Captura de Pantalla 2023-06-07 A La(s) 7.38.32 A.M.

INDICE
PRÁCTICA I
Normas Generales de Seguridad Biológica en el Laboratorio de Microbiología 1
PRÁCTICA II
Equipos y Materiales de Laboratorio de Microbiología 13
PRÁCTICA III
Microscopia y Coloraciones 27
PRÁCTICA VI
Métodos de Control Sobre el Crecimiento Microbiano 40
PRÁCTICA V
Clasificación de los Medios de Cultivo Microbiológicos y su Utilidad en el Diagnóstico 50
PRÁCTICA VI
Medios en Placas para la Bacteriología de Rutina 56
PRÁCTICA VII
Métodos de Siembras 61
PRÁCTICA VIII
Macroscópicas de Cultivos (Morfología de las Colonias) 67
PRÁCTICA IX
Tomas de Muestras en Microbiología Recogida y Transporte de Muestras 71
PRÁCTICA X
Determinación del Crecimiento de Poblaciones Bacterianas 90
PRÁCTICA XI
Genética Microbiana 95
PRÁCTICA XII
Estudios de los Hongos 99
PRÁCTICA XIII
Antibiograma 110
PRÁCTICA XIV
Identificación de Cocos Grampositivos y su Importancia Clínica 116
PRÁCTICA XV
Identificación de Bacilos Grampositivo y su Importancia Clínica 128
PRÁCTICA XVI
Cocos de Importancia Médica Neisserias 132
1
PRÁCTICA XVII
Identificación de Cocos Gramnegativos y su Importancia Clínica 138
PRÁCTICA XVIII
Bacilos Gramnegativos de Importancia Médica 150
PRÁCTICA XIX
Bacilos Gramnegativos No Fermentadores 154
PRÁCTICA XX
Serología en Bacteriología Pruebas de V.D.R.L y Sífilis (LUES) 158
PRÁCTICA XXI
Diagnóstico de Infecciones Nosocomiales 165
PRÁCTICA XXII
Toma de Muestra y de Infecciones Fúngicas 169
PRÁCTICA XXIII
Producción de Pigmentos Bacterianos 174
Bibliografías 178
2
INTRODUCCIÓN
El diagnóstico de las infecciones y el estudio de la microbiología médica, estos

métodos se hicieron precisamente los más grandes descubrimientos en
microbiología, genética e inmunología.
En este manual empezamos a hablar sobre la Bioseguridad que tiene un doble

objetivo: que los estudiantes aprendan los protocolos de manejo de muestras
biológicas potencialmente infecciosa y de los materiales del laboratorio.
Por otro lado introducir a los estudiantes a la formación de hábitos a las actitudes
acorde con su condición de futuros del equipo de salud, adquirido os conocimientos
básicos que luego se convertirán en una herramienta útil al diagnóstico y tratamiento
de las infecciones.
3
Filosofía
La UCE es una Institución de Educación Superior privada, abierta a todas las

corrientes del pensamiento, comprometida con la búsqueda de la verdad y del
conocimiento, sin distinción de credo político, religioso, raza o condición
socioeconómica.
Considera imperativo el compromiso con el bienestar de la población a través de los

servicios educativos y culturales, así como la investigación, estimular la capacidad
creadora, el pensamiento crítico y una visión ética y humanista que forme a los
profesionales para responder a sus necesidades individuales y de la sociedad.
Según los Estatutos de la Universidad, tres términos recogen su lema: "Sacrifico,
Estudio y Responsabilidad".
Misión y Visión
Misión
Ser un referente de importancia regional, nacional e internacional en educación

superior, mediante el mejoramiento continuo de la docencia y de la investigación,
con recursos educativos actualizados y prácticas pedagógicas modernas, que
fomenten en sus estudiantes autonomía e independencia en los aprendizajes a
través de procesos académicos y de gestión creativa e innovadora.
Visión
Dirigir todos sus recursos humanos, materiales y tecnológicos hacia una oferta
académica de calidad y pertinencia en los niveles de grado, posgrado y técnico
superior para lograr egresados competentes, cuyos ejercicios profesionales estén
inspirados en principios éticos y morales, con orientación hacia una cultura de
investigación y difusión de conocimiento útil a la sociedad, capaces de contribuir al
desarrollo social, productivo, científico, tecnológico y a la sostenibilidad ambiental.
1
Competencias
1. El estudiante de Microbiología de la escuela de la Salud, Medicina,

Bioanalisis y las escuelas afines tendrán como competencias Básicas,
Generales y especificas las que enunciaremos más abajo.
2. Conocer los fundamentos de la microbiología
3. Saber formular con competencia las recomendaciones adecuadas para el
transporte y almacenamiento de las muestras clínicas.
4. Saber interpretar con competencia los resultados de las pruebas de
sensibilidad bacteriana a los antimicrobianos.
5. Saber interpretar con competencia los resultados de los estudios
microbiológicos.
6. Saber reconocer con competencia el valor diagnóstico de las pruebas
sexológicas en las infecciones por: Salmonella Typha, Brucella sp.,
Treponema pallidum, Hemophilus inflenza, Neisserias.
7. Saber fundamentar microbiológicamente una terapéutica antimicrobiana.
8. Haber aplicado adecuadamente bajo supervisión del tutor los métodos de
desinfección y esterilización.
9. Haber reconocido bajo supervisión del tutor el valor diagnóstico de las
pruebas serológicas en las infecciones por: Las bacterias de la familia
rickettsiaceae, y de los géneros borrelia, micoplasma y chlamydia
10. Que los estudiantes puedan transmitir información, ideas, problemas y
soluciones a un público tanto especializado como no especializado.
11. Que los estudiantes puedan desarrollar aquellas habilidades de aprendizaje
necesarias para emprender estudios posteriores con un alto grado de
autonomía.
12. Que el estudiante puede tener la destreza de Resolución de problemas,
Toma de decisiones.
13. Trabajo en equipo, trabajo en equipo de carácter multidisciplinar,
razonamiento crítico, y compromiso ético.
14. Conocer las principales técnicas de diagnóstico microbiológico e interpretar
los resultados.
15. Saber cómo obtener y procesar una muestra biológica para su estudio
mediante los diferentes procedimientos diagnósticos.
16. Desarrollar la práctica profesional con respeto a otros profesionales de la
salud, adquiriendo habilidades de trabajo en equipo.
17. Comprender y reconocer los efectos, mecanismos y manifestaciones de la
enfermedad.
18. Comprender y reconocer los agentes causantes y factores de riesgo que
determinan los estados de salud y el desarrollo de la enfermedad.
2
19. Obtener y elaborar una historia clínica que contenga toda la información
relevante.
20. Conocer la flora microbiana normal de hombre.
21. Conocer las técnicas de desinfección y esterilización.
22. Identificar las características generales de los microorganismos y parásitos
patógenos del hombre.
23. Conocer los priones como agentes de infección humana.
24. Identificar métodos de cultivo y aislamiento de los microrganismos patógenos
del hombre.
25. Conocer los mecanismos de acción de los fármacos antimicrobianos.
26. Describir el concepto de sensibilidad bacteriana a los antimicrobianos.
3
PRÁCTICA I
NORMAS GENERALES DE SEGURIDAD
BIOLÓGICA EN EL LABORATORIO
DE MICROBIOLOGÍA
1
OBJETIVOS
❖ Brindar herramientas para el aprendizaje de las técnicas experimentales
microbiológicas y entrenamiento práctico de los mismos.
❖ Inducir a conocer los métodos de control microbiológico por el hombre y su
importancia en las diferentes áreas de la microbiología.
❖ Fomentar la enseñanza de los fundamentos de morfología, nutrición,
fisiología y reproducción de los microorganismos y sus aplicaciones en el
diagnóstico microbiológico.
GENERALIDADES
El estudio de las bacterias, virus, parásitos, hongos y otros agentes infecciosos que
pueden ser patógenos para el hombre, los animales u otras formas de vida
conforman riesgos que varían según el agente infeccioso y los procedimientos
utilizados.
Las Normas de Seguridad Biológica pretenden reducir a un nivel aceptable el riesgo
inherente a la manipulación de material peligroso y son muy rigurosas para los
agentes más peligrosos y menos exigentes para los que causan problemas de
menor entidad.
Es imposible protegerse de lo que se desconoce, de ahí la necesidad e importancia

de este conjunto de normas, las cuales deben ser cumplidas estrictamente.
2
NORMAS GENERALES DE SEGURIDAD BIOLÓGICA EN EL
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA
La peligrosidad de un agente está directamente relacionada con el tipo de

manipulación a la que es sometido. Por ello se debe tener en cuenta:
❖ Manipulación a la que es sometido.

❖ Deberá usarse siempre una bata blanca y limpia.
❖ Antes de comenzar cualquier trabajo, el alumno deberá lavarse las manos
usando agua y jabón y secarse con una toalla limpia.
❖ Los libros y cuadernos de notas, nunca deben colocarse sobre la mesa de
trabajo.
❖ Antes de comenzarse el experimento, deberá leerse detenidamente el
experimento a realizarse.
❖ Quedan terminada mente prohibidos los ruidos molestos, así como un
movimiento excesivo dentro del laboratorio.
❖ Queda terminantemente prohibido comer o fumara dentro del laboratorio.
❖ Por ningún motivo deberá llevarse el lápiz o cualquier objeto a la boca.
❖ La superficie de la mesa deber ser cuidadosamente desinfectada antes y
después del trabajo.
❖ El material usado (tubos, matraces, frascos, etc.,) debe colocarse
inmediatamente en los recipientes dispuestos para este fin.
❖ Las asas de Kolle y pinzas infectadas, deberán ser esterilizadas por flameo
inmediatamente después de ser usadas.
❖ Las pipetas y portaobjetos usados, deberán ser colocados en los recipientes
que contengas solución desinfectante de fenol al 0,5%.
❖ Las envolturas, tapones de algodón etc. No deben tirarse nunca al suelo,
deben depositarse en recipientes para desperdicios.
❖ Todo accidente, tales como cortes en las manos, volcaduras de líquidos
contaminados, absorción de los mismos al pipetear deberá informarse
inmediatamente.
❖ Antes de dejar el laboratorio se deberá ubicar cada cosa en su lugar y las
mesas convenientemente limpias.
❖ Terminado el trabajo deberá lavarse las manos con jabón desinfectante y
alcohol.
❖ Se recomienda observar el resultado de las experiencias con el mayor
detenimiento posible, así como aclarar los conceptos dudosos o que no son
de su dominio, consultando al Docente presente.
3
CONCLUSIONES
Los colores de seguridad podrán formar parte de una señalización de seguridad o
constituirla por sí mismos. En el siguiente cuadro se muestran los colores de
seguridad, su significado y otras indicaciones sobre su uso:
Color Significado Indicaciones y precisiones
Señal de prohibición Comportamientos peligrosos
Alto, parada, dispositivos de desconexión

Peligro-alarma de emergencia.
Rojo Evacuación
Material y equipos
de lucha contra Identificación y localización
incendios
Amarillo, o
Señal de Atención, precaución.
amarillo
advertencia Verificación
anaranjado
Comportamiento o acción específica.

Azul Señal de obligación Obligación de utilizar un equipo de
protección individual
Señal de Puertas, salidas, pasajes, material,

salvamento o de puestos de salvamento o de socorro,
auxilio locales
Verde
Situación de
Vuelta a la normalidad
seguridad
Con nuestra primera práctica pudimos conocer los tipos de señales y son los
siguientes:
❖ Señales de advertencia.
❖ Forma triangular.
❖ Pictograma negro sobre fondo amarillo, bordes negros.
❖ Señales de prohibición.
❖ Forma redonda.
❖ Pictograma negro sobre fondo blanco, bordes y banda rojos
❖ Señales de obligación.
❖ Forma redonda.
4
❖ Pictograma blanco sobre fondo azul.
❖ Señales de relativas a los equipos de lucha contra incendios.
❖ Forma rectangular o cuadrada.
❖ Pictograma blanco sobre fondo rojo.
❖ Señales de salvamento o socorro.
❖ Forma rectangular o cuadrada.
❖ Pictograma blanco sobre fondo verde.
❖ Pictogramas.
A continuación se muestra una tabla en la que se reflejan los pictogramas utilizados

en la señalización de lugares de trabajo:
5
CUESTIONARIO
1. Definir agentes biológicos, esterilización, Bioseguridad, desinfección,

limpieza, contaminación, niveles de Bioseguridad.
AGENTES BIOLÓGICOS
Son microorganismos con inclusiones genéticamente modificadas, cultivos
celulares y endoparásito humanos susceptibles de originar cualquier tipo de
infección, alergia o toxicidad.
En la siguiente tabla se esquematizan las características de los distintos agentes
biológicos para su clasificación dentro de un grupo de riesgo determinado.
6
GRUPOS DE RIESGO DE LOS AGENTES BIOLÓGICOS
AGENTES RIESGO DE
PROFILAXIS O
BIOLÓGICO DEL RIESGO PROPAGACIÓN
TRATAMIENTO
GRUPO DE INFECCIOSO A LA
EFICAZ
RIESGO COLECTIVIDAD
Poco probable
1 que cause No Innecesario
enfermedad
Pueden causar
una
enfermedad y Posible
2 Poco Probable
constituir un generalmente
peligro para los
trabajadores
Puede provocar
una
enfermedad
grave y Posible
3 Probable
constituir un generalmente
serio peligro
para los
trabajadores
Provocan una
enfermedad
grave y
No conocido en la
4 constituyen un Elevado
actualidad
serio peligro
para los
trabajadores
7
ESTERILIZACIÓN
OBJETIVOS
Comparar los diferentes procesos de esterilización utilizados en el laboratorio de
microbiología. Describir las diversas técnicas para la preparación del material a
esterilizar por calor húmedo.
Esterilización:
Es el conjunto de operaciones destinadas a eliminar o matar todos los
microorganismos contenidos en un objeto o sustancia” con el fin de destrucción de
todo organismo vivo en cualquier objeto o material por medios físicos o por
procedimientos químicos acondicionado de modo tal de impedir su posterior
contaminación". También se define, en biología, la esterilización como la anulación
de la capacidad de reproducción biológica de un ser vivo.
El calor seco o húmedo elimina todas las bacterias combinando adecuadamente

factores como la temperatura a la que se someten y el tiempo de exposición. Se
puede esterilizar por calor seco en estufas a más de 160 °C durante media hora, o
por calor húmedo en autoclaves a 120 °C durante 20 minutos y a presión superior
a la atmosférica. La ebullición a 100 °C no elimina todos los gérmenes patógenos
(entre los que no sólo están incluidas las bacterias sino también virus y levaduras).
Otro medio habitual de esterilización, utilizado para objetos no resistentes al calor,

son los medios químicos: el ácido fénico, iniciador de la era de la antisepsia (véase
Fenol), el ácido cianhídrico, el óxido de etileno, la clorhexidina, los derivados
mercuriales, los derivados del yodo (especialmente la povidona yodada) y muchas
otras sustancias. El alcohol etílico no produce esterilización completa. Otro medio
de esterilización actual son las radiaciones ionizantes (beta, gamma).
La antisepsia o esterilización mecánica incluye lavado, cepillado y arrastre de

gérmenes por irrigación. La antisepsia física emplea el calor seco (esterilización a
la llama, estufa de Poupinel para instrumental quirúrgico), el calor húmedo (chorros
de vapor desinfectante para sábanas y colchones, autoclaves para instrumental
quirúrgico) y las radiaciones ionizantes para material desechable (jeringas,
catéteres, sondas, implantes).
La esterilización química se consigue con el yodo y sus derivados (povidona

yodada), los derivados mercuriales (mercurocromo), el formol (uso en anatomía
patológica), la clorhexidina y los desinfectantes gaseosos (óxido de etileno) para
material sensible al calor.
8
ESTERILIZACIÓN POR RADIACIONES
Las radiaciones más comunes que se usan para destruir a los
microorganismos son:
1. La luz ultravioleta. Se utiliza principalmente para la esterilización de áreas
y superficies, y cuya principal limitación es que debe ser absorbida para ser
efectiva, no pasa a través del vidrio transparente u objetos opacos e irrita los
ojos y la piel.
2. La luz infrarroja. Se emplea para reducir la contaminación de ciertos
alimentos y se aplica durante la preparación de los mismos; el efecto
esterilizante de este tipo de radiaciones se debe a la energía térmica que
imparte de manera rápida, y por ello oxidan los componentes celulares de los
microorganismos.
3. Radiaciones ionizantes. Se utilizan para la esterilización de material
quirúrgico sensible al calor y otros materiales usados en medicina.
Desinfección:
Conjunto de operaciones destinadas a eliminar o matar todos o casi todos los

microorganismos contenidos en un objeto o sustancia, con excepción de las
esporas".
También se le puede denominar proceso mediante el cual se produce la destrucción

o eliminación de agentes infecciosos y contaminantes que se encuentran fuera del
organismo, o sobre la piel. Por la aplicación directa de medios físicos o químicos".
En este caso se considera un adecuado proceso de desinfección a aquel que

permite una reducción de un 99,999 % de los microorganismos que existían al
comienzo de la desinfección limpieza:
Limpieza:
Es la eliminación mediante el fregado y el lavado de la superficie en la cual se
comienza a trabajar o se concluye la misma, se recomienda utilizar agua caliente
jabón o algún detergente adecuado o el empleo de alguna aspiradora, para así
poder eliminar algunos agentes infecciosos y las sustancias orgánicas que se
encuentran en la superficie en las cuales estos se pueden encontrar condiciones
adecuadas para sobrevivir.
9
Contaminación:
Es la presencia de un agente infeccioso en la superficie del organismo y también
nosotros lo poder tener o está impregnado en nuestra vestimenta, juguetes, en los
propios instrumento s quirúrgicos u otros objeto inanimados o sustancias como por
ejemplo el agua.
El principal contaminante que esta entre nosotros y que nos está afectando muy
rápidamente a la salud humana, es la contaminación atmosférica ya que en el
mundo cada día más se viola las norma de bioseguridad para nuestra propia salud.
Ejemplo, en los centros mineros, industriales, tecnológicos, etc.
Contaminación Atmosférica:
Es la mayor afectada ya que se da la impregnación del aire, el agua o el suelo con

productos que afectan a la salud del hombre, la calidad de vida o el funcionamiento
natural de los ecosistemas. Sobre la contaminación de la atmósfera por emisiones
industriales, incineradoras, motores de combustión interna y otras fuentes.
Niveles de Bioseguridad:
Ya se han comentado las precauciones que deben tomarse para el trabajo con
microorganismos.
Estos cuidados deben ser cada vez mayores a medida que la peligrosidad de los
mismos aumenta. Así, en un laboratorio docente de microbiología o bien donde se
estudien organismos no patógenos, las medidas de bioseguridad a tomarse serían
las que ya se han citado; mientras que si se trabaja con microorganismos
potencialmente letales para el hombre, las precauciones deberán extremarse.
Ya se ha visto someramente que los agentes infecciosos en estudio pueden ser

bacterias, virus, hongos y par sitos.
Clasificación de los organismos según el nivel de peligrosidad:

NIVEL 1: Incluye aquellos agentes no patógenos para el hombre. Ej.: Bacillus
subtilis.
NIVEL 2: Microorganismos de riesgo moderado y procedimientos de riesgo

moderado. Ej.:Hepatitis B, Salmonella.
NIVEL 3: Microorganismos que pueden causar la muerte o aquellos de riesgo

moderado pero donde los procedimientos de trabajo incluyen alto riesgo de
infección (aerosoles). Ej.: Mycobacterium tuberculosis, Brucella, virus oncogánicos,
HIV en alta concentración.
10
NIVEL 4: Microorganismos exóticos y/o altamente peligrosos cuyo manipuleo
involucre alto riesgo para la vida. Ej.:Virus Lassa, Machupo, Junín.
En concordancia con estos niveles crecientes de peligrosidad, se incrementan las

precauciones a tomar y así se definen los niveles de bioseguridad.
Estos constituyen el conjunto de medidas, prácticas de trabajo y barreras de

contención requeridas frente a los organismos de diferente nivel de peligrosidad.
DESINFECCIÓN SU IMPORTANCIA
Los desinfectantes son los agentes químicos que pueden matar a los organismos
patógenos al contacto. Por lo que sería la mejor prevención contra nuestra propia
salud si nosotros nos vamos a exponer a ciertos elementos o sustancias.
El Centro para la Prevención y el Control de Enfermedades (CDC - Centers for

Disease Control and Prevención) recomienda:
❖ Usar guantes de goma cuando limpie o desinfecte sobre todo cuando tenga
cortes o abrasiones en las manos ya que estas lesiones facilitan la entrada
al cuerpo de una infección. Incluso al usar guantes, lávese las manos
después de limpiar o desinfectar una superficie.
❖ Leer las instrucciones en la etiqueta del producto limpiador, incluyendo las
precauciones.
❖ Limpie la superficie con agua y jabón (u otro limpiador).
❖ Use lavandina en la superficie y déjelo actuar durante unos minutos.,
❖ Seque la superficie con una toalla de papel y descártela, o use un paño que
después deberá lavarse.
❖ Lávese las manos cuidadosamente, incluso después de usar guantes.
11
Los valores se presentan a continuación:
Indicadores %
Asistencia a la práctica 10
Habilidades y Manejos de 20
procedimientos
Cuestionario y entrega de reportes 20
Presentaciones y exposiciones 20
Examen parciales 30
Total 100
LISTA DE COTEJO
PARÁMETROS EVALUACIÓN DEL ESTUDIANTE

¿Trajiste impresa la metodología y el
Manual Práctico?
¿Utilizaste el equipo personal de
protección adecuado para la práctica?
¿Respetaste las normas de conducta y
seguridad en el laboratorio?
¿Trajiste los materiales gastables de uso
solicitados?
¿Elaboraste el listado de los materiales y
reactivos solicitados?
¿Realizaste la clasificación de los
materiales utilizables en la práctica?
¿Identificaste todo el material, los medios
de cultivos y colorantes utilizados en la
práctica?
12
PRÁCTICA II
EQUIPOS Y MATERIALES DE
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA
13
OBJETIVOS
Concientizar al alumno la importancia de conocer los equipos de laboratorio. Su
función en el laboratorio de Microbiología.
GENERALIDADES
Un laboratorio de Microbiología es un lugar habilitado para manejar y estudiar
microorganismos.
El trabajo debe realizarse de acuerdo con los estándares técnicos y de seguridad

propios de un laboratorio de Microbiología Clínica.
Es importante recordar que la finalidad es determinar los microorganismos

presentes en la muestra por lo que es preciso extremar las precauciones para evitar
contaminaciones que den lugar a resultados erróneos.
Todas las muestras deben ser manejadas con precaución por su potencial
patogenicidad.
Mechero Bunsen
❖ Todas las manipulaciones deben realizarse en un radio de 10-15cm de la

llama del mechero (zona aséptica).
❖ En caso de utilizar mechero nunca se debe coger material por encima de la
llama.
❖ Antes de comenzar a trabajar se procurará disponer de todo el material
necesario para el procesamiento de la muestra.
❖ Tomar las medidas necesarias para evitar la contaminación de las muestras
o/ y cultivo por microorganismos ambientales.
14
Gradillas
Incubadora
Es una cámara de temperatura controlada para cultivo de microorganismos.

Se utiliza para facilitar el desarrollo de los microorganismos a su temperatura óptima
de crecimiento (generalmente 35-37º).
15
Microscopio Óptico
Centrífuga
Aparato que aplica sobre los tubos una fuerza centrífuga lo que permite la
separación de los distintos componentes de la muestra mediante la precipitación en
el fondo del tubo de las partículas en suspensión.
16
Cámara de Seguridad Biológica
Desionizador de agua.
La mayor parte de los trabajos que se realizan en un laboratorio de Microbiología

Clínica necesitan la utilización de agua pura con el fin de evitar cualquier tipo de
interferencia. Entre otras características debe: estar exenta de materiales en
suspensión o un pH comprendido entre 5,0 y 7,5. Durante años se ha utilizado
agua destilada, en la actualidad los destiladores se han ido abandonando para dar
paso a desionizadores que funcionan con resinas de intercambio iónico. También
se pueden utilizar otras técnicas como la ósmosis inversa.
17
Contador de colonias: Es un aparato que mediante la iluminación de la placa y
una lupa, nos permite observar con mayor nitidez las colonias y por tanto facilita su
recuento.
18
Balanzas
Baños termostáticos: son recipientes que contienen agua y un sistema de
regulación de la temperatura. Se utilizan para atemperar medios de cultivo o incluso
para incubar cultivos de microorganismos.
19
Cilindro de anaerobios:
Recipientes que se usan para conseguir una atmósfera libre de oxígeno para el
cultivo de microorganismos anaerobios.
Siembra:
Se utilizan para sembrar. Pueden ser metálicas o de plástico, curvas o rectas
(para la siembra por picadura).
20
Placas de Petri: recipientes para la preparación de medios de cultivo sólidos
Placas de Petri con medio sólido
21
Tubos con medio líquido
Tubos con medio sólido
22
Pipetas automáticas (micropipetas) y puntas de pipeta:
❖ Se utilizan para pipetear pequeñas cantidades de líquidos.
❖ Se utilizan con puntas desechables de distinto tamaño y color según la
micropipeta. Existen cuatro tamaños: de 0,5-2µm; de 2-20 µm; de 20-200 µm
y de 200-1000 µm.
Portas y cubres
Para realizar las observaciones al microscopio.
23
Vasos de precipitados y matraces
Autoclave
Es el equipo más utilizado.
Es un procedimiento de esterilización mediante calor húmedo. Se realiza en al
autoclave durante 15 ó 20 min, según el volumen, a 115°C ó 121°C, según la
naturaleza del material que se desee esterilizar.
Autoclavado: es un procedimiento en el que se emplea vapor a presión (a 1
atmósfera). Como tiene gran poder de penetración la temperatura y el tiempo
utilizado son menores que los que se emplean con el horno Pasteur (121º C, 15-20
minutos).
Se utiliza para esterilizar: Medios de cultivo, ropa, material de plástico resistente al
calor húmedo, objetos de metal que no se alteren con la humedad y sobre todo
material de vidrio.
24
Horno de Pasteur: emplea altas temperaturas (160-180º C) durante un tiempo
prolongado (1.5 a 3 horas). Debido a su poca capacidad de penetración se usa para
esterilizar vidrio y metales. Actúa principalmente desnaturalizando las proteínas y
secundariamente oxidando los compuestos celulares.
25
Indicadores %
Habilidades y Manejos de procedimientos 20
Examen parciales 30
Total 100
LISTA DE COTEJO

Manual Práctico?
solicitados?
práctica?
26
PRÁCTICA III
MICROSCOPIA Y COLORACIONES
27
OBJETIVO
Conocer las partes que integran un microscopio, así como el correcto manejo y
cuidado del mismo.
GENERALIDADES
La microbiología es el estudio de los microorganismos y sus actividades, su forma,
estructura, reproducción, fisiología, metabolismo e identificación, cómo están
distribuidos en la naturaleza, sus relaciones con otros seres, los efectos benéficos
o perjudiciales que ejercen sobre los humanos y las alteraciones físicas y químicas
que provocan en su medio.
La microbiología empezó cuando el hombre aprendió a pulir piezas de vidrio y a
combinarlas para lograr ampliaciones lo bastante grandes para poder ver los
microbios. Anthony van Leeuwenhoek fue el primero en comunicar sus
observaciones con descripciones y dibujos precisos, Leeuwenhoek observó entre
otras cosas, bacterias y protozoarios en el agua de lluvia, en infusiones diversas y
en su sarro dental. Leeuwenhoek registró cuidadosamente sus observaciones en
una serie de cartas dirigidas a la British Royay Society, sus cartas fueron leídas
con interés por científicos británicos, pero es claro que la importancia y
trascendencia de sus descubrimientos no fue debidamente valorada.
El estudio microscópico de los microorganismos proporciona datos fundamentales
para su identificación, determinar su forma, tamaño, reacción a diferentes colorantes
y estructuras celulares; orienta al microbiólogo cuando trata de aislar
microorganismos y permite establecer características como la pureza, presencia de
contaminantes, variedad o edad de una población, entre otras cosas. Por ello, el
microscopio es uno de los instrumentos de mayor importancia en bacteriología, su
descubrimiento y desarrollo fueron los acontecimientos más importantes en el
florecimiento de la microbiología.
28
MICROSCOPIO
Los microscopios pertenecen a dos clases, el de luz (óptico) y el electrónico, según
el principio en el que se basa la amplificación. El microscopio mediante el cual la
amplificación se obtiene por medio de un sistema de lentes ópticos (microscopios
de luz) abarca los siguientes tipos: a) campo claro o luminoso, b) campo oscuro, c)
luz ultravioleta, d) fluorescencia y e) contraste de fases. El microscopio electrónico,
como su nombre lo indica, se basa en un haz de electrones (en lugar de ondas
luminosas) y un campo magnético para obtener la imagen amplificada. La
microscopia electrónica abarca dos tipos: a) microscopia electrónica de transmisión
y b) microscopia electrónica de barrido, esta última presenta la característica de dar
una notable impresión tridimensional, aunque su poder de resolución es menos que
el obtenido al utilizar un microscopio electrónico de transmisión.
MICROSCOPIO ÓPTICO DE CAMPO CLARO

En la microscopia de campo claro, el campo microscópico o área observada está
brillantemente iluminada y los objetos en estudio aparecen más oscuros en el fondo.
Un microscopio óptico de fondo claro consiste en un armazón de metal que contiene
tres sistemas principales que son:
Sistema mecánico: Consta de los siguientes elementos: Base, brazo y cuerpo del
tubo, los cuales sirven para mantener en posición todos los componentes del
microscopio. Tubo intercambiable del microscopio, el cual se encuentra insertado
en la parte superior del cuerpo del tubo.
29
Soporta el ocular y permite alinearlo con el objetivo seleccionado para una
observación. Platina, en ella se coloca la preparación o portaobjetos de estudio. La
platina está equipada con pinzas para sujetar la preparación y dos tornillos para
desplazarla, lo cual facilita la localización del objeto y la revisión de la preparación.
Revólver, es el disco que soporta a los objetivos y que se gira para colocar el
objetivo requerido bajo el tubo. Tornillo macrométrico o de enfoque rápido, permite
desplazar el tubo del microscopio acercando el objetivo a la preparación, lo cual
permite localizar la imagen y lograra un enfoque aproximaDe acuerdo con la teoría
óptica, la resolución más alta posible en un microscopio de luz compuesto permitirá
ver con claridad objetos cuyo diámetro sea de casi 0.2 μm. De este modo, en un
microscopio óptico compuesto, los objetos de dimensiones menores a las
señaladas, al ser amplificados, darán lugar a imágenes difusas.
MICROSCOPIO ÓPTICO DE CAMPO OSCURO

El efecto producido por la técnica del campo oscuro consiste en un fondo negro
sobre el cual se ven los objetos intensamente iluminados. La microscopía de campo
oscuro es de un valor especial en el examen de microorganismos sin teñir que
exhiban algún aspecto morfológico en vivo y en suspensión (preparaciones
húmedas y en gota pendiente).
MICROSCOPIO ÓPTICO DE LUZ ULTRAVIOLETA

El microscopio de luz ultravioleta permite un mayor poder de resolución con útiles y
mayores ampliaciones que las obtenidas con el microscopio de luz ordinario, ya que
la luz ultravioleta tiene una longitud de onda más corta (180-400 nm frente a 400-
700 nm) que la luz visible, su aplicación principal es la diferenciación de
componentes celulares sobre la base de una mayor o menor facultad de absorber
la luz ultravioleta.
MICROSCOPIO ÓPTICO DE FLUORESCENCIA

Algunas sustancias químicas absorben la energía de las ondas ultravioletas y la
emiten como ondas visibles de mayor longitud. Así, un material aparece con un color
a la luz ordinaria y con otro del todo distinto con luz ultravioleta, a estos materiales
se les llama do. Tornillo micrométrico o de enfoque fino, éste puede desplazar el
tubo en forma más lenta, lo cual permite hacer movimientos finos que se requieren
para obtener un enfoque exacto y preciso.
MICROSCOPIO ÓPTICO DE CONTRASTE DE FASES

Mejora las diferencias de contraste entre las células y el medio circundante, lo que
permite observar células vivas sin tinción.
30
El microscopio de contraste de fases permite que la luz pase a través de objetos
transparentes, como las células y se fusiona en diferentes fases dependiendo de
las propiedades de los materiales de a través de los cuales pasa. Este efecto se
amplifica en la lente objetivo, lo que da origen a la formación de una imagen oscura
en un entorno luminoso. Permite el examen de estructuras celulares en células vivas
de organismos más grandes: levaduras, algas, protozoarios y algunas bacterias.
MICROSCOPIO ELECTRÓNICO
El microscopio electrónico utiliza ondas de electrones y campos magnéticos para
producir la imagen, se utiliza principalmente para el examen de virus y de la
ultraestructura de las células microbianas. La resolución superior de la microscopia
electrónica se debe al hecho de que los electrones tienen una longitud de onda
mucho más corta que los fotones de la luz blanca. Hay dos tipos de microscopio
electrónico el microscopio electrónico de trasmisión, que tiene muchas
características en común con el microscopio de luz y el microscopio electrónico de
barrido conociendo los parámetros anteriores y un manejo adecuado del
microscopio, se espera la obtención de resultados satisfactorios.
31
Indicadores %
procedimientos
Examen parciales 30
Total 100
LISTA DE COTEJO

Manual Práctico?
solicitados?
¿Identificaste todo el material, y las partes
del microscopio?
32
OBJETIVO DE LAS COLORACIONES
Conocer los diferentes tipos de tinciones y colorantes para realizar el análisis
microscópico de una muestra, observando la morfología microscópica del
microorganismo y sus afinidades tintoriales.
GENERALIDADES
La célula bacteriana tiene una pared externa, gruesa, que tiene muy poca afinidad
por las tinciones y no es permeable a ellas. Durante la elaboración de los frotis sobre
las laminillas, esta barrera se altera de forma tal que la tinción puede difundirse a
través de la pared celular y el protoplasma se mezcla con ella. La fijación de los
frotis tiene como propósito matar al microorganismo y unirlo al portaobjetos,
preservando el estado natural del microorganismo con distorsiones mínimas.
Las tinciones sirven para demostrar la estructura y morfología de las bacterias.
33
TIPOS DE COLORANTES
En las tinciones utilizamos colorantes que son sales compuestas de un ión positivo
y un ión negativo, el ión colorido recibe el nombre de cromóforo; así, tenemos tres
tipos de colorantes:
BÁSICOS (CATIONICOS): El ión colorido (cromóforo) es positivo (catión colorido y

anión incoloro). Tiñen componentes ácidos
ÁCIDOS (ANIÓNICOS): El ión colorido (cromóforo) es negativo (anión colorido y
catión incoloro). Tiñen componentes básicos.
NEUTROS: Sal compuesta de un colorante ácido y un colorante básico.
TINCIONES: De acuerdo a los fines para los que son utilizadas y los tipos de
colorantes empleados, las tinciones pueden dividirse en varios grupos:
TINCIÓN SIMPLE: Se hacen empleando un solo colorante y se usan por lo general
sólo para resaltar las características morfológicas más marcadas de la célula
bacteriana; el valor de esta clase de tinción es su simplicidad y facilidad de empleo.
TINCIÓN DIFERENCIAL: Se usan dos o más colorantes y uno de ellos sirve de
contraste. Se denominan diferenciales porque discriminan ciertas características y
permiten agrupar a los microorganismos; ejemplos: Tinción de Gram y Tinción de
Ziehl Neelsen.
Una de las coloraciones más importantes es la tinción de Gram, la cual separa las
bacterias en dos grupos, Gram positivos y Gram negativos.
La técnica se basa en la decoloración del cristal violeta por alcohol-acetona y un
posterior contraste con safranina. Se considera que las reacciones de los colorantes
con las bacterias dando una reacción Gram positiva, se debe a la presencia de un
complejo de ribonucleato de magnesio-proteína, que no existe en las Gram
negativas. Otras teorías explican la reacción de Gram, como una diferencia en el
punto isoeléctrico del contenido celular entre las bacterias Gram positivas y las
Gram negativas, o debido a una permeabilidad diferencial para el complejo soluble
en el alcohol de iodo-colorante (El complejo cristal violeta-iodo, es retenido en la
pared celular por un compuesto lipoproteíco poliglicerofosfato).
TINCIÓN ESPECIAL: Se usa para resaltar características o estructuras específicas;
gránulos metacromáticos, cápsulas, flagelos, esporas.
Los mordientes son necesarios para la tinción de ciertas estructuras especiales
como cápsulas, flagelos y paredes celulares que tienen poca afinidad tintorial. El
proceso consiste en el tratamiento de las células antes, después o durante la tinción
con sustancias que tienen afinidad por el material celular y por la tinción y unen a
ambas.
34
Material y reactivos
❖ Material
❖ Portaobjetos
❖ Asa bacteriológica
❖ Mechero buncen
❖ Papel seda
Material biológico
❖ Klebsiella pneumoniae
❖ Corynebacterium sp.
❖ Mycobacterium phlei
❖ Bacillus subtilis
❖ Escherichia coli
❖ Staphylococcus aureus
Reactivos
❖ Cristal violeta.
❖ Lugol.
❖ Alcohol-acetona.
❖ Safranina.
❖ Carbolfucsina.
❖ Alcohol-ácido.
❖ Azul de metileno boratado.
❖ Azul de metileno.
❖ Verde de malaquita.
❖ Colorante de Albert.
❖ Rojo Congo.
❖ Mordiente de cápsula.
❖ Aceite de inmersión.
Equipo
❖ Microscopio óptico de campo claro.
35
Procedimiento
I. PREPARACIÓN DE FROTIS
CULTIVOS LÍQUIDOS O SÓLIDO, O MATERIAL BIOLÓGICO FRESCO
❖ Si el cultivo es líquido tómese una asada y extiéndase sobre el portaobjetos.
❖ Déjela secar al aire.
❖ Teñir el frotis con uno de estos colorantes, cubriendo el frotis con 1 min de
tiempo cubierto por un colorante, lavar y secar.
TINCIONES
I. TINCIONES DIFERENCIALES
Tinción de Gram
❖ Cubrir su frotis con cristal violeta por un minuto
❖ Lavar con agua de la llave.
❖ Aplicar lugol por un minuto. 4. Lavar con agua y secar rápidamente.
❖ Decolorar por de 7 a 8 segundos con la mezcla alcohol-acetona.
❖ Lavar y dejar secar
❖ Contrastar con safranina durante 30 segundos.
❖ Lavar con agua y dejar secar. 9. Observar al microscopio a inmersión.
NOTA: El tiempo de aplicación de cristal violeta, de alcohol-acetona y la safranina
pueden ser modificados a criterio, dependiendo de la maduración de los colorantes
y del aspecto que tenga la preparación al microscopio (Fenómeno de añejamiento
de los colorantes)
36
Tinción de Ziehl Neelsen
1. Agregar carbolfucsina al frotis calentando a emisión de vapores por 5
minutos.
2. Lavar con agua.
3. Decolorar con alcohol-ácido hasta eliminar el colorante aproximadamente un
minuto.
4. Lavar con agua.
5. Agregar colorante de contraste azul de metileno por 30 segundos.
6. Dejar secar y observar con el objetivo de inmersión.
II. TINCIONES ESPECIALES
COLORACIÓN DE ESPORAS
La esporulación es un mecanismo especializado de supervivencia que han
desarrollado algunos bacilos generalmente Gram positivos como los géneros
Bacillus y Clostridium. Las esporas presentan mayor resistencia al efecto letal del
calor, desecación, alteraciones químicas e irradiaciones.
1. Hacer un frotis y fijar al calor.
2. Agregar verde de malaquita y calentar la preparación a emisión de vapores
por espacio de un minuto, cuidar que no se seque el colorante.
3. Lavar con agua.
4. Cubrir con safranina por 30 segundos.
5. Dejar secar y observar a inmersión.
Tinción de Zhiel-Neelsen
37
COLORACIÓN DE CÁPSULAS
La cápsula bacteriana es una estructura laxa semejante a un gel que varía en
grosor, densidad y adherencia a la pared celular. Esta cápsula es demostrada por
tinciones especiales; la sustancia capsular es un polisacárido o poliurónido
relacionado con la virulencia del microorganismo.
Técnica de rojo congo
1. Coloque una gota de rojo Congo y K. pneumoniae en un portaobjetos.

2. Hacer una suspensión de la cepa.
3. Fijar.
4. Adicionar mordiente de cápsula por 3 minutos.
5. Lavar con agua.
6. Dejar secar.
7. Observar a inmersión.
Coloración de gránulos metacromáticos
1. Cubrir el frotis con el colorante de Albert por 5 minutos.
2. Lavar con agua y dejar secar.
3. Aplicar lugol por 1 minuto.
4. Lavar con agua y dejar secar.
5. Observar a inmersión.
Reporte de resultados
Describir la forma, color, agrupación y estructuras observadas para cada
microorganismo y registrarlo en el siguiente cuadro.
MICROORGANISMO FORMA COLOR AGRUPACION ESTRUCTURA
38
Indicadores %
procedimientos
Examen parciales 30
Total 100
LISTA DE COTEJO

Manual Práctico?
solicitados?
práctica?
39
PRÁCTICA VI
MÉTODOS DE CONTROL SOBRE EL
CRECIMIENTO MICROBIANO
40
OBJETIVOS
Evaluar y comprobar prácticamente el efecto de la temperatura sobre el desarrollo
de los microorganismos.
Relacionar el efecto de la temperatura con algunas características de los
microorganismos.
El estudiante aprenderá las diversas técnicas de laboratorio para el control
bacteriano.
GENERALIDADES
Los microorganismos son vitales para la vida en el planeta, los seres humanos
simplemente no podríamos existir sin ellos. Sin embargo, algunos de ellos tienen
efectos nocivos en nuestra vida diaria, ya sea produciendo enfermedades o
contaminando productos de interés. Es por esta última razón, que los seres
humanos han tratado de encontrar maneras para controlar a los microorganismos,
ya sea matándolos o simplemente deteniendo su desarrollo.
Muchas bacterias poseen en su forma vegetativa (forma metabólicamente activa),

una tolerancia limitada a variaciones en su medio ambiente y poseen poca
capacidad de supervivencia ante condiciones adversas de desarrollo; otras, en
cambio, producen estructuras de resistencia a dichas condiciones adversas
denominadas esporas.
Los mecanismos de control microbiológico deben ser capaces ya sea, de eliminar o
simplemente limitar el desarrollo de formas tanto vegetativas como esporuladas.
Entre los mecanismos existentes para controlar el crecimiento microbiano se

encuentran los tratamientos físicos; estos métodos físicos de control se han utilizado
ampliamente a lo largo de la historia de la humanidad sobre todo, para conservar
alimentos (secado y salado son probablemente las técnicas más antiguas utilizadas
por el ser humano).
Cuando se debe seleccionar un método para controlar el desarrollo de los
microorganismos, se debe considerar el (los) efecto(s) que dicho método pueda
tener sobre los productos que se deseen preservar, por ejemplo, ciertas vitaminas
y antibióticos en solución pueden ser inactivados por el calor. Los principales
métodos físicos utilizados para controlar el desarrollo de microorganismos son:
CALOR
La aplicación de calor constituye el método más sencillo para esterilizar materiales,
siempre y cuando el material mismo sea resistente al daño por calor. El calor actúa
sobre los microorganismos desnaturalizando las proteínas celulares, los ácidos
nucleicos y desorganizando las membranas celulares.
41
Como es de esperarse, no todas las células expuestas a un tratamiento microbicida
(calor, radiaciones, presión osmótica alta, etc.) mueren al mismo tiempo, sino que
lo hacen de manera exponencial; esto quiere decir, que el número de células
sobrevivientes decae en una unidad logarítmica por cada unidad de tiempo, esta
unidad de tiempo se conoce como tiempo de reducción decimal o valor-D, y es el
tiempo, expresado en minutos, en el cual, el 90% de una población bacteriana
morirá a una temperatura dada. Durante valores D subsecuentes, el 90% de las
bacterias sobrevivientes será eliminado de manera consecutiva. Para destrucción
térmica, la temperatura utilizada en el tratamiento puede indicarse en forma de
subíndice, por ejemplo, el valor-D a 90°C se escribe D90°C. Además del valor-D,
otros dos términos que son útiles para describir la susceptibilidad de un determinado
microorganismo a la destrucción por calor son el Punto Térmico Mortal y el Período
Térmico Mortal. El Punto Térmico Mortal es la temperatura mínima requerida para
matar todos los microorganismos en una suspensión líquida en 10 minutos. El
Período Térmico Mortal es el tiempo mínimo necesario para destruir una población
de microorganismos a una temperatura dada. Tanto el Punto como el Período
Térmico Mortales sirven de guía para indicar el tratamiento térmico requerido para
destruir una población bacteriana en específico.
BAJAS TEMPERATURAS
Las bajas temperaturas no matan a la mayoría de los microorganismos, de hecho,
se utilizan para conservar cultivos de estos por períodos limitados. Si se mantiene
a los microorganismos a una temperatura por debajo de su valor mínimo de
crecimiento, estos comenzarán a morir lentamente. Por otra parte, al congelar una
población bacteriana, se destruyen algunas células, pero los sobrevivientes
permanecen viables en estado congelado por largos períodos. Debido a que las
bacterias son muy pequeñas, no se logran formar cristales de agua en su interior
como ocurren en células eucariotas; por lo tanto, no sufren destrucción mecánica
intracelular. En su lugar, las bacterias son destruidas debido a la alta fuerza
osmótica que se desarrolla conforme el agua del ambiente se va congelando.
FILTRACIÓN
Es un proceso mecánico utilizado para remover microorganismos de líquidos
materiales sensibles al calor, como algunos medios de cultivo, enzimas, vacunas y
antibióticos. Algunas áreas hospitalarias utilizan filtros HEPA (high-efficiency
particulate air) para disminuir el número de microorganismos en el aire. Estos filtros
pueden retener casi todos los microorganismos mayores a 0.3 µm de diámetro.
42
DESECACIÓN
En ausencia de agua los microorganismos no pueden crecer o reproducirse pero
pueden mantenerse viables por años. Cuando hay agua disponible, los
microorganismos vuelven a crecer y a dividirse. El agua puede eliminarse del medio
ambiente por evaporación o sublimación. La primera casi nunca se utiliza en los
laboratorios debido a que produce cambios químicos. Sin embargo, la sublimación
es ampliamente utilizada en el proceso de liofilización. La resistencia a la
desecación varía de acuerdo a la especie y al medio ambiente en el que se
encuentre el microorganismo.
PRESIÓN OSMÓTICA
El uso de altas concentraciones de sal o azúcar para conservar alimentos se basa
en los efectos de la presión osmótica. Las altas concentraciones de estos solutos
en el medio crean un ambiente hipertónico que daña a las células por plasmólisis.
Este método de control se asemeja al de desecación, ya que priva a la célula del
agua que necesita para poder desarrollarse. Este método de control es ampliamente
utilizado en la industria de alimentos.
RADIACIONES
Las radiaciones tienen diversos efectos sobre las células, dependiendo de su
longitud de onda, intensidad y tiempo de exposición. Existen dos tipos de
radiaciones capaces de matar microorganismos: Las radiaciones ionizantes (rayos
gamma y rayos X) y las no ionizantes (luz ultravioleta).
Material
❖ 4 placas de Agar Nutritivo.
❖ Asa bacteriológica.
❖ Mechero bunsen.
❖ Pipetas graduadas estériles.
❖ Tubo de 13x100 con 5 mL de caldo nutritivo.
❖ 4 tubos de 13x100 estériles.
❖ Gradilla.
❖ Olla de presión.
❖ Tubo número 1 de la escala de McFarland
Material biológico
❖ Escherichia coli
❖ Bacillus subtilis
43
Equipo
❖ Incubadora.
❖ Baños metabólicos.
Procedimiento
PREPARACIÓN DE LAS CEPAS.
a) En un tubo que contenga caldo nutritivo, colocar varias asadas de la cepa E.
coli hasta obtener una suspensión turbia homogénea que corresponda al
tubo número 1 de la escala de McFarland (aproximadamente una población
bacteriana de 3X 108 bacterias/mL).
b) Distribuir a cada equipo, una alícuota de esta suspensión en un tubo de
ensaye estéril*.
c) Etiquetar cuatro tubos estériles para E. coli.
d) A estos tubos, distribuir volúmenes iguales de caldo nutritivo en condiciones
de esterilidad (a partir del tubo que contiene 5 mL de caldo nutritivo).
e) Diluir la suspensión bacteriana original en estos tubos a una proporción 1:2
Preparar la cepa de B. subtilis de la misma manera.
f) Para esta cepa, etiquetar los tubos con los valores de temperatura 80, 90,
110 y 120 °C. *Estos pasos serán realizados por los profesores de
laboratorio.
DETERMINACIÓN DEL PUNTO TÉRMICO MORTAL

Para Escherichia coli
❖ Colocar los baños metabólicos a 35, 45, 55 y 65 °C respectivamente.
❖ Etiquetar los 4 tubos de la suspensión diluida de E. coli con las temperaturas
indicadas.
44
Dividir una placa de agar nutritivo en seis sectores de la siguiente manera:
Determinación del punto térmico mortal (E. coli).

En el quinto sector sembrar una asada de la suspensión original (sin tratamiento
térmico) como control positivo. Dejar el sexto sector sin inocular como control
negativo.
Para Bacillus subtilis. Realizar el mismo procedimiento que para E. coli pero a
temperaturas de 80, 90, 110 y 120 °C (en este caso, para los dos últimos valores
de temperatura se requerirá de ollas de presión en vez de baños metabólicos).
45
Determinación del punto térmico mortal (B. subtilis).
❖ Determinación del período térmico mortal.
Para Escherichia coli
❖ Dividir una placa de agar nutritivo en seis sectores de la siguiente manera:
Determinación del período térmico mortal.
Colocar el tubo con la suspensión diluida de E. coli en el baño metabólico a la
temperatura de 65 °C por un período de 5 minutos.
a) Tomar una asada y sembrar por estría simple en el sector de la placa
correspondiente a 5 minutos.
b) Volver a colocar el tubo en el baño metabólico por otros 5 minutos (es decir,
completar 10 minutos en total) y sembrar de igual manera en el sector
correspondiente.
c) Colocar el tubo otros 10 minutos en el baño (20 min en total) y sembrar de
igual manera.
d) Repetir el procedimiento por 10 minutos más (30 min).
e) Sembrar una asada de la suspensión original (sin tratamiento térmico) en el
quinto cuadrante.
f) Dejar sin inocular el sexto cuadrante.
Para Bacillus subtilis
a) Realizar el mismo procedimiento que para Escherichia coli utilizando en este
caso la temperatura de 90 °C para el baño metabólico.
Reporte de resultados
a) Determinación del Punto Térmico Mortal. Interpretar para cada cepa utilizada
la temperatura a la que no hubo desarrollo bacteriano, el cual corresponde al
punto térmico mortal.
b) Determinación del Período Térmico Mortal. Interpretar para cada cepa
utilizada el tiempo al que no hubo desarrollo bacteriano, el cual corresponde
al período térmico mortal.
APÉNDICE: ESCALA DE MCFARLAND.

La utilidad de esta escala es poder realizar suspensiones bacterianas ajustadas a
un patrón. La finalidad, es establecer una relación entre una precipitación química y
una suspensión bacteriana. La escala se basa en la mezcla de concentraciones
crecientes de cloruro de bario con concentraciones decrecientes de ácido sulfúrico,
obteniéndose un precipitado de sulfato de bario en cantidades diferentes. La
turbidez producida por cada mezcla ha sido calibrada para aproximar un cierto
número de bacterias por unidad de volumen. En otras palabras, la turbidez que
resulta de agitar bien estas mezclas, se aproxima a la producida por un cierto
número de bacterias en suspensión.
46
La escala cuenta con 10 estándares base (en la tabla aparece la composición de
estos) y por espectrofotometría se crea una curva patrón, de forma tal que se va a
poder detectar la concentración de diluciones bacterianas (de manera aproximada,
ya que depende de Factores como el tamaño de la bacteria, la formación de
agregados, etc.). Cada estándar de la escala es denominada tubo de McFarland y
se le asigna un número para reconocer de qué estándar de la escala se está
hablando. Así, el tubo 3 de la escala de McFarland corresponde a aproximadamente
9.0x108 bacterias por mililitro.
ESCALA MCFARLAND
Nº BaCl2 H2SO4 Vf Nº Células
0,048M 0,36M
ml Ml Ml
0,5 0,05 9,95 10 1,5 · 108
1 0,1 9,9 10 3 · 108
2 0,2 9,8 10 6 · 108
3 0,3 9,7 10 9 · 108
4 0,4 9,6 10 12 · 108
5 0,5 9,5 10 15 · 108
6 0,6 9,4 10 18 · 108
7 0,7 9,3 10 21 · 108
8 0,8 9,2 10 24 · 108
9 0,9 9,1 10 27 · 108
10 1 9 10 30 · 108
Materiales y reactivos Reactivos

Materiales Cloruro de bario 0,36 M
Tubos de ensayo y tapón Ácido sulfúrico 0,048 M
Pipetas con diferentes volúmenes Agua destilada

Espectrofotómetro Agua de muestra peptonada
Cubetas
La curva del crecimiento bacteriano.

El premio Nobel de Medicina Jacques Monod resume en este artículo de 1949, un
hecho bien conocido en el campo de la microbiología: La curva de crecimiento
bacteriano las bacterias toman nutrientes, aumentan su tamaño, duplican su
material genético y lo reparten por igual en dos células hijas de igual tamaño que
cada una porta una copia idéntica de su ADN. Si las condiciones se mantienen,
cada célula hija sería capaz de originar otras 2 células hijas. En el caso de
Escherichia coli (un habitante de nuestro intestino) tarda aproximadamente media
hora en dividirse bajo condiciones óptimas.
47
El poder calcular el número final de bacterias luego de determinado número de
divisiones con elevar la base 2 al exponente n, es lo que define aquella parte de la
curva de crecimiento bacteriano llamada EXPONENCIAL, logarítmica o vegetativa
(recordemos que el término ‘logaritmo’ es sinónimo de ‘exponente’).
Así las etapas serán
Etapa 1: (etapa de adaptación)
Etapa 2: (aceleramiento del crecimiento)

Etapa 3: (crecimiento exponencial o logarítmico)
Etapa 4: (desaceleración del crecimiento)
Etapa 5: (fase estacionaria)
Etapa 6: (fase de muerte)
48
Indicadores %
procedimientos
Examen parciales 30
Total 100
LISTA DE COTEJO

Manual Práctico?
solicitados?
¿Conoce cómo se preparan las cepas
microbianas y la determinación del punto
térmico mortal?
49
PRÁCTICA V
CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE
CULTIVO MICROBIOLÓGICOS Y SU
UTILIDAD EN EL DIAGNÓSTICO
50
OBJETIVO
Analizar el fundamento de los principales tipos de medios de cultivo para
bacteriología.
GENERALIDADES
Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros
compuestos que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los
microorganismos.
Todos los organismos necesitan para su desarrollo:
1. Sustancias esenciales para la síntesis de sus constituyentes celulares.
2. Una fuente de energía para que realicen sus funciones vitales.
3. Condiciones ambientales óptimas.
Es posible cultivar la mayoría de las especies de bacterias, hongos y algunos
protozoarios de importancia médica en medios artificiales, pero no existe un medio
de cultivo universal que permita el crecimiento de todos ellos.
Hay algunas especies que solo pueden cultivarse en animales de experimentación,

por ejemplo, Mycobacterium leprae y Treponema pallidum.
Los virus, las Clamidas y las Rickettsias no se producen in vitro, si no tiene células
de tejidos vivos.
UTILIDAD EN LOS MEDIOS DE CULTIVO:
❖ Aislamiento.
❖ Identificación.
❖ Propagación.
❖ Conservación.
❖ Recuerdo.
❖ Estudios especiales.
FACTORES DE MÁXIMA IMPORTANCIA EN LA FORMULACIÓN DE

UN MEDIO DE CULTIVO.
1. Debe contener elementos nutritivos esenciales.
2. Debe tener un contenido de humedad satisfactorio.
3. Debe tener un pH adecuado.
4. La consistencia del medio debe ser favorable para los fines establecidos.
5. Debe crecer el microorganismo deseado, si es selectivo, los otros deben
ser inhibidos.
51
REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES:
HUMEDAD: Al contrario de lo que sucede con los organismos superiores, cuyos
integumentos especializados retienen el agua, el metabolismo de las bacterias
depende de un ambiente en el que exista agua.
2. FUENTE DE CARBONO: Brinda energía a través de la oxidación y además
proporciona componentes estructurales. Las bacterias autotróficas (litotrosficas)
solo requieren agua, sales inorgánicas y dióxido de carbono para su desarrollo. Las
baterías heterotróficas (organotroficas) que exigen una forma orgánica para su
crecimiento como los azucares o hidratos de carbono.
FUENTE DE NITRÓGENO: Brinda nitrógenos para la síntesis de aminoácidos,
ácidos nucleicos y coenzimas. Muchos medios contienen la peptona como fuente
de nitrógeno. Las peptonas son hidrolisados de proteínas (soya, carne, gelatina,
caseína) por medio de una reacción acida, alcalina o por digestión enzimática. Están
construidas por mezcla de proteasas, polipeptidos y aminoácidos que son
fácilmente asimilados por los microbios en crecimiento; además, son solubles y de
fácil incorporación a la mayoría de los medios.
FACTORES DE CRECIMIENTO: Se llaman factores de crecimiento aquellos
compuestos orgánicos específicos que son necesarios en cantidades muy
pequeñas y no pueden ser sintetizados por el microorganismo. Muchas de las
bacterias heterotróficas son incapaces de crecer a menos que se le suministren
factores de crecimiento- Estas sustancias que habitualmente se pronuncian con el
medio de cultivo en forma de extractos de la levadura, carne, hígado, cerebro,
sangre entera, sangre desfibranada, plasma o suero, incluyen vitaminas,
aminoácidos, ácidos grasosos, purinas y pirimidinas.
IONES INORGÁNICOS: Cofactores necesarios para las enzimas; almacén d
energías; sistema de trasporte de electrones. Todas las bacterias requieren
pequeñas cantidades de un cierto número de iones inorgánicos (además del
nitrógeno, azufre y el fosforo presente en la mayoría de los nutrientes esenciales)
tales como el potasio, el magnesio, el calcio, hierro, manganeso, cinc, cobalto.
SISTEMA AMORTIGUADORES: El pH del medio que expresa su concentración de
iones hidrogeno, es extremadamente importante para el desarrollo de los
microorganismos, la mayoría de ellos crecen a pH aproximadamente neutros, y se
determina por medida colorimétrica o electrométrica. Debido a que muchas
bacterias elaboran productos metabólicos ácidos o básicos algunos componentes
son incorporados al medio de cultivo para mantener el pH dentro del rango óptimo
de crecimiento bacteriano. Una combinación de KH2PO4 (fosfato potásico
monobásico) y K2HPO4 (fosfato potásico dibasico), o sustancias como las peptonas
previenen una desviación del pH.
INDICADORES DE PH: Indicadores acido base se añade a menudo a los medios
de cultivo con objeto de detectar variaciones de pH.
52
CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS POR SU COMPOSICIÓN
MEDIOS EMPÍRICOS
La composición exacta de estos medios es desconocida al participar en ellas
sustancias de descomposición compleja y variantes (extractos de carne, levadura,
etc.).
MEDIOS SINTÉTICOS
Son medios químicamente definidos en los que se conoce su proporción exacta de
cada componente, se emplean para estudios de metabolismo y crecimiento
bacteriano.
MEDIOS SEMISINTÉTICOS
Su composición participan compuestos químicos puros y sustancias orgánicas de

naturaleza química poco definida (extracto de levadura, En peptona). Son los más
extensamente utilizados para el aislamiento e identificación de la mayoría de los
microorganismos.
CLASIFICACIÓN DE ACUERDO A SU CONSISTENCIA

LÍQUIDOS
Los elementos nutrientes se encuentran en una solución acuosa y reciben el nombre
de Caldos.
SÓLIDOS
Son medios líquidos a los que se les añade, sin alterar su valor nutritivo, una
sustancia solidificaste.
SEMISÓLIDOS
Son medios líquidos a los que añade una concentración de agar baja, según la
consistencia que se quiera obtener. Se utiliza principalmente para estudiar la
mortalidad de los microorganismos.
SUSTANCIAS USADAS COMO AGENTES SOLIDIFICANTES PARA

FORMULACIONES NO LIQUIDAS
EL AGAR: Es un polisacárido extraído de ciertas algas marinas principalmente de
la clase Rhodophyceae, en particular de la especie Gelidium corneum. Funde
aproximadamente a 92 °C Solidifica a no más de 42 °C. Es digerida por muy pocos
microorganismos y su adición al medio no afecta sus características nutricionales ni
su pH. La concentración de agar para un medio solido es del 2% y para un medio
semisólido es de 0.05-0.75%.
53
LA GELATINA: Es una mezcla de proteínas libre de carbohidratos obtenida a partir
de colágeno de la piel, cuero, tendones y huesos de animales. Forma un gel de
buenas características a concentraciones del 12-15% que permiten usarla como
soporte; Como pueden ser digerida por algunos microorganismos se usa el 3% para
determinar características proteolíticas. Su punto de fusión es de 22 °C, quedando
destruidas sus propiedades al alcanzar temperaturas superiores a los 100 °C.
PLASMA: Una variante de los medios sólidos son los medios condensados
preparados a partir de materiales coagulables como el suero o la albumina de huevo
u condensado en forma de pico de flauta a temperaturas cuidadosamente
controladas entre 70 y 80 °C.
CLASIFICACIÓN DE ACUERDO A SU APLICACIÓN

MEDIOS GENERALES O BÁSICOS: Contienen los nutrientes básicos que
permiten el desarrollo de una gran variedad de microorganismos, Por ejemplo Caldo
Nutritivo, agar nutritivo, etc.
MEDIOS ENRIQUECIDOS: Son medios básicos que se han enriquecido con

aditivos como son líquidos corporales, vitaminas, aminoácidos y proteínas
específicas. Por ejemplo Agar con sangre; agar chocolate, etc.
MEDIOS DE ENRIQUECIMIENTO: Son aquellos medios líquidos selectivos que
enriquecen la población de un microorganismo específico de una población mixta.
Se les incorporan sustancias para inhibir el crecimiento de microorganismos
distintos a aquellos para los que fueron ideados. Ejemplos Caldo selenito y Caldo
tetrationato que son útiles pare el enriquecimiento de especies de Salmonella y
Shigella.
MEDIOS DIFERENCIALES: Son aquellos en los que se pone de manifiesto
propiedades que un determinado tipo de microorganismo posee. Ejemplo agar
sangre, agar SS. La diferenciabilidad de muchos microorganismos se basa en la
producción de ácidos o álcalis a partir de varios sustratos utilizando por ellos. Es por
eso que muchos de estos medios incluyen indicadores de pH que permiten la
detección visual de estos cambios. Ejemplo agar MacConkey, agar SS.
MEDIOS ESPECIALES O DE ENSAYOS: Son medios empleados para comprobar
una o más características bioquímicas, se crearon con el fin de identificar y clasificar
a los microorganismos según sus actividades metabólicas. Ejemplo SIM, TSI, LIA,
etc.
MEDIOS PARA EL TRANSPORTE: Son medios semisólidos o líquidos, su función
es la de mantener la vialidad de los microorganismos durante varias horas,
permitiendo así el aislamiento de especies poco resistentes después de transcurrido
cierto tiempo entre la toma de muestra y la entrega en el laboratorio. Ejemplo Amies,
Cary Blair, Stuart.
54
Indicadores %
procedimientos
Examen parciales 30
Total 100
LISTA DE COTEJO

Manual Práctico?
solicitados?
de cultivos utilizados en la práctica?
55
PRÁCTICA VI
MEDIOS EN PLACAS PARA LA
BACTERIOLOGÍA DE RUTINA
56
MEDIOS EN PLACAS PARA LA BACTERIOLOGÍA DE RUTINA
Medio Componentes/comentarios Objetivo principal

Agar alcohol feniletílico Agar base nutritivo. El Aislamiento selectivo de
feniletanol inhibe el cocos grampositivos y
crecimiento de bacilos anaerobios
microorganismos gramnegativos.
gramnegativos.
Agar chocolate Medio extremadamente Cultivos de especies de
nutritivo, preparado con Haemophilus y
adición de sangre de especies patógenas de
cordero calentada sobre Neisseria.
80°C hasta que el medio se
torne parduzco, para liberar
la hemoglobina y entregar al
medio todos los factores de
crecimiento.
Agar Columbia Agar base Columbia con 10 Aislamiento selectivo de
colistina-ácido mg de colistina por litro, 15 cocos grampositivos.
nalidíxico (CNA) mg de ácido nalidíxico por
litro y sangre de carnero al
5%.
Agar con bilis y Agar base nutritivo con Aislamiento diferencial
esculina citrato férrico. La hidrólisis e identificación
de la esculina por los presuntiva de
estreptococos del grupo D le estreptococos grupo D
otorga un color castaño al y enterecocos.
medio; el desoxicolato de
sodio inhibe muchas
bacterias.
Agar eosina azul de Base de peptona con Aislamiento y
metileno (EMB) lactosa y sacarosa, eosina y diferenciación de
azul de metileno que actúan bacilos entéricos
como indicadores. fermentadores y no
fermentadores de
lactosa.
Agar Hektoen entérico Base de peptona con sales Medio diferencial y
(HE) biliares, lactosa, sacarosa, selectivo, para el
salicina y citrato de amonio aislamiento y
férrico. Los indicadores son diferenciación de
el azul de bromotimol y la especies de Salmonella
fucsina ácida. y Shiguella de otros
bacilos entéricos
gramnegativos.
57
Agar MacConkey Base de peptona con Aislamiento y
lactosa. Los diferenciación de bacilos
microorganismos entéricos gramnegativos
grampositivos son fermentadores y no
inhibidos por el cristal fermentadores de la
violeta y las sales lactosa.
biliares. Rojo neutro
como indicador.
Agar manitol salado Base de peptona, manitol Aislamiento selectivo de
y rojo fenol como estafilococos.
indicador. La
concentración de sal al
7,5% inhibe la mayoría
de las bacterias.
Agar sangre Agar con sustrato Cultivo de
nutritivo (extracto de microorganismos con
levadura, peptona, requerimientos
hidrolizado de hígado), especiales de cultivo,
cloruro de sodio, con 5% determinación de
de sangre de cordero. reacciones hemolíticas.
Agar Thayer-Martin Agar sangre base Selectivo para N.
enriquecido con gonorrhoeae y N.
hemoglobina y meningitidis.
suplemento B; los
microorganismos
contaminantes inhibidos
por colistina, nistatina,
vancomicina y
trimetoprima.
Caldo para Caldo base de peptona Medio líquido selectivo
gramnegativos (GN) con glucosa y manitol. El (enriquecimiento) para
citrato de sodio y el patógenos entéricos.
desoxicolato de sodio
actúan como agentes
inhibidores.
Caldo selenito Caldo base de peptona. Enriquecimiento para el
El selenito de sodio aislamiento de las
resulta tóxico para la especies de Salmonella.
mayoría de las
Enterobacteriaceae.
Caldo tetrationato Caldo base de peptona. Selectivo para especies
Las sales biliares y el de Salmonella y Shigella.
tiosulfato de sodio
inhiben los
microorganismos
58
grampositivos y
Enterobacteriaceae.
Caldo de tioglicolato Digerido pancreático de Favorece el crecimiento
caseína, caldo de soja y de anaerobios, aerobios,
glucosa que enriquece el microaerófilos y
desarrollo de la mayoría microorganismos
de los microorganismos. exigentes.
El tioglicolato y el agar
reducen el potencial
rédox.
Caldo tripticasa soja Caldo enriquecido con Caldo de enriquecimiento
(TSB) múltiples propósitos que utilizado para el
puede favorecer el subcultivo de diversas
crecimiento de muchas bacterias de cultivos
bacterias con primarios en placas de
requerimientos agar.
especiales de cultivo y
sin ellos.
59
Indicadores %
procedimientos
Examen parciales 30
Total 100
LISTA DE COTEJO

Manual Práctico?
solicitados?
de cultivos y los nombres de ellos
utilizados en la práctica?
60
PRÁCTICA VII
MÉTODOS DE SIEMBRAS
61
OBJETIVOS
❖ Aprender la técnica de siembra adecuada dependiendo de la consistencia
del medio de cultivo y la finalidad de dicha siembra (aislar, crecimiento
masivo, enriquecimiento, conteo semicuantitativo y/o metabolismo
bacteriano).
❖ Manipular los medios de cultivo en placa para obtener colonias aisladas

mediante el procedimiento de siembra en cuadrantes (agotamiento e inoculo
o siembra en T) y en tubo (medios líquidos, sólidos y semisólidos)
GENERALIDADES
En el laboratorio de microbiología todas las manipulaciones deben ser llevadas a
cabo de tal modo que se impida la contaminación en el área de trabajo; los
procedimientos utilizados se conocen como técnica aséptica, ésta tiene un doble
objetivo a) evitar que el operador se contamine con microorganismos procedentes
de las muestras o cultivos y b) evitar la contaminación de las muestras y cultivos
con microorganismos procedentes del ambiente o del propio operador. Principios
fundamentales de la técnica aséptica:
❖ Limpiar el área de trabajo antes y después de la sesión de laboratorio con la
solución sanitizante.
❖ Trabajar siempre al lado de la flama del mechero. Está flama crea a su
alrededor una atmósfera estéril y además se utilizará para esterilizar o
flamear el material usado durante la siembra (asas bacteriológicas).
❖ Las asas deben esterilizarse antes de utilizarlas y una vez esterilizadas
deben enfriarse antes de tomar la muestra de microorganismos con objeto
de no destruirlos con el calor. El asa se enfría sobre el agar o sobre el
material de vidrio (en zonas estériles del material de vidrio).
❖ Después de utilizar las asas se vuelven a esterilizar.
❖ Las bocas de los tubos y matraces de vidrio se flamean ligeramente una vez
destapados antes y después de la inoculación.
❖ Durante la inoculación los tapones se mantienen en la mano sujetándolos de
la parte que no entra en contacto con los tubos y matraces. Siempre que sea
necesario abrir un tubo, debe mantenerse en posición inclinada para que el
riesgo de contaminación sea mínimo. Las tapas de las placas de Petri nunca
deben colocarse sobre la mesa de trabajo.
El método de siembra va a depender de dos factores:

La consistencia del medio de cultivo: Líquido, semisólido, sólido (en placa o en
tubo)
La finalidad de la siembra: Aislar, hacer conteos, pruebas con antibióticos o
agentes químicos, metabolismo bacteriano, etc.)
62
SIEMBRAS
SIEMBRA EN PLACA DE AGAR
Dependiendo de la finalidad que se persiga existen varias técnicas de siembra:
❖ Aislamiento. Siembra en "T" o por cuadrantes o por agotamiento de inóculo.
❖ Siembra masiva.
❖ Siembra para recuentos semicuantitativos.
SIEMBRA EN TUBO
Depende de la consistencia del medio:
Líquido: Por dispersión o punto de contacto.
Semisólido: Punción con asa recta.
Sólidos: Siembra por picadura y estría o estría en pico de flauta.
Material
❖ Mechero.
❖ Asa recta.
❖ Asa en aro.
❖ Medios de cultivo elaborados en la práctica anterior.
Material biológico
❖ Cepas sugeridas por su profesor (cultivos puros).

❖ Procedimiento
❖ Trabajar siempre con técnicas asépticas (Ver aspectos teóricos).
TOMA DE INÓCULO
❖ Esterilizar el asa bacteriológica colocándola en un ángulo de 45º en la
periferia de la flama del mechero hasta que tome un color rojo vivo en las tres
cuartas partes del filamento del asa.
❖ Tomar el tubo de la cepa con la mano izquierda y retirar el tapón con los
dedos anular y meñique de la mano derecha sin que estos toquen la parte
del tapón que va dentro del tubo.
❖ Flamear la boquilla del tubo.
❖ Introducir el asa tocando las paredes del tubo para enfriarla o tocar un
extremo del agar donde no haya crecimiento.
❖ Tocar con el asa el crecimiento (no debe ser muy denso el inóculo). Retirar
el asa, flamear el tubo y tapar.
63
SIEMBRA EN PLACA DE AGAR
TÉCNICA DE AISLAMIENTO POR CUADRANTES (3
CUADRANTES) O AGOTAMIENTO DEL INÓCULO
❖ Tomar la placa Petri con la mano izquierda por la base con los dedos medio
a meñique y la tapa con los dedos pulgar e índice. Abrir la placa cerca del
mechero.
❖ Descargar en un primer cuadrante masivamente, hasta la mitad de la placa.
Tapar la caja.
❖ Girar la placa 90º.
❖ Esterilizar el asa. Enfriar tocando una parte de la periferia del agar (alejada
de la parte donde se hizo la descarga).
❖ Tocar con el asa el primer cuadrante tres veces y estriar el segundo
cuadrante hasta la mitad de la caja. (2º cuadrante)
❖ Nuevamente esterilizar el asa como se procedió anteriormente y realizar un
3er. Cuadrante (la estría es más abierta de manera que se obtengan colonias
aisladas)
SIEMBRA EN TUBOS
LÍQUIDOS (CALDOS)
Difusión (Punto de contacto): Inclinar el tubo en un ángulo de 30º, colocar el
inóculo tocando la superficie interna del vidrio por encima del punto donde el medio
forma un ángulo agudo. Colocar en posición vertical. El inóculo queda cubierto por
el medio difundiendo el crecimiento.
Dispersión: Colocar el inóculo rotando el asa dentro del medio de cultivo.
MEDIO SEMISÓLIDO
❖ Usar Asa recta para tomar el inóculo.
❖ Sembrar el medio por punción hasta las tres cuartas partes del tubo y retirar
el asa.(tratar de hacerlo por la misma vía de punción)
MEDIOS SÓLIDOS (AGARES)

❖ Fondo profundo.
❖ Usar asa recta.
❖ Punción y estría en pico de flauta
❖ Pico de flauta.
❖ Estriar la superficie del agar en forma de zig-zag.
❖ Puede usar asa recta o en arillo.
64
65
Indicadores %
procedimientos
Examen parciales 30
Total 100
LISTA DE COTEJO

Manual Práctico?
solicitados?
de cultivos?
66
PRÁCTICA VIII
CARACTERÍSTICAS MACROSCÓPICAS
DE CULTIVOS (MORFOLOGÍA DE LAS
COLONIAS)
67
OBJETIVO
Diferenciar las principales características de crecimiento de los microorganismos en
medios sólidos, semisólidos y líquidos.
GENERALIDADES
Una bacteria que se siembra en un medio de cultivo sólido quedará prácticamente
fija y al reproducirse dará origen a millones de células reunidas en una masa
observable a simple vista, a este conglomerado de bacterias se le conoce como
“colonia bacteriana” y posee características morfológicas útiles para el aislamiento
primario de la bacteria que le dio origen. La interpretación de los cultivos primarios
después de 24 a 48 horas de incubación requiere de una considerable habilidad, a
partir de las observaciones iniciales, el microbiólogo debe evaluar el crecimiento de
las colonias y decidir si son necesarios procedimientos adicionales.
Esta evaluación se hace observando las características y el número relativo de cada
tipo de colonia recuperado en medios de agar, así como determinando la pureza y
coloración de Gram y la morfología de las bacterias en cada tipo de colonia así como
observando los cambios en el medio que rodea dichas colonias, los cuales reflejan
actividades metabólicas específicas de las bacterias recuperadas.
La inspección de cultivos se lleva a cabo sosteniendo la placa en una mano y
observando la superficie del agar, cada placa debe estudiarse con cuidado ya que
las bacterias inicialmente recuperadas de muestras a menudo están en un cultivo
mixto y puede haber una variedad de tipos de colonias, colonias puntiformes
de bacterias que crecen lentamente pueden pasarse por alto entre colonias más
grandes, en particular si el crecimiento tiene tendencia a diseminarse sobre la
superficie de la placa. Durante el examen las placas deben de inclinarse en varias
direcciones, con una iluminación directa brillante, de modo que la luz se refleje
desde varios ángulos, se recomienda el uso de una lupa o microscopio para
disección como ayuda para detectar colonias diminutas o inmaduras y observar
mejor sus características.
Las placas de agar sangre también deben examinarse con transiluminación con una
luz brillante por detrás de la placa para detectar reacciones hemolíticas en el agar,
el tipo de hemólisis dependiendo del microorganismo puede ser:
Alfa. Se observa como un aclaramiento parcial de sangre alrededor de las colonias
con coloración verde del medio; el contorno de los eritrocitos se encuentra intacto.
Beta. Se observa una zona de aclaramiento total de sangre alrededor de las
colonias debido a la lisis de los eritrocitos.
Gamma. No hay ningún cambio en el medio alrededor de la colonia; no hay lisis o

coloración de los eritrocitos.
Alfa prima. Se observa un halo de lisis incompleta inmediatamente alrededor de las
colonias con una segunda zona de hemólisis completa en la periferia.
68
LAS CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS MÁS IMPORTANTES DE UNA
COLONIA EN AGAR, SON LAS SIGUIENTES:
Tamaño: se mide en milímetros.
Forma de la colonia: puntiforme, circular, filamentosa, irregular, rizoide, como en
huso.
Borde de la colonia: entero, ondulado, lobulado, lacerado, filamentoso, rizado.
Elevación: elevada, plana, convexa, pulvinada, embonada, umbilicada.

Superficie: lisa, brillante, radial, concéntrica, rugosa.
Luz transmitida: transparente u opaca.
Luz reflejada: brillante o mate.
Color de la colonia: depende del medio de cultivo y de las condiciones de
incubación; en algunos casos presentan pigmentación propia como resultado de su
metabolismo, la cual es constante y con valor diferencial.
Otras: las que dependen específicamente del medio.
Textura: Seca, viscosa, pastosa, cremosa, algodonosa, etc.
EN MEDIOS DE CULTIVO LÍQUIDO O SEMISÓLIDO, NO HAY FORMACIÓN DE
COLONIAS, LAS CARACTERÍSTICAS DE CULTIVO OBSERVADAS SON:
Caldo de nutrientes: superficie de crecimiento: Floculenta, anillada, peliculada y
membranosa.
Siembra por picadura en medio de cultivo sólido o semisólido: forma de
crecimiento: Filiforme, perlada, papilar, vellosa, arborescente.
69
Indicadores %
procedimientos
Examen parciales 30
Total 100
LISTA DE COTEJO

Manual Práctico?
solicitados?
de cultivos y la morfología de las colonias
estudiadas en la práctica?
70
PRÁCTICA IX
TOMAS DE MUESTRAS EN MICROBIOLOGÍA
RECOGIDA Y TRANSPORTE DE MUESTRAS
71
OBJETIVO
El estudiante aprenderá a realizar una de la toma, transporte y conservación de las
muestras microbiológicas reseñando el material necesario, la técnica de obtención,
volumen, número y transporte de cada una de ellas, según las distintas
localizaciones y características especiales de aquellas o de los microorganismos a
investigar.
GENERALIDAD
El diagnóstico de las enfermedades infecciosas se basa en el estudio de los
síntomas y signos clínicos, así como en la demostración de la presencia del agente,
de productos o de la huella que éste ha dejado en su contacto con el sistema
inmune del individuo. El diagnóstico clínico es, en muchos casos, orientador luego
de evaluar los datos que ofrecen la historia clínica y la exploración pero, la
confirmación de un diagnóstico clínico requiere en enfermedades infecciosas el
diagnóstico etiológico que confiere el Laboratorio de Microbiología Clínica.
72
RECOGIDA Y TRANSPORTE DE LAS MUESTRAS
La idoneidad de las muestras enviadas al laboratorio de Microbiología depende del
cumplimiento de una serie de medidas o reglas referentes a: procedimiento de
obtención, cantidad enviada y transporte rápido y adecuado al laboratorio.
Como reglas generales cabe indicar las siguientes:
❖ Antes de recoger la muestra, considerar el riesgo/beneficio de la recogida de
la muestra para el paciente.
Cada muestra deberá ir acompañada de un volante de petición, que deberá estar
correcta, legible y completamente cumplimentado (2020 del 21 enero):
❖ Identificación del paciente.
a) Apellido 1º, Apellido 2º, Nombre.

b) Nº de historia.
c) Fecha de nacimiento.
d) Sexo.
e) Diagnóstico permanente.
f) Teléfono/dirección.
MUESTRAS DEL TRACTO RESPIRATORIO

MUESTRAS DEL TRACTO RESPIRATORIO SUPERIOR
EXUDADO FARINGEO
Se utiliza para el diagnóstico de faringitis estreptocóccica. Excepcionalmente se
pueden requerir búsqueda de otros patógenos (por ejemplo: Neisseria gonorrhoeae)
consultar con el laboratorio.
A. MATERIAL NECESARIO.
Bajalenguas (imprescindible) - Hisopo de algodón con medio de transporte.
(Stuart, Amies)
B. TÉCNICA.
Bajo visión directa, con la ayuda del bajalengua, se tocará con el hisopo en todas
las partes con exudado, membranas o inflamación. Se deben frotar las criptas
tonsilares y la faringe posterior. En lo posible no tocar la mucosa oral, lengua, úvula
ni dientes.
C. NÚMERO DE MUESTRAS Y/O VOLUMEN.
Basta con un hisopo.
73
D. TRANSPORTE Y CONSERVACION.
Envío inmediato al laboratorio (no superior a 2 horas). Si no es posible, conservar
en heladera a 4ºC hasta 12 horas. D. OBSERVACIONES. Se investigará
rutinariamente la presencia de Streptococcus beta-hemolítico del grupo A (S.
pyogenes) y otros grupos beta hemolíticos como C y G.
CAVIDAD OROFARINGEA.
Esta muestra se emplea habitualmente para el diagnóstico de la llamada "Angina

de Vincent". Este tipo de muestra conviene realizarla en el Laboratorio de
Microbiología, coordinando con un Microbiólogo.
❖ Hisopo de algodón sin medio de transporte.
❖ Porta objetos limpios.
B. TÉCNICA.
❖ Se pedirá al paciente que se enjuague la boca con agua.
❖ Tras enjuagar la boca, frotar o raspar las lesiones con una espátula o con
un hisopo y hacer una extensión sobre un porta objetos.
❖ 1 extensión en porta objeto + 1 hisopo.
❖ No requiere medidas especiales para su transporte y conservación.
EXUDADO NASAL
Esta muestra solo se utiliza para buscar portadores de S.aureus o en el diagnóstico

etiológico de impétigo. No es útil para el diagnóstico etiológico en casos de rinitis,
rinosinusitis ni en casos de otitis media ni cuadros respiratorios altos prolongados
Recordamos que alrededor del 30% de la población es portadora de este
microorganismo a nivel nasofaríngeo por lo cual su hallazgo no tiene habitualmente
significancia clínica salvo en situaciones especiales. En el personal de salud sólo
se realizará la búsqueda de portadores en el caso de brotes de infecciones en los
que no se ha encontrado otra fuente de infección. Este tipo de investigación se
realizará en coordinación con el Comité de Infecciones Hospitalarias, quien
determinará la oportunidad de su realización.
74
A.MATERIAL NECESARIO.
❖ Hisopo de algodón con medio de transporte.
B. TÉCNICA.
❖ Tomar muestra profunda de ambas fosas nasales con el mismo hisopo,
previamente embebido en suero fisiológico estéril.
❖ Basta con un hisopo.

❖ Envío inmediato al laboratorio (no superior a 2 horas).
D. OBSERVACIONES.
❖ Se deberá consignar en el boleto de pedido si hay lesiones o costras
a nivel nasal. (Muy importante)
MUESTRAS DE OÍDO
CONDUCTO AUDITIVO EXTERNO
Solo se utiliza para conocer la etiología en caso de otitis externa. Suele tratarse de
muestras de mala calidad y en ningún caso resultan representativas de los
microorganismos existentes en el oído medio.
A MATERIAL NECESARIO.
❖ Hisopos de algodón con medio de transporte.
❖ Suero fisiológico estéril.
B. TÉCNICA.
❖ Primero limpiar posibles restos de pus o secreciones del conducto auditivo

externo con hisopo humedecido en suero fisiológico y descartar. Luego tomar
muestra del oído indicado o de ambos por separado frotando con nuevo
hisopo contra las paredes.
❖ Un hisopo para cada oído.
MUESTRAS OCULARES.
❖ Por vecindad estas muestras se estudian con las del tracto respiratorio
superior.
75
EXUDADO CONJUNTIVAL
Este tipo de muestras sirve para el diagnóstico de conjuntivitis de causa bacteriana.
Estas son a menudo unilaterales. De todas maneras se solicita que se haga la toma
de muestra de ambos sacos conjuntivales por separado, de manera de poder
valorar la flora normal. Siempre que sea posible se realizará la toma de muestra en
el Laboratorio de Microbiología.
❖ Hisopos con medio de transporte.
❖ Suero fisiológico estéril.
B. TECNICA.
❖ Debe obtenerse la muestra antes de la instilación de los analgésicos locales,
colirios o antibióticos.
❖ Con un hisopo mojado en suero fisiológico frotar sobre la conjuntiva tarsal
inferior y el fórnix de afuera hacia adentro.
❖ Para la investigación de Chlamydia trachomatis, everter el párpado y frotar
con una torunda la superficie conjuntival con hisopo provisto por el laboratorio
para investigación de Chlamydias.
❖ Deberá utilizarse un hisopo para cada ojo.
D. TRANSPORTE Y CONSERVACIÓN.
El transporte deberá ser inmediato. Cuando no sea posible, se utilizarán hisopos
con medio de transporte tipo Stuart o Amies, que se mantendrán a temperatura
ambiente. Para Chlamydia se utilizará un medio de transporte específico que
depende de cada laboratorio.
E. OBSERVACIONES.
Los cultivos de conjuntiva preoperatorios no son útiles. El número y tipo de
microorganismos de la conjuntiva normal varía diariamente, por lo que estas
muestras no son válidas, excepto en el caso de signos inflamatorios a nivel ocular.
MUESTRAS DEL TRACTO RESPIRATORIO INFERIOR
EXPECTORACIÓN
En las condiciones habituales de la clínica diaria, no es una muestra representativa
de la situación existente en el tracto respiratorio inferior por su mezcla con
secreciones procedentes de todo el árbol traqueo-bronquial y con la flora saprófita
de la orofaringe. No obstante es un método fácil y rápido cuya utilidad o relación
entre resultado obtenido y verdadera etiología depende en gran medida de su
correcta obtención, control de calidad antes de iniciar su procesamiento, tipo de
agente que se pretenda detectar y valoración adecuada del resultado.
76
A.MATERIAL NECESARIO.
❖ Frasco estéril de boca ancha y hermético.
❖ Suero fisiológico estéril y nebulizador ocasionalmente.
B.TÉCNICA O METODOLOGÍA DE OBTENCIÓN DE LA MUESTRA.
❖ Enjuagar la boca con agua destilada estéril o solución salina. Obtener el
esputo tras una expectoración profunda luego de un esfuerzo de tos,
preferentemente matinal.
❖ La muestra debe provenir del sector bajo del tracto respiratorio. La saliva no
sirve para realizar este estudio.
❖ De no producirse expectoración espontánea, puede inducirse el esputo con
nebulizaciones de suero fisiológico estéril tibio (15 ml durante 10 minutos),
siendo útil además realizar un drenaje postural o fisioterapia respiratoria.
C.VOLUMEN MÍNIMO.
❖ De 2 a 10 ml, si es posible.
D.TRANSPORTE Y CONSERVACION.
E.OBSERVACIONES.
❖ Es preferible realizar la toma antes de instaurar el tratamiento antibiótico.
❖ No es útil para anaerobios.
❖ No son inoculables las secreciones de sospechosa procedencia.
❖ La expectoración debe rechazarse hasta obtener un esputo de calidad
suficiente (más de 25 leucocitos polimorfonucleares y menos de 10 células
epiteliales por campo 100x).
❖ Si no se obtiene muestra representativa del tracto respiratorio inferior, es
inútil insistir con esta técnica diagnóstica.
❖ Si el pedido incluye baciloscopía se deben recoger 3 muestras en 3 días
sucesivos. Mientras conservar en la heladera a 4ºC hasta el tercer día y
llevar las 3 muestras juntas al laboratorio.
SANGRE
HEMOCULTIVOS
❖ Frascos de hemocultivo proporcionados por el Laboratorio de Microbiología.
❖ Ligadura de goma.
❖ Jeringas y agujas de punción i/v.
❖ Gasas estériles.
❖ Guantes estériles.
❖ Alcohol etílico o isopropílico al 70%.
❖ Yodo povidona al 10%.
77
B. OBTENCIÓN DE LA MUESTRA.
El procedimiento de extracción de sangre para la realización de
hemocultivos se debe realizar cumpliendo las máximas precauciones de
asepsia.
❖ Lavarse las manos.
❖ Colocar ligadura y campo estéril.
❖ Palpar la vena a puncionar.
❖ Realizar antisepsia con alcohol 70% en una zona de piel de unos 10 cm de
diámetro alrededor del sitio de punción. Se comenzará por el centro y se irán
haciendo círculos concéntricos hacia el exterior.
❖ Repetir el procedimiento utilizando Yodo povidona al 10%.
❖ Dejar actuar 1-2 minutos, esto es: hasta que se seque el antiséptico sobre la
piel.
❖ Mientras actúa el iodóforo, desinfectar el tapón de goma del frasco de
hemocultivo con alcohol 70%.
❖ Colocarse los guantes estériles.
❖ Extraer la sangre sin tocar en ningún momento el campo desinfectado. Si
fuera necesario palpar nuevamente la vena se cambiarán los guantes
estériles y se realizará nueva antisepsia de piel.
❖ Inyectar directamente la sangre en el frasco. No es necesario cambiar de
aguja.
❖ Mover los frascos para que la sangre y el medio de cultivo se mezclen.
❖ Para frascos de sistemas automatizados, retirar las tirillas de las botellas y
pegarlas en la hoja de pedido correspondiente al paciente. En ningún caso
se rotulará o pegará ningún tipo de etiqueta adhesiva sobre los códigos de
barras de las botellas.
C. VOLUMEN DE LA MUESTRA.
La cantidad de sangre a introducir en cada botella es de 10 ml en el caso de

pacientes adultos. En caso de neonatos y niños pequeños en que no se pueden
obtener volúmenes grandes de sangre, es suficiente una cantidad 1-5 ml por frasco.
En estos casos se utilizan botellas de hemocultivo pediátrico.
D. NÚMERO DE MUESTRAS.
Dos hemocultivos por paciente, previos al tratamiento antimicrobiano. El intervalo
de tiempo entre las extracciones es suficiente con una hora, pero cuando exista una
gran urgencia en iniciar el tratamiento, este intervalo puede acortarse hasta 15
minutos o se pueden extraer dos muestras simultáneas de diferentes sitios de
punción. En caso de endocarditis subaguda se recomienda aumentar a tres frascos
de hemocultivo repartidos en 24 horas y en caso de que la primera serie sea
negativa, obtener tres muestras más al día siguiente. Si el paciente está recibiendo
antibióticos puede ser necesario obtener otra serie de hemocultivos al tercer día.
78
E. TRANSPORTE.
Deben enviarse en forma inmediata al laboratorio una vez finalizada la serie.
Mientras, mantener a temperatura ambiente. Nunca debe refrigerarse ni congelarse.
F. OBSERVACIONES.
❖ Cuando no haya venas accesibles puede realizarse la extracción de sangre
arterial. No son adecuadas las muestras extraídas a través de catéteres.
❖ En caso de sospecha de determinados microorganismos (Brucella spp,
Leptospiras, Micobacterias, Hongos, etc) ponerse en contacto con el
Laboratorio de Microbiología.
❖ En caso que el paciente esté recibiendo antibióticos realizar la toma previo a
la administración de la dosis de antimicrobiano.
❖ Si se evita conversar durante la toma de la muestra no es necesario.
colocarse tapabocas.
❖ En sala de inmunodeprimidos sí es aconsejable el uso de gorro y tapabocas.
MUESTRAS DEL TRACTO URINARIO
UROCULTIVO Orina obtenida por “Chorro medio”
❖ Jabón neutro.
❖ Recipiente de boca ancha con tapa de rosca hermético y estéril.
B. OBTENCIÓN DEL PRODUCTO.
La muestra idónea es la primera micción de la mañana, ya que permite la

multiplicación de bacterias durante la noche.
TÉCNICA PARA MUJERES.
❖ Lavarse las manos cuidadosamente con agua y jabón, enjuagar con agua y
secar con una toalla limpia.
❖ Se separarán los labios mayores y menores, y los mantendrá separados en
todo momento hasta que se haya recogido la orina.
❖ Con una gasa enjabonada se lava bien la vulva pasándola de delante hacia
atrás, se repetirá el proceso un total de 4 veces.
❖ Enjuagar cuidadosamente con agua para eliminar los restos de jabón.
❖ Se indicará a la paciente que orine desechando el primer chorro (20-25
primeros mililitros) tras lo cual y sin interrumpir la micción, se recogerá el
resto de la orina en el recipiente, el cual se cerrará inmediatamente.
❖ El frasco debe sujetarse para que no tome contacto con pierna, vulva o ropa
del paciente. Los dedos no deben tocar el borde del frasco o su superficie
interior.
79
TÉCNICA PARA HOMBRES.
❖ Lavado de las manos con agua y jabón.
❖ Retraer completamente el prepucio, que se mantendrá así en todo momento,
hasta que se haya recogido la orina.
❖ Limpiar el glande con jabón neutro.
❖ Eliminar los restos de jabón enjuagándolo con agua.
❖ Se pedirá al paciente que orine desechando el primer chorro, los primeros
20-25 mililitros y sin interrumpir la micción, recoger el resto de la orina en el
recipiente estéril.
LÍQUIDOS BIOLÓGICOS
LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO
LCR POR PUNCIÓN LUMBAR

Es un procedimiento médico
❖ Campos estériles.
❖ Guantes estériles.
❖ Alcohol etílico o isopropílico al 70%.
❖ Yodo povidona al 10%.
❖ Jeringas de 5-10 ml
❖ Agujas de punción IM.
❖ Trócares de punción lumbar de varios tamaños.
❖ Tubos cónicos limpios y estériles con tapón de rosca. Es necesario que estén
totalmente limpios, no alcanza con que estén sólo estériles pues la presencia
de bacterias muertas por la esterilización puede inducir a errores por
tinciones falsamente positivas. No se deben usar tampoco frascos que
hayan contenido medicamentos como por ejemplo antibióticos aunque
estén estériles, porque restos de medicación pueden tener efecto
antimicrobiano y negativizar los cultivos.
B. OBTENCIÓN DE LA MUESTRA.
❖ Se obtendrá antes de instaurar cualquier terapéutica antibiótica.
❖ Quien realice la toma de la muestra deberá lavarse las manos previo al
procedimiento, colocarse sobretúnica y guantes estériles.
❖ Se localiza la zona elegida para la punción lumbar mediante palpación de los
espacios intervertebrales una vez colocado el paciente en la posición
adecuada.
❖ Se desinfecta con alcohol al 70% una zona de uso 10 cm de diámetro en el
área elegida, la aplicación del desinfectante se hace de forma concéntrica
del centro a la periferia.
❖ Se coloca campo estéril.
80
❖ Se repite la operación con Yodo povidona que se deja secar durante un
minuto.
❖ Realizar la punción entre los espacios intervertebrales L3-L4, L4-L5 o L5-S1,
siguiendo las normas de la más estricta asepsia.
❖ Al llegar al espacio subaracnoideo retirar el estilete y dejar salir libremente el
líquido cefalorraquídeo que se recogerá en tres tubos, sin conservantes, con
tapón de rosca. El primer tubo es el que debe enviarse para el estudio
bioquímico, el segundo para el estudio microbiológico y el tercero para
investigación de células (este suele ser el más transparente aunque la
punción haya sido traumática). No obstante, el tubo más turbio se enviará a
Microbiología.
C. VOLUMEN MÍNIMO.
❖ Para el estudio bacteriológico rutinario es suficiente 1 ml, aunque es
preferible disponer de volúmenes superiores.
❖ Para hongos o micobacterias se necesitan al menos 2 ml adicionales más
por cada uno de los estudios, siendo deseable llegar a los 10 ml.
❖ Para estudio de virus se necesita por lo menos 1 ml más.
D. TRANSPORTE.
El producto debe enviarse inmediatamente al laboratorio, pues alguno de los
agentes etiológicos como S. pneumoniae, pueden lisarse rápidamente a partir de
una hora tras su recogida. Si no es posible se mantendrá en estufa a 35-37ºC y una
parte se incubará en un frasco de hemocultivo que se mantendrá en idénticas
condiciones hasta su procesamiento en el laboratorio. Si no se dispone de estufas
se mantendrá a temperatura ambiente. Nunca deberá refrigerarse pues se puede
afectar la viabilidad de N. meningitidis y H. influenzae. En el LCR no se estudian
rutinariamente anaerobios. En caso de solicitar esta investigación se enviará en un
medio de transporte de líquidos para estudio de anaerobios o en frasco de
hemocultivo anaerobios. Las muestras para el estudio de virus se enviarán en hielo,
si el envío se retrasa más de 24 horas, se deberá de conservar a -70ºC.
E. OBSERVACIONES.
❖ Como la meningitis suele surgir por un proceso bacteriémico se solicitarán
simultáneamente hemocultivos, pudiendo ser así mismo estudiadas las
posibles lesiones metastásicas cutáneas.
❖ Es necesario que el médico señale claramente las investigaciones solicitadas
(bacterias habituales, micobacterias, anaerobios, hongos o virus).
HERIDAS SUPERFICIALES Y ABSCESOS ABIERTOS.
MATERIAL NECESARIO.
❖ Suero fisiológico.
❖ Jeringa y aguja estériles.
❖ Recipientes estériles con tapa de rosca.
❖ -Hisopos con medio de transporte tipo Stuart-Amies.
81
B. TÉCNICA.
❖ Lavar con suero fisiológico estéril cuidadosamente la superficie de la herida
para retirar la flora colonizante.
❖ Recoger el pus mediante jeringa y aguja, aspirando preferentemente de
zonas profundas.
❖ Cuando la muestra sea insuficiente, instilar suero o solución de Ringer lactato
y aspirarlo nuevamente en la jeringa.
❖ Cuando los procedimientos anteriores no sean factibles podrá efectuarse un
frotis de los bordes de la herida con un hisopo.
Para muestras líquidas se intentara obtener 1-10 ml. En el resto de las ocasiones
se enviará la máxima cantidad posible.
D. TRANSPORTE Y CONSERVACIÓN.
El envío al laboratorio debe ser inmediato. Se utilizará para el envío tubos estériles
con tapa rosca. La jeringa de la extracción será evacuada en el recipiente en que
se hará el envío. La práctica de colocar un tapón de goma en la aguja (usando la
jeringa como recipiente de transporte) debe desecharse por el riesgo para el
personal de sufrir un pinchazo con una aguja contaminada con líquidos orgánicos.
No olvidar identificar la muestra adecuadamente y si no puede procesarse antes de
2 horas usar medio de transporte.
E. OBSERVACIONES.
Las muestras recibidas en hisopo son de escasa rentabilidad y deben obtenerse

sólo en circunstancias muy excepcionales, cuando no se pueda recoger la muestra
por otros métodos. Es importante especificar sitio anatómico de donde se realizó la
toma de muestra.
MUESTRAS DEL TRACTO GASTROINTESTINAL
MATERIAS FECALES
Esta muestra se utiliza para el diagnóstico etiológico de gastroenterocolitis aguda.
Excepcionalmente se puede utilizar para la búsqueda de portadores de Salmonella
SP. En los laboratorios de Microbiología de índole asistencial de adultos se realiza
búsqueda de Salmonella y Shigella. Si se sospechan otros agentes consultar con
el Laboratorio de Microbiología.
A.- MATERIAL NECESARIO

❖ Recipiente de boca ancha para recoger las heces, no es necesario que esté
estéril, solo es preciso que esté limpio. No contendrá restos de jabones,
detergentes, desinfectantes o iones metálicos.
82
❖ Recipiente estéril de boca ancha y cierre hermético para enviar la muestra.
(ejemplo: frasco de urocultivos). La muestra de heces para colocar en el
frasco se recoge con espátula o bajalenguas.
❖ Medios de transporte para heces. Se emplean solo si el envío de la muestra
se demora y se solicita en laboratorio de Microbiología. Existen sistemas
comerciales para bacterias. (CaryBlair o solución de glicerol tamponado)
B.- OBTENCIÓN DE LA MUESTRA

❖ Solo se procesan materias líquidas o a lo sumo pastosas.
❖ Si son pastosas se toma una porción del recipiente donde hayan sido
emitidas y se transfieren al sistema elegido para el envío al laboratorio. Se
seleccionan las partes con mucus, pus o sangre. - En caso de heces líquidas
puede utilizarse jeringa para aspirado del material fecal del recipiente en
donde ha sido emitido.
❖ No se procesarán las muestras de materias sólidas ni contaminadas con
orina.
C.- VOLUMEN MINIMO
Heces pastosas: muestras del tamaño de una nuez son muy adecuadas pues
permiten realizar la mayoría de los estudios. Heces líquidas entre 5 y 10 ml.
D.- TRANSPORTE
❖ Si la muestra no se envía en forma inmediata se debe refrigerar.
❖ Si se va a procesar en el plazo de 1 o 2 horas después de su emisión, no
necesitan medio de transporte.
❖ En caso contrario se remiten las materias en un sistema de transporte para
enteropatógenos. Mientras tanto mantener refrigerada las muestras, para
evitar el sobrecrecimiento de la flora normal que puede enmascarar o destruir
a los enteropatógenos. El frío puede afectar la viabilidad de Shigella spp.
❖ Para el estudio de toxinas de Clostridium difficile la muestra se puede
mantener hasta 48 horas refrigerada a 4 º en la heladera.
❖ Es preferible enviar las muestras para estudio virológico sin medio de
cultivo, pues este diluye las partículas virales disminuyendo la sensibilidad.
Si su envío se retrasa mucho utilizar medio de transporte y recipientes
colocados en hielo.
E.- OBSERVACIONES
❖ Las muestras para coprocultivo, deberán tomarse antes de la administración
de antimicrobianos y preferiblemente antes de tomar antidiarreicos.
❖ Indicar siempre el juicio diagnóstico de presunción y si el paciente es menor
de un año.
❖ Solicitar las investigaciones especiales explícitamente (C. difficile, C.
perfringens, S. aureus,etc)
83
❖ En el caso de búsqueda de portadores de Salmonella, se deberá
fundamentar adecuadamente el pedido y se necesitan 3 muestras negativas
para asegurar que el paciente no es portador.
❖ Muestras para investigación de enteroparásitos ver Sección Parasitología.
HISOPOS RECTALES
Para conocer la etiología en el caso de una gastroenteritis aguda se debe utilizar
una muestra de materia fecal. Los hisopos rectales solo se aceptarán en casos en
que no se puedan obtener heces, por ejemplo en neonatos o adultos debilitados, o
internados en unidades de cuidados intensivos. Se ha demostrado eficaz en el
aislamiento de Neisseria gonorrhoeae, Campilobacter spp, Shigella spp, C. difficile,
virus del Herpes simplex y en portadores anales de Streptococcus pyogenes. No
es válido para la búsqueda de antígenos.
A.- MATERIAL NECESARIO
❖ Hisopos con medio de transporte.
❖ Guantes.
B.- OBTENCIÓN DE LA MUESTRA
❖ Para realizar la toma se introduce el hisopo sobrepasando el esfínter anal y

se rota para hacer la toma de las criptas anales, mantener allí durante 30
segundos para que se absorban los microorganismos y retirar.
❖ Una vez realizado se introduce en un medio de transporte.
C.- TRANSPORTE
Se envían en medio de transporte adecuado (Stuart, Cary-Blair, para anaerobios

en el caso de C. difficile), pues así se protege a las bacterias de la desecación y se
envía rápidamente al laboratorio.
D. OBSERVACIONES
Son muestras inadecuadas: Hisopos rectales secos. Hisopos rectales sin medio
de transporte. Hisopos con heces cuando se busquen bacterias diferentes de
enteropatógenos.
TRACTO GENITAL
TRACTO GENITAL FEMENINO
EXUDADO VAGINAL
Esta muestra se utiliza para conocer la etiología en casos de vaginitis y vaginosis.
Puede utilizarse para búsqueda de portadoras de Streptococcus del grupo B en
embarazadas. Los exudados vaginales se realizan en el Laboratorio de
Microbiología. En el único caso que se aceptarán muestras realizadas fuera del
Laboratorio es si la paciente se encuentra internada e imposibilitada de movilizarse.
84
MATERIAL NECESARIO
❖ Camilla ginecológica
❖ Espéculo estéril
❖ Hisopos de alginato cálcico o Dracon, con medio de transporte.
❖ Tubo con 1 mi de suero fisiológico y pipeta descartable. Condiciones previas:
La paciente no debe tomar antibióticos, ni utilizar soluciones antisépticas
vaginales, óvulos ni pomadas en los días previos a la recolección de la
muestra. No debe mantener relaciones sexuales 48 hs antes de la toma de
muestra.
B-TÉCNICA
❖ Con la paciente en posición ginecológica se introducirá un espéculo “sin
lubricante” (si fuera necesario lubricar, utilizar solo agua tibia)
❖ Recoger la muestra, bajo visión directa, con un hisopo del fondo del saco
vaginal posterior.
❖ Repetir la operación con un segundo hisopo.
❖ Recoger con la pipeta una muestra de fondo de saco y descargar en el tubo
con suero fisiológico.
C- NÚMERO DE MUESTRAS Y/O VOLUMEN
Se obtendrán dos hisopos, uno destinado al estudio microscópico y otro al cultivo.
La muestra en suero fisiológico se destinará al examen en fresco para investigación
de Trichomonas vaginalis.
D- TRANSPORTE Y CONSERVACIÓN
El envío de la muestra debe ser inmediato siempre que sea posible. Cuando la
muestra no pueda procesarse antes de 15 minutos deberán emplearse hisopos con
medio de transporte tipo StuartAmies, que se mantendrán a temperatura ambiente,
o preferentemente, en estufa 35-37ºC hasta su procesamiento, que deberá ser
antes de 3-6 horas. El examen en fresco deberá observarse inmediatamente o de
lo contrario mantener en estufa a 37ºC por no más de 1 hora.
E- OBSERVACIONES
Cuando se sospeche la infección por Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia
trachomatis, Mycoplasma hominis o Ureaplasma urealtycum, deberá enviarse
muestra endocervica.
EXUDADOS URETRALES
Se utiliza para el diagnóstico etiológico en casos de sindrome uretral aguda en la
mujer después que se han descartado otras causas. Las etiologías a investigar son
N. gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis.
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A- MATERIAL NECESARIO
❖ Hisopos uretrales finos, con varilla de alambre no excesivamente flexible, de
alginato cálcico o Dracon con medio de transporte tipo Stuart o Amies.
B- TÉCNICA
Limpiar cuidadosamente la mucosa circundante con gasas estériles. Introducir el
hisopo suavemente con un movimiento de rotación hasta penetrar unos 2 cm dentro
de la uretra (3-4 cm para la investigación de Chlamydia trachomatis) Repetir
operación con un segundo hisopo. Realizar frotis para el examen directo. Cuando
no haya suficiente exudado, puede estimularse mediante un masaje suave de la
uretra contra la sínfisis del pubis, a través de la vagina.
C-NÚMERO DE MUESTRAS Y/O VOLÚMEN

Deberán enviarse dos hisopos, uno para el examen directo y otro para el cultivo.
D- TRANSPORTE Y CONSERVACIÓN.
Debe ser inmediato. Cuando no puedan procesarse las muestras inmediatamente,
se utilizarán hisopos con medio de transporte que se mantendrán a temperatura
ambiente o preferentemente a 35-37º. Las muestras se procesarán siempre que se
pueda antes de las 3 horas, y como máximo en un plazo de 6-12 horas.
E-OBSERVACIONES
La muestra ha de recogerse preferentemente antes de la primera micción de la
mañana, si no es posible, se deberá esperar al menos una hora tras la última
micción para recogerla.
TRACTO GENITAL MASCULINO
EXUDADOS URETRALES
Se utiliza para confirmar el diagnóstico clínico de uretritis y valorar su etiología. No
es adecuado si el paciente no tiene corrimiento.
La toma de muestra se debe realizar en el Laboratorio de Microbiología, de
preferencia en la mañana y con por lo menos 4 horas de retención urinaria.
❖ Hisopos finos, de alginato de calcio o Dacron con medio de transporte tipo
Stuart-Amies.
❖ Asa de siembra de platino
❖ Potaobjetos.
❖ Suero fisiológico.
86
B- TÉCNICA
Cuando exista exudado franco puede recogerse con un hisopo o con un asa
bacteriológica. Se le solicita al paciente que retraiga el prepucio y lo mantenga así
durante todo el procedimiento. Si no hay corrimiento franco puede estimularse
exprimiendo la uretra desde la raíz del pene. Cuando no se obtenga exudado se
introducirá un hisopo suavemente con un movimiento de rotación hasta penetrar
unos 2 cm. en la uretra. Repetir la operación con un segundo hisopo. Tomar con
ansa bacteriológica una gota de secreción y colocar en un portaobjetos con una
gota de suero fisiológico para investigación de Trichomonas vaginalis (examen en
fresco).
Deberán obtenerse dos hisopos, uno destinado al examen directo y otro al cultivo y
la muestra para examen en fresco.
D- TRANSPORTE Y CONSERVACIÓN
Debe ser inmediato. Cuando no puedan procesarse las muestras antes de 15
minutos, se utilizarán hisopos con medio de transporte Stuart-Amies que se
mantendrán a temperatura ambiente o preferentemente en estufa 35-37º. El
examen en fresco deberá observarse de inmediato. Las muestras se procesarán
siempre que se pueda antes de 3 horas y como máximo en un plazo de 6-12 horas.
E- OBSERVACIONES
La muestra ha de recogerse preferentemente antes de la primera micción de la
mañana. Si esto es imposible, esperar al menos una hora tras la última micción para
recogerla. En algunos casos puede ser rentable realizar la investigación de
patógenos de transmisión sexual en la orina del primer chorro.
MUESTRAS PARA INVESTIGACIÓN DE CHLAMYDIAS
Las muestras adecuadas no son las secreciones, ya que Chlamydia trachomatis
sólo afecta células escamo-columnares, como las células del epitelio de transición
del cérvix. No son adecuadas muestras vaginales para estas determinaciones.
❖ Espátulas
❖ Hisopos aportados por el laboratorio de Microbiología.
B- TÉCNICA
La muestra se recogerá mediante frotado o raspado enérgico de la zona cervix,

uretra, etc siguiendo las instrucciones específicas para cada localización.
87
Generalmente es suficiente con un hisopo destinado exclusivamente al
diagnóstico de Chlamydia.
D-TRANSPORTE Y CONSERVACIÓN
Las muestras que no puedan ser procesadas de inmediato consultar al laboratorio
sobre transporte y conservación más adecuada para la técnica en uso en ese
momento.
MUESTRAS PARA INVESTIGACIÓN DE MYCOPLASMAS UROGENITALES A-
MATERIAL NECESARIO
Hisopos (Pedir al laboratorio de Microbiología según técnica en uso)
B-TÉCNICA
Hisopado de la zona a investigar generalmente cervix o uretra femenina o
masculina.
C-NÚMERO DE MUESTRAS Y/O VOLUMEN
Es suficiente con un hisopo destinado a este estudio.
D-TRANSPORTE Y CONSERVACIÓN
Las muestras que no puedan ser procesadas de inmediato consultar al laboratorio
sobre transporte y conservación más adecuada para la técnica en uso en ese
momento
MUESTRAS PARA ESTUDIO INMUNOLÓGICO DE LAS INFECCIONES
BACTERIANAS
La respuesta del huésped a las infecciones bacterianas se estudia por diversas
técnicas que detectan la presencia de anticuerpos circulantes, de los diferentes
tipos, según se trate de una infección aguda o crónica. Aunque las técnicas son bien
diferentes según el tipo de agente involucrado, complejidad y disponibilidad de
recursos del laboratorio que va a realizar la investigación, para la mayoría se
requieren 10 cc de sangre sin anticoagulante en tubo seco. Siempre es conveniente
antes de extraer la sangre, preguntar en el laboratorio acerca del agente que se
quiere investigar, disponibilidad de reactivos, número de muestras. La mayoría de
las investigaciones serológicas se benefician de la extracción de dos muestras
pareadas de sangre separadas por 15-20 días.
MUESTRAS PARA INVESTIGACIÓN DE AGENTES INFECCIOSOS POR
TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR
Prácticamente en todos los especímenes biológicos se pueden investigar agentes
infecciosos por técnicas de biología molecular mediante la detección de los ácidos
nucleicos de los microrganismos o sus productos. Como el número de técnicas
disponibles es muy amplio y por ser muestras con requerimientos específicos en
cuanto a tipo de producto biológico a analizar, conservación (cadena de frío) y
transporte su realización, debe ser coordinada previamente con el Laboratorio de
Microbiología.
88
Indicadores %
procedimientos
Examen parciales 30
Total 100
LISTA DE COTEJO

Manual Práctico?
solicitados?
¿Identificaste todo el material de toma de
muestras y los medios de transportes
utilizados en la práctica?
89
PRÁCTICA X
DETERMINACIÓN DEL CRECIMIENTO DE
POBLACIONES BACTERIANAS
90
OBJETIVOS:
Desarrollar algunas técnicas comunes para medir el crecimiento bacteriano en
poblaciones, tanto en células vivas, como en muertas, comprendiendo su
fundamento y aplicación.
GENERALIDADES
Se puede considerar como crecimiento al incremento de células individuales por un
lado, y por otro lado se puede considerar al crecimiento del número de células
(proliferación de la población). Las bacterias se dividen por fisión binaria, a través
de la una cual célula madre al alcanzar un determinado volumen se divide dando
dos células hijas (Benintende, s.f.). Existen diferentes métodos para el conteo de
bacterias, como los métodos para el conteo de microorganismos viables, estos
métodos se basan en poner en evidencia la presencia de los microorganismos vivos
como la filtración o el recuento en placa de colonias, usualmente, antes de realizar
la siembra se realizan diluciones seriadas para facilitar el conteo de las UFC
(Unidades Formadoras de Colonias) ("Medición del crecimiento bacteriano.", s.f.).
Existen los recuentos directos; el recuento microscópico: Es una técnica común,
rápida y barata que utiliza un equipamiento fácilmente disponible en un
laboratorio de microbiología. Aquí se utilizan generalmente cámaras de
recuentos, aunque también pueden realizarse a partir de muestras filtradas
en membranas y transparentadas o teñidas con colorantes fluorescentes. Recuento
electrónico: Los contadores electrónicos permiten realizar recuentos de bacterias,
levaduras no filamentosas y protozoarios, pero no de hongos y microorganismos
filamentosos o miceliares. Turbidimetría: La turbidimetría mide la reducción
de la transmisión de luz debido a partículas de una suspensión y cuantifica la luz
residual transmitida ("Medición del crecimiento bacteriano", s.f.).
El crecimiento de una población o cultivo bacterianos se puede expresar en función
de:
▪ Aumento de masa del cultivo.

▪ Aumento del número de células.
Ambos tipos de expresiones son equivalentes entre sí en cultivos que estén en
crecimiento balanceado (en el que todos los componentes aumentan una misma
proporción por unidad de tiempo).
MEDIDA DE MASA BACTERIANA

Métodos directos:
En estos métodos se requieren preparaciones limpias, sin partículas extrañas.
Determinación del peso húmedo:
▪ Se hará un tubo de centrífuga.
▪ Se centrifuga el cultivo y se elimina el sobrenadante.
▪ Se determina el peso del sedimento.
91
Inconvenientes: grandes errores, debido al líquido intercelular retenido, cuya
cuantía depende a su vez de la forma y tipo de agrupaciones de la cepa, intensidad
del empaquetamiento, etc.
Determinación del peso seco: como el anterior, pero el sedimento se seca antes de
ser pesado (105oC, toda la noche), hasta peso constante. Las medidas de peso
seco suelen representar el 10-15% de los valores de peso húmedo.
Inconvenientes: método tedioso (requiere mucho tiempo) y con bastantes errores:
es difícil pesar menos de 1 mg con exactitud en las balanzas habituales de
laboratorio. 1 mg de peso seco equivale a unas 5x109 bacterias.
Determinación del nitrógeno total: técnica de micro-Kjeldahl.
Determinación de un componente característico: peptidoglucano, ADN, ARN,
proteínas, etc.
Comentarios: se suele usar en bacterias para las que otros métodos más fáciles
dan errores debido a que forman grumos no dispersables, crecen en filamentos, etc.
Se emplean en determinaciones de crecimientos en ambientes naturales.
Métodos indirectos
Medida de consumo de nutrientes o de producción de algún metabolito por unidad

de tiempo. Ejemplos: consumo de oxígeno (QO2) y consumo de carbónico (QCO2),
determinados por el respirómetro de Warburg. Producción de ácidos.
MEDIDA DEL NÚMERO DE INDIVIDUOS
Métodos directos
▪ Cámara de recuento de Petroff-Hauser: Consiste en un portaobjetos especial

con una graduación en superficie y unas medidas muy concretas:
▪ Excavación con 0.02 mm de profundidad.
▪ Área de 1 mm2, dividida en un retículo de 25 cuadrados grandes.
▪ Cada cuadrado grande está subdividido a su vez en 4x4 = 16 cuadrados
pequeños.
▪ Sea, la muestra se distribuye en 16X25 = 400 celdillas (cuadros pequeños).
La muestra, una vez dispensada entre el porta y el cubre, se deja reposar sobre la
plataforma del microscopio durante unos minutos, y se cuenta el número de células
en varias celdillas (normalmente en 16, equivalentes a uno de los cuadros grandes).
Se anota el número n de células observadas en esas 16 celdillas. Entonces, la
concentración celular es fácil de establecer:
▪ n x 25 x 50 x 1000 = concentración en células/ml.
▪ Recuento de viables en placa: Como esta técnica será explicada al alumno
en clase, y además la realizará en las prácticas, remitimos a las pertinentes
explicaciones "en vivo". Es una de las técnicas de recuento más usadas en
la rutina del laboratorio de Microbiología.
92
Precauciones:
▪ Para minimizar los errores estadísticos de muestreo, se recomienda sembrar
5 placas de cada dilución.
▪ Hay que usar pipetas nuevas en cada dilución.
▪ Contar las placas donde existan entre 50 y 300 colonias.
93
Indicadores %
procedimientos
Examen parciales 30
Total 100
LISTA DE COTEJO

Manual Práctico?
solicitados?
¿Aprendió sobre el crecimiento bacteriano
y los factores que influyen en este?
94
PRÁCTICA XI
GENÉTICA MICROBIANA
95
OBJETIVOS
El estudiante conocerá sobre la herencia y cambios funcionales de los organismos
y la estructura del ADN Y ARN.
GENERALIDADES
GENÉTICA
Define y analiza a la herencia, o la constancia y el cambio de las funciones de cada
organismo.
GEN: Segmento de ADN que lleva información genética en su secuencia nucleotida
para propiedades específicas.
ORGANIZACIÓN DE LOS GENES LA ESTRUCTURA DEL ADN Y ARN
ADN (Ácido Desoxiribonucleico), doble cadena, bases nitrogenadas Adenina,
Guanina, Citosina y Timina.
ADN BACTERIANO
La replicación del ADN bacteriano comienza cuando las dos cadenas se separan y
se utilizan como modelo para sintetizar cadenas nuevas (replicación
semiconservadora). La estructura donde las dos cadenas se separan y se lleva a
cabo la síntesis nueva se llama horquilla de replicación. La replicación del
cromosoma bacteriano está controlada y el num. De cromosomas por células en
crecimiento es de 1-4. La replicación del ADN bacteriano circular doble comienza
en el locus ori e interactúa con proteínas.
96
TRANSFERENCIA DEL ADN
La transferencia del ADN entre cepas procariotes es muy diferente a las eucariotes.
El intercambio genético entre bacterias se caracteriza por transferencia de
fragmentos pequeños de un genoma donador a una célula receptora, para una
recombinación exitosa es necesario que el ADN donado se replique en el
microorganismo recombinante. La replicación se puede lograr por integración del
ADN donado como replicón independiente.
MECANISMOS DE RECOMBINACIÓN
El ADN donado que no lleva información necesaria para su autorreplicación debe
recombinarse con el ADN receptor con el fin de establecerse en una cepa receptora.
La recombinación puede ser homóloga (gran similitud en las secuencias del ADN
donado y las del receptor) o no homóloga (recombinación catalizada por enzimas
entre secuencias de ADN diferentes).
MECANISMO DE TRANSFERENCIA GENÉTICA
Los tres tipos se diferencian por la forma en que se dona el ADN:
CONJUGACIÓN: únicamente se dona una cadena de ADN, el receptor completa la
doble cadena.
RANSDUCCIÓN: el ADN se transporta dentro de la cubierta de un fago y se
transfiere al receptor por el mecanismo utilizado en la infección por fagos.
TRANSFORMACIÓN: la captación directa del ADN por el receptor (natural o
forzada). Pocas cepas son competentes para la transformación, estas asimilan el
ADN que se encuentra linealmente. La transformación forzada se induce en el
laboratorio.
Video Genética Bacteriana
https://www.bing.com/videos/search?q=video+sobre+genetica+microbiana&
&view=detail&mid=80F4EBBED96767DA5F2A80F4EBBED96767DA5F2A&&F
ORM=VRDGAR&ru=%2Fvideos%2Fse
97
Indicadores %
procedimientos
Examen parciales 30
Total 100
LISTA DE COTEJO

Manual Práctico?
solicitados?
¿Sobre los videos puede hacer una
exposición explicativa de el tema?
98
PRÁCTICA XII
ESTUDIOS DE LOS HONGOS
99
OBJETIVOS
Favorecer la enseñanza de los fundamentos de la morfología y fisiología de los
hongos y sus aplicaciones en el diagnóstico de las patologías micoticas,
GENERALIDADES
Micosis superficiales
Son las micosis que afectan la capa córnea de la piel y la porción suprafolicular del
pelo. La pitiriasis versicolor es la micosis superficial más frecuente, siendo las
demás muy raras en nuestro medio.
Pitiriasis versicolor
Es una infección superficial crónica, no irritativa del estrato córneo producida por
especies del género Malassezia: M. furfur, M. globosa, M. obtusa, M. restricta, M.
slooffiae y M. sympodialis.
La pitiriasis versicolor es una micosis muy frecuente y ampliamente distribuida entre
la población mundial, aunque su incidencia aumenta en los climas húmedos y
cálidos, existiendo una predisposición individual a padecerla. Su aparición se
relaciona con la presencia de ciertos aminoácidos y compuestos hidrófobos en la
piel, así como con la disminución del recambio epitelial en el estrato córneo.
100
Dermatitis seborreica y caspa (pitiriasis capitis): áreas de piel enrojecida e
inflamada, recubierta de escamas grasientas de color amarillo, generalmente en
cuero cabelludo, cara y tórax. Tienen una evolución crónica y recurrente. En los
pacientes con sida o síndrome relacionado puede localizarse en las axilas con un
cuadro muy florido de diagnóstico complejo.
Foliculitis en pacientes inmunocomprometidos: constituida por pápulas
foliculares pruriginosas y pustulosas en espalda, tórax y parte superior de los
brazos.
Fungemia: en pacientes sometidos a nutrición parenteral con emulsiones lipídicas
(lactantes prematuros).
Síndrome de Gougerot-Carteaud: es una papilomatosis confluente reticular con
pápulas de color gris-marronáceo localizadas en la región.
Micosis cutáneas
Las infecciones cutáneas en el ser humano incluyen una amplia variedad de
procesos en los que pueden estar afectados la piel y sus anejos (pelos y uñas). El
término dermatomicosis se refiere a cualquier proceso micótico de la piel, y el de
dermatofitosis, al causado por hongos dermatofitos [3,5]. Además de las infecciones
primarias, en la piel también pueden encontrarse lesiones granulomatosas o de otro
tipo, como expresión de las metástasis de una micosis sistémica.
Dermatofitosis
Así se denomina a la infección de los tejidos queratinizados (piel, pelos y uñas)
ocasionada por un grupo de hongos queratinofílicos, taxonómicamente
relacionados, a los que se ha denominado dermatofitos. La infección puede estar
limitada a la capa córnea o llegar a estratos más profundos, sin invasión linfática.
Estas micosis cutáneas se encuentran entre las infecciones de mayor prevalencia
en el mundo y, dado que producen lesiones fácilmente observables, su presencia
en el ser humano está documentada a lo largo de la historia. Los agentes etiológicos
se clasifican en tres géneros diferentes: Microsporum (Gruby, 1843), Trichophyton
(Malmsten, 1845) y Epidermophyton (Sabouraud, 1907). La descripción de los
géneros se basa en la morfología de las conidias y organelos accesorios.
Candidiasis cutánea y de mucosas
Las infecciones por especies del género Candida y especialmente por Candida
albicans, la más patógena, han aumentado notablemente en los últimos 30 años.
Su clasificación en dos grupos, el de las cutaneomucosas y el de las sistémico-
profundas, facilita su estudio.
101
Candidiasis cutánea
La zona más frecuentemente afectada son los pliegues cutáneos donde la humedad
crea un hábitat adecuado para su supervivencia. Se puede manifestar como:
Intértrigo de grandes pliegues: localizado en axilas, ingle, surco interglúteo,
pliegue submamario (Figura 2.8) y, en personas obesas, en el pliegue suprapúbico.
Suele estar favorecido por la diabetes, el alcoholismo o la obesidad.
Erosión interdigital: infección localizada entre los dedos de las manos o de los
pies.
Candidiasis del pañal: intértrigo del lactante localizado en los pliegues inguinales,
suprapúbico e interglúteo (Figura 2.9).
Foliculitis: infección del folículo piloso en los pacientes VIH positivos (Figura 2.10).
Onicomicosis candidiásica con paroniquia y perionixis: inflamación

periungueal, con dolor y enrojecimiento y, en las fases agudas, exudado purulento.
En las onicomicosis pueden aislarse otras especies de hongos diferentes de los
dermatofitos, como Fusarium o Aspergillus (Figura 2.7) que, en ausencia de un
hongo dermatofito y aislados tres veces en cultivo puro, podrían considerarse como
causantes de la lesión. En caso contrario, sólo puede admitirse que está
colonizando una uña previamente lesionada. La onicomicosis negra está producida,
casi siempre, por especies del género Phialophora. Las onicomicosis en los dedos
de las manos con perionixis suelen ser producidas por C. albicans.
.
TINCIÓN DE AZUL ALGODÓN DE LACTOFENOL
❖ No es considerada una tinción diferencial, sin embargo, posee características
tintoriales que permiten observar cada uno de los componentes fúngicos y
apreciar fácilmente las estructuras para una adecuada identificación.
❖ El fenol destruye la flora acompañante.
❖ El ácido láctico conserva las estructuras fúngicas al provocar un cambio de
gradiente osmótico con relación al interior del fúngico generando una película
por así llamarlo protectora.
❖ Es útil para realizar el examen directo de cultivos, ya que es una técnica
rápida que permite visualizar perfectamente las estructuras fúngicas.
❖ El colorante es fuertemente ácido y se usa para la tinción directa del micelio
micólico, el cual toma un delicado color azul claro.
102
TINCIÓN DE AZUL ALGODÓN DE LACTOFENOL
❖ Preparación de la impronta.
❖ Colocar el material necesario en la campana de seguridad tipo 2A.
❖ Seleccionar las colonias para realizar las improntas.
❖ Cortar segmentos de cinta adhesiva transparente aproximadamente de 1 cm.
Pegar los segmentos de cinta en un asa micológica.
❖ Poner una gota de azul de algodón en el portaobjetos.
❖ Con el lado adhesivo de la cinta, tocar la parte superior de hongo.
❖ Colocar la cinta sobre la gota de azul de algodón y poner otra gota de azul
de algodón.
❖ Poner un cubreobjetos sobre la preparación.
❖ Observar en 40x.
Tinción de tinta china o tinción negativa
TINCIONES DIFERENCIALES
Son técnicas que utilizan dos o más colorantes y/o principios activos:
❖ Tinción de Gram.
❖ Tinción Ziehl-Neelsen.
❖ Tinción de Schiff.
103
Género Aspergillus
Imagen del aspergillis
Especie: A. fumigatus
Introducción
Los Aspergillus son hongos sapróﬁ tos comunes, le favorece su crecimiento en
condiciones apropiadas de humedad y temperatura, se encuentran en heno, pienso,
sustratos en descomposición y detritus de los animales.
Producen cantidades abundantes de esporas que forman con facilidad aerosoles en
el medio; las cuales, al ser inhaladas, producen la enfermedad. La aspergilosis es
una enfermedad infecciosa en la cual se afecta de manera primaria el aparato
respiratorio y se maniﬁesta por la formación de nódulos caseosos amarillos que se
instalan primariamente en el pulmón, con posterior diseminación a otros sistemas
orgánicos.
Enfermedad: Aspergilosis.
Animales susceptibles: aves, bovino y equino.
Aves: se presenta una aerosaculitis difusa, neumonitis y nodular. Se observan la
presencia de nódulos caseosos amarillos ubicados en los pulmones pasando
después a otros órganos diana. En aves de 2 semanas causan anorexia, diarrea, y
aumento de la temperatura.
104
MICOSIS
La Micología es el estudio de los hongos. Un hongo es un protista eucariótico (posee
un núcleo verdadero), que está caracterizado por la ausencia de clorofila y por la
presencia de quitina en la pared celular. La estructura básica puede ser filamentosa:
mohos y setas o unicelular, levaduras.
Hay alrededor de 100.000 especies de hongos de los cuales aproximadamente 50
son consideradas patógenas. Además hay una lista creciente de organismos
oportunistas que pueden causar enfermedad en el paciente comprometido.
Hasta que punto debe ser un hongo identificado es una decisión clínica y a veces
académica. Frecuentemente una identificación es realizada para eliminar la
posibilidad de que el aislado sea un patógeno verdadero. La especificación deberá
ser interpretada sólo cuando sea clínicamente relevante o académicamente
importante.
COLECCIÓN DE ESPECÍMENES
La técnica para la colección de material para cultivo de hongos es importante, ya
que muchas levaduras y mohos no patógenos: Son frecuentes contaminantes en
especímenes clínicos y pueden crecer más y enmascarar los hongos patógenos
significantes.
Especímenes cutáneos y superficiales: Suspender la medicación, lavar con agua y
jabón secar bien al aire. Todo material puede ser transportado al laboratorio en un
sobre de papel limpio y estéril. El material es viable por meses.
Piel: Las lesiones cutáneas requieren raspados del borde activo. Material suficiente
y representativo para cultivo y examen microscópico deberá ser colectado y
transportado al laboratorio.
Pelo: Los pelos infectados deben ser arrancados y enviados al laboratorio.
Uñas: Las uñas infectadas no deben ser cortadas con tijeras. No colecte detritus de
debajo de la uña infectada. Primero, remueva la parte superficial no infectada de la
uña por raspado. Cuando se alcanza la porción enferma, remuévala por raspado y
envíela al laboratorio.
Especímenes subcutáneos
Todo material debe ser enviado al laboratorio en un contenedor estéril. Transporte
e inoculación rápida son necesarios ya que muchos especímenes pueden también
contener bacterias que pueden crecer y enmascarar y consecuentemente inhibir o
retardar el aislamiento de los hongos patógenos.
105
Especímenes sistémicos (tejidos profundos)
Esputo, secreciones traqueales, secreciones bronquiales y respiratorias bajos un
buen espécimen de esputo es de 5 a 10 ml de material recientemente descargado
del árbol bronquial, con cantidades mínimas de contaminantes orales o nasales.
Tres especímenes pequeños de este tipo son mejores que un espécimen
coleccionado de 24 horas de volumen total igual. El hecho de que el espécimen sea
obtenido por la mañana temprano o a otra hora no es importante a pesar que
muchos pacientes producen más esputo poco después de levantarse en la mañana.
El esputo debe ser colectado usando un contenedor estéril. Esputos inducidos
deben también ser colectados en un contenedor estéril. Aspirados traqueales y
secreciones bronquiales pueden ser enviados en tubos de ensayo con tapón de
caucho u otros contenedores estériles apropiados.
106
Lavados gástricos
Lavados gástricos en ayunas deberán ser colectados cuando no sea posible obtener
esputo. Deberán ser colectados en tubos estériles. Una serie de tres especímenes
es recomendada.
Orina
El espécimen de elección es la porción media del chorro de la micción de la mañana
obtenida limpiamente. Múltiples especímenes de este tipo son superiores a un
espécimen recolectado de 24 horas. Mantener refrigerado antes de procesar.
Fluidos pleural, espinal, articular y otros.
Los especímenes de fluidos deben ser remitidos en contenedores estériles,
prefieren grandes cantidades de espécimen ya que muy pocos organismos pueden
estar presentes. Examine mientras estén frescos o refrigérelos.
Médula ósea
Los especímenes de médula ósea son enviados en 0,1 ml de anticoagulante EDTA.
Tejidos
Los especímenes de tejido deben ser remitidos en un contenedor estéril. Si el tejido
está seco, mójelo ligeramente con solución salina al 0.85% y refrigérelo hasta ser
procesado. Todo tejido debe ser molido o finamente cortado cuidadosamente.
PROCEDIMIENTO PRIMARIO DE INOCULACIÓN PARA CULTIVOS DE
HONGOS
▪ Examen macroscópico.
▪ Examen microscópico directo del material clínico (KOH 10%).
Coloraciones: Gram, azul de metileno, tinta china, acido resistente.
Cultivo:
Reportes preliminares:
Dentro de 24 horas de la recepción de especímenes con el resultado de la
coloración Después de 7 días de incubación (si no se detecta crecimiento)
reportando "No hay crecimiento en siete días".
107
Reportes finales:
Los reportes finales serán enviados al completarse los procedimientos de
identificación o después de 28 días de incubación si no hay evidencia de crecimiento
fungal.
Hongos aislado Especímenes para cultivo
Histoplasma Médula ósea LCR, sangre, esputo
Cryptococcus neoformans LCR, orina, esputo

Blastomyces dermatitis Masaje prostático, lesiones de piel, esputo
Coccidipides inmitis LCR, pus de sitios de drenaje, esputo
Candida especies Sangre LCR, orina
Aspergillus especies Sangre, orina
Sporotrichum shenkii Drenaje de heridas, esputo

Phycomycetes Frotis nasal u ocular, biopsia
108
Indicadores %
procedimientos
Examen parciales 30
Total 100
LISTA DE COTEJO

Manual Práctico?
solicitados?
¿Puede reconocer los hongos mediante
cultivos y tinciones?
109
PRÁCTICA XIII
ANTIBIOGRAMA
110
ANTIBIOGRAMA
OBJETIVOS:
• Conocer y realizar el método convencional de difusión en discos.
• interpretar la sensibilidad y resistencia que presentan diferentes bacterias
a los antibióticos.
CONTEXTUALIZACIÓN
Las enfermedades infecciosas siempre han sido un problema grave para el

hombre, el hallazgo de sustancias eficaces que pudieran ser utilizadas en el
tratamiento de estas enfermedades se remonta al siglo XVII en el que ya se
emplearon sustancias químicas coma la quinina para la malaria.
Hacia el o de 1900, el trabajo de Paul Ehrlich marca el inicio de la quimioterapia

coma ciencia pues este científico establece los principios de la toxicidad selectiva,
el desarrollo de la resistencia a los medicamentos y el uso de la terapia
combinada para combatir dicha resistencia.
Antimicrobiano o antibiótico: es una sustancia producida por microrganismo

o de manera sintética, que tiene la capacidad de actuar sobre otros
microorganismos inhibiéndolos o destruyéndolos.
TÉCNICA DE BAUER.KIRBY MODIFICADA PARA MEDICIÓN DE LA

SENSIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS
Reactivos y Materiales
Agar de Mueller Hinton: Preparar el agar de acuerdo a las indicaciones del
fabricante. Una vez salido del autoclave permitir que el media alcance entre 45 y
50°C, es recomendable para asegurarse de tener esta temperatura colocar el
media que sale del autoclave, en un baño María a 48°C y mantenerlo ahí par un
tiempo prudencial hasta que la temperatura interna del medio contenida en el
recipiente alcance la temperatura deseada.
En condiciones asépticas dispensar el medio en cajas petri esteriles de 100 mm

de diámetro y permitir que solidifique el medio, cuidar de obtener un espesor de
4mm. Una vez solidificadas colocar una de las cajas en la estufa a 37°C, para
control, chequear hasta al día siguiente por ausencia de microorganismos.
Seleccionar una caja de lote preparado y someter a la prueba de inhibidores de
timidina y timina utilizando Streptococcus faecalis ATCC 29212 o 33186 y colocar
un disco de cotrimoxazol. Un agar de Mueller Hinton fiable debe mostrar una
sensibilidad bien diferenciada de 20 mm de diámetro. Las cajas que no se utilicen
deben colocarse en funda plástica y guardarlas en la nevera en posición invertida.
Conservarlas en refrigeraci6n hasta dos semanas.
111
Caldo de Tripticase Soya (TSB): Para la suspensión se debe preparar de
acuerdo a las recomendaciones del fabricante un caldo de tipo de digerido de
soya y caseina y dispensar 4 6 5 ml de este caldo en tubos adecuados.
▪ Un caldo se coloca en la estufa para control y los otros se almacenan en la

nevera.
▪ Agua destilada estéril y solución salina estéril al 0.85 %
▪ Discos de antibióticos
▪ Frascos con etanol al 70 %
▪ Pinzas
▪ Hisopos estériles
▪ Regla en milímetros o plantilla de lectura
▪ Mechero
▪ Desinfectante
TEGO
Preparación del patrón de turbidez MacFrarland #0.5
Reactivos: Cloruro de Bario 0.048M (1.75%p/v), Ácido Sulfúrico 0.3N (1% p/v).
Añadir 0.5 ml de Cloruro de Bario a 99.Sml de Ácido Sulfúrico. La densidad óptica

en un espectrofotómetro a 625nm que debe dar 0.08 a 0,10 de absorbancia.
Técnica
Una vez sembrado y obtenido el crecimiento de los microorganismos de una
muestra clínica, "evaluar correctamente" el hallazgo antes de decidir la realización
del antibiograma. Seleccionar 4 a 5 colonias similares del microorganismo
susceptible de practicar el antibiograma y colocarlas en el caldo de cultivo.
Incubar a 35°C y mantenerlos en esa temperatura de 2 a 5 horas. Ajustar la

turbidez del cultivo a la turbidez del estándar MacFarland #0.5. Si la turbidez del
cultivo sobrepasa a la del estándar diluir con agua destilada estéril a la
concentración deseada.
112
En las bacterias exigentes tales como Haemophilus influenzae, Neisseria
gonorrhoeae y Streptococcus pneumoniae, obviar el paso de crecimiento en caldo
y preparar un inóculo directamente en 4 a 5 ml de solución salina y ajustarlo con el
estándar MacFarland # 0,5 para luego inocularlo en las cajas petri.
Introducir un aplicador estéril en el caldo de crecimiento, eliminar el exceso por

rotación en las paredes del tubo luego inocular en un sentido en toda la superficie
de la caja petri y repetir el paso anterior en dos sentidos diferentes para finalizar la
inoculación pasar el aplicador por la periferia del medio de cultivo.
Permitir secar la siembra mediante el reposo por un lapso de 3 a 5 minutos y no

más allá de 15 minutos.
Introducir la pinza en el frasco de alcohol y pasarla por el mechero esperar hasta

que el fuego de la pinza se consuma. Colocar los discos de los antibióticos
seleccionados con la pinza e impregnarlos en la superficie de las placas inoculadas
haciendo una ligera presión sobre ellos.
Los discos deben quedar a una distancia de 15 mm de los bordes de la placa y

suficientemente alejados entre ellos para evitar la sobreposición de halos.
113
La selección de los agente antimicrobianos se denominan batería de
antimicrobianos, las decisiones finales con respecto al contenido de la batería deben
ser tomadas por el laboratorista, el personal médico (en particular de los
especialistas en enfermedades infecciosas) y de la farmacia.
El siguiente paso es incubar a 35°C en un ambiente de aerobiosis sin CO2 ya que

puede alterar el pH de la superficie y consecuentemente el desarrollo de los
microorganismos inoculados, excepto para Haemophilus influenzae y Neisseria
gonorrhoeae cuyas variaciones de estandanzación fueron determinadas bajo ese
parámetro, chequear adecuadamente la temperatura de la incubadora ya que si
sobrepasa la temperatura ideal puede afectar la prueba.
Luego de 16 a 18 horas de incubación se procede a la lectura de las zonas, de

inhibición, para ello se puede utilizar una regla o también se puede utilizar plantillas
previamente diseñadas para el efecto. Una vez hecha la lectura de los halos de
inhibición se procede a comparar con las tablas pertinentes para establecer la
categoría con la cual será clasificado el microorganismo para cada uno de los
antibióticos.
Métodos de prueba
Métodos que miden directamente la actividad de antimicrobianos en forma
directa
❖ Las mediciones directas de la actividad antimicrobiana se hacen mediante:
❖ Métodos de prueba de sensibilidad convencionales, como dilución en caldo,
dilución en agar y difusión con discos (la explicada anteriormente).
❖ Sistemas comerciales de pruebas de sensibilidad.
- Métodos de microdilución en caldo.

- Derivados de la dilución en agar.
- Derivados de la difusión en agar.
- Sistemas automatizados de prueba de sensibilidad a antimicrobianos.
❖ Pruebas especiales de screening e indicadoras.
114
CRITERIOS PARA EL CONTENIDO Y USO DE BATERÍAS DE
ANTIMICROBIANOS
Identificación del microorganismo o grupo: los antimicrobianos a los que le
microorganismo es intrínsecamente resistente se excluyen de rutina de la batería.
Por ejemplo vancomicina no se usa para bacilos gramnegativos.
Patrones de resistencia adquiridos frecuentes en la flora microbiana local: si
la resistencia a un agente determinado es frecuente, la utilidad del agente puede
presentar limitaciones suficientes como para que no se justifique la realización de
pruebas de rutina y solo los antimicrobianos más potentes se incluyen en la batería
de prueba. A la inversa, puede que no sea necesario que los agentes más potentes
integren la batería de prueba si la sensibilidad a agentes menos potentes es
frecuentes.
Método de prueba de sensibilidad a antimicrobianos usados: en función del
método de prueba, algunos agentes no detectan la resistencia de forma confiable,
y no deben incluirse en la batería. Por ejemplo, la resistencia de Streptococcus
Pneumoniae a la cefotaxima no puede detectarse por difusión con discos, por lo que
no debe formar parte de una batería de prueba con discos.
Localización de la infección: los agentes antimicrobianos, como nitrofurantoína,
que solo alcanzan niveles efectivos en el aparato urinario, no deben incluirse en
baterías probadas contra aislamientos bacterianos provenientes de otros sitios del
cuerpo (es decir, deben ser capaces de lograr la aproximación anatómica).
Disponibilidad de los agentes antimicrobianos: las baterías de prueba de
agentes antimicrobianos se seleccionan por su capacidad de detectar resistencia
bacteriana a agentes utilizados por el personal médico al que presta servicios el
laboratorio.
El NCCLS publica tablas actualizadas que enumeran los posibles agentes
antimicrobianos a incluir en las baterías de prueba contra determinados
microorganismos o grupos de microorganismos.
DISCOS DE ANTIBIÓTICOS USADOS PARA GÉRMENES GRAM POSITIVOS Y
GRAM NEGATIVOS TOMANDO EN CUENTA AL PACIENTE AMBULATORIO
GRAM POSITIVOS GRAM NEGATIVOS

Oxacilina (ox) Ampicilina (am)
Eritromicina (E) Cefuroxima (cxm)
Clindamicina (cc) Ampicilina + sulbactam (sam)
Cefoxitin (fox) Gentamicina (gm)
Sulfas (sxt) Norfloxacina (nor)
Ciprofloxacina (cip) Nitrofurantoína (fm)
Vancomicina (va) Sulfas (sxt)
115
ACTIVIDADES Y EXPERIMENTACIÓN
EXPERIMENTACIÓN
1. Continuando con la práctica anterior, cada estudiante realizará la

observación de las colonias sembradas en agar sangre y realizará la
coloración Gram de dos colonias diferentes, observar en el microscopio y
anotar los resultados de todos los del equipo de trabajo en un cuadro para el
informe pendiente.
2. Se realizará el antibiograma y su respectiva interpretación. Trabajo grupal.
RESPONDA AL SIGUIENTE CUESTIONARIO:
1. ¿Cómo se llama la técnica empleada en clases para medición de sensibilidad

de antimicrobianos?
2. ¿Para qué sirve el caldo de tripticasa soya en el antibiograma?¿Qué tipo de
medio es: enriquecimiento, universal, selectivo, etc.?
3. ¿Se puede realizar el antibiograma únicamente con el resultado Gram? ¿Qué
falta realizar antes?
4. ¿Se compara el patrón de turbidez Mac Farland con el cultivo realizado en el
medio de Muller Hinton o con el caldo de cultivo TSB?
5. ¿Qué debe hacer cuando la turbidez supera al patrón Mac Farland?
6. ¿A qué temperatura se debe incubar el cultivo líquido (TSB) y el sólido (Muller
Hinton? ¿Porqué?
7. ¿Por qué razón se debe obviar el crecimiento de bacterias como
Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae y Streptococcus
pneumoniae en el caldo de TSB? ¿Qué debe hacer?
8. ¿A qué distancia se deben poner los discos de antibióticos en el medio de
Muller Hinton?¿Porqué?
9. ¿Se puede utilizar Vancomicina en un antibiograma para la Escherichia coli?
¿Porqué?
10. ¿Porqué razón la Nitrofurantoína no debe ser utilizada para las vías
respiratorias?
11. ¿Podemos utilizar la ampicilina para bacterias cuyo resultado Gram es:
cocos Gram positivos dispuestos en cadena?
12. ¿Cómo se llama el método convencional empleado para realizar el
antibiograma empleado en la práctica de nuestra clase?
116
Indicadores %
procedimientos
Examen parciales 30
Total 100
LISTA DE COTEJO

Manual Práctico?
solicitados?
¿Conoce lo que es un antibiograma y su
utilidad en el tratamiento de un paciente?
117
PRÁCTICA XIV
IDENTIFICACIÓN DE COCOS GRAM
POSITIVOS Y SU IMPORTANCIA CLÍNICA
118
IDENTIFICACIÓN DE COCOS GRAM POSITIVOS
OBJETIVOS:
❖ Conocer los diferentes fundamentos de las pruebas empleadas para Ia

identificación.
❖ Realizar los diferentes métodos de identificación de las familias y géneros de
cocos Gram positivos.
❖ Reconocer algunas especies mediante las técnicas de identificaci6n
empleadas.
FAMILIA MICROCOCCACEAE
Son cocos gram positivos, aparecen solos, en pares, tetradas, paquetes de ocho y
en racimos. No motiles, no esporulados, catalasa (+), reducen nitratos a nitritos. Las
colonias son redondas, lustrosas, blancas aunque tambien existen especies
pigmentadas. Forman esta familia especies SaprOfitas, parasitas y patogenas que
se encuentran distribuidas ampliamente en Ia naturaleza.
Los géneros Micrococcus y Staphylococcus forman parte de la flora humana y de

animales pero también existen ciertas especies patógenas para el hombre.
El género Staphylococcus contiene tres especies de importancia clínica:

Staphylococcus aureus: (facultativo anaerobio)
Puede infectar cualquier parte del cuerpo humano, es la causa más común de
infecciones supurativas, en casos severos puede producir septicemias, es
frecuentemente el agente causal de la ostiomielitis.
Cepas de S. aureus cuando crecen en altas concentraciones de CO2 (30%) pueden

producir una enterotoxina termoestable, causante de envenenamiento por
alimentos. Otras cepas producen una toxina epidermolítica (exfoliativa) causante
del síndrome de piel escaldada.
Staphylococcus epidermidis: Se lo encuentra en el aire y en la piel. Normalmente

no patógeno, pero puede causar infecciones secundarias de la piel, heridas
posquirúrgicas y endocarditis posoperatorias.
Staohylococcus saprofiticus: Se lo encuentra en el aire, polvo y productos

animales. Generalmente considerados no patógenos, pero en ocasiones puede
producir infecciones urinarias.
119
Micrococos: (estrictos aerobios) Forman parte de la flora normal de la piel y
mucosas. Las coloirias son blancas y chiclosas.
Peptococcus: Son anaerobios estrictos se los considera los Estafilococos

anaeróbicos, se los encuentra en cultivos de heridas profundas.
FAMILIA STREPTOCOCCACEAE,
Son cocos gram positivos que se dividen en un solo plano, formando pares o
cadenas, aerobios y anaerobios facultativos. No producen esporas, no son mótiles.
Son catalasa negativa.
Este género contiene organismos patógenos para el hombre. Los más importantes
son:
GRUPO A: Streptococcus pyogenes
GRUPO B: Streptococcus agalactiae (pigmento)
GRUPO D: Enterococcus faecalis Streptoccocus pneumoniae y grupo viridans
Además las infecciones causadas por Estreptococos del grupo A pueden llevar a
síndromes post-infecciosos de fiebre reumática, cardiopatías reumáticas y
glomérulo nefritis aguda.
Los estreptococos tienen hemolisinas que actúan de diferente manera en agar

sangre: Hemólisis beta: zona clara alrededor de la colonia Hemólisis alfa: zona de
hemólisis incompleta (verde). Hemólisis gamma: ausencia de hemólisis.
120
Streptococcus pneumoniae
Son diplococos gram positivos, con los extremos alargados en forma de lanza,
también se agrupan en cadenas; no forman esporas, no mótiles, poseen una
cápsula formada de polisacáridos específicos, lo que permite una tipificación con
antisueros específicos.
Patógenos para el hombre, producen neumonías, meningitis, otitis y endocarditis.

Crecen bien en agar sangre y chocolate en atmósferas que contienen el 10% de
CO2.
PRUEBAS DE LABORATORIO
Ahora enumeraremos las pruebas bioquímicas necesarias para la

identificación de los estafilococos.
PRUEBA DE LA CATALASA.
PRUEBA DE LA COAGULASA.
SUSCEPTIBILIDAD A LA NOVOBIOCINA.
HIDROLISIS DEL PYR.
PRUEBA DE CAMP.
BILIS ESCULINA.
PRUEBA DE TOLERANCIA A LA SAL (Caldo.
PYR.
121
Catalasa: la catalasa es una enzima que descompone el peróxido de hidrógeno
(H202) en oxígeno y agua. El peróxido de hidrógeno se forma como uno de los
productos finales del metabolismo oxidativo o aeróbico de los hidratos de carbono.
Si se deja acumular, el peróxido de hidrógeno es letal para las células bacterianas.
2H202 ► 2H20 + 02 (burbujas de gas)
Procedimiento: En una placa portaobjetos añadir 1 o 2 gotas de peróxido de

hidrógeno al 3% (diluir la solución al 30% con agua destilada), transferir células del
centro de una colonia bien aislada y mezclar. La rápida aparición y producción
sostenida de burbujas de gas o efervescencia indica una reacción positiva.
Coagulasa: la coagulasa es una enzima proteíca de composición química

desconocida, con actividad semejante a la protrombina, capaz de transformar el
fibrinógeno en fibrina, provocando la formación de un coágulo visible en un sistema
analítico adecuado. En el laboratorio, la prueba de coagulasa se utiliza más
comúnmente para diferenciar al S. aureus (coagulasa positivo) de otros
estafilococos y micrococos.us (coagulasa positivo) de otros estafilococos y
micrococos. La coagulasa se halla en 2 formas, "libre" y "fija", cada una de las cuales
posee diferentes propiedades que requieren el uso de técnicas separadas.
Prueba en tubos (coagulasa libre):
1. Colocar asépticamente 0.5 ml de plasma de conejo reconstituido en el fondo

de un tubo estéril.
2. Mezclar por rotación suave del tubo, evitando remover o agitar el contenido.
3. Colocar el tubo en la incubadora de 4 a 24 horas. Observar la formación de
un coagulo visible.
Novobiocina: Se usa el agar Mueller-Hinton, como el antibiograma ó también en

agar sangre.
Se utiliza para identificar que tipo de Staphylococcus coagulasa negativos es.

Pueden ser sensibles o no a la novobiocina (5 pg). Staphylococcus epidermidis es
sensible, mientras que Staphylococcus saprophyticus no lo es.
Procedimiento: Se toma un agar Muller Hinton ó agar sangre y en un lado de la

placa se estría con el asa en forma continua la cepa del Staphylococcus coagulasa
negativo, con una pinza estéril se coloca el disco de novobiocina en el centro del
estriado realizado se incuba a 35°C por 18 horas.
122
Interpretación de resultados: Un halo de inhibición de crecimiento menor o igual
a 16 mm corresponde Staphylococcus saprofiticus. Un halo de inhibición mayor de
16 mm corresponde al Staphylococcus epidermidis (también pueden ser otros
estafilococos negativos).
Bacitracina: las pruebas presuntivas en la identificación del EbHGA (Estreptococo

beta hemolítico del grupo A) se basan en la susceptibilidad e inhibición del
crecimiento en una placa de agar sangre, y que tienen la mayor parte (95%) de las
cepas al ponerlas en contacto con discos que contienen dosis bajas (0.04U) de
bacitracina.
Procedimiento: Se toma un agar sangre y en un lado de la placa se estria con el

asa en forma continua la cepa de estreptococo beta hemolítico, con una pinza estéril
se coloca el disco de bacitracina en el centro del estriado realizado. La placa de
agar sangre es incubada a 35-37° C durante toda la noche. Los resultados son
cualitativos y es positiva para estreptococo beta hemolítico del grupo A si se
encuentra cualquier halo de inhibición alrededor del disco.
Camp: Se realiza en agar sangre. Se usa para poder identificar que estreptococo
puede ser (A, B, D). Se basa en que los estreptococos del grupo B (Streptococcus
agalactiae) producen un factor llamado CAMP (factor de monofosfato de adenina
cíclica) que aumenta la zona de hemólisis producida por un estafilococo productor
de lisina.
123
Procedimiento: La prueba se realiza en agar sangre, colocando una estría del
estreptococo sospechoso del grupo B y luego se coloca otra estría en forma
perpendicular del estafilococo productor de lisina, el resultado es positivo cuando
hay la presencia de una zona de potenciación de la hemólisis en forma de puntas
de flecha en el lugar donde se contactan las dos estrías. La lisina aumenta la zona
de hemólisis producida por un estreptococo del grupo B.
Bilis esculina: los estreptococos del grupo D crecen rápidamente en el agar bilis
esculina e hidrolizan la esculina, que en presencia de iones hierro forman un
compuesto de color verde oliva hasta negro. Las sales biliares presentes inhiben el
desarrollo de la flora acompañante.
Optoquina: se usa el disco de optoquina para diferenciar entre S. pneumoniae

(sensibles) y otras especies de estreptococos a hemolíticos (resistentes). La
sensibilidad a la optoquina es una medida de la fragilidad de la membrana celular
bacteriana. La optoquina, que es el clorhidrato de etilhidrocupreína.
Procedimiento: Se toma una suspensión de colonias puras en caldo Mueller Hinton

o tioglicolato y con un hisopo se estría una placa de agar sangre de carnero al 5 %.
Sobre la estría se coloca el disco de optoquina. Se incuba con atmósfera de CO2 al
5 %(jarra con vela) durante 24 hs. a 35° C.
Interpretación: Sensible, cuando hay inhibición alrededor del disco. Se considera

como punto de corte 16 mm. (discos de 10 mm) o 14 mm (discos de 6 mm).
Resistente, cuando el crecimiento no es inhibido alrededor del disco. Los casos de
halos intermedios deben resolverse por acumulación de pruebas a favor o en contra.
124
EXPERIMENTACIÓN
1. Se realizarán pruebas de:
▪ Catalasa para diferenciar a la familia Micrococcaceae de Streptcoccoceae.

▪ Coagulase para identificar al Staphylococcus aureus.
▪ Novobiocina, bacitracina, optoquina, Camp.
▪ Diferenciar hemólisis en agar sangre.
2. Realizar el portafolio de la práctica correspondiente y colocar los resultados

obtenidos.
RESPONDA AL SIGUIENTE CUESTIONARIO:

❖ ¿Qué técnicas diagnósticas se utilizan en el laboratorio para identificar a los
a los Staphylococcus y a los Streptococcus?
❖ ¿Cómo se presentan en la coloración Gram las bacterias pertenecientes a la
familia Micrococcaceae y la Streptococcaceae?
❖ ¿Cómo identificamos al Staphylococcus aureus del Strpetoccous pyogenes?
Mencione varias técnicas de identificación que ayuden para este propósito.
Según el grado de hemólisis clasifique a varias especies de Streptococcus y coloque

además las diversas pruebas con las que se las puede identificar.
María Teresa presenta una herida post-quirúrgica con abundante pus, su médico
solicita realizar exámenes microbiológicos para detectar el microorganismo
presente:
a) ¿Cuáles serían los pasos para la identificación del microrganismo luego de

tomar la muestra? Coloque los resultados obtenidos en cada paso.
b) ¿Cuál sería el microorganismo presente según los resultados del literal 5.1?
c) ¿Qué antibióticos emplearía?
José Antonio presenta fiebre reumática, su médico solicita realizar exámenes

microbiológicos para detectar el microorganismo presente:
a) ¿Cuáles serían los pasos para la identificación del microrganismo luego de

tomar la muestra? Coloque los resultados obtenidos en cada paso.
b) ¿Cuál sería el microorganismo presente según los resultados del literal 6.1?
c) ¿Qué antibióticos emplearía?
125
Utilizando una foto explique la prueba de Camp.
Verdadero o falso:
▪ Es mejor sembrar al Streptococcus pneumoniae en agar chocolate que en

agar sangre (justifique su respuesta).
Mencione dos diferencias entre enterococos y no enterococos.
▪ ¿Por qué razón especies de bacterias del género Micrococcus crecen bien
en agar sangre en una atmósfera con oxígeno?
▪ ¿Cómo identificaría al Staphylococcus saprofyticus del Streptococcus
pneumoniae?. Mencione dos pruebas microbiológicas.
▪ ¿Según el grado de hemólisis como puedo identificar al Streptococcus
pneumoniae del Streptococcus pyogenes?. Mencione dos pruebas
microbiológicas.
126
Indicadores %
procedimientos
Examen parciales 30
Total 100
LISTA DE COTEJO

Manual Práctico?
solicitados?
¿Puede realizar las pruebas sin ayuda ni
supervisión con toda destreza?
127
PRÁCTICA XV
IDENTIFICACIÓN DE BACILOS GRAM
POSITIVO Y SU IMPORTANCIA CLÍNICA
128
Objetivos
▪ Aprender la técnica de la baciloscopia con la finalidad de conocer los bacilos
acido alcohol resistente, el micobacterium tuberculosis.
▪ Manipular los medios de cultivo en placa que más se usan para obtener y
aislar las colonias de el Micobacterium tubercolosis.
Generalidades
Mycobacterium tuberculosis es una bacteria aerobia estricta patógena responsable

de la mayor cantidad de casos de tuberculosis en el mundo. Quien la describió por
primera vez, el 24 de marzo de 1882, fue Robert Koch, a quien posteriormente se
le otorgó el premio Nobel de Fisiología o Medicina.
La transmisión de los bacilos de la tuberculosis se produce casi exclusivamente por
medio de núcleos suspendidos en pequeñas gotas que son expulsadas con la
expectoración de las personas afectadas por tuberculosis pulmonar. Estas
pequeñas gotas pueden permanecer infectantes en el aire durante bastante tiempo
y pueden ser inhaladas por otras personas. La infección de los contactos es más
probable cuando conviven o permanecen durante un tiempo prolongado cerca del
enfermo que está expectorando bacilos y en un ambiente poco ventilado.
Nombre científico: Mycobacterium tuberculosis
Filo: Actinobacteria
Familia: Mycobacteriaceae
Categoría: Especie
Clasificación superior: Mycobacterium

Orden: Actinomycetales
OBJETIVOS:
▪ Conocer los diferentes fundamentos de las pruebas empleadas para Ia
identificación.
▪ Realizar los diferentes métodos de identificación de las familias y géneros de
Bacilos Gram positivos.
▪ Reconocer algunas especies mediante las técnicas de identificación
empleadas.
Generalidades:Bacilos Gram positivos formadores de esporas Bacillus Clostridium.
Los bacilos grampositivos formadores de esporas son bacterias de los géneros de
Bacillus y Clostridium. Estos bacilos son universales y, debido a su capacidad para
formar esporas, pueden vivir en el ambiente por varios años. Los géneros de
Bacillus son aerobio y, los de Clostridium son anaerobio.
129
De las muchas especies de Bacillus y géneros afines que aún no se han clasificado
bien en la microbiología médica, la mayoría no causa enfermedades. Sin embargo,
existen algunas especies que generan enfermedades importantes en seres
humanos. Bacillus anthracis origina el carbunco, enfermedad clásica en la historia
de la microbiología; este padecimiento sigue siendo importante en animales y, en
ocasiones, en seres humanos. Debido a sus toxinas tan potentes, B. anthracis es
un microorganismo potencialmente importante para el bioterrorismo y la guerra
biológica. Bacillus cereus y Bacillus thuringiensis causan intoxicación alimentaria y
a veces infecciones oculares y de otro tipo.
Procedimientos
▪ Tinción Gram
▪ Cultivo en agar sangre y agar yema de huevo en anaerobiosis
PRUEBA DE NAGLER
▪ Actividad lecitinásica se inhibe añadiendo antisuero a la mitad de la placa.
▪ Técnicas serológicas para presencia de toxina en heces.
Principio: la lecitinasa bacteriana descompone esta lecitina (un componente
normal de la yema de huevo) en un diglicérido insoluble que da como resultado un
halo opaco, que rodea la colonia cuando se cultiva en el medio de agar de yema de
huevo.
Generalidades:
El agar de yema de huevo modificado es un medio diferencial y enriquecido utilizado
en el aislamiento y la presunta diferenciación de diferentes especies en función de
su producción de lecitinasa y lipasa y actividad proteolítica. La degradación de la
lecitina presente en la yema de huevo da como resultado la formación de un
precipitado opaco alrededor de las colonias. La enzima lipasa hidroliza las grasas
dentro de la yema de huevo, lo que resulta en un brillo iridiscente en la superficie de
la colonia.
130
Indicadores %
procedimientos
Examen parciales 30
Total 100
LISTA DE COTEJO

Manual Práctico?
solicitados?
¿Conoce cuales Bacilos son de
importancia medica?
131
PRÁCTICA XVI
COCOS DE IMPORTANCIA
MÉDICA NEISSERIAS
132
COCOS DE IMPORTANCIA MÉDICA: NEISSERIAS
OBJETIVOS:
1. Identificar cocos gramnegativos de importancia médica.

2. Que los estudiantes conozcan la forma de realizar la toma de muestra
bacteriológica de secreción vaginal y uretral.
FUNDAMENTO:
El género de Neisserias es un grupo de cocos que incluye dos especies patógenas
para el 3 hombre, el meningococo (Neisseria meningitidis) ye 1 gonococo (Neisseria
gonorrhoeae).
Las Neisserias son cocos gramnegatiyos inmóviles, que crecen habitualmente en

parejá„ pero que en Ocasiones lo hacen en tétradas o en racimos. El tamaño
individual de los cocos 3 es pequeño (alrededor de 0.8 um) y su forma puede estar
distorsionada por autolisis parcial. Los meningococos aislados de la sangre o del
líquido cefalon-aquídeo tienen una cápsula" de polisacárido.
Las Neisseriás crecen mejor en condiciones aerobias en presencia de un -5,10% de

CO'T. Todos los. miemlios del género son' oxidása - positivas; esto es lás colonias
se vuelven negras cuando son sometidas a la acción de una solución 'de dimetilo
de tetrametil – p - parafenilendiamina al 1 %.
El medio dé cultivo especial para el gonococo es el Agar Thayer Martin modificado:

b Este medio es enriquecido por un complejo vitamínico llamado Isovitalex y sangre
calentada (para liberar la hemoglobina). Además, contiene glucosa y antibióticos
111 (vancomicina, dolistina, nistatina y trimetropin) estos sirven para inhibir la flora
saprofita que se encuentre en la secreción. Las colonias características de Neisseria
son pequeñas translucidas y en forma de rocío de lluvia.
133
TOMA DE MUESTRA:
Muestras-vaginales
Interrogar al paciente sobre:
a) Medicamento que esté tomando.

b) Óvulos o antisépticos vaginales que se esté aplicando.
c) Utilización de dispositivos intrauterino.
d) Edad.
e) Fecha de la última menstruación.
1. Indicar a la paciente que el día del examen, no debe hacerse baño de "ducha
vaginal".
2. Explicar a la paciente el procedimiento que se le practicara.
3. Introducir especulo vaginal metálico o de plástico desechable. Asegurarlo
correctamente, si la paciente es una niña no utilizar especulo vaginal. Advertir
a la persona responsable de la niña sobre el" procedimiento que se realizara.
Si la paciente es mayor y niega haber tenido relaciones sexuales, evitar
utilizar igualmente especulo vaginal y tornar la muestra de la secreción que
sale espontáneamente.
4. No utilizar lubricantes que faciliten la introducción del especulo (Los
lubricantes producen interferencia en los resultados.).
5. Tomar muestra de exocervix Y fondo de saco posterior con hisopo estéril.
Tomar con un nuevo aplicador, muestras de- endócervix. Colocar el aplicador
en tubo de vidrio estéril con tapa, que contenga un (1) ml de Solución salina
estéril al 0.85%. (Muy útil para investigar Tricomonas y gardnerellas).
134
Secreción Uretra Masculina
1. Indicar al paciente que debe abstenerse de orinar al levantarse y que podrá

hacerlo una vez que se practique la toma de muestra uretral.
2. Retractar el prepucio del paciente (si es necesario) y limpiar con gasa seca
estéril el meato urinario.
3. Introducir escobillón p asa bacteriológica de puntas estériles. muy
cuidadosamente, a través del orificio uretral (aproximadamente 1 a 2
centímetro).
MATERIAL PARA LA PRÁCTICA:
❖ Asa bacteriológica.
❖ Aguja bacteriológica.
❖ Disco de Oxidasa.
❖ Bajalenguas.
❖ Hisopo de algodón estéril.
❖ Placas de agar Thayer Martin.
PROCEDIMIENTO:
Aislamiento de Moraxella catharralis de faringe
1. Tome un hisopo estéril y un Bajalenguas.

2. Pida al compañero que se eligió para la práctica que abra la boca y saque la
lengua.
3. Con el Bajalenguas deprima la lengua para tener una mejor visión de la
faringe.
4. Con el hisopo, toque a manera de raspado la parte posterior de la faringe, las
amígdalas y el pilar posterior del veló del paladar.
5. Con el mechero de Bunsen encendido y respetando el margen de esterilidad
inocule con el hisopo el material del exudado faríngeo en una placa con agar
Thayer Martin y siembre con una asa.
6. Incube a 37° C durante 24 horas.
7. Transcurrido las 24 horas, saque las placas de la incubadora y encienda el
mechero.
8. Coloque un disco de oxidasa en la tapa de la placa, toque con un asa las
colonias sospechosas y toque el disco.
9. Reporte sus resultados.
135
136
Indicadores %
procedimientos
Examen parciales 30
Total 100
LISTA DE COTEJO

Manual Práctico?
solicitados?
¿Conoce la importancia médica de
diagnosticar a tiempo una neisseria y los
medios de cultivo en que este
microorganismo crece con mayor
facilidad?
137
PRÁCTICA XVII
IDENTIFICACIÓN DE COCOS GRAM
NEGATIVOS Y SU IMPORTANCIA CLÍNICA
138
IDENTIFICACIÓN DE COCOS GRAM NEGATIVOS Y SU
IMPORTANCIA CLÍNICA
OBJETIVOS:
❖ Mediante el empleo de medios de cultivos identificar enterobacterias.
❖ Realizar la correcta interpretación de las reacciones de los medios de cultivos
mediante la intervención de enzimas y cambios de Ph.
ENSAYO DEL ROJO DE METILO (RM/VP)

Principio El test se usa para determinar la presencia de iones hidrógeno cuando un
microorganismo fermenta glucosa. Todos los miembros de la familia
Enterobacteriaceae convierten glucosa en ácido pirúvico por el camino de Embden-
Meyerhof. Los organismos que metabolizan ácido pirúvico producen ácido y bajan
el pH a menos de 4.4. Los organismos que utilizan, en cambio, el camino del
butilenglicol producen acetoína y butanodiol (diacetilo). El indicador del medio, rojo
de metilo, es rojo a pH < 5.0 y amarillo a pH > 5.8. El test es útil para la diferenciación
de Escherichia coli (rojo metilo positivo) de Klebsiella (rojo metilo negativo).
139
Procedimiento y resultado:
1. Con un asa estéril tomar material e inocular un tubo con caldo RMNP.
2. Incubar a 35° C por un mínimo de 48 horas.
3. Transferir 2.5 ml de la suspensión a un tubo.
4. Agregar 5 gotas del indicador y observar si hay cambio de color.
5. Agregar 5 gotas del indicador rojo metilo y observar si hay cambio de color.
6. Ensayo positivo: el reactivo permanece rojo.
7. Ensayo negativo: el reactivo se torna amarillo-naranja.
8. Si el resultado es negativo continuar la incubación de la bacteria por 24 horas
más.
ENSAYO DE - VOGES PROSKAUER

Principio
El piruvato es un intermediario en el metabolismo de la glucosa. A partir del ácido

pirúvico un microorganismo puede seguir varios caminos. Algunos lo rompen para
formar como productos finales ácidos láctico, acético o fórmico. Otros metabolizan
el piruvato por el camino del butilenglicol para formar como productos finales
acetoína (acetilmetilcarbinol) y 2,3-butanodiol (diacetilo). El ensayo de Voges-
Proskauer (VP) detecta estos productos metabólicos. En presencia de oxígeno e
KOH, la acetoína se oxida a diacetilo, que da un complejo rojo. La sensibilidad del
ensayo se aumenta por el agregado de alfa-naftol antes del agregado de KOH.
Procedimiento y resultados:
1. Con un asa estéril tomar material e inocular un tubo de RMNP.

2. Incubar a 37°C por un mínimo de 48 horas.
3. Agregar unas gotas del reactivo de alfa-naftol.
4. Agregar unas gotas del reactivo de KOH.
5. Agitar el tubo y dejar descansar 10 a 15 minutos • Observar la formación de
un color rosado a rojo.
140
PRUEBA DE LA UREA
1. Principio La urea es una diamida del ácido carbónico, cuya hidrólisis por
acción de la ureasa da 2 moléculas de amoníaco. La ureasa es una enzima
constitutiva que se sintetiza independientemente de la presencia o no de la
urea. La prueba determina la capacidad de la bacteria de desdoblar la urea,
con la consiguiente alcalinización del medio. Es una actividad característica
de especies de Proteus y se usa para diferenciar Klebsiella (+) de Escherichia
(-) y Proteus (+ rápido) de Providencia (-); Yersinia pseudotuberculosis (+) de
Yersinia pestis (-).
141
Especímenes subcutáneos
Todo material debe ser enviado al laboratorio en un contenedor estéril. Transporte
e inoculación rápida son necesarios ya que muchos especímenes pueden también
contener bacterias que pueden crecer y enmascarar y consecuentemente inhibir o
retardar el aislamiento de los hongos patógenos.
Especímenes sistémicos (tejidos profundos)

Esputo, secreciones traqueales, secreciones bronquiales y respiratorias bajos un
buen espécimen de esputo es de 5 a 10 ml de material recientemente descargado
del árbol bronquial, con cantidades mínimas de contaminantes orales o nasales.
Tres especímenes pequeños de este tipo son mejores que un espécimen
coleccionado de 24 horas de volumen total igual. El hecho de que el espécimen sea
obtenido por la mañana temprano o a otra hora no es importante a pesar que
muchos pacientes producen más esputo poco después de levantarse en la mañana.
El esputo debe ser colectado usando un contenedor estéril. Esputos inducidos
deben también ser colectados en un contenedor estéril. Aspirados traqueales y
secreciones bronquiales pueden ser enviados en tubos de ensayo con tapón de
caucho u otros contenedores estériles apropiados.
Procedimiento y resultados
❖ Con un asa estéril se toma abundante material y se inocula por punción.

❖ Se incuba a 37°C y se efectúan lecturas a las 2, 4, 6 y 18 horas. Los tubos
negativos se observan diariamente por 4 a 7 días para detectar reacciones
tardías que dan ciertos miembros de la familia, registrando los resultados día
por día.
❖ Ensayo positivo: aparición de color rojo en el medio por una alcalinización del
mismo.
❖ Ensayo negativo: no hay cambio de color.
142
PRUEBA DEL SIM (H2S, indol, motilidad)
❖ Determinar si la bacteria a través de Triptofanasas puede degradar el

Triptófano a indol.
❖ Determinar si hay producción de H2S a partir de aminoácidos azufrados
dando como resultado un color negro.
❖ Determinar si la bacteria es móvil mediante la difuminación de la misma hacia
los lados, de lo contrario, la bacteria sólo crece en la línea de inoculación.
Principio del Indol
El indol es uno de los productos del metabolismo del aminoácido triptofano. Con un
medio rico en triptofano, el indol se puede detectar por su habilidad para combinarse
con ciertos aldehidos para formar un compuesto coloreado. El ensayo constituye un
método rápido para detectar organismos productores de indol. Como indicador de
la presencia del aldehído se usa el reactivo de Erlich. Es especialmente útil en la
identificación preliminar de Escherichia coli, y para diferenciar Edwardsiella (+) de
Salmonella (-).
Procedimiento y resultados
1. Con un asa tomar material de una colonia aislada e inocular en el medio SIM
• Incubar a 37°C por 18 a 24 horas.
2. Agregar 5 gotas del reactivo de Erlich por la pared del tubo.
3. Agitar el tubo y observar un color rosado en la interfase entre el medio y el
reactivo. Si el ensayo es negativo no hay cambio de un color amarillo en la
interfaseolor, el cultivo se debe reincubar otras 24 horas.
143
AGAR KLIGLER (TSI)
Principio
El agar de Kligler contiene dos azúcares: lactosa (1%) y glucosa (0.1%). Si el
microorganismo fermenta glucosa, tanto la punción como la estría aparecerán de
color amarillo. Si el organismo fermenta lactosa y, la estría permanecerá ácida
(amarilla). Si no fermenta lactosa, la estría se vuelve alcalina (roja). Los organismos
que no fermentan glucosa no producen cambios en el pH del medio o producirán
productos alcalinos y el medio permanecerá rojo. La producción de SH2 se
manifiesta por un ennegrecimiento del medio.
Resultados
1. Estría ácida/fondo ácido (amarillo/amarillo): fermentación de glucosa, lactosa

(E. coli).
2. Estría alcalina/fondo ácido (rojo/amarillo): fermentación de glucosa
solamente (Shigella spp.) Estría alcalina/fondo alcalino (rojo/rojo): no
fermentador (Pseudomonas aeruginosa).
3. Precipitado negro en el fondo: producción de SH2 (Salmonella spp).
4. Burbujas o roturas: producción de gas (E. coli, Salmonella spp).
144
PRUEBA DE LA LISINA (CARBOXILASA-DIHIDROLASA)
Principio
La descarboxilación es un proceso en el cual las decarboxilasas atacan el extremo
carboxilo de los aminoácidos, formando la correspondiente amina. La
decarboxilación de lisina da cadaverina (diaminas). Como la decarboxilación es una
reacción anaeróbica, se debe cubrir el medio con una capa de aceite mineral estéril.
El proceso ocurre en dos etapas: por fermentación de la glucosa se produce una
acidificación del medio (pH < 6.0), apareciendo color amarillo. La acidificación es
necesaria para que ocurra la decarboxilación.
Este último proceso de lugar a la formación de las aminas que elevan el pH con el
consiguiente viraje del indicador al color violeta.
La prueba de la lisina ayuda en la diferenciación de Edwardsiella (+), y Salmonella

(-h) de Citrobacter (-); de Enterobacter aerogenes (+) de Enterobacter cloacae (-) y
Enterobacter agglomerans (-).
Procedimiento y resultados:
1. Tomar material con un asa e inocular el tubo control y los tubos con los
aminoácidos.
2. Cubrir todos los tubos con una capa de vaselina estéril.
3. Incubar a 37°C
4. Efectuar las lecturas día por día hasta 4 días, registrando los resultados día
por día
5. Ensayo positivo: medio turbio y púrpura a púrpura amarillento.
6. Ensayo negativo: color amarillo.
7. Tubo control: permanece con su color original o se vuelve amarillo si el
organismo es un fermentador de glucosa (se debe ver turbidez en el tubo).
145
PRUEBA DEL CITRATO
Principio Es uno de los test del IMVIC (lndol, Rojo de metilo, Vogues-proskauer y
Citrato) usado para diferenciar enterobacterias. Hay microorganismos capaces de
utilizar el citrato como única fuente de carbono produciendo alcalinidad, se detecta
en un medio de cultivo con citrato como única fuente de carbono mediante el
crecimiento y la alcalinización del medio Este aumento de pH se visualiza con el
indicador azul de bromotimol que vira al alcalino a pH 7,6. Cuando el resultado es
positivo el medio de cultivo se vuelve azul y cuando es negativo se mantiene verde.
Procedimiento
Se inocula el agar inclinado en una sola estría en el pico. Utilizar un cultivo de 24

horas en un medio sólido y cuidando no arrastrar medio de cultivo, ya que se pueden
producir falsos positivos por crecimiento a partir del medio de cultivo del inóculo.
Incubar a 35°C durante 4 días. El ensayo es positivo cuando se observa crecimiento
a lo largo de la estría, acompañado o no de un viraje del indicador al azul.
Resultados
❖ (+)Klebsiella spp , ( - ) Escherichia Coli
FENILALANINA DESAMINASA
Las desaminasas catalizan la pérdida de NH3 en un aminoácido originando un ácido
carboxílico. Las bacterias que desaminan la fenilalanina producen ácido
fenilpirúvico que con Fe3CI en solución ácida produce un color verdoso (resultado
positivo) y cuando es negativo es de color amarillo (reactivo es de color amarillo).
146
MALONATO
El fundamento es igual al citrato, de esta manera se puede observar si se utiliza al
malonato como fuente de carbono.
API 20E
La batería de pruebas API20E es un sistema de identificación rápida para bacterias

de la familia Enterobacteriaceae y otras bacterias Gram (-). Básicamente consta de
21 tests bioquímicos estandarizados y miniaturizados y una base de datos. Este
sistema presenta las ventajas de ser rápido, eficaz y de permitir realizar numerosas
pruebas a la vez. Cada tira de API 20E contiene 20 microtubos o pocillos con
distintos sustratos deshidratados. Cada tubo es una prueba bioquímica distinta.
Los microtubos se inoculan con una suspensión de microorganismos, en agua o

solución salina, que rehidrata los medios. Las tiras o galerías se incuban a 37°C y
por efecto del metabolismo bacteriano se producen cambios de color espontáneos
o bien por la adicción de reactivos.
La lectura de las reacciones se hace mediante comparación con una tabla de lectura
donde se indica si los microorganismos deben considerarse positivos o negativos
para cada reacción según el color aparecido.
147
1. Efectuar la siembra en los medios de cultivo para la identificación de bacilos
Gram negativos, partiendo de un medio Mac conkey en donde un
microorganismo "x" se ha desarrollado. Trabajo grupal, venir estudiando la
práctica, se evaluará durante la clase.
2. Realizar el portafolio de la práctica y subirlo a la plataforma Moodle.
148
Indicadores %
procedimientos
Examen parciales 30
Total 100
LISTA DE COTEJO

Manual Práctico?
solicitados?
¿Reconoce las reacciones producidas en
los medios de cultivos?
149
PRÁCTICA XVIII
BACILOS GRAMNEGATIVOS DE
IMPORTANCIA MÉDICA
150
BACILOS GRAMNEGATIVOS DE IMPORTANCIA MÉDICA
OBJETIVOS
Identificar los bacilos Gram negativos de mayor importancia clínica, así como los
cuadros clínicos que frecuentemente ocasionan.
FUNDAMENTO:
Los bacilos Gram negativos conforman un grupo compuesto por múltiples familias
bacterianas entre las que destacan la familia Enterobacteriaceae, Vibrionaceae
Pseudomonadaceae y otros.
La familia Enterobacteriaceae constituye el conjunto mayor y más heterogéneo de
bacilos Gram negativos. Se han descrito al menos 27 géneros y 7 grupos entéricos
con más de 110 especies. Estos géneros se han clasificado en función de la
homología del ADN, propiedades bioquímicas, reacciones serológicas,
susceptibilidad a bacteriófagos específicos y patrones de sensibilidad a los
antibióticos. Son bacilos Gramnegativos, facultativos que fermentan glucosa, son
oxidasa negativos, reducen nitratos a nitritos y no requieren ni su desarrollo, se
acrecienta con NaCl. Pueden ser móviles o inmóviles, estas características sirven
para diferenciar miembros de esta familia de otros bacilos de Gramnegativos
facultativos fermentadores de glucosa pertenecientes la familia Vibrionaceae.
Son organismos obicuos de distribución mundial, se encuentran en el suelo, agua,
vegetación y formando parte de la - microbiota normal del intestino de casi todos los
animales incluyendo al humano. Las Enterobacterias pueden dar cuenta del 80%
de los aislamientos clínicamente significativos de bacilos Gramnegativos en
laboratorios de microbiología clínica y del 50% de todos los aislamiento.
Clínicamente significativos, así mismo pueden causar aproximadamente de un 60 a
70% de enteritis bacteriana aguda. Si bien muchas Enterobacterias han sido
implicadas en caso de diarrea solo se han establecido claramente como patógenos
entéricos miembros de los géneros Escherichis, Salmonella, Shigella y Yersinia.
Excepto las especies de Shigellas, que rara vez causan infecciones fuera del tracto
gastrointestinal, la mayoría de las Enterobacterias son capaces de producir una
variedad de infecciones extraintestinales. Sin embargo, un pequeño número de
especies incluyendo Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Escherichia
coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis y Serratia marcescens dan cuenta de
la gran mayoría de las infecciones. Las infecciones del tracto urinario (más del 70%)
principalmente cistitis son las más comunes, infecciones respiratorias, de heridas,
del torrente sanguíneo y del SNC.
El síntoma más característico de infecciones gastrointestinales es la Diarrea, que
se define como el aumento en el número de evacuaciones o una disminución en la
consistencia de las heces, siendo- una de las enfermedades de mayor frecuencia
en nuestro país, afectando principalmente a niños.
151
Los géneros bacterianos que causan diarrea comúnmente son: Shigella,
Salmonella, Escherichia, Campylobacter, Vibrio y otros.
TOMA DE MUESTRA:
Se debe obtener materia fecal ya sea por evacuación espontanea o por estimulo
rectal, la muestra se debe colocar en un frasco limpio y de boca ancha, deberá
procesarse dentro de las primeras dos horas a partir de la torna, si no es posible el:
proceso durante este tiempo se deberá utilizar medio de transporte como el de Cary-
Blayr, Selenite o Tetrationato, para evitar la alteración de bacterias patógenas. Para
la siembra deben escogerse las porciones con aspecto purulento, sanguinolento o
con moco.
❖ Bacterias Gram. negativas.
❖ Placas con agar EAM.
❖ Placas de SS.
❖ Placas de McConkey.
❖ Tubos con LIA.
❖ Tubos con Citrato de Simmons.
❖ Tubos con SIM.
❖ Tubos con TSI.
❖ Tubos con Urea.
REACTIVOS:
❖ Reactivo de Kovacks.
❖ Reactivo de rojo de Metilo.
PROCEDIMIENTOS:
1. Siembre las bacterias en los medios provistos siguiendo las instrucciones
del profesor y el monitor.
2. Incube a 370 C por 24 horas.
Anote sus resultados y compárelos con la tabla provista y elabore su reporte.
152
Indicadores %
procedimientos
Examen parciales 30
Total 100
LISTA DE COTEJO

Manual Práctico?
solicitados?
¿Conoce cuales Bacilos gram negativo
son de importancia medica?
153
PRÁCTICA XIX
BACILOS GRAMNEGATIVOS NO
FERMENTADORES
154
BACILOS GRAMNEGATIVOS NO FERMENTADORES
OBJETIVO
Identificar los bacilos no fermentados de importancia clínica, así como los cuadros
clínicos a los que frecuentemente se asocian.
FUNDAMENTO:
Genero Representante: Pseudomonas. Otras bacterias de importancia medica: B.

Cepacia, B. Pseudomallei, S. maltophilia, A. a Baumandii, Moraxella catarrhalis,
Acinetobacter.
Características de las Pseudomonas:
Se encuentran en el suelo materia orgánica en descomposición, la vegetación de
agua. En eI medio hospitalario en reservorios húmedos. La colonización es rara en
sanos, alrededor de un 6%; en hospitalizados 36%, en inmunosuprimidos 68%.
Tienen flagelos, no son fermentadores, aerobios obligados, capsulados. Algunos
producen pigmentos.
Factores de virulencia:
Pili, Cápsula, Endotoxina: Exotoxina A. Exoenzima Oil S, Elastasa, Fosfolipasa C,

Otras proteasas.
Está relacionada a condiciones de oportunismo en:
Infecciones pulmonares, (Fibrosis quísticas inmunodeficiencia con producción de
mucosidad), Infecciones primarias de piel y quemaduras, Infecciones de oído y
oculares. Infecciones de las vías urinarias, Endocarditis y Bacteriemia.
❖ Bacteria; Pseudornona. ❖ Tubos con TSI.
❖ Placas de Mueller Hinton. ❖ Tubos de Urea.
❖ Placas de McConkey. ❖ Discos de Oxidasa.
❖ Tubos con LIA. ❖ Reactivo de Kovacks.
❖ Tubos con Citrato de Simmons. ❖ Rojo de Metilo.
❖ Tubos con SIM.
PROCEDIMIENTOS:
1. Siembre las bacterias en los medios provistos siguiendo las instrucciones del
profesor y el monitor.
2. Incube a 370 C por 24 horas.
3. Anote sus resultados y elabore su reporte.
155
156
Indicadores %
procedimientos
Examen parciales 30
Total 100
LISTA DE COTEJO

Manual Práctico?
solicitados?
¿Puede reconocer el crecimiento
bacteriano y característica de la
pseudomona organismo modelo de
nuestra práctica?
157
PRÁCTICA XX
SEROLOGÍA EN BACTERIOLOGÍA
PRUEBAS DE V.D.R.L Y SÍFILIS (LUES)
158
SEROLOGIA EN BACTERIOLOGIA PRUEBA DE V.D.R.L Y SIFILIS (LUES)
OBJETIVO:
Demostrar la presencia de reagínas en el suero de ciertos pacientes con sífilis, e
introducir un método serológico en bacteriología.
FUNDAMENTO:
Dentro de los temas incluidos en el programa de bacteriología, consideramos un
tema serológica que está relacionado ampliamente con la bacteriología, es el que
trata de investigación de anticuerpos serológicas originados por la sustancias
antigénicas bacterianas.
PRUEBA DE V.D.R.L
Estas siglas significan "Venereal Disease Research Laboratory"; es una prueba
basada en la determinación de anticuerpos (reaginas) los cuales se producen como
respuesta humoral a la presencia de Treponema y sus productos.
Antes de referimos al tema serológica, expondremos brevemente los eventos 11
clínicos que resultan de la infección luética.
Haciendo un poco de historia sobre el origen de sífilis, hay datos que hasta ahora
son los más aceptados y se refieren a dos orígenes de la sífilis. Uno constituye la
teoría Colombiana la cuál cree que la infección sifilítica era endémica de la
Hispaniola (Haití), y fue subsecuentemente contraída y llevada a Europa por Colon
y sus huestes, cuando retorno a España.
En las guerras de 1494 entre españoles e italianos se dice que la sífilis ya estaba
presente entre los contendientes.
Los que sostienen la teoría pre-colombiana afirman vehemente que la sífilis estaba
presente en Europa antes del viaje de Colon, pero en forma no reconocida y
confundida con otras enfermedades como lepra o presente en una forma leve.
Hudson y otros creen que la infección probablemente se originó en África Central y
fue introducida luego en Europa por viajeros y comerciantes.
Sea cual sea su origen, no hay duda que ninguna de las teorías es enteramente
satisfactoria; es difícil concebir como la enfermedad se pudo difundir tan
rápidamente de un solo puerto de entrada.
La sífilis humana es transmitida por contacto sexual. En el hombre, las treponemas
están presentes en lesiones en el pene o descargados de lugares más internos aun
el líquido seminal.
En las mujeres, las lesiones están localizadas más comúnmente en la región
perineal o labios, pared vaginal o cérvix.
159
En aproximadamente 10% de casos, la lesión primaria es extra genital, usualmente
eh la boca.
El organismo penetra las membranas mucosas, pero aparenta entrar solamente por
erosiones pequeñas de piel. La multiplicación en el lugar de entrada resulta en un
lapso de 10 a 90 días (promedio 21) formándose una lesión característica, primaria
inflamatoria conocida como Chancro hunteriano el cual comienza como una pápula
la cual se rompe para formar ulcerita superficial de base firme; aunque el Chancro
cicatriza espontáneamente en cuatro a seis semanas, los organismos escapan e
invaden los linfáticos regionales formando bubones satélites, eventualmente llegan
a la sangre donde establecen una infección sistemática.
Los Chancros son únicas, lesiones múltiples son raras, son indoloros si están libre
de otras infecciones; pueden localizarse en labios, lengua. Amígdalas, mamas,
dedos y ano.
En una a cuatro semanas la reaginas serológicas puede ser reactiva.
Luego después de seis semanas (2 semanas a 6 meses) puede aparecer una
erupción) generalizada constituyendo la etapa secundaria de la sífilis, con lesiones
que envuelven piel y mucosas, en algunos casos esta etapa puede aparecer antes
que el Chancro cure.
Las pruebas serológicas aquí son invariablemente reactivas. Acompañando a estas
lesiones secundarias aparecen lesiones como fiebres y malestar general, las
lesiones en piel, pueden ser bilaterales, simétricas, maculares, populares,
foliculares, papuloescamosas pustulares, son secas y no pruriginosas.
Ocurren lesiones de piel como alopecia, caída de la cola de las cejas y condijornas
(cresta de gallo). Se encuentran usualmente linfadenopatías y esplenomegalia.
Todas las lesiones secundarias particularmente aquellas en membranas mucosas
son 1 altamente infecciosas. La cicatrización completa puede ser lenta
requiriéndose ocasionalmente varios años. En este periodo puede existir latencia
de la enfermedad sin manifestación y con serología positiva. En contadas ocasiones
los estados primarios y secundarios pasaran inadvertido para seguir a la etapa
tardía o terciaria.
En aproximadamente la mitad de pacientes no tratados, bastante treponema
persisten para originar lesiones terciarias varias años después de la infección.
La primera lesión terciaria es el GUMMA o goma que es una lesión necrótica de

piel, huesos y tejidos blandos.
Otras manifestaciones resultan de lesión de sistema nervioso central como parálisis
general y tabes dorsal.
160
Aproximadamente
25 % de los casos de sífilis terciaria no tratada asintomática y solo se reconocen por
la 1/ presencia de anticuerpos en el suero como T pallidum traspasa la barrera
placentaria una madre sifilítica puede transmitir la enfermedad al producto de
gestación particularmente en la etapa secundaria de la enfermedad. Las lesiones
de sífilis congénita se parecen a la sífilis adquirida.
Puede ocurrir intervención del embarazo o aborto habitual, natimuerte o recién
nacido con invasión de casi todos los tejidos del cuerpo.
MATERIAL NECESARIO:
1. Suero a investigar.
2. Rotador eléctrico.
3. Hipodérmicas #18 sin bisel.
4. Láminas de cristal 3 X 2 con anillos.
5. Pipetas graduadas de 1 a 5 ml.
6. Antígeno de V.D.R.L.
7. Solución salina amortiguada.
NOTA: El antígeno es una solución alcohólica de cardiolipina, colesterol y lecitina

la -cual puede obtenerse en el comercio en ampollas de 0.5 ml.
PROCEDIMIENTO:
1. Los sueros a investigar se obtienen en la forma usual por centrifugación. Si
persisten pequeñas partículas se centrifuga hasta que permanezca limpio.
2. Se inactiva el suero por 30 minutos a 56° C, algunos autores aconsejan que
cuando' se tiene prisa por conocer los resultados, se puede calentar el suero
60° C por 10 minutos.
3. Deposite con una pipeta de 1 ml graduada hasta la punta 0.05 ml de suero
del paciente previamente inactivado en una placa de cristal anillada.
4. Agréguele una gota de antígeno.
5. Coloque sobre el rotador eléctrico a 180 RPM por 4 minutos o rótelo a mano
sobre la mesa describiendo círculos de 2 pulgadas de diámetro.
6. Lea en el microscopio con objetivo y ocular de 10X y reporte los resultados.
RESULTADOS:
a) N.R ó no reactivo.
b) D.R ó débil reactivo.
c) R ó reactivo.
161
Resultados por falsos positivos biológicos. Además de los errores posibles en
los resultados debido a complejidad técnica, ciertos sueros dan positivos en
ausencia de sífilis como ocurre en paludismo, lepra, sarampión, enfermedades del
colágeno y otros procesos.
Prueba cuantitativa: Consiste en titular la concentración de anticuerpos existentes
en el suero reactivo.
Se efectúan por medio de la dilución del suero del paciente el cual se le agrega el
antígeno.
Procedimiento:
1. Prepare tantas disoluciones de 1:8 como sueros R haya encontrado en la
reacción cualitativa, colocando en cada tubo marcado con el número
correspondiente al suero problema 0.7m1 de salina al 0.9%.
2. Agréguele 0.1 ml del suero al tubo que contiene 0.7 ml de salina amortiguada
y mezcle.
3. Coloque con la pipeta de 0.02. ml en 6 anillos de las placas las siguientes
cantidades: Anillo 4, 5 v.6 recibirán respetivamente 0.04, 0.02 y 0.01 ml. del
suero diluido. Anillo 1, 2 y 3 recibirán 0:04, 0.02 y 0.01 ml de suero puro
respectivamente.
4. Agregue dos gotas de solución salina 0.9°0-.a los anillos 2 y 5, y 3 gotas al
anillo 3 y 6.
5. Después de agregar las gotas de salina y rotar por 15 segundos tendremos
en los 6 anillos las siguientes disoluciones: 1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 6.
6. Agregue a cada anillo una gota de antígeno y rote por 4 minutos.
7. Lea al microscopio con objetivo de 10X.
162
Los resultados se reportan de acuerdo a la última dilución que sea reactivo: Ejemplo:
1:1 = 1 Dilución
1:2 = 2 Diluciones
1:4 = 4 Diluciones
1:8 = NR (no reactivo)
Se reportan 4 diluciones.
163
Indicadores %
procedimientos
Examen parciales 30
Total 100
LISTA DE COTEJO

Manual Práctico?
solicitados?
¿Conoce los métodos serológicos para la
investigación de enfermedades como la
sífilis y la leptospirosis?
164
PRÁCTICA XXI
DIAGNÓSTICO DE INFECCIONES
NOSOCOMIALES
165
DIAGNÓSTICO DE INFECCIONES NOSOCOMIALES
OBJETIVO:
Al final de esta sesión el alumno percibirá la ocurrencia de infecciones nosocomiales
como un evento que necesita vigilancia y control en un establecimiento de salud.
FUNDAMENTOS:
Las infecciones que se presentan durante el proceso de asistencia hospitalaria,
reciben la denominación de nosocomiales, estas se refieren a la ocurrencia de una
infección que no estaba presente ni en incubación al momento de ingreso. En
ocasiones es difícil saber si la infección es hospitalaria, en general se acepta un
periodo de 72 horas libre de signos o síntomas, pues algunas infecciones se
encuentran en incubación al momento del ingreso. A lo largo del siglo XX han sido
muchas las diferentes bacterias que han comenzado a generar infecciones
nosocomiales. Este tipo de infecciones suelen ser difíciles de tratar debido a la
resistencia que acostumbran a desarrollar los diferentes gérmenes en los
hospitales. Estas en cualquiera de sus formas representan un problema de
actualidad e importancia, por lo que es preciso establecer un sistema de vigilancia
y control de infecciones hospitalarias en cada establecimiento sanitario.
DEFINICION DE LAS INFECCIONES HOSPITALARIAS MÁS COMUNES
Infección de Herida Aparición de pues en la herida quirúrgica

Infección Urinaria Urocultivo positivo. En pacientes con sonda a
permanencia la presencia de Piuria puede ser
criterio suficiente.
Neumonía Nuevo infiltrado en radiografía o condensación
pulmonar, aunado a secreciones bronquiales
purulentas.
Gastroenteritis Diarrea de dos o más días de duración.
Bacteriemia Hemocultivo positivo. Cultivo cultivo positivo de
punta de catéter o de los líquidos parenterales,
aunado a cuadro clínico de sepsis.
Maningitis Rigidez de nunca y líquido cefalorraquídeo
compatible.
Peritonitis Cuadro clínico y citoquimico o cultivo del líquido
peritoneal.
Deciduoendometritis Fiebre y secreción transvaginal fétida en
puerperio con restos placentarios en legrado.
Flebitis Cuerda venenosa palpable y dolorosa, o pus
alrededor del catéter.
166
Un sistema de vigilancia es un sistema de recogida, proceso, análisis y presentación
de los resultados de la frecuencia y distribución de un proceso patológico específico.
El principal objetivo de la vigilancia es disminuir las tasas de infección nosocomial
en los departamentos de los establecimientos de salud; para esto deben contar con
apoyo de recursos y personal para la lucha y prevención de estas infecciones.
PRECAUCIONES ESTÁNDAR:
1. Lavado de manos en todos los casos.
2. Uso de guantes para contacto cori líquidos corporales.
3. Uso de bata, máscara o lentes para protección contra salpicaduras.
4. Precauciones con la ropa contaminada.
5. Curación de pacientes con heridas infectadas con técnica de "no tocar.
MATERIALES PARA LA MUESTRA:

❖ Agar Sangre.
❖ Asa Bacteriológica.
❖ Hisopo estéril.
PROCEDIMIENTO PARA LA PRÁCTICA:
Recolectar con ayuda del hisopo, material de las mesas, paredes y piso del
laboratorio, buscando presencia bacteriana.
167
Indicadores %
procedimientos
Examen parciales 30
Total 100
LISTA DE COTEJO

Manual Práctico?
solicitados?
¿Conoce cuales microorganismos de
mayor importancia medico
168
PRÁCTICA XXII
TOMA DE MUESTRA Y DE
INFECCIONES FÚNGICAS
169
TOMA DE MUESTRA Y DIAGNÓSTICO DE INFECCIONES
FÚNGICAS
OBJETIVO:
Al final de esta sesión el alumno:
1. Identificara las condiciones para realizar una toma de muestras para
investigación de hongos como agente etiológico de enfermedades.
2. Podrá realizar toma de muestra de piel, pelos y uñas para identificación de
hongos.
FUNDAMENTO:
Los hongos son organismos eucariotas, portadores de esporas con nutrición por
absorción, carentes de clorofila, que se producen de forma sexual y asexual. Las
enfermedades producidas por hongos se denominan micosis.
Para realizar toma de muestra para investigación de hongos se seguirán las
siguientes instrucciones:
1. El paciente debe abstenerse de tratamiento antimicótico 10 días previos al

estudio y del empleo de talcos o cremas durante el día anterior.
2. Limpie el área de toma de la muestra con gasa humedecida en agua
destilada estéril o alcohol. No se debe utilizar algodón.
3. Raspe cuidadosamente con hoja estéril de bisturí los bordes de la lesión
(tome muestra de diferentes lesiones).
4. Coloque las escamas desprendidas dentro de una caja de Petri estéril, así
como Sal también sobre un portaobjetos de vidrio estéril.
5. Si con las escamas coexisten vesículas, estas deben romperse con la punta
de la hoja o de una lanceta estéril, su contenido debe ser depositado en los
recipientes indicados.
6. Puede colocarse también cinta adhesiva transparente sobre la lesión y
después de haber presionado la lesión con la misma, retirarla y
posteriormente pegar la cinta en el portaobjetos.
7. Procure tomar muestra suficiente para examen directo y cultivos.
8. Las muestras deben procesar en las dos (2) horas siguientes a su obtención.
9. Para investigación de Onicomicosis (micosis en uñas) la paciente debe
remover esmaltes de sus uñas, tres (3) días antes del estudio.
10. Las muestras de secreciones se obtienen de acuerdo al lugar en donde se
produzcan. Generalmente se recolectan por medio de jeringa estéril,
escobillo o capilar de vidrio estéril.
170
PROCEDIMIENTO DIAGNOSTICO GENERAL PARA INVESTIGACION DE
HONGOS
TOMA DE MUESTRA
METODO DIRECTO DE KOH TAPE TEST
Todas las Lesiones Lesiones características

de Piririasis Versicolor
Cultivo con Agar Saboureaud

(Identificación definitiva)
MATERIALES PARA LA PRÁCTICA:
❖ Bisturís estériles.
❖ Portaobjetos.
❖ Cubreobjetos.
❖ KOH al 40%.
PROCEDIMIENTO
1. Tomar muestra con ayuda del bisturí en lugares frecuentados por hongos
(preferiblemente espacios interdigitales de los pies).
2. Colocar las escamas en una lámina portaobjetos.
3. Agregar una gota de KOH al 40 % y cubrir la preparación con un
cubreobjetos.
4. Calentar por debajo la preparación al mechero, con flameos rápidos.
5. Observar hifas, filamentoso estructuras levaduriformes al microscopio.
6. Realice su reporte.
171
172
Indicadores %
procedimientos
Examen parciales 30
Total 100
LISTA DE COTEJO

Manual Práctico?
solicitados?
¿Puede reconocer el crecimiento de los
hongos y características morfológicos de
ellos en nuestra práctica?
173
PRÁCTICA XXIII
PRODUCCIÓN DE PIGMENTOS
BACTERIANOS
174
OBJETIVO
❖ Demostrar las especies de bacterias cromógenas.
PRODUCCIÓN DE PIGMENTOS BACTERIANOS
FUNDAMENTO: Determinados grupos bacterianos se caracterizan por producir
sustancias coloreadas en los medios en que se encuentran.
Para la determinación de esta característica es necesario hacer uso de medios
claros que permitan la mayor visualización, corno el de Muelles – Hinton. Los
pigmentos se visualizan mejor a temperatura ambiente. La pigmentación es más
frecuente en la bacteria saprófita y la masa celular puede tener color rojo,
anaranjado, amarillo, etc., por la presencia de pigmentos carotinoides, es verde en
casos de bacterias fotosintéticas que contienen bacterioclorina.
Entre los elementos patógenos que producen pigmentos están el estafilococo
dorado faureus) que produce un pigmento amarillo oso y Pseudomonas aeruginosa,
que produce un pigmento verdoso el cual se compone de picionina, que es
antimicrobiana y OIP y fluoresceína, sustancia fluorescente, en las infecciones a
Pseudomonas se puede observar frecuentemente un pus verdoso azul:
Las demás bacterias cromógenas son saprofita, patógenos potenciales entre los
que contamos a Staphylococcus álbus, que produce un pigmento blanco marfil:
Staphylococcus citrus, que produce un pigmento verde-limón: Sarcina lote con su
pigmento amarillo 4 intenso: Serrata marcescens que produce un pigmento rojo-
anaranjado: y E. Coli que en mucho casos presenta un color crema en sus colonias.
La pigmentación no se manifiesta en cada célula aislada pues el pigmento se halla
4 en gránulos intracelulares demasiado pequeños para poder ser vistos con
microscopio de luz. En muchos casos la pigmentación de las colonias depende del
medio de cultivo. Como estas características ocurren en grados y combinaciones
variables según los tipos de bacterias, el aspecto de la colonia muchas veces es
característico y pueden distinguirse tipos de bacterias entre sí en cultivos mixtos o
contaminados.
MATERIAL A UTILIZAR:
❖ Bacterias cromógenas.
❖ Medio Mueller-Hinton inclinado.
PROCEDIMIENTO:
❖ Siembre por estrías en Muelles-Hinton inclinado. Rotule.
❖ Incube a temperatura ambiente por 24-48 horas.
❖ Reporte.
175
176
Indicadores %
procedimientos
Examen parciales 30
Total 100
LISTA DE COTEJO

Manual Práctico?
solicitados?
¿Puede reconocer el crecimiento de los
hongos y característica morfológicos de
ellos en nuestra práctica?
177
BIBLIOGRAFÍAS
Ah L.R. (2010). Atlas de Parasitología Humana, 5ta. Edición, Buenos Aires: Editorial
Médica Panamericana.
Felicia Caiza Rubén (2003). Resistencia a los antimicrobianos de bacterias
frecuentes encontradas como agentes causales de infección nosocomial. (Tesis
Maestría). PUCE. Quito, Ecuador.
Forbes, Betty A. (2004). Diagnóstico Microbiológico Bailey  Scott/Betty A (11).

Buenos Aires, Argentina: Médica Panamericana.
Gilbert, David N. (2010). The Sanford guide to antimicrobial therapy 2010 (40).
Sperryville, Estados Unidos: SN.
Guadalupe García Elorriaga (2012). Citosinas, diabetes e infección de tejidos
blandos. Su relación con la severidad y mortalidad. Revistas Médicas del Instituto
Mexicano del Seguro Social, 50, 235.
Guadalupe García Elorriaga (2013). Bacterias oportunistas y microbiotas en niños
con leucemia y enterocolitis neutropénica. Revistas Médicas del Instituto Mexicano
del Seguro Social, 50, 235.
Henry, J.B (2005). El laboratorio en el diagnóstico clínico, Edición 20ª Vol.1, México:
Editorial Salvat Médica.
Jawetz, Ernest (2011). Microbiología de Jawetz (25).SL.Mc. Graw-Hill.
Manual de Bioseguridad en el Laboratorio (1995) OMS. Ginebra.
Rojas W. (2010). Inmunología de Rojas, Medellín-Colombia: Editorial Corporación
para Investigación Biológicas.
Zurita Jeannette (2012). Resistencia Bacteriana en Ecuador. Quito, Ecuador: SN.
178

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INDICE

El diagnóstico de las infecciones y el estudio de la microbiología médica, estos

En este manual empezamos a hablar sobre la Bioseguridad que tiene un doble

La UCE es una Institución de Educación Superior privada, abierta a todas las

Considera imperativo el compromiso con el bienestar de la población a través de los

Ser un referente de importancia regional, nacional e internacional en educación

1. El estudiante de Microbiología de la escuela de la Salud, Medicina,

Es imposible protegerse de lo que se desconoce, de ahí la necesidad e importancia

La peligrosidad de un agente está directamente relacionada con el tipo de

❖ Manipulación a la que es sometido.

Color Significado Indicaciones y precisiones

Señal de prohibición Comportamientos peligrosos

Alto, parada, dispositivos de desconexión

Comportamiento o acción específica.

Señal de Puertas, salidas, pasajes, material,

A continuación se muestra una tabla en la que se reflejan los pictogramas utilizados

1. Definir agentes biológicos, esterilización, Bioseguridad, desinfección,

El calor seco o húmedo elimina todas las bacterias combinando adecuadamente

Otro medio habitual de esterilización, utilizado para objetos no resistentes al calor,

La antisepsia o esterilización mecánica incluye lavado, cepillado y arrastre de

La esterilización química se consigue con el yodo y sus derivados (povidona

Conjunto de operaciones destinadas a eliminar o matar todos o casi todos los

También se le puede denominar proceso mediante el cual se produce la destrucción

En este caso se considera un adecuado proceso de desinfección a aquel que

Es la mayor afectada ya que se da la impregnación del aire, el agua o el suelo con

Ya se ha visto someramente que los agentes infecciosos en estudio pueden ser

Clasificación de los organismos según el nivel de peligrosidad:

NIVEL 2: Microorganismos de riesgo moderado y procedimientos de riesgo

NIVEL 3: Microorganismos que pueden causar la muerte o aquellos de riesgo

En concordancia con estos niveles crecientes de peligrosidad, se incrementan las

Estos constituyen el conjunto de medidas, prácticas de trabajo y barreras de

El Centro para la Prevención y el Control de Enfermedades (CDC - Centers for

PARÁMETROS EVALUACIÓN DEL ESTUDIANTE

El trabajo debe realizarse de acuerdo con los estándares técnicos y de seguridad

Es importante recordar que la finalidad es determinar los microorganismos

❖ Todas las manipulaciones deben realizarse en un radio de 10-15cm de la

Es una cámara de temperatura controlada para cultivo de microorganismos.

La mayor parte de los trabajos que se realizan en un laboratorio de Microbiología

Placas de Petri con medio sólido

Tubos con medio sólido

Para realizar las observaciones al microscopio.

PARÁMETROS EVALUACIÓN DEL ESTUDIANTE

MICROSCOPIO ÓPTICO DE CAMPO CLARO

MICROSCOPIO ÓPTICO DE CAMPO OSCURO

MICROSCOPIO ÓPTICO DE LUZ ULTRAVIOLETA

MICROSCOPIO ÓPTICO DE FLUORESCENCIA

MICROSCOPIO ÓPTICO DE CONTRASTE DE FASES

PARÁMETROS EVALUACIÓN DEL ESTUDIANTE

Las tinciones sirven para demostrar la estructura y morfología de las bacterias.

BÁSICOS (CATIONICOS): El ión colorido (cromóforo) es positivo (catión colorido y

1. Coloque una gota de rojo Congo y K. pneumoniae en un portaobjetos.

MICROORGANISMO FORMA COLOR AGRUPACION ESTRUCTURA

PARÁMETROS EVALUACIÓN DEL ESTUDIANTE

Muchas bacterias poseen en su forma vegetativa (forma metabólicamente activa),

Entre los mecanismos existentes para controlar el crecimiento microbiano se

DETERMINACIÓN DEL PUNTO TÉRMICO MORTAL

Determinación del punto térmico mortal (E. coli).

APÉNDICE: ESCALA DE MCFARLAND.

Materiales y reactivos Reactivos