Tincion de Gram

ESCUELA SUPERIOR POLITÉCNICA DE CHIMBORAZO
VICERRECTORADO ACADÉMICO
DIRECCIÓN DE DESARROLLO ACADÉMICO
FACULTAD DE CIENCIAS PECUARIAS

CARRERA: ZOOTECNIA
GUÍA DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGIA
PRÁCTICA No. 5
CULTIVO BACTERIANO
TINCIÓN DE GRAM
1. DATOS GENERALES:
NOMBRE: ……………………………. CODIGO……………………
GRUPO No.
FECHA DE REALIZACIÓN: FECHA DE ENTREGA:
2. OBJETIVOS:
3. INSTRUCCIONES
1. Leer y comprender la composición de los medios de cultivo bacteriano

2. Identificar cada componente y la forma en que actúa
3. Seguir las instrucciones que establece el técnico de laboratorio.
4. Tomar las debidas precauciones para manipular los materiales y equipos de
laboratorio
4. ACTIVIDADES POR DESARROLLAR:
Equipos/Materiales/Reactivos
Equipos
o Balanza
o Plancha de agitación magnética
o Autoclave
o Refrigerador
o Estufa de incubación aerobia
o Microscopio
o Cámara de video
Materiales
o Papel de aluminio
o espátula
o Frasco termorresistente
o Barrilla de agitación magnética
o Pinza
o Asa de cultivo
o Probeta graduada de 100ml
o Cajas Petri
o Tubos de ensayo
o Fundas de lienzo
o Marcador permanente
o Gradilla para tubos
o Papel secante
o Porta objeto
o Una regla milimetrada
o Molde Petri film
o Mechero de alcohol
o Hisopos
Reactivos
o Agua destilada
o Agar nutritivo
o Agar MacConkey
o Agar lisina y hierro
o Agar SIM
o Set de tinción Gram
o Aceite de inmersión
o Reactivo de Kovacs
o Xilol
5. PROCEDIMIENTO
1. Preparación del medio de cultivo

Agar nutritivo
Suspenda 23 gramos de polvo en un litro de agua purificada. Mezcle bien y caliente agitando
frecuentemente y hierva durante un minuto para disolver completamente el polvo. Autoclave
a 121 grados Celsius durante 15 minutos
Agar MacConkey
Suspenda 50 gr del polvo en un litro de agua purificada. Mezcle bien y caliente agitando
Agar lisina hierro
Suspenda 33 gramos de polvo en un litro de agua purificada. Mezcle bien y caliente agitando
Agar SIM
Suspenda 30 gramos del polvo en un litro de agua purificada . Mezcle bien y caliente agitando
a 121 grados Celsius durante 15 minutos.
Para poner a hervir las preparaciones se colocan en frascos de vidrio termo resistente.
2. Esterilización de materiales
• Primero se pone agua destilada en el autoclave hasta que cubra la marca establecida
• En fundas de lienzo se coloca todos los materiales de vidrio a esterilizar, tales como
cajas Petri, tubos de ensayo, pipetas, etc.
• Los frascos con los agares también se introducen en la autoclave, pero ligeramente
abiertos para que no se rompan con la presión posterior que genera el equipo
• Se cierra el autoclave y se ajusta los tornillos de seguridad, se cierra todos los
dispositivos de presión y seguridad y se prende el equipo, así procedemos a esterilizar
por 15 minutos, tomados desde el primer silbido que emite la salida de vapor del
autoclave
Una vez transcurrido el tiempo se apaga el equipo y se libera el vapor por uno de los
dispositivos de presión, hasta que baje a cero, luego de ello y con una temperatura de
manipulación manual se abre el autoclave y se saca los materiales ya estériles.
3. Siembra de muestras
Agar MacConkey y Agar Nutritivo
Siembra con Asa de cultivo
a) Tomamos el asa y la esterilizamos en la llama de un mechero, sea de alcohol o de gas
b) Introducimos en la muestra que se quiere sembrar
c) Sembramos con la técnica de “agotamiento por estrías” desde la mitad hacia debajo en
forma de zigzag, es decir sembramos ½ de la caja Petri, damos la vuela y en el resto del
agar sobrante sembramos1/4 del total de la caja Petri, volvemos a dar la vuelta y sembramos
la última parte. De esa manera nos aseguramos de sembrar en tres diferentes direcciones
Siembra con un hisopo

d) Con un hisopo de algodón, tomamos una muestra
e) En la caja Petri descargamos la muestra en un costado de la parte superior del agar
f) Tomamos el asa previamente esterilizada y procedemos a sembrar en zigzag con cuidado
de no romper el agar, aplicando la técnica ya citada “agotamiento por estrías”
g) Este proceso se lo realiza con cada una de las muestras y en cada uno de los agares
correspondientes (Agar Nutritivo y Agar MacConkey)
h) Lo llevamos a la estufa de cultivo a una temperatura de 38 grados Celsius durante 48
horas
i) Sacamos las muestras y la llevamos a refrigeración para poder observarlas.
4. Tinción Gram y observación al microscopio
a) Tomamos una placa porta objetos, la limpiamos y colocamos una gota de agua destilada
en el centro
b) Esterilizamos el asa que vamos a utilizar
c) Con el asa procedemos a tomar una muestra de una de las colonias crecidas en el medio
de cultivo de la caja Petri y hacemos una especie de raspado sobre la gota de agua de la
placa porta objetos
d) Enseguida se hace la fijación de las bacterias, flameando la placa porta objetos sobre la
llama del mechero en forma consecutiva, hasta que toda el agua se evapore y quede una
especie de mancha blanquecina que corresponde a las bacterias muertas, enteras y pegadas
o fijas al vidrio del porta objetos
e) Procedemos a teñir la muestra con la tinción Gram, que consiste en:
• Cubrir la muestra con cristal violeta para teñir a los microorganismos Gram positivos
durante un minuto
• Luego se lava y cubre con Yodo (en forma de lugol) como fijador, durante un minuto
• Lavamos la placa con agua destilada
• Ahora decoloramos con alcohol-acetona por un minuto
• Aplicamos por un minuto el rojo de safranina que va a teñir a las bacterias Gram
negativas
• Lavamos otra vez con agua destilada
• Al final de la tinción Gram se obtiene ya sea bacterias Gram Positivas que toman un color
violeta azulado o bacterias Gram Negativas que toman una coloración de tono rojizo rosado
f) La placa porta objetos con la tinción obtenida la llevamos al microscopio, le colocamos
una gota de aceite de inmersión y la observamos utilizando 1000 aumentos totales (Lente
de 100 X) para poder distinguir los microorganismos

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1. Preparación del medio de cultivo

Siembra con un hisopo

4. Tinción Gram y observación al microscopio

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