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1292–1305 Investigación de ácidos nucleicos, 2002, vol. 30, nº 6 © 2002 Prensa de la Universidad de Oxford
ENCUESTA Y RESUMEN
PCR en tiempo real en virología
Ian M Mackay1,2,3,*, Katherine E. Arden4 y Andreas Nitsche5
1Unidad de Investigación de Virología Clínica, Centro de Investigación de Virus Sir Albert Sakzewski, Royal Children's Hospital,
Brisbane, Australia,2Departamento de Pediatría y3Centro de Virología Clínica Médica, Universidad de Queensland, Queensland,
Australia,4Laboratorio de Transporte de Membranas, División de Cáncer y Biología Celular, Instituto de Investigación Médica de
Queensland, Queensland, Australia y5TIB MOLBIOL, Tempelhofer Weg 11–12, D-10829 Berlín, Alemania
Recibido el 31 de octubre de 2001; Revisado el 2 de enero de 2002; Aceptado el 14 de enero de 2002
ABSTRACTO cada uno hibridando con una cadena de un objetivo de ADN de doble
cadena (dsDNA), y el par abarca una región que se reproducirá
El uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en el
exponencialmente. El cebador hibridado actúa como sustrato para una
diagnóstico molecular se ha incrementado hasta el punto
ADN polimerasa (más comúnmente derivada de la bacteria termófila
en que ahora se acepta como el estándar de oro para Termo acuáticoy llamó Taq), que crea una hebra complementaria
detectar ácidos nucleicos de varios orígenes y se ha mediante la adición secuencial de desoxinucleótidos. El proceso se
convertido en una herramienta esencial en el laboratorio puede resumir en tres pasos: (i) separación de dsDNA a temperaturas
de investigación. La PCR en tiempo real ha generado una >90°C, (ii) recocido de imprimación a 50–75°C, y (iii) extensión óptima
mayor aceptación de la PCR debido a su mayor rapidez, en 72–78°C (Fig. 1A). La tasa de cambio de temperatura o tasa de
sensibilidad, reproducibilidad y menor riesgo de rampa, la duración de la incubación a cada temperatura y el número
contaminación por arrastre. Actualmente, se utilizan cinco de veces que se repite cada conjunto de temperaturas (o ciclo) se
productos químicos principales para la detección de controlan mediante un termociclador programable. Las tecnologías
actuales han acortado significativamente los tiempos de rampa
productos de PCR durante la PCR en tiempo real. Estos son
utilizando bloques de calentamiento controlados electrónicamente o
los fluoróforos de unión al ADN, los 5′ endonucleasa,
flujos de aire calentado forzado por ventilador para moderar la
oligosondas adyacentes lineales y en horquilla y los
temperatura de reacción. En consecuencia, la PCR está desplazando
amplicones autofluorescentes, que se describen en detalle.
algunos de los cultivos celulares de referencia, la antigenemia y los
También analizamos los factores que han restringido el ensayos serológicos (3). Las combinaciones existentes de PCR y
desarrollo de la PCR en tiempo real multiplex, así como el ensayos de detección (llamados aquí "PCR convencional") se han
papel de la PCR en tiempo real en la cuantificación de utilizado para obtener datos cuantitativos con resultados
ácidos nucleicos. Tanto el hardware de amplificación como prometedores. Sin embargo, estos enfoques han sufrido los laboriosos
las químicas de detección fluorogénica han evolucionado pasos de manejo posteriores a la PCR necesarios para evaluar el
rápidamente a medida que se ha desarrollado la amplicón (4).
comprensión de la PCR en tiempo real y esta revisión tiene La detección tradicional de ADN amplificado se basa en la
como objetivo actualizar al científico sobre el estado actual electroforesis de los ácidos nucleicos en presencia de bromuro de
del arte. Describimos los antecedentes, las ventajas y las etidio y el análisis visual o densitométrico de las bandas resultantes
limitaciones de la PCR en tiempo real y revisamos la después de la irradiación con luz ultravioleta (5). La detección de
Southern blot de amplicón mediante la hibridación con una sonda de
literatura sobre su aplicación a la detección de virus en el
oligonucleótido marcada también lleva mucho tiempo y requiere
laboratorio de rutina e investigación para centrarnos en
múltiples pasos de manipulación del producto de PCR, lo que aumenta
una de las muchas áreas en las que la aplicación de la PCR
el riesgo de que el amplicón se propague por todo el laboratorio (6).
en tiempo real tiene proporcionó beneficios metodológicos Como alternativa, se puede usar PCR-ELISA para capturar el amplicón
significativos y mejoró los resultados de los pacientes. Sin en una fase sólida utilizando cebadores marcados con biotina o
embargo, digoxigenina, sondas de oligonucleótidos (oligosondas) o directamente
después de la incorporación de la digoxigenina en el amplicón (7–12).
Una vez capturado, el amplicón se puede detectar usando una
molécula indicadora de avidina o anti-digoxigenina marcada con
FONDO enzima similar a un formato ELISA estándar.
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (1,2) se ha utilizado como el La posibilidad de que, a diferencia de los ensayos convencionales, la
nuevo estándar de oro para detectar una amplia variedad de plantillas en detección de amplicón pudiera visualizarse a medida que avanzaba la
una variedad de especialidades científicas, incluida la virología. El método amplificación fue bienvenida (13). Este enfoque ha proporcionado una
utiliza un par de oligonucleótidos sintéticos o cebadores, gran cantidad de información sobre la cinética de la reacción.
* A quién debe dirigirse la correspondencia a: CVRU, SASVRC, Royal Children's Hospital, Herston Road, Herston, Queensland 4029, Australia. Teléfono: +61
3636 8716; Fax: +61 3636 1401; Correo electrónico: i.mackay@mailbox.uq.edu.au
Investigación de ácidos nucleicos, 2002, vol. 30, nº 61293
beneficios sobre oligosondas radiogénicas que incluyen evitar

emisiones radiactivas, facilidad de eliminación y una vida útil
prolongada (18).
El aumento de la velocidad de la PCR en tiempo real se debe en gran parte a la
reducción de los tiempos de ciclo, la eliminación de los procedimientos de
detección posteriores a la PCR y el uso de etiquetas fluorogénicas y métodos
sensibles para detectar sus emisiones (19,20). La reducción en el tamaño del
amplicón generalmente recomendada por los creadores de ensayos comerciales
en tiempo real también puede desempeñar un papel en esta velocidad, sin
embargo, hemos demostrado que la disminución del tamaño del producto no
necesariamente mejora la eficiencia de la PCR (21).
Las desventajas de usar la PCR en tiempo real en comparación con la
PCR convencional incluyen la incapacidad de monitorear el tamaño del
amplicón sin abrir el sistema, la incompatibilidad de algunas
plataformas con algunas químicas fluorogénicas y las capacidades
multiplex relativamente restringidas de las aplicaciones actuales.
Además, el costo inicial de la PCR en tiempo real puede ser prohibitivo
cuando se usa en laboratorios de bajo rendimiento. Estas deficiencias
se deben principalmente a las limitaciones en el hardware del sistema
o los tintes fluorogénicos o 'fluoróforos' disponibles, los cuales se
discutirán con más detalle.
Debido a que la mayoría de las químicas de PCR en tiempo real
populares dependen de la hibridación de una oligosonda con su
secuencia complementaria en una de las hebras del amplicón, el uso
de más cebador que crea esta hebra es beneficioso para la generación
de una fluorescencia aumentada. señal (22). Se ha demostrado que la
PCR asimétrica, como se la conoce, produce una fluorescencia
mejorada a partir de una PCR con oligosonda en horquilla (23) y hemos
encontrado que es directamente aplicable a otros ensayos de
hibridación con oligosonda.
Las oligosondas fluorogénicas más utilizadas se basan en la
transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET; Fig.
Figura 1.Amplificación cinética. (A) Una gráfica idealizada de la temperatura frente al tiempo 2) entre etiquetas fluorogénicas o entre un fluoróforo y un
durante un solo ciclo de PCR que consta de los pasos de desnaturalización (D), hibridación del apagador no fluorescente (NFQ) oscuro o de "agujero negro", que
cebador y la sonda (A) y extensión del cebador (E). En los rangos de temperatura óptimos dispersa la energía como calor en lugar de fluorescencia. FRET es
indicados, el dsDNA se desnaturaliza (TD), recocido de oligosondas (TSONDA M) y finalmente los
un proceso espectroscópico por el cual la energía pasa entre
cebadores se recocen como precursor de su extensión (TM-PRIMER). La temperatura real, que se
muestra como una línea discontinua, puede exceder la temperatura deseada en varios grados,
moléculas separadas por 10–100 Å que tienen espectros de
dependiendo de la calidad del termociclador empleado. (B) La curva de amplificación ideal de emisión y absorción superpuestos (24,25). Förster desarrolló
una PCR en tiempo real (negrita), cuando se representa como intensidad de fluorescencia frente principalmente la teoría detrás de este proceso: el mecanismo es
al número de ciclo, es una curva de crecimiento sigmoidal típica. La amplificación temprana no
una interacción de dipolo inducido no radiativo (26). La eficiencia
se puede ver porque la señal de detección no se puede distinguir del fondo. Sin embargo,
de la transferencia de energía es proporcional a la inversa de la
cuando hay suficiente amplicón, el progreso exponencial del ensayo se puede controlar a
medida que la tasa de amplificación entra en una fase logarítmica lineal (LP). En condiciones sexta potencia de la distancia (R) entre el donante y el aceptor (1/R
ideales, la cantidad de amplicón aumenta a un ritmo de aproximadamente un logaritmo10 cada 6) fluoróforos (27,28).
tres ciclos. A medida que los cebadores y la enzima se vuelven limitantes y se acumulan los La manipulación posterior a la amplificación del amplicón no es
productos que inhiben la PCR, la reacción se ralentiza y entra en una fase de transición (TP) y
necesaria para la PCR en tiempo real, por lo que estos ensayos se
finalmente alcanza la fase de meseta (PP) donde hay poco o ningún aumento adicional en el
rendimiento del producto. El punto en el que la fluorescencia pasa de niveles insignificantes a
describen como sistemas "cerrados" u homogéneos. Las ventajas de
niveles claramente detectables se denomina ciclo umbral (CT; indicado por una flecha), y este los sistemas homogéneos incluyen un tiempo de respuesta reducido,
valor se utiliza en el cálculo de la cantidad de plantilla durante la PCR cuantitativa en tiempo real. la minimización del potencial de contaminación por arrastre y la
También se muestran curvas que representan una titulación óptima de la plantilla (gris), que
capacidad de examinar minuciosamente el rendimiento del ensayo
consta de concentraciones de plantilla iniciales más altas y más bajas, que producen una
(29). Además, la PCR en tiempo real ha demostrado ser rentable
titulación más baja o más alta.CTvalores, respectivamente. Los datos para la construcción de una
curva estándar se toman del LP, que posteriormente permite determinar la concentración de cuando se implementa en un laboratorio de alto rendimiento (30), en
muestras desconocidas. particular cuando reemplaza los enfoques convencionales basados en
cultivos para la detección de virus.
En el resto de este artículo, se revisará la teoría detrás de la
y es la base de la PCR cinética o 'en tiempo real' (Fig. 1B) (6,14–17). PCR en tiempo real y se utilizará como ilustración su uso cada
La PCR en tiempo real ya ha demostrado ser valiosa en vez mayor en los campos de la virología humana.
laboratorios de todo el mundo, basándose en la enorme cantidad
de datos generados por los ensayos de PCR convencionales.
DETECCIÓN DE AMPLÍCONOS
El seguimiento de la acumulación de amplicón en tiempo real ha
sido posible gracias al marcaje de cebadores, sondas o amplicón En la siguiente sección nos centraremos en los procesos de detección
con moléculas fluorogénicas. Esta química tiene una clara que discriminan la PCR en tiempo real de la convencional.
1294 Investigación de ácidos nucleicos, 2002, vol. 30, nº 6
requiere menos conocimientos especializados que el diseño de

oligosondas fluorogénicas, es menos costoso y no sufre cuando
varía la secuencia de la plantilla, lo que puede anular la hibridación
de una oligosonda (36). La formación de cebador-dímero (37) es
común y, junto con la formación de productos específicos, está
fuertemente asociada con la entrada de la PCR en la fase de
meseta (Fig. 1B) (38,39). La asociación de un fluoróforo de unión al
ADN con un dímero de cebador u otros productos de amplificación
no específicos puede confundir la interpretación de los resultados.
Agregar una incubación breve a temperatura más alta después del
paso de extensión en el que se adquieren los datos de
fluorescencia minimiza la contribución de estos productos a la
señal de fluorescencia (40). El problema del dímero de
imprimación también se puede abordar utilizando un software
capaz de analizar la curva de fusión fluorescente.TD; Figura 1A). El
dímero de cebador más corto se puede discriminar por su
reducidoTDen comparación con el amplicón de longitud completa.
El análisis de las curvas de fusión del amplicón en presencia de
SYBR green 1 ha demostrado que la sensibilidad práctica de los
fluoróforos que se unen al ADN está limitada por la amplificación
no específica a bajas concentraciones iniciales del molde.
Los fluoróforos que se unen al ADN también aumentan laTDy
ampliar la transición de fusión, lo que requiere un cambio de secuencia
sustancial para producir un cambio en laTD. Las oligosondas son
capaces de discriminar mutaciones puntuales utilizando la
temperatura a la que se separan el 50 % de los dúplex oligosonda-
Figura 2.Mecanismos fluorogénicos. cuando un 5′ el indicador (R) y el extintor (Q,
objetivo (41). Esta temperatura se llama temperatura de fusión (TMETRO)
abierto) de la sonda de nucleasa están muy cerca como en (A), el extintor 'secuestra' las
emisiones que han resultado de la excitación del reportero por la fuente de luz del y depende de la concentración del dsDNA, su longitud, la secuencia de
instrumento. El extintor luego emite esta energía (flechas sólidas). Cuando los nucleótidos y la composición del solvente, y a menudo se confunde con
fluoróforos se separan más allá de cierta distancia, como ocurre con la hidrólisis como se TD(Fig. 1A) (42).
muestra en (B), el extintor ya no ejerce ninguna influencia y el indicador emite en una
longitud de onda distintiva (flechas discontinuas) que es registrada por el instrumento. Oligosondas lineales
En el proceso inverso como se muestra en (C) usando oligosondas adyacentes, los
fluoróforos comienzan como entidades separadas. Una señal del aceptor (A) solo se El uso de un par de oligosondas de hibridación fluorogénicas
puede generar cuando el donante (D) se acerca mucho, como se muestra en (D). Esto adyacentes se describió por primera vez a fines de la década de 1980
ocurre como resultado de la hibridación adyacente de las oligosondas con el amplicón
(43,44) y, ahora conocidas como 'HybProbes', se han convertido en el
objetivo. En (Y) se muestra otra forma de extinción, provocada por el contacto íntimo de
etiquetas adheridas a oligosondas en horquilla (faro molecular, amanecer o escorpión). método de elección para LightCycler™ (Roche Molecular Biochemicals,
El fluoróforo (F) y un NFQ (Q, cerrado) interactúan más por colisión que por FRET, Alemania) , un fluorímetro y termociclador de microvolumen de base
interrumpiendo la estructura electrónica del otro y transmitiendo directamente la capilar con control rápido de temperatura (20,45). La oligosonda aguas
energía de excitación que se disipa como calor (flechas discontinuas irregulares).
arriba está marcada con un 3′ fluoróforo donante (FITC) y la sonda
Cuando las etiquetas se separan por ruptura de la horquilla, como es el caso en (F), el
fluoróforo es libre de emitir fluorescencia (flechas discontinuas).
aguas abajo se etiqueta comúnmente con un fluoróforo aceptor
LightCycler Red 640 o Red 705 en los 5′terminal de modo que cuando
ambas oligosondas se hibridan, los dos fluoróforos se ubican dentro
de los 10 nt uno del otro, atrayendo a veces el nombre de sondas
Ensayos de PCR. Hay cinco químicas principales actualmente en uso, y se 'besadoras' (Figs. 2C, D y 3C). Los capilares compuestos de plástico y
pueden clasificar en métodos específicos de secuencia de amplicón o vidrio son ópticamente transparentes y actúan como cubetas para el
métodos no específicos de detección de PCR en tiempo real (31). Cada una análisis de fluorescencia, además de facilitar una rápida transferencia
de las químicas tiene una nomenclatura asociada para describir las de calor. Los capilares se giran más allá de un diodo emisor de luz azul
etiquetas fluorescentes; sin embargo, para la discusión general, se seguirá
y la fluorescencia se controla mediante tres diodos de fotodetección
con diferentes filtros de longitud de onda. La temperatura varía
utilizando el fluoróforo para describir estos restos. Aunque esta revisión se
calentando y enfriando rápidamente el aire usando un elemento
centra en el uso de estas sustancias químicas en aplicaciones en tiempo
calefactor y un ventilador que producen velocidades de rampa de 20°
real, también se pueden usar como etiqueta para la detección de
C/s, prolongando la supervivencia de la polimerasa (46). Además,
amplicones de punto final.
debido a que las oligosondas no se hidrolizan significativamente
fluoróforos de unión al ADN durante la amplificación (47) y el LightCycler puede monitorear los
cambios en la emisión de fluorescencia durante la desnaturalización de
La base de los métodos de detección de secuencias no específicas las oligosondas adyacentes de su amplicón, este sistema puede
es la molécula fluorogénica de unión al ADN. En este grupo se realizar el genotipado de un solo tubo. Esta capacidad, que hace uso
incluyen los enfoques más antiguos y sencillos de PCR en tiempo del análisis de la curva de fusión fluorescente, proporciona
real. Bromuro de etidio (32), YO-PRO-1 (33,34) y SYBR® verde 1 (35) información importante sobre la secuencia a la que se unen las
todos emiten fluorescencia cuando se asocian con dsDNA que se oligosondas. Las mutaciones bajo una o ambas oligosondas pueden
expone a una longitud de onda de luz adecuada. Este enfoque determinarse por la disminución de la fusión
Figura 3.Químicas de oligosonda. (A) 5′ Oligosondas de nucleasa. A medida que la ADN polimerasa (pol) avanza a lo largo de la hebra relevante, desplaza y luego hidroliza la
oligosonda a través de sus 5′→3′actividad de la endonucleasa. Una vez que el indicador (R) se retira de la influencia extintora del extintor (Q, abierto), puede liberar energía de
excitación en una longitud de onda que es monitoreada por el instrumento y diferente de las emisiones del extintor. El recuadro muestra la molécula NFQ y MGB que componen las
oligosondas de nucleasa MGB mejoradas. (B) Oligosondas en horquilla. La hibridación de la oligosonda con el objetivo separa el fluoróforo (F) y el extintor no fluorescente (Q, cerrado)
lo suficiente como para permitir la emisión del fluoróforo excitado, que se controla. El recuadro muestra una oligosonda de horquilla de desplazamiento de longitud de onda que
incorpora una molécula cosechadora. (C) Oligosondas adyacentes. La hibridación adyacente da como resultado una señal FRET debido a la interacción entre los fluoróforos donante (D)
y aceptor (A). Este sistema bimolecular adquiere sus datos de las emisiones del aceptor de manera opuesta a la función de la química de oligosonda de nucleasa. (D) Imprimadores
Sunrise. La hebra opuesta se duplica para que la estructura de horquilla de la imprimación pueda romperse. Esto separa las etiquetas, eliminando el apagado de manera similar a la
oligosonda de horquilla. (Y) Cebadores de escorpión. El cebador no requiere la extensión de la hebra complementaria; de hecho, bloquea la extensión para garantizar que la horquilla
en la sonda solo se interrumpa por hibridación específica con una secuencia complementaria diseñada para ocurrir aguas abajo de su propia hebra naciente. El recuadro muestra un
escorpión dúplex que intercambia la estructura de bucle de tallo por un elemento cebador terminalmente marcado con el fluoróforo y un oligonucleótido complementario separado
marcado con un extintor en el 5′ término.
temperatura en la que incurren debido a la desestabilización del dúplex la detección de patógenos virales relacionados. A pesar de que la
oligosonda/objetivo (Fig. 4). Esto ha impartido mejoras significativas en la hibridación no alcanza el equilibrio utilizando estas rampas, la
velocidad del diagnóstico de enfermedades genéticas, así como un número aparenteTMETROlos valores son tanto reproducibles como
creciente de enfoques de PCR multiplex para característicos de un dúplex sonda/objetivo dado (48). Sin embargo,
parte de la oligosonda es consumida por la actividad de endonucleasa

relacionada con la secuencia (50, 51). Las tres químicas de oligosonda
(SYBR Green I, nucleasa y oligosonda adyacentes) parecen capaces de
detectar el producto amplificado con aproximadamente la misma
sensibilidad (20).
Ahora están apareciendo combinaciones de los enfoques anteriores
a medida que más usuarios de la instrumentación se familiarizan con
los conceptos detrás de la PCR en tiempo real y contribuyen a la
literatura. Si se agrega una oligosonda lineal marcada con fluoróforo y
específica de secuencia a una mezcla SYBR green 1, actualmente
denominada sistema Bi-probe, se producirá FRET y se podrá obtener
una capa adicional de especificidad (44,52,53). Un ensayo usando un
BODIPY®La oligosonda marcada con FL se adaptó para funcionar en el
LightCycler utilizando una secuencia diana de β-globina (54). La sonda
se diseñó de modo que el fluoróforo se ubicara en una citosina
terminal y se extinguiera por proximidad con una guanina
complementaria. El ensayo demostró que la extinción varía
linealmente con la concentración de la plantilla en un rango de
concentración definido. El fluoróforo FITC de uso común se apaga
inherentemente por nucleótidos de desoxiguanosina. El nivel de
extinción se puede aumentar si hay más guaninas presentes o si se
ubica una sola guanina en la primera posición sobresaliente, 1 nt más
allá del extremo de la sonda marcado con fluoróforo. Este enfoque
para la detección de amplicón es más fácil de diseñar que las
oligosondas fluorogénicas, más simple de sintetizar y usar en PCR en
tiempo real y no requiere una polimerasa de ADN con actividad de
nucleasa (55).
La sonda luminosa es un ácido nucleico peptídico al que se une el
fluoróforo de cianina asimétrico naranja tiazol (56). Cuando se hibrida
con un objetivo de ácido nucleico, ya sea como dúplex o tríplex,
dependiendo de la secuencia de la oligosonda, el fluoróforo se vuelve
fuertemente fluorescente. Estas sondas no interfieren con la PCR, no
requieren cambios conformacionales, son sensibles a los desajustes de
un solo nucleótido, lo que permite el análisis de fusión de la
fluorescencia y, debido a que se usa un solo indicador, se puede
realizar una medición directa de la fluorescencia en lugar de la
Figura 4.Análisis de la curva de fusión fluorescente. Al finalizar una PCR en tiempo real usando medición de un cambio en fluorescencia entre dos fluoróforos (56,57).
un par de oligosondas adyacentes, la reacción se puede enfriar a una temperatura por debajo de Sin embargo, se ha notificado fluorescencia no específica durante
la esperada.TMETROde las oligosondas luego se calienta por encima de 85°C a una fracción de ciclos posteriores utilizando estas sondas (58).
grado por segundo (B). Durante el calentamiento, las emisiones del aceptor se pueden adquirir
constantemente (C). El software calcula la derivada negativa de la fluorescencia a lo largo del
5′ Oligosondas de nucleasa
tiempo, produciendo picos claros que indican laTMETROde la transición de fusión oligosonda-
objetivo (D). Cuando una o más mutaciones están presentes en una o ambas oligosondas (A), A fines de la década de 1980, los ensayos homogéneos eran pocos y
esteTMETROse desplaza y este desplazamiento se puede utilizar de forma diagnóstica para
distantes entre sí, pero los rápidos avances en la instrumentación de
discriminar polimorfismos de un solo nucleótido en la plantilla. Idealmente, una de las
termocicladores y la química de la manipulación de ácidos nucleicos han
oligosondas, el ancla, está diseñada para unirse a una región de secuencia estable, mientras que
la otra, el sensor, abarcará el desajuste. Los desajustes cerca del centro de la sonda y hecho que estos ensayos sean algo común desde entonces. El éxito de estos
flanqueados por pares G:C son más desestabilizadores que los desajustes cerca de los extremos ensayos gira en torno a una señal que cambia de forma rápida y medible
de la oligosonda flanqueados por pares A:T. tras la hibridación de una sonda con su objetivo (59). Al usar un exceso, se
reduce significativamente el tiempo requerido para la hibridación de una
oligosonda con su objetivo, especialmente cuando la cantidad de ese
los capilares son frágiles y requieren cierta experiencia para
objetivo ha sido incrementada por PCR o algún otro proceso de
manipularlos (49).
amplificación (41, 59).
Al comparar las señales de las diferentes químicas, la destrucción de las
En 1991, Holandaet al. (6) describieron una técnica que
oligosondas de nucleasa continúa a pesar de una meseta en la acumulación sentaría las bases para la PCR homogénea usando oligosondas
del producto, mientras que la fluorescencia de SYBR green 1 en el control fluorogénicas. El amplicón se detectó monitoreando el efecto
sin plantilla generalmente aumenta de manera no específica durante los deTaqADN polimerasa 5′→3′ actividad de la endonucleasa en
ciclos posteriores. La fluorescencia de la oligosonda adyacente comienza a dúplex específicos de oligosonda/ADN diana. Los productos
disminuir a medida que aumenta la tasa de colisión entre el número radiomarcados se examinaron mediante cromatografía en
creciente de cadenas de amplicón complementarias, lo que favorece la capa fina y se utilizó la presencia o ausencia de hidrólisis como
formación de dsDNA sobre la hibridación de la oligosonda con su cadena de indicador de la formación de dúplex. Estas oligosondas
ADN objetivo. Adicionalmente, existe la posibilidad de que contenían 3′ resto de fosfato, que bloqueó su extensión por el
polimerasa, pero por lo demás no tuvo ningún efecto sobre el rendimiento del amplicón. por el amplicón acumulado supera las 10 desviaciones
estándar de la fluorescencia inicial media, usando datos
Los criterios deseables para un marcador de oligosonda son (i) fácil tomados de los ciclos 3 a 15 (Fig. 1B) (64). ElCTes proporcional
unión del marcador al ADN, (ii) detectabilidad a bajas concentraciones, al número de copias diana presentes en la muestra (17).
(iii) detectabilidad usando instrumentación simple, (iv) producción de Una mejora reciente de la oligosonda de nucleasa ha dado
una señal alterada tras una hibridación específica, como resultado las oligosonda de unión al surco menor (MGB)
(v) seguridad biológica, (vi) estabilidad a temperaturas elevadas y (Fig. 3A, recuadro). Esta química reemplaza el extintor TAMRA
(vii) una ausencia de interferencia con la actividad de la estándar con un NFQ e incorpora una molécula que estabiliza el
polimerasa (6, 18). dúplex oligosonda-objetivo plegándose en el surco menor del
Un enfoque innovador utilizó la PCR de traducción de muescas en dsDNA (65). Esto permite el uso de oligosondas muy cortas (14 nt),
combinación con oligosondas marcadas con fluoróforo doble (14). En que son ideales para detectar polimorfismos de un solo nucleótido
el primer ensayo verdaderamente homogéneo de este tipo, se añadió (SNP). Un uso relacionado de las secuencias de oligonucleótidos
un fluoróforo a los 5′ terminal y uno en el medio de una sonda de doblemente marcadas ha sido proporcionar la parte generadora
oligonucleótidos específica de secuencia. Cuando están tan cerca, los 5′ de señales del sistema DzyNA-PCR (66). Aquí, el indicador y el
el fluoróforo reportero (6-carboxi-fluorosceína) transfirió energía de extintor se separan después de la escisión de la sonda por una
excitación inducida por láser mediante FRET a los 3′fluoróforo extintor ADNzima, que se crea durante la PCR como complemento de una
(6-carboxi-tetrametil-rodamina; TAMRA), que redujo la vida útil del secuencia de ADNzima antisentido incluida en el 5′cola de uno de
estado excitado del reportero al tomar su exceso de energía y emitirlo los cebadores. Tras la escisión, el sustrato marcado dual libera los
como una señal fluorescente propia (Fig. 2A y B). TAMRA emitió la fluoróforos y genera una señal de manera análoga a la 5′sonda de
nueva energía a una longitud de onda que fue monitoreada pero no nucleasa.
utilizada en la presentación de datos. Sin embargo, cuando la
oligosonda se hibridó con su plantilla, los fluoróforos se liberaron Oligosondas en horquilla
debido a la hidrólisis del componente oligosonda del dúplex sonda/
Las balizas moleculares fueron las primeras oligosonda en horquilla y son una variación de la
objetivo. Una vez que se separaron las etiquetas, las emisiones del
oligosonda de nucleasa de doble marcaje (Fig. 3B). Las etiquetas fluorogénicas de la oligosonda
reportero ya no se extinguieron y el instrumento controló la
en horquilla se denominan fluoróforo y extintor, y se colocan en los extremos de la oligosonda.
fluorescencia resultante. Estas oligosondas se han denominado 5′
Las etiquetas se mantienen muy cerca por regiones de tallo distal de emparejamiento de bases
nucleasa, hidrólisis o TaqMan® oligosondas (Fig. 3A). Las oligosondas
homólogas diseñadas deliberadamente para crear una estructura de horquilla que da como
de nucleasa tienen requisitos de diseño que son aplicables a las otras
resultado el enfriamiento por FRET o una transferencia de energía directa por un mecanismo de
químicas de oligosonda lineales, que incluyen (i) una longitud de 20 a
colisión debido a la proximidad íntima de las etiquetas (Fig. 2E y F) (67). En presencia de una
40 nt, (ii) un contenido de GC de 40 a 60 %, (iii) sin corridas de un solo
secuencia complementaria, diseñada para ocurrir dentro de los límites de los sitios de unión del
nucleótido, particularmente G, (iv) sin motivos de secuencia repetidos,
cebador, la oligosonda se hibridará, cambiando a una configuración abierta. El fluoróforo ahora
(v) ausencia de hibridación o superposición con los cebadores directos
se elimina espacialmente de la influencia del extintor y las emisiones fluorescentes se controlan
o inversos y (vi) unTMETROPor lo menos 5°C más alta que la de los
durante cada ciclo (68). La aparición de un desajuste entre una oligosonda en horquilla y su
cebadores, para garantizar que la oligosonda se haya unido a la
objetivo tiene un mayor efecto desestabilizador en el dúplex que la introducción de un desajuste
plantilla antes de que se produzca la extensión de los cebadores (60).
equivalente entre el objetivo y una oligosonda lineal. Esto se debe a que la estructura de
horquilla proporciona una conformación alternativa muy estable. Por lo tanto, se ha demostrado
Sin embargo, esta tecnología requirió el desarrollo de una plataforma
que las oligosondas en horquilla son más específicas que las oligosondas lineales más comunes,
para excitar y detectar la fluorescencia, así como para realizar ciclos
lo que las convierte en candidatas ideales para detectar SNP (67). El extintor, 4-(4 Esto se debe a
térmicos. En 1992 se describió un dispositivo de carga acoplada para la
que la estructura de horquilla proporciona una conformación alternativa muy estable. Por lo
cuantificación de productos convencionales de transcripción inversa (RT)-
tanto, se ha demostrado que las oligosondas en horquilla son más específicas que las
PCR (61). En 1993, este enfoque se combinó con un termociclador, lo que
oligosondas lineales más comunes, lo que las convierte en candidatas ideales para detectar SNP
dio como resultado la primera plataforma de detección y excitación de
(67). El extintor, 4-(4 Esto se debe a que la estructura de horquilla proporciona una conformación
fluorescencia de PCR en tiempo real (29). Hasta la fecha, el prisma ABI® El
alternativa muy estable. Por lo tanto, se ha demostrado que las oligosondas en horquilla son
sistema de detección de secuencias 7700 (Perkin Elmer Corporation/Applied
más específicas que las oligosondas lineales más comunes, lo que las convierte en candidatas
Biosystems, EE. UU.) ha sido el principal instrumento utilizado durante 5′
oligosondas de nucleasa. Las fluctuaciones de fluorescencia no relacionadas ideales para detectar SNP (67). El extintor, 4-(4′-dimetilamino-fenilazo)-benceno (DABCYL), difiere
con PCR se normalizaron utilizando un fluoróforo de referencia interno no del descrito para las oligosondas de nucleasa porque es un NFQ.
participante o "pasivo" (6-carboxi-norte,norte,norte′,norte′-

tetrametilrodamina; ROX). Los valores corregidos, obtenidos a partir de una La sonda de horquilla de desplazamiento de longitud de onda es una
relación entre la intensidad de emisión de la señal del reportero y ROX, se mejora reciente de esta química que utiliza un segundo fluoróforo de
denominan RQ+. Para controlar aún más las fluctuaciones de amplificación, recolección. El recolector pasa la energía de excitación adquirida de
la fluorescencia de una reacción de control de 'nota de plantilla' (RQ–) se una fuente de luz azul y la libera como energía fluorescente en las
resta de RQ+ longitudes de onda del rojo lejano. Luego, la energía puede ser
resultando en el∆Valor de RQ que indica la magnitud de la utilizada por un fluoróforo 'emisor' receptivo que produce luz en
señal generada para la PCR dada (62). longitudes de onda características (Fig. 3B, recuadro). Esto ofrece el
El número de ciclo fraccional en el que la señal de fluorescencia potencial para mejorar el análisis de SNP y PCR multiplex en tiempo
en tiempo real refleja la progresión de la reacción por encima del real (Fig. 4), utilizando los instrumentos actualmente disponibles (69).
ruido de fondo se utilizó como indicador de una amplificación del Debido a que la función de estas oligosondas depende de la
objetivo satisfactoria (63). Este ciclo umbral (CT) se define como el hibridación correcta del tallo, el diseño preciso es crucial para su
ciclo de PCR en el que la ganancia de fluorescencia generada función (47).
amplicón autofluorescente rango dinámico predeterminado para los componentes de

amplificación y detección (79).
El amplicón autocebante es similar en concepto a la oligosonda en
Aunque una comparación de curvas estándar absolutas, curvas estándar relativas yCT
horquilla, excepto que el marcador se incorpora irreversiblemente al
valores produce valores finales similares (80), la creencia general sigue siendo que un
producto de la PCR (Fig. 3D y E). Se han descrito dos enfoques: los
control interno en combinación con réplicas de cada muestra son esenciales para la
primers sunrise (ahora denominados comercialmente primers de
cuantificación fiable por PCR (38,39). Desafortunadamente, el software de PCR en tiempo
horquilla Amplifluor™) y los primers scorpion (31, 70). La imprimación
real con la capacidad de calcular la concentración de un desconocido al comparar las
sunrise consta de 5′fluoróforo y un DABCYL NFQ. Las etiquetas están
señales generadas por un objetivo amplificado y el control interno apenas está
separadas por tramos complementarios de secuencia que crean un
comenzando a surgir. Es de esperar que este problema se aborde en los próximos
tallo cuando se cierra el cebador sunrise. a las 3′terminal es una
lanzamientos comerciales (81). Por lo tanto, el siguiente mejor enfoque para la
secuencia de cebador específica de la diana. La secuencia del cebador
cuantificación por PCR es el uso de una curva estándar externa. Este enfoque se basa en
de la salida del sol está destinada a ser duplicada por la cadena
la titulación de una plantilla amplificada de manera idéntica, en una matriz de muestra
complementaria naciente y, de esta manera, el tallo se desestabiliza,
relacionada, dentro de la misma serie experimental. Si bien la curva estándar externa es
los dos fluoróforos se mantienen separados por ~20 nt (70 Å) y el
el enfoque más comúnmente descrito, sufre variaciones entre tubos no controladas ni
fluoróforo es libre de emitir su energía de excitación para el
monitoreadas. Debido a esta omisión, tales experimentos deben describirse como
monitoreo. (70). Este sistema podría sufrir de fluorescencia no
semicuantitativos. A pesar de este enfoque subóptimo, los datos de fluorescencia
específica debido a la duplicación de la secuencia del cebador sunrise
generalmente se recopilan de ciclos de PCR que abarcan la porción de amplificación
durante la formación del dímero del cebador.
lineal de la reacción donde la señal fluorescente y el ADN acumulado son proporcionales.
El cebador de escorpión tiene un diseño casi idéntico excepto por una
Debido a que las emisiones de los productos químicos fluorescentes dependen de la
molécula de hexetilenglicol adyacente que bloquea la duplicación de la
temperatura, los datos generalmente se adquieren solo una vez por ciclo a la misma
porción de señalización del escorpión. Además de la diferencia en la
temperatura para monitorear el rendimiento de amplicón (45). El Debido a que las
estructura, la función de los cebadores de escorpión difiere ligeramente en
emisiones de los productos químicos fluorescentes dependen de la temperatura, los
que los 5′La región del oligonucleótido está diseñada para hibridar con una
datos generalmente se adquieren solo una vez por ciclo a la misma temperatura para
región complementaria dentro del amplicón. Esta hibridación fuerza a las
monitorear el rendimiento de amplicón (45). El Debido a que las emisiones de los
etiquetas a separarse rompiendo la horquilla y permitiendo la emisión de la
productos químicos fluorescentes dependen de la temperatura, los datos generalmente
misma manera que las sondas de horquilla (31).
se adquieren solo una vez por ciclo a la misma temperatura para monitorear el
rendimiento de amplicón (45). ElCTde la muestra a un valor de fluorescencia específico se
CUANTIFICACIÓN VIRALES puede comparar con datos similares recopilados de una serie de estándares mediante el
cálculo de una curva estándar. La determinación de laCT
La mayoría de los ensayos de PCR de diagnóstico informados hasta la depende de la sensibilidad y la capacidad del instrumento para
fecha se han utilizado en un formato cualitativo o 'sí/no'. El desarrollo discriminar la fluorescencia específica del ruido de fondo, la
de la PCR en tiempo real ha sacado la verdadera cuantificación de los concentración y la naturaleza del componente que genera la
ácidos nucleicos objetivo del laboratorio de investigación pura al fluorescencia y la cantidad de plantilla inicialmente presente.
laboratorio de diagnóstico. La PCR en tiempo real ofrece mejoras significativas para la
La determinación de la cantidad de molde por PCR se puede cuantificación de la carga viral debido a su enorme rango
realizar de dos formas: como cuantificación relativa y como dinámico que puede acomodar al menos ocho log10copias de la
cuantificación absoluta. La cuantificación relativa describe los plantilla de ácido nucleico (33,52,77,82–89). Esto es posible porque
cambios en la cantidad de una secuencia objetivo en los datos se eligen de la fase lineal (LP; Fig. 1B) de amplificación
comparación con su nivel en una matriz relacionada. La donde las condiciones son óptimas, en lugar del punto final donde
cuantificación absoluta establece el número exacto de dianas la cantidad final de amplicón presente puede haber sido afectada
de ácido nucleico presentes en la muestra en relación con una por inhibidores, reacción pobremente optimizada condiciones o
unidad específica (71). En general, la cuantificación relativa saturación por subproductos inhibidores de la PCR y amplicón de
proporciona información suficiente y es más sencilla de doble cadena. El resultado de tomar datos del punto final es que
desarrollar. Sin embargo, al monitorear el progreso de una puede no haber una relación entre la plantilla inicial y las
infección, la cuantificación absoluta es útil para expresar los concentraciones finales de amplicón.
resultados en unidades que son comunes tanto para La PCR en tiempo real también es una alternativa atractiva a la PCR
científicos como para médicos y en diferentes plataformas. La convencional para el estudio de la carga viral debido a su baja
cuantificación absoluta también puede ser necesaria cuando variabilidad interensayo e intraensayo (77,87,90) y su sensibilidad
no hay muestras secuenciales para demostrar cambios en los analítica equivalente o mayor en comparación con el cultivo viral
niveles de virus, tradicional, o PCR convencional de ronda única y anidada (77,85,91–
Un enfoque muy preciso para la cuantificación absoluta por PCR es el uso 96). Se ha informado que la PCR en tiempo real es al menos tan
de coamplificación competitiva de un ácido nucleico de control interno de sensible como la transferencia Southern (92). Sin embargo, estos
concentración conocida y un ácido nucleico diana de tipo salvaje de informes podrían ser una sobreestimación debido a la elección de
concentración desconocida, con el primero diseñado o elegido para objetivos más pequeños, que se amplifican de manera más eficiente, o
amplificar con la misma eficiencia. a este último (72-76). Sin embargo, debido al uso de cebadores diferentes o mejorados para los ensayos
mientras que la PCR competitiva convencional es relativamente económica, en tiempo real debido al uso de software para diseñar cebadores y
la PCR en tiempo real es mucho más conveniente, confiable y más adecuada oligosondas optimizados. Es más común.
para la toma rápida de decisiones en una situación clínica (77,78). Esto se Cuando se combinan esta mayor sensibilidad y el amplio rango
debe a que la PCR convencional, cuantitativa y competitiva (qcPCR) requiere dinámico, es posible cuantificar la plantilla a partir de muestras que
un desarrollo y una optimización significativos para garantizar un contienen una amplia gama de concentraciones, como suele ser el
rendimiento reproducible y una caso en las muestras de pacientes. Esto evita la necesidad de diluir el
amplicón antes de la detección convencional o repetir el ensayo usando una longitud de onda produce emisiones brillantes de un fluoróforo
muestra diluida porque el primer resultado de la prueba está fuera de los adecuadamente seleccionado, esto restringe el número de fluoróforos
límites del ensayo. Estos son problemas que se encuentran cuando se que se pueden incluir (69). Las mejoras recientes en el diseño de los
utilizan algunos kits de ensayo de qcPCR convencionales, que no pueden cebadores de horquilla y las oligosonda de horquilla y nucleasa, así
abarcar cargas virales elevadas manteniendo una sensibilidad adecuada como las nuevas combinaciones de fluoróforos, como en los sistemas
(52,97–99). La flexibilidad de la PCR en tiempo real también se demuestra de sonda bi-sonda y de luz, han prometido la capacidad de discriminar
por su capacidad para detectar un objetivo en presencia de un gran exceso un número cada vez mayor de objetivos.
de otro objetivo en ensayos dúplex (84). El descubrimiento y la aplicación de los extintores no fluorescentes ha liberado algunas longitudes de onda que antes estaban
La carga viral también es un indicador útil de la extensión de la infección ocupadas por las emisiones de los primeros extintores. Este avance ha permitido la inclusión de un mayor número de oligosondas
activa, las interacciones virus-huésped y la respuesta a la terapia antiviral, espectralmente discernibles por reacción y destacó la necesidad de un único extintor no fluorescente, que puede extinguir una
todo lo cual puede desempeñar un papel en el régimen de tratamiento amplia gama de longitudes de onda de emisión (p. ej., 400–600 nm). Los primeros sistemas de PCR en tiempo real contenían filtros
seleccionado (100,101). La PCR cuantitativa convencional ya ha demostrado optimizados para minimizar la superposición de los espectros de emisión de los fluoróforos. A pesar de esto, el número de
los beneficios de aplicar la amplificación de ácidos nucleicos para fluoróforos que podían combinarse y distinguirse claramente era limitado en comparación con las capacidades discriminatorias de la
monitorear la carga viral como un marcador útil de la progresión de la PCR múltiplex convencional. Las plataformas de PCR en tiempo real más recientes han incorporado múltiples diodos emisores de luz
enfermedad y como un componente de los estudios sobre la eficacia de los para abarcar todo el espectro visible o una fuente de luz de tungsteno, que emite luz en una amplia gama de longitudes de onda.
compuestos antivirales (74,100,102–104). Se ha demostrado que la Cuando estas plataformas incorporan filtros ópticos de alta calidad, es posible aplicar cualquier química actual de detección de PCR
gravedad de algunas enfermedades se correlaciona con la carga viral, lo en tiempo real en una sola máquina. No obstante, estas mejoras generalmente permiten solo la multiplexación de oligosonda de
que hace que la cuantificación por PCR en tiempo real sea útil para estudiar cuatro colores, de los cuales un color se reserva idealmente para un control interno para monitorear la inhibición y tal vez incluso
no solo la presencia de un virus, sino también el papel de la reactivación o
actuar como un competidor coamplificado. Algunos diseños de PCR en tiempo real han hecho uso de cambios de uno o varios
persistencia viral en la progresión de la enfermedad (78,82,91,105– 112).
nucleótidos entre plantillas similares para permitir su diferenciación por Cuando estas plataformas incorporan filtros ópticos de alta
Un ejemplo de los beneficios que ha aportado la PCR en tiempo real calidad, es posible aplicar cualquier química actual de detección de PCR en tiempo real en una sola máquina. No obstante, estas
a la detección cuantitativa del citomegalovirus humano (CMV) se
mejoras generalmente permiten solo la multiplexación de oligosonda de cuatro colores, de los cuales un color se reserva idealmente
observa en pacientes inmunodeprimidos tras un trasplante de órgano
para un control interno para monitorear la inhibición y tal vez incluso actuar como un competidor coamplificado. Algunos diseños de
sólido o de médula ósea. Aunque la detección cualitativa del ADN del
PCR en tiempo real han hecho uso de cambios de uno o varios nucleótidos entre plantillas similares para permitir su diferenciación
CMV mediante PCR se ha utilizado como indicador del éxito de la
por Cuando estas plataformas incorporan filtros ópticos de alta calidad, es posible aplicar cualquier química actual de detección de
terapia antiviral, se prefieren los ensayos cuantitativos para
PCR en tiempo real en una sola máquina. No obstante, estas mejoras generalmente permiten solo la multiplexación de oligosonda
monitorear las respuestas terapéuticas del paciente. Además, dado
de cuatro colores, de los cuales un color se reserva idealmente para un control interno para monitorear la inhibición y tal vez incluso
que se ha postulado que el seguimiento de la replicación viral a lo
actuar como un competidor coamplificado. Algunos diseños de PCR en tiempo real han hecho uso de cambios de uno o varios
largo del tiempo es un indicador más fiable de una enfermedad viral
nucleótidos entre plantillas similares para permitir su diferenciación por de los cuales un color se reserva idealmente para un control
en desarrollo que la determinación de cantidades virales absolutas en
interno para monitorear la inhibición y tal vez incluso actuar como un competidor coamplificado. Algunos diseños de PCR en tiempo
un solo momento, se han establecido y evaluado varios ensayos
real han hecho uso de cambios de uno o varios nucleótidos entre plantillas similares para permitir su diferenciación por de los cuales
cuantitativos para aumentar la capacidad de diagnóstico. exactitud.
un color se reserva idealmente para un control interno para monitorear la inhibición y tal vez incluso actuar como un competidor
Los ensayos competitivos cuantitativos basados en análisis de punto
coamplificado. Algunos diseños de PCR en tiempo real han hecho uso de cambios de uno o varios nucleótidos entre plantillas
final han mostrado límites de detección de 5× 101 equivalentes del
similares para permitir su diferenciación porTMETRO(Fig. 4), evitando así la necesidad de múltiples fluoróforos (49,91,118–122). Este
genoma (ge) por ensayo y un rango dinámico de 5× 101–5 ×104ge/
enfoque se ha utilizado mucho más comúnmente en la detección de enfermedades genéticas humanas en las que se han detectado
ensayo (113). Los ensayos basados en hibridación cubrieron
hasta 27 posibles sustituciones de nucleótidos utilizando solo uno o dos fluoróforos (48,123–128).
aproximadamente el mismo rango dinámico de cuatro órdenes de
magnitud con límites de detección de 20 ge/ensayo (114,115). Aunque
Hasta la fecha, solo ha habido un puñado de ensayos de PCR en tiempo
estos ensayos poseen rangos dinámicos que pueden ser suficientes
para la mayoría de las aplicaciones clínicas, muestran una alta real verdaderamente multiplexados descritos en la literatura y pocos de
variabilidad interensayo e intraensayo, de hasta un 40 % (115). estos se han aplicado al diagnóstico de enfermedades infecciosas. Algunos
Por el contrario, uno de los primeros ensayos de PCR en tiempo real de estos enfoques, técnicamente, no pueden considerarse ensayos
publicados para la detección de ADN del CMV se pudo realizar en <90 homogéneos en tiempo real porque requieren la interrupción del
min, abarcó un rango dinámico de seis a siete órdenes de magnitud procedimiento para transferir la plantilla, su fluorescencia se detecta
con un límite de detección de al menos 10 ge/ensayo y una variabilidad mediante análisis de punto final o los ensayos no se realizan dentro del
interensayo e intraensayo de <10 % y <5 %, respectivamente, utilizando mismo tubo. Uno de los mejores protocolos virales de PCR multiplex en
muestras de plasma de pacientes con trasplante de médula ósea (116). tiempo real puede discriminar entre cuatro secuencias diana retrovirales
(129), sin embargo, la PCR multiplex convencional que usa detección de
punto final puede discriminar fácilmente más de cinco secuencias
amplificadas diferentes, lo que indica una mayor flexibilidad en
PCR MÚLTIPLE EN TIEMPO REAL comparación con PCR en tiempo real (130–133).
La multiplexación (el uso de múltiples cebadores para permitir la A pesar de estas limitaciones, se han aplicado varios ensayos para la
amplificación de múltiples plantillas dentro de una sola reacción) es una detección de varios genomas virales a la vez, incluido el uso de una
aplicación útil de la PCR convencional (117). Sin embargo, su transferencia a etiqueta no específica, SYBR green 1 para detectar virus del herpes
PCR en tiempo real ha confundido su terminología tradicional. El término simple (VHS), virus de la varicela zoster (VZV) o CMV. , en tubos
PCR multiplex en tiempo real se usa más comúnmente para describir el uso separados (134) o, mediante la adaptación de una PCR multiplex
de múltiples oligosondas fluorogénicas para la discriminación de múltiples convencional, para identificar HSV-1 y HSV-2, VZV y enterovirus dentro
amplicones. La transferencia de esta técnica ha resultado problemática de un solo capilar mediante la aplicación de análisis de curva de fusión
debido al número limitado de fluoróforos disponibles (14) y al uso común de fluorescente (121). Otra RT-PCR de oligosonda de nucleasa
una fuente de luz energizante monocromática. Aunque la excitación por un multiplexada de un solo tubo fue capaz de detectar simultáneamente
solo la influenza A y B en las muestras respiratorias del paciente
con una sensibilidad mejorada en comparación con el cultivo convencional 111,112,144,167,171), ortomixovirus (95), parvovirus
o viral de la concha (95). (88), papovavirus (122,143,145), paramixovirus (94), picornavirus (85,86),
Los desarrollos futuros de químicas novedosas, como las etiquetas de retrovirus (90,93,156,196,197) y virus TT (137). La monitorización de la carga
transferencia de energía de fluorescencia combinatoria (135), y las mejoras viral mediante PCR en tiempo real también ha demostrado ser beneficiosa
en el diseño de la instrumentación y el software en tiempo real mejorarán para el estudio de pacientes después de un trasplante de órganos
en gran medida el futuro de la PCR en tiempo real multiplex. (21,83,107,198–201).
Esta tecnología se ha convertido ahora en una herramienta esencial en la
evaluación exhaustiva de los vectores de terapia génica viral antes de su uso
APLICACIONES A LA VIROLOGÍA
en ensayos clínicos. Las oligosondas de nucleasa se han informado con
La PCR en tiempo real ha sido extremadamente útil para estudiar agentes mayor frecuencia para estos estudios, que evalúan la biodistribución, la
virales de enfermedades infecciosas y ayudar a aclarar los procesos de función y la pureza de estas preparaciones de fármacos (164,197,202–205).
enfermedades infecciosas en disputa. La mayoría de los ensayos
presentados en la literatura permiten una mayor frecuencia de detección de Además, el estudio de virus emergentes se ha complementado con
virus en comparación con las técnicas convencionales, lo que hace que la el uso de PCR en tiempo real como herramienta para demostrar
implementación de la PCR en tiempo real sea atractiva para muchas áreas vínculos entre secuencias virales únicas y signos y síntomas clínicos del
de la virología. paciente (94,96,150,160,206,207).
Por supuesto, la PCR en tiempo real ha demostrado ser cada vez más La velocidad y la flexibilidad de la PCR en tiempo real también han
valiosa para los estudios virológicos generales, aunque cada vez más, estas resultado útiles para los intereses comerciales en la detección de
aplicaciones son difíciles de revisar debido a la naturaleza de su uso como contaminación microbiana de preparaciones de reactivos a gran escala
herramienta más que al enfoque del estudio publicado. Dichos estudios han producidas a partir de sistemas de expresión eucarióticos (208,209).
investigado el papel de los virus en una variedad de enfermedades
simplemente confirmando la presencia o ausencia del virus (136,137) o, en
CONCLUSIONES Y RESUMEN
el futuro, monitoreando los niveles de actividad de genes específicos (138)
como resultado del crecimiento en condiciones manipuladas. condiciones. Los avances en el desarrollo de fluoróforos, químicas de etiquetado de
La entrada o la replicación viral alterada, causada por la modificación de los nucleótidos y las nuevas aplicaciones de la hibridación de oligosonda han
tejidos diana, también se puede seguir mediante PCR en tiempo real, al proporcionado a la tecnología de PCR en tiempo real una base lo
igual que los vínculos entre la replicación del virus y la expresión de genes suficientemente amplia como para garantizar su aceptación.
celulares (139–141). Recientemente, ha aparecido instrumentación que es capaz de tiempos de
La PCR en tiempo real ha mejorado la velocidad y el alcance de la ciclo increíblemente cortos combinados con la capacidad de detectar y
medición de la cepa viral y las diferencias de título en pacientes que diferenciar múltiples amplicones. Los nuevos instrumentos también son lo
presentan diferentes síndromes debido a variedades del mismo virus (106). suficientemente flexibles como para permitir el uso de cualquiera de las
Además, los estudios epidemiológicos han mejorado en velocidad y alcance químicas descritas en esta revisión, lo que hace que la amplificación de
mediante el uso de PCR en tiempo real porque puede medir de manera ácidos nucleicos en tiempo real sea una propuesta cada vez más atractiva y
confiable la cantidad de dos objetivos de ácido nucleico dentro de una sola viable para el laboratorio de diagnóstico de rutina. En muchos casos, estos
reacción (91,142). Los nuevos productos químicos han permitido una mejor laboratorios realizan cultivos de tejidos para aislar el virus y métodos
discriminación de múltiples genotipos virales dentro de un solo recipiente serológicos para confirmar la identidad del aislado, lo que puede llevar una
de reacción (143) y han proporcionado una alternativa a los métodos de cantidad de tiempo considerable y clínicamente relevante.
detección de virus basados en ensayos de morbilidad y mortalidad. La familiaridad que conduce al cómodo uso rutinario de una
tecnología ahora es evidente en la inclusión de las químicas de
El uso de la PCR en tiempo real ha brindado información sobre la(s) oligosonda fluorogénica en muchos laboratorios. Según la literatura, el
función(es) que tienen algunos compuestos en la inhibición de la PCR, formato más utilizado es el de 5′oligosonda de endonucleasa, aunque
además de arrojar luz sobre la eficiencia de diferentes métodos de lo más probable es que se deba a su madurez comercial. Las químicas
extracción de ácidos nucleicos, a partir de una amplia gama de tipos de de oligosonda desarrolladas más recientemente se han utilizado en
muestras (144–146). Esta capacidad de utilizar plantillas de una una serie de aplicaciones innovadoras y, a partir de la tasa y el
variedad de tipos de muestras cumple con un requisito para un contenido de las publicaciones relacionadas con la PCR en tiempo real,
sistema de detección ideal, que es la capacidad de aplicar una sola es evidente que se están aceptando cada vez más.
tecnología en muchos campos. Esta flexibilidad se destaca por la Los desarrollos recientes en PCR multiplex en tiempo real han
detección de ácidos nucleicos virales derivados, de diferentes maneras, sugerido un futuro en el que la fácil identificación, el genotipado y la
de plantas (147–149), animales (86,89,94,150–152), lodos urbanos cuantificación de objetivos virales en reacciones únicas y rápidas serán
(85,153), cultivo de tejidos (23,77,96,154 –160), varios tejidos sólidos comunes. Por supuesto, esta tecnología no está restringida de ninguna
(108,118,161–166), líquido cefalorraquídeo (49,167,168), células manera a la virología, ya que han aparecido logros significativos en el
mononucleares de sangre periférica (82,93,105,112,169–171), plasma área de detección de mutaciones, aplicando todos los beneficios
(81,88,90,172–176), suero (30,33,36, 87,97,99,109,177–181), hisopos descritos anteriormente para mejorar la detección de enfermedades
(182,183), saliva (106) y orina (78,122,184,185). Además, las genéticas y, en su caso, permitir la cuantificación de la extensión de
enfermedades crónicas como el sarcoma (186–189), el carcinoma tales cambios genéticos.
(92,111), la neoplasia intraepitelial cervical (190–192) y los trastornos La tecnología de micromatrices y macromatrices seguramente jugará un
linfoproliferativos (193,194) pueden estudiarse con relativa facilidad papel quimérico en la PCR en tiempo real de la investigación futura, pero
para investigar los vínculos directos o indirectos con la infección viral. por ahora existe un potencial significativo para los intereses comerciales, de
Estos estudios se han dirigido a virus que incluyen los flavivirus investigación y de rutina para rediseñar los sistemas existentes para una
(33,36,96,109,195), hepadnaviridae (52,97), herpesvirus (21,77,78,82– mayor sofisticación, flexibilidad y la capacidad de generar datos
84,91,92,98,105,106,108, cuantitativos de alta calidad. El desarrollo de ensayos capaces
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Traducido del "?" al español - www.onlinedoctranslator.

Recibido el 31 de octubre de 2001; Revisado el 2 de enero de 2002; Aceptado el 14 de enero de 2002

beneficios sobre oligosondas radiogénicas que incluyen evitar

requiere menos conocimientos especializados que el diseño de

parte de la oligosonda es consumida por la actividad de endonucleasa

participante o "pasivo" (6-carboxi-norte,norte,norte′,norte′-

amplicón autofluorescente rango dinámico predeterminado para los componentes de

181.Pas,SD, Fries,E., De Man,RA, Osterhaus,ADME y Niesters,HG (2000)

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