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Informes de células vegetales (1997) 16: 820–824 © Springer Verlag 1997

W.­L. Teng · M.­C. teng

Patrones de regeneración in vitro de Bifurcación de platycerium

Recibido: 3 de marzo de 1997 / Revisión recibida: 11 de abril de 1997 / Aceptado: 3 de junio de 1997

Resumen Se desarrolló un sistema de cultivo en suspensión simple de Generación a través de un callo o un gametofito aposporoso.
Platy­cerium bifurcatum donde los esporofitos etapa (Bordonneau y Tourte 1987; Kshirsagar y Mehta
Podría regenerarse directamente a partir de células de las hojas o indirectamente. 1978; Kwa et al. 1995; Mehra y Sulklyan 1969; Ragha­van 1989). Muchos
a través de una etapa de gametofito aposporoso bajo el mismo factores, como la edad del explante, el rejuvenecimiento, el nivel de
condiciones de cultivo. Las células individuales y los agregados de hasta nutrición (sacarosa), las combinaciones y concentraciones de reguladores
100 células desarrollaron gametofitos aposporosos que luego de crecimiento y el cultivo líquido/sólido.
dio origen a los esporofitos. Estos gametofitos comenzaron la apogamia Se han empleado métodos para manipular las rutas de regeneración
cuando en su mayoría tenían menos de 0,7 mm de longitud, tomadas por las células esporofíticas (Bhambie y
teniendo sólo rizoides. En la mayoría de los casos, sólo un esporofito Gupta 1994; Camloha et al. 1994; Kwa et al. 1995; Materi
fue regenerado a partir de un gametofito. Agregados de y Cumming 1991; Von Aderkas 1986). Por lo general, las condiciones
Por otro lado, se regeneran entre 500 y 1000 o más células. culturales que favorecen la diferenciación de los esporofitos
esporofitos directamente. La interacción intercelular fue considerada la no favorecen la inducción de gametofitos aposporosos
causa fisiológica, y la separación de (Bhambie y Gupta 1994; Hirsch 1975; Materi y Cum­ming 1991). Por
Las células de las hojas hasta cierto punto impulsaron a las células a embarcarse en ejemplo, la proporción de esporofitos a gametofitos producidos a partir de
diferentes caminos de regeneración. Se sugiere que la posible existencia hojas de Microgramma vac­ciniifolia aumentó cuando la concentración de
de un tamaño umbral de agregados celulares separa los dos patrones de sacarosa aumentó del 0% al 4% (Hirsch 1975). En Adiantum capil­lus­
regeneración. veneris, 1­2% de sacarosa indujo esporofitos mientras que

Palabras clave Helecho cuerno de ciervo · Platycerium bifurcatum · 7% indujo gametofitos aposporosos (Bhambie y
Aposporia · Apogamia · Micropropagación Gupta 1994). Además, los factores que influyen en la fase.
Los cambios a menudo interactuaban entre sí. Al 2% de sacarosa,
Abreviatura Célula–G–S · Célula–gametofito–esporofito · Célula–S · Célula– Segmentos de rizoma de 10 mm de esporofitos regenerados de
esporofito Ampelopteris prolifera , mientras que segmentos de 3 a 4 mm solo de
gametofitos regenerados. Al 0,2%, tanto de 3 a 4 mm como de 10 mm
segmentos de rizoma regenerados gametofitos (Mehra y
Sulklian 1969).
Introducción La información disponible implica que el medio ambiente
las señales son el factor principal que dirige la morfogénesis de los
El proceso de regeneración de esporofitos a partir de esporofitos. esporofitos o gametofitos; el efecto del explante en la ruta de regeneración
tejidos implica regeneración directa o regeneración indirecta. está mediado por interacciones con factores ambientales. Ningún informe
ha identificado nunca ningún
factor distinto de las condiciones ambientales que pueden por sí solos,

W.­L. Teng ()
influyen críticamente en la regeneración de gametofitos o
Instituto de Biotecnología de Hong Kong, 2 esporofitos. Informamos aquí, utilizando una simple suspensión.
Biotechnology Avenue, 12 Miles, Tai Po Road, Shatin, NT, sistema de cultivo de Platycerium bifurcatum, que el tamaño del agregado
Hong Kong celular está estrechamente relacionado con los patrones de regeneración. El
Número de fax: +852­26036820
El sistema establecido también es una muy buena herramienta para comprender
Correo electrónico: wl­teng@hkib.org.hk
Interacciones entre los regenerantes incipientes y las células vecinas
MC. teng
durante la morfogénesis.
Departamento de Industria Vegetal,
Instituto Politécnico Nacional de Pingtung, 1 Hseuh
Fu Road, Nei Pu Hsiang, Pingtung, Taiwán
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(Figura 1d,e). Yemas apógamas, una yema por gametofito en

Se diseccionaron hojas fértiles con esporangios inmaduros de P. bifurcatum, se aproximadamente 0,5 a 0,7 mm de tamaño (Fig. 1f, g). Estas yemas se convirtieron
lavaron con detergente y se remojaron durante 1 min en etanol al 70%. en esporofitos (Fig. 1h).
luego se sonicó durante 20 minutos en NaOCl al 2%, seguido de un enjuague Células individuales regeneradas a través de una Cell­G­S modificada
minucioso con agua destilada estéril. Después de la esterilización, los esporangios fueronpatrón, exhibiendo dos rutas de formación de gametofitos. Alguno
Se rasparon las hojas fértiles y se colocaron en placas de Pe tri desechables de 90
Las células se comportaron como esporas. Se formó un protonema bipolar.
× 10 mm que contenían 20 ml de medio de cultivo compuesto por Murashige.
y Skoog (1962) sales basales suplementadas con (mg/l) 0,5 tiamina HCl, 0,5 de una sola célula de hoja (Fig. 2a) seguida de la formación
piridoxina­HCl, 0,5 ácido nicotínico, 2 glicina, 100 mioinositol, más 3% de sacarosa de un gametofito (Fig. 2b). La regeneración posterior
y 0,8% de agar Difco Bacto. El pH del medio se ajustó a 5,5 antes de esterilizarlo en El proceso fue el mismo que se muestra en la Fig. 1f – h. la mayoría soltera
autoclave a 121 °C y
124 kPa durante 20 min. las células, sin embargo, formaron grupos de gametofitos. Durante el desarrollo del

Algunas esporas germinaron y se desarrollaron hasta convertirse en gametofitos protonema, las células del extremo distal se ramificaron
en 5 meses, la mayoría tardó 8 meses. Los gametofitos, a su vez, se regeneraron. en varias direcciones (Fig. 2c), y luego creció hasta convertirse en
esporofitos. Se diseccionaron hojas (frondas jóvenes en desarrollo) de esporofitos estructuras en forma de brazos (Fig. 2d). Estos continuaron creciendo con
de 1 a 2 cm para regenerar más esporofitos en la misma
ramificación secundaria o terciaria mientras se desarrolla en gametofitos en forma
medio. Los explantes de hojas fueron examinados bajo un estereomicroscopio.
de costilla (Fig. 2e, f). Un grupo de gametofitos
(Nikon, SMZ­2T) para garantizar que no se recogieran esporas accidentalmente.
Para garantizar que todos los esporofitos regenerados estuvieran libres de esporas, como de 20 a 40 gametofitos se formó así con un máximo
La regeneración de esporofitos se repitió al menos cinco veces. tamaño alrededor de 3 mm de diámetro (Fig. 2 g). Los gametofitos individuales en el
Se prepararon suspensiones celulares a partir de hojas de 1 a 3 cm de largo. grupo regeneraron esporofitos.
esporofitos de dos a tres hojas. Las hojas fueron homogeneizadas durante
a través de la apogamia (Fig. 2 h).
60 s con agua destilada esterilizada utilizando una batidora (Osterizer, velocidad
modo: “picar”; Öster). Las suspensiones celulares se filtraron en secuencia. Aparte del patrón de regeneración, el tamaño del agregado celular
a través de pantallas de poliéster de 400 µm, 230 µm, 30 µm y 10 µm para afectó la tasa de regeneración de esporofitos. La Célula­G­S
clasificar las suspensiones en tres grupos: 10–30 µm, 30–230 µm y el patrón requirió más tiempo que el patrón Cell­S; La formación de grupos de
>400 µm. El examen microscópico mostró que las masas celulares de
gametofitos llevó aún más tiempo. Por ejemplo,
Entre 10 y 30 µm se encontraban células individuales, restos celulares de células rotas y,
ocasionalmente, cadenas celulares individuales de varias células. Masas celulares de 30 a 230 µm agregados celulares de ≤100 células tomaron sólo la mitad del tiempo para
contenía agregados celulares de hasta 100 células. Masas celulares >400 µm regeneración de gametofitos en comparación con la de células individuales
contenía agregados de varios tamaños, algunos de hasta 2 mm de largo (3,6 vs. 7,1 semanas), 3,6–6,5 semanas menos para la regeneración de yemas y
(500–1000 células).
7,1–9,3 semanas menos para el desarrollo de esporofitos.
Después de la filtración, cada grupo de masas celulares se resuspendió en
Las diferencias fueron los tiempos necesarios para la formación de la
agua destilada estéril. Para la inoculación, 2 ml de suspensión (40–50 mg
peso seco/ml) se pipeteó sobre el medio de cultivo suplementado gametofitos aposporosos y grupos de gametofitos, respectivamente (Tabla 1).
con 0,54 µM adicionales, las placas a ­ácido naftalenacético. el petri
se agitaron suavemente para extender una fina capa de suspensión sobre El carácter más distintivo de la cultura en suspensión.
la médium. Todas las placas de Petri se incubaron a 25 ± 2 ° C durante 16 h.
sistema de P. bifurcatum es que tanto Cell­G­S como
fotoperiodo proporcionado por una luz fluorescente blanca fría en
20 µmol · m–2 · s–1. Los cultivos fueron examinados periódicamente bajo El patrón de células S tiene lugar en las mismas condiciones de cultivo (Figs. 1,2).
el microscopio estereoscópico para determinar los patrones de crecimiento de cada célula En estudios previos, aunque esporofitos
grupo. Los experimentos de control incluyeron cultivos de animales no homogeneizados, Las células expresaron los programas de desarrollo esperados de un
explantes cortados con bisturí, ≤1–2 mm, en el mismo medio.
espora (patrón Célula­G­S) o un embrión (patrón Célula­S),

Tabla 1 Los efectos del tamaño del agregado celular y el patrón de regeneración.
Resultados y discusión
sobre la tasa de regeneración de cultivos en suspensión de células foliares de
Platyce rium bifurcatum. Cell­G­S indica regeneración de esporofitos
Las suspensiones de células de hojas de P. bifurcatum exhibieron dos a través de una etapa de desarrollo intermedia de tofitos de caza aposporosos.
Gametofitos aposporosos simples G1, grupo de gametofitos aposporosos G2,
patrones de regeneración que estaban estrechamente relacionados con el tamaño
regeneración directa Cell­S de esporofitos de
de agregados celulares. Grandes agregados de células de más de 500 a 1000 células esporofíticas. Los tiempos de regeneración son los necesarios para que
las células regeneraron esporofitos directamente [célula­esporofito aproximadamente el 50% del inóculo muestre regeneración. Había
(Patrón de celda­S)] (Fig. 1a, b). La formación de yemas se caracterizó por el aproximadamente 1000 regenerantes en una placa de Petri. Se utilizaron seis placas de Petri.
para evaluación y el experimento se repitió dos veces [no aplicable (sólo se
crecimiento de grupos celulares organizados, con una yema
observaron unos pocos gametofitos ocasionalmente y no
ápice rodeado de escamas, desde la superficie del explante Se tomaron datos de regeneración)]. Medios seguidos de letras diferentes.
(Figura 1a). Cada uno de los grupos celulares organizados desarrolló posteriormente son significativamente diferentes en P≤0.01
en una yema (Fig. 1b). Las yemas en los mismos agregados celulares.
Células foliares Regeneración Tiempo de regeneración (semanas)
Se convirtió en un grupo de esporofitos.
patrón
Agregados de ≤100 células regeneradas a través de gametofitos aposporosos Fito gameto­brote mucha
como etapa intermedia de desarrollo fita
antes de la regeneración del esporofito [patrón célula­gametofito­esporofito (Célula­
Celdas individuales Celda–G1–S 7.1a Celda– 10.0b 15.7b
G­S)]. El primer signo de regeneración.
G2–S 7.1a 12.9a 17.9a
estuvo marcado por la hipertrofia del regenerante incipiente
células, distinguiéndolas de otras (Fig. 1c). El primero se convirtió en un protonema Agregados celulares
≤100 células Celda–G–S 3.6b 6.4c 8.6c
bipolar, formando un cordón 500–1000 celdas Celda–S ya 3.6d 5.0d
placa en el extremo distal y rizoides en el extremo proximal
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Fig. 1a – h Regeneración de esporofitos a partir de agregados de células foliares. tuvieron que cultivarse en diferentes condiciones (Raghavan 1989), incluidas
de Platycerium bifurcatum con agregados celulares superiores a 500­1000 diferentes concentraciones de sacarosa (Bell 1992; Hirsch 1975; Materi y
células (a, b) o agregados celulares de menos de 100 células (c­h) [barras de 200 µm
Cumming 1991;
(a–g) 500 µm (h)]. a Brotación en un patrón único a partir de una puerta agregada
celular. b Una yema completamente desarrollada cubierta por escamas. c Células Raghavan 1989) y reguladores del crecimiento (Bhambie y
regenerantes incipientes que se distinguen de las células circundantes por su color verde Gupta 1994; Mehra y Sulklyan 1969), cultivo líquido (Von
e hipertrofia. Se han formado algunos rizoides. d Varios protonemas bipolares se Aderkas 1986) y cultivo de protoplastos (Binding y Mord­horst 1991). Ninguno
desarrollaron a partir de células regenerantes incipientes (flecha). Un protonema
de estos estudios mostró el desarrollo
lleva una placa de aproximadamente 20 células en su extremo distal. e Un gametofito
aposporoso más desarrollado con una placa cordiforme. de ambos patrones bajo las mismas condiciones de cultivo.
f Desarrollo temprano de esporofitos en un gametofito aposporoso (flecha). g Una Dado que las células de las hojas pueden expresar diferente regeneración
yema bien formada sobre un gametofito aposporoso (flecha).
patrones bajo las mismas condiciones culturales, es poco probable
En esta etapa se formaron más rizoides. h Esporofitos jóvenes desarrollados a partir
de yemas en gametofitos que las células regenerantes incipientes están predeterminadas como game­
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Fig. 2a – h Regeneración de esporofitos a partir de células individuales de P. bi­ más ramas y crecimiento de las estructuras en forma de brazos. f Más
furcatum [barras 200 µm (a – f), 1 mm (g)]. a Un protonema bipolar con un rizoide. desarrollo avanzado de un complejo de gametofitos cuyo crecimiento en forma de
b Un gametofito aposporoso de un esporofito brazo formó gametofitos en forma de cinta debido a la secundaria
celúla. c Extremo distal ramificado de un protonema con células apuntando en o ramificación terciaria. g Gametofito aposporoso bien formado
varias direcciones. d Crecimientos en forma de brazos desde el extremo distal ramificadocomplejo con una yema apógama. h Un gametofito en forma de cinta disecado del
de un protonema. e Una etapa temprana de un complejo gametofito con complejo gametofito (g) que porta una yema apógama
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Células formadoras de tofitos o esporofitos. El patrón Cell­G­S en células pequeño (datos no mostrados). Un mensaje especial que regula la
individuales (Fig. 2), la falta y la rara ocurrencia de gametofitos morfogénesis probablemente sea liberado por el pequeño aposporoso
aposporosos en agregados de gametofitos para cambiar el evento morfogenético desde más lejos
500 a 1000 células (Fig. 1a, b; Camloha et al. 1994; Richards desarrollo de gametofitos hasta la regeneración de esporofitos. El
et al. 1983) sugieren además que el grado de separación celular puede La gemación retrasada durante la formación del grupo de metofitos ga­
hacer que las células se embarquen en el patrón Célula­G­S. apósporos (Fig. 2c­g; Tabla 1) indica que algunos
o patrón Celda­S. Se han informado resultados similares en A. prolifera Se liberaron otras señales para posponer la regeneración de los
utilizando explantes mucho más grandes (Mehra y Sulk­lyan 1969). Para esporofitos para que pudiera continuar la proliferación de gametofitos.
segmentos de rizoma de 10 mm, el 2% de sacarosa promovió el En conclusión, el presente estudio muestra que los eventos
crecimiento esporófilo mientras que el 0,5% de sacarosa promovió el morfogenéticos pueden ser manipulados no sólo por factores ambientales
crecimiento gametofítico; para segmentos de rizoma de 3 a 4 mm, sólo sino también por el estado celular, es decir, el tamaño de los agregados. El
se regeneraron gametofitos incluso en un 2% El sistema de cultivo en suspensión establecido también es un método prometedor.
sacarosa (Mehra y Sulklyan 1969). herramienta para analizar las bases moleculares de diferentes patrones
Ciertos eventos deben ser responsables de los diferentes programas de regeneración, así como la apogamia temprana de los gametofitos
de regeneración. Se ha sugerido que el metabolito aposporosos.
la disponibilidad está involucrada en tales cambios morfológicos (Mehra y
Sulklyan; 1969; Sheffield y Bell 1981; Shef­field et al. 1982). Sheffield y
compañeros de trabajo (Sheffield y
Referencias
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planta a las extremidades de las hojas debido a la oclusión traquearia y la
capulus­veneris L. J Ind Bot Soc 73:25–28
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que el suministro de metabolitos desde el tejido parental sea responsable protoplastos arquegonizados en condiciones diseñadas
de los diferentes patrones de regeneración, ya que tanto los esporofitos para plantas superiores. Bot Actas 104:330–335
Bordonneau M, Tourte Y (1987) Potencialidades genéticas de los tejidos
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coordinación y la interacción entre células pueden
apogámicas en gametofitos de Pteridium . planta
juegan un papel importante en los patrones de regeneración (Figs. 1, 2). 111:85–90
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Las células mantienen y fortalecen la naturaleza esporofítica, mientras que hojas de helecho extirpado en gametofitos o esporofitos.
Fisiol vegetal 56:390–393
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gametofíticas. Por supuesto, el estrés impuesto a y diferenciación en callos de rizoma de Pteris vitata. Fitomorfología 28:50–
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también debe ser considerado. Se puede activar una señal de estrés. Kwa SH, Wee YC, Lim TM, Kumar PP (1995) Apogamia inducida por IAA en
Platycerium coronarium (Koenig) Desv. gametofitos
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cultivado in vitro. Representante de células vegetales 14:598–602
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regeneración de esporofitos. Además, el cambio de una avestruz (Matteuccia struthiopteris) . ¿Puede J Bot 69?
1241­1245
Patrón Cell­G­S a un patrón Cell­S correspondiente al
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El cambio de células individuales a agregados celulares revela la posible
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Ampelopteris prolifera (Retz.) Copel. Bot J. Linn Soc. 62:431–443
entre los dos patrones tiene lugar. Se propone que en Murashige T, Skoog F (1962) Un medio revisado para un crecimiento rápido
En los agregados de tamaño umbral, algunas células reciben mensajes y bioensayos con cultivos de tejidos de tabaco. Planta Fisiol
15:473–497
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bien la mayoría de los gametofitos aposporosos inducen Richards JH, Beck JZ, Hirsch AM (1983) Investigaciones estructurales
de reproducción asexual en Nephrolepis exaltara y Platyceri bifurcatum.
apogamia cuando eran ≤0,7 mm, sólo unos pocos pudieron
Soy J Bot 70:993–1001
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una mayor respuesta apógama se asoció con mayores poblaciones de el desarrollo de aposporas en Pteridium aquilinum (L.)
gametofitos (Elmore y Whittier 1973), donde Kuhn. Nuevo fitol 88:533–538
no se formaron los órganos sexuales (Kwa et al. 1995), se llevó a cabo Sheffield E, Bell PR, Laird S (1982) Oclusión traquearia en frondas
de Pteridium aquilinum (L.) Kuhn mostrando aposporia. Nuevo Phy­tol
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por placa de Petri a formar. La mayoría de los gametofitos todavía se Von Aderkas P (1986) Mejora de la aposporia en cultivo líquido de
regeneraban mediante apogamia cuando eran muy Matteuccia struthiopteris Ann Bot 57:505–510