Diagnostico Molecular

El diagnóstico molecular es un área encargada de la detección y cuantificación especifica de material genético en

una muestra biológica que tiene una gran importancia en el área de infecciones y el cáncer.

ADN y ARN

Los ácidos nucleicos, macromoléculas compuestas de unidades llamadas

nucleótidos, existen de manera natural en dos variedades: ácido
desoxirribonucleico (ADN) y ácido ribonucleico (ARN). El ADN es el
material genético de los organismos vivos, desde las bacterias unicelulares
hasta los mamíferos multicelulares como tú y yo. Algunos virus usan ARN, no
ADN.

En eucariontes, como plantas y animales, el ADN se encuentra en el núcleo, dentro de la membrana o en distintos
organelos como la mitocondria o cloroplastos. En procariontes, como las bacterias, el ADN no está encerrado en
una envoltura membranosa, aunque sí se encuentra en una región especializada de la célula llamada nucleoide.

Para la codificación de proteínas se necesita del ARN, que se forma mediante una transcripción de ADN a ARN,
este se conoce como ARNm (mensajero) y sirve como mensajero entre el ADN y los ribosomas, también está el
ARNt (transferencia), que lleva los aminoácidos al ribosoma.

Un ARN de transferencia (ARNt) es un tipo especial de molécula de ARN. Su función es

hacer corresponder un codón del ARNm con el aminoácido para el cual codifica. Cada
ARNt contiene un conjunto de tres nucleótidos conocido como anticodón. El anticodón
de un ARNt puede unirse a uno o unos pocos codones específicos del ARNm. La
molécula de ARNt también lleva un aminoácido: concretamente, el que está
codificado por los codones a los cuales se une el ARNt.

También tenemos el ARNr (ribosomal), este se combina con proteínas para producir ribosomas.
Extracción y análisis de ácidos nucleicos

Para el estudio de ácidos nucleicos como ADN y ARN, estos se deben aislar del resto de componentes celulares
como tejidos, lípidos y proteínas. En el caso de extracción de ARN se realiza para estudios de niveles de expresión
génica (ARNm), y para el caso de ADN es para la búsqueda de modificaciones o alteraciones genéticas.

Para esta extracción debemos tener condiciones que garanticen la calidad e integridad de los ácidos nucleicos

- Integridad del ácido nucleico, es que la molécula este completa.

- Para la toma de sangre debemos utilizar tubo de tapa morada (EDTA).
- Pureza: acido nucleico no contaminado por ninguna proteína, lípido u otro ácido nucleico.

Hay 3 fases para garantizar la toma correspondiente de ácidos nucleicos.

1. Fase pre-analítica:
- Manipulación y toma de muestra.
- Anticoagulante empleado.
- Transporte y conservación de la muestra.
2. Fase analítica:
- Extracción.
- Análisis genético.
- Datos e informe de resultado.
3. Fase post-analítica:
- Validación del informe.

Objetivo de la extracción y purificación del material genético

Primero es obtener la mayor cantidad de ADN o ARN y que este tenga un alto peso molecular, esto quiere decir
que la molécula este con alto grado de pureza y sin presencia de contaminantes como proteínas, fenol, sales e
inhibidores de enzimas.

Manejo de muestras

- Selección de la muestra ¿Qué muestra debo tomar?

➢ Saber identificar el tipo de ácidos nucleicos a estudiar en este caso puede ser el acido nucleico del
individuo (estudio genómico) o si se va a detectar ácidos nucleicos exógenos (ADN o ARN de un
virus).
➢ En el estudio de estructura genómica se utiliza ADN extraído de leucocitos de sangre periférica, este
puede ser utilizado en el caso de querer identificar:
• Mutaciones: Fibrosis quística, hemofilia, distrofia muscular.
• Polimorfismos: Diabetes, cirrosis, cáncer, distrofia muscular.
➢ Para un análisis más espacial temporal, es decir para ver la expresión génica que puede ser asociada
a una patología, esto se asocia a ARNm, obtenido desde los leucocitos de suero, biopsia o liquido
sinovial, este estudio puede ser utilizado en el caso de querer identificar:
• Diabetes, Cirrosis, cáncer, obesidad y artritis.
➢ Si se quieren detectar genomas extraños, que dependen de la historia natural del virus infectante,
se debe ver si se extrae ADN o ARN exógeno. Se puede obtener de los leucocitos de suero, exudado
vaginal, LCR.
• Si es una bacteria, se extrae ADN.
• Si es un virus, se extrae ARN o ADN.
• VPH, VIH, M. tuberculosis, etc.
• En el caso de un virus respiratorio se debe ocupar muestra nasofaríngea.
 Estudio de ácidos nucleicos
de un individuo

Expresón de sus genes

Estructura genómica (ARN) Ácidos nucleicos exógenos

ARNm
ADN genómico (núcleo) ADN o ARN exógenos

La muestra de elección Primero se debe conocer la

Procedimiento menos dependerá del tejido donde
invasivo y la menor historia natural del
se exprese el gen de interes: microorganismo para ver si
cantidad de riesgos e
incomdidad para el paiente. se quiere obtener ARN o
ADN

- Leucocitos, es sangre
Sangre periferica con periferica con
anticoagulante (Globulos anticoagulante.
blancos, globulos rojos y - Hígado, se realiza una
plaquetas). biopsia de higado.
- Tejido tumoral, se realiza
una bipsia del tejido
sospechoso.

Leucocitos de sangre
periferica.
- Toma de la muestra ¿Cómo debe tomarse la muestra?

➢ Uso de material libre de nucleasas (230° C durante 8 horas para inactivar nucleasas).
➢ Nucleasas: enzimas que degrada ADN y ARN. ARNsas degradas ARN y ADNsas degradan ADN.
➢ Durante el proceso de extracción se utilizan ADNsas y ARNsas para eliminar los ácidos nucleicos
interferente, pero por lo general todo es libre de nucleasas.
➢ Uso de guantes y mascarillas, esto se debe a que nosotros tenemos nucleasas en el sudor y en la saliva.
➢ Limpieza total.
➢ Anticoagulante, para sangre periférica se utiliza el tubo de tapa lila (EDTA) o citrato de sodio (si es que
el proceso no esta asociado a una PCR). No se recomienda heparina ya que esta interfiere en la PCR
(reacción en cadena de polimerasa).
➢ El EDTA utilizado como anticoagulante lo que hace es eliminar el calcio e inhibir la acción de las
enzimas necesarias en la coagulación.
➢ La heparina va a inhibir que la protrombina pase a trombina, inactivando el proceso de coagulación.
➢ Se debe evitar la hemolisis, ya que la hemoglobina es un inhibidor de acciones enzimáticas que se
utilizan para los análisis posteriores.
➢ ADN o ARN desde leucocitos: sangre periférica en un tuvo nuevo con EDTA o citrato.
➢ En el caso de ADN la muestra puede estar guardada por 5 días a 4°C sin que altere la cantidad de ADN
de manera significativa.
➢ En el caso de ADN o ARN de suero, se deben tomar 3 ml de sangre periférica y se deja el tiempo necesario
a T° ambiente o en la centrifuga para la formación del coagulo. Al estar el coagulo ser separa el suero en
un tubo diferente y limpio y desde aquí se extrae el ácido nucleico. El suero se puede guardar a -20°C
hasta el momento de procesarlo.
➢ En el caso de biopsias la toma de muestra la realiza un medico al ser un proceso muy invasivo. A veces
se ocupan biopsias en tacos de parafina.
➢ Otros fluidos biológicos, la orina no sirve debido a que no tiene células a no ser que este en un estado
patológico, el LCR es una muestra critica que se obtiene con una punción lumbar, que en condiciones
patológicas se ve más turbia por la presencia de células, esta se ocupa para ver patologías de LCR y
marcadores tumorales. El semen se puede obtener de manera directa del paciente, si son estudios de
tracto genital o marcadores de fertilidad, también se puede obtener de manera indirecta por aspiración
desde la vagina, esto sirve para investigación, con un tiempo máximo de 1 hora después de la toma,
debido a ala importancia en la investigación.
➢ Algunos ejemplos de tejidos para la obtención de muestras:

➢ Los huesos, pulpa de los dientes o medula de los huesos, nos pueden ayudar para identificar un cadáver.
➢ Los tejidos incluidos en parafina son biopsias para poder guardarlas, con el microtomo se cortan y se
hace un proceso para eliminar la parafina y poder quedarnos con el tejido y de ahí realizar el proceso de
extracción.
➢ El tejido hepático es alto en DNA, el tejido muscular es pobre en ADN.
- Preservación ¿Qué variantes afectan la estabilidad de los ácidos nucleicos?

➢ La preservación es un proceso dirigido a inactivar las nucleasas.

➢ Una vez que aislamos el ADN se puede mantener a 4°C por varias semanas, a -20°c durante meses y
a -70°C durante años.
➢ Si hay mucho ADN se debe alícuotar, es decir 50 ul en varios tubos de 5 ul.
➢ Las biopsias se pueden ultracongelar a -80° o en nitrógeno liquido a -180°.
➢ En caso de fluidos biológicos, si la molécula de interés es ARN se debe mantener a -70°C y también
se debe alícuotar.
➢ En el caso del ADN de leucocitos, las muestras de sangre se pueden mantener a 4° durante varios
días y de manera indefinida a -70°C.

Contaminación de muestras y degradación

Los problemas de contaminación que hay en los procesos de extracción o preservación, hay dos problemas
comunes:

1. Contaminación con nucleasas.

2. Contaminada con ácidos nucleicos exógenos.

En caso de contaminación de muestras, los resultados no son de fiar y

podemos hablar de:

➢ Falso positivo: si la muestra se contamina con otra.

➢ Falso negativo: ocurre cuando el ADN o ARN presente se degrada por
la acción de nucleasas, lo que los convierte en indetectables a la
sensibilidad del método molecular utilizado.

Extracción y purificación de ADN

El proceso de obtención del ácido nucleico, específicamente el ADN, se divide en dos grandes procesos:

1. Extracción
• Lisis celular
• Inactivación de nucleasas
• Clarificación
2. Purificación: se debe separar el acido nucleico de los restos celulares
• Proteínas
• Otros ácidos nucleicos
• Lípidos, carbohidratos, sales, etc.

Al terminar el proceso debemos tener solo el ácido nucleico de interés.

Todos los procesos deben estar asociados a inactivación de nucleasas, soluciones estériles y guantes de nitrilo, ya
que el talco es contaminante.

Etapas de la extracción de ADN

Lisis celular

Nos centramos en la ruptura de la membrana celular y la membrana nuclear en el caso de las eucariotas, en el
caso de procariotas es solo la pared celular. El objetivo es romper la célula para obtener el ácido nucleico de
interés.

Hay distintas técnicas para realizar el proceso de lisis, cuando se utiliza un tejido se debe romper este tejido, este
tejido se mantiene “pegado” mediante uniones estrechas (oclusivas), de anclaje, GAP. Para esto se deben romper
estas uniones, es decir, disgregar el tejido. Esto se puede hacer con un mortero o sonicación (técnica de lisis
ampliamente utilizada como método establecido y fiable de disrupción celular y extracción de material
intracelular).
Si la muestra tiene solo células, como la sangre periférica no es necesario disgregarla.

Se pueden utilizar detergentes para solubilizar las membranas celular y nuclear, también se pueden utilizar
soluciones hipotónicas para hinchar la célula y romperla.

Disrupción enzimática /lisozimas, estas se utilizan principalmente para romper la pared, estas se ocupan
principalmente para procariotas.

* Quelantes: los quelantes inhiben la acción debido a que atrapa cationes, el EDTA atrapa cationes de magnesio
y este es un cofactor de las DNAsas. El Dietilpirocarbonato (DEPC), las RNAsas no utilizan cofactores, lo que
hace el DEPC es unirse a una histidina en el centro activo de RNAsas por lo tanto impide que actúe.

Clarificación

Al realizar el proceso de lisis quedan restos de células en el tubo, aquí viene el proceso de clarificación, esta se
realiza por centrifugación y va a precipitar todo lo que sea muy pesado.
Purificación

La purificación consiste en eliminar todas las moléculas interferentes y quedar solo con el ácido nucleico de
interés. Se puede utilizar:

1. Separación de proteínas y lípidos: soluciones saturadas de sales (efecto Salting out), se deshidratan las
proteínas. Fenol cloroformo es un método de solventes orgánicos también utilizado para la
precipitación de proteínas.
2. Precipitación: se realiza con etanol o isopropanol en relación 2:1 o 1:1 acompañado de bajas T° (-70°C),
además del etanol al 70% y centrifugación para la eliminación de exceso de sales (ADN en el
precipitado).
3. Resuspensión: tampón TE (Tris-EDTA) o agua destilada estéril.

Salting out o método de Lahirí

El salting out es una técnica de extracción de proteínas que consiste en concentrar la fase liquida tanto como sea
requerido para que las proteínas se precipiten, lo que se produce es que, al solubilizar la sal, esta se rodeade agua,
limitando las moléculas que solubilizan a las proteínas, logrando que al final, no haya moléculas disponibles de
agua precipitando las proteínas. La característica que deben de tener la fase liquida es que sea polar para poder
disolver la sal.

Desde el paso 2 al 4 se utilizan inactivadores de nucleasas o todo libre de nucleasas.

Estos métodos enzimáticos van de la mano con un proceso químico, es por esto que se utilizan 2 detergentes para
llegar a la precipitación de ADN

En el paso 1, se utiliza el Reactivo de Lahirí 1: En conjunto con trito x-100 se realiza la lisis celular (glóbulos
rojos), en este paso se libera hemoglobina, la cual es interferente para precipitar el ADN.

En el paso 4, se utiliza el Reactivo de Lahirí 2: En conjunto de SDS se realiza la lisis celular (leucocitos), este
paso es crítico, ya que se debe eliminar la hemoglobina del pellet del cual se realizará la extracción del ADN. El
NaCl 6 M es una sal caotropica (aumenta la fuerza iónica), de esta manera la solución de NaCl elimina el agua
de las proteínas, las cuales, al deshidratarse, comienzan a interaccionar hidrofobicamente y formar agregados,
permitiendo separarlas del ADN mediante precipitación (proteínas en el precipitado y ADN en el sobrenadante).
Las proteínas al deshidratarse pierden el agua al estar frente a una solución muy saturada de sal, estas solvatan a
los iones. Las proteínas pierden la esfera de solvatación, se vuelven insolubles, se comienzan a disgregar y
precipitan.

En el paso 7, se utiliza isopropanol

o etanol absoluto frío, disminuye la
solubilidad del ADN,
deshidratándolo, permitiendo que
precipite, esto se debe a que los AN
son insolubles en soluciones
alcohólicas. Cuando se emplea
etanol (EtOH), la cantidad que se
requiere para la precipitación es dos
veces el volumen de la fase acuosa,
mientras que con isopropanol
(IprOH) se demanda solamente 0.7
veces el volumen de fase acuosa.
Extracción orgánica

La extracción orgánica utiliza una mezcla de solventes orgánicos en distintas proporciones como cloroformo
/fenol (25:1) o cloroformo/ alcohol isoamílico (24:1). Estos desnataran las proteínas.

El fenol o el alcohol isoamílico desnaturalizan las proteínas contaminantes de la muestra, siendo esta su función.

Cloroformo: permite la separación de las fases; el ADN queda en la fase acuosa y en la fase orgánica quedan
proteínas y otros contaminantes.

Para precipitar la molécula de interés se debe ocupar etanol (2:1) o isopropanol (1:1), estos siempre se acompañan
de bajas temperaturas, el etanol o isopropanol debe haber estado previamente a -20°C, con esto quitamos la
esfera de solvatación al ADN y luego lo precipitamos.

Al tener el precipitado, se hace un lavado con etanol al 70%, de 100ml 70ml corresponden a etanol y 30ml a agua,
siendo el agua capaz de solubilizar las sales que estaban interfiriendo.

Purificación de ácidos nucleicos por precipitación salina diferencial

Se puede separar el ADN y el ARN utilizando una diferencia de solubilidad, precipitación Salina diferencial.

EL ARN y DNA son soluciones que tienen una alta concentración de sal, el ARN es el único soluble en altas
concentraciones de sal. Si bajamos la sal el ADN se vuelve insoluble y el ARN sigue soluble, si se centrifuga va a
precipitar RNA, pero va a seguir soluble.

Es más fácil agregar una RNAsa o DNAsa para eliminar el acido nucleico no deseado.
Columnas de Silica (kit comercial)

Este es el método con menos riesgo de contaminación.

Este procedimiento se basa en adsorción y desorción, es un fenómeno de superficie, donde DNA se une a la
superficie de algo. Este proceso se realiza en presencia de sales caotropicas (aumento de la fuerza iónica).

El DNA tiene una esfera de solvatación, el grupo fosfato de su estructura al ser negativo va a hacer que el agua se
sienta atraída y es por esto que al estar presente una sal caotropica, se le quita la esfera de solvatación y el ADN
queda libre, para que este puede interactuar directamente con la columna.

Una vez que se le quita la esfera de solvatación de DNA, de alguna manera el DNA se va a unir a la columna, de
esta manera se purifica.

Una vez que se hace la lisis celular, este lisado se coloca dentro de la columna, centrifugo y pasa todo excepto el
DNA que queda pegado en la columna. Luego se lava para quitar restos de hemoglobina y después se debe soltar
el DNA de la columna, para esto se devuelve la esfera de solvatación. Durante el proceso de elución se puede
utilizar agua libre de nucleasas o tampón PE, esto entrega nuevamente la esfera de solvatación a la molécula de
DNA.

Métodos de extracción para ARN

Para la extracción de ARN el trabajo es similar, pero necesita ciertos puntos distintos, como

• Se debe trabajar siempre a 4°C, es decir todo el procedimiento se realiza en hielo, esto se debe a que el
RNA es una molécula muy inestable.

El único método que se utiliza para la extracción de RNA es el método de extracción orgánica.

Siempre se van a utilizar inhibidores de RNAsas, ya que es muy sensible a la acción de RNAsas. El inhibidor de
ADNsas es el DEPC 0,1% exógenas.

La inhibición de las RNAsas endógenas, al momento de aislar el ARN, se realiza con desnaturantes fuertes, ya
que estas enzimas se caracterizan por ser termoestables, es decir, resisten la desnaturación por calor y además
no utilizan cofactores ni quelantes.

La extracción con cloroformo y fenol se hace a un pH ácido (entre 4 y 5), condiciones en las que el DNA ya no se
mantiene en la fase acuosa, sino que se distribuye hacia la fase orgánica o la interfase, al igual que las proteínas.

El isotiocianato de guanidina es un potente desnaturalizante de proteínas con capacidad de inhibir ARNsas.

Los solventes orgánicos juntos con el DEPC, es lo que se utiliza para denaturar las proteínas, inhibir las RNAsas
y hacer el proceso de extracción de ARN.

El ARN nos va as permitir evaluar expresión génica (RNAm), pero el RNA no sirve para ningún proceso anterior
debido que es muy fácil de degradar y no es capaz de resistir una T° mayor para hacer una PCR.
Tenemos RNAm, RNAt, RNAr. Pero solo sirve el
RNAm, para esto debemos transformarlo en
ADNc (codificante), aquí tenemos toda la
información codificante ya que aquí sacamos todos
los intrones. Para esto utilizamos una
transcriptasa inversa que es una DNA polimerasa
dependiente de ARN y además se utiliza un primer
de oligo dT, es decir son muchas timinas juntas,
esto se debe a que este primer se une por
complementariedad a la cola poliA del RNAm, una
vez que se une el oligo dT, se va a unir la transcriptasa inversa y va a copiar RNAm, pero utilizando
desoxirribonucleótidos (adenina-guanina-citocina-timina). Una vez que realiza la copia, se obtiene una
molécula hibrida con una hebra de RNA y una de DNA, se degrada el RNA mediante una solución alcalina y se
va a realizar la complementaria de la mono hebra de ADN y esto lo realiza la polimerasa que lee y realiza el
complementario.
Evaluación de pureza e integridad del ADN extraído

Objetivos

• Adquirir destrezas prácticas en la cuantificación de ADN por distintos métodos.

• Análisis comparativo de los métodos de cuantificación de ADN: ventajas y desventajas.
• Adquirir destrezas prácticas de las técnicas para evaluar cualitativamente el ADN extraído.
• Análisis del ADN extraído en prácticos anteriores en relación con la cantidad obtenida, calidad y
contaminación.

Cuantificación de los ácidos nucleicos

Ya sea AND, ARN o ADN en monohebra.

Se utilizan dos métodos, la espectrofotometría o fluorimetria. En la espectrofotometría es donde se ocupa como

fundamento un haz de luz por parte de la estructura química de una molécula, un AN consiste en una base
nitrogenada, una pentosa y los grupos fosfato, varían en el ADN y ARN. En el rango ultravioleta la estructura que
absorbe luz son las bases nitrogenadas, tanto el ADN y el ARN absorben luz en una onda analítica máxima de
260 nm. En el espectrofotómetro se mide la absorción a 260nm y con eso realizamos la cuantificación y
utilizamos esta una formula. Este método no es especifico.

El resultado de la formula va a ser la concentración del acido nucleico que se midió.

Depende de la molécula que querramos cuantificar, es el factor que utilizamos.

El tipo de AN es muy importante para la cuantificación. Esto se debe a que ADN o ARN se mide a la misma onda
analítica y en caso de no haber realizado bien el proceso previo, esto nos ayuda a distinguir.

La fluorimetria es un método especifico ya que tiene un kit especifico para el AN de interés. Es menos susceptible
a las proteínas o otros contaminantes, ya que es muy especifico solo va a cuantificar por ejemplo ADN. Tiene una
desventaja, es que no vamos a poder obtener información sobre la pureza, porque por ejemplo si hay interferentes
proteínas, a través de la espectrofotometría si se pueden evaluar los contaminantes, pero en la fluorimetria no se
puede. En que consiste la fluorimetria, es un kit donde se hace una muestra según el inserto y tiene 2 STD y nos
ayuda a hacer una curva de calibrado con el punto mínimo y con el punto máximo que es capaz de cuantificar,
nosotros entregamos todos los datos que estamos pidiendo cuanto volumen estamos midiendo con el factor de
dilución, nos da inmediatamente el valor de la concentración del AN que se está cuantificando.

En el laboratorio se utiliza Qubit, donde después de seguir todo el protocolo del Kit, colocamos el cubito y nos
entrega la concentración.
Valoración de la pureza del ácido nucleico extraído (cuantitativo)

Para evaluar la pureza del ADN, es decir, ver que tan contaminado esta con otras moléculas que pueden interferir
en los procedimientos posteriores. Ojo ningún proceso nos va a permitir que no haya ninguna molécula externa,
siempre hay algo que contamina, es por esto que hay índices que nos indican si esta dentro de un rango que se
considera optimo.

Contaminación por proteínas (260:280) (cualitativo)

Las proteínas absorven a 280nm, por lo que es muy cercano a los 260 del ADN. De la proteína la estructura que
absorbe la luz son los aminoácidos aromáticos a 280nm.

Con el índice de pureza nos referimos a la relación matemática que existe entre la abs a 260nm:280 nm

• Para ADN lo optimo es 1.8

• Para ARN lo optimo es de 2.0

La variación entre ambos se debe a la base nitrogenada, el uracilo es capaz de absorber más luz a 260 que la
timina.

¿Qué pasa si el índice es menor?, por ejemplo, si para ADN el índice es 1.5, el valor que se ve alterado es la
absorbancia a 280nm. Por lo que hay mayor cantidad de proteínas de lo que se considera optimo. Los mismo
sucede si en el ARN el índice es por ejemplo 1.8, hay mayor cantidad de proteína.

¿Qué pasa si el índice es mayor?, por ejemplo, si para el ADN el índice es 2.1, el valor que se ve alterado es a
260nm, esto se debe a que hay dos monohebras, si hay una absorción mayor se habla de que la doble hélice se
abre y las bases nitrogenadas quedan más expuestas, por lo que absorben más luz.

Contaminación con Fenol (260:270) (cuantitativo)

El fenol se utiliza solo en los métodos de extracción orgánica, pero no en todos porque en la extracción de AdN
bacteriano se utiliza el cloroformo en relación con el Alcohol isoamílico. Pero cuando se utkliza el método
orgánico para la extracción de ADN genomico se utiliza la formula cloroformo fenol.

El fenol tiene un anillo, tiene un máximo de abs a 270nm, aún absorbe algo de luz que puede sobreestimar la
absorción a 260nm. Entonces si se mide a 260 el ADN y hay contaminación de fenol vamos a tener como resultado
la absorbancia de los dos, por eso se sobrestima el valor de la concentración.

Índice optimo 260:270 lo optimo es 1.2

Si es menor, hay una contaminación considerable de fenol y puede estar sobrestimando la concentración.

Contaminación con sales de fenol y sales (260:230) (cuantitativo)

Iones fenolatos o tiocianatos, péptidos, compuestos aromáticos u otras sustancias absorven a 230nm.

El índice debe estar entre 2.0 -2.2 para confirmar que esta dentro del rango de pureza.

Evaluación de la integridad del ácido nucleico extraído (cualitativo)

Con esto nos referimos si no hubo acción de alguna nucleasa durante el proceso. Esto se ve mediante una
electroforesis.
Electroforesis

La electroforesis en gel es una técnica utilizada para

separar fragmentos de ADN según su tamaño.

Las muestras de ADN se cargan en pozos (ranuras)

en un extremo de un gel y se aplica una corriente
eléctrica para arrastrarlas a través del gel.

Los fragmentos tienen carga negativa, por lo que se

mueven hacia el electrodo positivo. Puesto que todos
los fragmentos de ADN tienen la misma cantidad de
carga por masa, los fragmentos pequeños atraviesan el gel más
rápido que los grandes.

Cuando un gel se tiñe con un pigmento que se une al ADN, los

fragmentos de ADN pueden verse como bandas, las cuales
representan un grupo de fragmentos de ADN del mismo tamaño.

La electroforesis es la separación de las moléculas dependiendo de

su tamaño en una matriz porosa. Estas moléculas están cargadas y
se mueven de un polo + (cátodo) a uno negativo (ánodo). El ánodo
atrae aniones y el cátodo atrae cationes.

Si la electroforesis es para proteínas o AN, en el caso de las proteínas

se hace un tratamiento con SD para cargarlas negativamente, pero
en el caso del ADN o ARN, el fosfato de su estructura ya le otorga la
carga negativa.

Migran más las que tienen menor tamaño, porque son capaces de
migrar por los poros, mientras mayor sea el peso molecular menos
migran y quedan más cerca del pocillo.

Es importante que para electroforesis se ocupe un Ladders, que es

un patrón de pesos moleculares.

¿Qué se utiliza para la electroforesis?, se utiliza una cámara de

electroforesis, la peineta para formar los pocillos donde se cargan las
muestras, un buffer de corrimiento que es el mismo donde se
preparan el gel, el marcador de pesos moleculares y el buffer de
carga. Una fuente de poder y un transiluminador que es donde se
visualiza la electroforesis.
Cámaras electroforéticas

Verticales: migración de arriba hacia abajo.

En las cámaras de electroforesis vertical el corrimiento de la muestra sigue la gravedad,

ya que el polo positivo de encuentra en la parte inferior de la cámara

Horizontales: deben ir del ánodo al cátodo, para que las moléculas migren.

En la electroforesis horizontal debe cuidarse que el ánodo se coloque hacia el extremo

del gel donde corren las muestras, de lo contrario las muestras se salen del gel.

En el caso del laboratorio utilizamos la cámara horizontal.

¿Qué pasa si se colocan las muestras al revés? Las muestras se van a salir y no van a ir hacia el anodo

Gel de Agarosa

La matriz porosa que se utiliza es la agarosa, también se puede utilizar la acrilamida, aunque esta es toxica.

La agarosa es un polisacárido extraído de algas marinas que tiene la propiedad de mantenerse en estado sólido a
temperatura ambiente, que se disuelve fácilmente en temperatura de 50 a 60ºC, se torna líquida y se solidifica
cuando se enfría formando un gel altamente poroso. Para elaborar el gel se pesa la cantidad de agarosa requerida,
se disuelve en una solución amortiguadora adecuada de la misma composición y concentración que el buffer de
corrida y se calienta hasta formar una solución. Sin dejar enfriar se vacía inmediatamente sobre un molde de
forma rectangular y en uno de los extremos se coloca un aditamento en forma de peine con la finalidad de generar
los pocillos u orificios donde se colocarán las muestras.

La agarosa posee ventajas sobre la acrilamida, ya que no es un compuesto tóxico

y permite realizar el análisis de ácidos nucleicos con pesos moleculares variados,
según la concentración de agarosa que se emplee. Sin embargo, su poder de
resolución es menor que el de los geles de poliacrilamida.

La concentración de agarosa se escoge según el tamaño del ácido nucleico que

se vaya a analizar

El tamaño de los poros de la matriz del gel depende de la

concentración de agarosa utilizada y la concentración de agarosa es
inversamente proporcional al tamaño del poro obtenido; esto es, a
mayor concentración, menor tamaño de los poros, y viceversa,
si los poros son pequeños la migración del ácido nucleico es más lenta.

Durante la electroforesis, los ácidos nucleicos lineales con un peso

molecular alto migran al ánodo más lentamente que los de menor peso
molecular. Esto se debe a que los ácidos nucleicos de peso elevado
tardan más tiempo en atravesar los poros de agarosa.

Los AN se miden como pared de bases, donde 10 pares de base son 20

nucleótidos, 100 pares de bases son 100 nucleótidos.

Buffer de corrida o de corrimiento

El buffer de corrimiento es de la misma composición y pH que el buffer con el que se prepara el gel de resolución,
ya sea de agarosa o de acrilamida. Éste proporciona el medio para la transmisión de la corriente eléctrica y
mantiene el pH sin variaciones mientras se realiza el corrimiento. En el caso de los ácidos nucleicos, pueden
emplearse TBE o TAE como buffer de corrimiento. El buffer TBE contiene Tris base, ácido bórico y EDTA, y se
maneja a un pH de 7.2. El buffer TAE contiene Tris base, ácido acético y EDTA, ajustado a pH 8.5.

El TBE nos permite tener mejor resolución de fragmentos más pequeños, con el TAE se trabaja para ver integridad
del material genómico y el TBE para PCR y separar moléculas más pequeñas.
Marcador de peso molecular

Son moléculas de ADN o de proteínas que permiten determinar por

comparación el tamaño de los fragmentos de ácidos nucleicos o proteínas
contenidos en las muestras sometidas a electroforesis.

Siempre al hacer un gel de agarosa debe ir un marcador de peso molecular,

por lo general estos son fagos o plásmidos que fueron digeridos con enzimas
de restricción.

Como se tiene el mapa de restricción (donde corta la enzima y que

fragmento genera), estos se utilizan y se puede ver el tamaño de los
fragmentos que se van a obtener.

El marcador en una corrida electroforética puede tener 2 funciones.

1. Validar la corrida electroforética: por ejemplo, no ver nada en

la muestra, pero el marcador se ve clarito, el problema fue la
muestra. Pero si no vemos el marcador es un problema de la
corrida electroforética.
2. Estimar el peso molecular de alguna banda: se tiene el
marcador de pesos molecular, la muestra no se sabe el tamaño que
tiene y se ve cercano a los 500-600 pares de bases.

Transiluminador ultravioleta

Al gel de agarosa al momento de prepararlo se le agrega un intercalante de

AN, este es una molécula que se coloca en el surco mayor o en el surco
menor o se une principalmente a los nucleótidos. Cuando es irradiada por
luz ultravioleta esta fluoresce y se puede visualizar.

Si se olvida agregar el intercalante, se puede preparar una solución parte

con el intercalante y se deja incubando. Esto antes se hacia con el bromuro
de etidio, pero al ser muy toxico se dejo de utilizar. Ahora se ocupan
intercalantes comerciales no tóxicos.

El transiluminador es una placa donde sobre esta se coloca el gel de agarosa

y se pueden ver las bandas. Entonces el transiluminador lo que hace es
emitir luz UV.

En general emiten energía a una longitud de onda a 302 nm, aunque

también existen para 254 y 365 nm; y suelen contar con un botón para baja/
alta intensidades por si se requiere una menor exposición de la muestra a
la luz ultravioleta.
Evaluación de la integridad del ácido nucleico extraído (DNA)

El ADN genómico, se espera ver una banda intensa lo más arriba posible, generalmente más arriba que el
marcador de pesos moleculares.

Si se comienza a ver un chorreado, el DNA esta degradado y no sirve. Esto se ve porque hubo degradación de
nucleasas y lo que se ve son pedacitos de fragmentos que no son tan grandes como para formar ADN. Mientras
más gruesa e intensa sea la banda, más molécula hay.

Se cuantifica y se ve la pureza. En un gel de agarosa NO se ven proteínas, ni contaminación, a menos que

sea de otro acido nucleico. Por ejemplo, se busca DNA y se ve puede ver ARN.

La integridad es importante para el ADN, es decir el que esta más condensado y sin “chorreado”.

Una vez que los fragmentos se han separado, se puede examinar el gel
y saber el tamaño de las bandas que se encuentran en él. Cuando un
gel se tiñe con un pigmento que se une al ADN y se coloca bajo luz UV,
los fragmentos de ADN brillarán, lo cual nos permite ver el ADN
presente en distintos lugares a lo largo del gel.

La banda 6 es la que se encuentra más integra, por lo que es la banda

que corresponde.

Cuando se tiene un RNA intacto, se esperan ver estas bandas que

corresponden a las 2 subunidades de los RNAribosomales, el 18S y
28S, si estas bandas se ven nítidas, el RNA esta integro.

Evaluación de la integridad del ácido nucleico extraído (DNA plasmidial)

Cuando se hace la extracción de ADN bacteriano debemos tener en cuenta que este plásmido es circular y se
puede encontrar en diferentes maneras y se pueden encontrar hasta 3 bandas distintas.

Las formas de encontrar el plásmido bacteriano pueden ser:

• Circular relajado: La doble cadena fue cortada. Es la

primera banda que se visualiza. Sobreestimación menor a
la subestimación del superenrollado.
• Superenrollado: cuando el plásmido esta superenrollado
se achica y migra más. Es la tercera banda que se visualiza.
• Lineal: esto quiere decir que la doble cadena fue cortada en
un punto y quedo lineal. Es la segunda banda que se
visualiza.

A pesar de que estas tres estructuras tienen el mismo tamaño molecular, no tiene el mismo movimiento
migratorio. Donde el tamaño puede variar al que en realidad es, la única estructura que nos da el tamaño real de
un plásmido es el Lineal.
Enzimas de restricción

Enzimas de restricción: son de origen procarionte, vienen desde las bacterias.

Son nucleasas, es decir, son capaces de cortar ácidos nucleicos y son
fosfodiesterasas, cortan el enlace fosfodiéster y de esta manera degradan los
ácidos nucleicos.

Posición del corte respecto a la cadena: Las hebras tienen dos extremos uno 5´y
otro 3´

• Endonucleasas: cortan dentro de la cadena alejadas de los extremos.

• Exonucleasas: cortan los enlaces fosfodiéster que están más a los
extremos.

Posición del corte con respecto al fosfato: Actúan sobre uno de los dos enlaces
éster que forman el fosfodiéster (3´ o 5´)

• Tipo A: rompen el extremo del 3´ P entre 3`-OH y P. Dejan un extremo O libre.

• Tipo B: rompe el extremo 5´. P entre 5`-OH y P. Dejan un extremo OH libre.

Reconocimiento de moléculas mono o bicatenarios: las enzimas son capaces de reconocer que tipo de cadenas
hay, ya sea mono hebra, doble hebra o hebra hibrida entre DNA y RNA. Esto se debe a que reconocen la pentosa
y también son capaces de reconocer los nucleósidos esto se debe a las bases nitrogenadas.

Reconocimiento de nucleósidos específicos a través de su base nitrogenada: Reconocen entre nucleósidos

purínicos y pirimídicos. El nucleósido es solo la unión de la pentosa con la base nitrogenada, cuando se une con
un grupo fosfato se habla de un nucleótido.

Nomenclatura

Las enzimas son purificadas desde bacterias, por lo que el nombre proviene de la bacteria que se purifica. Son las
primeras tres letras del nombre científico de la bacteria, por ejemplo, EcoRI, donde la primera letra es el genero
de la bacteria, en minúscula va la especie y la R es por restricción o M por metilación, dependiendo de la función
de la enzima. En algunos casos existe una cuarta letra que es la cepa, pero no es en todos los casos. El numero
romano nos indica que numero de generación de endonucleasa es, en este caso EcoRI es la primera endonucleasa
aislada de Ecoli.
Endonucleasas de restricción

Hay tres tipos de endonucleasas de restricción, tipo I y tipo III son endonucleasas y metilasas en la misma
proteína, es decir cortan y agregan un grupo metilo. Tipo II pueden ser endonucleasas o metilasas, la metilasa en
si es una proteína independiente, normalmente se habla de endonucleasa.

El tipo I y III utilizan coenzimas, Mg+, ATP y SAM (S. adenosín metionina, dona el grupo metilo), el tipo II no
lo tiene ya que la metilasa es otra proteína.

El sitio que reconoce el tipo I y III, no son palindrómicos, en cambio la II sin es palindrómica, esto le da la
especificidad a esta enzima.

El tipo I corta ambas hebras (DNA), en puntos cercanos, pero poco específicos. Tipo III cortan en ambas hebras
(DNA), en puntos aún más cercanos que el tipo I. El tipo II cortan en el sitio de reconocimiento, es por esto que
son específicas.
Sistema Metilación restricción

Sistema metilación restricción, donde algunas tienen las metilasas y las endonucleasas en las mismas proteínas,
esto quiere decir que estas enzimas que son metilasas son capaces de agregar un grupo metilo donado por SAM
que puede metilar a la citocina en el carbono 5 o puede metilar a la adenina en el hidrogeno 6. Algunas pueden
metilar a citocinas y adeninas, otras solo a la citocina o solo adenina.

El mecanismo de defensa es el siguiente: El DNA propio de la bacteria se metila de una forma específica,
característica de cada especie bacteriana, en las secuencias reconocidas tanto por la restrictasa como por la
metilasa de esa especie. La metilación de las bases impide la unión de la enzima de restricción, con lo que el DNA
propio no es hidrolizado. Por lo contrario, al entrar en la célula DNA de otro organismo, no metilado o con un
patrón de metilación diferente, este DNA puede ser degradado por la enzima de restricción, ya que carece de los
grupos metilo en la secuencia diana (por razones del azar, en cualquier genoma habrá un cierto numero de
secuencias de 4, 6 u 8 pb iguales a la reconocida por la enzima, luego habrá secuencias dianas disponibles). A
partir de este mecanismo de acción combinad surgió precisamente el nombre de enzimas de restricción: “la
acción de la nucleasa restringe la posibilidad de infección por virus”.

La EcoRI, es una enzima de restricción tipo II, corta y la metilasa reconoce el mismo sitio que la EcoRI. Si el sitio
no está metilado, después de actuar la metilasa del EcoRI, no metila en cualquier sitio, metila solo una adenina
especifica, en la imagen el grupo metilo tiene de 5´G-A-A-T-T-C y de 3´C-T-T-A-A-G y metila la adenina en el 3´.
Cuando el DNA no metilado, la enzima EcoRI es capaz de cortar en el mismo sitio, en cambio cuando esta
metilado, la EcoRI no es capaz de cortar. La restrictasa actúa sobre sitios no metilados y la metilasa actúa sobre
sitios no cortados, y ambas reconocen la misma secuencia.

Enzimas de restricción tipo II

Estas son solo la restrictasa por un lado y metilasa por el otro, pero ambas reconocen el mismo sitio. Estas son
palindrómicas, esto se refiere a que la cadena de 5´a 3´se lee igual que leyendo la de 3´a 5´al revés.

En general estas enzimas son tipo A, por lo que siempre dejan libre el extremo 3´ OH, esto es importante debido
a que se puede unir hacia abajo otro nucleótido.
Las enzimas de restricción pueden dejar distintos extremos dependiendo del sitio de corte, es decir si el corte es
a la mitad del ciclo palindrómico, el corte es recto, esto se denomina “extremos romos”. Si el corte es al inicio de
un extremo, los extremos dejan una colita y se denominan “extremos cohesivos”, pueden ser con el 5´saliente o
con el 3´saliente. Esto de interés.

Clonación de DNA recombinante

La clonación es producir un numero de copias de una región de DNA de interés, puede ser un fragmento x, un
gen o un DNA codificante formado por un RNAm. Se va a producir algo para que el material se clone muchas
veces. El objetivo es amplificar para detectar o estudiar o ver la expresión de ese producto.

La clonación consiste en distintas etapas:

1. Obtención del DNA de interés.

2. Preparación del vector.
3. Unir con el vector, generar el DNA recombinante.
4. Incorporación del DNAr.
5. Y 6, etapas simultaneas de propagación celular y selección (de las células que han incorporado el DNA
de interés).

7. Opcional, expresión del DNA clonado.

➢ Obtención del DNA de interés: cuando se tiene definida la

región que se quiere amplificar y de donde se va a sacar lo que se
hace es cortar esa región con enzimas de restricción, idealmente
enzimas que dejen extremos cohesivos y que sean dos enzimas
distintas, esto es si viene de DNA. En el caso que venga de
RNAm, se realiza el proceso de retro transcripción, se obtiene el
DNAc aquí se corta y se agrega a la secuencia de interés un
adaptador que tiene el sitio de reconocimiento para las enzimas
de restricción. Al estar el sitio listo se comienza a preparar el
vector.

➢ Preparación del vector: el vector es una molécula de DNA que se va a encargar de clonar el fragmento de
interés en alguna célula anfitriona, es un DNA doble cadena que tiene la capacidad de que se pueda pegar
un DNA exógeno.
✓ Vector de clonación o plásmido, cuando se quiere almacenar el DNA de forma estable, ya que es una
estructura circular y solo se utiliza para amplificar ese material. En cambio, los vectores de expresión
tienen esa finalidad y otras cosas que nos permiten expresar ese fragmento de DNA. En este caso se
habla de un plásmido como vector de clonación, el plásmido es un fragmento de doble cadena
circular, este plásmido tiene ambos sitios de múltiple clonación, esta región dentro del DNA tiene
sitios de corte para varias enzimas de restricción que cortan solo una vez.
✓ El origen de replicación es importante en los vectores de clonación y de expresión, esto se debe a que
permite al fragmento la autonomía cuando sea inserto en una célula huésped a través del origen de
replicación va a utilizar la maquinaria de replicación de la célula y va a replicar múltiples veces.
 ✓ El marcador de selección que puede ser un gen de resistencia para ampicilinas o un gen para una
enzima que después en presencia de un sustrato hace una transformación colorimétrica, siendo un
marcador de selección.
✓ El vector de expresión tiene tres cosas importantes que lo diferencian del vector de clonación. Este
vector de expresión nos va a permitir que el fragmento de DNA que se utilice se transforme en
proteína, es decir de transcriba y se traduzca. Se va a necesitar de un promotor, que nos va a permitir
que el fragmento se replique muchas veces, esto se transcriba a RNA, al transcribirse también se va
a transcribir el IRES que es el sitio de entrada al ribosoma y la cola poliA, por lo tanto, esto cuando
se transcribe esta señal lo va a mandar al ribosoma y la cola poliA lo va a proteger para que no sea
degradado.

Plásmidos

Existen muchos vectores de

replicación, pero los que mas se
utilizan son los plásmidos, debido a
que tienen replicación autónoma a
través del origen de replicación y
también son más fáciles de entrar a la
célula. El mapa de restricción nos va a
entregar los lugares donde cortan las
enzimas de restricción, en este caso
tenemos un poli conector que es el sitio
de múltiple clonación, tiene para
cortar por ejemplo la EcoRI, SacI, etc.,
todas estas enzimas cortan solo una
vez. Para distinguir un plásmido de
clonación de uno de expresión, nos
debemos fijar en el promotor, en el
sitio IRES y en la cola poliA, ya que
estos solo se presentan en el de
expresión. El plásmido se debe cortar
en el sitio de múltiple clonación.
➢ Formación de la molécula de DNAr: Es importante que el fragmento de interés sea cortado con las
mismas enzimas que el vector y en el mismo orden, si en el 5´se corta con EcoRI, el vector también debe
ser cortado con EcoRI, y el 3´se corta con SmacI el vector también con esta enzima. Esto permite que al
cortar ambos con las mismas enzimas permite que ambos extremos sean igual de complementarios y al
momento de colocar el fragmento de DNA en el plásmido, sea compatible y se unan por
complementariedad de base y formar los puentes de hidrogeno, aunque en los cortes de las enzimas se
deben unir en los enlaces fosfodiéster, esto se realiza con la ligasa, una enzima que vuelve a formar el enlace
fosfodiéster, por lo que se pega el fragmento de interés al vector, en este caso es un plásmido.

➢ Integración de la molécula de DNAr: Puesto que habitualmente la membrana plasmática muestra una
permeabilidad selectiva y no permite el paso de las moléculas de rDNA, se acude a diversos métodos para
facilitar su captación por alteración transitoria de la permeabilidad celular (métodos pasivos) o
para introducir el rDNA directamente (métodos activos). En muchos casos, los mecanismos son poco
conocidos y los métodos resultan más o menos eficaces dependiendo del tipo de vector y de célula. El
proceso suele denominarse transformación o transfección, aunque estrictamente el primer término
corresponde a la introducción en bacterias anfitrionas y el segundo al empleo de virus como vectores. Los
métodos utilizados pueden dividirse también en físicos y químicos. Una vez que ya se generó el DNA
recombinante se tiene unas moléculas que se deben amplificar, por lo que se utilizan células de eucariota
o bacterias, para amplificar muchas veces el material. Para esto se debe incorporar dentro de la célula el
DNAr y puede ser mediante métodos pasivos o activos. Los pasivos modifican temporalmente la
permeabilidad de la membrana. Por ejemplo, si la membrana se pone en una solución con calcio logramos
que esta se abra y es posible que una de las hebras de DNAr logre entrar. Ingresar el material recombinante
se denomina transformación, ya que la bacteria se transforma.

✓ El tratamiento más frecuente es de tipo físico-químico y se dice que la célula se hace competente. Se
comienza con una incubación en presencia de CaCl2 a 0 C, seguida de un calentamiento bruscohasta37-
43 C, lo que induce a las bacterias a aceptar moléculas de DNA. Aunque el mecanismo de este proceso
no se ha podido confirmar, posiblemente la neutralización de la carga del DNA por parte de los iones
calcio posibilite el paso del DNA a través de la membrana celular. Se dispone de cepas establecidas que
son especialmente susceptibles a este proceso.
✓ La incorporación pasiva de DNA se favorece cuando sus moléculas se han agregado o coprecipitado por
interacción con cationes, habitualmente fosfato cálcico o DEAE-dextrano (dietilaminoetil-dextrano,
un polímero policatiónico). Es un método pasivo.
✓ Otros agentes químicos, en especial el polietilenglicol (PEG), aumentan la permeabilidad de la
membrana celular, con lo que se incorpora más fácilmente el DNAr, también de forma pasiva.
✓ El DNA se puede incorporar en liposomas, que luego con facilidad se fusionan con la membrana
celular y liberan su contenido al interior (incluyendo el DNA, aunque, en realidad, parece más bien
asociarse a la superficie exterior hidrófila del liposoma). Método de forma pasiva.
✓ Un método con elevada eficacia es el empleo de vectores de tipo vírico, que por su vía natural de
infección introducen en la célula anfitriona su DNA, en este caso recombinante. Para este tipo de
incorporación se ha acuñado el término transfección. Método de forma activa.
✓ Aplicando descargas eléctricas en forma de pulsos breves de alto voltaje se consigue la apertura de
poros transitorios en la membrana, por los que puede pasar el DNAr. Este método de electroporación
es bastante habitual para células eucarióticas, aunque de resultados muy variables. Método de forma
activa.
✓ Un método curioso y de aplicación creciente, la ‘‘biolística’’, consiste en el bombardeo de las células
anfitrionas con microesferas (de tungsteno u oro) recubiertas con el DNAr. Se emplean dispositivos
adecuados (‘‘pistolas de genes’’) que impulsan esos micro proyectiles mediante un gas a presión, y
pueden aplicarse sobre suspensiones celulares, células en cultivo o incluso in vivo (sobre la piel, hojas,
etc.). Algunos de los proyectiles impactan y penetran en las células, cuya membrana se resella
rápidamente, quedando el DNA incorporado en su interior. Método de forma activa.
✓ En casos en los que la eficiencia de suministro del DNAr debe ser máxima se acude a la microinyección
directa del DNA en la célula o en su núcleo, empleando micro manipuladores y agujas de vidrio (micro
jeringas o micropipetas, de punta extremadamente fina), bajo observación al microscopio.
Obviamente, el inconveniente es el escaso número de células que se pueden tratar por este método
manual, por lo que en general se utiliza sólo sobre oocitos y cigotos. Dado su carácter directo, se puede
incluso prescindir del vector y suministrar el fragmento de DNA deseado sin modificar. Método de
forma activa.
➢ Propagación del cultivo: una vez que se tiene el cultivo con las bacterias que han ingresado el DNAr, ya sea
una o ninguna, estas se pueden sembrar en un agar Lb. Se siembran y se visualizan las colonias, para luego
picarlas y pasarlas a un medio líquido.

✓ Aquí es donde se hace la selección de las colonias, por ejemplo, si el DNAr tenía el gen de resistencia
a ampicilinas, se puede tener un agar con ampicilina o dejarlas crecer en un medio sin ampicilina y
después se pican esas colonias, se agregan en otro cultivo y aquí se agrega la ampicilina. En el caso
de las bacterias tengan el DNAr, van a resistir ya que tienen el gen de resistencia a ampicilina. Si
crecen en un medio de cultivo con ampicilina, van a crecer solo aquellas que tienen el DNAr, el resto
no crece.
✓ Hay otra manera de detectar y seleccionar, esto es con un sustrato coloreado, que en presencia del
agar que tiene ese sustrato se genera una coloración, por lo que todas las colonias que tienen color
son las que tienen el DNAr. Se pueden tener un agar inactivado, que tiene el sustrato, pero no la
enzima, donde las bacterias que no tienen color tienen el DNAr y las que tienen color son las que no
tienen el DNAr.
 Hibridación de ácidos nucleicos

Las técnicas basadas en la hibridación se utilizan:

➢ Diagnóstico de enfermedades
➢ Identificación de microrganismos patógenos
➢ Estudio de perfiles de expresión génica
➢ Localización de genes en cromosomas
➢ Localización de ARN en tejidos

La hibridación está basada en el proceso de renaturalización de dos cadenas sencillas de un DNA, que
se observa, por ejemplo, al enfriar de forma lenta una disolución del DNA bicatenario previamente
desnaturalizado por calor. La especificidad del emparejamiento mediante puentes de hidrógeno entre bases
complementarias (A-T, A-U o G-C) de moléculas monocatenarias contiguas da lugar a estructuras bicatenarias,
de gran estabilidad. Cuando ambas moléculas corresponden a las hebras originales de un mismo ácido nucleico
se habla de renaturalización, mientras que si las dos hebras proceden de moléculas diferentes adquiere sentido
el término hibridación. El resultado puede ser híbridos DNA-DNA, híbridos RNA-RNA o híbridos DNA-RNA.

Desnaturalización y renaturalización

De forma similar a lo que ocurre en las proteínas, los ácidos nucleicos se desnaturalizan por efecto de agentes
químicos o físicos, perdiendo su conformación tridimensional, y en especial la naturaleza bicatenaria del DNA
(doble hélice).

La desnaturalización se debe a la desestabilización tanto de los puentes de hidrógeno entre bases como de las
interacciones de apilamiento entre bases y a la pérdida del efecto hidrófobo. Al desnaturalizarse, las dos hebras
del DNA se separan y pasan a una conformación al azar (llamada a menudo ovillo aleatorio), sin que se altere la
estructura primaria, pues no hay ruptura de enlaces covalentes. En el caso de los RNA, con muy distinta
conformación tridimensional a pesar de su analogía en estructura primaria, la desnaturalización afecta
fundamentalmente a los RNAt y RNAr, ya que son los que presentan más regiones bicatenarias locales.

Desnaturalización y renaturalización por efecto de la temperatura

Desnaturalización por ácidos y bases

El emparejamiento de las bases disminuye o se debilita por valores de pH alejados de la neutralidad, con la
consiguiente desnaturalización del DNA. Sin embargo, un medio ácido puede conducir también a la ruptura
de la estructura primaria de los ácidos nucleicos (recuérdese que el medio ácido fuerte rompe los enlaces
fosfodiéster y N-glicosídicos, mientras que en condiciones más suaves –por ejemplo, a pH alrededor de 3– se
separan las purinas). Por ello, para la desnaturalización del DNA es más habitual emplear condiciones
alcalinas (en las cuales el DNA, a diferencia del RNA, es estable). La neutralización posterior del medio puede
permitir la recuperación de la estructura de partida, es decir, la renaturalización del DNA (con consideraciones
similares a las de la desnaturalización por calor).

Condiciones alcalinas desnaturan, pero condiciones acidas destruyen la molécula.

Desnaturalización por agentes químicos

Por ejemplo, la urea, la formamida y el formaldehido, todos estos tienen un grupo carbonilo en común, estos
actúan rompiendo los puentes de hidrogeno que estabilizan la interacción entre bases y rompen esa estabilidad.

Los grupos carbonilos y los grupos aminos, son los que se interponen, por ejemplo, la A-T forman puentes de
hidrogeno y estas moléculas se meten entremedio par formar ellos los puentes de hidrogeno y de esta manera
separar ambas hebras.

Influencia de la desnaturalización sobre las propiedades del DNA

Se puede evidenciar la desnaturación del DN por efecto de la

temperatura midiendo la absorbancia a 260nm, esto se debe a que
hay una relación entre la doble hebra y la separación, donde cuando
las hebras están separadas las bases están expuestas y absorben
más. Si se tiene el DNA a 80° y se sube de manera paulatina, la
absorción a 260 aumenta. En este tipo de curvas de T° y absorción,
donde al inicio tenemos la doble hebra que absorbe menos a 260nm
se conoce como hipocrómico, en cambio al final de la curva donde
ya tenemos una mono hebra más expuesta, por lo que absorbe más
a 260nm, se conoce como hipercrómico.

En el caso de la viscosidad, si se compara el DNA en solución con la

doble hebra es mucho más viscoso que las dos mono hebras en
solución, por ende, si se comienza a desnaturar el DNA doble
hebra, se va a tener un aumento en la viscosidad y mientras voy
desnaturando, la viscosidad comienza a disminuir ya que se esta
separando en las dos mono hebras.
Temperatura de fusión del DNA

En este caso tenemos un grafico que nos da la temperatura por el % de desnaturalización que tenemos, se inicia
con altas temperaturas y una doble hebra, partiendo por la parte hipocrómica, para luego llegar a la mono hebra
y comenzar el proceso de enfriamiento lento, debido a que así podemos realizar la renaturalización de manera
correcta, en caso de que fuera rápido romperíamos la molécula de DNA y la desnaturalización no seria reversible.

Al ser la transición tan brusca, la desnaturalización térmica del DNA es similar en cierto modo a la fusión de un
sólido, por lo que se habla también de curvas de fusión, y la temperatura central del intervalo de transición (50%
de desnaturalización) se llama temperatura de fusión (Tf o Tm, del inglés melting). Bajo condiciones definidas,
cada DNA muestra una curva de fusión con valores característicos de Tm y de magnitud del efecto hipercrómico
(diferencia entre A260 máxima y mínima, o cambio de viscosidad).

Es importante resaltar la relación entre Tm y el contenido en pares de bases G C o A=T del DNA:

• Cuanto más abundantes son G C, más desplazada hacia la derecha

aparece la curva, es decir, se necesita mayor temperatura para la
desnaturalización, Tm es mayor.
• Y viceversa, cuantos más pares A = T, mayor desplazamiento a la
izquierda y menor Tm.
• Esto se debe a que, al ser más fuerte la interacción en los pares G C
(3 puentes de hidrógeno), necesitan mayor energía para disociarse.

La Tm se puede calcular y esta va a ser distinta dependiendo de la

composición del DNA, depende de la fuerza iónicas de la solución, de la longitud del DNA doble hebra y
principalmente de la composición de bases.

Por ejemplo, tenemos la siguiente cadena de ADN y necesitamos calcular la Tm:

Forward 5´- CCA AAC GAA ACA AAA AGC GT- 3´→ A= 11; C= 5; T= 1; G= 3
En este caso como tenemos 2
Reverse 5´GCT TGT GTA AAA GCC GTC GT- 3´ → A= 4; C= 4; T= 6; G= 6 primers, tenemos que utilizar
la temperatura menor y
Forward Tm= 2 x (A + T) + 4 x (G + C) → 2 x (11 + 1) + 4 x (3 + 5) → 56° restarle 5, en este cao la Tm
seria de 51°C.
Reverse Tm= 2 x (A + T) + 4 x (G + C) → 2 x (4 + 6) + 4 x (6 + 4) → 60°
Principio básico del ensayo de hibridación

Todos los ensayos de hibridación se basan en la gran especificidad de la interacción entre bases complementarias.
Para que la hibridación permita identificar en un genoma, u otra muestra cualquiera de ácido nucleico, una
secuencia particular se requieren dos elementos básicos:

• La presencia de la secuencia diana en uno de los fragmentos de la muestra de ácido nucleico,

generalmente obtenidos usando enzimas de restricción.
• El empleo de una sonda (sonda molecular, sonda de hibridación), que es un oligonucleótido (fragmento
corto de ácido nucleico) de secuencia conocida, marcado de forma que permita su detección. La
secuencia de la sonda ha de ser complementaria a la secuencia diana que se pretenda detectar, y su
marcaje puede ser con un isótopo radiactivo, un cromóforo, un fluoróforo, una enzima, etc.

Factores que afectan la estabilidad de los híbridos o sonda unida a la secuencia de interés

• Contenido GC v/s AT
• Grado de complementariedad
• Longitud de las hebras
• Concentración de cationes en la solución (los cationes interaccionan con los fosfatos de la hebra)
• Temperatura
• Concentración de formamida (una de las tres moléculas que intervienen entre la unión de los puentes
de hidrogeno)

Rigor de hibridación

Los factores anteriores hay que tenerlos en cuenta cuando realizamos el diseño, el ensayo de hibridación y para
esto, al modificar todo se afecta directamente el rigor de la hibridación. Este rigor es la especificidad de
emparejamiento entre la sonda y el DNA diana, se define como el numero de errores de apareamiento, lo ideal
es que la sonda se una al 100% a la secuencia diana, pero no siempre es así, el rigor de la hibridación es cuanto se
va a permitir que no se una la sonda a la secuencia diana.

• Mientras mayor sea el rigor, se van a permitir menos errores.

• Mientras menor sea el rigor, se van a permitir más errores.
➢ Las condiciones de rigor determinan la sensibilidad del método, el alto rigor disminuye la sensibilidad,
pero aumenta la especificidad.
➢ Cuando estamos en condiciones de hibridación de alto rigor con baja concentración de sales, alta
concentración de formamida y alta temperatura requiere de una alta complementariedad entre las bases
para que se produzca la unión.
➢ Cuando las condiciones de rigor son bajas, hay altas concentraciones de sales, baja concentración de
formamida y baja temperatura aumenta el número de errores y de bases desapareadas.

Métodos de ensayo con hibridación

Todos los ensayos de hibridación se basan en la mezcla de moléculas monocatenarias de ácido nucleico muestra
o diana, no marcado, con una sonda de secuencia conocida, marcada, bajo condiciones experimentales que
permitan el emparejamiento entre bases complementarias. Si la sonda o el DNA diana son bicatenarios, deben
desnaturalizarse previamente, en general por calentamiento o por tratamiento alcalino. Una vez mezcladas, se
permite la renaturalización en la cual, como ya se ha comentado, se pueden formar híbridos sonda: diana. Se ha
de disponer, además, de un método para detectar los híbridos formados, que viene determinado por el tipo de
marcaje empleado en la sonda. Hay tres tipos de hibridación en fase liquida, en soporte solido (Dot-blot y slot-
blot) e in situ.
Hibridación por Fase liquida

Esta ya no se utiliza mucho (es inespecífico), consiste en por ejemplo querer el DNA de una célula, tenemos la
célula se hace la lisis, se purifica, se desnatura el DNA, se agrega la sonda, se hibrida y hay dos formas de detectar
ya sea por cromatografía de adsorción, donde se utiliza una columna de hidroxiapatito que retiene los
bicatenarios, se elimina la fracción no retenida y después se eluye la fracción retenida que es la que tiene la sonda.
La otra forma es con una nucleasa S1, que degrada todo lo que es monocatenario, es decir todo lo que no este
hibridado y se precipita con tricloroacético que va a precipitar solamente las moléculas grandes.

Hibridación en soporte solido

Hibridación de colonias bacterianas: se ocupa en técnicas de DNA recombinante, para identificar las colonias de
bacterias que tenían el DNAr ya que habían sido capaces de incorporarlos.

Se coloca un papel absorbente dentro de la placa que tiene las colonias, se presiona y las colonias se van a traspasar
al papel, ya se tienen las colonias, se va a lisar y desnatura ahí mismo con el DNA e incubo con la sonda, se lava y
se visualiza. Comúnmente se debe hacer marcas en el papel y en la placa para saber de donde se tomo la muestra.

➢ Hibridación de dot blot y slot blot: Se utiliza un filtro de nitrocelulosa o nailon, se puede aplicar
directamente la muestra ya sea gotas (dot blot) o un slot (mancha más larga), ya se está trabajando con
el DNA por lo que no hay que lisar. Se marca con la sonda, se lava para eliminar el exceso de sonda y se
detecta.
➢ Hibridación de southern blot: lo primero que se hace es comprender que hay dos tipos de
hibridaciones de este tipo, el southern blot es con DNA y el northern blot es con RNA.
✓ El southern blot se compone de 5 etapas, electroforesis, desnaturación, transferencia,
hibridación y detección. Lo primero que se hace es, el DNA se va a cortar con enzimas de
restricción, para tener un patrón de bandas específicos, se realiza la electroforesis, se obtiene un
patrón de bandas X y luego ese mismo DNA se va a desnaturar, con condiciones alcalinas suaves
para después realizar una transferencia (es como un sándwich ), abajo se tiene una cubeta con un
tampón de alta fuerza iónica, una esponja, el gel, un papel o filtro de nitrocelulosa o nailon, otra
esponja o un bloque de papel absorbente y por ultimo un peso. La fuerza iónica sube por
capilaridad de 8 a 12 horas, donde por capilaridad van a pasar todas las moléculas que están en el
gel, pasando a la membrana de nitrocelulosa o nailon. Las bandas no se ven, por lo que debemos
incubar con la sonda para que hibride, se lava y después se detecta, y todo lo que se haya hibridado
con la sonda son las bandas.

✓ Cuando se va a visualizar el resultado, se debe tener en cuenta la sonda que se utilizo ya sea por
fluorescencia o un isotopo radioactivo, para así poder visualizarlo de manera correcta.
✓ En este caso tenemos una secuencia que responde a dos sondas diferente A y B, se debe cortar
con enzimas de restricción donde los fragmentos que quedan son de 0,7kb; 1,3kb; 4,9kb; 1,0 kb.
Entonces al momento de hacer la hibridación la secuencia con la sonda A queda en el fragmento
1,3kb y 4,9 kb; y en el caso de la secuencia con la sonda B este queda marcado en el fragmento
4,9kb. Es importante saber dónde se va a unir la sonda, ya que así se va a visualizar de manera
correcta.
➢ Hibridación de northern blot: utiliza RNA como muestra, no se necesitan enzimas de restricción,
pero hay que tener mucho cuidado con las RNAsas. También se deben ocupar agentes desnaturalizantes
ya que el RNA es una mono hebra y puede doblarse y formar una estructura secundaria sobre si mismo,
por lo que los desnaturantes son para que en caso de que el RNA se enrolle estos nos ayudan a
desarrollarlos y que queden como una mono cadena. La técnica de hibridación northern se emplea
principalmente para obtener información sobre el tamaño de RNA y sobre el modelo de expresión de
genes específicos. Éstos, una vez clonados, pueden utilizarse como sondas para hibridar con muestras
de RNA aisladas de una variedad de tejidos diferentes, y así conocer los tipos celulares en los que se
expresa el gen, la abundancia relativa y tamaño de los transcritos, y diversos detalles de su procesamiento
posterior.
➢ Matrices de ADN (microarrays) (método de soporte solido): Estas son matrices de DNA, placas de
vidrio, sílice u otro material, son de app 2x2 cm, estas tienen muchos pocillos. Los microarrays pueden
tener con oligonucleótidos, es decir en la placa hay oligonucleótidos marcados con sondas, es decir se
tiene la sonda especifica que va a hibridar con un gel, este se utiliza para el estudio de polimorfismos,
mutaciones o diagnostico de enfermedades. También tenemos el caso de que se utilicen moléculas de
DNA y luego se hace hibridar con una sonda especifica, esto se utiliza para estudios de expresión génica.

✓ Por ejemplo, tenemos dos líneas celulares que provienen de un tumor, con pronósticos diferente, por
ejemplo, cáncer de próstata. Línea tumoral A y línea tumoral B, lo que se hace es extracción del RNAm
ya que vamos a ver expresión génica, por lo que
el genoma de interés es RNAm, este se
transforma a DNAc, estos van a ser marcados
con un fluorocromo CY3 (verde) para la línea A
y el CY5 (rojo) para la línea B, esto se coloca
dentro de una genoteca, que van a tener por
ejemplo una secuencia de genes específicos que
han sido detectados en distintos pams. Al
momento de hibridare se van a ver los colores,
en el caso de que haya muchos verdes es que hay
más expresión de la línea A que la B, al contrario,
si hay más desarrollo de color rojo, es porque hay
más desarrollo de la línea B que de la A; y en caso
de haber un color amarillo es porque hay genes
que se expresan de forma similar en ambas
líneas.
➢ Tenemos matrices de genotipado y de expresión:
✓ Matrices de genotipado: esta generalmente se utiliza DNA como muestra y es para ver
mutaciones, polimorfismo, evaluar alguna enfermedad, evaluar la predisposición de una
enfermedad o la prognosis; y también para la tipificación o clasificación molecular de subtipos
de cáncer.
✓ Matrices de expresión: utilizan RNAm y son para evaluar la expresión de genes de interés en el
tejido de manera específica.
Hibridación In situ

Es un tipo especializado de hibridación en soporte sólido, en la que la sonda se aplica sobre muestras en su
ubicación natural (célula o tejido), generalmente las preparadas para microscopia. Supone, por tanto, el empleo
de la hibridación bajo un abordaje citológico e histológico y, en cuanto a la metodología, es análoga a las técnicas
inmunocitoquímicas e inmunohistoquímicas. De forma muy global, cabe distinguir entre sus aplicaciones tisular
y cromosómica.

➢ Hibridación in situ tisular: Se realiza sobre cortes de tejido, células intactas, núcleos aislados, etc. En
muchos casos, se lleva a cabo directamente sobre tejidos fijados con formalina, incluidos en parafina,
congelados, etc. Es una modalidad de hibridación particularmente relevante para detectar virus
patógenos, para diagnosticar células cancerosas como consecuencia de cambios genéticos o para
estudiar cambios en la expresión génica, detectando secuencias en el RNA celular. En este caso, tras una
fijación suave de la preparación, se añaden sondas de DNA complementario (DNAc), monocatenario.
La detección se realiza por autorradiografía y examen de la película fotográfica bajo el microscopio, o
por microscopia de fluorescencia, si se empleó este marcaje para la sonda.
✓ En este caso por ejemplo tenemos el corte de un cerebro de ratón, donde las zonas más oscuras nos
representan la hibridación de RNAm, especifico. También se puede realizar FISH, en este caso
tenemos un linfocito humano que se hibrido con dos sondas, en este caso se debe marcar el núcleo
si o si, este se marca con DAPI que es un fluoróforo azul que se une al surco menor del DNA, por lo
tanto, todo lo que es azul es el DNA, la forma roja es complementaria al centrómero del cromosoma
21 y el verde es complementario al centrómero del cromosoma 13.

➢ Hibridación in situ cromosómica: Se realiza sobre preparaciones en porta de cromosomas

metafásicos o prometafásicos (pág. 91), tratadas con reactivos fijadores para preservar las características
morfológicas del cromosoma. Se marca siempre con DAPI y en este caso lo que se está viendo, la verde
corresponde a una sonda complementaria al brazo corto del brazo del cromosoma 18 y la sonda roja es
complementaria al brazo largo del cromosoma 18. En este caso están ambos cromosomas, pero uno no
presenta el brazo corto.
Sondas

Como ya se ha indicado, la detección de ácidos nucleicos mediante ensayos de hibridación depende de la

presencia de la secuencia diana que debe detectarse en la muestra y de la disponibilidad de una sonda u
oligonucleótido de secuencia complementaria a la diana. Por tanto, la utilidad de la hibridación, el punto clave,
radica en la sonda: de su naturaleza depende que el ensayo sea fructífero. El papel de la sonda equivale al del
anticuerpo en un inmunoensayo y, al estar marcada, permite localizar y cuantificar cualquier secuencia diana
con la cual se pueda hibridar. Gracias al empleo de sondas, la sensibilidad de la hibridación es muy elevada, hasta
un millón de veces superior a la detección directa por otros métodos, por ejemplo, la tinción tras electroforesis.
La sonda se convierte así en un elemento esencial para cualquier estudio molecular, en especial para analizar la
variabilidad o polimorfismo del genoma.

Clasificación de las sondas

Las sondas se pueden clasificar según varios criterios, como su tamaño, longitud o tamaño de la secuencia diana,
método de marcaje y detección, método de preparación, etc. Este último criterio es el más utilizado,
distinguiéndose entre sondas preparadas por métodos convencionales (por clonación celular o acelular) y por
métodos de síntesis química.

Marcación de sondas: puede ser por isotopos radioactivos, fluorocromos o enzimas. Pueden ser de manera
directa o indirecta.

Sondas obtenidas por clonación celular (tecnología de DNA recombinante)

Se tiene el plásmido y el DNA, se va a unir, lo vamos a hibridar, se da a la bacteria, se va a reproducir, multiplicar,

después se purifica y el fragmento de interés es el que se utiliza, se va a marcar y se utiliza. La sonda es un DNA
monocatenario.

Sondas de DNA obtenidas por clonación acelular (amplificación por PCR)

Se tiene el DNA inicial y se amplifica muchas

veces y este fragmento de interés se
desnatura y se utiliza el DNA como mono
hebra (sonda).
Sondas de RNA o ribosondas

Se utiliza el mismo principio del DNA recombinante, la diferencia es que el plásmido que se va a utilizar es
especial que tiene un promotor SP6, que es el promotor de un fago, entonces se va a transcribir y el promotor es
para una RNA polimerasa del fago, por lo que va a transcribir y el DNA se va a transformar en un RNA de mono
hebra, que se marca y se utiliza como sonda.

Síntesis química de oligonucleótidos

Es uniendo un nucleótido al lado del otro, se parte por el extremo 5´y se utilizan como base los
desoxirribonucleótidos que tienen 3 fosfatos o se puede partir del 3´pero aquí hay que utilizar los nucleótidos
más el fosfato.

Marcaje de las sondas

El empleo de sondas de DNA o RNA como herramientas analíticas para localizar secuencias diana mediante
ensayos de hibridación requiere obligatoriamente un proceso de marcaje de la sonda, que permita su detección.
La molécula o grupo marcador puede tener diversa naturaleza, siempre y cuando se pueda detectar su presencia
de forma directa o indirecta; los marcadores más empleados son isótopos radiactivos, fluorocromos y enzimas.
En general, dan lugar a métodos sencillos de realizar, que detectan concentraciones muy bajas de la sonda. El
marcaje debe ser estable bajo diversas condiciones de temperatura, detergentes, disolventes, etc., y no afectar a
la reacción de hibridación. Clásicamente se utilizaron los métodos radiactivos, pero en gran medida se han visto
desplazados por otros marcadores, sobre todo para evitar los riesgos derivados de la radiación y la gestión de
residuos, para aprovechar la mayor vida media de sus reactivos de marcaje y, en algunos casos, para mejorar el
límite de detección.

El principio básico del marcaje es la unión química o conjugación del marcador a la sonda (en el caso radiactivo,
en realidad el isótopo forma parte de la molécula de sonda, no se une a ella). Como se acaba de indicar, esto
puede hacerse uniendo el marcador a la sonda ya preparada o a un nucleótido que se incorporará durante la
síntesis de aquélla. Por otra parte, la sonda puede llevar unido el marcador detectable (métodos directos de
marcaje) o bien otra molécula no detectable, ‘‘etiqueta’’ o ‘‘grupo indicador’’ (en inglés, reporter), con la
capacidad de ser reconocida posteriormente por una ‘‘proteína detectora’’, que es la que va marcada para la
detección (métodos indirectos).
Método directo: El grupo marcador se une de forma covalente, bien a grupos funcionales específicos o bien de
forma inespecífica. Los ácidos nucleicos ofrecen menos grupos funcionales adecuados para este fin que las
proteínas; básicamente, algunos átomos de las bases nitrogenadas (en especial, los no implicados en el
emparejamiento con la base complementaria) y los grupos terminales 3’-OH y 5’-P.

Método indirecto: puede convenir que a la sonda se una un grupo no detectable, etiqueta o indicador, el cual
en una segunda etapa es reconocido por otra molécula, por lo general una proteína, que incorpora el marcador
detectable. Para la unión del indicador son aplicables las consideraciones ya realizadas respecto a la unión del
marcador en los métodos directos. Se ilustra un ejemplo correspondiente a la modificación de los NTP.
PCR reacción en cadena de la polimerasa

El objetivo de la técnica es amplificar un fragmento de interés, ya sea un fragmento de ADN o un gen de interés,
la idea es poder amplificar y detectar.

Nos sirve para clonación acelular; detección de secuencias; preparar muestras para secuenciación; para evaluar
polimorfismos o mutaciones; para Tipificación de DNA para trasplantes; Diagnóstico de enfermedades genéticas
(incluido el diagnóstico prenatal); Determinación de secuencias específicas de DNA relacionadas con situaciones
patológicas definidas; Resolución de problemas forenses o arqueológicos, estudios evolutivos: Detección de
microorganismos infecciosos; Detección de células tumorales, amplificación de DNA para su posterior clonación
celular, etc.

Principio del método

1. Desnaturalización: es abrir por temperatura la doble hebra y formarlas en dos mono hebras
monocatenarias.
2. Annealing: es la hibridación, en donde los primers se vana pegar a cada una de las hebras que fueron
separadas, para que en la siguiente etapa.
3. Extensión: la DNA polimerasa se va a colocar sobre los primers, que están diseñados para que se
peguen por complementariedad. La DNA polimerasa se coloca sobre los primers y comienza a hacer la
copia complementaria de la hebra. Aquí la polimerasa necesita de los DNtps.

En cada ciclo se repiten las tres etapas una n cantidad de veces para generar muchas copias.

Etapas

1. Denaturación: favorece la separación del DNA con las histonas. La temperatura o el tiempo que dure
esta etapa va a depender del contenido G-C, ya que mientras más contenido G-C más temperatura se
necesita para que se separen las hebras.
2. Hibridación o annealing: los primers siempre se vana unir en el sentido 5´a 3´.
3. Elongación: el tiempo que dure esta etapa va a depender del tamaño del fragmento que se vas a
amplificar, generalmente la Taq polimerasa que es la que se utiliza es capaz de agregar 1000pb por
minuto, es decir si mi producto de amplificación es de 1000 pb el tiempo sea de 1 minuto. Si el
producto de PCR es de 500pb hacia abajo esto puede durar de 30s hacia abajo. El tiempo que se le da
va a depender del producto de amplificación.
Etapas opcionales de una PCR (pero necesarias)

Estas etapas nos permiten mejorar la amplificación del templado.

1. Desnaturación inicial: se realiza solo una vez y va al principio, antes de que inicie el primer ciclo. Se
hace a la misma temperatura o muy cercana 94°C y esto ayuda a separar mejor la doble hebra,
especialmente cuando el DNA presenta estructuras secundarias. Ayuda a prepararlo mejor y puede
durar de 3 a 5 minutos, en caso de que esta etapa dure 10 minutos se conoce como una PCR Hot Star,
esto se debe a que pasa 10 minutos a 95°C, esto se hace cuando el DNA que se esta ocupando es muy
grande. La Taq polimerasa proviene de la bacteria Thermophilus aquaticus, resiste a altas T°.
2. Elongación final: ocurre después de que terminen los ciclos, se realiza solo una ves y a 72°C. Permite
que los fragmentos que va a amplificar la polimerasa se puedan extender de manera correcta. Puede
durar de 5 a 7 minutos dependiendo del tamaño de la molécula.
3. Mantención: es una etapa a 4°C que tiene como finalidad, mantener el producto de PCR estable, ya
que si no están a 4°C corren el riesgo de degradarse.

Las copias que se van a producir se relacionan directamente con la cantidad de ciclos que se van a realizar, por
ejemplo, cuando se realiza un ciclo, tenemos dos copias del producto de amplificación, cuando se realiza dos
veces tenemos 4, si lo hacemos tres veces tenemos 8. Es 2n de ciclos y el resultado va a ser el numero de copias que
se van a tener.

Desnaturación inicial

Elongación final

Mantención

Componentes de una reacción de PCR

Se agrega DNA molde de donde se va a realizar la copia, ya sea un DNA doble

hebra (genómico) o el DNAc que viene del RNAm.

A la mezcla se agregan si o si los primers el forward y reverse, si estos no se

agregan la PCR no va a resultar. También e debe agregar la enzima, que en este
caso es la Taq polimerasa, el cofactor que es el MgCl2 ya que el Mg se une a los
DTPs para formar un complejo estable para que la polimerasa los vaya
agregando, los dNTPs que son los desoxirribonucleótidos que son el sustrato de
la polimerasa y el equipo que es el termociclador.
Optimización de la reacción de la polimerasa en cadena (PCR)

Para las reacciones, se deben ir estandarizando las concentraciones de lo que se utiliza.

DNA templado: Tiene que ser de buena calidad, es decir buena pureza e integridad. Se necesitan entre 1 a
1000ng, ese es el rango ideal.

Primers: los rangos van desde los 0,05 a 1uM, en el laboratorio se utiliza a 0,4. En el caso de que utilicemos un
primers que no es 100% complementario a nuestra secuencia, se debe lograr que al menos en el extremo 3´sea lo
más idéntico posible y que ahí haya una alta concentración de G-C, esto se debe a que el primer se debe pegar a
la hebra 5´a 3, por ejemplo si no se puede lograr que sea 100% complementario, siempre hay que verificar que
por el 3´quede muy pegado, ya que por aquí la polimerasa comienza a copiar. Cuando se trabaja con
concentraciones muy altas de los primers se pueden formar dímeros y productos inespecíficos, los primers al ser
secuencias de oligonucleótidos pueden tener complementariedad, cuando se pega forward + forward; forward +
reverse; reverse + reverse, estos se conocen como dímeros de complementariedad, esto es un problema ya que, si
el ADN comienza a producir dímeros, no quedan extremos libres para unirse a la hebra, por lo que no va a haber
amplificación. La amplificación de productos inespecíficos, la PCR es altamente especifica, pero si se trabaja a
mucha concentración de primers, estos se van a comenzar a pegar en otros lados del DNA y eso va a provocar que
se amplifiquen productos inespecíficos. Esta probabilidad aumenta si las cadenas no son complementarias.

Concentración de Mg++ (MgCl2): esta también se estandariza, por ejemplo, de 0,5 a 5 mM, en el laboratorio
se trabaja a 3 mM. Este es el cofactor de la polimerasa, por lo que afecta la actividad y la fidelidad de la polimerasa,
es decir, que tan bien copia la polimerasa, al no tener las condiciones optimas hay mayo probabilidad de errores.
Cuando se tiene una alta concentración de Mg se van a amplificar productos inespecíficos, en cambio si tenemos
una baja concentración de MG se va a disminuir la cantidad del producto PCR o totalmente no ocurre la reacción.

Concentración de los dNTPs (sustrato): bajas concentraciones de dNTPs minimizan los errores, esto se
traduce en aumentar al especificidad, es por esto que los dNTPs se trabajan en uM, en el laboratorio se trabaja a
10 uM.

Optimización de la PCR

• Solamente la Pfu tiene acción correctora, esto quiere decir que ella coloca un nucleótido y revisa si lo
agrego de manera correcta y si no lo hizo bien lo saca y lo cambia, tiene una alta fidelidad ya que es capaz
de corregir sus errores. En cambio, la Taq y la Tth no tienen esa acción correctora, por lo que pueden
cometer muchos errores.
• La Taq se utiliza cuando lo que se
quiere utilizar es menor a 5000 pb, la
Tfu cuando es mayor a 5000 pb ya que
es más precisa.
• La Taq y la Tfu son capaces de inhibirse
por contaminantes, en cambio la Tth
no, por lo que si hay contaminantes en
el DNA le va a dar igual.
• La Tth tiene actividad transcriptasa
inversa, es decir, puede iniciar con
RNAm y realiza la transcripción, y
luego todo el proceso de la PCR.

Adyuvantes de la PCR

Todos estos adyuvantes a una concentración adecuada, ayudan a que la

PCR sea confiable y fidedigna. Depende de muchas cosas, por ejemplo,
con la Taq no se necesitan muchos adyuvantes, a no ser que sea BSA o en
caso de que sean capaces de favorecer la acción.
Controles de la PCR

Control positivo: lo que se va a evaluar es que los primers y las condiciones de reacción que se determinaron
sean las adecuadas para amplificar lo que se quiere amplificar. El control positivo se realiza utilizando un
oligonucleótido sintético o utilizar el producto de PCR que ya fue amplificado. Por ejemplo, se utiliza un control
positivo para la B-globina un primer sintético o un producto PCR que ya fue validado. Este valida que se esta
evaluando el gen que corresponde.

Control negativo: se utiliza para descartar algún tipo de contaminación en la reacción de PCR. Se utiliza agua
en vez de DNA., este evalúa si hay presencia de contaminación de DNA exógeno. También se puede utilizar un
control negativo de Blanco, que es para evaluar la especificidad de los primers, en este caso se va a remplazar el
DNA de interés por otro DNA de una secuencia distinta, por ejemplo, quiero amplificar DNA de b-globina que
es solo para humanos, como control negativo blanco utilizo DNA de mono que no es especifico para humanos,
por lo que no debería haber reacción de ese blanco.

Control interno: nos va a permitir evaluar la presencia de inhibidores de la PCR en la muestra y si se amplifica
una secuencia distinta a la secuencia blanca. El control interno son genes constitutivos, por ejemplo, los PCR
que se realiza para la b-globina y B-actina, son dos genes Housekeeping, que son controles internos. El control
interno nos va a permitir validar el resultado de la PCR, es decir, el control negativo siempre tiene que estar, ya
que estos Housekeeping se expresan en todas las células de la misma manera, independientes del estado
patológico de una célula. Para poder validar un control negativo como realmente negativo, se debe tener el
control de calidad interno. Si el control interno no amplifica, es porque hay inhibidores de la PCR en la misma
PCR y por lo tanto no se puede validar el resultado.

Estructura de un laboratorio de Biología Molecular

• El laboratorio de la universidad es un laboratorio docente, por lo que solo busca adecuar la estructura
al de uno de biología molecular.
• Hay una zona Pre-PCR, que en este caso es la cabina donde se prepara el master mix, este master mix
contiene H2OLN, buffer, MgCl2, Forward, Reverse, Taq y el ADN que se agrega fuera de la cabina, este
se llama carga del templado y va luego de la Pre PCR.
• Hay una zona post PCR donde se realiza el PCR, es decir, el termociclador y el gel de agarosa.
• En un laboratorio de verdad este todo separado en salas, hay una para la realización del máster mix,
otra para el PCR y otra para ver el gel de agarosa. Todo esta separado por paredes, puertas y todo lo que
esta dentro de las salas, es especifico de esas salas. También todo se mueve de manera unidireccional,
es decir, si se saca algo del Pre al Post no se puede devolver. En la sala de pre-PCR hay una regla estricta
que es no entrar ADN, debido a que es contaminante, es por esto que todo lo que ingresa debe ser
alicuotado al mínimo, la preparación de muestras y las cabinas de luz UV que nos ayuda a mantener
todo limpio.

Diseño de primers para PCR

• Especificidad: esto quiere decir que se pegue solo a la secuencia que se quiere amplificar y no a otras
secuencias.
• Longitud del primer y el contenido G/C: la longitud optima es entre los 18 y 22 nt y que la concentración
de G-C no sea más de 40 a 60%.
• Temperatura de annealing: cada primer tiene una Tm, que depende del % de C-G y A-T, idealmente la
Tm del forward y del reverse no debe tener más de 5°C de diferencia. La temperatura de annealing debe
ser 5°C menor a la Tm más pequeña, por ejemplo, si tenemos que la Tm menor es de 56°C debemos
restarle 5 y quedaría en 51°C la temperatura de annealing.
Aunque no exista una regla general, se recomienda que:

• Los primers no tengan ninguna discrepancia (mismatch), a excepción de los utilizados para
mutagenesis.
• No exista algún sitio alternativo en el templado donde el primer pueda hibridarse.
• Los primers no formen estructura secundaria, especialmente en el extremo 3' o que sean parcialmente
complementarios.
• La longitud del oligo sea de 20 a 24 bases para reducir al mínimo la posibilidad de hibridación en sitios
secundarios en el vector o inserto.
• La temperatura de fusión (Tm) sea de 55°C o más, de manera que este por arriba de la temperatura de
"annealing".
• El oligo no contenga "strings" de más de una base. Es de especial importancia evitar 3 o mas G's o C's
consecutivas.
• Los primers tengan un contenido de C/G entre 40 y 60%. Para primers con contenido menor al 50% de
C/G, es necesario incrementar la secuencia de estos para elevar la Tm sobre la temperatura de
annealing.
• El primer sea más afín en su extremo 3'.

Estructura secundaria de los primers

Todos los primers van a formar estructura secundaria, por esto es importante revisar antes del PCR.

• Intraprimer: Es cuando el mismo primer se pliega sobre sí mismo para unirse.

• Interprimer: Cuando se forman dímeros.

Estandarización para la PCR

Cantidad de ADN templado: se tienen 0ng no se ve una banda; 1ng se comienza a ver una banda poco definida;
5ng se ve una banda más definida; 20ng se comienza a ver un chorreo; 100ng se ve un chorreo muy notorio (el
chorreo en la PCR es producto inespecífico de la PCR).

Gradiente de temperatura: se puede utilizar el primer a distintas T°, cuando la T° es perfecta debe verse una
única banda en la T° que corresponde. Puede haber una sola T° buena o un rango de T°, por ejemplo, en la A de
52 ° hasta 64°C funciona bien la PCR.
Concentración de MgCl2: Un aumento en la concentración de MgCl2 disminuye la especificidad y una
disminución de MGCl2 disminuye la especificidad. En este caso la banda A y B no tienen desarrollo, en la C y d
se ve una banda poco tenue, en la E hay una banda inespecífica y en la F tenemos una banda clara y sin chorreo.

Interpretación resultados de PCR

En el PCR la B-actina, el producto de amplificación es 315pb, siempre para evaluar el resultado es con un gel de
agarosa con un marcador de peso molecular con pesos similares a los que se busca. Por otro lado, tenemos la IL-
2 que es lo que buscamos, donde su peso es de 307 pb. Mi housekeeping es la B-actina, donde la banda es la
misma para las tres muestras, esto se debe a que se supone que el PCR se realizo con la misma cantidad de ADN.
En el caso de la IL-2 tenemos las tres bandas presentes, aunque con un poco de diferencia de intensidad, eso no
es un problema ya que esta notoria la banda en las tres muestras.

En el caso de que no se vieran las bandas en la muestra dos, pero si se ve banda en la tercera muestra, se valida
como negativo porque la banda 3 es positiva, se valida que se cargo el DNA. Si no se ve banda no se puede validar
como negativo, ya que la persona se puede haber equivocado y no haber cargado el DNA. Si hay bandas presentes
solo en el de la IL-2 no se valida.

Esta es una PCR cualitativa que nos va a decir solo si hay o no hay un gen.

En este caso tenemos una PCR multiplex, se evaluaron tres genes al mismo tiempo en el mismo tubo de reacción.

B-globina que es el housekeeping, se tiene la

amplificación para dos genes más.

Para las cinco muestras se amplifico la B-globina, por

lo que se pueden validar los 5 resultados, con esto
podemos decir que el 1 es negativo para GSTT1 y
positivo para GSTM1 y b-globina; la dos es positiva
para el gen GSTT1 y la B-globina; la tres es solo positiva
para el gen GSMT1 y la B-globina; la 4 es solo positiva
para la B-globina; la 5 es positiva para los 3. Tenemos
la B-globina expresada en todos, por lo que se puede
validar la PCR. Si no se ve la B-globina, pero no los
otros dos genes, no se puede validar ningún resultado.

Si no está el control interno, no se valida la PCR.

Aquí se trabaja con dos especies distintas, la banda 2 es de mono AAV.GFP, de la 3 a 5 es de mono AAV.sFlt-1, de
la 6 a la 9 es de ratón con AAV.sFlt-1, de la 10 a la 13 es de ratón con AAV.GFP y la 14 es un control negativo.

• La dos no expresa el gen, pero si expresa el Housekeeping, se valida como positivo.

• De la 3 a la 5, si expresa el housekeeping y el gen, se valida como positivo.
• Del 6 al 9, todos expresan el gen de menor medida, así que se valida como positivo.
• Del 10 al 13, no se expresan por lo que son negativas para este gen.
• La muestra 14 es el control negativo de agua, en este no debería haber amplificación. Si el control
negativo da una amplificación todo esta malo.
Variantes de la PCR

Distintos tipos de PCR que tienen variaciones, pero todos se basan en el mismo principio.

Principio del método

1. Desnaturalización: del DNA para obtener moléculas monocatenarias.

2. Annealing: hibridación especifica de la molécula monocatenaria con un oligonucleótido (primers).
3. Extensión: replicación de la molécula monocatenaria mediante una DNA polimerasa que emplea el
oligonucleótido anterior como cebador. También se puede denominar elongación o extensión del
cebador, o polimerización.

PCR anidado (nested- PCR)

Este tipo de PCR es muy sensible, es por esto que se ocupa en las siguientes situaciones:

• Cuando el fragmento del DNA que se quiere identificar se encuentra en baja cantidad en el ADN que
se esta analizando.
• Cuando la cantidad de ADN presente en la reacción es muy baja.

En este tipo de PCR son dos PCR consecutivas

1. Puede tener de 15 a 30 ciclos. Se amplifica un fragmento y dentro de este fragmento esta lo que se quiere
identificar. Se utilizan primers externos.
2. La segunda PCR ocupa el producto de la primera PCR como el DNA templado, generalmente es de 25
ciclos. Se utilizan primers internos, se amplifica el segundo producto de PCR.

Al ser tan sensible, tenemos inespecificidad solo en el primer

PCR y no en el segundo. Es decir, en el primer PCR los primers
se pueden unir a diferentes regiones, pero es imposible que en
el segundo ocurra una amplificación inespecífica. Si los primers
no se pegan de manera correcta, no va a ocurrir la segunda PCR.

Hay otra variante del Nasted PCR que se denomina semi-

anidado, cuando se realiza el segundo PCR se utiliza uno de los
primers que ya se utilizo en la segunda PCR, entonces un primer
externo se ocuparía en vez de un primer interno. Esta técnica se
utiliza para la detección de virus, bacterias y algunos parásitos.

PCR múltiple (multiplex PCR)

• En este caso, con una sola reacción se van a identificar distintas secuencias, genes o
microorganismos. Por lo tanto, aquí se aumenta la información que se obtiene de una sola PCR, en este
caso se disminuye el tiempo de la amplificación y el costo, ya que es distinto visualizar 7 genes en un solo
gel a hacer 7 geles para 7 genes.
• Se utilizan los mismos componentes de una PCR tradicional, la única diferencia es que se van a agregar
distintos primers, que corresponden a cada secuencia que se quiere
amplificar.
• El PCR múltiple nos da información muy rápida, pero hay que estandarizar
los primers que deben tener una baja formación de dímeros, las condiciones
grupales, por lo que es muy tardado.
• Cuando se realiza el diseño de primers para este PCR, el producto de
identificación o los amplicones que se van a diseñar tienen que ser de
distintos tamaños ya que tenemos que identificarlos por separado, deben
tener al menos 50 pb de diferencia para ver las diferentes bandas.
• Se utiliza para el análisis de deleciones genéticas; análisis de polimorfismos y
mutaciones; análisis cuantitativos; en el área de las enfermedades infecciosas,
es importante para la identificación de virus, bacterias y parásitos.
En un mismo tubo de PCR se agregan los distintos primers, donde cada uno debe tener una distancia entre su
peso molecular para una correcta identificación.

PCR multiplex donde se utilizó Staphylococcos y

genes de resistencia, en este caso son 5 en una
misma reacción.

• El carril uno es positivo para vanB;

femB; ileS-2 y mecA.
• El carril dos es positivo para vanA;
femB; ileS-2 y mecA.
• El carril tres es positivo solo para femB.
• El carril cuatro es positivo para femB y
vanB.

PCR con partidores arbitarios (AP-PCR)

Es una técnica simple, rápida y barata. Tiene un poder discriminatorio variable y las condiciones en las que se
realiza es en condiciones de baja astringencia del DNA (determina la estabilidad de la hebra de ADN). Se utiliza
un solo primers de 10-20pb. El resultado va a ser varios fragmentos de distintos tamaños.

Es el método más adecuado para una tipificación comparativa rápida, ya que se pueden obtener resultados
durante el día, de manera de poder controlar brotes epidemiológicos intrahospitalarios.

El cebador, se va a unir en cualquier parte, pero mientras se

una en un extremo 3´donde la polimerasa pueda copiar, esta
bien. Al ser un solo cebador y varios genes por identificar, las
bandas van a ser totalmente diferente para cada uno, esto se
debe a que el cebador se va a pegar donde encuentre una
hebra complementaria, por ende, no es la misma para todos.

Como el primer se puede pegar en cualquier lado, se van a

ver gran cantidad de productos, los chorreos corresponden a
muchas bandas pequeñitas, que vendrían siendo productos
inespecíficos en el PCR. He de recordar que el chorreo
corresponde a inespecificidad.

PCR transcripción reversa RT-PCR

RT-PCR es una retro transcripción y luego una PCR. Se inicia con el RNAm para
terminar con el DNAc que seria nuestro molde para la PCR. Este tipo de PCR se
utiliza para estudiar expresión génica.

• Una desventaja es que se necesitan altas cantidades de RNAm para

realizarlo, se ocupan 2ng para poder iniciar.
• Antes era un proceso largo y tedioso, pero actualmente existe un equipo
con el cual se realiza de forma más rápida.
• En el termociclador se configura una etapa antes del inicio de la PCR
para la retro transcripción y luego se sigue normal.
PCR Real Time o qPCR

Esta PCR es la única que nos va a permitir cuantificar, en esta PCR se va viendo la cinética de la reacción y
cuantificar las cantidades de ADN o ARN, dependiendo si el templado es ADNg o ADNc.

Se hace a partir de fluorescencia, es decir, se trabaja con fluoróforo que se pueden unir de manera inespecíficas o
especifica a la hebra.

En la siguiente curva en el eje x tenemos la cantidad de ciclos y en el eje Y tenemos la fluorescencia, por lo que a
medida que aumenta el numero de ciclos, aumenta el numero de ciclos y la intensidad de fluorescencia, puede
ser por la sonda o una sonda inespecífica.

Se tiene un umbral, el cual depende de criterios matemáticos o de quitar el ruido de fondo. Cuando la curva se
levanta sobre el umbral, esto corresponde a un numero de ciclo en específico, tenemos un CT (numero de ciclos
al cual se levanta).

También se puede realizar la cuantificación de cantidades de DNA, con una curva de calibrado, es decir,
realizando la PCR con distintas cantidades de DNA, donde para cada una se tiene una cantidad distinta de CT y
esto se puede graficar. Como son inversamente proporcionales, debido a que mientras mayor es la cantidad de
ADN menor es la cantidad de ciclos. Mientras mayor cantidad de ADN tenemos mayor amplificación, por lo
tanto, se supera el umbral en un numero más pequeño. Mientras menor es la cantidad de ADN el ciclo es mayor.

Hay dos maneras para cuantificar

• Cuantificación absoluta: una curva de calibrado, se interpola la absorbancia y se despeja la

concentración. Concentración de DNA (X) x numero de ciclos (Y) y se obtiene la ecuación de la recta.
Se realiza una curva de calibrado para realizar la cuantificación de DNA. Esto se utiliza mucho para ver
el número de copias de virus.
• Cuantificación relativa: se quieren evaluar los cambios en los niveles de expresión del RNAm, se debe
extraer un ácido nucleico, que en este caso es desde DNAc ya que al ser de RNAm debe ser DNAc. Se
debe hacer una curva de calibrado de todas formas, pero es con otro objetivo.

En la imagen tenemos lo que se le puede agregar al máster

mix para una qPCR. Se puede agregar un intercalante que es
un fluoróforo inespecífico, en este caso se puede utilizar otro
intercalante que es un normalizador o sondas específicas. Se
agregan también los dNTPs (A-G-C-U), aunque se creería
que el Uracilo no debe ir ahí, en el área clínica se recomienda
utilizarlo en vez de la Timina y por esto se utiliza una UNG,
que es una Uracil n-glicosilasa, que ayuda a evitar
contaminación carryon.
Comparación entre un qPCR y un PCR tradicional

• Proceso de amplificación y detección de manera simultánea distinguiendo y cuantificando de manera

específica una secuencia de AN, incluso cuando ésta se presenta en pequeñas cantidades
• Permite hacer un análisis cuantitativo de la expresión de genes, detectar mutaciones (SNP), análisis de
variaciones genéticas y discriminación alélica, etc
• Permite amplificar y cuantificar en forma absoluta el producto de amplificación.
• Monitorear el progreso de la reacción de PCR a medida que esta ocurre (cinética).
• Comparar los niveles de expresión del transcrito de interés mediante el uso de Fluorocromos.
• Mediante la detección de fluorescencia se puede medir la amplificación de la cantidad de DNA
sintetizado. La emisión de fluorescencia producida en la reacción es proporcional a la cantidad de DNA
formado.

Introducción

• La cantidad de ADN se mide después de cada ciclo a

través de tintes fluorescente que producen un
aumento en la señal de fluorescencia en proporción
directa al número de moléculas de producto de PCR
(amplicones) generadas.
• Datos recolectados en la fase exponencial de la
reacción dan información cuantitativa sobre la
cantidad inicial del objetivo de ampliación.
• Se tienen varias muestras, donde la que tenga mayor
concentración de ADN va a tener un CT menor.

Fluorocromos

• Poseen un alto coeficiente de extinción a la λ de excitación (absorción de luz)

• Alto rendimiento cuántico (emisión de luz)
• Elevada foto sensibilidad
• Corto estado de excitación
• El fluoróforo es una molécula que absorbe radiación a una longitud de onda determinada y luego emite
E absorbida en forma de luz a una longitud de onda diferente.
Clasificación de la PCR en tiempo real

• No específicos
• Sondas especificas (hidrolisis e hibridación)

SYBR Green

➢ Colorante de unión inespecífico a la doble cadena.

➢ 492nm a 520nm
➢ Intercalante que se une en el surco menor de la doble hebra y además de los dímeros de primer.
➢ Siempre que se utilizan se debe adicionar una curva de disociación o curva de melting.
➢ Se debe utilizar un fluoróforo como referencia, que permite compensar las diferencias de fluorescencias
debido a pequeños cambios en los volúmenes de cada tubo.
➢ ROX emisión a 608nm.

Curva de melting

➢ Nos entrega que tan especifico fue nuestra PCR.

➢ Se debe realizar cuando la detección se realiza con fluoróforo inespecíficos como SYBR Green.
➢ Es un paso extra, el ADN doble hebra es denaturado, enfriado y denaturado de nuevo, obteniéndose una
curva que muestra la recuperación de la fluorescencia.
➢ Nos muestra si existe un único producto de amplificación.
➢ Todas las muestras deberían tener el mismo peak a la misma T°, esto nos indica que tenemos un único
producto de PCR. Las curvas pequeñas a la izquierda son dímeros y a la derecha son productos
inespecíficos. En el caso de que me aparezcan productos inespecíficos la PCR no nos sirve, esto se debe
a que la concentración de primer no está bien estandarizada
Sondas especificas

Sondas marcadas con dos tipos de flkuorocromos

• Un donador (D)
• Un aceptor (A)

Algunas utilizan dos secuencias partidoras y otras una sola que tiene
donador y aceptor

Hay sondas de

Hidrolisis: TaqMan, esta utiliza la actividad 5´exonucleasa de la

Taqpolimerasa, es decir es capaz de cortar lo que pille por el 5´.

➢ Utiliza dos colorantes fluorescentes unidos donde en el extremo

5´esta el fluorocromo (donador) que emite la fluorescencia y en
el 3´el quencher o aceptor, que absorbe la fluorescencia del
donador.
➢ Cuando TaqMan esta hibridad no hay fluorescencia ya que lo que
imite el donador lo apaga el aceptor. La polimerasa comienza a
copiar hasta que llega a la zona TaqMan, donde hidrolisa en la
zona 5´y como se hidroliza el dador, comienza a emitir
fluoresencia.
➢ Es para fragmentos muy pequeños entre 60 y 150pb.
➢ La Tm debe ser 10°> que el de los cebadpres, de modo que
hibride antes que los mismos (60°C).
➢ La ventaja de TaqMan es que es muy especificas, y sus
desventajas que es muy cara y necesita una sonda para cada
producto.
➢ La sonda anilla de 3-12 pb del primer, por esto que es muy
especifica y eficiente.

Hibridación: molecular beacons y FRET

➢ Las sondas de hibridación, hibridan y fluorescen.

➢ Se utilizan dos sondas especificas y dos primers, un dador o reportero
(3´fluorescencia) y un quencher o aceptor (5´absorbe).
➢ Se unen en forma de tallo a la sencuencia.
➢ Se tiene la Sonda Beacon y la Sonda Fret.
• Las sondas Beacon, siempre antes de unirse a la hebra van a estar
como horquillas, porque son muy complementarias entre el
extremo 5 y el 3, por lo que antes que se una van a estar enrrolladas,
por lo que el dador esta muy cerca del aceptor y se apaga, pero al
momento de estar en contacto con el DNA estas se separan.
• Las sondas Fret son dos sondas distintas una sonda que tiene por
el extremo 3´al dador y otra sonda que tiene por el 5´al aceptor, es
por esto que al momento de diseñar las sondas se deben diseñar para
que hibriden en secuencias distintas del DNA, pero que esten muy
cerca. Al momento que hibridan en la secuencia de DNA. Cuando
ambas sondas hibridan, los fluoróforos se encuentran muy cercanos
entre sí, permitiendo que el fluoróforo reportero se excite y emita
fluorescencia, excitando al fluoróforo aceptor, lo que se denomina
transferencia de energía fluorescente mediante resonancia o FRET.
Esto produce la emisión de fluorescencia, que se detecta en la etapa de
hibridación y al inicio de la elongación en la reacción de PCR.
Analisis de datos

Curva de calibracion de PCR en tiempo real

• Se puede utilizar una serie de diluciones de concentraciones conocidas del templado para establecer
una curva estándar para determinar la cantidad de una muestra o para evaluar la eficiencia de la
reacción .
• El logaritmo de cada concentración conocida en la serie de diluciones (eje x) se traza contra el Ct valor
para esa concentración.
• La intersección con el eje y corresponde al límite teórico de detección de la reacción
• La pendiente de la fase log-lineal de la amplificación la reacción es una medida de la eficiencia de la
reacción

Eficiencia de la amplificación

• Utilizado para cada par de primers utilizado

• Esta eficiencia debe variar entre 90-110%, que corresponde a valores de pendiente entre -3,1 y -3,5 .
Cuantificación relativa

• Con los valores de Ct y de la eficiencia de cada gen (E), se puede determinar las veces de inducción del
gen de interés (GOI).
• Para esto se debe contar con controles internos o «housekeeping» (HK).
• En el caso del diagnóstico clínico, los más comunes son β-actina, β-globina, gliceraldehído 3-fosfato
deshidrogenasa (GAPDH) y ciclofilina, presentes en el genoma humano.
• Para calcular la inducción de cada gen se usa la siguiente fórmula que incluye los valores de eficiencia
y Ct de cada gen amplificado en el tratamiento y en el control respecto a su control interno.