PDF de una ponencia dada a Estudiantes de Medicina acerca de técnicas generales y procedimientos para la hibridación de ADN y ARN. Incluye material audiográfico (links adjuntos) como parte de complementaria a la presentación.
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Técnicas de Hibridación del ADN.
Biología Molecular.
Juárez Vega José Luis
Introducción. Introducción.
Para estudiar un solo gen, se debe
aislar del resto del genoma.
Cada gen representa una pequeña
sección dentro de un cromosoma.
Para el aislamiento de un gen o
fragmentos más pequeños, el ADN debe fragmentarse. Introducción.
Para avanzar hacia un estudio más detallado
del ADN fue necesaria una metodología para obtener grandes cantidades de fragmentos especí cos de ADN.
•ADN genómico.
•ADN complementario (ADNc)
•ADN de oligonucleótidos sintéticos.
fi Introducción. Antes de manipular un determinado fragmento de ADN o ARNm pueda manipularse, primero debe localizarse.
Para localizar fragmentos especí cos se
tienen que hibridar los ácidos nucleicos.
Entre las técnicas de hibridación más
comunes se encuentran
Southern blot.
Northern blot.
Slot blot.
Dot blot.
Hibridación in situ. fi Fundamento. Técnica De Sourthern Blot. Técnica De Sourthern Blot. Empleada en laboratorios de biología molecular.
Se usa para detectar secuencias de
A D N e s p e c í c a s a p a rt i r d e u n preparado de tejido.
Se basa en la aplicación de dos procesos
fundamentales:
• Desnaturalización (separación) de cadenas complementarias del ADN.
• Hibridación o unión de dos cadenas
complementarias. fi Técnica De Sourthern Blot. Técnica De Sourthern Blot. Técnica De Sourthern Blot.
El nombre de esta técnica se debe al
biólogo británico Edwin Southern, quién publicó el trabajo de esta técnica en el Journal of Molecular Biology, número 98, en 1975.
Desde entonces se han implementado
algunas mejoras, aunque el procedimiento básico es el mismo. Técnica De Sourthern Blot.
Permite detección de genes especí cos en el ADN celular:
Enfermedades de transmisión genética.
Prueba de paternidad.
Identi car mutaciones
Detectar la presencia del ADN de un individuo en un lugar.
fi fi Técnica De Sourthern Blot. - Pasos
1. Extraer el ADN.
. 2. Digestión del ADN con una endonucleasa de restricción.
3. E l e c t r o f o r e s i s e n g e l d e agarosa.
4. Preparación de un ensayo de Southern ("Southern blot”). Técnica De Sourthern Blot. - Pasos
.5. H i b r i d a c i ó n c o n s o n d a radioactiva.
6. D e t e c c i ó n d e l o s R F L P s mediante autorradiografía.
7. Reensayar el resultado del
Southern con sondas adicionales. https://youtube.com/watch?v=CSrUm-EgTK4 Técnica De Northern Blot. Técnica de Northern Blot. Empleada en laboratorios de biología molecular.
Se utiliza para detectar una secuencia de ARN especí ca en un muestra de sangre o de tejido.
fi Técnica de Northern Blot. El término Northern blot es un juego de palabras de cómo las inicialmente se analizaban el ADN.
El término "blot" o mancha, se re ere al protocolo en si donde se tiene un gel y luego se coloca como si fuera un sándwich, con la membrana que desea transferir en la parte superior.
Finalmente se agrega una pila de material absorbente y es como si estás trans riendo el ADN a la parte superior de la membrana para su posterior análisis. fi fi Técnica de Northern Blot. Es una herramienta muy útil para el estudio de los productos de la transcripción génica (ARNm) y de su regulación.
Permite estudiar potenciales variaciones en abundancia de especies del ARN en diferentes condiciones experimentales o comparar condiciones clínicas normales o patológicas. Técnica de Northern Blot - Pasos
1. Las moléculas de ARN en una
muestra se separan por tamaño mediante electroforésis en gel.
2. Lo s f ra g m e n t o s d e A R N s o n transferidas del gel a la super cie de una membrana.
3. La membrana se expone a una
sonda de ADN marcada con una etiqueta radiactiva o química.
4. Si la sonda se une a la membrana,
entonces la secuencia complementaria de ARN está presente en la muestra. fi Técnica de Northern Blot. Diferencias a otras técnicas. Técnica de Northern Blot - Diferencias a otras técnicas.
Es la contraparte del Southern blot
y como ácido nucleico se utiliza ARN en lugar de ADN.
A diferencia del Southern blot, con
esta técnica no se utilizan enzimas de restricción, ya que las moléculas de ARN son más pequeñas y para su análisis no requieren su fraccionamiento. Técnica de Northern Blot - Diferencias a otras técnicas. Prácticamente comparten todos los demás pasos:
Electroforesis.
Desnaturalización (aunque el ARN es de cadena sencilla, puede formar estructuras secundarias).
Transferencia.
Hibridación con una sonda.
https://youtube.com/watch?v=11NHYntRV4Q Hibridación in Situ Hibridación in Situ Técnica de laboratorio que consiste en marcar una hebra sencilla de ARN o ADN denominada sonda y permitir que se empareje con su secuencia complementaria en el ARN o el ADN presente en una muestra de tejido o de cromosomas.
La sensibilidad depende de:
• Preparación de la muestra • Construcción de la sonda • Etiquetado de la sonda • Sensibilidad del método. Hibridación in Situ
Permite usar al máximo la muestra de un tejido, logrando realizar
Ventajas cientos de hibridaciones diferentes en el mismo tejido.
Está limitada por su incapacidad para detectar secuencias que
Desventajas tienen bajo número de copias de ADN y ARN. Hibridación in Situ. PCR con hibridación in situ. Hibridación in Situ - PCR Se usa para la ampli cación de secuencias especí cas de ADN o ARN en células o secciones de tejido, de forma que el número de copias se incrementen en PCR in situ a niveles detectables por métodos estándar de hibridación in situ.
Posee una baja e ciencia de ampli cación y una mala reproducibilidad.
fi fi fi fi Hibridación in Situ. FISH. Hibridación in Situ - FISH La hibridación in situ con uorescencia detecta secuencias de ácidos nucleicos en células o tejidos preservados mediante el empleo de una sonda marcada con un uorocromo.
Sonda dirigida hacia un lugar
especí co del cromosoma y que emite uorescencia que puede ser observada con un microscopio.
Se caracteriza por permitir la
v i s u a l i z a c i ó n d i re c t a d e l a s alteraciones genéticas en la célula. fl fl fi fl Hibridación in Situ. CISH. Hibridación in Situ - CISH Hibridación in situ con cromógenos.
En esta técnica, los anticuerpos
se conjugan con una enzima que cataliza reacciones de sustratos cromogénicos.
Los cromógenos resultantes
precipitan en el lugar de destino de la sonda.
Se pueden detectar con un
microscopio de campo brillante estándar. Hibridación in Situ. GISH. Hibridación in Situ - GISH Hibridación in situ genómica.
Se utiliza con el n de distinguir
los cromosomas de diferentes progenitores o de diferentes genomas en híbridos interespecí cos o alopoliploides.
La característica principal de esta
técnica es que mientras FISH utiliza secuencias especí cas de ADN como sondas.
GISH utiliza ADN genómico de
una especie como sonda. fi fi fi Hibridación in Situ
Método de visualización / Técnica Ventaja Principal Aplicación principal. Instrumentos
Capacidad para visualizar la señal de CISH y D i a g n ó s t i c o d e a n a t o m í a
CISH Microscopía de campo claro. la morfología del tejido simultáneamente. patológica molecular.
Presencia de genes, ubicación y
Para multiplexing: visualice varios objetivos número de copias, análisis de FISH de ADN Microscopía de uorescencia. en la misma muestra. mutación.
Microscopía de uorescencia, Para multiplexing: visualice varios objetivos Expresión génica, ubicación FISH de ADN HCS y citometría de ujo en la misma muestra. espacial y temporal del ARN. fl fl fl Hibridación in Situ. Pasos. Hibridación in Situ. - Pasos
1. Preparación de la sonda.
2. Fijación
3. Hibridación de la sonda
5. Detección de la señal. https://youtube.com/watch?v=h5fFMxHIaOc Dot Blot https://youtube.com/watch?v=EzEeWMOZr3c Técnica Dot Blot. Técnica Dot Blot. Gracias por su atención. Biología Molecular: Técnicas de Hibridación del ADN.
Referencias Bibliográ cas.
• Bueno Topete, M. & González Cuevas, J. (2013). Técnicas de hibridación. En Salazar Montez, A. Sandoval Rodrígez, A. & Armendáriz Borunda, J. Biología Molecular: Fundamentos y aplicaciones en las ciencias de la salud.1ra. (pp.139-144). México: McGrawHill Education.
• Contreras, R. (2013, 30 diciembre). Southern blot | La guía de Biología. La guía. Recuperado 10 de noviembre de 2023, de https://biologia.laguia2000.com/tecnicas-en-biologia/southern-blot. • •MT vargas de los monteros, MC fernández-novoa garcía. Consejo genético. Unidad de Genética Dpto. Anatomía patológica H.U.V. Macarena Avda. Dr. Fedriani, s/n 14009 Sevilla. fi
