Resumen

Los análisis por cromatografía en papel son utilizados para realizar análisis cualitativos, puesto que
no requiere de equipamientos complejos ni de procedimientos exhaustivos además de ser de bajo
costo, la convierte en la técnica de separación de componentes más accesible en laboratorios de
investigación. Con el propósito de evaluar la aplicación de esta técnica de análisis químico
instrumental para la separación de pigmentos fotosintéticos de la planta Beta vulgaris var. Cicla
(Acelga), se procedió a comparar diferentes solventes (Etanol puro, acetona pura y etanol-
acetona) en cámaras de elución para evaluar cómo era la separación y cuál de estos era el mejor.
Por cromatografía en papel se identificó la separación de los pigmentos, a través de las distancias
recorridas por el mismo pigmento y por el solvente utilizando el Rf (Retention factor). El método
permitió determinar adecuadamente la separación de los pigmentos de acelga en los distintos
solventes. Para la cámara con etanol puro; para la acetona; y para etanol-acetona. Los resultados
obtenidos son comparables con datos provenientes de referencias bibliográficas.

Palabras clave: Cromatografía en papel, pigmentos fotosintéticos, solventes, Beta vulgaris var.
Cicla.

Introducción

En 1906, el botánico Ruso M. Tswett realizó un experimento que condujo al descubrimiento de lo

que hoy conocemos como cromatografía. Colocó un extracto de pigmentos vegetales en la parte
superior de una columna de vidrio rellena de carbonato de calcio (CaCO 3). Al agregar éter, observó
que la mezcla original se separaba en diversas bandas coloridas que descendían a través de la
columna a diferentes velocidades.

Un rasgo característico de la cromatografía es la presencia de dos fases; dispuestas de tal manera

que mientras una permanece estacionaria dentro del sistema (fase estacionaria), la otra se
desplaza a lo largo de él (fase móvil). La clave de la separación en cromatografía es que la
velocidad con la que se mueve cada sustancia depende de su afinidad relativa por ambas fases
(equilibrio de distribución). En el experimento de Tswett, la separación de los pigmentos vegetales
se logró gracias a que cada uno de ellos tenía una afinidad diferente por las fases. En general, los
componentes más afines a la fase estacionaria avanzan lentamente (más retenidos) mientras que
los más afines a la fase móvil (menos retenidos) se mueven con mayor rapidez. Por consecuencia,
el medio cromatográfico (columna, placa o papel) funciona como un controlador de la velocidad
de cada sustancia que constituye la mezcla, logrando así su separación y mediante el uso de un
detector, su caracterización química.

Aunque los principios fundamentales son los mismos, se acostumbra clasificar los métodos
cromatográficos según el estado físico de la fase móvil:

Cromatografía líquida

Esta forma de cromatografía puede realizarse con diferentes arreglos experimentales: en columna,
en capa delgada o en papel. En el primer caso, la fase estacionaria se encuentra rellenando un
tubo; en el segundo, se dispersa sobre una lámina de vidrio o aluminio formando un lecho de
espesor uniforme; en la cromatografía en papel, la fase estacionaria es la solución acuosa
contenida en el interior de las celdas formadas por las fibras de la celulosa, y es por tanto una
forma de cromatografía líquido-líquido.

Cromatografía de gases

Este tipo de cromatografía siempre es en columna, ya que es la única manera de que la fase móvil
gaseosa se mantenga fluyendo, confinada dentro del sistema. La columna puede estar rellena con
la fase estacionaria, en forma semejante a la cromatografía líquida, o bien la fase estacionaria
puede depositarse sobre las paredes de un tubo muy delgado (0.25mm de diámetro) y largo (hasta
100m). Este tipo de columnas se conocen como columnas capilares y proporcionan la mayor
capacidad de separación.

Cromatografía en capa fina

La cromatografía en capa fina se basa en la preparación de una capa, uniforme, de un adsorbente

mantenido sobre una placa de vidrio u otro soporte. Los requisitos esenciales son, pues, un
adsorbente, placas de vidrio, un dispositivo que mantenga las placas durante la extensión, otro
para aplicar la capa de adsorbente, y una cámara en la que se desarrollen las placas cubiertas. Es
preciso también poder guardar con facilidad las placas preparadas y una estufa para activarlas.

Cromatografía de permeación en gel

La cromatografía de permeación en gel, también conocida como cromatografía de exclusión es

una variante de la CLAE que consiste en una columna cromatográfica empacada de tal manera que
las partículas de dicho empacamiento tienen diferentes tamaños de poros o de redes de poros con
el fin de que las moléculas de soluto sean retenidas o excluidas basándose en su forma y tamaño y
no en el peso molecular.

Cromatografía de exclusión de iones

Una variante de la cromatografía de permeación en gel o cromatografía de exclusión, es cuando se

realiza para la exclusión de iones. Mediante esta modificación, se tienen separaciones que
dependen de factores como tamaño de partícula de la resina, forma iónica e incluso distribución
de isómeros. Esto permite separar especies que de otra forma eluirían al mismo tiempo. Las
separaciones se llevan a cabo en resinas de intercambio con base en poliestireno de alta capacidad
como eluyentes, ácidos minerales diluidos.

Cromatografía de intercambio iónico

La cromatografía de intercambio iónico se lleva a cabo con empaques de columna que tiene
grupos funcionales cargados unidos a una matriz polimérica. Los grupos funcionales enlazados
permanentemente y asociados con contraiones de carga opuesta. El mecanismo de retención más
común es el intercambio simple de los iones de la muestra y de la fase móvil con el grupo cargado
de la fase estacionaria.

Cromatografía de fluidos supercríticos

La cromatografía de fluidos supercríticos (SFC) es una modalidad híbrida entre la cromatografía de

gases y de líquidos que combina algunas características de cada una de ellas. Esta técnica es una
de los tres tipos importantes de cromatografía en columna, ésta permite la separación y
determinación de compuestos que no son manipulados ni por la cromatografía de gases ni por la
de líquidos: compuestos no volátiles o térmicamente lábiles para los que la cromatografía de gases
es inaplicable y los compuestos que tienen grupos funcionales que no son detectables por las
técnicas espectroscópicas o electroquímicas empleadas en cromatografía de líquidos.

Cromatografía de afinidad

La cromatografía de afinidad separa las proteínas (analitos) en función de su especificidad de

fijación de ligandos. Los ligandos de afinidad son moléculas poliméricas que sirven de soporte
porque están unidas covalentemente sobre la columna cromatográfica o matriz inerte que debe
de tener una estructura de poro abierta y estabilidad en condiciones de cambio de pH,
detergentes y agentes disociantes, para así, retener y adsorber específicamente a las proteínas, la
fase estacionaria es sólida. Cuando las proteínas no específicas se han lavado a través de la
columna, se eluye la proteína ligada con solución que contiene ligando libre. Después se introduce
una nueva fase móvil que se desactiva, generalmente por el acoplamiento o alteración de los sitios
activos inhibidor-ligando, para que esto pueda ser posible, se necesita un cambio en el pH, la
fuerza iónica o la polaridad, debido a que estas condiciones modifican las características de los
sitios activos, la finalidad de este proceso es hacer fluir a la proteína para continuar con la
regeneración de la columna cromatográfica.

Cromatografía de líquidos de alta resolución

La cromatografía de líquidos de alta eficacia es la técnica analítica de separación más ampliamente

utilizada. Las razones son la sensibilidad, su fácil adaptación a las determinaciones cuantitativas
exactas, es ideal para la separación de especies no volátiles o termolábiles y por su gran
aplicabilidad a sustancias que son de interés en la industria. Algunos ejemplos son: aminoácidos,
proteínas, ácidos nucleicos, hidrocarburos, carbohidratos, fármacos, terpenoides, plaguicidas,
antibióticos, esteroides, especies organometálicas y gran variedad de sustancias inorgánicas. La
fase móvil es un líquido y la fase estacionaria es una columna que puede ser de acero inoxidable.

Cromatografía en papel

La cromatografía en papel es un proceso muy utilizado en los laboratorios para realizar análisis
cualitativos ya que pese a no ser una técnica potente no requiere de ningún tipo de equipamiento.
Pertenece al tipo de “Cromatografía de partición” se fundamenta en que las sustancias problema,
pueden tener diferentes coeficientes de reparto en dos disolventes de inmiscibilidad limitada, uno
permanece fijo en la superficie del papel “fase estacionaria” generalmente en agua, la fase móvil
constituida generalmente por una mezcla de disolventes parcialmente miscibles en ella. La fase
estacionaria está constituida simplemente por una tira de papel de filtro. La muestra se deposita
en un extremo colocando pequeñas gotas de la disolución y evaporando el disolvente. Luego el
disolvente empleado como fase móvil se hace ascender por capilaridad. La separación se realiza en
función de la afinidad de los solutos con las dos fases, las más solubles en agua se quedarán cerca
del punto donde se aplicó la muestra, y las menos solubles en agua y más solubles en el disolvente
llegarán más lejos. Las sustancias separadas se identifican mediante diversos procedimientos
físicos o químicos.

Hay varios tipos de cromatografía, la ascendente (papel hacia arriba), descendente (papel
invertido), radial y de separación de zonas y sectores.

Al entrar en contacto con los disolventes empieza su fase de movilidad lo que produce unas
manchas características sobre el papel, generalmente, estas no son coloreadas y se revelan con
una lámpara fluorescente, los contornos se marcan con lápiz. Como medida en cromatografía
sobre papel se emplea el Rf (Retention factor), el cual se define como el cociente de dividir el
recorrido de la sustancia por el disolvente, esto es, la distancia media desde el origen hasta el
centro de la mancha (X) dividida por la distancia que media desde el origen hasta el frente del
disolvente (S).

X
Rf =
S

En la cromatografía en papel se utiliza como fase estacionaria una hoja de papel de celulosa de
elevada pureza recubierta de una capa de agua asociada a las fibras de celulosa. La fase móvil, en
la que irá disuelta la muestra, se forma por disolventes cuya naturaleza se elige en función de los
componentes que se pretenden separar.

 Mayolo-Deloisa, K.; MartÍnez, L.M.; Rito-Palomares, M. (2012). Técnicas cromatográficas y

su aplicación a estudios de cambios conformacionales, estabilidad y replegamiento de
proteínas. Revista Mexicana de Ingeniería Química, 11(3). pp. 415-429.