La reacción en cadena de la polimerasa es sin lugar a dudas,

la técnica mas importante y revolucionaria en biologia

molecular, debido a que permite obtener in vitro millones
de copias de un fragmento de acido desoxirribonucleico
(ADN).
En la reacción, si usamos como sustrato ADN genómico,
entonces típicamente hablamos de una PCR, pero si usamos
ADN complementario (ADNc) proveniente del ARNm (ácido
ribonucleico mensajero) se le conoce como RT-PCR (Reverse
Transcription-PCR.
 Secuenciación
 Establecimiento de polimorfismos
 Rastreo de mutaciones
 Diagnóstico de enfermedades genéticas
 Resolución de problemas forenses o arqueológicos
 Estudios evolutivos
 Detección de microorganismos infecciosos
 Detección de OGM’s
 Detección de células tumorales
 Clonación molecular
La reacción en cadena de la polimerasa es una técnica o metodología
basada en el proceso natural de replicación del DNA. Por tanto,
incluye los tres grandes pasos que se describen en la replicación
como son:

 Desnaturalización
 Hibridación
 Polimerización
A pesar de la aparente complejidad es un método sencillo, sensible
y relativamente rápido para la amplificación de secuencias de DNA.

En la práctica se requiere controlar ciertas variables y el uso de un

equipo adecuado conocido como «termociclador» para el
establecimiento de las condiciones de cada etapa del proceso
(tiempo y temperatura) y repetirlas de forma cíclica el número de
veces deseado.
DNTP’s
Se requieren los cuatro correspondientes a cada una de las cuatro bases
nitrogenadas presentes en el DNA.
Oligonucleótidos o primers
Son secuencias de DNA de cadena sencilla y longitud corta(18 a 30
nucleótidos)
Sus secuencias deben ser complementarias a los extremos 3’
Es para el diseño de éstos que se requiere conocer al menos en parte el
fragmento a amplificar
La posición donde hibridan los cebadores o primers define la longitud
del fragmento a amplificar.
H20
Usada como solvente. Se requiere al menos que sea desionizada o milli-Q
grado molecular. Si se busca un mejor rendimiento se aconseja además, que
sea libre de DNasas y RNasas, purificada por luz ultravioleta.
BUFFER
Mantiene el pH adecuado para el funcionamiento de la ADN polimerasa
IONES DIVALENTE O MONOVALENTES
Mg2+, agregado comúnmente como cloruro de magnesio (MgCl2)
MUESTRA-ADN
Contiene la región de ADN que se va a amplificar
DNA polimerasa termoestable

Que permanezca estable a temperatura entre 95-100 °C de forma tal

que permanezca activa durante ciclos sucesivos. Que sea de alta
fidelidad, es decir, que impida la formación de híbridos inespecíficos
En sus inicios el método empleo la Taq polimerasa del
microorganismo Thermus aquaticus pero hoy en día esta u otras
enzimas termoestables han sido modificadas genéticamente para
incrementar su estabilidad y fidelidad.
Hoy en día las casas comerciales venden junto con la DNA polimerasa el
buffer que incluye en caso de necesitar los cofactores. Completando así
los elementos necesarios en la mezcla de reacción de PCR. De igual
forma a esta mezcla se adiciona agua grado biología molecular.
Se requiere una sucesión de ciclos que incluirán los pasos de desnaturalización,
hibridación y replicación para conseguir la amplificación de un gran número de
moléculas que contiene la secuencia de interés o diana.
1. Desnaturalización
2. Hibridación
3. Elongación o polimerización de la cadena
Además de estas tres etapas de cada ciclo se añade una etapa previa y una final.
La etapa previa consiste en mantener elevada temperatura la cual asegura la
desnaturalización completa del DNA y la etapa final permite la elongación completa
de todos los fragmentos.
Rendimiento: Puesto que los productos de cada ciclo sirven de molde
para el siguiente la acumulación de copias es exponencial.
Duración: La duración de cada etapa del ciclo debe optimizarse
dependiendo de la secuencia completa a amplificar.
Especificidad: Es elevada y determinada por la secuencia de los
oligonucleótidos utilizados. La aparición de una única banda o un único
producto de PCR demuestra una alta especificidad.
Capacidad de detección o «sensibilidad»: Es muy alta. La PCR puede
permitir detectar un DNA diana en casi cualquier tipo de muestra clínica,
forense o arqueológica, sin embargo esto supone también un elevado
riesgo de contaminación.
Fidelidad: Es la capacidad de copiar secuencias con precisión, sin
introducir mutaciones (cambios en la secuencia de nucleótidos).
Esta característica dependerá de si la enzima empleada tiene o no
actividad correctora de pruebas (actividad exonucleasa 3’).

Esta característica puede ser de gran importancia para situaciones en

donde el objetivo es:
 La identificación de mutaciones poco frecuentes o
 La expresión de proteína
PCR EN TIEMPO REAL
El principio de la técnica se basa en la PCR punto final pero la
detección de los productos amplificados sucede en cada ciclo de la
reacción pudiendo así cuantificar la cantidad de ADN en la muestra.
El producto es monitoreado conforme transcurre la reacción. Si se usa
DNA genómico se escribe qPCR si es cDNA RT-qPCR.
La PCR en tiempo real detecta y cuantifica secuencias específicas de
ácidos nucleicos mediante el uso de reporteros fluorescentes en la
reacción
 METODOS PARA
DETECTAR
PRODUCTOS
AMPLIFICADOS

Específicos No Específicos

Pruebas basadas Hibridacion

en hidrólisis ( sondas SYBR Green
( sondas Taq molecular
man) Beacons)
Termociclador de PCR En tiempo real

a)excitar al reportero

b) capturar la señal de emisión del mismo

c) realizar el análisis cuantitativo

los termocicladores están proveídos de una PC con un software que
generalmente son fáciles de usar. Este software genera una serie de
gráficas en donde se muestran todos los datos necesarios para
conocer si la reacción fue exitosa
Tipos de cuantificación
 ABSOLUTA generalmente se utiliza para conocer el número exacto
de copias amplificadas del blanco o la concentración precisa de
ácidos nucleicos en una muestra. En la práctica, este tipo de
cuantificación se usa para medir la carga viral o bacteriana en
diferentes tejidos.
 RELATIVA se aplica cuando se desean evaluar los cambios en la
expresión de genes en distintos estados fisiológicos
PCR MULTIPLEX
Multiplex PCR es una técnica de biología molecular generalizada para
la amplificación de múltiples objetivos en un único experimento de
PCR. En un ensayo de multiplexación, más de una secuencia diana
puede ser amplificado mediante el uso de múltiples pares de
cebadores en una mezcla de reacción. Como una extensión para el
uso práctico de PCR, esta técnica tiene el potencial de producir un
ahorro considerable en tiempo y esfuerzo en el laboratorio sin
comprometer la utilidad del experimento.
1. Single Template PCR Reacción

Esta técnica utiliza una única plantilla que puede ser un ADN genómico, junto
con varios pares de cebadores directo e inverso para amplificar regiones
específicas dentro de una plantilla.

2. Reacción Múltiple Template PCR

Se utiliza múltiples plantillas y varios conjuntos de cebadores en el mismo tubo

de reacción. La presencia de múltiples cebadores puede dar lugar a
hibridación cruzada entre sí y con la posibilidad de errores de cebado con
otras plantillas
1. Primer Longitud

ensayos Multiplex PCR implican el diseño de un gran número de cebadores, por lo

tanto, se requiere que el cebador diseñado debe ser de longitud apropiada. Por lo
general, se utilizan cebadores de corta longitud, en el intervalo de 18-22 bases.

2. Temperatura de fusión

cebadores con Tm similares, preferiblemente entre 55 ° C-60 ° C se utilizan. Para las

secuencias con alto contenido de GC, se recomiendan cebadores con una Tm más
alta (preferiblemente 75 ° C-80 ° C). Una variación Tm de entre 3 ° -5 ° C es
aceptable para los cebadores usados en una piscina.
3. Especificidad

Es importante tener en cuenta la especificidad de los cebadores diseñados para las

secuencias diana, mientras se prepara un ensayo múltiple, sobre todo porque existe
competencia cuando múltiples secuencias diana están en un solo recipiente de
reacción.

4. Evitar la formación de dímero Primer

Los cebadores diseñados deben ser revisadas para la formación de dímeros de
cebadores, con todos los cebadores presentes en la mezcla de reacción. La
dimerización conduce a la amplificación inespecífica.

Todos los demás parámetros son similares a las directrices de diseño de cebadores
de PCR estándar .
 Controles internos 1.
Los problemas potenciales en un simple PCR incluyen falsos negativos debido a la falta de
reacción o falsos positivos debido a la contaminación. Los falsos negativos a menudo se revelan
en ensayos multiplex, porque cada uno de amplificación proporciona un control interno para los
otros fragmentos amplificados.
 2. Eficiencia
El gasto de los reactivos y el tiempo de preparación es menor en PCR multiplex que en los
sistemas donde se utilizan varios tubos de PCR UNIPLEX. Una reacción múltiple es ideal para la
conservación de la polimerasa costoso y plantillas escasean.
 3. Indicación de Plantilla Calidad
La calidad de la plantilla se puede determinar de manera más eficaz en multiplex que en un
simple reacción de PCR.
 4. Indicación de Plantilla Cantidad
La amplificación exponencial y los estándares internos de PCR multiplex se puede utilizar para
evaluar la cantidad de una plantilla determinada en una muestra. Para cuantificar las plantillas
con precisión por PCR multiplex, la cantidad de plantilla de referencia, el número de ciclos de
reacción, y la inhibición mínima de la duplicación teórica de producto para cada ciclo deben
tenerse en cuenta.
 La identificación de patógenos
 Genotipado de alto rendimiento SNP
 Análisis de la mutación
 Análisis de deleción del gen
 La cuantificación de plantilla
 El análisis de ligamiento
 Detección de RNA
 Los estudios forenses