Práctica Cultivos
Práctica Cultivos
Práctica Cultivos
Emily Blanco, Sara Breen, Masita Toure, Joel Moreno, Stefanny Hidalgo
● ¿Para qué se utilizan los medios de cultivo PCA (Plate count agar) y Agar
MacConkey/VRBG?.........................................................................................................2
● Tipos de siembra……………………………………………………………………………………………………..……3
● Métodos de sembrado…………………………………………………………………………………….……………4
● Lectura de siembras………………………………………………………………..…………………………………….6
● Incidencias………………………………………………………………………………………………………………….15
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1, ¿QUE CONSEGUIREMOS REALIZAR EN LA PRÁCTICA?
1. Elaborar medios de cultivo, esterilizar en autoclave y preparar placas con medio de cultivo.
Nos ponemos las batas, nos recogemos el pelo y nos lavamos las manos.
En la mesa de trabajo colocamos los materiales anteriormente mencionados para trabajar con
ellos, también se pone en la superficie de la mesa un papel absorbente por si se derrama algo.
Primero colocamos 6 tubos en un lado de la gradilla y otros 3 tubos en otra parte de la gradilla.
A los 6 tubos le agregamos 9 ml de agua destilada.
Calentamos el bote con PCA en el microondas con la tapa un poco abierta para que no explote, cada
45 seg miramos y removemos hasta que el PCA esté completamente líquido y no tenga una
pequeña nube sólida, para no quemarnos al cogerlo podemos utilizar una manopla, no debe
ponerse más de unos 6 minutos, cuanto esté preparado lo ponemos en baño termostático a 46
grados centígrados y esperamos a que los demás tubos de PCA estén listos para meterlo todo junto
en el autoclave.
Metemos dentro de la autoclave el PCA, Agar Mac Conkey, los tubos de 9 ml de agua destilada, los
3 tubos con 10 ml de PCA y la caja con las puntas de la micropipeta a 121 grados centígrados durante
15 minutos.
Cogemos un paquete de placas petri que estarán previamente esterilizadas y lo abrimos por la parte
de abajo para que en caso de que entre alguna bacteria no se posicione dónde vamos a poner las
muestras.
Cogemos el agar Mac Conkey y lo vertemos dejando una capa fina que recubre el interior la placa
petri y lo dejamos condensar, una vez haya solidificado le damos la vuelta para evitar
contaminaciones.
Vertemos 10 ml de PCA en tres tubos y los dejamos de manera vertical para que se solidifiquen. No
es necesario bajar la temperatura debido a que el PCA es sólido a temperatura ambiente.
3. ¿Para qué se utilizan los medios de cultivo PCA (Plate count agar) y Agar MacConkey/VRBG?
El agar de recuento en placa ( PCA ), también llamado agar de métodos estándar ( SMA ), es
un medio de crecimiento microbiológico comúnmente utilizado para evaluar o monitorear el
crecimiento bacteriano "total" o viable de una muestra. PCA no es un medio selectivo.
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El número total de bacterias aeróbicas vivas se puede determinar utilizando agar para recuento en
placa (PCA), que es un sustrato para que crezcan las bacterias. El medio contiene caseína que
proporciona nitrógeno, carbono, aminoácidos, vitaminas y minerales para ayudar en el crecimiento
del organismo. El extracto de levadura es una fuente de vitaminas, especialmente del grupo B. La
glucosa es el carbohidrato fermentable y el agar es el agente solidificante. Este es un medio no
selectivo y las bacterias se cuentan como unidades formadoras de colonias por gramo (UFC/g) en
muestras sólidas y (UFC/ml) en muestras líquidas.
El agar MacConkey es un medio de cultivo selectivo y diferencial para bacterias diseñado para
aislar selectivamente bacilos Gram negativos y entéricos (encontrados normalmente en el tracto
intestinal) y diferenciarlos sobre la base de la fermentación de la lactosa. El cristal violeta y las sales
biliares inhiben el crecimiento de organismos Gram positivos, lo que permite la selección y el
aislamiento de bacterias gram negativas. Las bacterias entéricas que tienen la habilidad de
fermentar lactosa pueden ser detectadas utilizando el carbohidrato de lactosa y el indicador de
pH rojo neutro. Sirve como un indicador visual de pH, distinguiendo así las bacterias gram negativas
que pueden fermentar la lactosa (Lac+) y las que no pueden (Lac-).
VRBG: medio de cultivo selectivo, utilizado para la detección y el recuento de enterobacterias a
partir de alimentos y productos farmacéuticos. En el medio de cultivo la peptona de gelatina y el
extracto de levadura aportan los nutrientes necesarios para el crecimiento bacteriano; las sales
biliares y el cristal violeta inhiben el desarrollo de la flora acompañante Gram positiva; la glucosa es
el hidrato de carbono fermentable y el rojo neutro es el indicador de pH. El agar es el agente
solidificante.
Todas las enterobacterias fermentan la glucosa, esto produce la acidificación del medio y el viraje
del indicador de pH al color rojo intenso. Debido a esto, se observan como colonias de color rojo
púrpura de 1 a 2 mm de diámetro, rodeadas generalmente de una zona rojiza de bilis precipitada.
TIPOS DE SIEMBRA
- Placa:
PCA placa: siembra en profundidad con distintas diluciones seriadas de solución bacteriana.
Mac Conkey: siembra en estría simple, cuatro cuadrantes y agotamiento por estría.
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RESUMEN SEGUNDA PARTE DE LA PRÁCTICA (de incubación a vista microscópica)
Sacamos las placas petri con PCA de la nevera y los tubos con PCA y agua destilada:
Cogemos una muestra de bacterias, en nuestro caso usamos la bacteria C, con el asa de siembra y
lo sumergimos dentro del primer tubo, el cual será el tubo madre, luego con la pipeta, pipeteamos
1 ml de un tubo a otro (técnica de seriado).
Luego con diferentes técnicas de sembrado que explicaremos más adelante ponemos cada una de
las muestras del tubo con un asa de sembrar en las placas petri, para posteriormente ver la cantidad
de bacterias que quedan en cada una.
Luego procedemos a coger muestras de bacterias de otros lugares: Recogemos muestras óticas,
vaginales, anales y nasales.
Dejamos las muestras en la incubadora a 37 grados durante 72 horas.
Una vez teñida las muestras (proceso explicado más adelante que es la tinción de Gram). Se procede
a dejar secar la muestra y una vez seco nos ponemos a observar en el microscopio.
Al principio se observa de forma normal usando los aumentos del microscopio en especial el 40X.
Luego vamos a utilizar el aumento de 100X, pero primero en el portaobjetos en donde se encuentra
la muestra se le pone un cubreobjetos. Encima del cubreobjetos se deja caer una gota del aceite
de inmersión. Dicha gota debe tocar el lente de del microscopio del aumento 100x y ya estaría listo
para observar.
MÉTODOS DE SEMBRADO
Todos los métodos de siembra en placas siguen el mismo principio básico: distribuir una gran
cantidad de células secuencialmente sobre la superficie de una placa hasta que las células estén lo
suficientemente separadas entre sí.
La técnicas de sembrado utilizadas en la práctica son las siguientes:
Agotamiento por estría (más utilizada): Es un buen método para el aislamiento de colonias
(obtención de colonias aisladas); mediante esta técnica se busca obtener colonias separadas a partir
de un inóculo. Para su realización: se toma la caja de Petri en la palma de la mano y ligeramente
inclinada; con la mano contraria, se manipula el asa de argolla previamente esterilizada y con ella
se recoge el material de cultivo, para colocarlo en un área periférica de la caja haciendo
movimientos circulares para homogeneizar el inóculo. El asa debe ser nuevamente flameada y
enfriada en un lateral del agar (procurando no dañarlo); a continuación, se realiza una estría
partiendo de la primera y arrastrando los microorganismos presentes en ella hacia el extremo
contrario de la superficie del agar. Se debe procurar que, en cada sección de la caja, las estrías
quedan trazadas con mayor separación.
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Muestras de Siembra ( en tubos de Agar inclinado): Se realiza sobre medios inclinados o en bisel,
haciendo una picadura hasta el fondo del tubo con asa recta y luego haciendo una siembra en estría
sobre la superficie expuesta del agar, deslizando el asa por la superficie en bise marcando las estrías;
de tal manera que, con el asa cargada se realizan los dos tipos de siembra y sin retirarla del tubo.
Sembrado simple: Se realiza deslizando el asa en forma de zig zag sobre la superficie expuesta del
agar de manera que se marquen surcos o estrías
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Agotamiento de cuatro cuadrantes: El objetivo de esta técnica, es el de diluir a medida que se
realizan estrías en la superficie del agar. La placa se divide en cuatro cuadrantes (imaginariamente
o con un rotulador en la base); se inicia el rayado de la superficie del agar, en cuatro cuadrantes
consecutivos (sin esterilizar el asa posteriormente o tomar nuevamente bacterias). Las cajas así
sembradas, se incubaron a la temperatura adecuada de acuerdo a la bacteria, en este caso a 37
grados.
Con esta técnica de siembra, se espera que al menos en el cuarto cuadrante (última estría
realizada), se encuentren colonias de la bacteria aisladas, ya que quedarán menos bacterias en el
asa.
LECTURA DE SIEMBRAS
PCA placa: ¿salen seriadas? ¿se pueden leer? ¿en cuál leerías? Resultado FOTO
Las muestras si son seriadas, se puede observar que cuanto mayor diluidas se encuentran las
bacterias, menores colonias se encuentran. En las dos primeras colonias se podría pensar que
existen menos ya que cuestan más verlas a simple vista a comparación de las demás, sin embargo
lo que realmente ha ocurrido es que la densidad de colonias es tan grande que no contaban con
espacio suficiente para expandirse. La lectura la realizamos en las dos últimas placas (foto y
resultado a continuación)
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UFC: 2.83X10^7 UFC: 1.9X10^7
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MacConkey: ¿cómo son las colonias? FOTO
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Se observan colonias de diversos
tamaños pero unificadas en cuanto a
color y sin presencia de halo siendo
mejor visible en la última siembra
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Se identifican colonias en el cuadrante tres, sin
presencia de halo, todas presentan un color
uniforme más oscuro respecto al medio de
cultivo.
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Muestra: Secreción Vaginal, son lactobacillus muy
chiquititos que precisan lácticos para vivir y un pH
ácido saliendo colonias más pequeñas con respecto a
la muestra anterior UFC: 526 X 4 cuadrantes = 2.104
colonias.
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TINCIÓN GRAM
El proceso es:
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- Lavar con alcohol durante 10 segundos
- Dejar secar
- Observar al microscopio
Gram positivas
Las bacterias gram positivas se colorean de un color morado, su coloración se relaciona con una
pared celular gruesa. Estas bacterias tienen una membrana biológica interna y varias capas de
peptidoglicano.
El alcohol deshidrata y compacta la capa de peptidoglicano, por lo que esta capa forma una
barrera impermeable que evita la pérdida del reactivo violeta. Esta es la razón de su color
predominante.
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Gram negativas
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INCIDENCIAS.
1. En algunas placas Petri hemos escrito sobre la tapa del cultivo ya que en caso de que se
caiga la muestra podemos no saber de qué es y si es peligroso, así que debemos ponerlo
sobre la base del mismo
2. Fisura a la hora de sembrar en la placa petri agar Mac Conkey por agotamiento de estría,
puede ser por oxígeno o demasiado tiempo en la estufa creando deshidratación.
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3. Faltó hacer la estría central (si se hubiese hecho se hubieran separado las colonias)
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