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    1 - PPT Practica 12 Transf. Electropración Sem 2023-I

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    WILBER ALEXANDER MILLA TRUJILLO
    La práctica describe el método de transformación bacteriana por electroporación. Este método involucra la aplicación de un pulso eléctrico de alto voltaje a bacterias en estado de competencia para formar poros reversibles en la membrana celular y permitir la entrada de ADN exógeno. El documento explica el procedimiento de obtención de células electrocompetentes, la electroporación y la selección de bacterias transformadas. Finalmente, se presenta un cálculo para determinar la eficiencia de transformación basado en el número de colonias obten

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    1 - PPT Practica 12 Transf. Electropración Sem 2023-I

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    WILBER ALEXANDER MILLA TRUJILLO
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    La práctica describe el método de transformación bacteriana por electroporación. Este método involucra la aplicación de un pulso eléctrico de alto voltaje a bacterias en estado de competencia para formar poros reversibles en la membrana celular y permitir la entrada de ADN exógeno. El documento explica el procedimiento de obtención de células electrocompetentes, la electroporación y la selección de bacterias transformadas. Finalmente, se presenta un cálculo para determinar la eficiencia de transformación basado en el número de colonias obten

    Descripción original:

    Protocolo practico de Trasformación bacteriana Parte 2

    Título original

    1- PPT Practica 12 Transf. Electropración sem 2023-I

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    La práctica describe el método de transformación bacteriana por electroporación. Este método involucra la aplicación de un pulso eléctrico de alto voltaje a bacterias en estado de competencia para formar poros reversibles en la membrana celular y permitir la entrada de ADN exógeno. El documento explica el procedimiento de obtención de células electrocompetentes, la electroporación y la selección de bacterias transformadas. Finalmente, se presenta un cálculo para determinar la eficiencia de transformación basado en el número de colonias obten

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    La práctica describe el método de transformación bacteriana por electroporación. Este método involucra la aplicación de un pulso eléctrico de alto voltaje a bacterias en estado de competencia para formar poros reversibles en la membrana celular y permitir la entrada de ADN exógeno. El documento explica el procedimiento de obtención de células electrocompetentes, la electroporación y la selección de bacterias transformadas. Finalmente, se presenta un cálculo para determinar la eficiencia de transformación basado en el número de colonias obten

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    UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

    (Universidad del Perú, DECANA DE AMÉRICA)

    FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

    Práctica N° 12
    Transformación Bacteriana por Electroporación

    CURSO: GENÉTICA MICROBIANA

    Dr. JAIME R. SÁNCHEZ VENEGAS

    SEMESTRE ACADÉMICO 2023-I


    TRANSFORMACIÓN BACTERIANA

    Método químico: Heat shock


    Estado de
    competencia

    Expresión del material


    genético incorporado

    Método físico: Electric shock


    Bacterias en estado de competencia artificial:
    - Químicamente competente
    - Electrocompetentes
    TRANSFORMACIÓN POR ELECTROPORACIÓN
    Método físico, que permite crear un estado de competencia, a las
    células, aplicando un pulso eléctrico breve y de alto voltaje, capaz
    de formar microporos en la membrana celular.

    Esta electropermeabilización es reversible, permitiendo el ingreso


    de DNA exógeno.

    Se aplica en la transformación de:


     Bacterias
     Levaduras
     Células animales
     Protoplastos vegetales

    Transfección  Transferencia génica en células eucariotas por


    métodos: biológicos, químicos o físicos.
    Transducción  Transferencia génica en bacterias mediante virus.
    FUNDAMENTO DE LA ELECTROPORACIÓN

    Fosfolípido Membrana plasmática

    Hidrofílico
    Hidrofóbico
    Formación de
    poros causado
    por un shock
    eléctrico
    Produce una reorganización rápida de la
    estructura molecular de la membrana

    Célula electroporada

    Formación de poros

    Aumento de la permeabilidad
    de la membrana
    Aplicación de un
    Transporte molecular
    pulso eléctrico

    https://www.youtube.com/watch?v=9dhge21A9SU
    Normal cell Electrocompetent cell Transformed cell

     El campo eléctrico forma microporos reversibles en la membrana


    celular facilitando el ingreso de DNA.

     Si el campo es muy intenso el proceso puede ser irreversible y


    producir lisis celular.
    EL ELECTROPORADOR

    Es un dispositivo que crea un


    campo electromagnético a través
    de la suspensión celular. .
    • .
    REQUERIMIENTOS PARA LA ELECTROPORACIÓN

     DNA plasmídico de alta pureza y una solución celular bajo en


    sales.

    o Las soluciones impuras pueden causar una pequeña


    explosión (arco eléctrico), causando la muerte celular.
    o Si esto ocurre a menudo, una precipitación de las células
    podría ser necesaria antes de una nueva electroporación.

     Células en estado de electrocompetencia (capacidad de


    introducir ADN foráneo)

     Someter a las células electro-transformadas en un medio de


    cultivo de regeneración celular.
    ARCO ELÉCTRICO
    Es el paso de la corriente a través de una zona de gases en
    estado incandescente.
    Se caracteriza:
    - Tiene una duración de menos de un segundo.
    - La temperatura puede llegar de 3000 a 30,000°C
    - Rayos infra rojos y ultravioletas, y rayos luminosos visibles
    OBJETIVO DE LA PRÁCTICA
    1- Conocer un método alternativo para comprobar la naturaleza
    transformante del DNA.
    2- Proporcionar al estudiante las bases de la técnica de
    transformación por electroporación para introducir DNA exógeno
    a una bacteria.

    PROCEDIMIENTO DE LA ELECTROPORACIÓN
    3 etapas:
    Obtención de células electrocompetentes

    Ensayo de electroporación

    Selección y/o visualización de células electrotransformadas


    PROCEDIMIENTO GENERAL DE TRANSFORMACIÓN
    POR ELECTROPORACIÓN
    Obtención de células electrocompetentes

    Selección de células electrotransformadas Ensayo de electroporación


    OBTENCIÓN DE CÉLULAS ELECTROCOMPETENTES
    SECUENCIA DEL ENSAYO DE ELECTROPORACIÓN
    Transformación de células bacterianas
    https://www.youtube.com/watch?v=-z9yiCu2JjM
    Transfección de células eucariotas
    https://www.youtube.com/watch?v=ulA8xsVji80
    LECTURA Y CÁLCULO DE EFICIENCIA DE
    TRANSFORMACIÓN POR ELECTROPORACIÓN
    (ET)

    o Visualizar los resultados obtenidos después del


    procedimiento de transformación de las bacterias.

    o Considerar los datos del procedimiento realizado


    en la transformación para el cálculo de eficiencia
    de transformación.
    LECTURA DE LA TRANSFORMACIÓN POR
    ELECTROPORACIÓN
    VISUALIZACIÓN DE COLONIAS DE BACTERIAS
    ELECTROTRANSFORMADAS

    Visualización (sin luz UV) de las Visualización (con luz UV) de las
    colonias de E. coli HB101 K-12 colonias de E. coli HB101 K-12
    transformadas con pGLO y cultivadas transfromadas con pGLO y cultivadas
    en agar LB + Amp + Arabinosa. en agar LB + Amp + Arabinosa.
    Se observa bioluminescencia de GFP.
    COMPARACIÓN DE COLONIAS DE BACTERIAS TRANSFORMADAS
    CON LOS CONTROLES
    CÁLCULO: EFICIENCIA DE TRANSFORMACIÓN (ET)

    Determinar la cantidad de moléculas de DNA que ingresa a las


    células bacterianas para ser genéticamente transformadas. Se
    puede determinar considerando:

     Número total de colonias transformantes que crecen en la


    placa  conteo de las colonias (UFC)
     Cantidad de DNA plasmídico con el cual se obtuvo las colonias
    en la placa  determinar la fracción de DNA plasmídico
    sembrado en la placa (µg).

    ET = Número de células que crecen sobre la placa (UFC)


    Cantidad de DNA sembrado en la placa (µg)
    EJEMPLO.
     80 µl de bacterias electrocompetentes
     20 µl de plásmido [ 50 pg/10 µl ] = 100 pg = 1*10-4 µg
     900 µl de medio LB + Glucosa
     100 µl del cultivo total sembrado en la placa
     300 colonias transformantes crecidas en la placa

    ET = Número de células que crecen sobre la placa (UFC)


    Cantidad de DNA sembrado en la placa (µg)

    o Fracción de DNA plasmídico usado en la siembra:


    Vol. sembrado/Vol. Total = 100 µl / 1000 µl = 0.1

    o Cantidad de DNA plasmídico sembrado en la placa:


    DNA total plasmídico x Fracción DNA plasmídico usado
    1*10-4 µg x 0.1 = 1*10-5 µg

    ET = 300 UFC / 1*10-5 µg = 3*107 UFC/µg


    COMPARACIÓN ENTRE SHOCK TÉRMICO Y
    ELECTROPORACIÓN

    ELECTROPORACIÓN SHOK TÉRMICO

     Electroporador  Fuente de calor

     Células  Células
    electrocompetentes quimiocompetentes

     Fácil y rápido  Complicado y lento

     Cantidad de DNA  Saturación a altas


    directamente concentraciones de
    proporcional a la ET DNA

     1 x 109-10 UFC/µg DNA  1 x 104-6 UFC/ µg DNA


    ASISTENTES DE LA PRÁCTICA

    o Wilma Quispe Rojas


    o Piero Revilla Montes
    o Asami Susuki Pacheco
    o Alexandra Andrade Elera
    GRACIAS POR SU ATENCIÓN

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