interferidas por
pocillo en placas p35 en medios con 4.5 g/l de glucosa o 0.9 g/l de galactosa como fuentes de
carbono. En los tiempos indicados las células se recogieron por tripsinización y se contaron en una
cámara Neubauer.
2.7. Inmunocitoquímica
Se plaquearon células HeLa que expresan CCDC56-Flag sobre cristales cubreobjeto y se
incubaron toda la noche a 37°C. Para teñir la red mitocondrial, las células se incubaron durante 30
minutos a 37°C con 50 nM Mitotracker Red (Molecular Probes, Invitrogen) añadido al medio de
68
cultivo. A continuación, las células se fijaron con paraformaldehido 2% en PBS, se trataron con
metanol y se incubaron con el anticuerpo anti-Flag en presencia de 2% BSA. Tras varios lavados,
se incubaron con un anticuerpo secundario anti-IgG de ratón acoplado a Alexa Fluor 488. Las
muestras se visualizaron en un microscopio confocal Carl-Zeiss.
2.8. Aislamiento de proteínas totales de células en cultivo

Para la obtención de extractos totales de proteínas, las células fueron tripsinizadas y lavadas
con PBS 1X. Posteriormente fueron resuspendidas en el volumen adecuado (100-200 μL) de
tampón RIPA (1% Nonidet P40, 0.5% deoxicolato de sodio, 0.1% SDS, 150 mM NaCl, 2 mM
EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8) al que se habían añadido previamente inhibidores de proteasas
(Protease Inhibitor Cocktail, Sigma-Aldrich). Tras 15 minutos en hielo, se centrifugaron a 16000g
durante 3 minutos a 4°C para eliminar los restos celulares. La concentración de proteínas en el
sobrenadante se determinó utilizando el kit DC Protein Assay (Bio-Rad).
2.9. Purificación de mitocondrias

La purificación de mitocondrias se llevó a cabo siguiendo el protocolo descrito por
Fernández-Vizarra y colaboradores (Fernandez-Vizarra et al., 2002).
2.10. Fraccionamiento submitocondrial

Para el fraccionamiento submitocondrial, la fracción mitocondrial fue resuspendida en
tampón 10 mM Tris-HCl pH 7.4, 0.32 M sacarosa y 1 mM EDTA y se rompieron mediante
sonicación. Las fracciones soluble y de membrana se separaron mediante centrifugación a 24000g
durante 10 minutos a 4°C. El pellet de membrana fue resuspendido en el mismo tampón al que se
le había añadido 0.1 M Na2CO3, se incubó durante 30 minutos a 4°C y fue centrifugado de nuevo
a 24000g durante 10 minutos a 4°C para separar las proteínas integrales de membrana de las que se
encuentran asociadas a ella de manera extrínseca.
2.11. Inmunodetección de proteínas unidas a membrana (Western Blot)

Entre 50 y 100 μg de proteínas de cada extracto total o fracción mitocondrial purificada
se separaron por electroforesis en geles de poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE) al 10% o al 12%
y posteriormente fueron transferidos a membranas de PVDF (Millipore). Las membranas se
incubaron toda la noche en solución de bloqueo (1X TBS pH 7.4, 0.1% Tween 20, 5% leche
desnatada en polvo) y posteriormente se incubaron con el anticuerpo primario correspondiente
en solución de bloqueo durante 1 hora a temperatura ambiente en las condiciones de dilución
establecidas para cada uno de ellos (Detalladas en la sección 1.8). Las membranas se lavaron tres
veces con 1X TBS pH 7.4, 0.1% Tween 20 y se incubaron con el anticuerpo secundario adecuado
en solución de bloqueo durante 30 minutos a temperatura ambiente. La membrana se lavó 3 veces
69
con 1X TBS pH 7.4, 0.1% Tween 20. Como reactivos de revelado se utilizaron los kits ECL y ECL
Prime Western Blotting Detection Reagents (Amersham).
2.12. Determinación de actividad enzimática de los complejos de la cadena respiratoria

mitocondrial
Todas las medidas se realizaron en extractos enriquecidos en mitocondria obtenidos
mediante el tratamiento con digitonina de las células. 5x106 células resuspendidas en tampón MOPS
20 mM y sacarosa 0.25 M, se incubaron con digitonina 0.2 mg/ml durante 5 minutos en hielo y
se centrifugaron a 10000g durante 3 minutos a 4°C. Los pellet mitocondriales se resuspendieron
en tampón fosfato 10 mM pH 7 y se lisaron mediante sonicación (2 ciclos de 15 segundos a una
amplitud de 15 micrones). La cantidad de proteínas presentes en el extracto se determinó utilizando
el kit DC Protein Assay (Bio-Rad).
La actividad de las enzimas de la cadena respiratoria mitocondrial fue determinada
mediante espectrofotometría, en un espectrofotómetro Beckman DU800, según técnicas descritas
previamente (Tiranti et al., 1995) con ligeras modificaciones.
La actividad del complejo I (NADH deshidrogenasa) se determinó midiendo la oxidación
del NADH a 340 nm. El medio de reacción contenía 20 mM tampón fosfato pH 8, 0.2 mM
NADH, 1 mM NaN3, 0.1% BSA-EDTA y 200 μM CoQ. La reacción fue inhibida al 90% tras
añadir 5 μM rotenona.
La actividad del complejo II (succinato deshidrogenasa) se determinó monitorizando la
reducción del aceptor artificial de electrones 2,6-diclorofenol-indofenol (DCPIP) a 600 nm. El
medio de reacción contenía: 32 mM Succinato, 50 mM tampón fosfato pH 7, 1.5 mM KCN, 50 μM
CoQ1 y 0.1 mM DCPIP.
Para la valoración de la actividad del complejo III (ubiquinol:citocromo c oxidorreductasa)
se midió la aparición de citocromo c reducido a 550 nm, en una mezcla de reacción que contenía
50 mM tampón fosfato pH 7.5, 2 mM NaN3, 0.1% BSA-EDTA, 1 mM citocromo c y 50 μM
decilubiquinol (DBH2).
La actividad del complejo IV (citocromo c oxidasa) se determinó midiendo la oxidación del
citocromo c reducido a 550 nm en una solución 10 mM tampón fosfato pH 7 y 80 μM citocromo
c reducido.
Todas las reacciones se llevaron a cabo a 30°C excepto la del complejo IV que se incubó a
38°C. Los resultados fueron normalizados frente a la concentración de proteínas de cada extracto.
2.13. Medida de la actividad citrato sintasa

La actividad de este enzima se cuantificó en función del cambio en la absorbancia del
DTNB (ácido 5-5’ ditio bis 2-nitrobenzoico) a 412 nm producido por su reacción con el coenzima
70
A libre formado en la reacción catalizada por la citrato sintasa. La reacción se llevó a cabo en un
espectrofotómetro Beckman DU800 a 30°C en un tampón que contiene acetil-CoA 350 μg/ml,
0.5 mM oxalacetato, 100 μM DTNB, 75 mM Tris-HCl pH 8 y 0.1% Tritón X-100. Los resultados
fueron normalizados frente a la concentración de proteínas del extracto celular.
2.14. Marcaje in vivo de proteínas mitocondriales

Siguiendo el protocolo descrito por A. Chomyn (Chomyn, 1996), se marcaron 300.000
células con 200 μCi/ml de L-[35S]-metionina (Perkin Elmer) durante 30, 60 o 90 minutos en 1
ml de medio DMEM sin metionina (Invitrogen) suplementado con 100 μg/ml de emetina para
los experimentos de pulso o 100 μg/ml de anisomicina para los experimentos de pulso y caza.
Después de la incubación, las células se lavaron y tripsinizaron para los experimentos de pulso o se
incubaron en medio completo durante los tiempos de caza estimados.
100 μg de cada extracto total de proteínas se cargaron en geles de poliacrilamida con
un gradiente del 15% al 20%. Las proteínas mitocondriales marcadas se visualizaron mediante
autorradiografía directa de los geles o se cuantificaron utilizando un Typhoon Trio phosphorimager
system (GE Healthcare).
2.15. Electroforesis en condiciones nativas (“Blue Native” PAGE) y ensayos de actividad

en gel (IGA)
La electroforesis en condiciones nativas y los ensayos de actividad en gel se realizaron
siguiendo el método descrito por L. Nitjmans (Calvaruso et al., 2008). Los extractos de proteínas
mitocondriales se obtuvieron mediante el tratamiento de las células con digitonina 2 mg/ml
seguido de la solubilización de los complejos de la membrana con 2% n-dodecil β-D-maltósido
(laurilmaltósido). 40 μg de cada extracto fueron separados en geles nativos de poliacrilamida con
un gradiente del 4 al 15%. Tras la electroforesis, las proteínas fueron transferidas a membranas de
PVDF e incubadas con los anticuerpos correspondientes.
Para los ensayos de actividad en gel del complejo I, tras la electroforesis los geles se
incubaron 1-2 horas a 37°C en 2 mM Tris–HCl pH 7.4, 0.1 mg/ml NADH y 2.5 mg/ml NTB (azul
de nitrotetrazolio). Los ensayos de actividad en gel del complejo IV se realizaron incubando los
geles 24 horas a 37°C en 50 mM fosfato sódico pH 7.2, 0.5 mg/ml 3,3’-diaminobencidina (DAB),
2 mg/ml citocromo c y 20 μg/ml de catalasa. Tras la tinción los geles fueron lavados con agua
destilada y escaneados.
Para los ensayos de cinética de formación de los complejos se trataron las células con 5 μg/
ml de cloranfenicol durante dos días y tras la transfección de los siRNAs se retiró el antibiótico.
Se crecieron las células en medio completo y se recogieron a las 8, 24, 48 y 72 horas de retirada
del cloranfenicol. Los experimentos de BN-PAGE se llevaron a cabo como se ha detallado
anteriormente.
71
2.16. Geles bidimensionales (2D BN/SDS-PAGE)

Para los experimentos de 2D BN/SDS-PAGE las células interferidas fueron retransfectadas
con los siRNAs y el control Ki #2 respectivamente a las 48 horas de la primera transfección
para obtener mayores niveles de interferencia. Los geles bidimensionales se realizaron siguiendo el
método descrito por L. Nitjmans (Calvaruso et al., 2008). Tras separar las muestras en un gel de “Blue
Native” con un gradiente del 4 al 18% de acrilamida, los carriles del gel fueron cortados e incubados
en 1% SDS y 1% β-mercaptoetanol durante 1 hora a temperatura ambiente. Posteriormente se
separaron en geles desnaturalizantes de poliacrilamida al 12% y transferidos a membranas de PVDF
para ser incubados con los anticuerpos correspondientes.
2.17. Generación de anticuerpos policlonales frente a la proteína CCDC56

El ADNc que codifica CCDC56 humano se clonó de manera dirigida en fase con la región
codificante de 6xHis que contiene el vector pRSET B (Invitrogen). La expresión de la proteína de
fusión se llevó a cabo en la cepa de E. coli BL21 CodonPlus crecida en medio LB con ampicilina
(200 μg/ml) y cloranfenicol (30 μg/ml). Para inducir la expresión de CCDC56 se añadió al medio
de cultivo 1 mM IPTG (Isopropil-β-D-1-galactopiranósido) y se incubaron las bacterias durante 4
horas a 37°C en agitación. Los cultivos de bacterias se recogieron centrifugando a 5000g durante 5
minutos, se resuspendieron en PBS con lisozima y se incubaron en hielo durante 30 minutos. Las
células se lisaron mediante sonicación (8 ciclos de 15 segundos a una amplitud de 20-25 micras).
El lisado se centrifugó durante 4 minutos a 300g a 4°C, se recogieron los sobrenadantes, y éstos
se centrifugaron durante 15 minutos a 16000g a 4°C. Los sedimentos obtenidos se separaron
por electroforesis en geles SDS-PAGE al 10%, que se tiñeron con azul brillante de Coomasie
R-250 (1 g/l) en etanol 20% (v/v) y ácido acético 10% (v/v) durante al menos una hora. Las
bandas correspondientes a la proteína se recortaron, se emulsionaron mediante sonicación con un
volumen de adyuvante completo de Freund (Sigma-Aldrich) y fueron inoculadas por vía subcutánea
en conejos New Zealand. Se inocularon con intervalos de 2 semanas otras tres dosis emulsionadas
con adyuvante incompleto de Freund (Sigma-Aldrich) por vía intramuscular seguidas de una última
inoculación subcutánea. Previamente a cada una de las inoculaciones se extrajo sangre al conejo
con objeto de analizar la respuesta inmune a lo largo del tiempo.
2.18. Inmunoprecipitación de CCDC56-Flag

La inmunoprecipitación con anticuerpos anti-Flag se llevó a cabo utilizando FLAG
Immunoprecipitation Kit (Sigma-Aldrich) siguiendo las instrucciones del fabricante con ligeras
modificaciones. Las mitocondrias de la línea que sobreexpresa CCDC56-Flag se lisaron con 50 mM
Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA y 0.5% laurilmaltósido. Este lisado se incubó a 4°C
durante toda la noche con el anticuerpo anti-Flag unido a una resina de agarosa, se lavó tres veces
con 50 mM Tris HCl pH 7.4, 150 mM NaCl para eliminar las proteínas no unidas al anticuerpo y
72
se eluyó CCDC56-Flag utilizando 150 ng/μl de péptido Flag.
2.19. Análisis estadístico de los resultados

Cada experimento se realizó al menos por triplicado. El análisis estadístico de los resultados
obtenidos se realizó con los programas Excel (Microsoft) y GraphPad Prism 4 (GraphPad Software).
Se utilizaron el test ANOVA y el post-test de Bonferroni para determinar la significación estadística
de las diferencias obtenidas en los resultados de cada experimento.
73
RESULTADOS
Resultados
CARACTERIZACIÓN FUNCIONAL DE CCDC56
Durante los últimos 20 años, Drosophila melanogaster ha demostrado ser un buen sistema
modelo para la caracterización de genes mitocondriales homólogos a genes humanos, entre los
que se incluyen genes implicados en el correcto desarrollo de la biogénesis mitocondrial como Pol
γ-β, mtSSB o mtTFB2 (Garesse and Kaguni, 2005). Durante la caracterización funcional del factor
de traducción mitocondrial mtTFB1, identificamos la presencia de una pauta abierta de lectura
en el primer exón de su ARNm, en lo que se consideraba como la región 5’UTR del mensajero.
Esta nueva ORF codifica una proteína de 87 aminoácidos, denominada CCDC56, de función
desconocida y con un posible destino mitocondrial.
De las más de 1500 proteínas que constituyen el proteoma mitocondrial, aproximadamente
la mitad no han sido aún identificadas mediante evidencias experimentales (Pagliarini et al., 2008),
lo cual unido al potencial destino mitocondrial de CCDC56, nos llevó a tratar de estudiar su posible
implicación en la función de este orgánulo.
77
Resultados
1. Falta de función de CCDC56 en Drosophila melanogaster
Como primera aproximación a la caracterización funcional de CCDC56, procedimos a

estudiar el fenotipo que producía su falta de función en Drosophila. Para ello, en un trabajo del
laboratorio previo a esta tesis, se generaron dos líneas “knock-out” para CCDC56 en D. melanogaster
((Peralta et al., 2012), enviado a publicar).
Ambas líneas se generaron mediante la movilización de un elemento P insertado en la región
promotora del bicistrón CCDC56/mtTFB1. Al introducir transposasa en este fondo genético,
se induce la movilización del elemento P, el cual puede llevarse consigo ADN de las regiones
flanqueantes generando deleciones. Así se obtuvieron dos líneas, CCDC56D6 y CCDC56D11, en
que se habían eliminado dos regiones de 570 y 1168 pb respectivamente. La deleción de la línea
CCDC56D6 (D6) incluye parte del promotor y de la región 5’ de CCDC56, hasta 23 nucleótidos por
debajo de su codón ATG de inicio de la traducción. En la línea CCDC56D11 (D11), la deleción ha
eliminado una amplia región del promotor así como la ORF completa de CCDC56, sin afectar a
mtTFB1 (Figura 7).
KG07792
{P-SUPOR}
CCDC56 mtTFB1
D6 570 bp
CCDC56 mtTFB1
D11 1168 bp
mtTFB1
Figura 7. Esquema de las deleciones generadas en CCDC56. El triángulo muestra la región genómica con
el punto de inserción del elemento P (P-SUPORKG07792) posteriormente movilizado. La escisión de este elemento
P generó dos líneas portadoras de deleciones, D6 y D11, esquematizadas en la figura. La deleción de la línea
D6, de 570 pb, afecta a parte del promotor y de la región 5’ de CCDC56, incluyendo su codón de inicio de la
traducción. La deleción de la línea D11 de 1168 pb elimina una región más amplia del promotor así como la
ORF completa de CCDC56. Ninguna de las deleciones afecta a la ORF de mtTFB1.
Ambas deleciones en homocigosis producen letalidad en el tercer estadío larvario,

demostrando que CCDC56 es esencial para el desarrollo de Drosophila. Las larvas KO para CCDC56
son de menor tamaño que los controles, permanecen en estado de larva durante más de 20 días,
frente a los 14 días de los controles, y presentan un defecto de proliferación celular y un aumento
de apoptosis en sus discos imaginales de ala (Figura 8), siendo éste un fenotipo típico de otros
mutantes con una severa disfunción mitocondrial en Drosophila (Maier et al., 2001, Adan et al.,
2008).
78
Resultados
A. B. Control D11
Control D6 D11
α PH3
α Caspasa3
Figura 8. Fenotipo de las líneas “knock-out” para CCDC56. A) Comparación del tamaño de las larvas de
tercer estadío de las líneas control y portadoras de las deleciones (D6 y D11). B) Inmunohistoquímica de los
discos imaginales de ala de las líneas control y D11. Los anticuerpos contra Caspasa 3 y Fosfohistona 3 (PH3)
mostraron un aumento de la apoptosis y una disminución de la proliferación celular, respectivamente, en las
líneas portadoras de la deleción 11.
Por tanto, para comprobar la relación de CCDC56 con la función mitocondrial, se midió la
actividad de los complejos de la cadena respiratoria en las larvas de tercer estadío. Estas medidas
revelaron que, en ausencia de CCDC56, las larvas presentan un grave defecto de la actividad del
complejo IV, mientras que las actividades de los complejos I, II y III, así como la actividad de
la citrato sintasa se encuentran ligeramente elevadas con respecto a los controles (Figura 9A).
Este defecto en la actividad del complejo IV correlaciona con una drástica caída en los niveles de
complejo IV totalmente ensamblado analizados mediante geles bidimensionales BN/SDS-PAGE
(Figura 9B).
A.
Complejo I Complejo II Complejo III
700 500 3000
Actividad específica
(nmol.min -1.mg -1)
(nmol.min -1.mg -1)
(nmol.min -1.mg -1)
600
* 400 ** 2500
500 2000
400 300
1500
300 200
1000
200
100 500
100
0 0 0
Control D6 D11 Control D6 D11 Control D6 D11
B.
Complejo IV Citrato sintasa Gel separador
2000 1250 4% 18%
BN-PAGE
(nmol.min -1.mg -1)
(nmol.min -1.mg -1)
1500 1000
S4 S3 S2* COX3
SDS-PAGE
750
1000 Control
500
α COX3
500
*** *** 250
D11
0 0
Control D6 D11 Control D6 D11
Figura 9. Caracterización bioquímica de las líneas “knock-out” de CCDC56. A) Medida de la actividad

de los complejos de la cadena respiratoria y del enzima citrato sintasa en larvas de las líneas control y portadoras
de las deleciones D6 y D11. El grado de significación estadística se muestra como *** p<0.001, ** p<0.01 y *
p<0.05. B) 2D BN/SDS-PAGE de la línea control y la línea portadora de la deleción 11. La hibridación con
anticuerpos anti-COX3 mostró una disminución de la cantidad de complejo IV totalmente ensamblado (S4) y
de sus subcomplejos.
79
Resultados
Puesto que en las líneas KO la deleción ha eliminado parte del promotor de CCDC56/
mtTFB1, procedimos a valorar la posible pérdida de su capacidad transcripcional, cuantificando
los niveles del ARNm de mtTFB1 mediante qPCR. A pesar de no encontrarse afectada la región
codificante de mtTFB1, los niveles de este mensajero se encontraban muy reducidos en ambas
líneas (Figura 10A). Para comprobar si el fenotipo de los animales era debido a la falta de función
de CCDC56 o a la disminución en la expresión de mtTFB1, se sobreexpresaron ambos genes en
las líneas delecionadas utilizando el sistema UAS-GAL4 de levadura. El defecto de la actividad
de COX podía ser rescatado parcialmente mediante la sobreexpresión del ADNc de CCDC56,
mientras que la sobreexpresión de mtTFB1 no tenía ningún efecto en la misma (Figura 10B).
A. ARNm CCDC56/mtTFB1
B. Complejo IV
(Unidades relativas)
(Niveles relativos)
0,8
ARNm
0,6
0,4
0,2
0 UAS CCDC56 mtTFB1 Control

Control 1 Control 2 D6 D11
GAL4 arm arm arm
Figura 10. Rescate de la actividad del complejo IV en las larvas “knock-out”. A) Niveles del ARNm
de CCDC56/mtTFB1 en larvas control y KO para CCDC56 (D6 y D11). Los niveles de ARNm se detectaron
mediante RT-PCR cuantitativa utilizando sondas Taqman (Applied Biosystems) específicas y se estandarizaron
frente a los niveles del ARNr 18S. B) Rescate de la actividad del complejo IV mediante la sobreexpresión de
CCDC56 y mtTFB1. Se introdujo en la línea portadora de la deleción 11 una copia de CCDC56 o de mtTFB1 bajo
el control de secuencias UAS y se indujo su expresión utilizando el transactivador armadillo-GAL4 (arm-GAL4).
Se muestra la actividad específica del complejo IV en la línea D11, en la línea D11/arm-GAL4, en la línea
que sobreexpresa CCDC56, la línea que sobreexpresa mtTFB1 y en la línea control. El grado de significación
estadística se muestra como * p<0.05.
Estos resultados apoyan que la ausencia de CCDC56 en estas líneas es la responsable de

la caída del complejo IV. Sin embargo, no se puede descartar completamente que mtTFB1 esté
interviniendo en el fenotipo de estas líneas ya que la sobreexpresión de CCDC56 no es capaz de
rescatar la actividad de COX hasta el nivel de los controles.
2. CCDC56 se encuentra conservada en humanos
Debido a la relevancia que CCDC56 parece tener en la actividad del complejo IV, procedimos
a realizar un rastreo de las bases de datos que nos permitiera identificar la presencia de este gen
en humanos (NCBI Blast: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Los análisis comparativos
mostraron que esta proteína se encuentra muy conservada en metazoos desde D. melanogaster hasta
80
Resultados
humanos y que, excepto en insectos, el gen CCDC56 se encuentra en una localización genómica
distinta al gen mtTFB1 codificado por su propio ARNm (Figura 11). Asimismo, estos análisis nos
mostraron que CCDC56 se encuentra ausente en bacterias, hongos, plantas o eucariotas inferiores
como Saccharomyces cerevisiae.
Figura 11. Comparación de la secuencia de aminoácidos de CCDC56 de diferentes organismos.

Los residuos conservados en todas las especies están indicados en color azul oscuro. En tonos azul claro se
representan los residuos con un menor grado de similitud. En blanco se indican los residuos no conservados.
El gen CCDC56 humano se encuentra localizado en el brazo largo de cromosoma 17

(17q21.31) y codifica una proteína de 106 aminoácidos y 11.7 KDa. Las bases de datos le asignan
a esta proteína una localización mitocondrial y dos dominios, un dominio transmembrana entre
los aminoácidos 58 a 78 y un dominio “Coiled-Coil”, de interacción proteína-proteína, entre los
aminoácidos 78 a 104 (Figura 12).
ARNm CCDC56
Transmembrana “Coiled-coil”
CCDC56 H 2N COOH
58 78 104
Figura 12. Representación esquemática del ARNm y la proteína CCDC56 humanos. El ARNm de
CCDC56 tiene un tamaño de 752 pb y está formado por dos exones. En él se muestra en rojo la región codificante
y en gris las regiones no traducidas. La proteína CCDC56 está formada por 106 aminoácidos, mostrándose en
rojo oscuro los dos dominios asignados a esta proteína por las bases de datos, un dominio transmembrana entre
los aminoácidos 58 y 78 y un dominio “Coiled-Coil” entre los aminoácidos 78 y 104.
81
Resultados
3. Caracterización funcional de CCDC56 en líneas celulares

humanas.
Puesto que CCDC56 se encuentra presente en humanos y está codificada en un mensajero

monocistrónico, proseguimos la caracterización funcional de esta proteína en la línea celular
humana HeLa, derivada de un carcinoma cervical.
3.1. Generación de anticuerpos policlonales contra la proteína CCDC56 humana

Una importante herramienta para la caracterización funcional de nuevas proteínas es la
disponibilidad de anticuerpos contra ellas que nos permitan su detección y la evaluación de sus
niveles en las distintas condiciones experimentales y fisiológicas. Por esta razón, se diseñó una
estrategia para la generación de anticuerpos policlonales de conejo que reconocieran la proteína
CCDC56 humana.
En primer lugar se clonó el gen CCDC56 en el vector pRSET B, que permite la sobreexpresión
de la proteína en E. coli. La construcción se transformó en la cepa BL21 Codon Plus y se indujo la
expresión de CCDC56 con IPTG. Mediante sonicación y centrifugación se separaron las fracciones
soluble e insoluble del cultivo bacteriano y comprobamos que CCDC56 aparecía mayoritariamente
formando parte de cuerpos de inclusión (Figura 13A). Esta fracción insoluble del cultivo se separó
en geles de acrilamida y se recortó la banda correspondiente a CCDC56, la cual fue utilizada para
inmunizar los conejos (Figura 13B).
A. pRSET B
B. C.
SD
pRSET B CCDC56
pRSET B
SD SN SD SN CCDC56 HeLa
Antisuero α CCDC56
15 KDa
CCDC56
CCDC56 CCDC56
6 KDa
Figura 13. Sobreexpresión de CCDC56 en E. coli y análisis de los anticuerpos policlonales obtenidos.
A) Extractos totales de proteína de bacterias E. coli de la cepa BL21 tras la inducción de la sobreexpresion
de CCDC56 con 1mM IPTG. Mediante sonicación y centrifugación se separaron las fracciones soluble
(sobrenadante, SN) e insoluble del cultivo (sedimento, SD). B) Fracción insoluble del cultivo de BL21. La
proteína CCDC56 se recortó e inyectó en conejos para la generación de anticuerpos. C) Western Blot en un
extracto de proteína total de células HeLa utilizando el antisuero anti-CCDC56 obtenido tras la inoculación.
82
Resultados
Tras varias inoculaciones de CCDC56, se obtuvo el suero de los conejos inmunizados y se

procedió a ensayar mediante Western Blot la afinidad y especificidad de los anticuerpos generados.
Desafortunadamente, no pudimos detectar ninguna proteína del tamaño esperado para CCDC56
en ninguna de las condiciones experimentales analizadas al utilizar estos sueros sobre un extracto
de células HeLa (Figura 13C).
3.2. Generación de líneas estables de sobreexpresión y localización subcelular de

CCDC56
El primer paso en la caracterización funcional de CCDC56 fue comprobar si esta proteína
se localiza en mitocondria como así se le asigna en las bases de datos. Puesto que los antisueros
obtenidos previamente contra CCDC56 no eran capaces de reconocer la proteína endógena,
generamos dos versiones de CCDC56 en las que fusionamos su ADNc a una cola HA en su
extremo amino terminal o a una cola Flag en su extremo carboxilo terminal que nos permitirían
el reconocimiento de la proteína mediante anticuerpos específicos contra el fragmento fusionado
(Figura 14).
HA-CCDC56 H 2N HA CCDC56 COOH
CCDC56-Flag H 2N CCDC56 Flag COOH
Figura 14. Representación esquemática de las construcciones generadas para la sobreexpresión de

CCDC56. Se fusionaron una cola de HA (Rosa) al extremo amino de la proteína o una cola Flag (Verde) a su
extremo carboxilo para generar las construcciones HA-CCDC56 y CCDC56-Flag respectivamente.
Estas dos construcciones se clonaron en el vector de expresión eucariota pIRESpuro2 y se

transfectaron en células HeLa. Mediante la selección con el antibiótico puromicina, se obtuvieron
dos líneas celulares que sobreexpresaban de manera estable y constitutiva las proteínas HA-
CCDC56 y CCDC56-Flag respectivamente, así como una línea celular control en la que se había
transfectado el vector pIRESpuro2.
El análisis mediante Western Blot reveló que ambas proteínas se expresaban correctamente
en las líneas generadas, utilizando para ello anticuerpos que reconocen los epítopos HA y Flag. Como
se muestra en el panel superior de la figura 15, ambas líneas expresan la versión correspondiente
de CCDC56, mientras que no se observa ninguna señal en las células transfectadas con el vector
pIRESpuro2. Curiosamente, el tamaño de la proteína HA-CCDC56 es ligeramente superior al
de CCDC56-Flag, a pesar de que HA y Flag tienen tamaños similares (HA: YPYDVPDYA, Flag:
DYKDDDDK).
Con objeto de confirmar estos resultados y para comprobar si el antisuero previamente
obtenido era capaz de reconocer la proteína sobreexpresada, realizamos un experimento similar
utilizando los antisueros contra CCDC56. Como se muestra en la figura 15, pudimos comprobar
83
Resultados
que, pese a no detectar la proteína CCDC56 endógena, estos antisueros sí eran capaces de hacerlo
cuando se encuentra sobreexpresada. Además, contrariamente a los resultados obtenidos con anti-
HA y anti-Flag, el tamaño de la proteína HA-CCDC56 detectada es inferior al de CCDC56-Flag
(Figura 15, panel inferior).
CCDC56-Flag
HA-CCDC56
pIRESpuro2
αHA
αFlag
αCCDC56
Figura 15. Sobreexpresión de HA-CCDC56 y CCDC56-Flag en células HeLa. En la figura se muestra el

Western Blot con anticuerpos anti-HA, anti-Flag (panel superior) y anti-CCDC56 (panel inferior) de las líneas
que contienen pIRESpuro2, y las construcciones HA-CCDC56 y CCDC56-Flag sobre el mismo vector.
Estos resultados se explican si tenemos en cuenta el procesamiento de la presecuencia de

localización mitocondrial de CCDC56 cuando ésta es importada a la mitocondria. Así, la proteína
CCDC56-Flag es procesada normalmente y es detectada tanto por los anticuerpos anti-Flag como
por los anticuerpos anti-CCDC56. Sin embargo, la cola de HA en el extremo amino terminal de
la proteína podría interferir con el procesamiento de su presecuencia mitocondrial haciendo que
en estas células existan dos formas distintas de CCDC56, una forma procesada y otra de mayor
tamaño sin procesar. Con los anticuerpos anti-HA se detecta la forma completa de HA-CCDC56,
de mayor tamaño ya que no ha sido procesada. Por otro lado, los anticuerpos contra CCDC56
detectan la proteína madura en la que el procesamiento de la presecuencia ha eliminado la cola de
HA, dando como resultado una proteína CCDC56 igual a la proteína endógena. Este antisuero
anti-CCDC56 también se une a la forma completa de HA-CCDC56, aunque ésta es minoritaria
(Figura 16).
HA CCDC56 αCCDC56
HA CCDC56
αHA
HA CCDC56
αCCDC56
αFlag
CCDC56 Flag CCDC56 Flag
αCCDC56
Figura 16. Representación esquemática del procesamiento de la presecuencia de HA-CCDC56 y

CCDC56-Flag. CCDC56 está representado en gris con su presecuencia rayada. Las colas HA y Flag están
representados en rosa y verde respectivamente. Una parte de la proteína HA-CCDC56 no es procesada y es
detectada por anticuerpos anti-HA y el antisuero anti-CCDC56. La proteína HA-CCDC56 procesada únicamente
es detectada con el antisuero anti-CCDC56. La presecuencia de CCDC56-Flag es procesada normalmente y la
proteína resultante es detectada tanto por anti-Flag como por el antisuero anti-CCDC56.
84
Resultados
Puesto que en la línea que expresa HA-CCDC56 coexisten dos formas distintas de
CCDC56, continuamos los experimentos únicamente con la línea que expresa CCDC56-Flag, que
probablemente nos permitirá una interpretación más clara de los resultados.
Seguidamente, procedimos a analizar la localización subcelular de CCDC56-Flag mediante
inmunocitoquímica con anticuerpos anti-Flag. Como marcador de la red mitocondrial se utilizó
el colorante fluorescente Mitotracker Red (Invitrogen), dependiente de potencial de membrana.
Como muestra la superposición de imágenes de microscopía confocal (Figura 17), la señal de
CCDC56-Flag colocaliza totalmente con la señal del Mitotracker, confirmando que la proteína
CCDC56 se encuentra localizada en mitocondria.
Figura 17. Localización subcelular de CCDC56-Flag. Inmunocitoquímica de la línea CCDC56-Flag. La

imagen de las células se tomó con microscopía óptica de contraste interdiferencial o Nomarski (DIC). CCDC56-
Flag se detectó utilizando anticuerpos anti-Flag. La distribución mitocondrial de las células se analizó mediante
incubación con el marcador específico mitocondrial Mitotracker Red (Invitrogen). Las imágenes se tomaron en
un microscopio confocal Carl Zeiss.
La purificación de mitocondrias de la línea que sobreexpresa CCDC56-Flag y su posterior

subfraccionamiento nos permitieron estudiar con precisión en qué compartimento mitocondrial se
encuentra localizada esta proteína. En primer lugar, la ruptura mediante sonicación y centrifugación
de estas mitocondrias permite separar las fracciones soluble y de membrana. A su vez, el tratamiento
de la fracción de membrana con carbonato de sodio facilita la separación de las proteínas que se
encuentran asociadas a la membrana de forma extrínseca de aquellas proteínas integrales de la
membrana mitocondrial. Como muestran los resultados en la figura 18, la MnSOD mitocondrial, una
proteína de la matriz, aparece en la fracción de las proteínas solubles. CCDC56-Flag, sin embargo,
se encuentra localizada en la fracción correspondiente a las proteínas integrales de membrana,
junto con porina o COX1. Estos resultados confirman la predicción de las bases de datos, que
indican que CCDC56 es una proteína integral de la membrana mitocondrial interaccionando con
ésta a través de un dominio transmembrana entre los aminoácidos 58 y 78.
85
Resultados
A. P
B.
Mit S MS MP “Coiled-Coil”
Porina
CCDC56
Membrana
COX1
mitocondrial
MnSOD
CCDC56-Flag
Figura 18. Localización submitocondrial de CCDC56-Flag. A) Fraccionamiento de mitocondrias de la línea

que sobreexpresa CCDC56-Flag. Mit: extracto mitocondrial total. S: Fracción de proteínas solubles. P: Fracción
de membrana. MS: Fracción de proteínas asociadas a la membrana mitocondrial de forma extrínseca. MP:
Fracción de proteínas integrales de la membrana mitocondrial. B) Representación esquemática de la disposición
de CCDC56 en la membrana mitocondrial.
3.3. Interferencia de CCDC56 en células HeLa

Una vez demostrada la localización mitocondrial de CCDC56 y con objeto de estudiar
la función que desempeña esta proteína dentro de la mitocondria de humanos, se diseñó un
experimento para silenciar su expresión mediante técnicas de interferencia de ARN. Ésta es una
potente estrategia experimental que induce la degradación del ARNm de interés en el citoplasma
celular mediante el empleo de pequeñas moléculas de ARN de doble cadena que hibridan con el
mismo.
Transfección transitoria de siRNAs en células HeLa y silenciamiento de CCDC56

Para silenciar la expresión de CCDC56, transfectamos células HeLa de manera transitoria
con una mezcla de 3 siRNAs (“small interfering RNAs”, Applied Biosystems) dirigidos contra
la región 3’UTR de su ARNm (Figura 19A). Mediante RT-PCR cuantitativa utilizando sondas
Taqman se analizaron los niveles de ARNm de CCDC56 tras la transfección. Con esta estrategia
de silenciamiento obtenemos una interferencia máxima de alrededor del 90% a las 24 horas de
la transfección. Desde este momento los niveles del mensajero de CCDC56 van aumentando
lentamente hasta alcanzar aproximadamente el 30% a las 96 horas de la transfección. Como
controles se han utilizado la línea HeLa sin transfectar y células HeLa transfectadas con un siRNA
cuya secuencia no es complementaria a la de ningún ARNm humano (Ki #2, Applied Biosistems)
(Figura 19B).
86
Resultados
A.
siRNA1 siRNA2 siRNA3
ARNm CCDC56
Taqman Hs00360235_m1
B. ARNm CCDC56
1,2
1,0
ARNm CCDC56
0,8 Sin transfectar

0,6 Ki #2
siRNAs CCDC56
0,4
***
0,2 ***
*** ***
0,0
24 horas 48 horas 72 horas 96 horas
Figura 19. Interferencia transitoria de CCDC56 en células HeLa. A) Representación esquemática del
ARNm de CCDC56. Los triángulos representan la localización de las zonas de homología con los siRNAs. En
azul se representa la región del ARNm detectada mediante el ensayo Taqman (Applied Biosystems). B) RT-PCR
cuantitativa del mensajero de CCDC56 tras la interferencia en células HeLa. Los niveles de ARNm de CCDC56
se cuantificaron a las 24, 48, 72 y 96 horas de interferencia mediante RT-PCR cuantitativa utilizando sondas
Taqman específicas y se estandarizaron frente a los niveles del ARNr 18S. El grado de significación estadística
se muestra como *** p<0.001.
Curvas de crecimiento
La mayor parte del ATP celular se produce en el interior de la mitocondria gracias a la
fosforilación oxidativa mediante la oxidación de los cofactores reducidos procedentes del
metabolismo de la glucosa y los ácidos grasos. La galactosa entra en el proceso de glucólisis
transformándose sucesivamente a galactosa-1-fosfato y fructosa-1-fosfato. Esta conversión de la
galactosa no es muy eficiente, por lo que el suministro de ATP procedente de la glucólisis a partir
de galactosa es insuficiente pata satisfacer la demanda de energía de las células en ausencia de un
sistema OXPHOS funcional. Así, para comprobar si la interferencia de CCDC56 causaba algún
defecto en el sistema OXPHOS y, por lo tanto, en la producción de ATP, realizamos curvas de
crecimiento en presencia de 4.5 g/l de glucosa o 0.9 g/l de galactosa como fuentes de carbono.
Como se puede observar en la figura 20, las células con bajos niveles de CCDC56, si bien
son capaces de crecer en medio con glucosa, lo hacen más lentamente que los controles. Asimismo,
estas células presentan un severo defecto de crecimiento cuando se les suministra galactosa como
fuente de carbono, indicando que la ausencia de CCDC56 está causando un defecto de la producción
de ATP.
87
Resultados
Figura 20. Curvas de crecimiento en glucosa y galactosa de las células con la deficiencia de CCDC56.
Las células control o con la interferencia de CCDC56 fueron cultivadas en medio suplementado con 4.5 g/l de
glucosa (panel de arriba) o 0.9 g/l de galactosa (panel de abajo). El grado de significación estadística se muestra
como *** p<0.001, ** p<0.01 y * p<0.05.
Medida de la actividad de los complejos de la cadena respiratoria

Para confirmar que la deficiencia de CCDC56 estaba produciendo un defecto de la cadena
de transporte electrónico, medimos la actividad de los complejos I, II, III y IV de la cadena
respiratoria y del enzima citrato sintasa, utilizado frecuentemente como marcador de la cantidad
de masa mitocondrial. Estas medidas se realizaron a las 96 horas de interferencia, ya que hasta este
momento el ARNm de CCDC56 permanece aún en niveles bajos y es un tiempo suficiente para que
se pueda manifestar algún fenotipo en las células interferidas.
Como se muestra en la figura 21, no se observan diferencias significativas en la actividad
de los complejos I, II y III ni en la actividad citrato sintasa en ninguna de las líneas estudiadas. Sin
embargo, en las células con la interferencia de CCDC56 la actividad del complejo IV se encuentra
muy disminuida, hasta aproximadamente el 40% de la actividad de los controles. Así pues, la
interferencia de CCDC56 en células HeLa reproduce los resultados de las líneas “knock-out” de
Drosophila melanogaster, reforzando a CCDC56 como responsable del fenotipo de las larvas KO e
indicando que esta proteína es esencial para la correcta actividad de COX en células humanas.
88
Resultados
A. B.
Complejo I Complejo II Citrato sintasa
18 18
15 15 250
(nmol.min -1.mg -1)
(nmol.min -1.mg -1)
(nmol.min -1.mg -1)
12 12 200
9 9 150
6 6 100
3 3 50
0 0 0
siRNAs siRNAs siRNAs
Sin transfectar Ki #2 Sin transfectar Ki #2 Sin transfectar Ki #2
CCDC56 CCDC56 CCDC56
C.
Complejo III Complejo IV ARNm CCDC56
100
60
90 1,4
80 50
(nmol.min -1.mg -1)
1,2
(nmol.min -1.mg -1)
70
40
ARNm CCDC56
1,0
60
50 30 0,8
40
30 20 *** 0,6
0,4
20
10 ***
10 0,2
0 0
0,0
siRNAs siRNAs
Sin transfectar Ki #2 Sin transfectar Ki #2 siRNAs
CCDC56 CCDC56 Sin transfectar Ki #2
CCDC56
Figura 21. Medida de la actividad de los complejos de la cadena respiratoria y del enzima citrato
sintasa a las 96 horas de interferencia de CCDC56. A) Actividades específicas de los complejos I, II, III y
IV de las distintas líneas celulares, expresadas en nmol.min-1.mg-1. B) Actividad específica de la actividad del
enzima citrato sintasa en las distintas líneas celulares, expresada en nmol.min-1.mg-1. C) RT-PCR cuantitativa del
mensajero de CCDC56 utilizando sondas Taqman específicas. Los niveles de ARNm se estandarizaron frente a
los niveles del ARNr 18S. El grado de significación estadística se muestra como *** p<0.001.
Evaluación de los niveles de los complejos de la cadena respiratoria totalmente ensamblados

El defecto del complejo IV que presentan las células con la deficiencia de CCDC56 puede
estar causado bien porque se haya producido una disminución en los niveles del mismo, o bien
porque, a pesar de tener complejo totalmente ensamblado, éste no sea funcional.
Con el fin de analizar los niveles de complejo IV totalmente ensamblado en las células
interferidas, preparamos extractos mitocondriales a las 96 horas de la transfección y separamos los
complejos de la cadena respiratoria mediante electroforesis en condiciones nativas (“Blue Native”
PAGE). Los resultados obtenidos muestran una clara disminución de la cantidad de complejo IV
totalmente ensamblado y del supercomplejo III+IV en las líneas interferidas, mientras que, en
línea con los resultados de actividad, no hay diferencias en la cantidad de los complejos I, II, III o
V (Figura 22A). Del mismo modo, esta disminución en los niveles de COX correlaciona con los
ensayos de actividad en gel (“In Gel Activity assays”, IGA), en los cuales los geles de BN-PAGE se
incuban con los sustratos para cada complejo y un aceptor final de los electrones que al reducirse
produce un precipitado coloreado (Figura 22A).
89
Resultados
A. BN-PAGE
Sin transfectar
CCDC56
siRNAs
Ki #2
α NDUFA9 CI
α β-ATPasa CV
B.
ARNm CCDC56
CIII+CIV 1,4
α CIII Core2 1,2

CIII
ARNm CCDC56
1,0
0,8
α COX5a CIV
0,6
0,4 ***
α CII 70KDa CII 0,2
0,0
siRNAs
Sin transfectar
Sin transfectar Ki #2
IGA CCDC56
CCDC56
siRNAs
Ki #2
CI
CIV
Figura 22. Electroforesis en condiciones nativas (BN-PAGE) de los complejos de la cadena respiratoria
en células con la interferencia de CCDC56. A) Panel superior: BN-PAGE de las líneas control y con la
deficiencia de CCDC56. Los complejos del sistema de fosforilación oxidativa se separaron en geles del 4%
al 15% y se analizaron sus niveles utilizando los anticuerpos anti-NDUFA9 para el complejo I, anti-βATPasa
para el complejo V, anti-CIII Core2 para el complejo III, anti-COX5a para el complejo IV y anti-CII 70KDa
para el complejo II. Panel inferior: ensayo de actividad en gel de los complejos I y IV en las líneas control y
con la deficiencia de CCDC56. B) RT-PCR cuantitativa del mensajero de CCDC56 utilizando sondas Taqman
específicas. Los niveles de ARNm se estandarizaron frente a los niveles del ARNr 18S. El grado de significación
estadística se muestra como *** p<0.001.
Además, en los distintos experimentos de “Blue Native” y sus correspondientes medidas

de actividad de la cadena respiratoria hemos observado que existe una clara correlación entre la
actividad de COX de las células, su cantidad de complejo totalmente ensamblado y el grado de
interferencia obtenido. Estos datos apoyan el hecho de que es la disminución en la cantidad del
enzima la responsable de la bajada de actividad y que, por lo tanto, el complejo IV residual que
presentan las células interferidas es totalmente activo.
Cuantificación de las proteínas de los complejos de la cadena respiratoria

Dado el bajo nivel de complejo IV ensamblado que presentan las células con CCDC56
interferido, a continuación nos planteamos estudiar cómo se encuentran los niveles de las proteínas
que lo componen. Para ello, a las 96 horas de interferencia analizamos mediante Western Blot los
niveles de COX1, COX2, COX3, COX4 y COX5a, únicas subunidades del enzima para las que
disponemos anticuerpos. Como control adicional del experimento analizamos los niveles de una
subunidad de cada uno del resto de complejos.
90
Resultados
A.
Sin siRNAs
transfectar Ki #2 CCDC56
NDUFA9
CII 70KDa
CIII Core 2 B.
ARNm CCDC56
COX1 1,4
1,2
COX2
ARNm CCDC56
1,0
0,8
0,6
COX3 0,4 ***
0,2
COX4 0,0
siRNAs
CCDC56
COX5a
βATPasa
Porina
Figura 23. Cuantificación mediante Western Blot de los niveles de las subunidades de los complejos de
la cadena respiratoria en las líneas con la interferencia de CCDC56. A) Western Blot de las subunidades
NDUFA9 del complejo I, CII 70KDa del complejo II, CIII Core2 del complejo III, COX1, COX2, COX3, COX4
y COX5a del complejo IV y βATPasa del complejo V en extractos mitocondriales de las líneas control y con la
interferencia de CCDC56. La porina se utilizó como control de carga del experimento. B) RT-PCR cuantitativa
del mensajero de CCDC56 utilizando sondas Taqman específicas. Los niveles de ARNm se estandarizaron frente
a los niveles del ARNr 18S. El grado de significación estadística se muestra como *** p<0.001.
Como se muestra en la figura 23, la disminución de los niveles de CCDC56 provoca una
caída tanto de las subunidades codificadas en el ADNmt COX1, COX2 y COX3 como de la
subunidad codificada en el núcleo COX4, mientras que los niveles de COX5a apenas se encuentran
afectados. Por otro lado, y en concordancia con los datos obtenidos anteriormente, no observamos
ningún cambio en los niveles de las proteínas del resto de complejos (NDUFA9 del complejo I, CII
70KDa del complejo II, CIII Core2 del complejo III y βATPasa del complejo V).
Cuantificación de los mensajeros mitocondriales

La disminución de los niveles de las subunidades del complejo IV codificadas en el ADNmt
causada por el “knock-down” de CCDC56, podría deberse a que esta proteína esté participando en
la transcripción, procesamiento o estabilidad de sus mensajeros. Para valorar si los bajos niveles
de COX1, COX2 o COX3 estaban causados por un defecto en la expresión de alguno de sus
transcritos, cuantificamos mediante RT-PCR cuantitativa los niveles de los mensajeros de las tres
91
Resultados
subunidades de COX. Como control cuantificamos algunos de los ARNm mitocondriales que
codifican subunidades del resto de complejos de la cadena respiratoria.
Los resultados mostraron que las células interferidas presentan niveles similares a los
controles de todos los mensajeros analizados y que, por lo tanto, los bajos niveles de las proteínas
COX1, COX2 y COX3 no se deben a un problema en la transcripción o la estabilidad de sus
mensajeros (Figura 24).
A. ARNm mitocondriales Sin transfectar

1,8
Ki #2
1,5 siRNAs CCDC56
Niveles ARNm
1,2
0,9
0,6
0,3
0,0
RNR1 COX1 COX2 ATP6 COX3 ND5 CytB
B. ARNm CCDC56
1,2
1,0
ARNm CCDC56
0,8
0,6
0,4
***
0,2
0,0
siRNAs
CCDC56
Figura 24. Cuantificación mediante RT-PCR cuantitativa de los niveles de los ARNm mitocondriales
en las líneas con CCDC56 interferido. A) RT-PCR cuantitativa utilizando SYBR Green (Applied Biosystems)
y oligonucleótidos específicos para cada uno de los genes analizados. Se analizaron los niveles de los ARNm de
COX1, COX2 y COX3 del complejo IV, ND5 del complejo I, CytB del complejo III, ATP6 del complejo V y
RNR1 (ARNr 12S) en las células control y con la interferencia de CCDC56. Los niveles de ARNm se expresan en
unidades relativas con respecto a las células HeLa. B) RT-PCR cuantitativa del mensajero de CCDC56 utilizando
sondas Taqman específicas. Los niveles de ARNm se estandarizaron frente a los niveles del ARNr 18S. El grado
de significación estadística se muestra como *** p<0.001.
Análisis in vivo de la síntesis de proteínas mitocondriales

Puesto que los niveles de los mensajeros mitocondriales no se encontraban afectados en las
células interferidas para CCDC56, nos planteamos si los bajos niveles de las subunidades de COX
se debían a una traducción menos eficiente de sus transcritos.
Para determinar si CCDC56 está implicado en la traducción de las subunidades del
complejo IV codificadas en el ADNmt, se llevó a cabo el marcaje in vivo de los productos de la
traducción mitocondrial en células interferidas durante 72 horas. Para ello, como se detalla en
materiales y métodos, las células control e interferidas se incubaron con metionina marcada con el
92
Resultados
radioisótopo S35 durante 30, 60 o 90 minutos, en presencia de un agente bloqueante de la traducción

citoplasmática. Los productos de la traducción mitocondrial se separaron mediante electroforesis
en gradiente en condiciones desnaturalizantes, los geles fueron autorradiografiados y se cuantificó
la señal de cada una de las proteínas. Los resultados sugerían que las células interferidas presentan
una tasa de síntesis de COX1 ligeramente inferior a los controles, mientras que la traducción de
COX2 y COX3, así como la del resto de proteínas codificadas en el ADNmt no se encuentra
afectada en la deficiencia de CCDC56 (Figuras 25 y 26).
Figura 25. Biosíntesis de proteínas mitocondriales en células control y con CCDC56 interferido. La
síntesis de proteínas citosólicas se inhibió con 100 μg/ml de emetina. Las proteínas mitocondriales se marcaron
con S35-Met en tres pulsos de 30, 60 y 90 minutos según se describe en materiales y métodos. Las proteínas
marcadas se separaron en geles desnaturalizantes SDS-PAGE en gradiente del 15 al 20% y fueron analizados
posteriormente por autorradiografía directa de los geles.
Como se puede observar en la autorradiografía (Figura 25) y en la posterior cuantificación

de la señal de las distintas proteínas (Figura 26), a los 30 minutos de pulso la intensidad relativa
de la banda de COX1 es menor que en los controles y, además, disminuye a medida que aumenta
el tiempo de marcaje. Esta diferencia creciente en la incorporación de S35-metionina puede ser
debida a que la deficiencia de CCDC56 esté produciendo un defecto combinado de la traducción
de COX1 junto con un defecto en la estabilidad de la proteína recién sintetizada. Si las células
interferidas están sintetizando una menor cantidad de COX1 y, a su vez, esta proteína tiene una
menor estabilidad, la diferencia en la cantidad de proteína marcada entre los controles y las células
93
Resultados
interferidas se irá haciendo mayor a medida que vamos aumentando el tiempo de pulso.
A. 1,4 COX1
1,2
Sin transfectar
1,0
Intensidad COX1
** Ki #2
0,8 siRNAs CCDC56
**
0,6
*** C.
0,4 ARNm CCDC56
0,2 1,2
0,0 1,0
30 minutos 60 minutos 90 minutos
ARNm CCDC56
0,8
B. ND5
0,6
1,4 0,4
***
1,2 0,2
0,0
1,0 Sin transfectar Sin siRNAs
Ki #2
Intensidad ND5
transfectar CCDC56
Ki #2
0,8 siRNAs CCDC56
0,6
0,4
0,2
0,0
30 minutos 60 minutos 90 minutos
Figura 26. Cuantificación de la señal correspondiente a COX1 y ND5 en los experimentos de pulso en
células control y con CCDC56 interferido. A y B) Cuantificación de la señal de las proteínas COX1 (A) y
ND5 (B) en los tres tiempos de pulso en células control e interferidas. La señal correspondiente a cada banda
se cuantificó utilizando el Typhoon Trio phosphorimager system (GE Healthcare). C) RT-PCR cuantitativa del
los niveles del ARNr 18S. El grado de significación estadística se muestra como *** p<0.001 y ** p<0.01.
Análisis in vivo de la estabilidad de las proteínas mitocondriales

Para confirmar nuestra hipótesis de que en ausencia de CCDC56 la proteína COX1 tiene una
menor estabilidad, llevamos a cabo experimentos de pulso y caza a las 72 horas de la transfección
de los siRNAs. Para ello, tras un marcaje de 30 minutos, se dejó a las células control e interferidas
seguir creciendo en un medio que no contenía metionina radiactiva durante 0, 2, 4 o 7 horas.
Como muestran los geles y la cuantificación de la señal, en ausencia de CCDC56 la proteína
COX1 recién sintetizada se degrada más rápidamente que en las células control, desapareciendo
prácticamente a las siete horas de su síntesis. Esta degradación más rápida no se observa en COX2,
COX3, ni en el resto de proteínas codificadas en el ADNmt (Figuras 27 y 28).
94
Resultados
Sin transfectar Ki #2 siRNAs CCDC56

Caza (horas) 0 2 4 7 0 2 4 7 0 2 4 7
ND5
COX1
ND4
CytB
ND2
ND1
COX3
COX2
ATP6
ND3
ND6
ND4L/ATP8
Figura 27. Análisis de la estabilidad de las proteínas mitocondriales sintetizadas de novo en células
control y con CCDC56 interferido. La síntesis de proteínas citosólicas se inhibió con 100 μg/ml de anisomicina
y las proteínas se marcaron con un pulso de 30 minutos de S35-Met (0h). Una vez retirados el antibiótico
anisomicina y la S35-Met del medio, las células fueron incubadas durante 2h, 4h y 7h en medio completo (cazas).
Las proteínas se separaron en geles SDS-PAGE en gradiente del 15-20% y los geles se autorradiografiaron.
A.
COX1
1,2
1,0
Intensidad COX1
0 horas
0,8
* 2 horas
*
0,6 * 4 horas
0,4
7 horas
C. ARNm CCDC56
0,2
** **
1,2
0,0 1,0

ARNm CCDC56
0,8
B. ND5
0,6
1,2 0,4
0,2 ***
1,0
0,0
Intensidad ND5
0 horas Sin Ki #2 siRNAs

0,8
transfectar CCDC56
2 horas
0,6
4 horas
0,4 7 horas
0,2
0,0
Figura 28. Cuantificación de la señal correspondiente a COX1 y ND5 en los experimentos de pulso y
caza en células control y con CCDC56 interferido. A y B) Cuantificación de la señal de las proteínas COX1
(A) y ND5 (B) en cada tiempo de caza en células control e interferidas. La señal correspondiente a cada banda
se cuantificó utilizando el Typhoon Trio phosphorimager system (GE Healthcare). C) RT-PCR cuantitativa del
mensajero de CCDC56 utilizando sondas Taqman específicas. Los niveles de ARNm se estandarizaron frente
a los niveles del ARNr 18S. El grado de significación estadística se muestra como *** p<0.001, ** p<0.01 y *
p<0.05.
95
Resultados
Como se ha mostrado en los Western Blot (Figura 23), a las 96 horas de interferencia de
CCDC56 las células presentan niveles bajos de COX2 y COX3 y sin embargo, no hemos observado
ningún defecto en su síntesis ni, aparentemente, en su degradación. Los bajos niveles de estas dos
proteínas pueden explicarse si en las células interferidas se está produciendo una degradación de
ambas más rápida que en los controles pero en una ventana de tiempo más larga que las 7 horas
analizadas en nuestros ensayos de pulso y caza.
Análisis del ensamblaje del complejo IV mediante BN-PAGE y 2D BN/SDS-PAGE

Como hemos visto, la falta de CCDC56 provoca un leve defecto en la síntesis de COX1 que
va acompañado de una degradación rápida de la proteína recién sintetizada. Esto unido al hecho
de que COX2, COX3 y la subunidad codificada en el núcleo COX4 se encuentran disminuidas en
células con la interferencia de CCDC56 parece sugerir la existencia de un defecto en el ensamblaje
del complejo IV. Este fenómeno ya se ha observado en levaduras y en algunos pacientes con
defectos de ensamblaje del mismo, en los cuales el bloqueo en la formación de COX provoca la
degradación de los intermediarios de ensamblaje y la disminución, por tanto, de las proteínas que
los forman (Nijtmans et al., 2001, Antonicka et al., 2003a).
Por esta razón nos planteamos estudiar si el proceso de ensamblaje del complejo IV se
estaba produciendo de forma correcta. En primer lugar analizamos la dinámica de ensamblaje
de los complejos de la cadena respiratoria. Para ello se trataron las células con el antibiótico
cloranfenicol, inhibidor de la traducción mitocondrial, durante dos días. En estas condiciones de
ausencia de síntesis, los complejos de la cadena respiratoria se degradan hasta casi su desaparición.
Posteriormente, se retiró el cloranfenicol del medio y se recogieron muestras seriadas con el fin de
estudiar mediante BN-PAGE la cinética de formación de los complejos de la cadena respiratoria
tanto en células control como en células con bajos niveles de CCDC56.
Los resultados se muestran en la figura 29, donde se observa que las células control van
recuperando los niveles de complejo IV hasta alcanzar a las 72 horas de la retirada del cloranfenicol
el nivel de las células que no han sido tratadas con el antibiótico. Sin embargo, en las células
interferidas apenas hay aparición del complejo IV totalmente ensamblado hasta las 72 horas de
retirada del cloranfenicol, indicando que CCDC56 es esencial para su formación. La formación del
resto de complejos de la cadena respiratoria no se encuentra afectada en las células deficientes para
CCDC56, indicando que esta proteína interviene específicamente en la biogénesis de COX.
96
Resultados
Cm 10 µg/ml - Cm Cm 10 µg/ml - Cm Cm 10 µg/ml - Cm

Recuperación (horas) 0 8 24 48 72 72 0 8 24 48 72 72 0 8 24 48 72 72
CIII+IV
α CIII Core2 CIII
CIII+IV
α COX5a
CIV
Interferencia CCDC56 (horas) 12 20 36 60 84 84 12 20 36 60 84 84 12 20 36 60 84 84
Figura 29. Cinética de formación de los complejos III y IV de la cadena respiratoria en células control
y con CCDC56 interferido mediante BN-PAGE. Se trataron las células control e interferidas con 5 μg/
ml de cloranfenicol (Cm) durante 2 días y tras la retirada del antibiótico se dejaron recuperar los niveles de
complejo totalmente ensamblado durante 8h, 24h, 48h y 72h. El complejo III se detectó con anticuerpos contra
la subunidad CIII Core2. El complejo IV se detectó con anticuerpos contra la subunidad COX5a.
Con objeto de analizar si este defecto en la formación del complejo IV se debe a que
CCDC56 está participando en su ensamblaje, a las 96 horas de interferencia y tras la separación de
los complejos de la cadena respiratoria en geles de BN-PAGE se llevó a cabo una segunda dimensión
en condiciones desnaturalizantes. Estos geles 2D BN/SDS-PAGE permiten la separación de las
proteínas que componen cada uno de los complejos y sus respectivos subcomplejos.
En primer lugar, confirmando los resultados observados tanto BN-PAGE como en
Western Blot, en ausencia de CCDC56 observamos una menor cantidad de complejo IV totalmente
ensamblado (S4) y una menor cantidad de las proteínas que lo componen en comparación con los
controles (Figura 30 A y C). Por otro lado, el análisis de estos geles 2D BN/SDS-PAGE reveló que
en las células sin transfectar y las células transfectadas con el Ki #2 el ensamblaje del complejo IV
procede de forma normal, mientras que en las células interferidas se observa la acumulación de un
subcomplejo que contiene al menos COX4. Se trata muy probablemente de una acumulación del
subcomplejo S2, ya que su peso molecular es similar al descrito para este subcomplejo (Nijtmans
et al., 1998) y aunque no se observa de forma tan evidente, COX1 y COX5a también parecen
formar parte del mismo. Esta acumulación de subcomplejos en las células interferidas nos muestra
que CCDC56 juega un papel fundamental para el ensamblaje de complejo IV y que se trata por lo
tanto de una nueva proteína que interviene en los pasos iniciales de la formación de la citocromo c
oxidasa en células humanas.
97
Resultados
C. BN-PAGE
SDS-PAGE
CIII+IV S4 S3 S2 S1
Sin transfectar
Sin transfectar
A. COX1
CCDC56
siRNAs
Ki #2
COX2
CIII+CIV COX4
α CIII Core2 COX5a
CIII
BN-PAGE
α COX1 CIV
SDS-PAGE
CIII+IV S4 S3 S2 S1
α CII 70KDa CII COX1
Ki #2
COX2
B. ARNm CCDC56
COX4
COX5a
1,2
1,0
ARNm CCDC56
0,8 BN-PAGE
SDS-PAGE
0,6
CIII+IV S4 S3 S2 S1
siRNAs CCDC56
0,4
0,2 *** COX1

0,0
siRNAs
Sin transfectar Ki #2 COX2
CCDC56
COX4
COX5a
Figura 30. Análisis de los intermediarios de ensamblaje del complejo IV mediante 2D BN/SDS-PAGE
en células control y con CCDC56 interferido. A) BN-PAGE de las líneas control y con la deficiencia de
CCDC56 a las 96 horas de interferencia. Para los experimentos de 2D BN/SDS-PAGE las células fueron
retransfectadas con los siRNAs a las 48 horas de la primera transfección. Los complejos de la cadena respiratoria
se separaron en geles del 4% al 18% y se analizaron sus niveles utilizando los anticuerpos anti-CIII Core2 para el
complejo III, anti-COX1 para el complejo IV y anti-CII 70KDa para el complejo II. B) RT-PCR cuantitativa del
los niveles del ARNr 18S. El grado de significación estadística se muestra como *** p<0.001. C) 2D BN/SDS-
PAGE. Tras la separación en geles de “Blue Native” las muestras se separaron en geles desnaturalizantes al 12%
de acrilamida y se transfirieron a membranas de PVDF. Se analizaron las subunidades COX1, COX2, COX4 y
COX5a con anticuerpos específicos en células sin transfectar (panel superior), transfectadas con el control Ki
#2 (panel central) y transfectadas con los siRNAs inductores de la interferencia de CCDC56 (panel inferior).
3.4. Rescate del fenotipo mediante la sobreexpresión de CCDC56

Con objeto de confirmar que los fenotipos observados se deben exclusivamente al efecto de
la interferencia de CCDC56, se diseñó un experimento de rescate para revertir el defecto de COX
que presentan las células interferidas.
Para ello se utilizó la línea celular, previamente generada, que sobreexpresa de manera estable
la proteína CCDC56-Flag. La transfección de los siRNAs en esta línea interferirá únicamente el
98
Resultados
gen endógeno y no la versión sobreexpresada, ya que esta línea expresa una construcción que
comprende exclusivamente la región codificante de CCDC56 y no la región 3’ UTR contra la
que van dirigidos los tres siRNAs (Figura 31). De esta forma conseguiremos expresar la proteína
CCDC56-Flag en células en las que el gen CCDC56 endógeno está interferido para así analizar si
rescata su fenotipo.
siRNA1 siRNA2 siRNA3
ARNm CCDC56
endógeno
ARNm
CCDC56-Flag Flag
Taqman Hs00360235_m1
Figura 31. Representación esquemática de las construcciones utilizadas en los experimentos de

rescate. Para los experimentos de complementación se utilizó una construcción CCDC56-Flag que no contenía
la región 3’UTR del mensajero endógeno por lo que no estaba sujeta a la interferencia inducida por los siRNAs
utilizados. La sonda Taqman utilizada para la cuantificación del ARNm de CCDC56 no discrimina entre el
mensajero endógeno y el mensajero que expresa la proteína CCDC56-Flag.
La medida de la actividad del complejo IV a las 96 horas de interferencia mostró que,

tanto en células HeLa como en aquellas que contienen el vector pIRESpuro2, la transfección de
los siRNAs contra CCDC56 provocaba una caída en la actividad de COX. Sin embargo, en las
mismas condiciones experimentales las células que sobreexpresan CCDC56-Flag presentan una
actividad del complejo IV similar a los controles, rescatándose completamente el fenotipo de la
interferencia (Figura 32A). La actividad del resto de los complejos de la cadena respiratoria, así como
la actividad citrato sintasa (Figura 32B) no presentan ninguna variación en las células interferidas.
La cuantificación del ARNm de CCDC56, utilizando una sonda Taqman que no discrimina entre la
forma endógena del gen y la sobreexpresada, mostró que en estas células los niveles de expresión
del ARNm CCDC56-Flag son unas 30 veces superiores a los niveles del gen endógeno (Figura
32C). Estos resultados nos permiten concluir que es la ausencia de CCDC56 la responsable de los
fenotipos que hemos observado en las células interferidas.
99
Resultados
A.
Complejo IV
40
35
(nmol.min -1 .mg -1 )
30 Sin transfectar
25 Ki #2
20
*** *** siRNAs CCDC56
15
10
5
0
HeLa pIRESpuro2 CCDC56-Flag
B.
250 Citrato sintasa
200
(nmol.min -1 .mg -1 )
Sin transfectar
150
Ki #2
siRNAs CCDC56
100
50
0
C. ARNm CCDC56
40
30
20 Sin transfectar
ARNm CCDC56
Ki #2
siRNAs CCDC56
2,0
1,5
1,0
0,5 *** ***
0,0
Figura 32. Rescate de la actividad del complejo IV mediante la sobreexpresión de CCDC56-Flag. A)

Actividad específica del complejo IV en células HeLa, en células HeLa transfectadas con el vector pIRESpuro2
y en células que sobreexpresan CCDC56-Flag. Cada una de estas líneas fue a su vez transfectada con el
siRNA control Ki #2 y los siRNAs contra CCDC56. La actividad específica está expresada en nmol.min-1.
mg-1. B) Actividad específica del enzima citrato sintasa en éstas líneas expresada en nmol.min-1.mg-1. C) RT-
PCR cuantitativa del mensajero de CCDC56 utilizando sondas Taqman específicas. Los niveles de ARNm se
estandarizaron frente a los niveles del ARNr 18S. El grado de significación estadística se muestra como ***
p<0.001.
3.5. Sobreexpresión de CCDC56 en células HeLa

El siguiente paso en la caracterización funcional de CCDC56 consistió en analizar el efecto
que producía la sobreexpresión de esta proteína en células HeLa. Todos estos experimentos se han
llevado a cabo en la línea celular que sobreexpresa CCDC56-Flag.
Medida de la actividad de los complejos de la cadena respiratoria

Puesto que la interferencia de CCDC56 provocaba una caída en la actividad del complejo
100
Resultados
IV, analizamos el efecto de su sobreexpresión sobre la actividad de los complejos de la cadena

respiratoria. Como podemos observar en la figura 33, la sobreexpresión de CCDC56 no tiene
ningún efecto significativo sobre la actividad de los complejos I, II y IV. Tampoco se observa ningún
cambio en la actividad citrato sintasa, marcador de la cantidad de mitocondrias. Curiosamente, sin
embargo, el aumento de CCDC56 está provocando un incremento en la actividad del complejo III
pese a que la interferencia de esta proteína no afecta a la actividad del mismo.
A. Complejo I Complejo II
B. Citrato sintasa
14 12
12 10 200
(nmol.min -1.mg -1)
(nmol.min -1.mg -1)

10 8
(nmol.min -1.mg -1)
150
8
6
6 100
4
4
50
2 2
0 0 0
pIRES CCDC56 pIRES CCDC56 pIRES CCDC56
HeLa HeLa HeLa
puro2 Flag puro2 Flag puro2 Flag
Complejo III Complejo IV C. ARNm CCDC56

60
* 45 35
50 40 30
***
35
(nmol.min -1.mg -1)
25
(nmol.min -1.mg -1)
40
ARNm CCDC56
30
20
30 25
20 15
20 15
10
10
10 5
5
0 0 0
pIRES CCDC56 pIRES CCDC56 pIRES CCDC56
HeLa HeLa HeLa
puro2 Flag puro2 Flag puro2 Flag
Figura 33. Medida de la actividad de los complejos de la cadena respiratoria y del enzima citrato
sintasa en células que sobreexpresan CCDC56-Flag. A) Las gráficas representan las actividades específicas
de los complejos I, II, III y IV de células HeLa, células transfectadas con el vector pIRESpuro2 y células que
sobreexpresan CCDC56-Flag desde el mismo vector. Las actividades específicas están expresadas en nmol.min-1.
mg-1. B) Actividad específica de la actividad del enzima citrato sintasa en las distintas líneas celulares, expresada
en nmol.min-1.mg-1. C) RT-PCR cuantitativa del mensajero de CCDC56 utilizando sondas Taqman específicas.
Los niveles de ARNm se estandarizaron frente a los niveles del ARNr 18S. El grado de significación estadística
se muestra como *** p<0.001.
Evaluación de los niveles de los complejos de la cadena respiratoria totalmente ensamblados

Para confirmar los resultados obtenidos con la medida de actividad de los complejos, se
llevaron a cabo experimentos de “Blue Native” para analizar los niveles de todos los complejos de la
cadena respiratoria. Como muestran los resultados del BN-PAGE, la sobreexpresión de CCDC56-
Flag no afecta a la cantidad de complejo I, II, IV o V totalmente ensamblados, corroborando las
medidas de actividad llevadas a cabo anteriormente (Figura 34). Sin embargo, no se observa un
aumento en la cantidad de complejo III totalmente ensamblado, contrariamente a lo que podrían
sugerir las medidas espectrofotométricas de la actividad del mismo.
101
Resultados
A. B.
CCDC56-Flag
pIRESpuro2
ARNm CCDC56
HeLa
35 **
α NDUFA9 CI 30
25
ARNm CCDC56
α βATPasa CV 20
15
CIII+CIV
α CIII Core2 10
CIII
5
α COX5a CIV
0
pIRES CCDC56
HeLa
puro2 Flag
α CII 70KDa CII
Figura 34. Electroforesis en condiciones nativas (BN-PAGE) de los complejos de la cadena respiratoria
en células sobreexpresando CCDC56-Flag. A) BN-PAGE de las líneas control y sobreexpresando CCDC56-
Flag. Los complejos del sistema de fosforilación oxidativa se separaron el geles nativos con un gradiente del 4
al 15% de acrilamida y se analizaron sus niveles utilizando los anticuerpos anti-NDUFA9 para el complejo I,
anti-βATPasa para el complejo V, anti-CIII Core2 para el complejo III, anti-COX5a para el complejo IV y anti-
CII 70KDa para el complejo II. B) RT-PCR cuantitativa del mensajero de CCDC56 utilizando sondas Taqman
específicas. Los niveles de ARNm se estandarizaron frente a los niveles del ARNr 18S. El grado de significación
estadística se muestra como ** p<0.01.
Cuantificación de las proteínas de los complejos de la cadena respiratoria

A continuación y puesto que en las células interferidas los niveles de las subunidades de
COX se encontraban muy disminuidos, nos planteamos analizar mediante Western Blot el efecto
de la sobreexpresión de CCDC56 sobre los niveles de las subunidades del complejo IV, así como
de una subunidad de cada uno del resto de complejos.
Como se observa en la figura 35, no se aprecian cambios significativos en el nivel de ninguna
de las subunidades que forman parte del complejo IV ni en aquellas subunidades pertenecientes al
resto de complejos de la cadena de transporte electrónico que se han analizado en este experimento.
102
Resultados
A.
CCDC56-Flag
pIRESpuro2
α NDUFA9
α CII 70KDa
α CIII Core2 B. ARNm CCDC56

35
α COX1
30
***
α COX2 25
ARNm CCDC56
20
α COX3
15
10
α COX4
5
α COX5a 0
pIRES CCDC56
HeLa
puro2 Flag
α βATPasa
α Porina
α Flag
α CCDC56
Figura 35. Cuantificación mediante Western Blot de los niveles de las subunidades de los complejos
del sistema OXPHOS en las líneas que sobreexpresan CCDC56-Flag. A) Western Blot de las subunidades
NDUFA9 del complejo I, CII 70KDa del complejo II, CIII Core2 del complejo III, COX1, COX2, COX3,
COX4 y COX5a del complejo IV y β-ATPasa del complejo V en extractos mitocondriales de las líneas control
y con la sobreexpresión de CCDC56-Flag. La sobreexpresión de CCDC56-Flag se confirmó con anticuerpos
anti-Flag y anti-CCDC56. La porina se utilizó como control de carga del experimento. B) RT-PCR cuantitativa
del mensajero de CCDC56 utilizando sondas Taqman específicas. Los niveles de ARNm se estandarizaron frente
a los niveles del ARNr 18S. El grado de significación estadística se muestra como *** p<0.001.
3.6. Búsqueda de proteínas que interaccionen con CCDC56

Con objeto de profundizar en el estudio de la función de CCDC56, a continuación nos
planteamos la búsqueda de posibles interactores de esta proteína utilizando para ello la línea de
células HeLa que sobreexpresa CCDC56-Flag.
En primer lugar, para analizar qué peso molecular presenta CCDC56 en condiciones nativas
llevamos a cabo experimentos de BN-PAGE que nos permitirían estudiar cuál es el peso molecular
de CCDC56 en condiciones nativas y por lo tanto indicarían si se encuentra unido a otras proteínas.
Sin embargo, no obtuvimos ninguna señal tras la incubación de estas membranas con anticuerpos
anti-Flag en las condiciones utilizadas.
103
Resultados
Puesto que en los geles de BN-PAGE no se obtuvo ninguna señal de CCDC56-Flag,

llevamos a cabo geles 2D BN/SDS-PAGE que facilitan la detección de las proteínas debido a que
se utilizan condiciones desnaturalizantes. Como se muestra en la figura 36, utilizando anticuerpos
anti-Flag se puede observar que CCDC56 se encuentra formando varios complejos discretos que
varían en tamaño desde los aproximadamente 12 KDa de CCDC56-Flag monomérica hasta algo
más de 880 KDa. Este resultado nos indica que CCDC56 en condiciones nativas se encuentra
interactuando con otras proteínas, que probablemente están participando junto con CCDC56 en
el ensamblaje del complejo IV. No podemos descartar que en estos complejos CCDC56-Flag esté
interactuando con alguno de los intermediarios de ensamblaje del complejo IV.
BN-PAGE
SDS-PAGE
CIII+IV S4 S3 S2S1
COX1
pIRESpuro2
CCDC56-Flag
CCDC56-Flag
880 KDa 440 KDa
Figura 36. Análisis del peso molecular de CCDC56-Flag en condiciones nativas mediante 2D BN/
SDS-PAGE. Tras la separación de los extractos mitocondriales de células que sobreexpresan CCDC56-Flag
en geles de “Blue Native”, éstos se separaron en geles desnaturalizantes al 12% de acrilamida y se transfirieron
a membranas de PVDF. Se indican los tres intermediarios de ensamblaje del complejo IV (S1, S2 y S3) y el
complejo totalmente ensamblado (S4) detectados con anti-COX1. CCDC56-Flag se detectó con anticuerpos
anti-Flag.
Con el fin de identificar las proteínas con las que interacciona CCDC56, a continuación
nos planteamos llevar a cabo una inmunoprecipitación de la proteína CCDC56-Flag. Para ello,
las mitocondrias de las líneas CCDC56-Flag y pIRESpuro2, como control negativo, se trataron
con 0.5% de laurilmaltósido que permite extraer CCDC56-Flag de la membrana mitocondrial y se
llevó a cabo la inmunoprecipitación de esta proteína con anticuerpos anti-Flag. Tras comprobar
mediante Western Blot que CCDC56-Flag se había eluído correctamente, analizamos que proteínas
se encontraban presentes en este eluído mediante espectrometría de masas en el servicio de
Proteómica del Centro de Biología Molecular Severo Ochoa.
El análisis mediante espectrometría de masas no ha permitido hasta la fecha identificar
ninguna proteína presente en este eluído debido a que se encontraban en muy baja proporción, lo
que hace necesario repetir este experimento partiendo de una mayor cantidad de material para así
identificar a las proteínas candidatas a interaccionar con CCDC56 y obtener nuevos datos sobre su
función.
104
Resultados
Total U W IP
IP α Flag
WB α Flag
CCDC56-Flag
Figura 36. Inmunoprecipitación de CCDC56-Flag. Utilizando anticuerpos anti-Flag unidos covalentemente

a agarosa se inmunoprecipitó la proteína CCDC56-Flag a partir de extractos mitocondriales de la línea que la
sobreexpresa (Total). U indica las proteínas no unidas al anticuerpo, W muestra las proteínas liberadas tras el
lavado de la resina e IP representa el inmunoprecipitado. La presencia de CCDC56-Flag se analizó mediante
Western Blot con anticuerpos anti-Flag.
4. Búsqueda de mutaciones en el gen CCDC56 en pacientes con

déficit del complejo IV
Aproximadamente el 80% de las enfermedades mitocondriales están producidas por

defectos en el ADN nuclear. Teniendo en cuenta que aproximadamente la mitad de las proteínas
que componen el proteoma mitocondrial aún no han sido identificadas, no es de extrañar que
en una gran parte de los pacientes diagnosticados de enfermedad mitocondrial se desconozca su
causa genética. Puesto que la ausencia de CCDC56 provoca un severo déficit del complejo IV en
la línea celular humana HeLa, este gen es un excelente candidato a secuenciar en pacientes aún no
diagnosticados que presentan alguna enfermedad mitocondrial causada por un déficit aislado de
este complejo.
Se diseñaron oligonucleótidos que cubrían tanto los exones como la región intrónica del
gen, que se utilizaron para secuenciar ADN procedente de 23 pacientes del grupo del Dr. Miguel
Ángel Martín (Hospital 12 de Octubre, Madrid) y 2 pacientes del grupo del Dr. Francesc Cardellach
(Hospital Cliníc, Barcelona) que presentaban un déficit aislado del complejo IV. La secuenciación
no reveló la presencia de mutaciones patogénicas en ninguno de ellos. Posteriormente el estudio
se amplió para incluir a 13 pacientes más que fueron secuenciados por el grupo del Dr. Massimo
Zeviani (Instituto Carlo Besta, Milán) y nuevamente no se identificaron mutaciones potencialmente
patogénicas en ninguno de ellos que explicaran el origen de su defecto en el complejo IV.
105
DISCUSIÓN
Discusión
1. Identificación de CCDC56
La principal función de la mitocondria es la producción de energía química en forma de

ATP, ya que éste es necesario para la mayor parte de los procesos fisiológicos de la célula. La mayor
parte del ATP celular es sintetizado en la mitocondria a partir de la oxidación de los cofactores
reducidos provenientes del catabolismo de los nutrientes, en un proceso llevado a cabo por los cinco
complejos enzimáticos de la cadena respiratoria que se conoce como fosforilación oxidativa (Wallace
and Fan, 2010). La mayor parte de las subunidades de los complejos de la cadena respiratoria se
encuentran codificadas en el núcleo, son traducidas en el citoplasma e importadas a la mitocondria.
Únicamente 13 de las subunidades estructurales de los complejos son codificadas por el ADNmt,
las cuales al ensamblarse junto con las proteínas codificadas en el ADN nuclear formarán los
holoenzimas maduros. Dada la complejidad estructural de estos enzimas y teniendo en cuenta
que las subunidades que los componen se encuentran codificadas en dos genomas físicamente
separados en la célula, no es de extrañar que el proceso de ensamblaje requiera la participación de
un gran número de proteínas accesorias, conocidas como factores de ensamblaje. Los factores de
ensamblaje son proteínas esenciales para la formación de los complejos que no forman parte del
complejo maduro y aseguran el correcto ensamblaje y funcionamiento de los enzimas.
El ensamblaje de COX, el complejo IV de la cadena respiratoria, es un proceso lineal
en el cual las subunidades y cofactores que lo componen se van uniendo de forma secuencial
y ordenada (Nijtmans et al., 1998). El estudio mediante geles bidimensionales BN/SDS-PAGE
109
Discusión
de los intermediarios de ensamblaje del complejo IV ha permitido conocer el orden en el que

se incorporan sus subunidades pero ha proporcionado poca información sobre las proteínas
accesorias que intervienen en cada paso.
Una estrategia que ha permitido la identificación de un gran número de los factores
que participan en el ensamblaje del complejo IV ha sido el estudio de mutantes de la levadura
Saccharomyces cerevisiae. Hasta la fecha se han identificado en este organismo más de 20 proteínas
auxiliares que intervienen en la formación de COX, cuyas funciones abarcan todas las etapas de
la formación del mismo, desde la transcripción de las subunidades codificadas en el ADNmt o el
procesamiento y traducción de sus tránscritos, hasta la síntesis de sus cofactores o el ensamblaje y
la estabilidad de las subunidades que formarán el complejo maduro (Fontanesi et al., 2006).
Un gran número de los factores de que participan en la formación del complejo IV en levadura
se encuentran conservados a lo largo de la escala evolutiva, lo que ha permitido la identificación de
sus ortólogos en humanos. No obstante, el número de factores de ensamblaje identificados hasta
la fecha en humanos es inferior al número de factores conocidos en S. cerevisiae. Puesto que a lo
largo de la evolución se han ido incorporando nuevas subunidades estructurales al complejo IV,
es razonable hipotetizar que el número de proteínas necesarias para su correcto ensamblaje será
superior en humanos que en levaduras y que, por lo tanto, aún quedan por identificar muchas de
las proteínas accesorias que intervienen en la formación de este complejo.
Drosophila melanogaster ha demostrado ser un organismo de una gran utilidad en la
identificación de nuevas proteínas mitocondriales. En nuestro laboratorio el estudio de la expresión
del gen pol γ-β, que codifica la subunidad accesoria de la ADN polimerasa γ, nos ha permitido
identificar una de las tres subunidades de la glutamil ARNtGln amidotransferasa mitocondrial, GatC,
que se encuentra codificada “upstream” del mismo. A su vez, el factor de transcripción mitocondrial
mtTFB1 también se encuentra codificado en un mensajero bicistrónico junto con CCDC56, una
proteína mitocondrial que, hasta este trabajo, presentaba una función desconocida.
A pesar de que esta disposición de dos genes en un mismo ARNm no es frecuente en
eucariotas, un estudio comparativo del genoma de 12 especies de Drosophila ha identificado la
presencia de más de un centenar de nuevos mensajeros policistrónicos en este organismo, que
ocurren preferentemente en genes que codifican proteínas mitocondriales y metiltransferasas (Lin
et al., 2007, Hayden and Bosco, 2008). Es tentador sugerir que la estructura bicistrónica típicamente
procariota que encontramos en el mensajero CCDC56/mtTFB1 de Drosophila fue transferida al
núcleo desde el endosimbionte y es, por tanto, una reminiscencia de la estructura que presentaban
estos dos genes en la proto-mitocondria. El factor de traducción mtTFB1 muy probablemente
deriva de una dimetiltransferasa similar a KsgA del endosimbionte (Shutt and Gray, 2006b). Sin
embargo, el hecho de no encontrar homólogos de CCDC56 en bacterias, hongos, plantas o levaduras
parece apuntar a que el gen CCDC56 apareció más tarde en la evolución y su localización junto con
mtTFB1 es una característica específica de insectos que permitiría la existencia de mecanismos de
110
Discusión
regulación conjunta de ambos. En procariotas se ha observado que la organización de dos genes

en un mismo ARNm favorece el mantenimiento de la estequiometria de los productos génicos y
una regulación eficiente de la expresión de ambos, que frecuentemente se encuentran participando
en los mismos procesos o rutas metabólicas (Blumenthal, 2004), sugiriendo que, al menos en
Drosophila, las funciones del factor de traducción mitocondrial mtTFB1 y CCDC56 podrían estar
relacionadas.
CCDC56 recibe el nombre de “Coiled-Coil Domain Containing 56” debido a que presenta un
dominio “Coiled-Coil”. Estos dominios se caracterizan por la presencia de dos a cinco α-hélices
enrolladas sobre sí mismas. La función fundamental de los dominios “Coiled-Coil” es la interacción
entre proteínas, aunque se trata de un dominio muy versátil que permite a las proteínas desempeñar
una gran variedad de funciones en la célula. De esta forma, se ha visto que este tipo de dominios
se encuentra presente en factores de transcripción, moléculas señalizadoras, canales de iones o
proteínas del citoesqueleto y la matriz extracelular (Burkhard et al., 2001, Lupas and Gruber, 2005).
En la mitocondria se han identificado y caracterizado funcionalmente proteínas que presentan
estos dominios “Coiled-Coil”, con funciones tan alejadas como CCDC44/TACO1, el activador de la
traducción de COX1 (Weraarpachai et al., 2009), o CCDC109A/MCU, el uniportador de calcio de
la mitocondria (Baughman et al., 2011, De Stefani et al., 2011).
Este trabajo nos ha permitido concluir que CCDC56 es una proteína mitocondrial no
descrita anteriormente, esencial para la formación del complejo IV tanto en mosca como en
células humanas, ratificando a Drosophila como un excelente sistema modelo para la búsqueda e
identificación de nuevas proteínas mitocondriales.
2. CCDC56 es una nueva proteína integral de la membrana

mitocondrial interna
Un primer paso a la hora de abordar la caracterización funcional de CCDC56 fue el estudio

de su localización subcelular. Al comienzo de este proyecto no existían anticuerpos comerciales
disponibles que reconocieran CCDC56 por lo que nos planteamos la generación de anticuerpos
policlonales contra esta proteína. Las distintas inmunizaciones de conejos no generaron antisueros
capaces de reconocer ninguna proteína del tamaño correspondiente a CCDC56.
A lo largo del desarrollo de este trabajo diversas empresas han puesto a disposición de los
usuarios anticuerpos anti-CCDC56, pero en nuestras manos ninguno de ellos ha reconocido la
proteína endógena mediante Western Blot en extractos de células HeLa. Asimismo, encargamos
la generación de anticuerpos contra el dominio “Coiled-Coil” de CCDC56 pero, nuevamente, no
logramos resultados positivos al utilizar en Western Blot ninguno de los antisueros obtenidos.
111
Discusión
Por esta razón, para analizar en que compartimento celular se encuentra localizada esta
proteína generamos una línea celular que sobreexpresaba de manera estable CCDC56 fusionada
al epítopo Flag. La inmunocitoquímica mostró una colocalización perfecta de esta proteína con la
mitocondria en células HeLa. Además del dominio “Coiled-Coil”, CCDC56 presenta un hipotético
dominio transmembrana entre los aminoácidos 58 y 78. El fraccionamiento de las mitocondrias de
la línea que sobreexpresa CCDC56-Flag confirmó este resultado, mostrando que CCDC56-Flag
es una proteína integral de la membrana mitocondrial. Puesto que la construcción CCDC56-Flag
complementa el fenotipo generado por la interferencia de CCDC56, podemos concluir además que
la proteína marcada con el Flag sigue siendo funcional y su localización es la correcta.
Un gran número de los factores de ensamblaje de COX, como son SURF1, COX10,
COX15, SCO1 o SCO2, son proteínas integrales de la membrana mitocondrial interna. El papel
que CCDC56 desempeña en el ensamblaje del complejo IV nos permite hipotetizar que esta
proteína muy probablemente también se encuentra integrada en la membrana mitocondrial interna,
aunque serán necesarios nuevos experimentos de fraccionamiento que confirmen en cuál de las dos
membranas de la mitocondria se encuentra localizada esta proteína.
Las proteínas mitocondriales codificadas en el núcleo, como es el caso de CCDC56, son
sintetizadas como precursores en los ribosomas citosólicos. La mayor parte de estos precursores
poseen una presecuencia en su extremo N-terminal que dirige a la proteína hasta su destino final en
la mitocondria. Una vez en el interior de la mitocondria unas peptidasas específicas se encargan del
procesamiento proteolítico de las presecuencias para dar lugar a las proteínas maduras (Mossmann
et al., 2011).
La transfección en células HeLa de HA-CCDC56 y CCDC56-Flag mostró que en las
células que sobreexpresaban HA-CCDC56 coexistían dos formas distintas de esta proteína, una
forma minoritaria de mayor tamaño detectada por los anticuerpos anti-HA y una forma de menor
tamaño detectada por el antisuero anti-CCDC56. Este resultado se puede explicar si consideramos
que CCDC56 tiene en su extremo amino una presecuencia de localización mitocondrial que es
procesada al ser importada a la mitocondria. La cola de HA en el extremo amino terminal de la
proteína estaría dificultando el procesamiento proteolítico de su presecuencia, explicándose así las
dos formas distintas de CCDC56 que aparecen en las células que contienen la construcción HA-
CCDC56.
Estos datos nos permiten concluir que CCDC56 es una proteína integral de la membrana
mitocondrial que posee en su extremo amino una presecuencia de localización mitocondrial que es
procesada al ser importada a la mitocondria para dar lugar a la proteína CCDC56 madura.
112
Discusión
3. La disminución de CCDC56 provoca un déficit severo y aislado

de la actividad complejo IV en la línea celular humana HeLa
Con objeto de estudiar la función de esta nueva proteína mitocondrial, en el laboratorio

nos planteamos dos estrategias utilizando para ello D. melanogaster y la línea celular humana HeLa.
En un trabajo previo a esta tesis se generaron dos líneas “knock-out” en D. melanogaster
((Peralta et al., 2012), enviado a publicar). Las líneas con la deficiencia de CCDC56 no llegaban
a completar su desarrollo, alcanzando únicamente el tercer estadío larvario. El principal fenotipo
bioquímico que presentaban estas larvas era un déficit severo de la actividad de COX. Debido a
que al generar las líneas KO se había eliminado el extremo 5’ del ARNm y parte del promotor de
CCDC56/mtTFB1, estas líneas presentaban junto con la falta de CCDC56 unos bajos niveles de
expresión de mtTFB1. Esto unido a que CCDC56 no era capaz de rescatar totalmente la actividad
del complejo IV, no permitía descartar que la disminución en el factor de traducción mtTFB1
estuviera también participando en el fenotipo de estas moscas.
Puesto que los resultados de las líneas KO de Drosophila señalaban a CCDC56 como una
proteína fundamental para la actividad del complejo IV, procedimos a realizar un rastreo de las
bases de datos que nos permitiera identificar la presencia de este gen en humanos. El análisis
mediante BLAST mostró que CCDC56 se encuentra conservado desde Drosophila hasta humanos,
y excepto en insectos se encuentra en una localización genómica distinta a mtTFB1. El hecho de
que CCDC56 en humanos no se encuentre codificado en un ARNm bicistrónico, nos permitió
continuar su caracterización funcional mediante interferencia de ARN utilizando la línea celular
humana HeLa. Para ello utilizamos tres siRNAs (Applied Biosystems) que reconocían de forma
específica la región 3’UTR del mensajero de CCDC56. Estos siRNAs se utilizaron en experimentos
de transfección transitoria en los que se obtenían muy bajos niveles del mensajero de CCDC56
hasta las 96 horas de interferencia.
Como hemos comentado anteriormente, la mayor parte del ATP celular se produce en el
interior de la mitocondria gracias a la fosforilación oxidativa mediante la oxidación de los cofactores
reducidos procedentes de la glucólisis y el metabolismo de los ácidos grasos. La galactosa no es
utilizada eficientemente como sustrato glucolítico, por lo que en estas condiciones únicamente son
capaces de crecer aquellas células con una cadena respiratoria fisiológicamente funcional que les
permita generar el ATP necesario para su crecimiento. Por esta razón, el análisis de la capacidad
de las células de crecer en presencia de glucosa o de galactosa como fuente de carbono es una
buena aproximación para conocer si presentan algún defecto del sistema OXPHOS. Las células
interferidas no son capaces de crecer cuando se les suministra galactosa como fuente de carbono,
por lo que podemos asumir que la deficiencia de CCDC56 está provocando una disminución en
la producción de ATP. El déficit de CCDC56 es el causante además de un defecto, aunque no tan
113
Discusión
acusado, del crecimiento de las células en medio con glucosa. El crecimiento más lento en medios
con glucosa ya se ha observado en células con los “knock-down” de COX5b, subunidad estructural
del complejo IV, (Galati et al., 2009) o de COX17, la chaperona de cobre implicada en la formación
de los centros de cobre CuA y CuB (Oswald et al., 2009) indicando que es necesaria la presencia de
un complejo IV plenamente funcional para la completa viabilidad de las células.
A continuación, analizamos si este defecto aparente de la producción de ATP que presentaban
las células interferidas se debía a defectos en la actividad de alguno de los complejos de la cadena
de respiratoria. Los resultados de actividad de los complejos mostraban una caída de la actividad
del complejo IV en las células donde habíamos interferido CCDC56, mientras que la actividad de
los complejos I, II y III no se encontraba afectada. Este defecto de la actividad del complejo IV es
rescatado totalmente por la sobreexpresión de CCDC56-Flag indicando que es exclusivamente la
ausencia de esta proteína la responsable del fenotipo.
Las medidas de actividad de los complejos de la cadena respiratoria en la interferencia de
CCDC56 apuntan a que es la ausencia de este gen y no la disminución de mtTFB1 la causante del
fenotipo de las líneas “knock-out” de D. melanogaster. Puesto que la interferencia de CCDC56 en
células HeLa en las que la expresión de mtTFB1 no se encuentra afectada era capaz por sí sola
de provocar una disminución de la actividad del complejo IV, es razonable pensar que la caída
de COX observada en Drosophila se debe únicamente al “knock-out” de CCDC56. Además de la
disminución de COX, en las líneas KO de Drosophila se había observado un aumento de la actividad
de los complejos I, II y III de la cadena respiratoria así como del enzima citrato sintasa, marcador
de la masa mitocondrial, que indican que puede estar teniendo lugar una respuesta compensatoria
por parte del núcleo para paliar el defecto en la actividad del complejo IV. Este fenómeno ya se ha
observado en otros mutantes mitocondriales en Drosophila, como por ejemplo las líneas en que se
ha interferido el factor de transcripción mtTFB2, las cuales presentan un aumento de las actividades
del complejo II y de la citrato sintasa (Adan et al., 2008). Este efecto compensatorio no se observa
en la interferencia de CCDC56 en células HeLa, bien porque no existan los mismos mecanismos de
señalización retrógrada o quizás, más probablemente, porque el defecto causado por la caída de la
actividad de COX no es tan acusado en el cultivo como para desencadenar esta respuesta.
Por otro lado, mediante experimentos de BN-PAGE observamos que la disminución
de la actividad del complejo IV provocada por la interferencia de CCDC56 en células HeLa iba
acompañada de una caída similar en los niveles de complejo IV totalmente ensamblado. Al tratarse
de experimentos de transfección transitoria en los que el grado de interferencia alcanzado en cada
uno varía ligeramente, pudimos observar, además, que había una clara correlación entre los niveles
de interferencia de CCDC56, la actividad del complejo IV y los niveles de complejo totalmente
ensamblado en cada experimento. Estos resultados apuntan a que el complejo IV residual que
presentan las células interferidas es totalmente activo y que la deficiencia de COX que observamos
es debida a la incapacidad de estas células de ensamblar el holoenzima.
114
Discusión
La caída del complejo IV totalmente ensamblado correlaciona con una caída similar en
los niveles de las subunidades que lo componen. Las proteínas COX1, COX2, COX3 y COX4 se
encuentran muy disminuidas en las células con la interferencia de CCDC56, aunque el grado de
disminución es distinto para cada una de ellas. Estas diferencias se deben muy probablemente a la
distinta estabilidad de cada una de las subunidades de COX, siendo aquellas más inestables las que
presentan los niveles más bajos. De esta forma se puede explicar también que no se encuentren
apenas afectados los niveles de COX5a, ya que esta proteína podría tener una mayor vida media y
por tanto observamos una menor disminución de la misma.
La sobreexpresión de CCDC56-Flag en células HeLa no tenía ningún efecto en la actividad
ni en la cantidad de complejo IV totalmente ensamblado, indicando que en condiciones normales los
niveles de CCDC56 son limitantes para el proceso de formación del complejo IV. Estos datos están
en coherencia con el hecho de que únicamente cuando se obtienen altos niveles de interferencia de
CCDC56 se puede observar el déficit del complejo IV, indicando que una ligera disminución de los
niveles de esta proteína no afecta al proceso de formación de COX. Aunque la sobreexpresión en
células generalmente no afectaba a la actividad del complejo IV, es necesario apuntar que en ciertos
experimentos las células que sobreexpresaban CCDC56 presentaban una mayor actividad de COX
y en estos casos también se observaba un aumento de las proteínas que forman el complejo,
indicando que quizás en ciertas situaciones haya una mayor dependencia de esta proteína y su
sobreexpresión puede hacer que aumente la biogénesis del complejo IV. Pese a que la interferencia
de CCDC56 no afectaba a la actividad del complejo III, su sobreexpresión provocaba un claro
aumento de la actividad del mismo. Si bien este aumento de la actividad no va acompañado de un
aumento de la cantidad de complejo III totalmente ensamblado. Las causas de la activación del
complejo III en presencia de un aumento de CCDC56 son actualmente desconocidas.
Los déficits del complejo IV son uno de los defectos más comunes de la cadena respiratoria.
Mutaciones en las subunidades estructurales del complejo o en cualquiera de las proteínas necesarias
para su correcta formación son la causa de patologías muy severas. Hasta la fecha se han descrito
mutaciones en los factores de ensamblaje SURF1 (Tiranti et al., 1998), COX10 (Valnot et al., 2000b),
COX15 (Antonicka et al., 2003b), SCO1 (Valnot et al., 2000a), SCO2 (Papadopoulou et al., 1999)
y C2orf64 (Huigsloot et al., 2011) y en el factor de traducción de COX1, TACO1 (Weraarpachai
et al., 2009). Todas ellas tienen como consecuencia una drástica caída en la actividad y en los
niveles de complejo IV totalmente ensamblado, fenotipo idéntico al observado en la deficiencia de
CCDC56. Desde el momento en que aún se desconoce la causa genética de la mayor parte de las
enfermedades causadas por defectos de COX, CCDC56 es un excelente candidato para analizar y
diagnosticar pacientes que presentan un déficit aislado de este complejo.
Por esta razón, una vez establecido que la deficiencia de CCDC56 era causante de una
caída de la actividad del complejo IV, secuenciamos este gen en pacientes que presentaban un
déficit del mismo. Se secuenció ADN procedente de 23 pacientes del Hospital 12 de Octubre de
115
Discusión
Madrid facilitados por el grupo del Dr. Miguel Ángel Martín, de 2 pacientes del Hospital Cliníc
de Barcelona, facilitados por el Dr. Francesc Cardellach, y 13 pacientes más en el grupo del Dr.
Massimo Zeviani (Instituto Carlo Besta, Milán), todos ellos con enfermedades mitocondriales
causadas por un déficit aislado del complejo IV. Sin embargo, la secuenciación no reveló la
presencia de mutaciones patogénicas en ninguno de ellos. Como se ha comentado anteriormente,
las enfermedades mitocondriales son un grupo de enfermedades poco frecuentes que pueden estar
causadas por mutaciones en cualquiera de los genes que afectan al funcionamiento del sistema
OXPHOS, por lo que no es de extrañar que en un grupo tan reducido de pacientes no se hayan
encontrado mutaciones patogénicas en CCDC56. No obstante, este gen es un excelente candidato
para analizar en pacientes cuya enfermedad curse con un defecto del complejo IV.
4. CCDC56 es una nueva proteína esencial para la formación del

complejo IV en células humanas
La interferencia de CCDC56 en células HeLa nos ha permitido concluir que cuando este gen
se encuentra ausente se produce una caída de la cantidad de complejo IV ensamblado acompañada
de una disminución de las proteínas que lo componen. Este comportamiento ya se había observado
en pacientes con mutaciones en alguno de los factores de ensamblaje del complejo IV. Por esta
razón nos planteamos que CCDC56 podría estar participando en alguno de los pasos necesarios
para que la formación de este complejo se produzca de forma adecuada.
Se puede considerar que el primer paso en la formación de los complejos de la cadena
respiratoria es la síntesis de las subunidades que los componen. De las 13 subunidades que forman
el complejo IV en humanos sólo tres de ellas, COX1, COX2 y COX3, se encuentran codificadas en
el ADNmt y por lo tanto han de ser transcritas y traducidas por las maquinarias de transcripción y
traducción de la mitocondria. Para ello, analizamos si la falta de CCDC56 estaba afectando al nivel
de los ARNm que codifican estas 3 subunidades de COX. Los resultados de la RT-PCR cuantitativa
mostraron que CCDC56 no afecta a la transcripción de estos tres mensajeros puesto que las células
interferidas presentan niveles similares a los controles. Seguidamente analizamos la tasa de síntesis
de las proteínas mitocondriales y su estabilidad mediante experimentos de pulso y caza (Chomyn,
1996). En ausencia de CCDC56 se produce una ligera disminución en la tasa de síntesis de COX1
que va acompañada de una degradación más rápida de la proteína recién sintetizada.
No podemos descartar completamente que la disminución de la intensidad de la banda de
COX1 que observamos en los experimentos de marcaje con pulsos de 30, 60 y 90 minutos de S35-
metionina se deba a una degradación muy rápida de la proteína recién sintetizada y no a un defecto
combinado de la síntesis de COX1 y su estabilidad como proponemos. Sin embargo, el resultado de
la cuantificación de los experimentos de caza en los que al retirar la S35-Met únicamente se analiza
116
Discusión
la estabilidad de las proteínas ya sintetizadas, no parece indicar que la degradación de COX1 sea tan
rápida como la observada en los experimentos de pulso. Por lo tanto, estos datos apuntan a que la
deficiencia de CCDC56 además de causar un defecto en la estabilidad de la proteína COX1 recién
sintetizada, está provocando una ligera disminución de su síntesis. De esta forma, al sintetizarse
una menor cantidad de COX1 que a su vez es degradada más rápidamente, observamos una mayor
diferencia en la intensidad de COX1 entre las células interferidas y los controles cuando llevamos a
cabo experimentos de pulso que cuando realizamos experimentos de caza.
A continuación nos planteamos analizar las posibles causas de la disminución en la
estabilidad de la proteína COX1 recién sintetizada observada en los experimentos de pulso y caza.
La degradación más rápida de COX1 podría explicarse si CCDC56 estuviera participando en la
síntesis de sus cofactores CuB, hemo a o hemo a3, o bien si estuviera participando en el ensamblaje
del complejo IV, estabilizando los intermediarios de ensamblaje y facilitando la unión de las distintas
subunidades para formar el holoenzima. En ambos casos una ausencia de CCDC56 impediría el
ensamblaje del complejo y conduciría a la desestabilización de las subunidades que lo componen,
explicando la rápida degradación de COX1 y los bajos niveles de COX2, COX3 y COX4 que
observamos en las células interferidas.
Para analizar el papel que CCDC56 desempeña en la formación del complejo IV, en primer
lugar analizamos la cinética de formación del mismo con objeto de comprobar si se encontraba
afectada en las células interferidas. Para ello, tratamos las células durante dos días con el antibiótico
cloranfenicol, inhibidor de la traducción de las proteínas mitocondriales, y posteriormente se dejó
a las células recuperarse durante diferentes periodos de tiempo. Con este tratamiento conseguimos
reducir los niveles de los complejos de la cadena respiratoria hasta casi su desaparición y la retirada
el antibiótico nos permite analizar su dinámica de recuperación. El resultado de los geles de BN-
PAGE mostró que en ausencia de CCDC56 apenas hay aparición de complejo IV ensamblado,
confirmando así la implicación de esta proteína en la formación del mismo.
A continuación y puesto que en ausencia de CCDC56 no había formación del complejo
IV, llevamos a cabo geles bidimensionales BN/SDS-PAGE, más sensibles para la detección de los
subcomplejos. Estos geles nos permiten analizar el contenido y la distribución de las subunidades
entre cada complejo y los intermediarios que aparecen durante su formación, pudiéndose en
ocasiones observar la acumulación de los subcomplejos en caso de fallos en el ensamblaje (Calvaruso
et al., 2008). Los geles bidimensionales mostraron que un déficit de CCDC56 está provocando un
bloqueo en el ensamblaje del complejo IV. En las células interferidas se observa fundamentalmente
la acumulación de un subcomplejo que contiene COX4 y coincide con el tamaño descrito para
el subcomplejo S2 (Nijtmans et al., 1998). Se ha descrito que este subcomplejo se compone de
COX1, COX4 y COX5a (Williams et al., 2004, Stiburek et al., 2009), y aunque no se observa tan
claramente, COX1 y COX5a también parecen encontrarse presentes en el intermediario acumulado
en las células deficientes para CCDC56. La acumulación del intermediario S2 en las células con la
117
Discusión
deficiencia de CCDC56 indica que el ensamblaje del complejo IV se encuentra bloqueado al menos
parcialmente y no puede proseguir adecuadamente.
El primer paso en el ensamblaje de COX consiste en la inserción de COX1 en la membrana
mitocondrial interna, formando el subcomplejo S1, al cual se unen los cofactores hemo a, hemo
a3 y CuB. Seguidamente se incorporan COX4 y COX5a, formando el segundo intermediario de
ensamblaje, S2 (Nijtmans et al., 1998, Williams et al., 2004). Tras la formación del subcomplejo
S2, COX2 unido a su grupo prostético CuA se incorpora al mismo, lo que desencadena una
cascada rápida de incorporación de prácticamente todas las proteínas que forman el complejo,
empezando por COX3, para dar lugar al subcomplejo S3 (Nijtmans et al., 1998). La acumulación
del subcomplejo S2 que presentan las células con la deficiencia de CCDC56 sugiere que en estas
células el ensamblaje se encuentra bloqueado anteriormente a la entrada de COX2 y COX3.
El fenotipo que presentan las células en las condiciones de interferencia de CCDC56
ya se ha observado anteriormente en pacientes que presentan mutaciones tanto en factores de
ensamblaje como en subunidades estructurales de COX. Se ha descrito que el subcomplejo S2
se encuentra acumulado en pacientes que presentan mutaciones en COX3 (Tiranti et al., 2000).
En estos pacientes la inserción de una citosina provoca un cambio en la fase de lectura de COX3
y la aparición de un codón de parada de la traducción prematuro. Como resultado, la proteína
COX3 se encuentra ausente en estos pacientes acumulándose los intermediarios de ensamblaje
anteriores a su incorporación e impidiendo la entrada al complejo de las subunidades nucleares
que se incorporan tras ella. Del mismo modo, se ha observado que mutaciones en SCO1 y SCO2,
proteínas responsables de la formación del centro de cobre CuA en COX2, tienen como resultado
la acumulación del subcomplejo S2. En estos pacientes la falta de maduración del centro de cobre
CuA impide la incorporación de COX2 al intermediario S2, produciéndose una acumulación del
mismo (Leary et al., 2004).
Por otro lado, se ha observado una acumulación de los subcomplejos S2 y S1 en pacientes
con mutaciones en el factor de ensamblaje SURF1 (Tiranti et al., 1999a, Coenen et al., 1999).
La función de SURF1 en humanos es aún desconocida y se ha propuesto que podría facilitar la
incorporación de COX2 al subcomplejo S2 (Tiranti et al., 1999a, Ugalde et al., 2002). Sin embargo,
diversos estudios de los homólogos de SURF1 en bacterias han propuesto que esta proteína
participa en la inserción del hemo a o la estabilización del centro hemo a3-CuB (Smith et al., 2005),
indicando en tal caso que la maduración de los grupos protéticos de COX1 es esencial para que
prosiga el ensamblaje del complejo IV.
El bloqueo en el ensamblaje de COX que observamos en las células con la deficiencia de
CCDC56 es similar al observado en pacientes con mutaciones en los factores de ensamblaje del
complejo IV y nos indica que esta proteína desempeña un papel fundamental para la formación
del mismo en células humanas. La acumulación del intermediario de ensamblaje S2 indica que
CCDC56 está implicada en las etapas iniciales de formación del complejo IV y sugiere que esta
118
Discusión
proteína podría estar participando en el ensamblaje del complejo en los pasos previos a la entrada
de COX2 y COX3, bien facilitando la entrada de estas dos proteínas o bien asegurando que el
subcomplejo S2 se forma correctamente para permitir que prosiga el ensamblaje del complejo IV.
5. CCDC56 participa en la coordinación de la síntesis de COX1 con

el ensamblaje del complejo IV
Para que el ensamblaje del complejo IV proceda de forma correcta las subunidades que
lo forman deben encontrarse en la estequiometría adecuada. Para ello, la levadura Saccharomyces
cerevisiae ha desarrollado un mecanismo de regulación traduccional de la síntesis de Cox1 que se
encuentra acoplado al ensamblaje de COX. De esta manera cualquier bloqueo en la formación del
complejo provoca la disminución de la síntesis de Cox1, asegurando una adecuada tasa de síntesis
e impidiendo así la acumulación de subunidades e intermediarios de ensamblaje (Mick et al., 2011,
Soto et al., 2011).
S. cerevisiae cuenta con una proteína conocida como Mss51 (“Mitochondrial Splicing Supressor
51”) que, además de interaccionar con el ARNm de Cox1 activando su traducción, se une a la
proteína recién sintetizada confiriéndole estabilidad y facilitando su ensamblaje con el resto de
proteínas del complejo IV (Perez-Martinez et al., 2003). La dualidad de funciones de esta proteína
hace de ella la pieza clave del sistema regulatorio de la síntesis de Cox1 (Figura 37)
En la membrana mitocondrial interna de S. cerevisiae se encuentran dos pequeñas proteínas
llamadas Cox14 y Cox25/Coa3 que interaccionan con la proteína Cox1 recién sintetizada
estabilizando el complejo Cox1-Mss51 (Mick et al., 2010, Fontanesi et al., 2011). La topología
de estas proteínas sugiere que podrían estar interaccionando con los dominios transmembrana
de Cox1 facilitando su inserción en la membrana mitocondrial interna (Soto et al., 2011). La
estabilización del complejo Cox1-Mss51 por la unión de Cox14 y Cox25/Coa3, impide que Mss51
esté disponible para activar la traducción del ARNm de Cox1.
El mecanismo encargado de la liberación de Mss51 es aún poco conocido. Se ha propuesto
que la unión de Coa1 al complejo Cox1-Mss51-Cox14-Cox25 promueve el reclutamiento de Shy1,
homólogo de SURF1 en levaduras, y la liberación de Mss51 (Mick et al., 2007, Pierrel et al., 2007).
De esta forma, el complejo Cox1-Cox14-Cox25-Coa1-Shy1 prosigue el proceso de ensamblaje
con la incorporación de las subunidades nucleares Cox5 y Cox6 y la proteína Mss51 se encontraría
disponible para nuevas rondas de traducción de Cox1.
De este modo S. cerevisiae consigue que los niveles de Mss51 disponibles para activar la síntesis
de Cox1 estén limitados por la cantidad de Mss51 que se encuentra secuestrada formando parte de
los intermediarios del ensamblaje de COX. Así, cualquier bloqueo en el ensamblaje del complejo
119
Discusión
IV tendrá como resultado que Mss51 quede retenido en estos subcomplejos y consecuentemente se
producirá una disminución en la síntesis de Cox1, impidiendo la acumulación de los intermediarios
de ensamblaje (Perez-Martinez et al., 2009). Se ha descrito que ciertos intermediarios de COX
pueden actuar como oxidantes, por lo que este mecanismo le impediría a la levadura además evitar
el estrés oxidativo cuando se encuentra bloqueado el ensamblaje del complejo (Khalimonchuk et
al., 2007).
Cox5
Shy1 Cox6 Shy1
IMS
Coa1 Coa1
Oxa1 Cox1 Cox14 Cox1 Cox1 Cox1
Cox14
Cox14
Cox25
MMI
Cox25
Cox25
Pet309 Mss51 Mss51 Mss51 Ssc1
Ssc1 Matriz
Mss51
ARNm COX1
Figura 37. La síntesis de Cox1 y el ensamblaje de COX se encuentran acoplados en Saccharomyces

cerevisiae. Cox1 es sintetizada en los ribosomas mitocondriales tras la activación de su traducción por Pet309
y Mss51. Mss51 interacciona con la proteína Cox1 recién sintetizada y su unión es estabilizada por las proteínas
Cox14 y Cox25. La unión de Coa1 al complejo Cox1-Mss51-Cox14-Cox25 promueve el reclutamiento de Shy1
y la liberación de Mss51, que se encuentra así disponible para nuevas rondas de traducción del mensajero de
Cox1. La chaperona mitocondrial Ssc1 de la familia Hsp70 (“Heat Shock Protein 70”) interacciona con Mss51 y
podría coordinar las funciones de Mss51 en traducción y en el ensamblaje del complejo IV. Adaptado de (Mick
et al., 2011) y (Soto et al., 2011).
En humanos aún no se ha caracterizado ningún mecanismo que permita la regulación

conjunta de la síntesis de las proteínas que componen el complejo IV y su ensamblaje. Sin embargo,
un trabajo reciente del grupo de E. Shoubridge sugiere la existencia de un acoplamiento de la
síntesis de COX1 y el ensamblaje del complejo IV, similar al mecanismo presente en levaduras
(Weraarpachai et al., 2012).
En este trabajo se identificaron mutaciones en el gen C12orf62 en un paciente neonato
con acidosis láctica fatal. C12orf62 es una proteína integral de la membrana mitocondrial de 6
KDa que se encuentra presente únicamente en vertebrados. Los pacientes con mutaciones en
C12orf62 presentaban una reducción de la actividad de COX y de los niveles de complejo totalmente
ensamblado, que iban acompañados de una disminución en los niveles de las subunidades COX1,
COX2 y COX4, apuntando a un defecto en el ensamblaje del complejo IV. El análisis mediante geles
bidimensionales mostró que las células del paciente presentaban un defecto en la incorporación
de COX2 y COX3 al complejo IV, indicando que se trata de una nueva proteína necesaria para su
ensamblaje. Asimismo, mediante ensayos de pulso y caza, se observó que las células del paciente
presentaban una disminución de la tasa de síntesis de COX1.
La inmunoprecipitación de C12orf62 reveló que esta proteína interacciona por un lado con
COX1, COX2 y COX4, apoyando su función como factor de ensamblaje del complejo IV, y por
120
Discusión
otro lado con el factor de elongación de la traducción EFTu y las proteínas LRPPRC y SLIRP.
LRPPRC y SLIRP forman un complejo ribonucleoproteico junto con los mensajeros mitocondriales
maduros que es esencial para su estabilidad, especialmente para la de los ARNm de COX1, COX2 y
COX3 (Sasarman et al., 2010, Ruzzenente et al., 2011). Esta interacción de C12orf62 con proteínas
implicadas en la traducción y estabilidad de los mensajeros apoya su participación en la traducción
de COX1.
La participación de C12orf62 en el ensamblaje del COX y en la traducción del ARNm de
COX1, lleva a los autores a proponer que esta proteína está participando en la coordinación de la
síntesis de COX1 con el ensamblaje del complejo IV de un modo similar al descrito en levadura,
siendo este trabajo la primera evidencia experimental que sugiere la existencia de este mecanismo
en células humanas.
Hasta la fecha no se han identificado otras proteínas que pudieran estar implicadas en
este nuevo mecanismo de regulación, no obstante, los resultados obtenidos con el silenciamiento
de CCDC56 apuntan a que esta proteína también forma parte de este circuito regulatorio junto
con C12orf62. Como se ha discutido anteriormente, CCDC56 es esencial para conseguir niveles
adecuados de marcaje de COX1 en los experimentos de pulso indicando que la presencia de esta
proteína es necesaria para su síntesis y, por otro lado, las células con la interferencia de CCDC56
presentan un defecto en el ensamblaje del complejo IV, encontrándose éste bloqueado en los
pasos previos a la entrada de COX2 y COX3 al complejo, al igual que ocurre en los pacientes con
mutaciones en C12orf62. Los defectos de síntesis de COX1 y bloqueo del ensamblaje del complejo
IV causados por la interferencia de CCDC56 apoyan fuertemente la existencia de un acoplamiento
de la traducción de COX1 con el ensamblaje del complejo IV también en células humanas.
CCDC56 en condiciones nativas se encuentra formando varios complejos de alto peso
molecular, pudiéndose tratar de diversos intermediarios del ensamblaje de COX o bien parte de la
maquinaria de traducción. Los datos obtenidos en este trabajo no nos han permitido identificar a las
proteínas que interaccionan con CCDC56, lo que hace necesario llevar a cabo nuevos experimentos
de inmunoprecipitación ya que la identificación de estas proteínas nos permitirá conocer la función
que CCDC56 desempeña en la formación del complejo IV y su coordinación con la síntesis de
COX1.
De un modo similar a las proteínas de levadura Mss51, Cox14 o Cox25/Coa3, CCDC56
podría encontrarse formando parte de subcomplejos en los que se encuentra presente la proteína
COX1 recién sintetizada facilitando su ensamblaje con el resto de subunidades del complejo IV.
Esta unión estaría impidiendo que o bien C12orf62, bien tanto C12orf62 como CCDC56 o bien
alguna otra proteína aún sin identificar interaccionaran con la maquinaria de traducción para activar
la síntesis de COX1. Si el ensamblaje del COX prosigue normalmente, estas proteínas se liberarán
de los subcomplejos y estarán disponibles para ejercer su función nuevamente como activadores de
la traducción (Figura 38A).
121
Discusión
Alternativamente, CCDC56 podría desempeñar una función similar a la proteína Coa1 de

S. cerevisiae. La interacción de CCDC56 con los intermediarios del ensamblaje de COX permitiría
la entrada de COX2 y COX3 al complejo y la liberación del mismo de C12orf62 u otros posibles
activadores de la traducción de COX1. En esta situación, la ausencia de CCDC56 dificultaría el
ensamblaje del complejo, acumulándose subcomplejos en los que podrían quedar secuestrados
C12orf62 u otros factores de traducción de COX1 produciéndose así la caída en su síntesis (Figura
38B).
A. S1 S2 S3
COX2
COX1 COX1
C12orf62
CCDC56
CCDC56
CCDC56
C12orf62
C12orf62
COX1
COX4
COX3
COX7c
MMI
COX4
COX8
LRPPRC
EFTu COX5a
SLIRP COX5a COX5b
ARNm COX1
SLIRP
LRPPRC
C12orf62
EFTu
CCDC56
ARNm COX1
B.
S1 S2 S3
COX2
COX1 COX1
C12orf62
CCDC56
C12orf62
C12orf62
COX1
COX4
COX3
COX7c
MMI
COX4
COX8
LRPPRC
COX5a
EFTu
SLIRP
ARNm COX1
SLIRP
LRPPRC
C12orf62
EFTu
ARNm COX1
Figura 38. Representación esquemática de los posibles mecanismos de acoplamiento de la traducción

de COX1 y el ensamblaje del complejo IV en humanos. A) CCDC56 podría interaccionar con la proteína
COX1 recién sintetizada facilitando su ensamblaje con el resto de subunidades del complejo IV. En estos
complejos se encuentran secuestrados C12orf62, CCDC56 u otros posibles activadores de la traducción de
COX1 (representados como un cuadrado blanco) impidiendo así la síntesis de COX1. B) La interacción de
CCDC56 con los intermediarios del ensamblaje de COX permitiría la entrada de COX2 y COX3 al complejo
y la liberación del mismo de C12orf62 u otros posibles activadores de la traducción de COX1 (representados
como un cuadrado blanco).
La mayor parte de las proteínas de S. cerevisiae encargadas del acoplamiento de la síntesis

de COX1 y el ensamblaje del complejo IV no presentan homólogos en humanos (Soto et al.,
2011) y a su vez, CCDC56 y C12orf62 no se encuentran presentes en S. cerevisiae, sugiriendo que
los vertebrados han desarrollado un nuevo circuito regulatorio que les permite llevar a cabo una
función muy similar a la de la levadura. La existencia de este mecanismo sería muy relevante para la
formación del complejo IV. COX1 es subunidad central del complejo y la primera en incorporarse
al proceso de ensamblaje, por lo que la regulación de su síntesis asegura la regulación del proceso
de ensamblaje del complejo y así adecuarlo a las necesidades de la célula.
122
CONCLUSIONES
Conclusiones
1. El factor de traducción mitocondrial mtTFB1 de Drosophila melanogaster se encuentra

codificado en un mensajero bicistrónico junto con CCDC56 (“Coiled-coil domain containing 56”) una
proteína altamente conservada en la escala evolutiva.
2. El gen CCDC56 humano codifica una pequeña proteína integral de la membrana
mitocondrial de aproximadamente 12 KDa. Esta proteína presenta una presecuencia de localización
mitocondrial que es procesada al ser importada al interior del orgánulo.
3. El silenciamiento transitorio de CCDC56 en la línea celular humana HeLa provoca
un déficit aislado de la actividad del complejo IV de la cadena respiratoria acompañado de una
disminución equivalente en la cantidad de complejo totalmente ensamblado y de las subunidades
que lo componen.
4. El silenciamiento de CCDC56 no afecta a los niveles de los ARN mensajeros mitocondriales,
pero produce una disminución en la tasa de síntesis de COX1 y una rápida degradación de la
proteína recién sintetizada.
5. El silenciamiento de CCDC56 en la línea celular humana HeLa produce un bloqueo
en el ensamblaje del complejo IV de la cadena respiratoria, acumulándose en estas células un
intermediario de ensamblaje cuyo tamaño coincide con el del subcomplejo S2, que contiene al
menos COX4. Aunque no se observa de forma tan evidente, también contiene COX1 y COX5a.
6. La sobreexpresión de CCDC56-Flag no tiene ningún efecto en la actividad del complejo
IV, en la cantidad de complejo totalmente ensamblado ni en la cantidad de las subunidades que lo
componen. Además, la proteína CCDC56-Flag rescata totalmente la caída de la actividad de COX
causada por el silenciamiento de CCDC56.
7. CCDC56-Flag en condiciones nativas se encuentra formando parte de varios complejos
de alto peso molecular, lo que indica su interacción con otras proteínas.
8. La secuenciación de ADN procedente de 38 pacientes que presentan un defecto aislado
en la actividad del complejo IV no ha revelado la presencia de mutaciones patogénicas en ninguno
de ellos.
125
BIBLIOGRAFÍA
Bibliografía
ACIN-PEREZ, R., FERNANDEZ-SILVA, P., PELEATO, M. L., PEREZ-MARTOS, A.

& ENRIQUEZ, J. A. 2008. Respiratory active mitochondrial supercomplexes. Mol Cell, 32, 529-39.
ADAN, C., MATSUSHIMA, Y., HERNANDEZ-SIERRA, R., MARCO-FERRERES, R.,
FERNANDEZ-MORENO, M. A., GONZALEZ-VIOQUE, E., CALLEJA, M., ARAGON, J.
J., KAGUNI, L. S. & GARESSE, R. 2008. Mitochondrial transcription factor B2 is essential for
metabolic function in Drosophila melanogaster development. J Biol Chem, 283, 12333-42.
ANTONICKA, H., LEARY, S. C., GUERCIN, G. H., AGAR, J. N., HORVATH, R.,
KENNAWAY, N. G., HARDING, C. O., JAKSCH, M. & SHOUBRIDGE, E. A. 2003a. Mutations
in COX10 result in a defect in mitochondrial heme A biosynthesis and account for multiple, early-
onset clinical phenotypes associated with isolated COX deficiency. Hum Mol Genet, 12, 2693-702.
ANTONICKA, H., MATTMAN, A., CARLSON, C. G., GLERUM, D. M., HOFFBUHR,
K. C., LEARY, S. C., KENNAWAY, N. G. & SHOUBRIDGE, E. A. 2003b. Mutations in COX15
produce a defect in the mitochondrial heme biosynthetic pathway, causing early-onset fatal
hypertrophic cardiomyopathy. Am J Hum Genet, 72, 101-14.
ARCO, A. D. & SATRUSTEGUI, J. 2005. New mitochondrial carriers: an overview. Cell
Mol Life Sci, 62, 2204-27.
BANCI, L., BERTINI, I., CIOFI-BAFFONI, S., HADJILOI, T., MARTINELLI, M. &
PALUMAA, P. 2008. Mitochondrial copper(I) transfer from Cox17 to Sco1 is coupled to electron
transfer. Proc Natl Acad Sci U S A, 105, 6803-8.
129
Bibliografía
BARRIENTOS, A., GOUGET, K., HORN, D., SOTO, I. C. & FONTANESI, F. 2009.
Suppression mechanisms of COX assembly defects in yeast and human: insights into the COX
assembly process. Biochim Biophys Acta, 1793, 97-107.
BAUGHMAN, J. M., PEROCCHI, F., GIRGIS, H. S., PLOVANICH, M., BELCHER-
TIMME, C. A., SANCAK, Y., BAO, X. R., STRITTMATTER, L., GOLDBERGER, O.,
BOGORAD, R. L., KOTELIANSKY, V. & MOOTHA, V. K. 2011. Integrative genomics identifies
MCU as an essential component of the mitochondrial calcium uniporter. Nature, 476, 341-5.
BELEVICH, I., VERKHOVSKY, M. I. & WIKSTROM, M. 2006. Proton-coupled electron
transfer drives the proton pump of cytochrome c oxidase. Nature, 440, 829-32.
BLUMENTHAL, T. 2004. Operons in eukaryotes. Brief Funct Genomic Proteomic, 3, 199-211.
BOGENHAGEN, D. & CLAYTON, D. A. 1977. Mouse L cell mitochondrial DNA
molecules are selected randomly for replication throughout the cell cycle. Cell, 11, 719-27.
BONNEFOY, N., KERMORGANT, M., GROUDINSKY, O., MINET, M., SLONIMSKI,
P. P. & DUJARDIN, G. 1994. Cloning of a human gene involved in cytochrome oxidase assembly
by functional complementation of an oxa1- mutation in Saccharomyces cerevisiae. Proc Natl Acad
Sci U S A, 91, 11978-82.
BURKHARD, P., STETEFELD, J. & STRELKOV, S. V. 2001. Coiled coils: a highly versatile
protein folding motif. Trends Cell Biol, 11, 82-8.
CALVARUSO, M. A., SMEITINK, J. & NIJTMANS, L. 2008. Electrophoresis techniques
to investigate defects in oxidative phosphorylation. Methods, 46, 281-7.
CALVO, S. E. & MOOTHA, V. K. 2010. The mitochondrial proteome and human disease.
Annu Rev Genomics Hum Genet, 11, 25-44.
CARRODEGUAS, J. A., KOBAYASHI, R., LIM, S. E., COPELAND, W. C. &
BOGENHAGEN, D. F. 1999. The accessory subunit of Xenopus laevis mitochondrial DNA
polymerase gamma increases processivity of the catalytic subunit of human DNA polymerase
gamma and is related to class II aminoacyl-tRNA synthetases. Mol Cell Biol, 19, 4039-46.
CELOTTO, A. M., FRANK, A. C., MCGRATH, S. W., FERGESTAD, T., VAN
VOORHIES, W. A., BUTTLE, K. F., MANNELLA, C. A. & PALLADINO, M. J. 2006.
Mitochondrial encephalomyopathy in Drosophila. J Neurosci, 26, 810-20.
CLARK, A. G., EISEN, M. B., SMITH, D. R., BERGMAN, C. M., OLIVER, B.,
MARKOW, T. A., KAUFMAN, T. C., KELLIS, M., GELBART, W., IYER, V. N., POLLARD,
D. A., SACKTON, T. B., LARRACUENTE, A. M., SINGH, N. D., ABAD, J. P., ABT, D. N.,
ADRYAN, B., AGUADE, M., AKASHI, H., ANDERSON, W. W., AQUADRO, C. F., ARDELL,
D. H., ARGUELLO, R., ARTIERI, C. G., BARBASH, D. A., BARKER, D., BARSANTI, P.,
130
Bibliografía
BATTERHAM, P., BATZOGLOU, S., BEGUN, D., BHUTKAR, A., BLANCO, E., BOSAK,
S. A., BRADLEY, R. K., BRAND, A. D., BRENT, M. R., BROOKS, A. N., BROWN, R. H.,
BUTLIN, R. K., CAGGESE, C., CALVI, B. R., BERNARDO DE CARVALHO, A., CASPI,
A., CASTREZANA, S., CELNIKER, S. E., CHANG, J. L., CHAPPLE, C., CHATTERJI, S.,
CHINWALLA, A., CIVETTA, A., CLIFTON, S. W., COMERON, J. M., COSTELLO, J. C.,
COYNE, J. A., DAUB, J., DAVID, R. G., DELCHER, A. L., DELEHAUNTY, K., DO, C. B.,
EBLING, H., EDWARDS, K., EICKBUSH, T., EVANS, J. D., FILIPSKI, A., FINDEISS, S.,
FREYHULT, E., FULTON, L., FULTON, R., GARCIA, A. C., GARDINER, A., GARFIELD,
D. A., GARVIN, B. E., GIBSON, G., GILBERT, D., GNERRE, S., GODFREY, J., GOOD, R.,
GOTEA, V., GRAVELY, B., GREENBERG, A. J., GRIFFITHS-JONES, S., GROSS, S., GUIGO,
R., GUSTAFSON, E. A., HAERTY, W., HAHN, M. W., HALLIGAN, D. L., HALPERN, A.
L., HALTER, G. M., HAN, M. V., HEGER, A., HILLIER, L., HINRICHS, A. S., HOLMES,
I., HOSKINS, R. A., HUBISZ, M. J., HULTMARK, D., HUNTLEY, M. A., JAFFE, D. B.,
JAGADEESHAN, S., et al. 2007. Evolution of genes and genomes on the Drosophila phylogeny.
Nature, 450, 203-18.
CLARK, K. M., TAYLOR, R. W., JOHNSON, M. A., CHINNERY, P. F., CHRZANOWSKA-
LIGHTOWLERS, Z. M., ANDREWS, R. M., NELSON, I. P., WOOD, N. W., LAMONT, P. J.,
HANNA, M. G., LIGHTOWLERS, R. N. & TURNBULL, D. M. 1999. An mtDNA mutation in
the initiation codon of the cytochrome C oxidase subunit II gene results in lower levels of the
protein and a mitochondrial encephalomyopathy. Am J Hum Genet, 64, 1330-9.
COBINE, P. A., PIERREL, F., LEARY, S. C., SASARMAN, F., HORNG, Y. C.,
SHOUBRIDGE, E. A. & WINGE, D. R. 2006. The P174L mutation in human Sco1 severely
compromises Cox17-dependent metallation but does not impair copper binding. J Biol Chem, 281,
12270-6.
COENEN, M. J., VAN DEN HEUVEL, L. P., NIJTMANS, L. G., MORAVA, E.,
MARQUARDT, I., GIRSCHICK, H. J., TRIJBELS, F. J., GRIVELL, L. A. & SMEITINK, J. A.
1999. SURFEIT-1 gene analysis and two-dimensional blue native gel electrophoresis in cytochrome
c oxidase deficiency. Biochem Biophys Res Commun, 265, 339-44.
COENEN, M. J., VAN DEN HEUVEL, L. P., UGALDE, C., TEN BRINKE, M.,
NIJTMANS, L. G., TRIJBELS, F. J., BEBLO, S., MAIER, E. M., MUNTAU, A. C. & SMEITINK,
J. A. 2004. Cytochrome c oxidase biogenesis in a patient with a mutation in COX10 gene. Ann
Neurol, 56, 560-4.
COMI, G. P., BORDONI, A., SALANI, S., FRANCESCHINA, L., SCIACCO, M.,
PRELLE, A., FORTUNATO, F., ZEVIANI, M., NAPOLI, L., BRESOLIN, N., MOGGIO, M.,
AUSENDA, C. D., TAANMAN, J. W. & SCARLATO, G. 1998. Cytochrome c oxidase subunit I
microdeletion in a patient with motor neuron disease. Ann Neurol, 43, 110-6.
131
Bibliografía
COTNEY, J. & SHADEL, G. S. 2006. Evidence for an early gene duplication event in
the evolution of the mitochondrial transcription factor B family and maintenance of rRNA
methyltransferase activity in human mtTFB1 and mtTFB2. J Mol Evol, 63, 707-17.
CHAN, D. C. 2006. Mitochondrial fusion and fission in mammals. Annu Rev Cell Dev Biol,
22, 79-99.
CHOMYN, A. 1996. In vivo labeling and analysis of human mitochondrial translation
products. Methods Enzymol, 264, 197-211.
DAVIES, S. M., RACKHAM, O., SHEARWOOD, A. M., HAMILTON, K. L., NARSAI,
R., WHELAN, J. & FILIPOVSKA, A. 2009. Pentatricopeptide repeat domain protein 3 associates
with the mitochondrial small ribosomal subunit and regulates translation. FEBS Lett, 583, 1853-8.
DE STEFANI, D., RAFFAELLO, A., TEARDO, E., SZABO, I. & RIZZUTO, R. 2011.
A forty-kilodalton protein of the inner membrane is the mitochondrial calcium uniporter. Nature,
476, 336-40.
DIAZ, F. 2010. Cytochrome c oxidase deficiency: patients and animal models. Biochim
Biophys Acta, 1802, 100-10.
DIAZ, F., KOTARSKY, H., FELLMAN, V. & MORAES, C. T. 2011. Mitochondrial
disorders caused by mutations in respiratory chain assembly factors. Semin Fetal Neonatal Med, 16,
197-204.
FALKENBERG, M., GASPARI, M., RANTANEN, A., TRIFUNOVIC, A., LARSSON,
N. G. & GUSTAFSSON, C. M. 2002. Mitochondrial transcription factors B1 and B2 activate
transcription of human mtDNA. Nat Genet, 31, 289-94.
FERNANDEZ-MORENO, M. A., BORNSTEIN, B., PETIT, N. & GARESSE, R. 2000.
The pathophysiology of mitochondrial biogenesis: towards four decades of mitochondrial DNA
research. Mol Genet Metab, 71, 481-95.
FERNANDEZ-SILVA, P., ENRIQUEZ, J. A. & MONTOYA, J. 2003. Replication and
transcription of mammalian mitochondrial DNA. Exp Physiol, 88, 41-56.
FERNANDEZ-VIZARRA, E., ENRIQUEZ, J. A., PEREZ-MARTOS, A., MONTOYA,
J. & FERNANDEZ-SILVA, P. 2011. Tissue-specific differences in mitochondrial activity and
biogenesis. Mitochondrion, 11, 207-13.
FERNANDEZ-VIZARRA, E., LOPEZ-PEREZ, M. J. & ENRIQUEZ, J. A. 2002.
Isolation of biogenetically competent mitochondria from mammalian tissues and cultured cells.
Methods, 26, 292-7.
132
Bibliografía
FERNANDEZ-VIZARRA, E., TIRANTI, V. & ZEVIANI, M. 2009. Assembly of the

oxidative phosphorylation system in humans: what we have learned by studying its defects. Biochim
Biophys Acta, 1793, 200-11.
FONTANESI, F., CLEMENTE, P. & BARRIENTOS, A. 2011. Cox25 teams up with
Mss51, Ssc1, and Cox14 to regulate mitochondrial cytochrome c oxidase subunit 1 expression and
assembly in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem, 286, 555-66.
FONTANESI, F., SOTO, I. C., HORN, D. & BARRIENTOS, A. 2006. Assembly of
mitochondrial cytochrome c-oxidase, a complicated and highly regulated cellular process. Am J
Physiol Cell Physiol, 291, C1129-47.
GABALDON, T. & HUYNEN, M. A. 2007. From endosymbiont to host-controlled
organelle: the hijacking of mitochondrial protein synthesis and metabolism. PLoS Comput Biol, 3,
e219.
GALATI, D., SRINIVASAN, S., RAZA, H., PRABU, S. K., HARDY, M., CHANDRAN,
K., LOPEZ, M., KALYANARAMAN, B. & AVADHANI, N. G. 2009. Role of nuclear-encoded
subunit Vb in the assembly and stability of cytochrome c oxidase complex: implications in
mitochondrial dysfunction and ROS production. Biochem J, 420, 439-49.
GARESSE, R. & KAGUNI, L. S. 2005. A Drosophila model of mitochondrial DNA
replication: proteins, genes and regulation. IUBMB Life, 57, 555-61.
GARESSE, R. & VALLEJO, C. G. 2001. Animal mitochondrial biogenesis and function: a
regulatory cross-talk between two genomes. Gene, 263, 1-16.
GARRIDO, N., GRIPARIC, L., JOKITALO, E., WARTIOVAARA, J., VAN DER BLIEK,
A. M. & SPELBRINK, J. N. 2003. Composition and dynamics of human mitochondrial nucleoids.
Mol Biol Cell, 14, 1583-96.
GASPARI, M., FALKENBERG, M., LARSSON, N. G. & GUSTAFSSON, C. M. 2004.
The mitochondrial RNA polymerase contributes critically to promoter specificity in mammalian
cells. EMBO J, 23, 4606-14.
GATTERMANN, N., RETZLAFF, S., WANG, Y. L., HOFHAUS, G., HEINISCH, J., AUL,
C. & SCHNEIDER, W. 1997. Heteroplasmic point mutations of mitochondrial DNA affecting
subunit I of cytochrome c oxidase in two patients with acquired idiopathic sideroblastic anemia.
Blood, 90, 4961-72.
GHEZZI, D., ARZUFFI, P., ZORDAN, M., DA RE, C., LAMPERTI, C., BENNA,
C., D’ADAMO, P., DIODATO, D., COSTA, R., MARIOTTI, C., UZIEL, G., SMIDERLE, C.
& ZEVIANI, M. 2011. Mutations in TTC19 cause mitochondrial complex III deficiency and
neurological impairment in humans and flies. Nat Genet, 43, 259-63.
133
Bibliografía
GRANT, J., SALDANHA, J. W. & GOULD, A. P. 2010. A Drosophila model for primary
coenzyme Q deficiency and dietary rescue in the developing nervous system. Dis Model Mech, 3,
799-806.
GRAY, M. W., BURGER, G. & LANG, B. F. 2001. The origin and early evolution of
mitochondria. Genome Biol, 2, REVIEWS1018.
GROHMANN, K., AMAIRIC, F., CREWS, S. & ATTARDI, G. 1978. Failure to detect
“cap” structures in mitochondrial DNA-coded poly(A)-containing RNA from HeLa cells. Nucleic
Acids Res, 5, 637-51.
HAMMARSUND, M., WILSON, W., CORCORAN, M., MERUP, M., EINHORN, S.,
GRANDER, D. & SANGFELT, O. 2001. Identification and characterization of two novel human
mitochondrial elongation factor genes, hEFG2 and hEFG1, phylogenetically conserved through
evolution. Hum Genet, 109, 542-50.
HANNAPPEL, A., BUNDSCHUH, F. A. & LUDWIG, B. 2011. Characterization of heme-
binding properties of Paracoccus denitrificans Surf1 proteins. FEBS J, 278, 1769-78.
HAYDEN, C. A. & BOSCO, G. 2008. Comparative genomic analysis of novel conserved
peptide upstream open reading frames in Drosophila melanogaster and other dipteran species.
BMC Genomics, 9, 61.
HISER, L., DI VALENTIN, M., HAMER, A. G. & HOSLER, J. P. 2000. Cox11p is required
for stable formation of the Cu(B) and magnesium centers of cytochrome c oxidase. J Biol Chem,
275, 619-23.
HORNG, Y. C., COBINE, P. A., MAXFIELD, A. B., CARR, H. S. & WINGE, D. R.
2004. Specific copper transfer from the Cox17 metallochaperone to both Sco1 and Cox11 in the
assembly of yeast cytochrome C oxidase. J Biol Chem, 279, 35334-40.
HORNG, Y. C., LEARY, S. C., COBINE, P. A., YOUNG, F. B., GEORGE, G. N.,
SHOUBRIDGE, E. A. & WINGE, D. R. 2005. Human Sco1 and Sco2 function as copper-binding
proteins. J Biol Chem, 280, 34113-22.
HUIGSLOOT, M., NIJTMANS, L. G., SZKLARCZYK, R., BAARS, M. J., VAN DEN
BRAND, M. A., HENDRIKSFRANSSEN, M. G., VAN DEN HEUVEL, L. P., SMEITINK,
J. A., HUYNEN, M. A. & RODENBURG, R. J. 2011. A mutation in C2orf64 causes impaired
cytochrome c oxidase assembly and mitochondrial cardiomyopathy. Am J Hum Genet, 88, 488-93.
HUTCHISON, C. A., 3RD, NEWBOLD, J. E., POTTER, S. S. & EDGELL, M. H. 1974.
Maternal inheritance of mammalian mitochondrial DNA. Nature, 251, 536-8.
JASTROCH, M., DIVAKARUNI, A. S., MOOKERJEE, S., TREBERG, J. R. & BRAND,
M. D. 2010. Mitochondrial proton and electron leaks. Essays Biochem, 47, 53-67.
134
Bibliografía
JIA, L., DIENHART, M., SCHRAMP, M., MCCAULEY, M., HELL, K. & STUART, R. A.
2003. Yeast Oxa1 interacts with mitochondrial ribosomes: the importance of the C-terminal region
of Oxa1. EMBO J, 22, 6438-47.
KAGUNI, L. S. 2004. DNA polymerase gamma, the mitochondrial replicase. Annu Rev
Biochem, 73, 293-320.
KANKI, T., OHGAKI, K., GASPARI, M., GUSTAFSSON, C. M., FUKUOH, A., SASAKI,
N., HAMASAKI, N. & KANG, D. 2004. Architectural role of mitochondrial transcription factor A
in maintenance of human mitochondrial DNA. Mol Cell Biol, 24, 9823-34.
KELLY, D. P. & SCARPULLA, R. C. 2004. Transcriptional regulatory circuits controlling
mitochondrial biogenesis and function. Genes Dev, 18, 357-68.
KHALIMONCHUK, O., BIRD, A. & WINGE, D. R. 2007. Evidence for a pro-oxidant
intermediate in the assembly of cytochrome oxidase. J Biol Chem, 282, 17442-9.
KOC, E. C. & SPREMULLI, L. L. 2002. Identification of mammalian mitochondrial
translational initiation factor 3 and examination of its role in initiation complex formation with
natural mRNAs. J Biol Chem, 277, 35541-9.
KORHONEN, J. A., GASPARI, M. & FALKENBERG, M. 2003. TWINKLE Has 5’ -> 3’
DNA helicase activity and is specifically stimulated by mitochondrial single-stranded DNA-binding
protein. J Biol Chem, 278, 48627-32.
KORHONEN, J. A., PHAM, X. H., PELLEGRINI, M. & FALKENBERG, M. 2004.
Reconstitution of a minimal mtDNA replisome in vitro. EMBO J, 23, 2423-9.
KUKAT, C., WURM, C. A., SPAHR, H., FALKENBERG, M., LARSSON, N. G. &
JAKOBS, S. 2011. Super-resolution microscopy reveals that mammalian mitochondrial nucleoids
have a uniform size and frequently contain a single copy of mtDNA. Proc Natl Acad Sci U S A,
108, 13534-9.
KURLAND, C. G. & ANDERSSON, S. G. 2000. Origin and evolution of the mitochondrial
proteome. Microbiol Mol Biol Rev, 64, 786-820.
LARSSON, N. G., WANG, J., WILHELMSSON, H., OLDFORS, A., RUSTIN, P.,
LEWANDOSKI, M., BARSH, G. S. & CLAYTON, D. A. 1998. Mitochondrial transcription factor
A is necessary for mtDNA maintenance and embryogenesis in mice. Nat Genet, 18, 231-6.
LEARY, S. C. 2010. Redox regulation of SCO protein function: controlling copper at a
mitochondrial crossroad. Antioxid Redox Signal, 13, 1403-16.
LEARY, S. C., KAUFMAN, B. A., PELLECCHIA, G., GUERCIN, G. H., MATTMAN,
A., JAKSCH, M. & SHOUBRIDGE, E. A. 2004. Human SCO1 and SCO2 have independent,
cooperative functions in copper delivery to cytochrome c oxidase. Hum Mol Genet, 13, 1839-48.
135
Bibliografía
LEARY, S. C., SASARMAN, F., NISHIMURA, T. & SHOUBRIDGE, E. A. 2009. Human

SCO2 is required for the synthesis of CO II and as a thiol-disulphide oxidoreductase for SCO1.
Hum Mol Genet, 18, 2230-40.
LEE, S., KIM, S., SUN, X., LEE, J. H. & CHO, H. 2007. Cell cycle-dependent mitochondrial
biogenesis and dynamics in mammalian cells. Biochem Biophys Res Commun, 357, 111-7.
LEFAI, E., CALLEJA, M., RUIZ DE MENA, I., LAGINA, A. T., 3RD, KAGUNI, L. S. &
GARESSE, R. 2000. Overexpression of the catalytic subunit of DNA polymerase gamma results
in depletion of mitochondrial DNA in Drosophila melanogaster. Mol Gen Genet, 264, 37-46.
LI, Y., PARK, J. S., DENG, J. H. & BAI, Y. 2006. Cytochrome c oxidase subunit IV is
essential for assembly and respiratory function of the enzyme complex. J Bioenerg Biomembr, 38,
283-91.
LIN, M. F., CARLSON, J. W., CROSBY, M. A., MATTHEWS, B. B., YU, C., PARK, S.,
WAN, K. H., SCHROEDER, A. J., GRAMATES, L. S., ST PIERRE, S. E., ROARK, M., WILEY,
K. L., JR., KULATHINAL, R. J., ZHANG, P., MYRICK, K. V., ANTONE, J. V., CELNIKER,
S. E., GELBART, W. M. & KELLIS, M. 2007. Revisiting the protein-coding gene catalog of
Drosophila melanogaster using 12 fly genomes. Genome Res, 17, 1823-36.
LING, M., MERANTE, F., CHEN, H. S., DUFF, C., DUNCAN, A. M. & ROBINSON, B.
H. 1997. The human mitochondrial elongation factor tu (EF-Tu) gene: cDNA sequence, genomic
localization, genomic structure, and identification of a pseudogene. Gene, 197, 325-36.
LITONIN, D., SOLOGUB, M., SHI, Y., SAVKINA, M., ANIKIN, M., FALKENBERG,
M., GUSTAFSSON, C. M. & TEMIAKOV, D. 2010. Human mitochondrial transcription revisited:
only TFAM and TFB2M are required for transcription of the mitochondrial genes in vitro. J Biol
Chem, 285, 18129-33.
LIU, M. & SPREMULLI, L. 2000. Interaction of mammalian mitochondrial ribosomes
with the inner membrane. J Biol Chem, 275, 29400-6.
LONGEN, S., BIEN, M., BIHLMAIER, K., KLOEPPEL, C., KAUFF, F.,
HAMMERMEISTER, M., WESTERMANN, B., HERRMANN, J. M. & RIEMER, J. 2009.
Systematic analysis of the twin cx(9)c protein family. J Mol Biol, 393, 356-68.
LONGLEY, M. J., PRASAD, R., SRIVASTAVA, D. K., WILSON, S. H. & COPELAND,
W. C. 1998. Identification of 5’-deoxyribose phosphate lyase activity in human DNA polymerase
gamma and its role in mitochondrial base excision repair in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A, 95,
12244-8.
LUPAS, A. N. & GRUBER, M. 2005. The structure of alpha-helical coiled coils. Adv Protein
Chem, 70, 37-78.
136
Bibliografía
MA, L. & SPREMULLI, L. L. 1995. Cloning and sequence analysis of the human
mitochondrial translational initiation factor 2 cDNA. J Biol Chem, 270, 1859-65.
MAIER, D., FARR, C. L., POECK, B., ALAHARI, A., VOGEL, M., FISCHER, S.,
KAGUNI, L. S. & SCHNEUWLY, S. 2001. Mitochondrial single-stranded DNA-binding protein
is required for mitochondrial DNA replication and development in Drosophila melanogaster. Mol
Biol Cell, 12, 821-30.
MAMMUCARI, C., PATRON, M., GRANATIERO, V. & RIZZUTO, R. 2011. Molecules
and roles of mitochondrial calcium signaling. Biofactors, 37, 219-27.
MANFREDI, G., SCHON, E. A., MORAES, C. T., BONILLA, E., BERRY, G. T.,
SLADKY, J. T. & DIMAURO, S. 1995. A new mutation associated with MELAS is located in a
mitochondrial DNA polypeptide-coding gene. Neuromuscul Disord, 5, 391-8.
MARGULIS, L. 1975. Symbiotic theory of the origin of eukaryotic organelles; criteria for
proof. Symp Soc Exp Biol, 21-38.
MARTINEZ-DIEZ, M., SANTAMARIA, G., ORTEGA, A. D. & CUEZVA, J. M. 2006.
Biogenesis and dynamics of mitochondria during the cell cycle: significance of 3’UTRs. PLoS One,
1, e107.
MASSA, V., FERNANDEZ-VIZARRA, E., ALSHAHWAN, S., BAKHSH, E., GOFFRINI,
P., FERRERO, I., MEREGHETTI, P., D’ADAMO, P., GASPARINI, P. & ZEVIANI, M. 2008.
Severe infantile encephalomyopathy caused by a mutation in COX6B1, a nucleus-encoded subunit
of cytochrome c oxidase. Am J Hum Genet, 82, 1281-9.
MATSUSHIMA, Y., ADAN, C., GARESSE, R. & KAGUNI, L. S. 2005. Drosophila
mitochondrial transcription factor B1 modulates mitochondrial translation but not transcription or
DNA copy number in Schneider cells. J Biol Chem, 280, 16815-20.
MATSUSHIMA, Y., GARESSE, R. & KAGUNI, L. S. 2004. Drosophila mitochondrial
transcription factor B2 regulates mitochondrial DNA copy number and transcription in schneider
cells. J Biol Chem, 279, 26900-5.
METODIEV, M. D., LESKO, N., PARK, C. B., CAMARA, Y., SHI, Y., WIBOM, R.,
HULTENBY, K., GUSTAFSSON, C. M. & LARSSON, N. G. 2009. Methylation of 12S rRNA is
necessary for in vivo stability of the small subunit of the mammalian mitochondrial ribosome. Cell
Metab, 9, 386-97.
MICK, D. U., FOX, T. D. & REHLING, P. 2011. Inventory control: cytochrome c oxidase
assembly regulates mitochondrial translation. Nat Rev Mol Cell Biol, 12, 14-20.
137
Bibliografía
MICK, D. U., VUKOTIC, M., PIECHURA, H., MEYER, H. E., WARSCHEID, B.,
DECKERS, M. & REHLING, P. 2010. Coa3 and Cox14 are essential for negative feedback
regulation of COX1 translation in mitochondria. J Cell Biol, 191, 141-54.
MICK, D. U., WAGNER, K., VAN DER LAAN, M., FRAZIER, A. E., PERSCHIL, I.,
PAWLAS, M., MEYER, H. E., WARSCHEID, B. & REHLING, P. 2007. Shy1 couples Cox1
translational regulation to cytochrome c oxidase assembly. EMBO J, 26, 4347-58.
MONTOYA, J., CHRISTIANSON, T., LEVENS, D., RABINOWITZ, M. & ATTARDI,
G. 1982. Identification of initiation sites for heavy-strand and light-strand transcription in human
mitochondrial DNA. Proc Natl Acad Sci U S A, 79, 7195-9.
MONTOYA, J., GAINES, G. L. & ATTARDI, G. 1983. The pattern of transcription of
the human mitochondrial rRNA genes reveals two overlapping transcription units. Cell, 34, 151-9.
MONTOYA, J., OJALA, D. & ATTARDI, G. 1981. Distinctive features of the 5’-terminal
sequences of the human mitochondrial mRNAs. Nature, 290, 465-70.
MOOTHA, V. K., LEPAGE, P., MILLER, K., BUNKENBORG, J., REICH, M.,
HJERRILD, M., DELMONTE, T., VILLENEUVE, A., SLADEK, R., XU, F., MITCHELL, G.
A., MORIN, C., MANN, M., HUDSON, T. J., ROBINSON, B., RIOUX, J. D. & LANDER, E.
S. 2003. Identification of a gene causing human cytochrome c oxidase deficiency by integrative
genomics. Proc Natl Acad Sci U S A, 100, 605-10.
MOSSMANN, D., MEISINGER, C. & VOGTLE, F. N. 2011. Processing of mitochondrial
presequences. Biochim Biophys Acta.
NAGAO, A., SUZUKI, T., KATOH, T. & SAKAGUCHI, Y. 2009. Biogenesis of glutaminyl-
mt tRNAGln in human mitochondria. Proc Natl Acad Sci U S A, 106, 16209-14.
NASS, M. M. & NASS, S. 1963. Intramitochondrial Fibers with DNA Characteristics. I.
Fixation and Electron Staining Reactions. J Cell Biol, 19, 593-611.
NICHOLLS, D. G. 2001. A history of UCP1. Biochem Soc Trans, 29, 751-5.
NIJTMANS, L. G., ARTAL SANZ, M., BUCKO, M., FARHOUD, M. H., FEENSTRA, M.,
HAKKAART, G. A., ZEVIANI, M. & GRIVELL, L. A. 2001. Shy1p occurs in a high molecular
weight complex and is required for efficient assembly of cytochrome c oxidase in yeast. FEBS Lett,
498, 46-51.
NIJTMANS, L. G., TAANMAN, J. W., MUIJSERS, A. O., SPEIJER, D. & VAN DEN
BOGERT, C. 1998. Assembly of cytochrome-c oxidase in cultured human cells. Eur J Biochem, 254,
389-94.
OJALA, D., MONTOYA, J. & ATTARDI, G. 1981. tRNA punctuation model of RNA
processing in human mitochondria. Nature, 290, 470-4.
138
Bibliografía
OLIVEIRA, M. T. & KAGUNI, L. S. 2011. Reduced stimulation of recombinant Pol

{gamma} and mtDNA helicase by variants of mitochondrial single-stranded DNA-binding protein
(mtSSB) correlates with defects in mtDNA Replication in animal cells. J Biol Chem.
OQUENDO, C. E., ANTONICKA, H., SHOUBRIDGE, E. A., REARDON, W. &
BROWN, G. K. 2004. Functional and genetic studies demonstrate that mutation in the COX15
gene can cause Leigh syndrome. J Med Genet, 41, 540-4.
OSWALD, C., KRAUSE-BUCHHOLZ, U. & RODEL, G. 2009. Knockdown of human
COX17 affects assembly and supramolecular organization of cytochrome c oxidase. J Mol Biol, 389,
470-9.
OTT, M., PRESTELE, M., BAUERSCHMITT, H., FUNES, S., BONNEFOY, N. &
HERRMANN, J. M. 2006. Mba1, a membrane-associated ribosome receptor in mitochondria.
EMBO J, 25, 1603-10.
OWUSU-ANSAH, E., YAVARI, A., MANDAL, S. & BANERJEE, U. 2008. Distinct
mitochondrial retrograde signals control the G1-S cell cycle checkpoint. Nat Genet, 40, 356-61.
PAGLIARINI, D. J., CALVO, S. E., CHANG, B., SHETH, S. A., VAFAI, S. B., ONG, S.
E., WALFORD, G. A., SUGIANA, C., BONEH, A., CHEN, W. K., HILL, D. E., VIDAL, M.,
EVANS, J. G., THORBURN, D. R., CARR, S. A. & MOOTHA, V. K. 2008. A mitochondrial
protein compendium elucidates complex I disease biology. Cell, 134, 112-23.
PAPADOPOULOU, L. C., SUE, C. M., DAVIDSON, M. M., TANJI, K., NISHINO, I.,
SADLOCK, J. E., KRISHNA, S., WALKER, W., SELBY, J., GLERUM, D. M., COSTER, R. V.,
LYON, G., SCALAIS, E., LEBEL, R., KAPLAN, P., SHANSKE, S., DE VIVO, D. C., BONILLA,
E., HIRANO, M., DIMAURO, S. & SCHON, E. A. 1999. Fatal infantile cardioencephalomyopathy
with COX deficiency and mutations in SCO2, a COX assembly gene. Nat Genet, 23, 333-7.
PENA, P. & GARESSE, R. 1993. The beta subunit of the Drosophila melanogaster ATP
synthase: cDNA cloning, amino acid analysis and identification of the protein in adult flies. Biochem
Biophys Res Commun, 195, 785-91.
PERALTA, S., CLEMENTE, P., SANCHEZ-MARTINEZ, A., CALLEJA, M.,
HERNANDEZ-SIERRA, R., MATSUSHIMA, Y., ADAN, C., UGALDE, C., FERNANDEZ-
MORENO, M. A., KAGUNI, L. S. & GARESSE, R. 2012. CCDC56 is a novel mitochondrial
protein essential for cytochrome c oxidase function.
PEREZ-MARTINEZ, X., BROADLEY, S. A. & FOX, T. D. 2003. Mss51p promotes
mitochondrial Cox1p synthesis and interacts with newly synthesized Cox1p. EMBO J, 22, 5951-61.
PEREZ-MARTINEZ, X., BUTLER, C. A., SHINGU-VAZQUEZ, M. & FOX, T. D.
2009. Dual functions of Mss51 couple synthesis of Cox1 to assembly of cytochrome c oxidase in
Saccharomyces cerevisiae mitochondria. Mol Biol Cell, 20, 4371-80.
139
Bibliografía
PIERREL, F., BESTWICK, M. L., COBINE, P. A., KHALIMONCHUK, O., CRICCO,

J. A. & WINGE, D. R. 2007. Coa1 links the Mss51 post-translational function to Cox1 cofactor
insertion in cytochrome c oxidase assembly. EMBO J, 26, 4335-46.
PIERRON, D., WILDMAN, D. E., HUTTEMANN, M., MARKONDAPATNAIKUNI,
G. C., ARAS, S. & GROSSMAN, L. I. 2011. Cytochrome c oxidase: Evolution of control via
nuclear subunit addition. Biochim Biophys Acta.
RACKHAM, O., DAVIES, S. M., SHEARWOOD, A. M., HAMILTON, K. L., WHELAN,
J. & FILIPOVSKA, A. 2009. Pentatricopeptide repeat domain protein 1 lowers the levels of
mitochondrial leucine tRNAs in cells. Nucleic Acids Res, 37, 5859-67.
RAHMAN, S., BROWN, R. M., CHONG, W. K., WILSON, C. J. & BROWN, G. K. 2001.
A SURF1 gene mutation presenting as isolated leukodystrophy. Ann Neurol, 49, 797-800.
ROBERTI, M., POLOSA, P. L., BRUNI, F., MANZARI, C., DECEGLIE, S., GADALETA,
M. N. & CANTATORE, P. 2009. The MTERF family proteins: mitochondrial transcription
regulators and beyond. Biochim Biophys Acta, 1787, 303-11.
RUIZ DE MENA, I., LEFAI, E., GARESSE, R. & KAGUNI, L. S. 2000. Regulation
of mitochondrial single-stranded DNA-binding protein gene expression links nuclear and
mitochondrial DNA replication in drosophila. J Biol Chem, 275, 13628-36.
RUZZENENTE, B., METODIEV, M. D., WREDENBERG, A., BRATIC, A., PARK,
C. B., CAMARA, Y., MILENKOVIC, D., ZICKERMANN, V., WIBOM, R., HULTENBY, K.,
ERDJUMENT-BROMAGE, H., TEMPST, P., BRANDT, U., STEWART, J. B., GUSTAFSSON,
C. M. & LARSSON, N. G. 2011. LRPPRC is necessary for polyadenylation and coordination of
translation of mitochondrial mRNAs. EMBO J.
SAMBROOK, J. & RUSSELL, D. W. (eds.) 2001. Molecular cloning, a laboratory manual: Cold
Spring Harbor Laboratory.
SANCHEZ-MARTINEZ, A., LUO, N., CLEMENTE, P., ADAN, C., HERNANDEZ-
SIERRA, R., OCHOA, P., FERNANDEZ-MORENO, M. A., KAGUNI, L. S. & GARESSE, R.
2006. Modeling human mitochondrial diseases in flies. Biochim Biophys Acta, 1757, 1190-8.
SASARMAN, F., BRUNEL-GUITTON, C., ANTONICKA, H., WAI, T. &
SHOUBRIDGE, E. A. 2010. LRPPRC and SLIRP interact in a ribonucleoprotein complex that
regulates posttranscriptional gene expression in mitochondria. Mol Biol Cell, 21, 1315-23.
SCHAEFER, A. M., MCFARLAND, R., BLAKELY, E. L., HE, L., WHITTAKER, R. G.,
TAYLOR, R. W., CHINNERY, P. F. & TURNBULL, D. M. 2008. Prevalence of mitochondrial
DNA disease in adults. Ann Neurol, 63, 35-9.
140
Bibliografía
SCHAFER, E., SEELERT, H., REIFSCHNEIDER, N. H., KRAUSE, F., DENCHER, N.

A. & VONCK, J. 2006. Architecture of active mammalian respiratory chain supercomplexes. J Biol
Chem, 281, 15370-5.
SCHAGGER, H. & PFEIFFER, K. 2000. Supercomplexes in the respiratory chains of
yeast and mammalian mitochondria. EMBO J, 19, 1777-83.
SCHEFFLER, I. E. 2001. A century of mitochondrial research: achievements and
perspectives. Mitochondrion, 1, 3-31.
SCHMIDT, O., PFANNER, N. & MEISINGER, C. 2010. Mitochondrial protein import:
from proteomics to functional mechanisms. Nat Rev Mol Cell Biol, 11, 655-67.
SHUTT, T. E. & GRAY, M. W. 2006a. Bacteriophage origins of mitochondrial replication
and transcription proteins. Trends Genet, 22, 90-5.
SHUTT, T. E. & GRAY, M. W. 2006b. Homologs of mitochondrial transcription factor B,
sparsely distributed within the eukaryotic radiation, are likely derived from the dimethyladenosine
methyltransferase of the mitochondrial endosymbiont. Mol Biol Evol, 23, 1169-79.
SHUTT, T. E., LODEIRO, M. F., COTNEY, J., CAMERON, C. E. & SHADEL, G. S.
2010. Core human mitochondrial transcription apparatus is a regulated two-component system in
vitro. Proc Natl Acad Sci U S A, 107, 12133-8.
SMEITINK, J. A., ZEVIANI, M., TURNBULL, D. M. & JACOBS, H. T. 2006. Mitochondrial
medicine: a metabolic perspective on the pathology of oxidative phosphorylation disorders. Cell
Metab, 3, 9-13.
SMITH, D., GRAY, J., MITCHELL, L., ANTHOLINE, W. E. & HOSLER, J. P. 2005.
Assembly of cytochrome-c oxidase in the absence of assembly protein Surf1p leads to loss of the
active site heme. J Biol Chem, 280, 17652-6.
SMITS, P., SMEITINK, J. & VAN DEN HEUVEL, L. 2010. Mitochondrial translation
and beyond: processes implicated in combined oxidative phosphorylation deficiencies. J Biomed
Biotechnol, 2010, 737385.
SOLEIMANPOUR-LICHAEI, H. R., KUHL, I., GAISNE, M., PASSOS, J. F., WYDRO,
M., RORBACH, J., TEMPERLEY, R., BONNEFOY, N., TATE, W., LIGHTOWLERS, R. &
CHRZANOWSKA-LIGHTOWLERS, Z. 2007. mtRF1a is a human mitochondrial translation
release factor decoding the major termination codons UAA and UAG. Mol Cell, 27, 745-57.
SOTO, I. C., FONTANESI, F., LIU, J. & BARRIENTOS, A. 2011. Biogenesis and assembly
of eukaryotic cytochrome c oxidase catalytic core. Biochim Biophys Acta.
SPELBRINK, J. N. 2010. Functional organization of mammalian mitochondrial DNA in
nucleoids: history, recent developments, and future challenges. IUBMB Life, 62, 19-32.
141
Bibliografía
SPELBRINK, J. N., LI, F. Y., TIRANTI, V., NIKALI, K., YUAN, Q. P., TARIQ, M.,
WANROOIJ, S., GARRIDO, N., COMI, G., MORANDI, L., SANTORO, L., TOSCANO, A.,
FABRIZI, G. M., SOMER, H., CROXEN, R., BEESON, D., POULTON, J., SUOMALAINEN,
A., JACOBS, H. T., ZEVIANI, M. & LARSSON, C. 2001. Human mitochondrial DNA deletions
associated with mutations in the gene encoding Twinkle, a phage T7 gene 4-like protein localized
in mitochondria. Nat Genet, 28, 223-31.
SPIERINGS, D., MCSTAY, G., SALEH, M., BENDER, C., CHIPUK, J., MAURER, U. &
GREEN, D. R. 2005. Connected to death: the (unexpurgated) mitochondrial pathway of apoptosis.
Science, 310, 66-7.
STARKOV, A. A. 2008. The role of mitochondria in reactive oxygen species metabolism
and signaling. Ann N Y Acad Sci, 1147, 37-52.
STIBUREK, L., VESELA, K., HANSIKOVA, H., HULKOVA, H. & ZEMAN, J. 2009.
Loss of function of Sco1 and its interaction with cytochrome c oxidase. Am J Physiol Cell Physiol,
296, C1218-26.
STIBUREK, L., VESELA, K., HANSIKOVA, H., PECINA, P., TESAROVA, M., CERNA,
L., HOUSTEK, J. & ZEMAN, J. 2005. Tissue-specific cytochrome c oxidase assembly defects due
to mutations in SCO2 and SURF1. Biochem J, 392, 625-32.
SZYRACH, G., OTT, M., BONNEFOY, N., NEUPERT, W. & HERRMANN, J. M.
2003. Ribosome binding to the Oxa1 complex facilitates co-translational protein insertion in
mitochondria. EMBO J, 22, 6448-57.
TAIT, S. W. & GREEN, D. R. 2010. Mitochondria and cell death: outer membrane
permeabilization and beyond. Nat Rev Mol Cell Biol, 11, 621-32.
TIRANTI, V., CORONA, P., GRECO, M., TAANMAN, J. W., CARRARA, F., LAMANTEA,
E., NIJTMANS, L., UZIEL, G. & ZEVIANI, M. 2000. A novel frameshift mutation of the mtDNA
COIII gene leads to impaired assembly of cytochrome c oxidase in a patient affected by Leigh-like
syndrome. Hum Mol Genet, 9, 2733-42.
TIRANTI, V., CHARIOT, P., CARELLA, F., TOSCANO, A., SOLIVERI, P., GIRLANDA,
P., CARRARA, F., FRATTA, G. M., REID, F. M., MARIOTTI, C. & ZEVIANI, M. 1995.
Maternally inherited hearing loss, ataxia and myoclonus associated with a novel point mutation in
mitochondrial tRNASer(UCN) gene. Hum Mol Genet, 4, 1421-7.
TIRANTI, V., GALIMBERTI, C., NIJTMANS, L., BOVOLENTA, S., PERINI, M. P. &
ZEVIANI, M. 1999a. Characterization of SURF-1 expression and Surf-1p function in normal and
disease conditions. Hum Mol Genet, 8, 2533-40.
142
Bibliografía
TIRANTI, V., HOERTNAGEL, K., CARROZZO, R., GALIMBERTI, C., MUNARO,

M., GRANATIERO, M., ZELANTE, L., GASPARINI, P., MARZELLA, R., ROCCHI, M.,
BAYONA-BAFALUY, M. P., ENRIQUEZ, J. A., UZIEL, G., BERTINI, E., DIONISI-VICI, C.,
FRANCO, B., MEITINGER, T. & ZEVIANI, M. 1998. Mutations of SURF-1 in Leigh disease
associated with cytochrome c oxidase deficiency. Am J Hum Genet, 63, 1609-21.
TIRANTI, V., JAKSCH, M., HOFMANN, S., GALIMBERTI, C., HOERTNAGEL,
K., LULLI, L., FREISINGER, P., BINDOFF, L., GERBITZ, K. D., COMI, G. P., UZIEL, G.,
ZEVIANI, M. & MEITINGER, T. 1999b. Loss-of-function mutations of SURF-1 are specifically
associated with Leigh syndrome with cytochrome c oxidase deficiency. Ann Neurol, 46, 161-6.
TOIVONEN, J. M., O’DELL, K. M., PETIT, N., IRVINE, S. C., KNIGHT, G. K.,
LEHTONEN, M., LONGMUIR, M., LUOTO, K., TOURAILLE, S., WANG, Z., ALZIARI, S.,
SHAH, Z. H. & JACOBS, H. T. 2001. Technical knockout, a Drosophila model of mitochondrial
deafness. Genetics, 159, 241-54.
TOWPIK, J. 2005. Regulation of mitochondrial translation in yeast. Cell Mol Biol Lett, 10,
571-94.
TSUKIHARA, T., AOYAMA, H., YAMASHITA, E., TOMIZAKI, T., YAMAGUCHI, H.,
SHINZAWA-ITOH, K., NAKASHIMA, R., YAONO, R. & YOSHIKAWA, S. 1995. Structures of
metal sites of oxidized bovine heart cytochrome c oxidase at 2.8 A. Science, 269, 1069-74.
TSUKIHARA, T., AOYAMA, H., YAMASHITA, E., TOMIZAKI, T., YAMAGUCHI, H.,
SHINZAWA-ITOH, K., NAKASHIMA, R., YAONO, R. & YOSHIKAWA, S. 1996. The whole
structure of the 13-subunit oxidized cytochrome c oxidase at 2.8 A. Science, 272, 1136-44.
UGALDE, C., COENEN, M. J., FARHOUD, M. H., GILINSKY, S., KOOPMAN, W. J.,
VAN DEN HEUVEL, L. P., SMEITINK, J. A. & NIJTMANS, L. G. 2002. New perspectives on the
assembly process of mitochondrial respiratory chain complex cytochrome c oxidase. Mitochondrion,
2, 117-28.
VALNOT, I., OSMOND, S., GIGAREL, N., MEHAYE, B., AMIEL, J., CORMIER-
DAIRE, V., MUNNICH, A., BONNEFONT, J. P., RUSTIN, P. & ROTIG, A. 2000a. Mutations
of the SCO1 gene in mitochondrial cytochrome c oxidase deficiency with neonatal-onset hepatic
failure and encephalopathy. Am J Hum Genet, 67, 1104-9.
VALNOT, I., VON KLEIST-RETZOW, J. C., BARRIENTOS, A., GORBATYUK, M.,
TAANMAN, J. W., MEHAYE, B., RUSTIN, P., TZAGOLOFF, A., MUNNICH, A. & ROTIG, A.
2000b. A mutation in the human heme A:farnesyltransferase gene (COX10 ) causes cytochrome c
oxidase deficiency. Hum Mol Genet, 9, 1245-9.
143
Bibliografía
VON KLEIST-RETZOW, J. C., YAO, J., TAANMAN, J. W., CHANTREL, K., CHRETIEN,
D., CORMIER-DAIRE, V., ROTIG, A., MUNNICH, A., RUSTIN, P. & SHOUBRIDGE, E. A.
2001. Mutations in SURF1 are not specifically associated with Leigh syndrome. J Med Genet, 38,
109-13.
WAI, T., TEOLI, D. & SHOUBRIDGE, E. A. 2008. The mitochondrial DNA genetic
bottleneck results from replication of a subpopulation of genomes. Nat Genet, 40, 1484-8.
WALLACE, D. C. 2005. A mitochondrial paradigm of metabolic and degenerative diseases,
aging, and cancer: a dawn for evolutionary medicine. Annu Rev Genet, 39, 359-407.
WALLACE, D. C. 2010. Mitochondrial DNA mutations in disease and aging. Environ Mol
Mutagen, 51, 440-50.
WALLACE, D. C. & FAN, W. 2010. Energetics, epigenetics, mitochondrial genetics.
Mitochondrion, 10, 12-31.
WERAARPACHAI, W., ANTONICKA, H., SASARMAN, F., SEEGER, J., SCHRANK,
B., KOLESAR, J. E., LOCHMULLER, H., CHEVRETTE, M., KAUFMAN, B. A., HORVATH,
R. & SHOUBRIDGE, E. A. 2009. Mutation in TACO1, encoding a translational activator of COX
I, results in cytochrome c oxidase deficiency and late-onset Leigh syndrome. Nat Genet, 41, 833-7.
WERAARPACHAI, W., SASARMAN, F., NISHIMURA, T., ANTONICKA, H., AURE,
K., ROTIG, A., LOMBES, A. & SHOUBRIDGE, E. A. 2012. Mutations in C12orf62, a Factor
that Couples COX I Synthesis with Cytochrome c Oxidase Assembly, Cause Fatal Neonatal Lactic
Acidosis. Am J Hum Genet, 90, 142-51.
WILLIAMS, S. L., VALNOT, I., RUSTIN, P. & TAANMAN, J. W. 2004. Cytochrome c
oxidase subassemblies in fibroblast cultures from patients carrying mutations in COX10, SCO1, or
SURF1. J Biol Chem, 279, 7462-9.
XIN, H., WORIAX, V., BURKHART, W. & SPREMULLI, L. L. 1995. Cloning and
expression of mitochondrial translational elongation factor Ts from bovine and human liver. J Biol
Chem, 270, 17243-9.
XU, F., ACKERLEY, C., MAJ, M. C., ADDIS, J. B., LEVANDOVSKIY, V., LEE, J.,
MACKAY, N., CAMERON, J. M. & ROBINSON, B. H. 2008. Disruption of a mitochondrial
RNA-binding protein gene results in decreased cytochrome b expression and a marked reduction
in ubiquinol-cytochrome c reductase activity in mouse heart mitochondria. Biochem J, 416, 15-26.
ZHANG, Y. & SPREMULLI, L. L. 1998. Identification and cloning of human mitochondrial
translational release factor 1 and the ribosome recycling factor. Biochim Biophys Acta, 1443, 245-50.
144
Bibliografía
ZHU, Z., YAO, J., JOHNS, T., FU, K., DE BIE, I., MACMILLAN, C., CUTHBERT,
A. P., NEWBOLD, R. F., WANG, J., CHEVRETTE, M., BROWN, G. K., BROWN, R. M. &
SHOUBRIDGE, E. A. 1998. SURF1, encoding a factor involved in the biogenesis of cytochrome
c oxidase, is mutated in Leigh syndrome. Nat Genet, 20, 337-43.
ZORDAN, M. A., CISOTTO, P., BENNA, C., AGOSTINO, A., RIZZO, G., PICCIN, A.,
PEGORARO, M., SANDRELLI, F., PERINI, G., TOGNON, G., DE CARO, R., PERON, S.,
KRONNIE, T. T., MEGIGHIAN, A., REGGIANI, C., ZEVIANI, M. & COSTA, R. 2006. Post-
transcriptional silencing and functional characterization of the Drosophila melanogaster homolog
of human Surf1. Genetics, 172, 229-41.
145
ANEXOS
Anexos
Durante la realización de esta Tesis Doctoral se han publicado los siguientes artículos y
revisiones:
SANCHEZ-MARTINEZ, A., LUO, N., CLEMENTE, P., ADAN, C., HERNANDEZ-

SIERRA, R., OCHOA, P., FERNANDEZ-MORENO, M. A., KAGUNI, L. S. & GARESSE, R.
2006. Modeling human mitochondrial diseases in flies. Biochim Biophys Acta, 1757, 1190-8.
FONTANESI, F., CLEMENTE, P. & BARRIENTOS, A. 2011. Cox25 teams up with

Mss51, Ssc1, and Cox14 to regulate mitochondrial cytochrome c oxidase subunit 1 expression and
assembly in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem, 286, 555-66.
PERALTA, S., CLEMENTE, P., SANCHEZ-MARTINEZ, A., CALLEJA, M.,

HERNANDEZ-SIERRA, R., MATSUSHIMA, Y., ADAN, C., UGALDE, C., FERNANDEZ-
MORENO, M. A., KAGUNI, L. S. & GARESSE, R. 2012. CCDC56 is a novel mitochondrial
protein essential for cytochrome c oxidase function. En revisión en J Biol Chem.
149
Anexos
Biochimica et Biophysica Acta 1757 (2006) 1190 – 1198

www.elsevier.com/locate/bbabio
Review
Modeling human mitochondrial diseases in flies
Álvaro Sánchez-Martínez a , Ningguang Luo b , Paula Clemente a , Cristina Adán a ,
Rosana Hernández-Sierra a , Pilar Ochoa a , Miguel Ángel Fernández-Moreno a ,
Laurie S. Kaguni b , Rafael Garesse a,⁎
a
Departamento de Bioquímica, Instituto de Investigaciones Biomédicas “Alberto Sols” CSIC-UAM. Facultad de Medicina, Universidad Autónoma de Madrid,
Arzobispo Morcillo 4, E-28029 Madrid, Spain
b
Department of Biochemistry and Molecular Biology, Michigan State University, East Lansing, MI 48824-1319, USA
Received 1 March 2006; received in revised form 24 April 2006; accepted 5 May 2006
Available online 13 May 2006
Abstract
Human mitochondrial diseases are associated with a wide range of clinical symptoms, and those that result from mutations in mitochondrial
DNA affect at least 1 in 8500 individuals. The development of animal models that reproduce the variety of symptoms associated with this group of
complex human disorders is a major focus of current research. Drosophila represents an attractive model, in large part because of its short life
cycle, the availability of a number of powerful techniques to alter gene structure and regulation, and the presence of orthologs of many human
disease genes. We describe here Drosophila models of mitochondrial DNA depletion, deafness, encephalopathy, Freidreich's ataxia, and diseases
due to mitochondrial DNA mutations. We also describe several genetic approaches for gene manipulation in flies, including the recently developed
method of targeted mutagenesis by recombinational knock-in.
© 2006 Elsevier B.V. All rights reserved.
Keywords: Drosophila; Mitochondria; Mitochondrial diseases; Gene targeting; Oxidative phosphorylation
1. Introduction polytene chromosomes, (v) the straightforward use of X-rays

and other mutagenic agents to generate large collections of
The fruit fly Drosophila has played a critical role in the mutant stocks and, (vi) the physical accessibility of the mech-
origin and development of modern biology, particularly in the anosensory apparatus for experimentation. During the remain-
field of genetics. In 1910, T. H. Morgan's experiments demon- der of the century, new technologies were developed to manipulate
strating the chromosome theory of heredity initiated Drosophila and understand the Drosophila genome, leading to remarkable
as a tool to investigate the basis of genetics and development discoveries such as the genetic control of embryonic develop-
[1]. Features that made Drosophila useful as an animal model in ment by E. Lewis, C. Nüsslein-Volhard and E. Wieschaus [3].
the first half of the past century are still attractive today [1,2]. Advances in molecular biology have allowed the generation of
These include (i) a short life cycle, (ii) the facility to feed and transgenic flies using P-element transposons [4], the develop-
maintain stocks and populations without specialized instrumen- ment of the yeast UAS-GAL4-based gene overexpression sys-
tation or infrastructure, (iii) the availability of non-recombino- tem [5] and more recently, technologies based on site specific
genic balancer chromosomes, (iv) physical mapping of genes on recombination to knock-in and knock-out specific genes, and
RNA interference (RNAi) to knock-down gene expression (for
Abbreviations: mtDNA, mitochondrial DNA; OXPHOS, oxidative phos- a review, see [6]). At the same time, Drosophila melanogaster
phorylation; NRG, Nuclear respiratory gene; COX, cytochrome oxidase; MDS, was one of the first organisms to be sequenced in its entirety.
mtDNA depletion syndrome; pol γ-α, DNA polymerase γ catalytic subunit; LS, The first annotated sequence was published in March 2000, and
Leigh syndrome; CNS, central nervous system; FA, Friedreich's ataxia; adPEO, it has been updated regularly (http://flybase.net/annot/dmel-
autosomal dominant progressive external ophthalmoplegia; RNAi, RNA
interference; PNS, peripheral nervous system; DSB, double-strand break release4-notes.html). The Drosophila genome contains a large
⁎ Corresponding author. Tel.: +34 91 4975452; fax: +34 91 5854401. number of human orthologs, demonstrating its potential as a
E-mail address: rafael.garesse@uam.es (R. Garesse). model of human disease [7].
0005-2728/$ - see front matter © 2006 Elsevier B.V. All rights reserved.
doi:10.1016/j.bbabio.2006.05.008
151
Anexos
Á. Sánchez-Martínez et al. / Biochimica et Biophysica Acta 1757 (2006) 1190–1198 1191
2. Mitochondrial biogenesis in Drosophila Table 1

DNA sequence elements involved in the regulated expression of essential factors
for mtDNA metabolism in Drosophila
Mitochondrial biogenesis is an essential process in cell
proliferation and differentiation. It depends on the co-ordinated Gene DNA sequence elements
expression of two genomes located in different subcellular com- DRE NRG EWG
partments, the nucleus and the mitochondrion [8]. Mitochondrial pol γ-α − − +
DNA (mtDNA) is a circular double-stranded DNA molecule with pol γ-β + + −
an extremely compact organization, and a gene content that is well mtSSB + + −
mtDNA helicase + − −
conserved in the animal kingdom. It encodes 22 tRNAs, 2 rRNAs
mtRNA pol − + −
and 13 polypeptides, all of which are components of the oxidative TFAM + + −
phosphorylation system (OXPHOS). The rest of the subunits of mtTFB1 + − −
the OXPHOS system (about 90) and all of the proteins involved in mtTFB2 + − −
the maintenance and expression of mtDNA, and all other mito- mtTTF + − −
chondrial functions, are encoded in nuclear DNA [8]. The proximal promoter (2 Kb) and 3′-upstream gene regions of several genes
In the last few years, several mammalian transcriptional reg- encoding essential factors for Drosophila mtDNA metabolism have been
analyzed in silico, to search for potential binding sites for DREF, NRG and
ulators have been characterized that control the expression of both
EWG. The functional role of all DREF binding sites except that in the gene for
nuclear and mitochondrial genes, and therefore play a critical role mtTFB1 has been demonstrated by EMSA and cell transfection analyses. [14
in intergenomic communication [9]. Extracellular signals induce (mtSSB), 65 (pol γ-β), 66 (Tfam) and unpublished data from our laboratories].
expression of PGC-1 family coactivators, which in cooperation
with specific transcription factors (mainly Nuclear Respiratory
Factors, NRF-1 and NRF-2), have been found to regulate the and transcription machineries contain both DRE and NRG
expression of many genes involved in mitochondrial biogenesis. sites.
These include structural subunits of the OXPHOS system, en- To begin to understand the regulation of mitochondrial bio-
zymes involved in intermediary metabolism, and several factors genesis during embryonic development, we have studied by in
involved in mtDNA maintenance and transcription (reviewed in situ hybridization and immunostaining the spatio-temporal ex-
[10]). A similar framework to explain the integrated control of pression pattern of genes encoding mtDNA replication factors
Drosophila mitochondrial gene expression has not been identi- as markers of mitochondrial proliferation, and those encod-
fied. The ortholog of nrf-1 in Drosophila, erect wing, is essential ing structural components of the OXPHOS system as markers
for neurogenesis and myogenesis [11], but it has not been linked of mitochondrial differentiation. We have found that genes in-
directly to regulation of mitochondrial gene expression. Thus, it is volved in mtDNA metabolism are highly expressed in the gut,
presently unknown if the circuitry that coordinates mitochondrial and in some cases in additional cellular domains of the embryo.
biogenesis at the transcriptional level in mammals is conserved in OXPHOS genes are also highly expressed in the gut, but are
Drosophila. also expressed at high levels in other tissues including the me-
Our laboratories and others have carried out a systematic soderm (M.A. Fernández-Moreno and R. Garesse, unpublished
characterization of the promoter regions of Drosophila genes en- data). These results indicate that mitochondrial proliferation and
coding factors involved in mtDNA replication, maintenance and differentiation are not strictly coupled during development.
transcription [reviewed in [12]). To date, these include the genes Interestingly, the molecular characterization of bonsai mutants
encoding the two subunits of DNA polymerase γ (α and β) [13], has also revealed that the gut is extremely active in mitochondrial
mtSSB [14], mtDNA helicase (L.S. Kaguni, unpublished data), biogenesis during Drosophila development [20]. The Bonsai pro-
mtRNA polymerase (R. Garesse, unpublished data), TFAM tein is highly expressed in the gut, localizes to mitochondria and
[15], mtTFB1 [16], mtTFB2 [17] and DmTTF [18] (Table 1). We shows strong homology to prokaryotic ribosomal protein S15,
have found that the expression of most of these genes is regu- suggesting a role in mitochondrial translation. However, the
lated by DREF, a transcription factor that also regulates the precise role of Bonsai in mitochondrial function remains to be
expression of genes involved in nuclear DNA replication and determined.
cell cycle control, including the catalytic subunit of DNA poly-
merase α, proliferating cell nuclear antigen, cyclin A and E2F 3. Drosophila as an animal model to study human
[12]. In addition, a recently identified conserved sequence ele- mitochondrial diseases
ment (RTTAYRTAAY), designated as the Nuclear Respiratory
Gene element (NRG), is located downstream of the transcrip- Drosophila provides a useful model for studying several
tional initiation site of a high proportion of nuclear genes en- complex biological processes because it is ideally tractable at
coding mitochondrial proteins [19]. Although there are no the genetic, biochemical, molecular and physiological levels. It
functional studies and the transcription factors that recognize the has served as a model in studies of development and differenti-
NRG site have yet to be identified, this element represents a good ation [3], aging [21], cell cycle [22], transcriptional and transla-
candidate for involvement in the coordinate response of genes tional control [23], signaling pathways [24], response to hyp-
involved in energy production in Drosophila, perhaps in com- oxia [25], sensorial perception [26], and circadian rhythms [27].
bination with DREF. In support of this hypothesis, several of the In addition, the presence in Drosophila of orthologs of genes
genes encoding factors of the Drosophila mtDNA replication involved in human diseases has spawned interest in using it to
152
Anexos
1192 Á. Sánchez-Martínez et al. / Biochimica et Biophysica Acta 1757 (2006) 1190–1198
understand the molecular basis of disease, and to discover new viate it. At the same time, recognizing that overexpression of the
therapies. Representative research using Drosophila has been wild-type catalytic subunit may generate secondary effects not
focused on neurodegenerative diseases [7,28], cancer [29], car- related directly to the mtDNA depletion, we are complementing
diac pathologies [30], age-associated dysfunction [31], sen- these studies with the introduction of specific mtDNA mu-
sitivity to pollutants [32], and more recently on mitochondrial tations in the pol γ-α gene by homologous recombination (see
diseases (see below). below).
Mitochondrial diseases, mainly due to the alteration of
OXPHOS functions, are associated with a wide range of clinical 3.2. Mitochondrial deafness
symptoms, especially those in neurodegenerative disorders, such
as blindness, deafness, dementia, movement disorders, ataxia, The Drosophila mutant technical knock-out, tko, carries a
corea, and encephalopathies [33,34]. Mitochondrial defects are point mutation affecting a phylogenetically conserved residue in
also associated with muscular weakness, cardiac failure, diabetes, the nuclear gene encoding the mitochondrial ribosomal protein
renal dysfunction and hepatic disease. The clinical and genetic S12 (MRPS12). This behavioural mutant exhibits developmen-
diversity of mitochondrial pathologies makes it difficult to esti- tal retardation at the larval stage, bang sensitivity, defective
mate their incidence in the population, which in composite, is response to sound, quantitatively reduced mitochondrial trans-
considered relatively high. The alteration of OXPHOS function lational capacity and impaired male courtship [38]. The primary
caused by known mutations in mtDNA affects at least 1 in 8500 biochemical defect is a decrease in OXPHOS and ATP synthase
people. One of the main objectives in understanding the phy- activities in mitochondria. tko mutants possess various features
siopathology of mitochondrial diseases is to create amenable of mitochondrial disorders in humans, and these phenotypes are
animal models that reproduce the variety of symptoms associated reverted by transgenic expression of a wild-type copy of the tko
with this group of complex human disorders. Although a great gene. The transgenic reversion analysis revealed critical steps
effort is currently focused on developing mammalian models of and cell types that were responsible for the disease-like pheno-
human mitochondrial pathologies, Drosophila emerges as an type [39]. Furthermore, inbreeding of mutant lines resulted in
attractive, tractable alternative. a systematic improvement of the phenotypic outcome. These
features have made the tko mutant a suitable model for many
3.1. mtDNA depletion forms of human mitochondrial disease that are characterized by
a reduction in the mitochondrial respiratory capacity and a
mtDNA depletion syndrome (MDS) is caused by a defect in generalized OXPHOS deficiency and in particular, for senso-
intergenomic communication that results in decreased mtDNA rineural deafness.
content (i.e., a low mtDNA/ nDNA ratio). Children usually pre-
sent with hypotonia, lactic acidosis and elevated serum creatine 3.3. Mitochondrial encephalopathy
kinase. Some also have severe hepatopathy or renal involvement
mimicking de Toni–Fanconi syndrome. The symptoms can also Mutations in mtDNA and in nuclear-encoded mitochondrial
involve multiple systems affecting the muscle. Mutations in the proteins cause a group of devastating encephalomyopathies with
genes encoding the mitochondrial deoxyguanosine and deox- complex clinical features [40]. Leigh syndrome (LS) is the most
ythymidine kinases are associated with the hepatocerebral and common infantile mitochondrial encephalopathy and is charac-
the myopathic forms of MDS [35]. In addition, preliminary terized by symmetric necrotic lesions in the brainstem,
studies have also shown a deficient activity of DNA polymerase diencephalon and basal ganglia. Symptoms usually include nys-
γ in tissues of patients suffering MDS [36]. tagmus, ataxia, dystonia, hypotonia and optic atrophy. Although
Our laboratories have used the UAS-GAL4 system to alter the cause of the disease is genetically heterogeneous, mutations in
the level of mtDNA in the fly. Overexpression of a wild-type the surf-1 gene are the single most prevalent cause of LS [41]. The
version of the catalytic subunit of mitochondrial DNA poly- surf-1 gene is highly conserved from prokaryotes to humans, and
merase (pol γ-α) interferes with the process of mtDNA rep- is expressed ubiquitously in human tissues, albeit at higher levels
lication and produces a significant decrease in the amount of in aerobic tissues. It encodes a 31 kDa protein located in the inner
mtDNA [37]. We have analyzed the consequences of the mitochondrial membrane. Previous studies in human cells [42],
mtDNA depletion in the whole animal, and specifically in two mice [43] and yeast [44] showed that Surf-1 is involved in COX
tissues affected in MDS patients, muscle and nervous system. complex assembly. Nonetheless, the molecular mechanism
mtDNA depletion resulting from constitutive overexpression is leading to the pathogenic course of LS is not fully understood.
lethal at the pupal stage, a phenotype that is also observed upon Zordan and co-workers performed a functional knock-down
specific overexpression in the muscle. Interestingly, the in- of Surf-1 in Drosophila using an RNAi strategy [45]. Post-
duction of mtDNA depletion in the nervous system is not lethal. transcriptional gene silencing was induced by GAL4-mediated
The main phenotype detected in adults is an increase in the expression of an UAS inverted-repeat transgene. Ubiquitous
population mortality rate, and a moderate but significant in- silencing results in severely impaired development. Larvae are
crease in apoptosis in the larval brain, which likely contributes smaller and exhibit profound alterations in spontaneous and
to the phenotype. This model presents the opportunity to char- light-induced locomotion. Most individuals die before enter-
acterize the molecular and metabolic responses of various ing pupariation. Notably, behavioural and electrophysiological
tissues to mtDNA depletion, and to develop methods that alle- abnormalities were found not to be due to structural defects, but
153
Anexos
were rather caused by a deficient energy supply. When surf-1 repeat transgenes used in RNAi reduce rather than totally eli-
was silenced exclusively in the central nervous system (CNS), minate the corresponding protein. Thus, the Drosophila model
individuals developed to adulthood and exhibited altered mi- mimics more accurately the genetic origin of FA, which arises
tochondria in larval muscles, and decreased COX activity in from a decrease rather than a complete loss of frataxin. Fur-
cephalic sections. Because both development and metamorpho- thermore, the fly model also circumvents the early embryonic
sis are high energy-requiring processes, a defect in respiration and lethality reported in frataxin-null mice. Systemic suppression of
ATP synthesis may be responsible for the developmental delay the dfh gene led to large, long-lived larvae that showed dimin-
and the late larval lethality observed in Surf-1-deficient larvae. ished iron cofactor-dependent enzyme activity, and increased
The results obtained in the Drosophila model suggest important susceptibility to iron toxicity. Because prolonged larval devel-
functions for Surf-1 in COX activity, and establish a critical role opment and failure to initiate and complete metamorphosis are
for mitochondrial energy pathways in organogenesis, develop- common features of Drosophila mutants defective in mtDNA
ment and CNS function that are likely to be similar in humans. maintenance, observations from this model prompted the
hypothesis that DFH depletion may lead to increased mtDNA
3.4. Friedreich ataxia damage. Whereas silencing of the dfh gene in motor neurons
had no deleterious effect, silencing in the PNS resulted in nor-
Friedreich ataxia (FA) is an inherited recessive neurodegen- mal larval development but a reduced adult life span. Over-
erative disorder associated with a genetic insufficiency of frataxin expression of primary ROS-metabolizing enzymes, such as
in humans [46]. Frataxin is encoded by the FRDA gene and has a SOD1, SOD2 and catalase in combination with silencing of the
predicted size of 210 amino acids [47]. It is a mitochondrial iron dfh gene did not improve the phenotype, suggesting that oxi-
chaperone that plays a critical role in iron storage, cellular iron dative stress is not a major contributor.
homeostasis and biogenesis of Fe–S clusters. As an iron binding The Drosophila model of FA is further validated by the fact
protein, frataxin prevents Fe+2 from generating toxic hydroxyl that the vulnerability of the PNS to frataxin depletion is con-
radicals inside the mitochondrial matrix. served across the animal kingdom. Because a DFH deficiency
Most FA patients are homozygous for a GAA triplet repeat produces a robust phenotype in Drosophila, the fly model may
expansion in the first intron of the FRDA gene. While normal aid in the identification of factors that alleviate FA symptoms,
chromosomes contain up to 40 repeats, FA chromosomes har- and the development of novel treatment strategies.
bor between 90 and 1000 triplets. Due to the meiotic and mitotic
instability of the expanded alleles, FA patients have insufficient 3.5. Mitochondrial diseases caused by mtDNA mutations
frataxin levels, resulting in iron accumulation in mitochondria
and dysfunctional iron-containing proteins, specifically aconi- Point mutations in mtDNA are associated with a wide range
tase and the OXPHOS complexes. The peripheral nervous sys- of severe mitochondrial diseases, including a number of
tem (PNS) and heart are among the most severely affected encephalomyopathies with complex clinical features [33].
tissues. Hence, FA is characterized by progressive neurological Although some of the mutations have been characterized in
disability and heart abnormalities. The age of onset may vary cybrid cell lines, and demonstrated to produce a clear
from infancy to adulthood, but FA usually appears during child- mitochondrial impairment, it has not been possible to study
hood. Variations in symptoms and age of onset suggest that other the consequences of the mutations in animal model systems
factors in addition to the degree of triplet expansion influence because of the currently inability to transform mitochondria with
disease progression, and there is currently no effective therapy exogenous DNA. Very recently, the first pathogenic mtDNA
for this devastating disease. mutation in an intact animal was reported in Drosophila, a G–A
Frataxin is highly conserved throughout evolution. Orthologs transition that affects an evolutionarily conserved amino acid
have been identified in mammals, invertebrates, yeast and plants, residue in the ATP6 gene [53]. Point mutations in the human
and several models have already been used to gain insight into ATP6 gene cause neuropathy, ataxia, and retinitis pigmentosa
the functions of frataxin and its related disease. Previous studies (NARP), maternally inherited Leigh's syndrome (MILS) and
in yeast revealed that deletion of YFH1, the frataxin homolog, familial bilateral striatal necrosis (FBSN) [33]. Notably, the G–A
produces iron accumulation in mitochondria and a progressive transition in the ATP6 gene was found in virtually homoplasmic
loss of respiratory competence and mtDNA. As a result, ΔYFH1 levels in a Drosophila sesB stock that carries a mutation in the
strains exhibit permanent mitochondrial damage and dysfunction ANT1 gene, which is associated with autosomal dominant
[48]. Cell differentiation experiments performed in mouse cell progressive external ophtalmoplegia (adPEO) in humans [54].
lines demonstrated that frataxin is essential for development of Patients with PEO are predisposed to secondary mtDNA
neural lineages [49]. Although mouse models for FA showed mutations, and it is thus possible that a similar mutator effect
early embryonic lethality [50] conditional inactivation of the has occurred in Drosophila. The ATP6 mutation inhibits
mouse FA gene led to cardiomyopathy, sensory nerve defects and significantly the activity of ATP synthase, but surprisingly does
Fe–S enzyme deficiency [51]. not affect the respiration rate, and therefore the mitochondria are
A RNAi strategy was used in Drosophila to suppress pro- uncoupled. Most interestingly, Drosophila ATP6 mutants have a
duction of the frataxin homolog (DFH) in a global or tissue- short life span, locomotion impairment and myodegeneration that
specific manner [52]. The main advantage in the Drosophila are strictly progressive, a situation similar to human mitochon-
system as compared to other eukaryotic models is that inverted drial encephalomyopathy of mitochondrial origin. Although the
154
Anexos
mutation per se does not induce neurodegeneration, neurological workers have recently circumvented this drawback with the
dysfunction was apparent. development of efficient homologous recombination-based
methods [55]. Any endogenous locus can be replaced or
4. New perspectives for gene manipulation in Drosophila deleted by the expression of a site-specific recombinase and
a site-specific nuclease, taking advantage of the fact that
Until recently, Drosophila models used in the study of double-strand breaks (DSB) in Drosophila DNA are
mitochondrial dysfunction were based on the analysis of recombinogenic. There are currently two techniques that
mutants generated by random mutagenic screens, or by gene use homologous recombination for gene replacement, “Ends-
silencing by RNAi that is based on P-element transgenesis. in” and “Ends-out”. These systems have similar efficiencies
One of the main advantages of the fly system is the UAS– but present different advantages and disadvantages.
GAL4 binary system, which can be exploited to knockdown
a target gene under the control of alternative promoters, thus 4.1. Ends-in
restricting silencing to a desired spatio-temporal pattern.
More recently, new technologies for gene manipulation in The Ends-in approach first introduces a version of the gene
Drosophila have been expanded to include new genome containing the mutation of interest in tandem with the endo-
integration methods based on bacteriophage ϕC31 or genous allele, and then removes one of the copies leaving only
piggybacks that show much less insertional specificity than the mutated or wild-type allele in the chromosome. The main
P-elements [6]. Despite these advances, the study of specific advantage of this approach is that intact alleles can be recovered
mutations associated with human diseases has been ham- that harbor the desired mutation.
pered by the lack of gene targeting techniques, one of the The Ends-in targeting technique is executed in three steps
main limitations in working with Drosophila. Golic and co- (Fig. 1A and B). First, a P-element construct is generated that
Fig. 1. Gene targeting in Drosophila. A, Ends-in technique and the elements of the donor construct. After transgenesis the combined action of FLP and endonuclease I-
SceI generates the recombinogenic template, which produces the duplication at the target gene locus by homologous recombination. B, reduction of target gene repeats.
The double-strand break caused by endonuclease I-CreI induces the second recombination. Ends-in targeting introduces a point mutation (green dot) in one of the
alleles of the target gene. C, Ends-out technique. FLP and I-SceI generate a linear DNA molecule that undergoes homologous recombination with the target gene.
155
Anexos
incorporates several specific features: a DNA region homolo- process of Ends-out targeting is similar to Ends-in targeting;
gous to the target gene containing the specific mutation(s), two through the action of FLP and I-SceI, a linear DNA extrachro-
FLP Recombination Target (FRT) sequences, an I-SceI en- mosomal donor fragment is generated, and it is targeted to the
donuclease recognition site, an I-CreI endonuclease recognition endogenous allele by homologous recombination. Two of the
site, and a marker gene, usually white+. P-element transfor- advantages of the Ends-out method are that the target gene can be
mation is performed by standard methods [4]. The range of total replaced without the involvement of a tandem duplication, thus
local homology that has led to successful targeting is between generating a knock-in or knock-out in one step. In addition, the
2 kb and 9 kb, with N4 kb utilized in most cases [56]. Second, a donor construct is easier to make than in Ends-in. The disad-
series of crosses between the transgenic flies carrying the donor vantage of this technique is that the end product leaves exogenous
element with fly stocks harboring FLP and I-SceI transgenes sequence at the altered locus, usually the marker gene [58]. Ends-
allow the expression of the enzymes by heat shock induction, out gene targeting has been used successfully to target yellow, the
thus generating the recombinogenic donor, and inducing target- myocardin-related transcription factor DMRTF, and the odorant-
ed homologous recombination. Homologous recombination ge- receptor gene, Or83b (reviewed in [6]).
nerates a typical structure in which the endogenous and the mutant
copies of the gene flank the marker gene at the target locus. The 5. Current models of mitochondrial diseases in flies
wild-type–white+-mutant gene structure is not expected to mani-
fest a phenotype until reduction. Finally, a second homologous In our laboratories, we are developing a Drosophila model of
recombination event resulting from expression of the endonucle- mitochondrial pathology associated with pol γ mutations using
ase I-CreI removes one copy of the gene, the wild-type or the the knock-in technology. Even though we have been successful in
mutant, and the white marker. This results in the replacement of the circumventing by low-level expression the deleterious phenotypes
endogenous copy with a version containing the specific mutation engendered with high-level overexpression of wild-type pol γ-α
without any other alterations in the genome. To date, this novel we recognize that potential problems may result from develop-
method has been used to generate mutant alleles of several endo- mental and spatial mis-expression of a transgene. Thus, we have
genous Drosophila genes [57]. altered our strategy for mutagenesis in Drosophila to use targeted
gene replacement by homologous recombination (Fig. 2). Our
4.2. Ends-out objective has been to introduce in Drosophila versions of the pol
γ-α gene that are associated with PEO in humans, and to examine
Ends-out targeting is the most frequently used method in mice the effects of several mutations in the Drosophila pol γ-α and pol
and yeast. This technique starts with a different donor construct γ-β genes for which disease phenotypes have not yet been
structure, and also differs from Ends-in in the position of the reported in humans. Of the 30 different mutations that have been
specific-site endonuclease cleavage sites (Fig. 1C). The double- identified in the human pol γ-α gene [59], approximately half are
stranded breakage occurs at the outer ends of donor DNA. The in strictly conserved positions in the orthologous gene in
Fig. 2. Pol γ knock-in in Drosophila. Approximately 12 kb of DNA from the D. melanogaster pol γ cluster genomic region [60] was amplified by PCR and cloned into
the vector pBluescript. For simplicity, only the pol γ-α and pol γ-β genes are shown schematically (arrows). The I-SceI recognition site was introduced between the
genes, and this construct was used to generate specific mutations (boxed in yellow) in the pol γ-α or pol γ-β coding regions. The conserved exonuclease (I, II and III),
and polymerase (A, B and C) active site motifs are indicated by boxes. Each of the modified genomic DNAs was cloned into the NotI site of the pTV2 vector, and the
orientation of the inserted DNA was confirmed by KpnI digestion. The main features of the pTV2 vector are indicated as follows: FRTs (arrows), white + marker gene
(red box), I-CreI recognition site (blue box), NotI recognition sites (thin arrows).
156
Anexos
Drosophila. We have selected two, A467T and Y955C (A434T Because the recent development of efficient gene targeting
and Y873C in Drosophila), which map within the conserved γ1 methods has paved the way for the introduction of specific
element in the spacer region and the pol domain, respectively, and mutations responsible for human mitochondrial diseases, Dro-
for which we and others have already evaluated the biochemical sophila offers substantial promise for understanding the patho-
defects upon recombinant expression in the baculovirus system genic mechanisms of this devastating group of diseases.
[60–63]. We have also selected the Drosophila γ3 spacer-region
mutation F578A, for which we have defined the biochemical
defects [64]. In addition, we have introduced a double mutation Acknowledgements
(D185A and D263A) within two active site aspartate residues in
the exonuclease domain, which we have shown to cause deve- We thank Erin Wakeling for critical reading and comments on
lopmental defects, delays and arrest, and to limit life span when it the manuscript. This work was supported by European Union
is expressed at a low level using the UAS-GAL4 system in trans- Project QLG1-CT-2001-00966, Ministerio de Ciencia y Tecno-
genic animals. Finally, we took advantage of our prior discovery logia, Spain (Grants BMC01-1525 and BFU2004-04591) and
that the two subunits of Drosophila pol γ map within a compact Instituto de Salud Carlos III, Redes de centros RCMN (C03/08)
gene cluster [13] to generate a fragment containing ∼12 kb donor and Temáticas (G03/011 (to R.G.) and National Institutes of
homology that carries both the pol γ-α and -β genes, with the I- Health Grant GM45295 (to L.S.K.).
SceI site introduced between them. This allowed us to introduce
specific amino acid substitutions in both pol γ-α and -β in a single
References
recombinant donor construct. After homologous recombination,
the expected product is a tandem partial duplication of the target [1] G.M. Rubin, E.B. Lewis, A brief history of Drosophila's contributions to
genome sequence, with one copy containing the desired pol γ-α genome research, Science 287 (2000) 2216–2218.
mutation and the other copy containing the desired pol γ-β muta- [2] M.A. Fernández-Moreno, C.L. Farr, L.S. Kaguni, R. Garesse. Drosophila
tion. As a result, we have also introduced three mutations in the C- melanogaster as a Model System to Study Mitochondrial Function, in
Methods in Molecular Biology, Humana Press Inc, Totowa, NJ. (in press).
terminal region of the Drosophila accessory subunit gene, which
[3] M. Bate, A. Martínez-Arias, The Development of Drosophila melanoga-
we have shown to be deleterious in our biochemical analysis of ster, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1993.
human pol γ-β. [4] G.M. Rubin, A.C. Spradling, Genetic transformation of Drosophila with
Our immediate goals will be to evaluate these models using transposable element vectors, Science 218 (1982) 348–353.
established protocols in Drosophila to analyze mtDNA content [5] A.H. Brand, N. Perrimon, Targeted gene expression as a means of altering
cell fates and generating dominant phenotypes, Development 118 (1993)
and integrity, respiratory chain complex activity, mitochon-
401–415.
drial distribution and function, apoptotic signaling and [6] K.J. Venken, H.J. Bellen, Emerging technologies for gene manipulation in
importantly, larval and adult behaviour. We expect to establish Drosophila melanogaster, Nat. Rev. Genet. 6 (2005) 167–178. (Erratum
an experimental system of mtDNA replication failure that is in: Nat. Rev. Genet. 6 (2005)340).
analogous to that associated with human pathologies and in [7] J. Bilen, N.M. Bonini, Drosophila as a model for human neurodegener-
ative disease, Annu. Rev. Genet. 39 (2005) 153–171.
doing so, we will establish a direct correlation between the
[8] R. Garesse, C.G. Vallejo, Animal mitochondrial biogenesis and function: a
defect(s) that the mutants exhibit in our biochemical assays regulatory cross-talk between two genomes, Gene 263 (2001) 1–16.
and their phenotypic effects in vivo. We anticipate that this will [9] R.C. Scarpulla, Nuclear activators and coactivators in mammalian
set the stage for us to use the power of Drosophila molecular mitochondrial biogenesis, Biochim. Biophys. Acta 1576 (2002) 1–14.
genetics to search for factors that modulate the phenotype, [10] R.C. Scarpulla, Nuclear control of respiratory gene expression in mammalian
cells, J. Cell. Biochem. 97 (2006) 673–683.
either augmenting or ameliorating it.
[11] S.M. DeSimone, K. White, The Drosophila erect wing gene, which is
important for both neuronal and muscle development, encodes a protein
6. Concluding remarks which is similar to the sea urchin P3A2 DNA binding protein, Mol. Cell.
Biol. 13 (1993) 3641–3649.
Although tissues requiring high oxidative metabolism are [12] R. Garesse, L.S. Kaguni, A Drosophila model of mitochondrial DNA
replication: proteins, genes and regulation, IUBMB Life 57 (2005) 555–561.
affected most severely in mitochondrial disorders, specific
[13] E. Lefai, M.A. Fernandez-Moreno, L.S. Kaguni, R. Garesse, The highly
tissue involvement varies considerably. In order to develop compact structure of the mitochondrial DNA polymerase genomic region
therapies for these diseases, it is necessary to determine both of Drosophila melanogaster: functional and evolutionary implications,
the cellular processes and the tissues that are altered by in- Insect Mol. Biol. 9 (2000) 315–322.
sufficient energy supply. Drosophila models can help us to [14] I. Ruiz de Mena, E. Lefai, R. Garesse, L.S. Kaguni, Regulation of
mitochondrial single-stranded DNA-binding protein gene expression links
understand common aspects of these pathologies because they
nuclear and mitochondrial DNA replication in Drosophila, J. Biol. Chem.
enable the identification of critical times, cell types and tissues 275 (2000) 13628–13636.
that account for the disease-like phenotypes. Global transcrip- [15] K. Takata, H. Yoshida, F. Hirose, M. Yamaguchi, M. Kai, M. Oshige, I.
tional analysis of these models has already revealed many sets Sakimoto, O. Koiwai, K. Sahaguchi, Drosophila mitochondrial transcription
of genes, including those related to stress responses and factor A: characterization of its cDNA and expression pattern during
development, Biochem. Biophys. Res. Commun. 287 (2001) 474–483.
metabolism, which are systematically up- or down-regulated
[16] Y. Matsushima, C. Adán, R. Garesse, L.S. Kaguni, Drosophila tran-
according to the degree of the mitochondrial dysfunction. The scription factor B1 modulates mitochondrial translation but not
ultimate aim of such transcriptomic approaches is to identify transcription or DNA copy number in Schneider cells, J. Biol. Chem.
potential pharmacological targets in mitochondrial disease. 280 (2005) 16815–16820.
157
Anexos
[17] Y. Matsushima, R. Garesse, L.S. Kaguni, Drosophila transcription factor [41] M. Bohm, E. Pronicka, E. Karcmarewicz, M. Pronicki, D. Piekutowska-
B2 regulates mitochondrial DNA copy number and transcription in Abramczuk, J. Sykut-Cegielska, H. Mierzewska, H. Hansikova, K. Vesela,
Schneider cells, J. Biol. Chem. 279 (2004) 26900–26905. M. Tesarova, H. Houstkova, J. Houstek, J. Zeman, Restrospective,
[18] M. Roberti, P. Fernández-Silva, P.L. Polosa, E. Fernández-Viana, F. multicentric study of 180 children with cytochrome c oxidase deficiency,
Bruni, S. Deceglie, J. Montoya, M.N. Gadaleta, P. Cantatore, In vivo Pediatr. Res. 59 (2006) 21–26.
transcription termination activity of the Drosophila mitochondrial DNA- [42] V. Tiranti, C. Galimberti, L. Nijtmans, S. Bovolenta, M.P. Perini, M. Zeviani,
binding protein DmTTF, Biochem. Biophys. Res. Commun. 331 (2005) Characterization of SURF-1 expression and Surf-1p function in normal and
357–362. disease conditions, Hum. Mol. Genet. 8 (1999) 2533–2540.
[19] M. Sardiello, G. Tripoli, A. Romito, C. Minervini, L. Viggiano, C. Caggese, [43] A. Agostino, F. Invernizzi, C. Tiveron, G. Fagiolari, A. Prelle, E. Lamantea,
G. Pesole, Energy biogenesis: one key for coordinating two genomes, A. Giavazzi, G. Battaglia, L. Tatangelo, V. Tiranti, M. Zeviani, Constitutive
Trends Genet. 21 (2005) 12–16. knockout of Surf1 is associated with high embryonic lethality, mitochondrial
[20] M. Galloni, Bonsai, a ribosomal protein S15 homolog, involved in gut disease and cytochrome c oxidase deficiency in mice, Hum. Mol. Genet. 12
mitochondrial activity and systemic growth, Dev. Biol. 264 (2003) (2003) 399–413.
482–494. [44] L.G. Nijtmans, M. Artal-Sanz, M. Bucko, M.H. Farhoud, M. Feenstra, G.A.
[21] S.L. Helfand, B. Rogina, Genetics of aging in the fruit fly, Drosophila Hakkaart, M. Zeviani, L.A. Grivell, Shy1p occurs in a high molecular weight
melanogaster, Annu. Rev. Genet. 37 (2003) 329–348. complex and is required for efficient assembly of cytochrome c oxidase in
[22] Y.H. Song, Drosophila melanogaster: a model for the study of DNA yeast, FEBS Lett. 498 (2001) 46–51.
damage checkpoint response, Mol. Cell 19 (2005). 67–179. [45] M.A. Zordan, P. Cisotto, C. Benna, A. Agostino, G. Rizzo, A. Piccin, M.
[23] J.E. Wilhelm, C.A. Smibert, Mechanisms of translational regulation in Pegoraro, F. Sandrelli, G. Perini, G. Tognon, R. De Caro, S. Peron, T.T.
Drosophila, Biol. Cell 97 (2005) 235–252. Kronnie, A. Megighian, C. Reggiani, M. Zeviani, R. Costa, Post
[24] S.A. Davies, Signalling via cGMP: Lessons from Drosophila, Cell. Signal. transcriptional silencing and functional characterization of the Drosophila
18 (2006) 409–421. melanogaster homolog of HumanSurf1, Genetics 172 (2006) 229–241.
[25] R. Farahani, C.G. Haddad, Understanding the molecular responses to [46] V. Campuzano, L. Montermini, M.D. Molto, L. Pianese, M. Cossee, F.
hypoxia using Drosophila as a genetic model, Respir. Physiol. Neurobiol. Cavalcanti, E. Monros, F. Rodius, F. Duclos, A. Monticelli, F. Zara, J.
135 (2003) 221–229. Canizares, H. Koutnikova, S.I. Bidichandani, C. Gellera, A. Brice, P.
[26] R.L. Davis, Olfactory memory formation in Drosophila: from molecular to Trouillas, G. De Michele, A. Filla, R. De Frutos, F. Palau, P.I. Patel, S.
systems neuroscience, Annu. Rev. Neurosci. 28 (2005) 275–302. Di Donato, J.L. Mandel, S. Cocozza, M. Koenig, M. Pandolfo, Friedreich's
[27] P.E. Hardin, The circadian timekeeping system of Drosophila, Curr. Biol. ataxia: autosomal recessive disease caused by an intronic GAA triplet repeat
15 (2005) 714–722. expansion, Science 271 (1996) 1423–1427.
[28] L. Chen, M.B. Feany, Alpha-synuclein phosphorylation controls neuro- [47] M. Pandolfo, Frataxin deficiency and mitochondrial dysfunction, Mito-
toxicity and inclusion formation in a Drosophila model of Parkinson chondrion 2 (2002) 87–93.
disease, Nat. Neurosci. 8 (2005) 657–663. [48] M. Babcock, D. de Silva, R. Oaks, S. Davis-Kaplan, S. Jiralerspong,
[29] E.C. Woodhouse, L.A. Liotta, Drosophila invasive tumors: a model for L. Montermini, M. Pandolfo, J. Kaplan, Regulation of mitochondrial iron
understanding metastasis, Cell Cycle 3 (2004) 38–40. accumulation by Yfh1p, a putative homolog of frataxin, Science 276 (1997)
[30] M.J. Wolf, H. Amrein, J.A. Izatt, M.A. Choma, M.C. Reedy, H.A. Rockman, 1709–1712.
Drosophila as a model for the identification of genes causing adult human [49] M. McBurney, W.E.M. Jones-Villeneuve, M.K. Edwards, P.J. Anderson,
heart disease, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (2006) 1394–1399. Control of muscle and neuronal differentiation in a cultured embryonal
[31] M. Saitoe, J. Horiuchi, T. Tamura, N. Ito, Drosophila as a novel animal carcinoma cell line, Nature 299 (1982) 165–167.
model for studying the genetics of age-related memory impairment, (16) [50] M. Cossee, H. Puccio, A. Gansmuller, H. Koutnikova, A. Dierich, M.
Rev, Neuroscience (2005) 137–149. LeMeur, K. Fischbeck, P. Dolle, M. Koenig, Inactivation of the Friedreich
[32] M. Wilson, J.H. Widdicombe, K. Gohil, K.C. Burtis, A.Z. Reznick, C.E. ataxia mouse gene leads to early embryonic lethality without iron accu-
Cross, J.P. Elserich, Are Drosophila a useful model for understanding the mulation, Hum. Mol. Genet. 9 (2000) 1219–1226.
toxicity of inhaled oxidative pollutants: a review, Inhal. Toxicol. 17 (2005) [51] H. Puccio, D. Simon, M. Cossee, P. Criqui-Filipe, F. Tiziano, J. Melki,
765–774. C. Hindelang, R. Matyas, P. Rustin, M. Koenig, Mouse models for Friedreich
[33] R. McFarland, R.W. Taylor, D.M. Turnbull, The neurology of mitochon- ataxia exhibit cardiomyopathy, sensory nerve defect and Fe–S enzyme
drial DNA disease, Lancet Neurol. 1 (2002) 343–351. deficiency followed by intramitochondrial iron deposits, Nat. Genet. 27
[34] J.A. Smeitink, M. Zeviani, D.M. Turnbull, H.T. Jacobs, Mitochondrial (2001) 181–186.
medicine: a metabolic perspective on the pathology of oxidative [52] P.R. Anderson, K. Kirby, A.J. Hilliker, J.P. Phillips, RNAi-mediated sup-
phosphorylation disorders, Cell Metab. 3 (2006) 9–13. pression of the mitochondrial iron chaperone, frataxin, in Drosophila,
[35] A. Spinazzola, M. Zeviani, Disorders of nuclear-mitochondrial inter- Hum. Mol. Genet. 14 (2005) 3397–3405.
genomic signalling, Gene 354 (2005) 16–18. [53] A.M. Celotto, A.C. Frank, S.W. McGrath, T. Fergestad, W.A. Van
[36] R.K. Naviaux, W.L. Nyhan, B.A. Barshop, J. Poulton, D. Markusic, N.C. Voorhies, K.F. Buttle, C.A. Mannella, M.J. Palladino, Mitochondrial
Karpinski, R.H. Haas, Mitochondrial DNA polymerase γ deficiency and encephalomyopathy in Drosophila, J. Neurosci. 26 (2006) 810–820.
mtDNA depletion in a child with Alpers' syndrome, Ann. Neurol. 45 [54] J. Kaukonen, J.K. Juselius, V. Tiranti, A. Kittala, M. Zeviani, G.P.
(1999) 54–58. Comi, S. Keranene, L. Peltonene, A. Suomalainen, Role of adenine
[37] E. Lefai, M. Calleja, I. Ruiz de Mena, A.T. Lagina III, L.S. Kaguni, R. nucleotide translocator 1 in mtDNA maintenance, Science 289 (2000)
Garesse, Overexpression of the catalytic subunit of DNA polymerase γ 782–785.
results in depletion of mitochondrial DNA in Drosophila melanogaster, [55] Y.S. Rong, K.G. Golic, Gene targeting by homologous recombination in
Mol. Gen. Genet. 264 (2000) 37–46. Drosophila, Science 288 (2000) 2013–2018.
[38] J.M. Toivonen, K.M. O'Dell, N. Petit, S.C. Irvine, G.K. Knight, M. [56] X. Bi, Y.S. Rong, Genome manipulation by homologous recombination in
Lehtonen, M. Longmuir, K. Luoto, S. Touraille, Z. Wang, S. Alziari, Z.H. Drosophila, Briefings in Functional Genomics and Proteomics, vol. 2, 2003,
Shah, H.T. Jacobs, Technical knockout, a Drosophila model of pp. 142–146.
mitochondrial deafness, Genetics 159 (2001) 241–254. [57] Y.S. Rong, S.W. Titen, H.B. Xie, M.M. Golic, M. Bastiani, P. Bandyo-
[39] H.T. Jacobs, J. Fernandez-Ayala, S. Manjiry, E. Kemppainene, J.M. padhyay, B.M. Olivera, M. Brodsky, G.M. Rubin, K.G. Golic, Targeted
Toivonen, K.M. O'Dell, Mitochondrial disease in flies, Biochim. Biophys. mutagenesis by homologous recombination in D. melanogaster, Genes Dev.
Acta 1659 (2004) 190–196. 16 (2002) 1568–1581.
[40] S. DiMauro, E.A. Schon, Mitochondrial respiratory chain diseases, [58] W.J. Gong, K.G. Golic, Ends-out, or replacement, gene targeting in
N. Engl. J. Med. 348 (2003) 2656–2658. Drosophila, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (2003) 2556–2561.
158
Anexos
[59] A. Di Fonzo, A. Bordoni, M. Crimi, G. Sara, R. Del Bo, N. Bresolin, G.P. [63] M.A. Graziewicz, M.J. Longley, R.J. Bienstock, M. Zeviani, W.C. Copeland,
Comi, POLG mutations in sporadic mitochondrial disorders with multiple Structure–function defects of human mitochondrial DNA polymerase in
mtDNA deletions, Hum. Mutat. 22 (2003) 498–499. autosomal dominant progressive external ophthalmoplegia, Nat. Struct. Mol.
[60] P.T. Luoma, N. Luo, W.N. Loscher, C.L. Farr, R. Horvath, J. Wanschitz, Biol. 11 (2004) 770–776.
S. Kiechl, L.S. Kaguni, A. Suomalainen, Functional defects due to spacer- [64] N. Luo, L.S. Kaguni, Mutations in the spacer region of Drosophila
region mutations of human mitochondrial DNA polymerase in a family with mitochondrial DNA polymerase affect DNA binding, processivity, and the
an ataxia–myopathy syndrome, Hum. Mol. Genet. 14 (2005) 1907–1920. balance between Pol and Exo function, J. Biol. Chem. 280 (2005) 2491–2497.
[61] S.S. Chan, M.J. Longley, W.C. Copeland, The common A467T mutation [65] E. Lefai, M.A. Fernández-Moreno, A. Alahari, L.S. Kaguni, R. Garesse,
in the human mitochondrial DNA polymerase (POLG) compromises The expression of the catalytic and accessory subunits of the mitochondrial
catalytic efficiency and interaction with the accessory subunit, J. Biol. DNA polymerase are differentially regulated in Drosophila melanogaster,
Chem. 280 (2005) 31341–31346. J. Biol. Chem. 275 (2000) 33123–33133.
[62] M.V. Ponamarev, M.J. Longley, D. Nguyen, T.A. Kunkel, W.C. Copeland, [66] K. Takata, Y.H. Inoue, F. Hirose, S. Murakami, K. Shimanouchi, I. Sakimoto,
Active site mutation in DNA polymerase gamma associated with progressive K. Sakaguchi, Spatio-temporal expression of Drosophila mitochon-
external ophthalmoplegia causes error-prone DNA synthesis, J. Biol. Chem. drial transcription factor A during development, Cell Biol. Int. 27 (2003)
277 (2002) 15225–15228. 361–374.
159
Anexos
160
Anexos
Supplemental Material can be found at:

http://www.jbc.org/content/suppl/2010/11/10/M110.188805.DC1.html
THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 286, NO. 1, pp. 555–566, January 7, 2011
© 2011 by The American Society for Biochemistry and Molecular Biology, Inc. Printed in the U.S.A.
Cox25 Teams Up with Mss51, Ssc1, and Cox14 to Regulate

Mitochondrial Cytochrome c Oxidase Subunit 1 Expression
and Assembly in Saccharomyces cerevisiae*□ S
Received for publication, September 26, 2010, and in revised form, November 8, 2010 Published, JBC Papers in Press, November 10, 2010, DOI 10.1074/jbc.M110.188805
Flavia Fontanesi‡, Paula Clemente§1, and Antoni Barrientos‡¶2
From the Departments of ‡Neurology and ¶Biochemistry and Molecular Biology, University of Miami Miller School of Medicine,
Miami, Florida 33136 and the §Departamento de Bioquímica, Instituto de Investigaciones Biomédicas Alberto Sols Consejo
Superior de Investigaciones Cientificas-Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Medicina, Universidad Autónoma de
Madrid, Madrid 28029, Spain
Downloaded from www.jbc.org at Instituto de Investigaciones Biomédicas, on October 25, 2011

In the yeast Saccharomyces cerevisiae, mitochondrial cyto- duction. Cytochrome c oxidase (COX)3 is a heme A-copper
chrome c oxidase (COX) biogenesis is translationally regu- terminal oxidase. It is the last enzyme of the respiratory chain
lated. Mss51, a specific COX1 mRNA translational activator and plays fundamental roles both in electron transfer from
and Cox1 chaperone, drives the regulatory mechanism. During reduced cytochrome c to molecular oxygen and in proton
translation and post-translationally, newly synthesized Cox1 pumping through the inner mitochondrial membrane to con-
physically interacts with a complex of proteins involving Ssc1, tribute to the generation of a proton gradient in the inter-
Mss51, and Cox14, which eventually hand over Cox1 to the membrane space that is subsequently used by the F1F0-ATP
assembly pathway. This step is probably catalyzed by assembly synthase to drive synthesis of ATP. COX biogenesis is compli-
chaperones such as Shy1 in a process coupled to the release of cated by its dual genetic origin, with subunits (11 in yeast and
Ssc1-Mss51 from the complex. Impaired COX assembly results 13 in mammals) encoded both in the organelle and in the nu-
in the trapping of Mss51 in the complex, thus limiting its avail- cleus. In most cases, the three subunits forming the catalytic
ability for COX1 mRNA translation. An exception is a null mu- core of the enzyme (subunits 1–3) are encoded in the mito-
tation in COX14 that does not affect Cox1 synthesis because chondrial DNA. In the yeast Saccharomyces cerevisiae, COX
the Mss51 trapping complexes become unstable, and Mss51 is assembly requires the assistance of at least 30 nuclear gene
readily available for translation. Here we present evidence products acting at all stages of the assembly process (1, 2).
showing that Cox25 is a new essential COX assembly factor COX assembly requires the accumulation of its constitutive
that plays some roles similar to Cox14. A null mutation in subunits in a defined stoichiometric ratio. Previous studies led
COX25 by itself or in combination with other COX mutations to the notion of two mechanisms responsible for the con-
does not affect Cox1 synthesis. Cox25 is an inner mitochon- certed accumulation of COX subunits in yeast mitochondria.
drial membrane intrinsic protein with a hydrophilic C termi- First, most unassembled COX subunit 1 and the other highly
nus protruding into the matrix. Cox25 is an essential compo- hydrophobic core subunits 2 and 3 are very efficiently post-
nent of the complexes containing newly synthesized Cox1, translationally degraded (3). Second, Cox1 is subject to as-
Ssc1, Mss51, and Cox14. In addition, Cox25 is also found to sembly-controlled translational auto-regulation (4 –9). This
interact with Shy1 and Cox5 in a complex that does not con- kind of translational regulation was initially found to operate
tain Mss51. These results suggest that once Ssc1-Mss51 are in the assembly of photosynthetic complexes in chloroplasts
released from the Cox1 stabilization complex, Cox25 contin- from the alga Chlamydomonas reinardthii (10, 11) and in
ues to interact with Cox14 and Cox1 to facilitate the formation higher plants (12) and termed control by epistasis of synthe-
of multisubunit COX assembly intermediates. sis. A distinctive characteristic of these organellar transla-
tional auto-regulatory systems is the involvement of ternary
factors, mRNA-specific translational activators, whose avail-
Eukaryotic cells rely on the mitochondrial respiratory chain ability would be regulated by the specific gene products. In
and oxidative phosphorylation system for aerobic ATP pro- the case of yeast COX, the ternary factor is Mss51, a specific
translational activator of COX1 mRNA (4 –9).
* This work was supported, in whole or in part, by National Institutes of Mss51 acts on the 5-UTR of COX1 mRNA to promote
Health Grant GM071775A (to A. B.). This work was also supported by a
research grant from the Muscular Dystrophy Association (to A. B.) and a translation initiation (4, 7) and additionally acts on a target in
development grant from the Muscular Dystrophy Association (to F. F.). the protein coding sequence of COX1 mRNA, perhaps to pro-
□S
The on-line version of this article (available at http://www.jbc.org) con- mote elongation (4). During Cox1 synthesis on the mitoribo-
tains supplemental Figs. S1–S4.
1
Recipient of a research contract from the Consejería de Educación de la somes, Mss51 and newly synthesized Cox1 form a transient
Comunidad de Madrid y Fondo Social Europeo and of a predoctoral fel- complex (4, 6) that is stabilized by Cox14 (6), the mitochon-
lowship for mobility from the Universidad Autónoma de Madrid (under drial hsp70 chaperone Ssc1, and its co-chaperone Mdj1 (8).
the mentorship of Dr. Rafael Garesse).
2
To whom correspondence should be addressed: Dept. of Neurology and
Biochemistry & Molecular Biology, Universtiy of Miami, Miller School of
3
Medicine, 1600 NW 10th Ave., RMSB # 2067, Miami, FL 33136. Tel.: 305- The abbreviations used are: COX, cytochrome c oxidase; Tricine,
243-86-83; Fax: 305-243-39-14; E-mail: abarrientos@med.miami.edu. N-[2-hydroxy-1,1-bis(hydroxymethyl)ethyl]glycine.
JANUARY 7, 2011 • VOLUME 286 • NUMBER 1 JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 555
161
Anexos
Regulation of Mitochondrial Cox1 Expression

TABLE 1
Genotypes and sources of yeast strains carrying null alleles of COX-related genes
The categories indicate the general function of the deleted genes in COX biogenesis.
Strain Genotype Source
Wild-type
a
BY4741 MATa his3D1 leu2D0 met15D0, ura3D0
b
W303-1A MATa ade2-1 his3-1,15 leu2-3,112 trp1-1 ura3-1
COX structural subunits
W303cox1 MATa ade2-1 his3-1,15 leu2-3,112 trp1-1 ura3-1, cox1 Ref. 7
W303cox5a MATa ade2-1 his3-1,15 leu2-3,112 trp1-1 ura3-1 Dcox5a::HIS3 Ref. 38
COX1 expression
W303Dpet309 MATa ade2-1 his3-1,15 leu2-3,112 trp1-1 ura3-1 Dpet309::HIS3 Ref. 38
W303Dmss51 MATa ade2-1 his3-1,15 leu2-3,112 trp1-1 ura3-1 Dmss51::HIS3 Ref. 5
COX2 expression
W303Dpet111 ade2-1 his3-1,15 leu2-3,112 trp1-1 ura3-1 Dpet111::HIS3 Ref. 39
Heme A biosynthesis
W303Dcox10 MATa ade2-1 his3-1,15 leu2-3,112 trp1-1 ura3-1 Dcox10::HIS3 Ref. 40

Maturation of CuA or CuB centers
W303Dcox17 MATa ade2-1 his3-1,15 leu2-3,112 trp1-1 ura3-1 Dcox17::TRP1 Ref. 43
W303Dsco1 MATa ade2-1 his3-1,15 leu2-3,112 trp1-1 ura3-1 Dsco1::URA3 Ref. 44
COX assembly/unknown
W303Dshy1 MATa ade2-1 his3-1,15 leu2-3,112 trp1-1 ura3-1 Dshy1::URA3 Ref. 5
W303Doxa1 MATa ade2-1 his3-1,15 leu2-3,112 trp1-1 ura3-1 Doxa1::HIS3 Ref. 45
W303Dcoa1 MATa ade2-1 his3-1,15 leu2-3,112 trp1-1 ura3-1 Dcoa1::KanMX4 Ref. 15
W303Dcox16 MATa ade2-1 his3-1,15 leu2-3,112 trp1-1 ura3-1 Dcox16::URA3 Ref. 46
W303pet100 MATa ade2-1 his3-1,15 leu2-3,112 trp1-1 ura3-1 Dpet100::HIS3 Ref. 6
W303Dpet191 MATa ade2-1 his3-1,15 leu2-3,112 trp1-1 ura3-1 Dpet191::HIS3 Ref. 6
W303cox14 MATa ade2-1 his3-1,15 leu2-3,112 trp1-1 ura3-1 Dcox14::TRP1 Ref. 6
a
BYDcox25 MATa his31 leu20 met150, ura30 Dcox25::KanMX
W303Dcox25 MATa ade2-1 his3-1,15 leu2-3,112 trp1-1 ura3-1Dcox25::KanMX This work
Other strains
W303Dcox25shy1 MATa ade2-1 his3-1,15 leu2-3,112 trp1-1 ura3-1 cox25::KanMX Dshy1::URA3 This work
W303cox11mss51 MATa ade2-1 his3-1,15 leu2-3,112 trp1-1 ura3-1 cox11::KanMX Dmss51::HIS3 This work
W303Dcox25cox14 MATa ade2-1 his3-1,15 leu2-3,112 trp1-1 ura3-1cox25::KanMX Dcox14::TRP1 This work
W303Dcox25cox11 MATa ade2-1 his3-1,15 leu2-3,112 trp1-1 ura3-1cox25::KanMX cox11::HIS3 This work
W303-1A/rho0 MATa ade2-1 his3-1,15 leu2-3,112 trp1-1 ura3-1/rho0 Ref. 7
a
Strains purchased from Open Biosystems.
b
Dr. R. Rothstein (Department of Human Genetics, Columbia University, New York, NY).
Following Cox1 synthesis, the Ssc1-Mss51-Cox1-Cox14 com- operates, we recently analyzed protein-interacting partners of
plex remains stable until Cox1 proceeds to downstream as- Mss51 in wild-type and a collection of COX assembly mu-
sembly steps. We have postulated that these interactions tants (8). These studies allowed us to identify Ssc1 as an im-
down-regulate Cox1 synthesis when COX assembly is important Mss51 partner, a partnership that could mediate the
paired by trapping Mss51 and limiting its availability for coordination of the translational and post-translational Mss51
COX1 mRNA translation (6, 8). The C-terminal residues of functions (8). Mass spectrometric analyses of Mss51-contain-
Cox1 have recently been shown to be essential for Mss51 se- ing complexes allowed us to identify additional proteins that
questration and to stabilize the Mss51-Cox14 interaction (9). could be potential candidates to participate in these pro-
We have shown that when Mss51 is released from the com- cesses. In the present study, we provide evidence that one of
plex, it is still in a very stable binary complex with Ssc1 (8). them, encoded in open reading frame YJL062W-A and here
According to this model, the release of Mss51-Ssc1 from the termed Cox25, is part of Mss51-containing Cox1 translational
post-translational complex and Mss51 availability for Cox1 and preassembly complexes and is essential for their stability.
synthesis (8) probably occur when Cox1 acquires its pros- Following Mss51 release from the Cox1 preassembly complex,
thetic groups or interacts with other COX subunits, a step Cox25 remains involved and becomes part of complexes con-
possibly catalyzed by Shy1, a protein involved in maturation taining Shy1 and the nuclear encoded subunit Cox5. We con-
and/or assembly of Cox1 (6, 13, 14). Coa1 could also partici- clude that Cox25 and Cox14 work together toward coordinat-
pate in Cox1 maturation. Coa1 has been proposed to stabilize ing the assembly line of Cox1 with the incorporation of
the Cox1-Ssc1-Mss51-Cox14 complex prior to its interaction additional subunits during COX biogenesis.
with Shy1 (13, 15); however, we and others did not find Coa1
as part of Mss51-containing complexes (8, 16). Independently, EXPERIMENTAL PROCEDURES
once Mss51 is released from the Cox1 preassembly complex, Yeast Strains and Media—The genotypes and sources of
Cox14 still interacts with increasingly matured COX assembly the S. cerevisiae strains carrying null alleles of COX-related
intermediates (13, 15). genes are listed in Table 1. A cox25 mutant in the BY4741
To gain insight into how Mss51 is recycled from its post- background created by replacement of the full COX25 gene
translational function to become available for COX1 mRNA with a KANMX cassette was obtained from Open Biosystems/
translation and to fully clarify how this regulatory mechanism Thermo Scientific (Huntsville, AL). The KANMX cassette and
556 JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOLUME 286 • NUMBER 1 • JANUARY 7, 2011
162
Anexos

flanking sequences of the COX25 gene were PCR-amplified for 30 min. The clarified extract obtained by centrifugation at
using primers: 5-GCGCCTTGTCCCTAGAGAG-3 and 5- 50,000 gav for 15 min was mixed with hemoglobin and lac-
GAAGTGTGCGTGGTAGATGAAC-3. The amplicon was tate dehydrogenase and applied to 5 ml of linear 7–20% su-
transformed into a W303-1A wild-type strain to create crose gradient containing 20 mM HEPES, 0.5 mM PMSF, 0.1%
W303cox25. The mss51 and cox14 null mutants trans- digitonin, 1.2 mM MgCl2, and 150 mM KCl. Following centri-
formed with an integrative plasmid containing fusion genes fugation for 12 h at 28,000 r.p.m. in a Beckman 55Ti rotor, the
expressing Mss51-GST and Cox14-GST, respectively, were gradients were collected in 14 equal fractions. Each fraction
previously reported (6). The cox25 null mutant was trans- was subsequently assayed for hemoglobin by absorption at
formed with an integrative plasmid containing fusion gene 409 nm, and for lactate dehydrogenase activity by measuring
expressing functional Cox25-GST (supplemental Fig. S1). NADH-dependent conversion of pyruvate to lactate. The dis-
Wild-type and mutant strains were transformed with an epi- tribution of Cox25, Cox14, and Mss51 was assayed by West-
somal plasmid (YEplac181) overexpressing COX25. Double ern blot analysis. The mass of Cox25 was determined from
mutants involving cox25 were constructed by crosses of the positions of the respective peaks relative to those of the
the single mutants. The compositions of the growth media markers (22). All of the gradients were performed at least in
have been described elsewhere (17). The following media

triplicate using independent mitochondrial preparations. The
were used routinely to grow yeast: YPD (2% glucose, 1% yeast gradients reported are representative of each strain because
extract, 2% peptone), YPGal (2% galactose, 1% yeast extract, the patterns observed were reproducible.
2% peptone), and YPEG (2% ethanol, 2% glycerol, 1% yeast Construction of COX25-GST Chimera—The construction
extract, 2% peptone). of a plasmid containing chimeric COX25-GST was performed
Characterization of Yeast Mitochondrial Respiratory Chain— in two steps. First, the GST gene was amplified by PCR and
Endogenous cell respiration was assayed in whole cells in second, cloned in-frame to the COX25 gene into a plasmid
the presence of galactose using a Clark type polarographic already containing it. The GST gene plus a thrombin cleavage
oxygen electrode from Hansatech Instruments (Norfolk, UK) site at its N terminus was amplified from pGEX-3X (Amer-
at 24 °C as described (5). Mitochondria were prepared from
sham Biosciences) with primers 5-GGCTGCAGCTGGTTC-
strains grown in media containing 2% galactose plus 0.5% glu-
CGCGTGGATCCGGAGGAATGTCCCCTATACTAGGT
cose according to the method of Faye et al. (18) except that
and 5-CCGGGAGCTCGGATCCACGCGGAACCA-
zymolyase 20T (ICN Biochemicals Inc., Aurora, OH) instead
GATCC. The 600-bp product was digested with PstI/SacI
of glusulase was used for the conversion of cells to sphero-
and kept until used for further cloning. The COX25 gene was
plasts. Mitochondria were used to measure oxygen consump-
amplified with the primers 5-GGCCGAATTCGACTTGAC-
tion in the presence of either NADH or succinate as the sub-
TAACAGCCACATC-3 and 5-GGCCCTGCAGTGCCT-
strates as reported (14). The specific activities reported were
TCTTCTTGGCTTCGTACTCC-3 using total DNA isolated
corrected for KCN-insensitive respiration.
from wild-type W303 cells as the template and cloned as an
Mitochondria prepared from the different strains were used
EcoRI/PstI fragment into YIp352 (23). The previously ampli-
for spectrophotometric assays carried out at 24 °C to measure
KCN-sensitive COX activity, antimycin A-sensitive NADH fied GST gene was subsequently cloned into this plasmid as
cytochrome c reductase, and succinate cytochrome c reduc- PstI-SacI, in-frame with the 3-end of COX25 to yield
tase activities and oligomycin-sensitive ATP synthase activity, YIp352/COX25-Thr-GST.
measured as described (5, 19). Total mitochondrial cyto- GST Pulldown—A functional Mss51 fused with GST with
chrome spectra were obtained as reported (20). an intercalated thrombin site was expressed from an integra-
In Vivo and in Organello Mitochondrial Protein Synthesis— tive plasmid in a strain carrying a null mutant allele of mss51
Mitochondrial gene products were labeled with [35S]methi- (mss51/MSS51-GST) and in the double mutant
onine in whole cells at 30 °C in the presence of cycloheximide mss51cox11 (mss51cox11/MSS51-GST) as previously
(5). For in organello translation, mitochondria were prepared reported (6). Mitochondria were prepared from the mss51/
by the method of Herrmann et al. (21) and labeled with MSS51-GST and the mss51cox11/MSS51-GST strains by
[35S]methionine as described (14). Equivalent amounts of to- the method of Herrmann et al. (21). Mitochondrial proteins
tal cellular or mitochondrial proteins were separated by SDS- (24 mg) were solubilized in 20 mM HEPES, pH 7.4, 0.5 mM
PAGE on a 17.5% polyacrylamide gel, transferred to a nitro- PMSF, 1% digitonin, 1.2 mM MgCl2, and 150 mM KCl, and the
cellulose membrane, and exposed to x-ray film. extracts were loaded in six sucrose gradients. After centrifu-
Preparation of Antibodies to Cox25—A rabbit polyclonal gation, 14 equal fractions were collected from each gradient;
antibody was obtained against a C-terminal Cox25 peptide the equivalent fractions were pooled and tested for Mss51
(DPQELEALKKEYEAKKKA) using the services of Open Bio- distribution by Western blot analyses. Three fractions around
systems/Thermo Scientific (Huntsville, AL). each peak were pooled and used for GST pulldown experi-
Sucrose Gradients—The sedimentation properties of Cox25 ments as reported (8). Each set of pooled fractions were incu-
and Mss51 in sucrose gradients were analyzed essentially as bated in a rotator with glutathione-Sepharose beads for 4 h at
described (6). Mitochondria were prepared by the method of 4 °C. After centrifugation at 500 gav for 5 min, the beads
Herrmann et al. (21). Four mg of protein were solubilized in were washed three times with cold PBS. The Mss51-GST fu-
400 l of extraction buffer (20 mM HEPES, pH 7.4, 0.5 mM sion protein was eluted with 10 mM reduced glutathione, 50
PMSF, 1% digitonin, 1.2 mM MgCl2, and 150 mM KCl) on ice mM Tris-base, pH 8.0. Samples from the different pulled
163
Anexos

down materials were used for Western blot analyses using Statistical Analysis—All of the experiments were done at
antibodies against Cox25 and Mss51. least in triplicate. The data are presented as the means S.D.
Cox25 fused with GST with an intercalated thrombin site of absolute values or percentages of control. The values ob-
was expressed from YIp352/COX25-Thr-GST in a tained for wild-type and cox25 mutant strains for the different
W303cox25 strain. This strain was respiratory competent parameters studied were compared by Student’s t test. p
and grew on nonfermentable carbon sources with a doubling 0.05 was considered significant.
time similar to the parental wild-type strain (supplemental
Fig. S1). A functional Cox14 fused with GST with an interca- RESULTS
lated thrombin site was expressed from an integrative plasmid Identification of Cox25—Mass spectrophotometry analyses
in a strain carrying a null mutant allele of cox14 (cox14/ of a 450-kDa protein complex containing Mss51, Cox14, and
COX14-GST) as previously reported (6). Mitochondria were newly synthesized Cox1 allowed us to identify the presence of
prepared from W303cox14/COX14-Thr-GST, W303cox25/ the mitochondrial Hsp70 chaperone Ssc1 in this complex (8).
COX25-Thr-GST, and W303mss51/MSS51-Thr-GST strains Peptides from the protein encoded in the gene corresponding
by the method of Herrmann et al. (21), solubilized as men- to ORF YJL062W-A were also detected in some of our replica
tioned above and directly used for GST pulldown followed by samples. Recently, Merz and Westermann (28) reported a

Western blot analyses of the pulled down material. genome-wide deletion mutant analysis that revealed a num-
Pulldown of Newly Synthesized Mitochondrial Products with ber of new genes required for respiratory growth in S. cerevi-
Cox25-GST—Mitochondria were prepared from a cox25 null siae. One of these genes is encoded in ORF YJL062W-A, and
mutant with a chromosomally integrated plasmid expressing it was termed RRG10 (28). Rrg10 was proposed to be involved
the Cox25-GST fusion protein. Mitochondria were labeled in the expression of mitochondrial proteins based on the at-
with [35S]methionine for 30 min as described (6) and ex- tenuation of [35S]methionine incorporation into Cox1 during
tracted with 1% digitonin, 20 mM HEPES, pH 7.4, 1.2 mM in vivo mitochondrial protein synthesis using a deletion mu-
MgCl2, 150 mM KCl, and 0.5 mM PMSF. The extract was clari- tant of rrg10 (28). The precise function of Rrg10 is not known
fied by centrifugation at 50,000 gav for 30 min and incu- at present. As explained below, we have shown that Rrg10 is a
bated with glutathione-Sepharose beads for 4 h at 4 °C. Fol- COX assembly factor that acts early in Cox1 metabolism and,
lowing centrifugation at 500 gav for 5 min, the supernatant together with Mss51, Cox14, and Ssc1, operates in transla-
was collected, the beads were washed three times with PBS tional regulation of COX1 mRNA. For these reasons, we have
and eluted with Laemmli buffer (24). Mitochondria corre- renamed the gene COX25. A Blast search identified homo-
sponding to 20 g of protein, equivalent volumes of the ex- logues of the COX25 product only among fungi (Fig. 1A).
tract, the supernatant from the glutathione-Sepharose beads, COX25 Is Essential for Respiration, Cytochrome c Oxidase
and the washed beads were separated on a 17.5% polyacryl- Assembly, and Function—We obtained a BYcox25 strain
amide gel by SDS-PAGE. from Open Biosystems in which the COX25 gene was re-
Cox25 Localization and Topology in Isolated Mitochondria— placed by a KANMX cassette in the BY4741 background. The
A sample of mitochondria at 4 mg/ml was gently sonically cox25 deletion cassette was transferred to a W303-1A strain
irradiated and centrifuged at 50,000 gav for 30 min at 4 °C to create a W303cox25 strain, which was used for most of
to separate the soluble and membrane proteins. The mem- the experiments. The cox25 mutants in either background are
brane pellet was resuspended in 0.6 M sorbitol, 20 mM HEPES able to use glucose (Fig. 1B) and less efficiently other ferment-
buffer containing 0.1 M Na2CO3, pH 11, and 50 mM EDTA. able nonrepressive carbon sources (supplemental Fig. S2)
After 30 min on ice, the sample was centrifuged at 100,000 but are unable to utilize respiratory substrates for growth (Fig.
gav for 15 min at 4 °C to separate the soluble membrane ex- 1B and supplemental Fig. S2). Overexpression of Cox25 did
trinsic from the insoluble intrinsic membrane proteins. not affect the growth of wild-type cells and fully restored the
Equivalent volumes of each fraction were analyzed by West- respiratory growth of cox25 cells (Fig. 1C).
ern blotting. The respiratory growth defect of cox25 cells is due to a
Miscellaneous Procedures—Standard procedures were used virtually complete abolishment of the capacity of the cells to
for the preparation and ligation of DNA fragments and for respire as shown by a polarographic measurement of KCN-
transformation and recovery of plasmid DNA from Esche- sensitive endogenous cell respiration (Fig. 2A). The ability of
richia coli (25). Yeast were transformed by the method of the mutant cells to respire was restored by reinsertion of re-
Schiestl and Gietz (26). The proteins were separated by SDS- combinant COX25 (data not shown). The respiratory defect
PAGE in the buffer system of Laemmli (24), and Western was also evident by the complete inability of mitochondria
blots were treated with antibodies against the appropriate isolated from W303cox25 cells to oxidize either NADH or
proteins followed by a second reaction with anti-mouse or succinate (Fig. 2B).
anti-rabbit IgG conjugated to horseradish peroxidase (Sigma). To ascertain whether the origin of the respiratory defect
The SuperSignal chemiluminescent substrate kit (Pierce) was stemmed from a defect in the respiratory chain enzymes, we
used for the final detection. In vivo mitochondrial protein analyzed the oxidized minus reduced total mitochondrial cy-
synthesis was performed as previously described (5, 8). The tochrome spectra. Comparison of the wild-type and mutant
one-step gene insertion method (27) was used to integrate spectra revealed slight differences in the levels of cytochromes
linear plasmids at the URA3 or LEU2 locus of yeast chromo- b, c, or c1. More importantly, cytochromes a and a3 were ab-
somal DNA. sent in the cox25 mutant compared with the wild-type strain
164
Anexos
FIGURE 1. S. cerevisiae COX25 codes for a protein required for respiratory growth. A, sequence alignment of COX25 from S. cerevisiae (Sc) and other

fungi: Neurospora crassa (Nc), Aspergillus nidulans (An), Podospora anserina (Pa), Gibberella zeae (Gz), Kluiveromyces lactis (Kl), Pichia pastoris (Pp), and Yar-
rowia lipolytica (Yl). TM indicates a predicted transmembrane domain. B, the respiratory competent wild-type strains BY4741 and W303 and strains carrying
a null allele of cox25 in both genetic backgrounds were grown overnight in liquid YPD media. 10-fold serial dilutions of the four strains were plated on solid
YPD or YPEG media and incubated at 30 °C. The pictures were taken after 3 days of incubation. C, wild-type W303 and mutant cox25 cells overexpressing
or not COX25 were grown overnight in liquid YPD media. Serial dilution growth test was performed as for B.
(Fig. 2C), indicating a complete COX impairment. The enzy- genes including cox11 (Fig. 3B), mss51, pet309, and shy1 (data
matic defect was confirmed by measuring COX activity in not shown). The cox25 mutation restored normal Cox1 syn-
isolated mitochondria, which indicated a complete absence of thesis in all the COX mutants except in strains carrying null
functional COX in the mutant as compared with the isogenic alleles of mss51 and pet309, genes that encode the two trans-
wild type (Fig. 2D). The cox25 mutation also induced a lational activators essential for Cox1 synthesis. Despite being
pleiotropic decrease in other segments of the OXPHOS sys- epistatic with respect to Cox1 expression, the cox25 mutation
tem, particularly in NADH cytochrome c reductase and ATP did not rescue either respiration or the ability of the mutants
synthase activities (Fig. 2D). Although the precise mecha- to assemble COX (data not shown). The observed phenotype
nisms for these pleiotropic effects remain to be explored, they is not the result of a decrease in Cox14 steady state levels,
were similar to the alterations measured in a cox14 strain which were not modified by the absence of Cox25 (Fig. 3C).
(Fig. 2D) and several other COX assembly mutants (29). Stability of Newly Synthesized Cox1p in Wild-type and COX
Steady state levels of Cox1 and Cox2 were barely detected Mutants—We have reported that in the absence of Cox14,
in the cox25 mutant, and those of Cox3 were significantly newly synthesized Cox1 is rapidly degraded because the pres-
reduced (Fig. 2E). This is most likely due to the rapid turnover ence of Cox14 is required to stabilize a high molecular mass
of the COX catalytic core subunits when the assembly process protein complex additionally containing newly synthesized
is hindered. Like in most COX mutants, including cox14, a Cox1, the COX1 mRNA translational activator Mss51, and
less significant difference was detected in the more stable nu- the mitochondrial Hsp70 chaperone Ssc1 (6, 8). To assess the
clear encoded subunits such as Cox4 (Fig. 2E). However, the stability of unassembled Cox1 in the absence of Cox25, wild-
steady state levels of Cox5 were particularly low in the ab- type W303, cox25, and double mutant cox14cox25 cells
sence of Cox25 (Fig. 2E), and the two subunit isoforms, Cox5a were pulsed with [35S]methionine for 15 min in the presence
and Cox5b, were similarly affected (Fig. 2F). of cycloheximide and chased for different times following ad-
A Null Mutation in COX25 Does Not Repress Cox1 dition of puromycin and excess of cold methionine. Most of
Synthesis—The cox25 mutation in the BY4741 background the translation products in the wild-type strain, including the
was previously reported to induce a Cox1 synthesis defect three COX subunits, were stable during 1 h of chase (Fig. 3D).
(28). This phenotype likely results from a down-regulation of In the mutants, most of the Cox1 was degraded during the
Cox1 synthesis when normal COX assembly is compromised chase, and a significant fraction of Cox2 and Cox3 was also
as has been reported for most COX assembly mutants (6). degraded during this period (Fig. 3D). This is in contrast with
However, in vivo pulse labeling with [35S]methionine of either the pattern of most COX assembly mutants in which Cox1
BYcox25 or W303cox25 cells in the presence of cyclohexi- synthesis is down-regulated, but the small amount of labeled
mide showed that the amount of detectable newly synthesized Cox1 detected in these mutants remains unchanged during
Cox1 is similar in cox25 and wild-type cells (Fig. 3A). To the chase, whereas Cox2 and Cox3 are labile (6). The greater
date, the two reported exceptions of genes that when mutated instability of Cox1 in the cox25 mutant mimics that in the
bypass Cox1 synthesis down-regulation in the absence of cox14 mutant and is also supported by the results of Western
COX assembly are Cox14 (6) and Coa1 (13, 15). analysis showing barely detectable Cox1 steady state concen-
The lack of effect of the cox25 mutation on Cox1 synthesis trations in these two mutants (Fig. 2E) even lower than in
(Fig. 3, A and B) suggested that similar to Cox14, Cox25 other COX assembly mutants (6).
might contribute to negatively regulate translation of this A double cox25cox14 mutation produced a bypass of
COX subunit. This was tested by measuring Cox1 synthesis in Cox1 translational autoregulation similar to that produced by
strains carrying mutations in cox25 and other COX-specific the single mutations (Fig. 3, A and D) and a similar instability
165
Anexos
FIGURE 2. Biochemical properties of cox25 cells. Respiratory assays A, KCN-sensitive endogenous cell respiration measured polarographically in the
presence of galactose. B, rate of NADH and succinate oxidation in isolated mitochondria. C, total mitochondrial cytochrome spectra. Mitochondria from the
wild-type strain W303 and the null mutant cox25 cells were extracted at a protein concentration of 5 mg/ml with potassium deoxycholate under condi-
tions that quantitatively solubilize all of the cytochromes (36). Difference spectra of the reduced (sodium dithionite) versus oxidized (potassium ferricya-
nide) extracts were recorded at room temperature. The absorption bands corresponding to cytochromes a and a3 have maxima at 603 nm (a and a3); the
maxima for cytochrome b (b) and for cytochrome c and c1 (c and c1) are 560 and 550 nm, respectively. D, mitochondrial respiratory chain enzyme spectro-
photometric measurements in isolated mitochondria. COX, NADH cytochrome c reductase (NCCR), succinate cytochrome c reductase (SCCR), and ATP syn-
thase activities were measured as described under “Experimental Procedures.” E, steady state concentrations of mitochondrial respiratory chain complexes
IV (COX), II (Sdh), and III (bc1 complex) and ATP synthase subunits estimated by Western blot analyses of proteins separated in a 12% Tris-glycine SDS-PAGE.
F, steady state concentrations of COX subunit 5 isoforms estimated by Western blot analyses of proteins separated in a 16.5% Tris-Tricine SDS-PAGE. Two
expositions of the film are shown. In E and F, an antibody against porin was used to normalize the signals for protein loading.
166
Anexos

FIGURE 3. In vivo synthesis and turnover of mitochondrial gene products in cox25 cells. A, wild type (either BY4741 or W303), null mutants of cox25 in
both backgrounds and a double mutant cox25cox14 were labeled with [35S]methionine at 30 °C for the indicated times in the presence of cyclohexi-
mide. Equivalent amounts of protein were separated by SDS-PAGE on a 17.5% polyacrylamide gel, transferred to a nitrocellulose membrane, and analyzed
by autoradiography. #1 and #2 indicate two independent cox25 clones. B, in vivo labeling of mitochondrial products from the indicated strains with
[35S]methionine at 30 °C for 5 and 10 min in the presence of cycloheximide. C, steady state levels of Cox14 and Mss51 in mitochondria isolated from wild-
type, cox25, and cox14 cells analyzed by Western blotting. D, the indicated strains were labeled for 15 min at 30 °C with [35S]methionine in the presence
of cycloheximide. Labeling was terminated by the addition of 80 mol of cold methionine and 12 g/ml puromycin (0 time). The samples were collected
after the indicated times of incubation at 30 °C and processed as in A.
of newly synthesized Cox1 (Fig. 3D), suggesting that both expression of cytochrome c, the presence of which is required
Cox25 and Cox14 contribute to establish Cox1 translational for COX assembly, and overexpression of Hap4, which par-
control jointly or through the same mechanism. tially rescues the COX deficiency of shy1 mutants by inducing
Overexpression of Cox25 Does Not Alter Synthesis of Cox1— overexpression of nuclear encoded subunits Cox5 and Cox6
Normal labeling of Cox1 in cox25 single and double mutants (14), failed to suppress the cox25 respiratory defect (data not
could indicate that Cox25 acts to increase degradation of un- shown). Reciprocally, overexpression of COX25 in strains car-
assembled or incompletely assembled Cox1. If this were the rying null alleles of cox14, mss51, cox10, cox15, oxa1, pet309,
case, overexpression of Cox25 in a wild-type or mutant back- pet111, pet100, pet191, shy1, sco1, cox11, cox16, cox17, and
ground might be expected to affect the amount of newly syn- cox5a did not rescue the respiratory defect of these strains
thesized Cox1. This was examined by transforming wild-type (data not shown).
and cox25 cells with an episomal plasmid containing a wild- Cox25 Is an Integral Mitochondrial Inner Membrane
type COX25 gene. Overexpression of Cox25 in these strains Protein—The phenotype of cox25 cells strongly suggested
was more than 10-fold (supplemental Fig. S3A). It did not that Cox25 must be a mitochondrial protein. Cox25 is a 10-
affect the growth of wild-type cells, fully restored the respira- kDa protein predicted to have a single transmembrane do-
tory growth of cox25 cells (Fig. 1C), and did not affect in vivo main. To determine the subcellular localization of Cox25, we
labeling of Cox1, similar to Cox14 overexpression in the wild- have generated an affinity-purified peptide antibody that rec-
type strain (supplemental Fig. S3B). ognizes this protein. Cell fractionation and Western blot ana-
The Function of Cox25 Does Not Overlap the Functions of lyses enabled us to find Cox25 in the mitochondrial fraction
Other COX Assembly Factors—Because Cox25 seems to act but not in the postmitochondrial supernatant containing cy-
early in the biogenesis of Cox1, we asked whether overexpres- toplasmic proteins such as Pgk1 (3-phosphoglycerate kinase)
sion of COX assembly factors could at least partially restore (Fig. 4A, upper panel). The protein was absent in the cox25
respiratory growth in cox25 cells. Overexpression of Mss51, strain (Fig. 4A, lower panel). We have determined the submi-
Cox14, Cox10, Shy1, Cox11, Cox17, and Sco1 as well as over- tochondrial localization of Cox25, its topology, and its solubil-
167
Anexos
FIGURE 4. Mitochondrial localization of Cox25. A, Cox25 is a mitochondrial protein. Mitochondria (M) and the post-mitochondrial supernatant (PMS) frac- Downloaded from www.jbc.org at Instituto de Investigaciones Biomédicas, on October 25, 2011
tion were isolated from the wild-type W303 strain. Samples of the two fractions corresponding to 40 g of protein were analyzed by Western blotting using
antibodies against Cox25, the cytosolic marker 3-phosphoglycerate kinase subunit 1 (Pgk1), and the mitochondrial marker porin. The specificity of the sig-
nal detected with the anti-Cox25 antibody was tested by including a sample of cox25 mitochondria. B, Cox25 is a membrane protein. As described under
“Experimental Procedures,” soluble (S) and membrane-bound (P) mitochondrial proteins were separated from 40 g of total wild-type mitochondria. The
pellet was submitted to alkaline extraction to allow the separation of the extrinsic proteins present in the supernatant (CS) from the intrinsic proteins in the
pellet (CP). The samples were analyzed by Western blotting using antibodies against Cox25, Cox14, the inner membrane extrinsic protein Mss51, the solu-
ble intermembrane space protein Cox17, and the inner membrane intrinsic protein Cox3. C, Cox25 is an inner mitochondrial membrane protein. Isolated
mitochondria were fractionated into inner and outer membranes by sonication plus sucrose gradient sedimentation as described (37). Inner membranes
(IM) and outer membranes (OM) were analyzed by Western blotting using antibodies against porin (outer membrane marker), Cox1 (inner membrane
marker), Cox14, and Cox25. D, Cox25 is a membrane protein facing the matrix. Four aliquots of 40 g of mitochondrial protein were pelleted and resus-
pended in buffer containing either 20 mM HEPES or 0.6 M sorbitol with 20 mM HEPES. One aliquot in each buffer was supplemented with final 100 g/ml
proteinase K (PK) and incubated on ice for 60 min. The reaction was stopped with 2 mM PMSF. Mitochondria (Mt) and mitoplasts (Mp) were recovered by
centrifugation at 50,000 gav for 15 min at 4 °C. The samples were analyzed by Western blotting using antibodies against Cox25, Cox14, Cmc2 (protein
facing the inner membrane space), and Mss51 (protein facing the matrix). E, sequence alignment of S. cerevisiae Cox25 and Cox14. F, Kyte-Doolittle hydro-
phobicity plots for these proteins. TM indicates a predicted transmembrane domain. G, topology of Cox25 and Cox14 in the inner membrane. Mitochondria
were prepared from cox25 or cox14 strains, respectively, expressing Cox25 or Cox14 fused with GST at their C terminus and used for proteinase protec-
tion assays as in D. H, cartoon depicting the topology of Cox25 and Cox14 in the mitochondrial inner membrane.
ity properties. Sonic irradiation of wild-type mitochondria Mss51, however, was solubilized by treatment of mitochon-
solubilized Cox17, a soluble protein of the intermembrane dria with alkaline carbonate because it is a peripheral protein,
space, but not Cox25, Cox3, Cox14, or Mss51 (Fig. 4B). whereas Cox3 was recovered in the membrane fraction, be-
168
Anexos

cause it is an intrinsic protein of the inner membrane. Cox14
was previously shown to be associated with the inner mem-
brane of mitochondria (30) and proposed to be a peripheral
protein (6). However, similar to Cox25, Cox14 has a predicted
transmembrane domain (Fig. 4E), and when reassessing its
solubility properties we consistently found that both Cox14
and Cox25 were not extracted with alkaline carbonate (Fig.
4B). To discern to which membrane Cox25 is integrated, we
sonicated mitochondria and separated inner and outer mem-
branes by sucrose gradient fractionation. Porin and Cox1
were used as markers of the outer and inner mitochondrial
membranes, respectively, to test the purity of the fractions.
Similar to Cox1, Cox14 and Cox25 are found exclusively in
the inner membrane fraction (Fig. 4C).
Similar to Mss51, a peripheral inner membrane protein

facing the matrix, Cox25 has no significant hydrophilic por-
tions located on the intermembrane space side of the inner
membrane as evidenced by its resistance to proteinase K in
mitochondria and in mitoplasts prepared by hypotonic swell-
ing of mitochondria (Fig. 4D). In contrast, similar to Cmc2, a
peripheral inner membrane protein facing the intermembrane
space, Cox14 is protected against proteinase K degradation in
mitochondria but not in mitoplasts, indicating that it must
contain some hydrophilic domain exposed to the intermem-
brane space.
Cox25 and Cox14 are both small proteins with similar pre-
dicted structural features. An alignment of both proteins does
not show a major homology beyond the predicted transmem-
brane domains in each one (Fig. 4E). The Kyte-Doolittle hy-
drophobicity plot (31) shows that both proteins contain a rel-
atively hydrophilic C terminus (Fig. 4F). To elucidate the
topology of these proteins, we prepared mitochondria from
cox25 cells expressing functional Cox25-GST (supplemental
Fig. S2) or cox14 cells expressing functional Cox14-GST (6)
and used them in proteinase protection assays. In both cases,
FIGURE 5. Native molecular mass and steady state levels of Cox25.
the GST tag was fused to the C terminus of the proteins. A, sedimentation properties of Mss51 in a linear 7–20% sucrose gradient
Cox25 and its GST tag were proteinase K protected in both using mitochondrial extracts from the indicated strains. The gradient was
mitochondria and mitoplasts, whereas Cox14 and its GST tag calibrated with hemoglobin (Hb, 67 kDa) and lactate dehydrogenase (LDH,
130 kDa). The distribution of Mss51 was assayed by Western blot analysis.
were protected from proteinase K digestion in mitochondria B and C, sedimentation properties of Cox25 (B) and of Cox14 (C) in a linear
but not in mitoplasts (Fig. 4G). Taken together and as de- 7–20% sucrose gradient using mitochondrial extracts from the indicated
picted in the cartoon in Fig. 4H, our results demonstrate that strains, analyzed as in A.
both Cox14 and Cox25 have a transmembrane domain and a
relatively hydrophilic C-terminal domain that protrudes ei- Cox25 in the 450-kDa complex by mass spectrometry men-
ther into the intermembrane space (Cox14) or into the matrix tioned earlier. As expected, analyses of the sedimentation
(Cox25). properties of Cox25 extracted from wild-type mitochondria in
Cox25 Co-sediments with Mss51 in Sucrose Gradient—The a sucrose gradient showed that Cox25, Cox14, and Mss51
similar phenotypes of Cox25 and Cox14 suggest that both co-sediment in the 450-kDa complex (Fig. 5). Although the
proteins could cooperate with Mss51 and Ssc1 to coordinate absence of Cox1, Mss51, and Cox14 destabilizes this complex
Cox1 synthesis with its assembly into the COX holoenzyme. (Ref. 8 and Fig. 5A), both Cox25 and Cox14 remain part of the
We have previously shown that in wild-type cells, most Mss51 high molecular mass material (Fig. 5, B and C), presumably
is part of a 450-kDa complex (Ref. 8 and Fig. 5A) that contains interacting with other COX subunits or assembly factors.
Cox1, Cox14, Mss51, and Ssc1 (8). In the absence of Cox14, It is particularly noticeable that in the absence of Cox1,
the 450-kDa complex is destabilized, and Mss51 accumulates Mss51, or Cox14, a small portion of Cox25 accumulates in
in a 120-kDa heterodimer (Ref. 8 and Fig. 5A) in partnership heavy fractions (Fig. 5B). Also Cox14 is detected in these frac-
with Ssc1 (8). Similarly, the absence of Cox25 results in the tions in the absence of Cox1 and Mss51 but not in the ab-
accumulation of Mss51 in the 120-kDa complex (Fig. 5A), sence of Cox25 (Fig. 5C). In these fractions we have previously
supporting the fact that Cox25 is also part of the 450-kDa detected ribosomal molecules (8). The absence of Cox1,
complex. This result is in agreement with the detection of Mss51, Cox14, Cox2, and Cox5a or the large number of COX
169
Anexos

assembly factors tested does not alter the steady state levels of
Cox25 (supplemental Fig. S4). Unexpectedly, Cox25 levels are
enhanced by 2.5-fold in mitochondria isolated from cells
devoid of mitochondrial DNA (0) and thus of mitochondrial
ribosomes (supplemental Fig. S4). Future studies will be de-
voted to explore a possible association of Cox25 with mito-
chondrial ribosomes.
Cox25 Is Part of High Molecular Mass Complexes Contain-
ing Mss51, Cox14, Ssc1, and Newly Synthesized Cox1—Follow-
ing our recently reported model of translational regulation of
Cox1 synthesis, Mss51 is a component of a high molecular
mass Cox1 translational complex (HMW-T), a 450-kDa Cox1
stabilization complex, and finally a 120-kDa complex contain-
ing translationally competent Mss51 (8). We have now asked
whether Cox25 is physically part of these complexes.

Mss51-containing 450- and 120-kDa complexes were puri-
fied from mitochondrial extracts from a mss51 strain ex-
pressing MSS51-GST using a combination of sucrose gradi-
ents and GST pulldown as reported (8). In this strain, the
steady state level of Mss51-GST is 2-fold that of Mss51 in a
wild-type strain, and the excess of Mss51 accumulates in the
120-kDa complex (8). Mss51-containing HMW-T and 450- FIGURE 6. Cox25 physically interacts with Cox1 and Cox1 biogenesis
and assembly factors. A, Cox25 interacts with Mss51 in the 450-kDa com-
and 120-kDa complexes were similarly purified from mito- plex and in the high molecular mass Cox1 translational complex (HMW-T)
chondrial extracts from a mss51cox11 strain expressing but not in the 120-kDa complex previously described (8). Complexes con-
MSS51-GST as reported (8). In the later strain, in the absence taining Mss51 were purified by sucrose gradient followed by GST pulldown
of mitochondrial extracts from either a mss51 or a mss51cox11 both
of COX assembly, a significant portion of Mss51 remains expressing a GST-tagged version of Mss51 (8). Samples from the different
trapped in the HMW-T and 450-kDa complexes, thus limit- complexes were analyzed by Western blotting using antibodies against
ing its availability for translation (8). Using Western blot anal- Mss51 and Cox25. B, mitochondria were prepared from mss51 cells ex-
pressing Mss51-GST, cox14 cells expressing Cox14-GST and cox25 cells
yses, we have detected Cox25 in both the HMW-T and 450- expressing Cox25-GST, extracted with 1% digitonin, 150 mM KCl, and 1.2
kDa complexes but not in the 120-kDa complex as expected mM MgCl2 in buffer containing 20 mM HEPES and 0.5 mM PMSF and used for
GST pulldown assays. Samples of material bound to GST-Sepharose beads
(Fig. 6A). The interaction among Cox25, Mss51, and Cox14 (lanes B) or remaining in the supernatant (lanes S) were separated in a 12%
was further tested by GST pulldown assays of extracts pre- Tris-glycine SDS-PAGE and analyzed by Western blotting using specific anti-
pared from mitochondria isolated from cox25 cells express- bodies against the indicated proteins. C, interaction of Cox25 with newly
synthesized Cox1. Mitochondria isolated from a cox25 strain with a chro-
ing Cox25-GST, cox14 cells expressing Cox14-GST, and mosomally integrated plasmid expressing Cox25-GST fusion protein were
mss51 cells expressing Mss51-GST, respectively. In each labeled with [35S]methionine for 30 min, extracted, and submitted to GST
case, the tagged protein and the other two untagged proteins pulldown as described under “Experimental Procedures.” Mitochondria (M)
corresponding to 20 g of protein, equivalent volumes of the extract (Ex),
were detected by Western blot in the material adsorbed to the the supernatant from the glutathione-Sepharose beads (S), and the washed
GST-Sepharose beads, indicating physical interactions among beads (B) were separated on a 17.5% polyacrylamide gel by SDS-PAGE.
D, Cox25-GST pulldown samples were also separated in a 16.5% Tris-Tricine
them (Fig. 6B). SDS-PAGE and analyzed by Western blotting using and anti-Cox5 antibody.
The ability of Cox25 to interact with Cox14 and Mss51 sug- E, GST pulldown analyses performed as in C, using mitochondrial extracts
gested that Cox25 might be directly or indirectly interacting from cox25, cox25cox14, and cox25shy1 cells all expressing COX25-
GST. Material unbound (S) or bound to the GST-Sepharose beads was ana-
with newly synthesized Cox1. To test for a physical interac- lyzed by Western blotting using antibodies against Cox25 and Cox5.
tion with Cox1, mitochondria from a cox25 strain express-
ing Cox25-GST from a chromosomally integrated plasmid Cox5, probably the first subunit to form an assembly interme-
were labeled in organello with [35S]methionine, extracted with diate with Cox1 (14). Although Mss51-GST does not pull
1% digitonin in the presence of 150 mM KCl and 1.2 mM down Shy1 nor Cox5, these proteins are poorly co-precipi-
MgCl2 and adsorbed onto glutathione-Sepharose beads. SDS- tated with Cox14-GST and very efficiently with Cox25-GST
PAGE analysis of the proteins recovered from the beads indi- (Fig. 6B). Noticeably, both Cox5 isoforms were co-precipi-
cated quite a selective pulldown of labeled Cox1 (Fig. 6C). tated with Cox25-GST (Fig. 6D). Furthermore, we tested
Cox25 Interacts with Cox5 and Shy—It has been recently whether the interaction of Cox25 with Cox5 depends on Shy1
reported that Shy1, Cox14, and Coa1 are part of large com- and Cox14. For that purpose, we prepared cox25 strains ex-
plexes and interact with Cox1-containing subassemblies pressing COX25-GST from a chromosomally integrated plas-
downstream from the roles of Mss51 in COX biogenesis (6, mid and carrying an additional mutation either in shy1 or in
13). We have asked whether Cox25 also participates in COX cox14. Mitochondrial extracts from these strains were used
assembly once Mss51 has been released from the 450-kDa for pulldown assays. As shown in Fig. 6E, Cox5 was efficiently
Cox1 stabilization complex. Using samples from the same pulled down in the absence of Shy1, but only traces were de-
pulldown assays explained earlier, we have tested whether tected in the absence of Cox14 when the film was overex-
Cox25 interacts with Shy1 and the nuclear encoded subunit posed (data not shown). In all the GST pulldown assays, none
170
Anexos

synthesis is completed, Cox14 and Cox25 serve to stabilize a
450-kDa Ssc1-Mss51-Cox1-Cox14-Cox25 complex. The re-
lease of Mss51 from this complex is possibly catalyzed by the
incorporation of the COX assembly factors Shy1 and Coa1 as
well as nuclear encoded subunits Cox5a-Cox6, thus allowing
Cox1 to proceed to downstream events in the COX assembly
process (4 – 6, 13, 15). In this way, Mss51 becomes available
for new rounds of translation (Ref. 8 and Fig. 7).
Noticeably, Cox25 and Cox14 are relatively similar proteins
FIGURE 7. Scheme of a model depicting the role of Ssc1 and Cox14 on
translational regulation of cytochrome c oxidase biogenesis by inter- that seem to perform quite similar roles. However, their func-
acting with Mss51 in several high molecular mass complexes. Cox25 is a tions are essential for COX assembly and nonoverlapping be-
partner in some of these complexes. See the explanation in the text.
cause overexpression of COX25 in a cox14 mutant or of
COX14 in a cox25 mutant does not suppress the COX as-
of the analyzed proteins were detected bound to plain (non- sembly and respiratory growth defects of these strains. Both
GST conjugated) Sepharose beads (data not shown). Our re- Cox25 and Cox14 have a similar predicted architecture, al-

sults indicate that in addition to interacting with Mss51, though their orientation in the inner membrane is different.
Cox14 and Cox25 also exist as part of large COX assembly Both have a transmembrane domain and a hydrophilic C ter-
intermediates not necessarily involving Shy1. minus, but the latter protrudes into a different mitochondrial
compartment for each protein. Although the C terminus of
DISCUSSION Cox14 resides in the intermembrane space and is glutamine-
Our findings identify Cox25 as a new essential COX bio- rich, the C terminus of Cox25 resides in the matrix milieu and
genesis factor. It is required to promote the stability of newly contains a positively charged lysine-rich terminal domain.
synthesized Cox1 and, in this capacity, to facilitate regulation Because Cox25 is found in Cox1 translational complexes, it is
of COX1 mRNA translation and couple this process to Cox1 tempting to speculate that Cox25 could mediate the interac-
assembly into multi-subunit intermediates. tion of Mss51 with the mitoribosome. Incidentally, we have
In most COX assembly mutants, the rate of Cox1 synthesis noticed that ORF YJL062W-A containing COX25 is located in
is significantly lower than in wild-type cells. Experimentally, chromosome X “head to head” to ORF YJL063C containing
COX1 mRNA translational auto-regulation can be bypassed MRPL8, which encodes a mitoribosomal protein of the large
in the absence of COX assembly by increasing the effective subunit. The proximity of these genes (less than 250 bp apart)
concentration of Mss51 as a COX1 mRNA translational acti- suggests that their expression could be co-regulated. The to-
vator, thus preventing the trap of Mss51 with newly synthe- pologies of Cox14 and Cox25 appear to be suitable to pro-
sized Cox1 in high molecular mass complexes. This can be mote the stability of the Cox1-Mss51-Ssc1 complex by inter-
accomplished in a COX mutant strain by introducing an addi- acting with Cox1 through their transmembrane domains and
tional copy of MSS51 or by substituting the endogenous holding the complex from both the intermembrane space and
MSS51 by certain mutant mss51F199I and mss51T167R alleles the matrix sides of the inner membrane.
that encode Mss51 proteins with an increased ability to be A phenotypic trait that distinguishes cox25 and cox14
released from the 450-kDa Mss51-trapping complex (6, 8). An mitochondria is the different steady state level of Cox5. In the
alternative approach consists of destabilizing the Mss51-trap- absence of Cox25, Cox5 accumulation is significantly lowered,
ping complex by introducing mutations in either coa1 (13, 15) suggesting a role for Cox25 in the stability of this subunit.
or cox14 (6). This later approach allowed us to identify Cox14 COX assembly is thought to be a sequential process (32, 33)
as a protein involved in Cox1 translational auto-regulation. initiated by the synthesis of Cox1, which subsequently forms a
Now we have identified Cox25 as part of the Cox1 transla- subassembly with Cox5 and Cox6 (33, 34). These subunits are
tional complex and the 450-kDa Cox1 preassembly complex, in direct contact with Cox1 in the mature enzyme (35). Cox5
and in this capacity, the absence of Cox25 destabilizes these interacts with Cox1 through its single transmembrane do-
complexes, increasing the availability of Mss51 for COX1 main, whereas Cox6 caps the matrix side of Cox1 (35). It was
mRNA translation in the absence of COX assembly. previously reported that during the COX assembly process,
Following our recently reported model of translational reg- upon release of Mss51 from the Cox1 preassembly complex,
ulation of Cox1 synthesis (8), depicted in Fig. 7, in wild-type Cox14 still interacts with Cox1 and becomes part of higher
cells, a small portion of total Mss51 is present in a binary 120- order subassemblies involving Coa1, Shy1, and Cox5 (13, 15).
kDa complex with Ssc1. When required for COX assembly, Here we have shown that Cox25 also participates in these
Mss51 molecules contained in this pool would interact with later assembly steps by interacting with Shy1 and Cox5. We
the 5-UTR of the COX1 mRNA to promote its translation (4, were able to pull down Cox5 together with Cox25-GST with
7). During Cox1 synthesis, Mss51 would interact directly or efficiency significantly higher than with Cox14-GST. It is
indirectly with the mitochondrial ribosomes and with the nas- tempting to speculate that Cox25 could directly interact with
cent Cox1 polypeptide together with the chaperones Ssc1 and Cox5, thus providing stability to this protein in the absence of
Mdj1, which would ensure the proper folding of the nascent COX assembly. Additionally, the Cox25-Cox5 interaction
polypeptide. Cox14 and Cox25 are imagined to be added to requires Cox14. This could suggest that Cox25 does not exist
this complex at a later step, forming a HMW-T. Once Cox1 in a complex with Cox5 prior to its role in Cox1 biogenesis.
171
Anexos

Contrarily, the interaction of Cox25 with Cox5 does not de- 13. Mick, D. U., Wagner, K., van der Laan, M., Frazier, A. E., Perschil, I.,
pend on Shy1, which suggests that Shy1 could interact with Pawlas, M., Meyer, H. E., Warscheid, B., and Rehling, P. (2007) EMBO J.
26, 4347– 4358
the Cox1 subassemblies concurrently or immediately after
14. Fontanesi, F., Jin, C., Tzagoloff, A., and Barrientos, A. (2008) Hum. Mol.
incorporation of subunit Cox5. Further studies are required Genet. 17, 775–788
to elucidate essential aspects of the COX biogenesis process 15. Pierrel, F., Bestwick, M. L., Cobine, P. A., Khalimonchuk, O., Cricco,
involving the incorporation of Cox2 into the assembly inter- J. A., and Winge, D. R. (2007) EMBO J. 26, 4335– 4346
mediates and the precise timing for the maturation of both 16. Khalimonchuk, O., Bestwick, M., Meunier, B., Watts, T. C., and Winge,
Cox1 and Cox2 by incorporation of their metal prosthetic D. R. (2010) Mol. Cell. Biol. 30, 1004 –1017
groups. 17. Myers, A. M., Pape, L. K., and Tzagoloff, A. (1985) EMBO J. 4,
2087–2092
In summary, in this work we have described Cox25, a pro-
18. Faye, G., Kujawa, C., and Fukuhara, H. (1974) J. Mol. Biol. 88, 185–203
tein partner of Cox14, Mss51, and Ssc1, essential for COX 19. Soto, I. C., Fontanesi, F., Valledor, M., Horn, D., Singh, R., and Barrien-
assembly-dependent translational autoregulation of Cox1 tos, A. (2009) Biochim. Biophys. Acta 1793, 1776 –1786
synthesis. Our observations fit in a model in which Cox25 20. Tzagoloff, A., Akai, A., and Needleman, R. B. (1975) J. Biol. Chem. 250,
additionally participates in assembly steps beyond Cox1 bio- 8228 – 8235
genesis serving to promote the incorporation or stability of 21. Herrmann, J. M., Stuart, R. A., Craig, E. A., and Neupert, W. (1994)

Cox5 within COX assembly intermediates. We conclude that J. Cell Biol. 127, 893–902
22. Martin, R. G., and Ames, B. N. (1961) J. Biol. Chem. 236, 1372–1379
Cox25 and Cox14 in cooperation coordinate the regulation of
23. Hill, J. E., Myers, A. M., Koerner, T. J., and Tzagoloff, A. (1986) Yeast 2,
Cox1 synthesis and its assembly with partner subunits, thus 163–167
facilitating the assembly of the COX holoenzyme. 24. Laemmli, U. K. (1970) Nature 227, 680 – 685
25. Maniatis, T., Fritsch, E. F., and Sambrook, J. (1982) Molecular Cloning: A
Acknowledgments—We thank Dr. M. Bourens, Dr. C. Trivigno, and Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
I. C. Soto for critically reading the manuscript. We are in debt to Dr. Harbor, NY
Alexander Tzagoloff (Columbia University, New York) for providing 26. Schiestl, R. H., and Gietz, R. D. (1989) Curr. Genet. 16, 339 –346
an antibody against Cox17. 27. Rothstein, R. J. (1983) Methods Enzymol. 101, 202–211
28. Merz, S., and Westermann, B. (2009) Genome Biol. 10, R95
29. Horn, D., Zhou, W., Trevisson, E., Al-Ali, H., Harris, T. K., Salviati, L.,
Note Added in Proof—During the review process of our manu- and Barrientos, A. (2010) J. Biol. Chem. 285, 15088 –15099
script, it has come to our attention that a paper has been published 30. Glerum, D. M., Koerner, T. J., and Tzagoloff, A. (1995) J. Biol. Chem.
in J. Cell. Biol. (47) presenting the identification of the gene en- 270, 15585–15590
coded in open reading frame YJL062W-A, which we have called 31. Kyte, J., and Doolittle, R. F. (1982) J. Mol. Biol. 157, 105–132
COX25, and which was called COA3 in that paper. COA3 is the 32. Nijtmans, L. G., Taanman, J. W., Muijsers, A. O., Speijer, D., and Van
standard name assigned in the SGD site. Both papers conclude that den Bogert, C. (1998) Eur. J. Biochem. 254, 389 –394
the protein encoded in this gene is involved in translational regula- 33. Williams, S. L., Valnot, I., Rustin, P., and Taanman, J. W. (2004) J. Biol.
tion of COX1 in mitochondria from S. cerevisiae. Chem. 279, 7462–7469
34. Church, C., Goehring, B., Forsha, D., Wazny, P., and Poyton, R. O.
REFERENCES (2005) J. Biol. Chem. 280, 1854 –1863
35. Tsukihara, T., Aoyama, H., Yamashita, E., Tomizaki, T., Yamaguchi, H.,
1. Fontanesi, F., Soto, I. C., Horn, D., and Barrientos, A. (2006) Am. J.
Shinzawa-Itoh, K., Nakashima, R., Yaono, R., and Yoshikawa, S. (1996)
Physiol. Cell Physiol. 291, C1129 –C1147
Science 272, 1136 –1144
2. Fontanesi, F., Soto, I. C., and Barrientos, A. (2008) IUBMB Life 60,
36. Tzagoloff, A., Akai, A., Needleman, R. B., and Zulch, G. (1975) J. Biol.
557–568
Chem. 250, 8236 – 8242
3. Langer, T., Käser, M., Klanner, C., and Leonhard, K. (2001) Biochem.
37. Manthey, G. M., Przybyla-Zawislak, B. D., and McEwen, J. E. (1998) Eur.
Soc. Trans. 29, 431– 436
J. Biochem. 255, 156 –161
4. Perez-Martinez, X., Broadley, S. A., and Fox, T. D. (2003) EMBO J. 22,
38. Glerum, D. M., and Tzagoloff, A. (1997) FEBS Lett. 412, 410 – 414
5951–5961
5. Barrientos, A., Korr, D., and Tzagoloff, A. (2002) EMBO J. 21, 43–52 39. Barros, M. H., and Tzagoloff, A. (2002) FEBS Lett. 516, 119 –123
6. Barrientos, A., Zambrano, A., and Tzagoloff, A. (2004) EMBO J. 23, 40. Nobrega, M. P., Nobrega, F. G., and Tzagoloff, A. (1990) J. Biol. Chem.
3472–3482 265, 14220 –14226
7. Zambrano, A., Fontanesi, F., Solans, A., de Oliveira, R. L., Fox, T. D., 41. Glerum, D. M., Muroff, I., Jin, C., and Tzagoloff, A. (1997) J. Biol. Chem.
Tzagoloff, A., and Barrientos, A. (2007) Mol. Biol. Cell 18, 523–535 272, 19088 –19094
8. Fontanesi, F., Soto, I. C., Horn, D., and Barrientos, A. (2010) Mol. Cell. 42. Tzagoloff, A., Capitanio, N., Nobrega, M. P., and Gatti, D. (1990) EMBO
Biol. 30, 245–259 J. 9, 2759 –2764
9. Shingú-Vázquez, M., Camacho-Villasana, Y., Sandoval-Romero, L., But- 43. Glerum, D. M., Shtanko, A., and Tzagoloff, A. (1996) J. Biol. Chem. 271,
ler, C. A., Fox, T. D., and Pérez-Martínez, X. (2010) J. Biol. Chem. 285, 14504 –14509
34382–34389 44. Glerum, D. M., Shtanko, A., and Tzagoloff, A. (1996) J. Biol. Chem. 271,
10. Wollman, F. A., Minai, L., and Nechushtai, R. (1999) Biochim. Biophys. 20531–20535
Acta 1411, 21– 85 45. Hell, K., Herrmann, J., Pratje, E., Neupert, W., and Stuart, R. A. (1997)
11. Choquet, Y., Wostrikoff, K., Rimbault, B., Zito, F., Girard-Bascou, J., FEBS Lett. 418, 367–370
Drapier, D., and Wollman, F. A. (2001) Biochem. Soc. Trans. 29, 46. Carlson, C. G., Barrientos, A., Tzagoloff, A., and Glerum, D. M. (2003)
421– 426 J. Biol. Chem. 278, 3770 –3775
12. Wostrikoff, K., and Stern, D. (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 47. Mick, D. U., Vukotic, M., Piechura, H., Meyer, H. E., Warscheid, B.,
6466 – 6471 Deckers, M., and Rehling, P. (2010) J. Cell. Biol. 191, 141–154
172
Anexos
CCDC56 is a novel mitochondrial protein essential for cytochrome c oxidase function*
Susana Peralta1,3, Paula Clemente1, Álvaro Sánchez-Martínez1,4, Manuel Calleja5, Rosana

Hernández-Sierra1, Yuichi Matsushima6,7, Cristina Adán1, Cristina Ugalde2, Miguel Ángel
Fernández-Moreno1, Laurie S. Kaguni6 and Rafael Garesse1 *.
1- Departamento de Bioquímica, Instituto de Investigaciones Biomédicas “Alberto Sols” UAM-

CSIC. Centro de Investigación Biomédica en Red en Enfermedades Raras (CIBERER)
Facultad de Medicina, Universidad Autónoma de Madrid, Spain.
2- Instituto de Investigación Sanitaria 12 de Octubre (i+12) Madrid, Spain.
3- Present address: Department of Neurology, University of Miami Miller School of Medicine,
Miami, Florida 33136, USA.
4- Present address: Department of Biomedical Sciences, MRC Centre for Developmental and
Biomedical Genetics, University of Sheffield, Sheffield S10 2TN, UK.
5- Centro de Biología Molecular “Severo Ochoa” CSIC-UAM, Madrid, Spain.
6- Department of Biochemistry and Molecular Biology, and Center for Mitochondrial Science
and Medicine, Michigan State University, East Lansing, MI 48824-1319, USA.
7- Present address: Department of Mental Retardation and Birth Defect Research, National
Institute of Neuroscience, National Center of Neurology and Psychiatry, 4-1-1 Ogawahigashi,
Kodaira, Tokyo 187-8502, Japan.
Running Title: Isolated COX deficiency in Drosophila
* Corresponding author. Rafael Garesse, Instituto de Investigaciones Biomédicas “Alberto Sols”

UAM-CSIC. c/ Arturo Duperier 4, 28029-Madrid, Spain. Email: rafael.garesse@uam.es Phone +34-
914975452. Fax: +34-91-5854401
Accession codes. GenBank: CCDC56, NP_001035521.1. Flybase ID: FBgn0261353, CG42630.
Keywords: CCDC56, cytochrome c oxidase, OXPHOS function, Complex IV

, mitochondria, Drosophila
CAPSULE We demonstrate that CG42630 encodes a

novel protein: the Coiled-Coil Domain
Background: Cytochrome c oxidase (COX), Containing protein 56, CCDC56, conserved
the final enzyme of the mitochondrial electron in metazoans. We show that Drosophila
transport chain, requires several assembly CCDC56 protein localizes to mitochondria
factors for its proper function. and contains 87 amino acids in flies and 106
Results: ccdc56-Knock-out flies showed in humans, with the two proteins sharing
developmental delay, lethality and a dramatic 42% amino acid identity. We show by
decrease in the levels/ activity of COX. RACE and Northern-blotting that
Conclusion: CCDC56 protein is necessary for Drosophila CCDC56 protein and mtTFB1
COX function and for viability in flies. are encoded on a bona fide bicistronic
Significance: Drosophila-CCDC56 is a novel transcript. We report the generation and
putative COX assembly factor conserved in characterization of two ccdc56 knockout
humans. lines in Drosophila carrying the ccdc56D6
and ccdc56D11 alleles. Lack of the CCDC56
SUMMARY protein in flies induces a developmental
In Drosophila melanogaster, the delay and 100% lethality by arrest of larval
mitochondrial transcription factor B1 (d- development at the third instar. ccdc56
mtTFB1) transcript contains in its 5’-UTR a knockout larvae show a significant decrease
conserved upstream Open Reading Frame in the level of fully- assembled cytochrome c
(uORF) denoted as CG42630 in FlyBase. oxidase (COX) and in its activity, suggesting
a defect in complex assembly; the activity of
173
Anexos
the other OXPHOS complexes remained mitochondria, processed and assembled

either unaffected or increased in the ccdc56 together with the mtDNA-encoded subunits to
knockout larvae. The lethal phenotype and form the holoenzyme. The nDNA-encoded
the decrease in COX were rescued partially subunits are necessary for the assembly/
by reintroduction of a wild-type UAS- stability of the holoenzyme (11), and to
CCDC56 transgene. These results indicate regulate the catalytic activity of complex IV
an important role for CCDC56 in the (12,13).
OXPHOS system and in particular in COX The majority of COX deficiencies in
function, required for proper development humans have been associated with mutations
in Drosophila melanogaster. We propose in COX assembly factors (reviewed in 7),
CCDC56 as a candidate factor required for although some rare diseases have been
COX biogenesis/ assembly. associated with mutations in COX structural
subunits (2,14). For this reason the biogenesis
INTRODUCTION of cytochrome c oxidase has garnered much
interest in the last few years. More than 20
Cytochrome c oxidase (COX) or assembly factors required for correct COX
Complex IV (EC 1.3.9.1) is the terminal function have been described in yeast, albeit
enzyme of the electron transport chain, and the specific function of many of these factors
catalyzes electron transfer from reduced remains elusive (reviewed in 15). Assembly
cytochrome c to molecular oxygen. Most factors are proteins involved in the biogenesis
cellular ATP is produced in mitochondria by of the complex, which are not present in the
the oxidative phosphorylation (OXPHOS) mature complex. They are involved in
system comprising the electron transport chain different biological processes, for example in
complexes (plus two electron carriers, the biogenesis and/ or insertion of prosthetic
coenzyme Q and cytochrome c) and the groups (16-19), regulation of mt-CO1
multimeric ATP-synthase (complex V) (1). translation (20), and stabilization of the mt-
The energy released from the oxidation of CO1 and mt-CO3 transcripts (21,22).
carbohydrates and lipids is converted to Transcription of genes in bacteria and
reducing power (NADH + H+ and FADH2) in Archaea occurs in polycistronic messenger
the mitochondrial matrix. The electron RNA, whereas in Eukaryota the majority of
transport chain couples electron transfer from genes are transcribed monocistronically (23).
NADH and FADH2 to molecular oxygen, with However, there are some exceptions in
the proton translocation from the matrix to the Eukaryota where genes are transcribed in
mitochondrial intermembrane space by polycistronic messages and in general, these
complexes I, III and IV. This proton polycistronic genes tend to be involved in the
translocation generates an electrochemical same biological process as occur in bacteria
gradient that is used by complex V to generate (24-27).
ATP from ADP and inorganic phosphate. Mitochondrial gene expression is
Defects in the OXPHOS system are regulated by several nuclear encoded proteins,
associated with human mitochondrial diseases including the mitochondrial transcription
that are characterized by a wide variety of factor B1 (mtTFB1) (28). mtTFB1 is dual-
symptoms and affected organs (2,3), with an function protein that can activate mtDNA
incidence of at least 1 in 5000 live births (4,5). transcription in vitro (29) and act as rRNA
COX deficiency is one of the most common methyltransferase in vivo (30,31). Previous
respiratory chain defects in human pathology work from our group in cultured Drosophila
and it has been associated with a wide variety cells indicated a major role for mtTFB1 in
of clinical phenotypes (6,7). Eukaryotic COX mitochondrial translation (32). And more
is a heteromeric enzyme of dual genetic origin recently, Larsson and coworkers have
(8,9). The catalytic core of the enzyme is corroborated this data in mammals, where they
composed of three subunits encoded in the showed methylation of the 12S rRNA
mitochondrial DNA (mtDNA): mt-CO1, mt- mediated by mtTFB1 is required for assembly
CO2 and mt-CO3. The structural subunits that of the mitochondrial ribosome, and therefore
surround the catalytic core are encoded by the for mitochondrial translation (33). The
nuclear genome (nDNA)(10). The nDNA- mtTFB1 gene in Drosophila melanogaster was
encoded subunits must be imported into the annotated as the protein coding gene number
174
Anexos
CG7319 in the fly genome database prepared using the First Choice RLM-RACE
(http://flybase.org). More recently, the cDNA amplification kit (Ambion). 5’ RACE
FlyBase Genome Annotators have published was performed using the following specific
changes affecting the annotation of the primers for Drosophila mtTFB1 cDNA
mtTFB1 gene that indicates the existence of an (CG42631, formerly CG7319): R1, R2 and
upstream Open Reading Frame (uORF) in its R3, depicted in Fig1A. These primers, plus
5’-untranslated region. The putative protein primers F1 and F2 used for 3’ RACE are
coding gene is annotated as CG42630 in the described in Table S2. RACE products were
flybase database (http://flybase.org). Here we cloned into the pCRII-TOPO vector
show that CG42630 is transcribed in a (Invitrogen) and sequenced. Sequence analysis
bicistronic RNA messenger with the mtTFB1 was performed using Vector NTI Advance 10
gene and is expressed in flies. Blast of the (Invitrogene Software). Human CCDC56
novel uORF indicated 42% amino acid identity (NP_001035521.1) and CCDC56 homologues
with the human annotated Coiled-Coil Domain were identified by BLAST
Containing protein 56, (CCDC56; (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) using
NP_001035521.1). Thus, we propose the deduced amino acid sequence of the D.
Drosophila CG42630 as the homologue of melanogaster CG2630 coding gene (35).
human CCDC56. Although the function of Multiple sequence alignments of the predicted
CCDC56 is unknown, it is highly conserved in CCDC56 polypeptides were performed using
higher eukaryotes. To study the function of the the ClustalW 2.0.12 algorithm (36).
CCDC56 protein, we generated a Drosophila
melanogaster knockout model by inducing Northern blotting
genomic deletions by imprecise P-element Five µg of total RNA from control flies were
excision. Our results indicate that the CCDC56 resolved on a 1.2% agarose gel and transferred
homolog is a mitochondrial protein required to a ZETA-PROBE GT membrane (Bio-Rad)
for COX activity and assembly in Drosophila following standard procedures. Invitrogen's
melanogaster, suggesting a role as a COX 0.5 – 10 Kb RNA Ladder was used as a
assembly factor. molecular size marker. A PCR fragment of
280 bp containing the complete ccdc56 ORF
EXPERIMENTAL PROCEDURES (261 bp) was used as a ccdc56-specific probe.
This probe was amplified by PCR from the
Drosophila strains and genetics pUASP-CCDC56 construct using primers
All fly crosses and stocks were grown at 25ºC 9558F and 9559R (see below). The specific
on a standard Drosophila medium. ccdc56D6 probe for the mtTFB1 coding sequence (322
and ccdc56D11 mutants were generated by bp) was obtained by PCR amplification using
inducing the transposition of the SUPor- the primers F9: 5’-
P[kg07792] P element insertion using standard AGCACATCCCGGACACCTCA-3’ and R4:
procedures (34) as represented in FigS1. 5’-TTTAGGGGAATTAGCTTGACG-3’.
Deletion breakpoints of alleles were Probes were radiolabeled with [P32]-dCTP
determined by PCR followed by sequencing using the Amersham Rediprime II Random
using specific primers (Fig 3B-C, Table S2). Prime Labeling System (GE Healthcare)
Sequences were assembled and analyzed using following the manufacturer’s instructions.
the Vector NTI software (Invitrogen).
Transgenic lines for the pUASP-CCDC56, Phenotyping analysis
pUASP-mtTFB1 and pUASP-cDNAbi We carried out 2-hour egg lays from the
constructs were generated by the injection of control w1118 stock and the stable mutant
Drosophila embryos (BestGene). For more stocks ccdc56D6/TM6b-Tb and
D11
details, see Table S1. ccdc56 /TM6B-Tb. To determine if mutant
larvae were developmentally arrested,
Identification and sequence analysis of developmentally delayed, or merely slow
bicistronic ccdc56-mtTFB1 cDNA and growing, their mouth hooks were examined
CCDC56 daily under the microscope from the fifth day
cDNAs from Drosophila control larvae (w1118 after egg laying (AEL). Fly vials were also
and Oregon R-C) and Schneider cells were photographed daily.
175
Anexos
Bacterial expression of d-CCDC56 and Human HeLa cells were grown in DMEM
generation of anti d-CCDC56 antibody (GIBCO-BRL) supplemented with 5% fetal
To express d-CCDC56 in Escherichia coli, a bovine serum (GIBCO-BRL). 1.5 * 105 HeLa
PCR fragment encoding the d-CCDC56 open cells were plated on coverslips and transfected
reading frame was cloned into the pRSET-B with 2 µg of the pcDNA3-d-ccdc56-FLAG
vector (Invitrogen) cut with NcoI and HindIII. construct. Lipofectamine (Invitrogen) was
Primers used were: Fw: 5’- used as a transfection reagent, following the
TTCCATGGCGGCGTCGGAGCAGGGACC manufacturer’s instructions.
-3’ and Rv: 5’-
AGAAGCTTCTAGGAAGACACCTTCTTG Immunohistochemistry
GGCTC-3’. Polyclonal antibody was To label the mitochondrial compartment, cells
generated using standard procedures. were incubated for 30 min with 250 nM of the
mitochondrial dye MitoTraker red (Invitrogen)
Constructs for the generation of transgenic 24 h after transfection, washed, and fixed for
flies 15 min in 2% paraformaldehyde. Primary anti-
The bicistronic ccdc56-mtTFB1 cDNA (1574 FLAG antibody (1:1000, Stratagene) and
bp) was obtained from the cDNA clone secondary Alexa Fluor 488 anti-mouse
LD40326 (GenBank AY069635) and cloned antibody (1:200, Molecular Probes) were used.
into the BglII/XbaI restriction sites of the Images were collected using a Confocal
pUAST transformation vector to generate the microscope (Leica).
pUAST-cDNA-bi construct. To generate the Imaginal discs from third instar larvae of each
pUASP-ccdc56 vector for transformation, a genotype were dissected in PBS and fixed with
fragment containing exclusively the complete 4% paraformaldehyde in PBS for 20 min at
ccdc56 ORF (261 bp), was amplified by PCR room temperature. They were blocked in PBS,
using the following primers: 9558F: 5’- 1% bovine serum albumin, 0.3% Triton X-100
TTTAGCAGCGTTTATAATGTCG-3’ and for 1 h, incubated with the primary antibody
9559R: 5’- overnight at 4°C (dilution 1:50), washed, and
TAGGGATAACTAACGCGGACA-3’, incubated with the appropriate secondary
subcloned into the pCAP vector (Roche) and antibody for 2 h at room temperature in the
cloned into the NotI/XbaI restriction sites in dark (dilution 1:200). Finally, they were
the pUASP vector. To generate the pUASP- washed and mounted in Vectashield (Vector
mtTFB1 construct, mtTFB1 ORF (990 bp) was Laboratories). Primary antibodies used were
obtained by digestion with KpnI/NotI of the rabbit anti-phosphohistone 3 (Sigma-Aldrich)
pBluescript II KS+ vector (Stratagene) and rabbit anti-caspase 3 (Cell Signaling
containing the mtTFB1 cDNA and cloned into Technology). Secondary antibodies were
the pUASP vector for transformation. coupled to the fluorochromes Alexa Fluor 647
(Invitrogen) or Alexa 555 (Invitrogen).
Drosophila CCDC56-FLAG construct Preparations were visualized under a Leica
D. melanogaster CCDC56 ORF was amplified TCS SP2 laser-scanning microscope.
by PCR from the pUASP-ccdc56 construct
indicated above, using the following primers: Mitochondrial enzyme assays and mtRNA
F 5’- and mtDNA quantification
TTGGTACCATGTCGGCGTCGGAGCAGG For enzymatic activity measurements,
GACC-3’ and R 5’- mitochondria-enriched homogenates were
TTGCGGCCGCCTACTTGTCGTCATCGT prepared from approximately 30 third instar
CTTTGTAGTCGGAAGACACCTTCTTGGG larvae ground in SETH buffer (250 mM
CTCC-3’containing the FLAG epitope at the sucrose, 2 mM EDTA, 100 U/L heparin, 10
C-terminal and the KpnI/NotI sites needed for mM Tris-HCl, pH 7.4), fractionated by
cloning into the mammalian expression vector differential centrifugation and sonicated (6s,
pcDNA3 (Invitrogen). Fidelity of the clones 15 microns at 4ºC). The activities of the
was confirmed by sequencing. respiratory chain complexes I, II, III and IV
and the mitochondrial mass marker citrate
Transfection and generation of CCDC56- synthase were measured by
FLAG overexpressing cell lines spectrophotometric methods as previously
described (37) and expressed in nanomoles of
176
Anexos
substrate catalyzed per minute per milligram PAGE) were performed as described (38),
of protein. For mtRNA quantification, RNA loading 40 µg of mitochondrial protein per
was extracted using TRIzol reagent lane. A 4-18% native acrylamide gradient gel
(Invitrogen) and 1 µg from each genotype was was used for the first dimension and 10%
converted into cDNA and amplified in a 7900 acrylamide gels were used for electrophoresis
Fast Real Time PCR System (Applied in the second dimension. Proteins were
Biosystems) using the Taqman probes listed in transferred overnight to a nitrocellulose
Table S3. For relative quantification of membrane. Anti mt-CO3 (Invitrogen) was
mtDNA, genomic DNA was isolated from used at a 1:200 dilution; polyclonal antibody
third instar larvae and quantified using against β-ATPase, generated in our lab (39)
standard methods. Ten ng of each DNA were was used at 1:1000, and secondary goat-anti
used as template. Taqman probes for mt-ND5 mouse antibody IgG-HRP (provided by
and mt-CO1 were used (Table S3). Zymed Laboratories) was used at 1:2000.
In-gel activity assays (IGAs) for Complex I
Immunoblotting/ subcellular fractionation and IV were performed as described in (38)
Thirty µg of each mitochondrial protein using 60 µg of mitochondrial protein per lane.
extract, obtained by differential centrifugation,
were separated on 10% or 15% SDS-PAGE Statistical analysis
gels and transferred to Immobilon P PVDF Statistical data analysis was performed with
membranes (Millipore). Filters were pre- Prism 4.03 software (GraphPad Software).
incubated for 1 h in 5% skim milk in TBS- One-way ANOVA (plus Bonferroni post-test)
0.1% Tween 20, followed by an overnight and Student´s t-test were used to determine
incubation with the corresponding primary statistical significance of the results, which
antibody. Monoclonal antibody against Porin was assumed at p <0.05.
(1:2000, VDAC) was obtained from Molecular
Probes, polyclonal antibody against d- RESULTS
CCDC56 was generated as described above
(1:50), and polyclonal antibody anti-mtTFB1 The D. melanogaster gene CG42630 is
was previously generated by Dr. L. Kaguni expressed in a bicistronic mRNA with
(1:1000, (32)). For subcellular fractionation, mtTFB1 and encodes a novel conserved
Drosophila melanogaster embryos were protein, CCDC56.
homogenized in 250 mM sucrose, 10 mM TES A search in the Drosophila genome
and 1mM EDTA pH 7.4 with 5 strokes at 1000 database (http://flybase.org) indicated the
rpm using a motor-driven Teflon pestle. existence of an upstream Open Reading Frame
Homogenates were then centrifuged at 900g (uORF) in the 5’-UTR of the mtTFB1
for 10 minutes at 4ºC and the supernatant was transcript located in the first exon of the
centrifuged again at 9000g for 10 minutes at mRNA (Fig1A). This putative polypeptide is
4ºC to obtain the mitochondrial fraction denoted as CG42630 in FlyBase, and the
(pellet) and post-mitochondrial supernatant. biological processes in which it is potentially
Fifty µg of each fraction were loaded onto involved are unknown. To confirm the
12% SDS-PAGE gels, transferred to PVDF existence of a bona fide bicistronic transcript
membranes and probed with anti- Porin of CG42630-mtTFB1, we isolated mRNA
(1:1000), anti-GAPDH (1:1000, Stressgene) from Drosophila strains and from Drosophila
and anti-d-CCDC56 (1:50) antibodies. SL2 Schneider cells, and carried out Rapid
Amplification of cDNAs ends (RACE, Fig1B),
Blue native gel analyses using the strategy described in Materials and
Mitochondrial pellets isolated from larvae Methods. We sequenced the cDNA clones
were resuspended in 1.5 M aminocaproic acid, obtained by 5’-RACE from different
75 mM Bis-Tris (pH 7.0). Respiratory chain Drosophila strains (w1118, n=8; Oregon R-C,
complexes were extracted with 2% n=6) and from cultured Schneider cells (n=6),
laurylmaltoside for 20 min on ice, and then and in all cases sequence analyses detected a
centrifuged for 30 min at 4ºC. Blue Native single transcript with a heterogeneous
Polyacrilamide Gel Electrophoresis (BN- transcription start point located upstream from
PAGE) and 2D electrophoresis (2D SDS- the CG42630 uORF (Fig1B). We excluded the
177
Anexos
presence of transcripts coding only for pathway or biological process (40). Because
CG42630 by 3’-RACE (data not shown). mtTFB1 is an essential protein involved in
These results suggest strongly that d-mtTFB1 mitochondrial translation, we first examined
and the putative gene, CG42630, are the possibility that CCDC56 is also located in
transcribed in the same mRNA, and therefore mitochondria (32,33). We cloned the
are encoded in a bicistron. We tested the Drosophila CCDC56 ORF tagged with the
existence of this CG42630-mtTFB1 bicistronic Flag epitope (FLAG) at the carboxyterminal
mRNA by Northern blot in total RNA end (d-CCDC56-FLAG), and transiently-
extracted from D. melanogaster flies (Fig1C) transfected cultured HeLa cells (Fig2). Using
using two different probes: a 280 nucleotide anti-FLAG antibodies, we observed a clear
(nt) probe specific for the CG42630 coding colocalization with the mitochondrial-specific
sequence, and a 320 nt probe specific for the dye MitoTracker Red, indicating that the
mtTFB1 coding sequence (see Materials and tagged CCDC56 version has a mitochondrial
Methods). We detected with both probes a localization (Fig2C).
single signal of about the expected size of In order to detect the endogenous
1574 bp (Figure 1A), confirming the existence protein in the fly, we generated a polyclonal
of the CG42630-mtTFB1 bicistronic structure antibody against the Drosophila CCDC56
in D. melanogaster. polypeptide. Immunoblot analysis of
subcellular fractions of wild type embryos
The putative CG42630 gene encodes a demonstrated that endogenous Drosophila
predicted polypeptide of 87 amino acids CCDC56 (d-CCDC56) is expressed and
(http://flybase.org). The deduced amino acid localized to the mitochondrial fraction
sequence from Drosophila CG42630 was used (Fig2D). The protein shows an electrophoretic
to perform a BLAST analysis of the human mobility that corresponds to a molecular mass
genome (35), and a single protein of unknown of approximately 10 KDa, in accordance with
function was identified: the Coiled-Coil the predicted size of the Drosophila CCD56
Domain Containing protein 56, CCDC56. We protein. Monoclonal anti-porin antibody was
found a 42% amino acid identity between D. used as a mitochondrial marker.
melanogaster and its human homolog.
CCDC56 has two putative domains: a single- Generation of ccdc56 knockout alleles
pass transmembrane domain (aa58 to aa78 in To study the in vivo function of
humans and aa49 to aa69 in D. melanogaster) CCDC56 we generated transgenic flies
and a protein-protein interaction coiled-coil harbouring ccdc56 loss-of-function alleles. To
domain (from aa79 to aa104 in humans and generate deletions that affect specifically the
from aa70 to aa 87 in D. melanogaster) ccdc56 gene, we mobilized the P{SUPor-
(Fig1E). We refer to the Drosophila CG42631 P}mtTFB1[KG07792] transposon located in the
gene as ccdc56. proximal 5’-region of the gene using standard
In contrast to the bicistronic structure procedures (34) (FigS1). From approximately
detected in flies, human CCDC56 is encoded 100 independent lines in which the P element
in a single transcript and the gene is located on had been removed, two lines carrying
chromosome 17q.21.31 (Entrez gene ID deletions that map specifically in the ccdc56
28958). Human CCDC56 protein contains 106 coding sequence without affecting the mtTFB1
aa protein (Swiss Prot Q9Y2R0). Orthologous coding sequence, ccdc56D6 and ccdc56D11,
CCDC56 proteins are present in metazoans were selected (Fig3A-C). A Drosophila line
showing a high degree of conservation harbouring an allele in which the P element
(Fig1D), but they are absent in yeast and was excised precisely without removing
plants. No mitochondrial signal peptide was additional DNA sequence was used as a
detected in the amino acid sequences of the control (designated Control 2, Fig3D-E). The
Drosophila and human CCDC56 proteins control flies were obtained by the same
using the bioinformatic programs TargetP and process as those harboring the deletions.
iPSORT. Homozygous ccdc56D6/D6 and ccdc56D11/D11
flies are not viable and die in the third larval
CCDC56 is a mitochondrial protein. instar stage, suggesting that ccdc56 is essential
In prokaryotes, operons encode factors for development. ccdc56D6/D11 trans-
that are usually involved in the same metabolic heterozygotes showed the same lethal
178
Anexos
phenotype as homozygous ccdc56D6/D6 and

ccdc56D11/D11 flies, indicating that these alleles The phenotype of ccdc56D6/D6 and
did not complement each other, which is ccdc56D11/D11 Drosophila lines is produced by
expected if the molecular lesion affects the the absence of CCDC56.
same gene. To map precisely the deletion Because both deletions remove a large
breakpoints, we PCR-amplified and sequenced 5’-region upstream of the ccdc56/ mtTFB1
the genomic region flanking the P element genes that potentially contain critical promoter
(Fig3A-C). The ccdc56D6 allele harbors a 570 elements involved in regulating their
bp-long deletion that includes the ATG- transcription, we used RT-PCR to identify
initiation codon and the first 23 nucleotides of truncated transcripts encoding the mtTFB1
the ORF of CCDC56 (Fig3B). The ccdc56D11 gene in the mutant lines. Interestingly, in both
allele shows a larger deletion of 1068 bp, the homozygous D6 and D11 lines the levels
comprising the complete ccdc56 coding of truncated ccdc56/ mtTFB1 transcript ranged
sequence and the first 26 nucleotides of the between 20-30% as compared to the wild type
intron in the ccdc56-mtTFB1 mRNA (Fig 3C). controls (Fig3E). Detailed analysis using 5’-
RACE revealed the presence of a family of
Phenotype of ccdc56D6/D6 and ccdc56D11/D11 transcripts originating from the 5’-upstream
Drosophila fly lines region close to the breakpoints (Fig3B-C),
Heterozygous ccdc56D6/TM6B-Tb and indicating clearly that these regions still
D11
ccdc56 /TM6B-Tb flies are viable and contain promoter activity. All the detected
fertile, and can be distinguished easily by the transcripts expressed in the mutant lines
genetic marker Tubby (Tb, generating small contained the complete d-mtTFB1 coding
pupa size) that allows classifying the progeny. sequence (Fig3B-C) but as expected, they
When raised at 25ºC, heterozygous mutant lacked the complete ccdc56 coding sequence.
larvae, like control larvae, reached the third Accordingly, no CCDC56 was detected by
larval stage at 4-5 days After Egg Laying immunoblot analysis of mitochondrial extracts
(AEL). However ccdc56D6/D6 and ccdc56D11/D11 from ccdc56D6/ D6 and ccdc56D11/D11 larvae,
homozygotes took between 10-12 days to indicating that both are ccdc56 null alleles
reach the third larval stage, monitored by (Fig3F); in contrast, mtTFB1 is present in
analyzing the mouth hook morphology mitochondrial extracts prepared from the
(Fig4B), indicating a developmental delay (see mutant larvae (Fig3F).
FigS2). Homozygous ccdc56D6/D6 and To demonstrate further that the lethal
D11/D11
ccdc56 third instar larvae were much phenotype observed in the mutants isolated in
smaller than controls, remained in this stage our screen was due exclusively to the loss of
for over 20 days and then died before CCDC56 function, we overexpressed
pupariation (Fig4A and FigS2). We used the independently ccdc56 or mtTFB1 in both D6
ccdc56D11/D11 mutant to perform and D11 homozygous genetic backgrounds.
immunocytochemical analysis in wing We cloned the ccdc56 and mtTFB1 coding
imaginal discs, the proliferating larval sequences in the pUASP vector and generated
epithelial cells that form the adult wings of the several UAS-CCDC56 and UAS-mtTFB1
fly. Mutant imaginal discs were smaller than transgenic lines (See Materials and Methods).
controls. Indeed, mutant wing discs showed a We selected two independent lines for each
decreased number of mitotic cells, as seen by a transgene that were viable upon homozygosis,
reduction in the number of cells that express and we generated stable stocks carrying these
phosphorylated Histone 3, a mitotic cell UAS constructs in homozygosis on
marker (Fig4C). ccdc56D11/D11 mutants also chromosome II, and the ccdc56D6 or ccdc56D11
showed increased levels of apoptosis in the alleles balanced over the TM6B-Tb
wing discs as detected with an antibody that chromosome on chromosome III (See FigS3A-
recognizes activated Caspase3, whereas cell B). To direct the expression of the transgenic
death in control wing discs was minimal UAS constructs we used the ubiquitous arm-
during most of the larval development GAL4 driver, in which expression of the
(Fig4D). These results indicate that two of the transcription activator factor GAL4 is driven
processes that contribute to tissue growth, cell by the armadillo promoter (ß-catenin homolog
division and cell survival, are compromised in in mammals; FigS3C). We found that
the ccdc56D11/D11 mutant. homozygous mutant larvae carrying one copy
179
Anexos
each of the UAS-CCDC56 and the arm-GAL4 To study the effect of the absence of
transgenes developed beyond the third larval CCDC56 on mitochondrial function we
stage, reaching the pupal stage (Fig5A). Two measured the OXPHOS enzyme activities in
independent transgenic lines expressing control and homozygous mutant third instar
CCDC56 produced 62.8 ± 1.8 % and 55.9 ± larvae. Both ccdc56D11/D11 and ccdc56D6/D6
4.8% of the homozygous mutant pupae mutant larvae showed a dramatic reduction in
progeny expected for a neutral allele (Table 1). cytochrome c oxidase (COX, complex IV,
However, the UAS-mtTFB1 construct directed CIV) activity (Fig6A). The decrease in COX
by the same driver was not able to rescue activity was almost complete when activities
lethality at the third larval stage for mutants were normalized with respect to citrate
carrying the D6 or D11 deletion allele (to synthase activity, an indicator of total
simplify, only data are shown regarding the mitochondrial mass (data not shown). This
ccdc56D11 allele, Table 1 and Fig5A). The decrease in COX activity in ccdc56D11/D11
presence in a mutant background of a copy mutant larvae was confirmed by Blue Native
only of the arm-GAL4 driver or a copy only of PAGE in combination with in-gel activity
the UAS-CCDC56 construct did not rescue assays (IGAs, Fig6B). Interestingly, the
mutant lethality. Accordingly, all pupae scored enzyme activities of the remaining OXPHOS
in the vials were heterozygous for the mutant complexes were either unaffected or increased
allele (Table 1 and Fig5A). significantly (complexes I and II in
Quantification of transcript levels by ccdc56D11/D11 mutants, Fig6A), a result that
qRT-PCR in homozygous third instar larvae of may reflect a compensatory response to the
the different genotypes showed that the arm- dramatic reduction of COX activity in the
GAL4 driver restores ccdc56 mRNA levels to mutants. Accordingly, complex I activity of
73.9% ± 0.1 of controls in a D11 mutant the mutants was increased in the native gels
background (Fig5B, white bar). Despite this (Fig6B). Most interestingly, a huge increase
increase in mRNA levels, CCDC56 protein (4-5 fold) in mtDNA levels was also observed
measured by immunoblot analysis was in mutant mitochondria as compared to
increased only to 15% of control levels controls (Fig6C). In addition, a moderate
(Fig5C). This result indicates that the increase was observed in the steady-state
induction of low levels of CCDC56 is levels of mitochondrial RNA (mtRNA)
sufficient to rescue the developmental arrest of transcripts (Fig6D), including the small
the ccdc56D11/D11 mutant, permitting pupation ribosomal RNA (rRNA-12S) and the
of the larvae and most of the metamorphosis cytochrome c oxidase transcripts mt-CO1, mt-
program of the flies (Fig5A). The fact that the CO2 and mt-CO3 that are increased 2-to-2.5-
rescue of lethality was not complete may be fold (Fig6D). The increased mtRNA transcript
explained by the slight increase of the levels in both mutants were confirmed by
CCDC56 protein obtained under these Northern-blot analyses (data not shown).
conditions. Accordingly, by restoring The ubiquitous expression of the UAS-
CCDC56 to control levels (by inducing the CCDC56 construct in a ccdc56D11/D11 genetic
expression of the bicistron), we obtained a background induced a significant increase in
stronger rescue of lethality: 96.77% ± 1.6 of COX enzyme activity (37.4% ± 0.043 vs
the ccdc56D11/D11 mutant progeny reached the 19.5% ± 0.040; Fig7C). As expected,
pupal stage and 34.5% ± 4.5 reached the adult expression of the UAS-mtTFB1 construct
stage (FigS4). As expected, the transcript under the same conditions had no effect,
levels assessed with the probe that recognizes showing similar levels of COX activity as the
the bicistronic mRNA were nearly absent in mutants (14.3% ± 0.043 Fig7C). These results
the D11 homozygous larvae for all transgene suggest strongly that CCDC56 is required for
combinations, as the D11 deletion (shown in cytochrome c oxidase function in Drosophila
Fig3C) includes part of the recognition melanogaster.
sequence for this probe (Fig5B, grey bars;
Fig3E probe1). ccdc56 knockout flies show a severe
reduction of fully-assembled complex IV
ccdc56 knockout flies show a severe isolated Because the only OXPHOS complex
cytochrome c oxidase deficiency. affected in ccdc56 knockout flies is complex
180
Anexos
IV, we next explored by Blue Native-PAGE analyses showed that this organization is also
analysis if the assembly of this complex was present in the other 11 Drosophila species for
affected in the mutants. Several antibodies which sequence data is available (data not
against mammalian mitochondrial and nuclear- shown). Northern blot and RACE experiments
encoded COX subunits were tested against demonstrate that ccdc56 and mtTFB1 are
Drosophila protein extracts, but unfortunately encoded on the same functional bicistronic
most showed little or no cross reactivity (data transcript in D. melanogaster. Although the
not shown). To determine the levels of fully- presence of operon-like structures is not
assembled complex IV in our mutant flies we frequent in eukaryotes, a comparative
performed 2D Blue Native PAGE followed by evolutionary study of 12 Drosophila genomes
immunoblot analysis with an anti-mt-CO3 predicted the presence of 123 novel
antibody that was able to recognize polycistronic transcripts (41). More recently,
Drosophila mt-CO3. In ccdc56D11/D11 and another comparative genomic approach using
ccdc56D6/D6 mitochondria, we observed a D. melanogaster and Anopheles gambiae
dramatic decrease in the levels of fully- transcript annotations and dipteran expressed
assembled holo-COX (indicated by complex sequence tags was performed in order to
S4, Fig7A). However, we did not detect the identify transcripts with upstream Open
accumulation of any subcomplex or putative Reading Frames (uORFs). Interestingly, in
assembly intermediate in our mutants, at least dipterans conserved uORFs occur
under the conditions tested (Fig7A). To preferentially in transcripts encoding
demonstrate that the absence of CCDC56 mitochondrial proteins and methyltransferases
function was responsible for the mutant CIV (42). The uORF usually encodes smaller
assembly defect, we attempted to rescue this proteins than those encoded in the main ORF
phenotype by inducing the ubiquitous (mORF). Some examples in Drosophila are
expression of a UAS-CCDC56 transgene in a the translocase of the inner membrane 10, Tim
mutant background. Consistent with our 10 (Flybase annotation: CG9878), and the
hypothesis, we observed a recovery of fully- translocase of the inner membrane 9b, Tim 9b
assembled complex IV levels in mutants (CG17767). It is possible that at least some of
expressing UAS-CCDC56 (Fig7A, third these uORFs are vestiges of ancient
panel), but not when we overexpressed prokaryotic operons that originated in the
mitochondrial translation factor B1 (Fig7A, mitochondrion and were transferred to the
fourth panel). This result indicates that nuclear genome over time. Another possible
CCDC56 is required for the proper assembly explanation would be that these structural
and/ or stability of mitochondrial complex IV organizations favor a coordinated regulation of
in Drosophila melanogaster. genes involved in similar biochemical
pathways (23).
DISCUSSION We further investigated if this novel
peptide is targeted to the mitochondrial
We have identified in D. melanogaster compartment, like mtTFB1, by transfecting
a novel mitochondrial protein, CCDC56, HeLa cells with a recombinant d-
which is evolutionarily well conserved in CCDC56FLAG-tagged protein. We observed a
metazoans. CCDC56 belongs to the Coiled- clear mitochondrial localization of CCDC56,
Coil Domain Containing family of proteins and in addition we detected by
and although its function is unknown, we immunoblotting the endogenous CCDC56
found that loss of CCDC56 results in a severe only in the mitochondrial fraction. Therefore,
isolated enzyme deficiency and assembly and in agreement with the results obtained in
defect of mitochondrial cytochrome c oxidase. the comparative genomic study, we describe
This indicates that CCDC56 plays a critical here a new case of a bicistronic transcript in
role in the biogenesis and activity of complex which both proteins have a mitochondrial
IV, and is therefore essential for the function function. To our knowledge, this is the first
of the OXPHOS system. demonstration of a eukaryotic bicistron in
In D. melanogaster, CCDC56 is which both proteins have a mitochondrial
annotated in a single transcription unit together function that is demonstrated to be functional
with mitochondrial transcription factor B1 in vivo.
(Flybase, http://www.flybase.org). Blast
181
Anexos
We explored the consequences of the significant increase in mtDNA, in

lack of function of mitochondrial protein mitochondrial transcript levels, in OXPHOS
CCDC56 by generating two independent activities in complexes I and II, and in levels
Drosophila knockout lines via inducing the of fully-assembled complex V. The molecular
excision of a P element located in the promoter nature of this retrograde signaling is presently
region of the ccdc56-mtTFB1 genes. Its unknown.
imprecise excision removed part of the The OXPHOS defect caused by the
flanking DNA and therefore generated specific CIV deficiency may be responsible for the
deletions. Transcripts detected by RACE in the developmental delay and 100% lethality in the
ccdc56D6 knockout line lack the first 23 third larval instar observed in ccdc56 knockout
nucleotides and therefore the translation start individuals. Mutant wing discs showed a
codon of ccdc56, while no ccdc56 containing reduced size, a decrease in cell proliferation
transcripts were detected in the ccdc56D11 and an increase in apoptosis levels as
knockout line. As expected, CCDC56 was not compared to controls. Larval to adult
detected in mitochondrial extracts from any of metamorphosis, which occurs during the pupal
the mutant lines, indicating a total absence of phase, is a high-energy requiring process.
CCDC56 protein in homozygous ccdc56D6 and Thus, defects in the OXPHOS system, and
ccdc56D11 animals. Furthermore, we have consequently defects in ATP production, may
demonstrated that both mutant lines retained be critical for successful completion of this
mtTFB1-encoding transcripts and mtTFB1 developmental phase. This is supported by the
protein, although in lower levels as compared phenotype observed in several other
to controls. Finally, we used the UAS-GAL4 Drosophila mitochondrial gene mutants. For
system (43) to promote independent example, knockdown of mtTFB2, which
expression of CCDC56 or mtTFB1 in a mutant encodes the mitochondrial transcription factor
background. Overexpression of CCDC56 but B2, or mutations in mitochondrial single-
not mtTFB1 rescued all mutant phenotypes: stranded DNA-binding protein, both involved
developmental delay, larval lethality, in mtDNA replication, also cause a
decreased complex IV enzyme activity and developmental delay and a developmental
reduction in the levels of fully-assembled arrest in the third larval instar (44;45).
complex IV. Previous results have shown that Complex IV assembly was studied
mtTFB1 is essential for mitochondrial initially by Nijtmans and colleagues (46), and
translation and more specifically for the subsequently by others (47) using Blue Native
stability of the small subunit of the gel electrophoresis in human cell lines or
mitochondrial ribosomes (12S rRNA) (32,33). tissues from patients with genetic defects in
Thus, if the functionality of mtTFB1 were assembly factors (reviewed in (7) and (48).
affected in these alleles, we would expect a These studies describe complex IV biogenesis
broader mitochondrial phenotype, not simply as a sequential process involving four
an isolated complex IV deficiency. intermediates, S1 to S4. The process starts
Biochemical measurements and in-gel activity with the incorporation of the prosthetic groups
assays showed no decrease in the other into mt-CO1 to form the subassembly
respiratory chain complex activities in mutant intermediate S1. The last intermediate, S4 or
animals, nor in complex V levels detected by holo-COX, constitutes the monomeric form of
Blue Native PAGE, which were even higher in COX that subsequently dimerizes to form the
the mutants. Taken together, our results active complex (46). Fully-assembled holo-
indicate clearly that the phenotypes exhibited COX levels were decreased greatly in
by the mutants were due exclusively to loss of homozygous ccdc56D11 knockout larvae, as
CCDC56 function. assessed by 2D Blue Native electrophoresis
The main biochemical phenotype of using an anti-mt-CO3 antibody. As expected,
the lack of CCDC56 is a severe isolated fully-assembled complex IV levels were
complex IV deficiency, suggesting a role for restored partially by the ubiquitous expression
CCDC56 in complex IV activity and of a UAS-ccdc56 transgene in the mutant
consequently in the proper function of the background. These results indicate that
OXPHOS system. Interestingly, in ccdc56 CCDC56 is essential for the formation or
knockout animals the OXPHOS defect elicits a stabilization of complex IV. No subassembly
compensatory response that causes a intermediates were detected under these
10
182
Anexos
conditions. mt-CO3 is incorporated into the S3 to explore these possibilities. Notably,

intermediate, as indicated by the absence of increasing number of essential assembly
fully-assembled holo-COX and the factors for the biogenesis of a functional
accumulation of S1 and S2 in cultured cytochrome c oxidase have been identified in
fibroblasts from patients lacking mt-CO3 (49), S. cerevisiae (10). We found by Blast analysis
and reviewed in (50) and (48). Unfortunately, that CCDC56 homologues are present in
we tried several antibodies against other metazoans that show high conservation levels.
complex IV subunits with no success, so we However, no CCDC56 homologue was
cannot rule out the possible accumulation of detected in yeast. The absence of a CCDC56
other subassembly intermediates not homologue in yeast might be due to a low
containing mt-CO3 and thus, a role for evolutionary conservation or could suggest the
CCDC56 in the early steps of complex IV presence of novel levels of regulation of the
biogenesis. complex IV assembly process in metazoans,
Although the function of CCDC56 in thus highlighting the importance of using
flies remains unknown, because ccdc56 different model systems for the identification
knockout strains have extremely low levels of of the complete mitochondrial proteome.
fully assembled complex IV it is tempting to In conclusion, we have identified
suggest that CCDC56 constitutes a new CCDC56 as a novel mitochondrial protein
complex IV assembly factor. In this regard, essential for cytochrome c oxidase activity in
CCDC56 might participate in various steps of D. melanogaster and hence OXPHOS
complex IV biogenesis: synthesis of function. The high degree of conservation
mitochondrial COX subunits, synthesis of between the human and Drosophila proteins
COX cofactors, the stability of different COX suggests strongly that the biological function
subunits or their assembly into a functional of CCDC56 has been preserved in metazoans,
holoenzyme. We suggest that it may function making CCDC56 a new candidate gene to
as a translational activator similar to TACO1 study in human mitochondrial diseases
(20), or as a membrane insertion factor like involving isolated cytochrome c oxidase
OXA1 (51). Future experiments are warranted deficiency.
11
183
Anexos
REFERENCES
1. Wallace, D. C., Fan, W., and Procaccio, V. (2010) Annu Rev Pathol 5, 297-348
2. DiMauro, S., and Hirano, M. (2005) Neuromuscul Disord 15, 276-286
3. Zeviani, M., and Carelli, V. (2007) Curr Opin Neurol 20, 564-571
4. DiMauro, S., and Schon, E. A. (2003) N Engl J Med 348, 2656-2668
5. Schaefer, A. M., McFarland, R., Blakely, E. L., He, L., Whittaker, R. G., Taylor, R. W.,
Chinnery, P. F., and Turnbull, D. M. (2008) Ann Neurol 63, 35-39
6. Shoubridge, E. A. (2001) Am J Med Genet 106, 46-52
7. Diaz, F. (2010) Biochim Biophys Acta 1802, 100-110
8. Tsukihara, T., Aoyama, H., Yamashita, E., Tomizaki, T., Yamaguchi, H., Shinzawa-Itoh, K.,
Nakashima, R., Yaono, R., and Yoshikawa, S. (1995) Science 269, 1069-1074
9. Szuplewski, S., and Terracol, R. (2001) Genetics 158, 1629-1643
10. Fontanesi, F., Soto, I. C., and Barrientos, A. (2008) IUBMB Life 60, 557-568
11. Galati, D., Srinivasan, S., Raza, H., Prabu, S. K., Hardy, M., Chandran, K., Lopez, M.,
Kalyanaraman, B., and Avadhani, N. G. (2009) Biochem J 420, 439-449
12. Arnold, S., and Kadenbach, B. (1997) Eur J Biochem 249, 350-354
13. Kadenbach, B., Huttemann, M., Arnold, S., Lee, I., and Bender, E. (2000) Free Radic Biol Med
29, 211-221
14. Massa, V., Fernandez-Vizarra, E., Alshahwan, S., Bakhsh, E., Goffrini, P., Ferrero, I., Mereghetti,
P., D'Adamo, P., Gasparini, P., and Zeviani, M. (2008) Am J Hum Genet 82, 1281-1289
15. Barrientos, A., Gouget, K., Horn, D., Soto, I. C., and Fontanesi, F. (2009) Biochim Biophys Acta
1793, 97-107
16. Papadopoulou, L. C., Sue, C. M., Davidson, M. M., Tanji, K., Nishino, I., Sadlock, J. E., Krishna,
S., Walker, W., Selby, J., Glerum, D. M., Coster, R. V., Lyon, G., Scalais, E., Lebel, R., Kaplan, P.,
Shanske, S., De Vivo, D. C., Bonilla, E., Hirano, M., DiMauro, S., and Schon, E. A. (1999) Nat Genet 23,
333-337
17. Valnot, I., von Kleist-Retzow, J. C., Barrientos, A., Gorbatyuk, M., Taanman, J. W., Mehaye, B.,
Rustin, P., Tzagoloff, A., Munnich, A., and Rotig, A. (2000) Hum Mol Genet 9, 1245-1249
18. Antonicka, H., Mattman, A., Carlson, C. G., Glerum, D. M., Hoffbuhr, K. C., Leary, S. C.,
Kennaway, N. G., and Shoubridge, E. A. (2003) Am J Hum Genet 72, 101-114
19. Stiburek, L., Vesela, K., Hansikova, H., Hulkova, H., and Zeman, J. (2009) Am J Physiol Cell
Physiol 296, C1218-1226
20. Weraarpachai, W., Antonicka, H., Sasarman, F., Seeger, J., Schrank, B., Kolesar, J. E.,
Lochmuller, H., Chevrette, M., Kaufman, B. A., Horvath, R., and Shoubridge, E. A. (2009) Nat Genet 41,
833-837
21. Xu, F., Addis, J. B., Cameron, J. M., and Robinson, B. H. (2011) Biochem J
22. Xu, F., Morin, C., Mitchell, G., Ackerley, C., and Robinson, B. H. (2004) Biochem J 382, 331-
336
23. Blumenthal, T. (2004) Brief Funct Genomic Proteomic 3, 199-211
24. Andrews, J., Smith, M., Merakovsky, J., Coulson, M., Hannan, F., and Kelly, L. E. (1996)
Genetics 143, 1699-1711
25. Brogna, S., and Ashburner, M. (1997) EMBO J 16, 2023-2031
26. Betran, E., and Ashburner, M. (2000) Mol Biol Evol 17, 1344-1352
27. Estes, P. S., Jackson, T. C., Stimson, D. T., Sanyal, S., Kelly, L. E., and Ramaswami, M. (2003)
Genetics 165, 185-196
28. Scarpulla, R. C. (2008) Physiol Rev 88, 611-638
29. Falkenberg, M., Gaspari, M., Rantanen, A., Trifunovic, A., Larsson, N. G., and Gustafsson, C. M.
(2002) Nat Genet 31, 289-294
30. Seidel-Rogol, B. L., McCulloch, V., and Shadel, G. S. (2003) Nat Genet 33, 23-24
12
184
Anexos
31. Cotney, J., and Shadel, G. S. (2006) J Mol Evol 63, 707-717
32. Matsushima, Y., Adan, C., Garesse, R., and Kaguni, L. S. (2005) J Biol Chem 280, 16815-16820
33. Metodiev, M. D., Lesko, N., Park, C. B., Camara, Y., Shi, Y., Wibom, R., Hultenby, K.,
Gustafsson, C. M., and Larsson, N. G. (2009) Cell Metab 9, 386-397
34. Engels, W. R., Johnson-Schlitz, D. M., Eggleston, W. B., and Sved, J. (1990) Cell 62, 515-525
35. Altschul, S. F., Madden, T. L., Schaffer, A. A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W., and Lipman, D.
J. (1997) Nucleic Acids Res 25, 3389-3402
36. Thompson, J. D., Higgins, D. G., and Gibson, T. J. (1994) Nucleic Acids Res 22, 4673-4680
37. Perez-Carreras, M., Del Hoyo, P., Martin, M. A., Rubio, J. C., Martin, A., Castellano, G., Colina,
F., Arenas, J., and Solis-Herruzo, J. A. (2003) Hepatology 38, 999-1007
38. Calvaruso, M. A., Smeitink, J., and Nijtmans, L. (2008) Methods 46, 281-287
39. Pena, P., and Garesse, R. (1993) Biochem Biophys Res Commun 195, 785-791
40. Overbeek, R., Fonstein, M., D'Souza, M., Pusch, G. D., and Maltsev, N. (1999) Proc Natl Acad
Sci U S A 96, 2896-2901
41. Stark, A., Lin, M. F., Kheradpour, P., Pedersen, J. S., Parts, L., Carlson, J. W., Crosby, M. A.,
Rasmussen, M. D., Roy, S., Deoras, A. N., Ruby, J. G., Brennecke, J., Hodges, E., Hinrichs, A. S., Caspi,
A., Paten, B., Park, S. W., Han, M. V., Maeder, M. L., Polansky, B. J., Robson, B. E., Aerts, S., van
Helden, J., Hassan, B., Gilbert, D. G., Eastman, D. A., Rice, M., Weir, M., Hahn, M. W., Park, Y.,
Dewey, C. N., Pachter, L., Kent, W. J., Haussler, D., Lai, E. C., Bartel, D. P., Hannon, G. J., Kaufman, T.
C., Eisen, M. B., Clark, A. G., Smith, D., Celniker, S. E., Gelbart, W. M., and Kellis, M. (2007) Nature
450, 219-232
42. Hayden, C. A., and Bosco, G. (2008) BMC Genomics 9, 61
43. Brand, A. H., and Perrimon, N. (1993) Development 118, 401-415
44. Adan, C., Matsushima, Y., Hernandez-Sierra, R., Marco-Ferreres, R., Fernandez-Moreno, M. A.,
Gonzalez-Vioque, E., Calleja, M., Aragon, J. J., Kaguni, L. S., and Garesse, R. (2008) J Biol Chem 283,
12333-12342
45. Maier, D., Farr, C. L., Poeck, B., Alahari, A., Vogel, M., Fischer, S., Kaguni, L. S., and
Schneuwly, S. (2001) Mol Biol Cell 12, 821-830
46. Nijtmans, L. G., Taanman, J. W., Muijsers, A. O., Speijer, D., and Van den Bogert, C. (1998) Eur
J Biochem 254, 389-394
47. Fornuskova, D., Stiburek, L., Wenchich, L., Vinsova, K., Hansikova, H., and Zeman, J. (2010)
Biochem J 428, 363-374
48. Fernandez-Vizarra, E., Tiranti, V., and Zeviani, M. (2009) Biochim Biophys Acta 1793, 200-211
49. Tiranti, V., Corona, P., Greco, M., Taanman, J. W., Carrara, F., Lamantea, E., Nijtmans, L.,
Uziel, G., and Zeviani, M. (2000) Hum Mol Genet 9, 2733-2742
50. Fontanesi, F., Soto, I. C., Horn, D., and Barrientos, A. (2006) Am J Physiol Cell Physiol 291,
C1129-1147
51. Bonnefoy, N., Fiumera, H. L., Dujardin, G., and Fox, T. D. (2009) Biochim Biophys Acta 1793,
60-70
ACKNOWLEDEMENTS
We thank Verónica Domingo for her excellent technical assistance and Dr. Francisca Diaz for critical
reading of the manuscript.
FOOTNOTES
This work was supported by grants from the Center for Biomedical Research on Rare Diseases
(CIBERER), Instituto de Salud Carlos III (grants PI 07/0167 and PI 10/0703 to R.G), the Comunidad de
Madrid (grant number GEN-0269/2006 to R.G.), ISCIII-Agencia Laín Entralgo (grant number PI08/0021
13
185
Anexos
to C. U.) and from the National Institutes of Health (grant GM45295 to L.S.K.). S.P. was a postdoctoral
fellow from CIBERER.
FIGURE LEGENDS
Fig1. The protein CCDC56, encoded in a bicistronic transcript together with mt-TFB1 in D.
melanogaster, is conserved in metazoans.
A) Genomic map of CG42630/ccdc56 and mtTFB1. Exons are indicated by boxes, coding regions are
colored black for the CCDC56 and mtTFB1 proteins, and untranslated regions are represented in white.
B) Bicistronic transcript determined by 5´-RACE from control flies (w1118 and OregonR-C) and cultured
Schneider cell cDNAs. The transcription start points identified are depicted as (+1). The primers R1, R2
and R3 used are represented in A. C) Bicistronic ccdc56-mtTFB1 mRNA detected by Northern blot using
5 g of RNA fromw1118 (C1) and OregonR-C (C2) control larvae. The signal detected using a specific
ccdc56 probe has the same migration as the signal detected when using a probe specific for mtTFB1. D)
ClustalW alignment of Drosophila CCDC56 protein with CCDC56 sequences from other metazoan
species. Accession numbers are as follows: fly (D. melanogaster)-CG42630-PA; zebrafish (Danio rerio)-
A8kB87; western clawed frog (Xenopus tropicalis)-A9UMl0-1; mouse (Mus musculus)-NP_080894.1;
cow (Bos taurus)-Q3T0E3; human (Homo sapiens)-NP_001035521.1. Identical residues in all sequences
(*), conserved substitutions (:) and semi-conserved substitutions (.) are noted in the alignment. E)
Schematic diagram of the sequences of the human and Drosophila melanogaster CCDC56 proteins,
showing the putative transmembrane and protein-protein interaction coiled-coil domains.
Fig2. CCDC56 protein localizes to mitochondria.

Immunocytochemistry of HeLa cells transfected with recombinant d-CCDC56-FLAG. A) MitoTracker
staining is shown in red. B) The same cells immunostained for the FLAG epitope (green). The
recombinant Drosophila protein colocalizes with the MitoTraker dye in the mitochondrial compartment
(C). D) Immunoblots of protein extracts (50 µg) from subcellular fractions of control embryos, probed
with anti-Drosophila-CCDC56 (d-CCDC56), anti-porin and anti-GAPDH antibodies. Total extracts,
mitochondrial fraction (Mit) and post-mitochondrial supernatant (PMS) are shown.
Fig3. Molecular characterization of the ccdc56D6 and ccdc56D11 alleles.

A) Genomic map of the ccdc56 and mtTFB1 genes showing the P element insertion (SUPor-P[kg07792];
triangle). Exons are indicated by boxes, coding regions are colored black for the CCDC56 and mtTFB1
proteins, and untranslated regions are represented in white. 5´-RACE from control (w1118) and mutant
(ccdc56D6 and ccdc56D11) homozygous third instar larvae cDNAs identified the transcription start points
depicted as (+1). The break points of the deletions generated in this work for the alleles ccdc56D6 and
ccdc56D11 are shown in B) and C), respectively. The ratios of the mRNA as determined by 5´-RACE in
the clones analyzed are represented (ccdc56D6/D6, n=8; ccdc56D11/D11, n=10). PCR products amplified with
F5 and R4 primers (shown in A and Table S2) from genomic DNA of third instar larvae are shown in D.
Lane 1: DNA from the stock containing the P-element SUPor-P [kg07792], as a negative control. Lane 2:
DNA from w1118 control flies. Lane 3: DNA from excised flies without any deletion, used as an additional
control. Lane 4: DNA from excised flies of the ccdc56D6/D6 strain, showing a 570 bp deletion. Lane 5:
DNA from excised flies of the ccdc56D11/D11 strain, showing a 1168 bp deletion. E) Transcript levels
determined by qRT-PCR in third instar larvae of control and deleted homozygous lines after normalizing
to w1118 flies using 18S rRNA as an internal control. The two different Taqman probes used are depicted
in B. Control 1: w1118 flies. Control 2: excised flies without any deletion. F) CCDC56 and mtTFB1 protein
levels determined by immunoblotting of mitochondrial extracts (30 µg) of control and deleted
homozygous larvae. Anti VDAC-porin antibody was used as a loading control.
Fig4. Lack of CCDC56 causes arrest at the third larval stage.
14
186
Anexos
A) Size comparison of control (w1118) and homozygous mutant third instar larvae. Homozygous larvae for
both alleles were smaller than control larvae in all cases tested. B) Mouth-hook morphology of control
third instar larvae and mutant 15 days AEL larvae, indicating third instar. C) Wing imaginal discs from
control (w1118) and homozygous ccdc56D11 third instar larvae were dissected and immunostained with
anti-phosphohistone-3 (PH-3) antibody. Mutant wing discs showed lower cell proliferation levels as
compared to controls. D) Anti-caspase-3 activated antibody was used to detect apoptotic signals in wing
imaginal discs. Increased apoptotic levels were observed in homozygous ccdc56D11 flies as compared to
control flies. Bar size is 50 µm.
Table 1. Rescue analysis of ccdc56D11/ccdc56D11 flies.

a
Homozygous ccdc56D11/ccdc56D11 pupae scored/ expected *100 of at least three replicate experiments.
Homozygous ccdc56D11/ccdc56D11 pupae expected are 1/3 of the total progeny of the cross (See FigS4D).
The Tb marker enables the progeny classes to be distinguished.
Fig5. CCDC56 expression rescues partially the mutant lethality phenotype.

A) Flies homozygous for the ccdc56D11 allele reach only the pupal stage when they carry on chromosome
II the UAS-CCDC56 and the arm-GAL4 transgenes. Larvae and pupae homozygous for the allele
ccdc56D11 are of normal size. Larvae and pupae heterozygous for the deletion (genotype ccdc56D11
/TM6B-Tb) carrying one copy of the Tb marker are smaller. B) qRT-PCR of CCDC56, bicistron and
mtTFB1 mRNA relative to 18S rRNA, from homozygous ccdc56D11 third instar larvae combined with the
different UAS-transgenes, and with or without the ubiquitous arm-GAL4 driver. The three Taqman
probes used are depicted in the scheme. Data represent the mean ± SEM of at least three independent
determinations; *p<0.05; **p<0.01; Student's t-test.
C) Immunoblot of mitochondrial extracts (30 µg) from homozygous ccdc56D11 third instar larvae of the
genotypes indicated, incubated with polyclonal anti-mtTFB1 and anti-CCDC56 antibodies, and with
monoclonal anti VDAC-porin antibody.
Fig6. ccd56 knockout flies exhibit an isolated complex IV enzyme deficiency.

A) Respiratory chain enzyme activities (complexes I, II, III and IV) and citrate synthase activity were
measured in mitochondrial extracts obtained from control and ccdc56 knockout third instar larvae of 15
days AEL. Both mutant alleles showed a severe decrease in complex IV enzyme activity. B) BN-PAGE
and in-gel activity assays of complexes I and IV from mitochondrial extracts (60 µg) from control and
ccdc56 knockout third instar larvae. The 880 kDa gel band, corresponding to the ATP synthase (complex
V) is shown as a loading control. C) Quantification of relative mtDNA levels by qRT-PCR using ND5
and COXI as mitochondrial gene probes and 18S rRNA as a nuclear gene probe from control, ccdc56D6/D6
and ccdc56D11/D11 third instar larvae of 15 days AEL. D) Steady-state expression levels of representative
genes from polycistronic transcripts from mitochondrial RNA were measured by qRT-PCR from
ccdc56D6/D6 and ccdc56D11/D11 third instar larvae of 15 days AEL, and are shown relative to the levels
found in control larvae, after normalization to 18S rRNA levels. Control larvae: genotype w1118; D6/D6:
ccdc56D6/D6 and D11/D11: ccdc56D11/D11. Data shown in A, C and D represent the mean ± SEM of at least
three independent determinations; *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001; ANOVA.
Fig7. Loss of ccdc56 induces a complex IV assembly defect.

A) 2D-BN/ SDS-PAGE analysis of mitochondrial extracts immunoblotted with an antibody against the
mitochondrial-encoded subunit mt-CO3 of the cytochrome c oxidase complex. Mitochondria-enriched
extracts were prepared from third instar larvae of the following genotypes: 1-control w1118; 2-mutant
ccdc56D11/D11; 3-mutant ubiquitously expressing the UAS-CCDC56 transgene arm-GAL4/UAS-CCDC56;
ccdc56D11/D11; and 4-mutant larvae expressing the UAS-mtTFB1 transgene under the same condition (arm-
GAL4/UAS-mtTFB1;ccdc56D11/D11). The lack of fully-assembled holo-COX exhibited by the ccdc56D11/D11
mutant is rescued partially by overexpression of the UAS-CCDC56 transgene. S4, fully assembled
15
187
Anexos
complex IV. The previously identified mt-CO3-containing COX subcomplex S3 is indicated. B) First
dimension of a duplicate BN-PAGE of mitochondrial extracts incubated with a polyclonal antibody
against complex V as a loading control for the 2D- BN/ SDS-PAGE shown in A. C) Complex IV enzyme
activity measured in mitochondrial extracts from homozygous ccdc56D11/D11 third instar larvae carrying
the indicated constructs on chromosome II. Data were normalized to control larvae (w1118) and represent
the mean SEM, n=3; *p<0.05; Student's t-test.
16
188
Anexos
Figure 1
17
189
Anexos
Figure 2
18
190
Anexos
Figure 3
19
191
Anexos
Figure 4
20
192
Anexos
Table 1
TABLE 1
Rescue analysis of ccdc56D11/ccdc56D11 flies
Nº of Nº of Nº of Mean (%)
Genotype Chr II ccdc56D11/TM6B-Tb ccdc56D11/ccdc56D11 Total pupae ccdc56D11/ccdc56D11
pupae scored pupae scored scored pupae scored/expecteda ±SEM
+/ + 1306 0 1306 0
+/ arm-GAL4 1527 0 1527 0
UAS-CCDC56-1/ + 1622 0 1622 0
UAS-CCDC56-1/ arm-GAL4 1823 487 2310 62.8 ± 1.8
UAS-CCDC56-2/ + 1786 0 1786 0
UAS-CCDC56-2/ arm-GAL4 1502 356 1858 55.9 ± 4.8
UAS-mtTFB1-1/ + 2039 0 2039 0
UAS-mtTFB1-1/ arm-GAL4 1984 0 1984 0
UAS-mtTFB1-2/ + 1629 0 1629 0
UAS-mtTFB1-2/ arm-GAL4 1626 0 1626 0
21
193
Anexos
Figure 5
22
194
Anexos
Figure 6
23
195
Anexos
Figure 7
24
196

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Departamento de Bioquímica

CCDC56, una proteína esencial para la formación

Paula Clemente Pérez

CCDC56, una proteína esencial para la formación

Memoria presentada por la Licenciada en Bioquímica

CCDC56, una proteína esencial para la formación

En Madrid, a 27 de Febrero de 2012.

Rafael Garesse Alarcón Miguel A. Fernández Moreno

Departamento de Bioquímica UAM

La principal función de la mitocondria es la producción de energía química en forma de

Oligonucleótidos para la secuenciación de CCDC56 en pacientes con 65

1. Falta de función de CCDC56 en Drosophila melanogaster 78

Transfección transitoria de siRNAs en células HeLa y silenciamiento de

1. Identificación de CCDC56 109

2D BN/SDS-PAGE Geles bidimensionales BN/SDS-PAGE

HRP “Horseradish peroxidase”, peroxidasa de rábano

1.1. Origen y evolución de la mitocondria

1.2. Estructura, morfología y distribución de las mitocondrias

1.3. Función mitocondrial

La transferencia de electrones de unos complejos a otros se realiza a favor de potencial

2. Estructura y metabolismo del genoma mitocondrial

2.1. Estructura y herencia del ADN mitocondrial

2.2. Replicación del ADN mitocondrial

Maquinaria basal de replicación del ADN mitocondrial

2.3. Transcripción del ADN mitocondrial

2.4. Traducción mitocondrial

Regulación de la traducción mitocondrial

La identificación de nuevas proteínas reguladoras de la traducción y la caracterización de

3. Biogénesis de los complejos de la cadena respiratoria

3.1. Inserción de las proteínas en la membrana mitocondrial interna

3.2. Ensamblaje de los complejos de la cadena respiratoria

3.3. Biogénesis de la citocromo c oxidasa

Estructura de la citocromo c oxidasa

Ensamblaje de la citocromo c oxidasa

COX1 COX5a COX2 COX2

En S. cerevisiae se han identificado más de 20 proteínas accesorias y factores de ensamblaje

Dado el papel central que la mitocondria desempeña en la fisiología celular, no es de extrañar

5. Drosophila melanogaster como sistema modelo para el estudio

Drosophila melanogaster constituye un excelente modelo para el estudio de procesos biológicos

la secuencia completa de su genoma o el elevado número de herramientas genéticas y moleculares

5.1. Identificación de nuevos genes mitocondriales en Drosophila melanogaster

gatC AUGA pol γ−β

Figura 5. Estructura del ARNm bicistrónico gatC/pol γ-β de Drosophila melanogaster. En D.

CCDC56 codifica una nueva proteína de potencial destino mitocondrial y de función

Drosophila melanogaster ha demostrado ser un buen sistema modelo para la caracterización de

1.1. Reactivos, soluciones y tampones.

1.3. Líneas celulares

1.4. Cepas bacterianas

Oligonucleótidos para el clonaje de CCDC56 en pRSET B

Oligonucleótidos para el clonaje de CCDC56 en pIRESpuro2

Oligonucleótidos para PCR cuantitativa de los ARNm mitocondriales

ND5 Rv 5’ AGA AGG ATA TAA TTC CTA CG 3’

Oligonucleótidos para secuenciación de CCDC56 en pacientes con déficit del complejo IV

1.7. siRNAs y sondas Taqman

- Silencer® Select predesigned siRNA, ID: s26294

Las técnicas básicas de Biología Molecular se realizaron según se describe en Sambrook y

2.2. Secuenciación de ácidos nucleicos y análisis de secuencias

2.3. Aislamiento de ácidos nucleicos

Aislamiento de ARN de células en cultivo