QUÍMICA ANALÍTICA II 2023

TP N°3

TRABAJO PRÁCTICO N° 3 - LABORATORIO

DETERMINACIÓN DE TRIPTÓFANO POR ESPECTROSCOPÍA DE

FLUORESCENCIA MOLECULAR

OBJETIVO
• Instruir al alumno sobre la práctica en el laboratorio de técnicas espectroscópicas de
fluorescencia.

INTRODUCCIÓN
El fenómeno de fotoluminiscencia ocurre cuando una especie química es excitada por medio de
radiación electromagnética y como consecuencia la especie pierde la energía adquirida remitiendo
está en forma parcial o total. Esto es, parte de la energía adquirida por la especie química se remite
en forma de choques moleculares y parte en forma de energía luminosa o el total de la energía
adquirida se remite en forma de radiación. La fluorescencia y la fosforescencia son dos
manifestaciones diferentes del fenómeno fotoluminiscente. Estos dos efectos difieren entre sí en
el mecanismo a través del cual son producidos, además del tiempo de duración de la
fotoluminiscencia, una vez que ha cesado de excitarse la muestra con radiación electromagnética.
La fluorescencia cesa casi inmediatamente después de que a la muestra se le suspende la radiación
(<10-6 segundos), mientras que la fosforescencia puede durar varios segundos o minutos en
iguales circunstancias.
La medición de la intensidad de la fotoluminiscencia o de la quimioluminiscencia facilita la
determinación cuantitativa de un conjunto de especies inorgánicas y orgánicas importantes
cuando están presentes en cantidades de trazas. En la actualidad, el número de métodos
fluorométricos es mucho más grande que la cantidad de aplicaciones de los procedimientos
fosforescentes y quimioluminiscentes.

Espín del electrón y de los estados excitados

El principio de exclusión de Pauli establece que en un átomo no puede haber dos electrones con
los cuatro números cuánticos iguales. Esta restricción requiere que no haya más de dos electrones
en un orbital y, además, los dos deben tener los estados de espín opuestos. Cuando esto ocurre se
dice que los espines están apareados. Debido al apareamiento de los espines, la mayoría de las
moléculas no presentan un campo magnético neto y se dice por tanto que son diamagnéticas, es
decir, no son atraídas ni repelidas por campos magnéticos permanentes. Por el contrario, los
radicales libres, que contienen electrones desapareados, tienen un momento magnético, y
consecuentemente, son atraídos cuando se encuentran en un campo magnético, por ello se dice
que los radicales libres son paramagnéticos.
Un estado electrónico molecular en el cual todos los espines de los electrones están apareados se
llama estado singulete y cuando las moléculas exponen campo magnético no se produce un
desdoblamiento de niveles de energía. Por otro lado, el estado fundamental para un radical libre,
es un estado doblete porque el electrón impar puede tomar dos orientaciones en un campo
magnético, lo que comunica ligeras diferencias de energía al sistema. Cuando uno de los
electrones de unas moléculas excita a un nivel de energía superior, se forma un estado singulete
o triplete. En el estado singulete excitado, el espín del electrón promocionado todavía está

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apareado con el electrón del estado fundamental; sin embargo, en el estado triplete, los espines de
los electrones se han desapareado y por tanto están paralelos. El estado triplete excitado es menos
energético que el estado singulete excitado.
Las propiedades de una molécula en el estado triplete excitado difieren significativamente de las
del estado singulete excitado. Por ejemplo, una molécula es paramagnética en el estado triplete y
diamagnética en el estado singulete. Más importante es el hecho de que una transición singulete
triplete o viceversa, que también supone un cambio en el estado electrónico, es un suceso menos
probable que la correspondiente transición singulete/singulete. Como consecuencia, el tiempo de
vida media de un estado triplete excitado puede variar desde 10-4 hasta varios segundos, mientras
que el tiempo de vida media para un estado singulete excitado es de 10-8 a 10-5 segundos.

Diagramas de nivel de energía para las moléculas fotoluminiscentes

La Figura 1 muestra un diagrama parcial de niveles de energía para una especie molecular
hipotética. Se muestran tres estados de energía electrónica, E0, E1 y E2; el estado basal E0, y los
estados excitados E1 y E2. Cada uno de los estados electrónicos se muestra como cuatro niveles
vibracionales excitados. Cuando estas especies son irradiadas con una banda de longitudes de
onda λ1 a λ5 (véase la Figura 1a), los cinco niveles vibracionales del primer estado electrónico
excitado, E1, son ocupados de forma momentánea. De manera similar, cuando las moléculas se
irradian con una banda más energética formada de longitudes de onda menores, λ1’ a λ5’, los cinco
niveles vibracionales del estado electrónico de energía más alto E2 son ocupados brevemente. Una
vez que la molécula es excitada a E1 o E2, pueden ocurrir varios procesos que provocan que la
molécula pierda su exceso de energía. Dos de los procesos más importantes, la relajación no
radiativa y la emisión de fluorescencia, se ilustran en la Figura 1b y c. Los dos métodos de
relajación no radiativa más importantes que compiten con la fluorescencia se ilustran en la Figura
1b. La relajación vibracional, descrita por las pequeñas flechas ondeantes entre los niveles de
energía vibracional, tiene lugar durante las colisiones entre las moléculas excitadas y las
moléculas del disolvente. La relajación no radiativa entre los niveles vibracionales más bajos de
un estado electrónico excitado y los niveles vibracionales más altos de otro estado electrónico
también pueden ocurrir. Este tipo de relajación, en algunas ocasiones llamada conversión
interna, está descrito con las dos flechas ondeantes más largas en la Figura 1b. La conversión
interna es mucho menos eficiente que la relajación vibracional, de tal manera que el tiempo de
vida promedio de un estado electrónico excitado está entre 10-9 y 10-6 segundos. El mecanismo
exacto por el que estos dos procesos de relajación ocurren está actualmente bajo estudio, pero el
resultado neto es un pequeño aumento en la temperatura del medio.

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Figura 1. Diagrama parcial de los niveles de energía para un sistema fotoluminiscente.

La Figura 1c ilustra el proceso de relajación que se desea: el proceso de fluorescencia. La

fluorescencia se observa casi siempre desde el estado electrónico excitado más bajo E1 al estado
basal E0. La fluorescencia generalmente ocurre desde el nivel vibracional más bajo E1 hacia varios
niveles vibracionales E0, debido a que los procesos de conversión interna y relajación vibracional
son muy rápidos en comparación con la fluorescencia. Por lo tanto, un espectro de fluorescencia
usualmente consta de una sola banda con muchas líneas estrechas que representan las transiciones
desde el nivel vibracional más bajo de E1 a los distintos niveles vibracionales de E0. La línea en
la Figura 1c con la que termina la banda de fluorescencia en la longitud de onda menor o en el
lado de alta energía (λ1) es idéntica en energía a la línea marcada como λ1 en el diagrama de
absorción de la Figura 1a. Dado que las líneas de fluorescencia en esta banda se originan en el
estado vibracional más bajo de E1, todas las otras líneas en la banda tienen menor energía o mayor
longitud de onda que la línea correspondiente a λ1. Las bandas de fluorescencia molecular están
compuestas en su mayoría de líneas que tienen longitudes de onda más largas, una mayor
frecuencia y, por lo tanto, tienen menor energía que la banda de radiación absorbida responsable
de su excitación. Este desplazamiento hacia una mayor longitud de onda se llama desplazamiento
de Stokes.

Desplazamiento de Stokes
Superponiendo los espectrogramas de exitación y emisión, el desplazamiento de Stokes es la
diferencia entre las longitudes de onda de los picos de máxima intensidad, es decir, la diferencia
de energía entre el pico de excitación y el de emisión (Figura 2). Muchas especies moleculares
también presentan fluorescencia de resonancia, pero lo más frecuente es encontrar bandas de
fluorescencia o de fosforescencia molecular centradas en longitudes de onda más largas que la

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línea de resonancia. Este desplazamiento hacia longitudes de onda más largas, o menores
energías, se denomina desplazamiento Stokes.

Figura 2. Desplazamiento de Stokes.

La intensidad de fluorescencia es afectada por los siguientes factores:

- La rigidez estructural aumenta la fluorescencia.
- La temperatura aumenta la probabilidad de desactivación por conversión externa.
- La viscosidad disminuye la probabilidad de desactivación por conversión externa.
- Disolvente con átomos pesados como el tetrabromuro de carbono o el yoduro de etilo
disminuyen la fluorescencia.
- El pH de la solución puede modificar la fluorescencia de los compuestos aromáticos con
sustituyentes ácidos o básicos.
- El oxígeno disuelto disminuye la fluorescencia porque favorece el cruce entre sistemas y la
conversión de las moléculas excitadas al estado triplete.
- Una concentración elevada puede provocar auto absorción disminuyendo la intensidad de la
fluorescencia.

Fluorescencia y estructura
1) Los compuestos que contienen grupos funcionales aromáticos con transiciones π→π* de baja
energía son los que presentan florescencia más intensa.
2) Los compuestos que contienen grupos carbonilo en estructuras alifáticas y alicíclicas o
estructuras con dobles enlaces altamente conjugados, también pueden presentar fluorescencia,
pero el número de estos compuestos es pequeño comparado con los aromáticos.
3) La mayoría de los hidrocarburos aromáticos no sustituidos son fluorescentes en solución. La
eficacia cuántica aumenta con el número de anillos y su grado de condensación

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INSTRUMENTACIÓN
Los componentes de un espectrómetro de fluorescencia (o fluorómetro o espectrofluorómetro)
son muy similares a los de un espectrómetro UV-Visible. Un diagrama simplificado de los
componentes de un fluorómetro son los que aparecen en la Figura 3.

Figura 3. Componentes de un espectrómetro de fluorescencia de filtros.

Fuentes de excitación: La lámpara de tungsteno ordinaria no da suficiente intensidad para ser

utilizada en fluorescencia. Son comunes las lámparas de xenón y de mercurio. La lámpara de
xenón es más versátil que la lámpara de mercurio. La lámpara de xenón produce una intensa
radiación por el paso de corriente en una atmósfera de xenón; el espectro de este tipo de lámpara
es continuo desde aproximadamente 200 a 1000 nm con un pico de máxima intensidad a 600 nm.
Filtros y Monocromadores: Para fluorómetros de filtros se utilizan frecuentemente filtros de
absorción y filtros de interferencia. Los espectrofluorómetros generalmente utilizan rejillas de
difracción como monocromadores.
Detectores: Debido a que la señal de fluorescencia es de baja intensidad se requiere de un potente
sistema de amplificación. Por esto son preferidos los tubos fotomultiplicadores, aunque también
se usan comúnmente los fototubos en aparatos de menor precio.
Celdas: En fluorescencia se utilizan celdas de vidrio común cuando la radiación que se maneja
es de rango visible. Para ultravioleta es necesario utilizar sílice o cuarzo.

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SOBRE LOS ANALITOS DEL TP

El triptófano es un aminoácido esencial que el cuerpo humano no lo
puede producir, por lo que se debe obtener de la alimentación (Figura
4). Abunda en los alimentos como el huevo, la leche, frutos secos, carnes
y legumbres. Químicamente, contiene un grupo alfa-amino, un grupo de
ácido alfa carboxílico y un indol de cadena lateral, lo que lo convierte en
un aminoácido aromático no polar. Es uno de los aminoácidos con un
grupo R neutro y posee cadenas laterales hidrofóbicas. Figura 4. Estructura
El triptófano presenta absorción de radiación en la región UV, con dos química del triptófano.
picos de fuerte fluorescencia λex/λem = 230/348 nm y 280/348 nm.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Material, equipos y reactivos

➢ Vasos de precipitados
➢ Espectrómetro de fluorescencia Agilent Cary Eclipse (Figura 5).
➢ Triptófano (C11H12N2O2) PM = 204,23 g/mol.
➢ Agua ultra pura.
➢ Material de vidrio: vasos de precipitados, matraces aforados, varillas de vidrio, pipetas.
➢ Peras de goma.
➢ Micropipetas y puntas para micropipetas (tips).

Figura 5. Espectrofotómetro de fluorescencia Agilent Cary Eclipse.

Para el manejo del espectrofotómetro de fluorescencia se han de tomar una serie de precauciones:
- No dejar huellas en las paredes de la cubeta espectrofluorométrica. A diferencia de las cubetas
usadas en espectrofotómetros UV-Visibles, las cubetas de fluorescencia tienen sus cuatro
paredes lisas.
- Enjuagar cuidadosamente la cubeta con la disolución que va a ser medida, antes de llenarla
definitivamente.
- Realizar las medidas empezando por la disolución más diluida y acabando por la más
concentrada.

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a) Preparación de soluciones:
- Preparar una solución madre de triptófano de 500 mL 25 µM.
- Preparar por dilución las soluciones patrón a partir de la solución madre de triptófano
mezclando:
• Patrón 1: 15 mL de agua ultrapura con 5 mL de solución madre.
• Patrón 2: 15 mL de agua ultrapura con 3 mL de solución madre.
• Patrón 3: 15 mL de agua ultrapura con 1 mL de solución madre.
• Patrón 4: 15 mL de agua ultrapura con 0.5 mL de solución madre.
• Patrón 5: 15 mL de agua ultrapura con 0.25 mL de solución madre.
- Calcular la concentración de triptófano en cada patrón.

b) Obtención de espectros:
- Realizar el blanco usando agua ultra pura.
- Obtención del espectro de excitación. Analizar con el espectrofotómetro de fluorescencia el
Patrón 3 de triptófano y obtener su espectro de excitación.
- Identificar la longitud de onda de máxima excitación, λex (es decir, la longitud de onda a la cual
el analito es más sensible a la radiación.). Presentar el gráfico del reporte indicando el máximo
de excitación considerado.
- Obtención del espectro de emisión: Analizar con el espectrofotómetro de fluorescencia el
Patrón 3 de triptófano y obtener su espectro de emisión.
- Identificar la longitud de onda de máxima emisión, λem (es decir, la longitud de onda a la cual
la emisión de radiación del analito es más fuerte). Presentar el gráfico del reporte indicando el
máximo de excitación considerado.
- Calcular el desplazamiento de Stokes a partir de los dos espectros (excitación y emisión).

c) Calibrado:
- Analizar las soluciones patrón de triptófano y registrar la intensidad de fluorescencia a las
longitudes de onda seleccionadas (λex y λem).
- Representar gráficamente la calibración hallando la recta que mejor se ajusta a los puntos de
calibrado. Indicar la ecuación de la curva de calibración y su coeficiente de determinación (R2).

d) Medición de la muestra:
- Analizar la muestra con el espectrofotómetro de fluorescencia y medir la intensidad de
fluorescencia a las longitudes de onda seleccionadas (λex y λem).
- Calcular la concentración de triptófano en la muestra con el valor de intensidad de fluorescencia
aplicando la ecuación de la curva de calibración.

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e) Informe:
- Elaborar el informe con los cálculos, gráficos y fotos del práctico. Incluir una conclusión.

CUESTIONARIO
1. Mencionar las aplicaciones más importantes de la espectroscopia de fluorescencia molecular.
2. ¿Por qué las mediciones deben realizarse a 90°?
3. ¿Qué características tienen las cubetas de espectroscopia de fluorescencia molecular?
4. ¿En qué caso es conveniente usar métodos de absorción y en qué caso usar métodos de
fluorescencia?
5. Explique el fenómeno de auto absorción en la técnica de espectroscopia de fluorescencia
molecular y por qué debe evitarse.

REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA BÁSICA

• Skoog, D. A., Holler, F. J. N. T. A., & Timothy, A. D. A. (2001). Principios de análisis
instrumental (No. 543.4/. 5). McGraw-Hill Interamericana de España.
• Yang, H., Xiao, X., Zhao, X., & Wu, Y. (2017). Intrinsic fluorescence spectra of tryptophan,
tyrosine and phenyloalanine. Proc.SPIE, 10255, 102554M.
https://doi.org/10.1117/12.2268397.

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