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MÉTODOS INSTRUMENTALES DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR I

(curso 2023-24)

PROFESORA: DRA. ESTHER LARREA

Parte III: Métodos inmunológicos en la detección de proteínas

Práctica 1: Análisis de la activación de proteínas por Western-blot

(- Cultivo celular y tratamiento con IFNalfa a tiempos cortos)
(- Lisis celular y preparación del extracto proteico)
- Cuantificación de la concentración de proteína
- SDS-PAGE
- Trasferencia proteínas de gel a membrana
- Inmunodetección de proteínas

Práctica 2: Cuantificación de proteínas por ELISA.

(- Cultivo celular y tratamiento con IFNalfa a tiempos largos)
- Determinación de los niveles de la proteína IP-10 por ELISA.
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Programa:
Día 1: (4h)
 Introducción a las técnicas inmunológicas. Western-blot.
 Realizar los cálculos para la preparación de soluciones.
 Preparar gel SDS-PAGE.
 Preparar soluciones.

Día 2: (4h)
 Cuantificación de proteínas por método de Bradford (muestras problema: extracto
proteico células Huh7 ± IFNα 1h)
 SDS-PAGE: Cargar muestras (extracto proteico Huh7 ± IFNα 1h) en el gel de
poliacrilamida y correr electroforesis
 Trasferencia proteínas de gel a membrana nitrocelulosa
 Verificar la transferencia: tinción membrana rojo ponceau
 Bloquear las membranas de nitrocelulosa
 Preparar soluciones

Día 3: (4h)
 Incubar las membranas de nitrocelulosa con anticuerpos primarios (anti-Stat1 total y
anti Stat1-tyr), anticuerpo secundario, sustrato y capturar imagen
quimioluminiscencia
 Explicación técnica ELISA
 Empezar ELISA IP10: Tapizar placa ELISA con Ac. Anti-IP-10
 Preparar soluciones

Día 4: (4h)
 ELISA IP10

Día 5: (2h)
 Analizar y discutir resultados western-blot y ELISA
 Comentar cuestiones del guion
 Test Wooclap
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Introducción:
1.1 Métodos inmunológicos
Los métodos inmunológicos para la detección de proteínas se basan en la utilización de
anticuerpos (Ac) específicos frente a los antígenos (Ag) en estudio.

Enzima
Fluoróforo
Radiactividad

Anticuerpo 2ª
marcado

Anticuerpo 1ª
marcado Anticuerpo 1ª

Antígeno Antígeno

Método Directo Método Indirecto

Existen varias técnicas inmunológicas para la detección de proteínas. Los diversos métodos
difieren principalmente en la forma que el antígeno es presentado a los anticuerpos y en la
manera de detectar el inmunocomplejo (Ag-Ac). Las técnicas más usadas en el laboratorio son:
Inmunofluorescencia, Inmunohistoquímica, Citometría de flujo, Western-blot,
Inmunoprecipitación y ELISA (Enzime linked inmunoabsorbent assay). Estas técnicas la
podemos agrupar en dos:
a) Técnicas que estudian el antígeno “in situ”: Inmunofluorescencia, Inmunohistoquímica,
Citometría de flujo.
b) Técnicas que estudian el antígeno “extraído”: Western-blot, ELISA,
Inmunoprecititación. Dentro de este grupo, podemos diferenciar las técnicas que
estudian el antígeno en solución (ELISA, Inmunoprecipitación) y las que estudian el
antígeno absorbido a un soporte sólido (western-blot).
El sistema de detección del inmunocomplejo Ag-Ac también es variado. El anticuerpo
primario (en el método directo), ó el anticuerpo secundario (en el método indirecto), pueden
estar marcados:
a) Fluoróforos
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b) Enzima. Las enzimas más utilizadas son la peroxidada y la fosfatasa alcalina. Además,
dependiendo del sustrato añadido a estas enzimas, podemos tener una reacción que nos
de luz ó color.
La sensibilidad de las diferentes técnicas también es diferente. Además, aunque con todas ellas
podemos decir si el antígeno está presente o no, nos pueden dar información adicional sobre el
antígeno. Por ejemplo, con la inmunofluorescencia y la inmunohistóquímica podemos estudiar
la localización del antígeno, dentro de un tejido podemos decir qué células lo expresan, y
dentro de una célula podemos decir si su localización es de membrana, núcleo, citosol, etc. El
western-blot nos permite saber el tamaño del antígeno. El ELISA nos permite cuantificar la
cantidad exacta de antígeno que tenemos. Con la inmunoprecipitación podemos estudiar
interacciones entre proteínas, además del tamaño.

Debido a esta diversidad de información que nos puede dar cada técnica, es importante saber
qué queremos saber del antígeno antes de realizar una técnica u otra. Si queremos sólo
presencia, nos puede servir cualquiera. Si queremos estudiar localización deberemos hacer
inmunofluorescencia o inmunohistoquímica, etc.
Es importante saber que no todos los anticuerpos disponibles en el mercado sirven para todas
las técnicas. Ello también nos condiciona la técnica a utilizar.

Para las técnicas que nos permiten estudiar la localización del antígeno (inmunofluorescencia,
inmunohistoquímica) se requiere un tratamiento previo de la muestra donde se inmovilice el
antígeno y se preserve la estructura del tejido y de las células.

Para las técnicas que requieren del antígeno extraído, existen diversos procedimientos para ello
que nos permiten obtener las proteínas desnaturalizadas o no. Para la técnica del western-blot,
donde previamente se hace un SDS-PAGE (condiciones desnaturalizantes, como veremos más
adelante), podemos realizar un extracto proteico de forma rápida en condiciones
desnaturalizantes (un tampón que contenga el detergente SDS y un agente reductor, DTT ó
mercaptoetanol, y posterior calentamiento a 100º durante 5 minutos). Pero muchas veces nos
interesa tener las proteínas no desnaturalizadas, para estudiar función, interacciones, etc. En
estos casos tenemos que realizar un extracto proteico en un tampón de lisis que contenga sales,
detergentes suaves, inhibidores de proteasas, un pH determinado, etc. Uno de estas soluciones
que nos permite obtener las proteínas no desnaturalizadas es la solución RIPA.
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1.2. El Interferón
En los dos métodos inmunológicos que se van a realizar en el laboratorio, vamos a comparar la
expresión de proteínas basalmente y tras tratamiento con IFNalfa, de la línea celular Huh7
(hepatocarcinoma humano). Por ello, a continuación, se hace una breve descripción del IFN y
cómo actúa sobre las células.
Los interferones (IFN) son proteínas que se producen de forma natural en células del
organismo para actuar frente a infecciones y tumores. Existen tres clases de interferones: alfa,
beta (IFN tipo I) y gamma (IFN tipo II). Los interferones son fármacos que activan las
defensas fisiológicas y controlan el crecimiento celular, atacando a células infectadas o a
células cancerosas.
¿Cómo actúa?
Para que el IFNalfa actúe sobre una célula, es necesario que esta célula posea receptor de
IFNalfa en su superficie. Tras la unión del IFNalfa a su receptor, se pone en marcha una
cascada de señalización
intracelular que da lugar a la
inducción de genes
antivirales,
antiproliferativos e
inmunomoduladores. Esta
cascada de señalización
comienza con la activación
de dos tirosina-kinasas
unidas al receptor de
IFNalfa: JAK1 y TYK2.
Estas kinasas activadas
fosforilan en residuos de
tirosina a los factores de transcripción STAT1, STAT2 y STAT3, que normalmente se
encuentran en el citoplasma celular en su forma no fosforilada (inactiva). Estos factores de
transcripción, una vez fosforilados forman homo- y heterodímeros entre ellos (stat1-stat1,
stat1-stat2, stat1-stat3, etc) y se translocan al núcleo. Aquí, se unen a otro factor de
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transcripción p48 y el trímero es capaz de unirse a los promotores de los genes con secuencia
ISRE y activar su transcripción. Uno de estos genes es IP10.
¿Para qué se utiliza?
Debido a sus propiedades antivirales, inmunomoduladoras y antiproliferativas, el IFN tipo I es
eficaz en diversas enfermedades virales y ciertos tumores.

El objetivo de estas prácticas es mostrar la utilidad de las técnicas western blot y ELISA para
la determinación y cuantificación de proteínas en estudios comparativos de activación celular.

Con el desarrollo de esta práctica se pretende que el alumno aprenda a:

- Cuantificar proteínas.
- Separar proteínas mediante la técnica SDS-PAGE.
- Inmunodetección de proteínas específicas: western blot y ELISA.
- Interpretación de resultados.
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Práctica 1. Análisis de la activación de proteínas por Western-blot: Stat1-p

1. Obtención de la muestra problema: extracto proteico células Huh7 tratadas con IFN-
alfa durante 1h.
Tratamiento células Huh7 con IFNalfa durante 1h:
La línea celular Huh7 proviene de un hepatocarcinoma humano. Crece adherida a plástico
en medio de cultivo DMEN suplementado con 10% suero fetal de ternera (FCS) y
antibióticos (100 U/ml penicilina y 100 g/ml estreptomicina). Las líneas celulares se
mantienen en cultivo a 37 ºC, con 5% de CO2 y ambiente húmedo. Estas condiciones se
programan en los llamados incubadores de células. El mantenimiento en cultivo de una
línea celular requiere trabajar en condiciones de esterilidad. Siempre en cabinas de flujo
laminar (contienen filtros HEPA que filtran el aire que entra en la cabina), con guantes, y
utilizando todo el material esterilizado.
Se realizó, a la línea celular Huh7, un tratamiento con IFNalfa, durante 1 h, para estudiar la
activación (fosforilación) del factor de transcripción stat1.
El tratamiento se realizó en una cabina de flujo laminar, con material esterilizado y
siguiendo los siguientes pasos:
- Sembrar 1x106 células Huh7/placa de cultivo, en el medio descrito anteriormente.
Sembrar 2 placas. Dejar que se adhieran al plástico y estabilicen hasta el día siguiente.
- Tras 24 h, retirar el medio y añadir medio nuevo con 500 U/ml IFNalfa en una placa. A la
segunda se añade medio nuevo SIN IFNalfa (tratamiento basal).
- A 1 h postratamiento con IFNalfa, se retira el medio de cultivo, se lavan las células con
PBS y posteriormente se recogen las células en 5 ml de PBS con ayuda de un “scraper”. Se
recoge igualmente las células de la placa sin tratamiento IFNalfa.
- Centrifugar las células a 1.600 rpm durante 8 minutos, retirar el medio. El pellet celular se
guarda a -80 ºC ó se puede continuar con la obtención del extracto proteico.

Obtención del extracto proteico de las células Huh7 tratadas durante 1h con IFNalfa:
Se realizó una extracción de proteínas de las células Huh7, tratadas y no tratadas con IFNalfa,
en condiciones no desnaturalizantes de proteínas: solución RIPA.
Durante el proceso de obtención de los extractos proteicos es muy importante evitar la
proteolisis debida a proteasas celulares. Por ello, todo el procedimiento se realizó sobre hielo
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(4 ºC) y añadiendo inhibidores de proteasas. En nuestro caso, como además queremos observar
activación de proteínas por fosforilación, añadimos inhibidores de fosfatasas. (Las fosfatasas
son enzimas que catalizan la eliminación de grupos fosfato de algunos sustratos. Esta reacción
es opuesta a la fosforilación, realizada por las enzimas kinasas).
Soluciones:
- Soluciones stock: - NaCl 2 M (50 ml) (Pm NaCl 58,44) ………g/50 ml
- Tris 1M, pH 8 (50 ml) (Pm Tris 121,14) ……….g/50 ml (+4ml ClH
5N). Ajustar pH.
- SDS 10% (comercial)
- Inhibidores de proteasas (PMSF 100 mM, Aprotinina 1 mg/ml)
-Inhibidores fosfatasas (ortovanadato sódico 1M, Pirofosfato sódico
0,5M).
- Solución RIPA (5 ml)
150 mM NaCl (……………..ml del stock 2 M)
50 mM Tris pH 8 (……………..ml del stock 1 M)
0,1% SDS (……………..ml del stock 10%)
1% Triton X-100 (……………..ml)
0,5% (p/v) DOC (Deoxicolato sódio) (………………g)
………………..ml H2O
Método
Todo el proceso se realizó sobre hielo.
- Añadir a la solución RIPA (5 ml) inhibidores de proteasas: PMSF 1 mM (stock 100 mM,
preparado en isopropanol), aprotinina 1 g/ml (Stock 1mg/ml), e inhibidores de fosfatasas
(para preservan la fosforilación de proteínas en el lisado celular): ortovanadato sódico 1 mM
(inhibe tirosina fosfatasas, stock 1 M), pirofosfato sódico 1 mM (falso sustrato de fosfatasas,
stock 0,5 M).
……….l PMSF ………….l aprotinina
………l ortovanadato sódico ………….l pirofosfato sódico

- Resuspender el pellet celular bien. Añadir al pellet resuspendido, 0,5 ml de solución RIPA
con inhibidores de proteasas y fosfatasas. Dejar incubar los tubos 30 minutos en agitación a 4
ºC.
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- Centrifugar a 13.000 rpm en microfuga a 4ºC durante 20 minutos.

- Recoger el sobrenadante que contiene el extracto proteico. Desechar el pellet del fondo del
tubo que contiene detritus celulares.
- Guardar el extracto proteico en hielo si se va a realizar la cuantificación de proteínas a
continuación o a -80ºC, si se va analizar en días posteriores.

2. Cuantificación de la concentración de proteína en el extracto proteico

Para realizar estudios comparativos de expresión de proteínas ó activación de las mismas en
diferentes condiciones (por ejemplo, antes y después de un tratamiento) se requiere partir de
una misma cantidad de proteína total.
Existen varios métodos para determinar la concentración de proteína total en una muestra:
- Métodos espectrofotométricos:
- Absorbancia a 280 nm de los aminoácidos aromáticos: triptófano, tirosina,
fenilalanina. Limitaciones: las
diferentes proteínas tienen distinto
contenido de triptófano, tirosina y,
fenilalanina, haciendo difícil una
calibración con curva estándar
- Absorbancia a 205 nm
del enlace peptídico.
Limitaciones: Algunos componentes
de los tampones también absorben a
205 nm.
- Métodos colorimétricos:
- Ensayo de Biuret: Es un método colorimétrico que permite determinar la
concentración de proteínas de una muestra mediante espectroscopía ultravioleta-visible a una
longitud de onda de 560 nm (para detectar el ión Cu2+).
Consiste en hidróxido potásico (KOH) y sulfato cúprico (CuSO4), junto con tartrato de sodio y
potasio (KNaC4O6ꞏ4H2O). El reactivo, de color azul, cambia a violeta en presencia de
proteínas, y vira a rosa cuando se combina con polipéptidos de cadena corta. El hidróxido de
potasio no participa en la reacción, pero proporciona el medio alcalino necesario para que
tenga lugar.
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- Método de Lowry: Este método combina la reacción de iones de cobre con los enlaces
peptídicos bajo condiciones alcalinas (Biuret), con la oxidación de los residuos aromáticos de
las proteínas.

Las desventajas de este método es que requiere largos periodos de incubación y las
interferencias con los tampones utilizados habitualmente para la obtención de los extractos
proteicos.

- Método ácido bicinconínico (BCA). Este método combina la reducción del ión cúprico
(Cu +2) a ión cuproso (Cu +1) en un medio alcalino (reacción de biuret) y la detección de este
catión (Cu +1) usando un reactivo que contiene el ácido bicinconínico. El producto final de la
reacción es de un color púrpura formado por la unión de dos moléculas BCA con una del ión
cuproso. Este complejo hidrosoluble puede ser detectado mediante absorbancia a una longitud
de onda de 560 nm

- Método de Bradford: consiste en la cuantificación de la unión del colorante Azul

Brillante de Coomassie a las proteínas de las muestras. Es uno de los métodos utilizado
habitualmente.

2.1 Cuantificación de proteínas por el método de Bradford

La concentración de proteína se determinará por un método colorimétrico comercial (Bio Rad
Protein Assay), basado en el método de Bradford. Este consiste en la cuantificación de la unión
del colorante Azul Brillante de Coomassie a las proteínas de las muestras en relación con la
unión a diferentes cantidades de una proteína patrón, en nuestro caso BSA (albúmina de suero
de ternera).
Material
- Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad)
- Solución stock BSA (2 mg/ml)
- Solución RIPA
- Lector de ELISA con filtro 595 nm

Protocolo
- Preparación de la curva estándar de BSA. Preparar 8 diluciones dobles seriadas en agua de la
solución stock de BSA en tubos ependorf de 1,5 ml, bien etiquetados:
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40 l solución stock BSA: 2 mg/ml (a)

40 l agua + 40 l solución stock BSA: 1 mg/ml BSA. Agitar suavemente con pipeta (b)
40 l agua + 40 l dilución (b): 0,5 mg/ml BSA. Agitar suavemente con pipeta (c)
40 l agua + 40 l dilución (c): 0,25 mg/ml BSA. Agitar suavemente con pipeta (d)
40 l agua + 40 l dilución (d): 0,125 mg/ml BSA. Agitar suavemente con pipeta (e)
40 l agua + 40 l dilución (e): 0,062 mg/ml BSA. Agitar suavemente con pipeta (f)
40 l agua + 40 l dilución (f): 0,031 mg/ml BSA. Agitar suavemente con pipeta (g)
40 l agua + 40 l dilución (g): 0,015 mg/ml BSA. Agitar suavemente con pipeta (h)
Curva final BSA: 2 mg/ml, 1 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,25 mg/ml, 0,125 mg/ml, 0,0625 mg/ml,
0,031 mg/ml, 0,0156 mg/ml.
- Preparar las 2 muestras problema: basal y tto IFN 1h, diluir las dos muestras en agua,
dilución 1/10 (10 microlitros muestra+ 90 microlitros agua).
- Diluir solución RIPA en agua (dilución 1/10) (10 microlitros solución RIPA+ 90 microlitros
agua). Nos sirve de blanco ya que las muestras las tenemos en solución RIPA.
- Hacer una dilución 1/5 de la solución Bradford en agua (1 ml solución Bradford + 4 ml agua).
Y añadir 190 microlitros de dicha solución Bradford diluida a los pocillos que se van a usar de
la placa de 96 pocillos (ver siguiente esquema).
- Añadir 10 l de cada dilución del estándar de BSA, de las dos muestras ya diluidas (basal
1/10, tto IFN 1h 1/10) y de la solución RIPA diluida (blanco) sobre la solución Bradford que
hemos colocado anteriormente en los diferentes pocillos de la placa (según esquema siguiente
y todo por duplicado). Mezclar con la pipeta suavemente para evitar formar burbujas.
BSA BSA Basal
2mg/ml 2mg/ml 1/10
BSA BSA Basal
1mg/ml 1mg/ml 1/10
BSA BSA Tto
0,5mg/ml 0,5mg/ml IFN1h
BSA BSA Tto
0,25mg/ml 0,25mg/ml IFN1h
BSA BSA Blanco
0,125mg/ml 0,125mg/ml
BSA BSA Blanco
0,062mg/ml 0,062mg/ml
BSA BSA
0,032mg/ml 0,032mg/ml
BSA BSA
0,015mg/ml 0,015mg/ml
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- Incubar 10 minutos a temperatura ambiente.

- Leer absorbancia a 595 nm. (Programar el lector de placas para que lea la absorbancia de
cada muestra a 595 nm y nos reste el valor de absorbancia del blanco).
- Trazar una recta con las concentraciones conocidas del estándar de BSA y sus respectivos
valores de absorbancia (media del duplicado), y calcular la ecuación de la recta (y = a x + b)
- Interpolar en la ecuación de la recta el valor de absorbancia de las muestras problema para
calcular su concentración (evitar los puntos saturados de la curva). (Tened en cuenta que las
muestras se diluyeron 1/10)

BSA mg/ml Abs. 595nm

2
1
0,5
0,25
0,125
0,0625
0,031
0,0156

Concentración proteína total en las muestras:

- Huh7-basal:-------------------------------
- Huh7-tto IFNalfa 1h: ------------------------------------

3. SDS-PAGE
Introducción:
El SDS-PAGE (gel de electroforesis en matriz de poliacrilamida y condiciones
desnaturalizantes: 0,1% SDS) es la técnica electroforética más utilizada para el análisis de
proteínas en base a su peso molecular. El SDS es un detergente aniónico que solubiliza,
desnaturaliza y disocia fuertemente la mayoría de las proteínas. Casi todas las proteínas unen
una cantidad constante de SDS (1,4 g SDS/g proteína) alcanzando idéntica densidad de carga
(esto enmascara la carga de las cadenas polipeptídicas) y por lo tanto, el complejo SDS-
proteína migra hacia el ánodo de acuerdo a su peso molecular (no a la carga).
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Los geles de poliacrilamida se forman por la polimerización de monómeros de

acrilamida formando cadenas
lineales de acrilamida polimérica y
la unión de estas cadenas por
puentes transversales de
N,N´methylene-bis-acrilamida. La
reacción de polimerización se
inicia con la adición del persulfato
de amonio (APS) y es acelerada
por el TEMED, el cual cataliza la
formación de radicales libres
desde el persulfato de amonio. Las
concentraciones de acrilamida y bisacrilamida determinan el tamaño del poro en el gel. La
mayoría de las proteínas se resuelven en geles de poliacrilamida que contengan entre 5-20% de
acrilamida y 0,2-0,5% de bisacrilamida. Concentraciones de acrilamida del 5% resuelven
proteínas entre 60-200 KDa, 10% entre 16-70 KDA y 15% entre 12-45 KDa.
Para conocer el peso molecular de las proteínas de nuestra muestra se suele correr en
una calle del gel un marcador de peso molecular de proteínas, el cual contiene una serie de
proteínas de conocido peso molecular.
Gel de electroforesis discontinuo es el más utilizado, está basado en el sistema descrito
por Laemmli y es el utilizado en este protocolo. Este sistema aumenta la resolución de las
proteínas debido a que utiliza dos soluciones de acrilamida-bis-acrilamida con diferente
concentración de acrilamida y a diferente pH:
- Solución gel apilamiento: Tris Cl/SDS pH 6,8, baja concentración acrilamida. (Función:
acumular las proteínas a la entrada del gel separador para que salgan al mismo tiempo)
- Solución gel separación: Tris Cl/SDS pH 8,8, alta concentración acrilamida. (Función:
separar las proteínas).
Por lo que en este sistema se dan los siguientes hechos:
- Gel de apilamiento con grandes poros (baja concentración de acrilamida), mientras
que el gel de separación tiene una alta concentración de acrilamida dependiente del tamaño de
proteínas que se quieren separar.
- La muestra de proteína y ambos geles tienen iones Cl- , mientras el buffer de
electroforesis lleva iones de glicina.
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- El pH del gel de separación es mayor al pH del gel de apilamiento y al pH de la

muestra.
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En el gel de apilamiento a pH 6,8 la
glicina se disocia poco, por lo que
tiene baja movilidad electroforética.
Mientras que el cloro es altamente
Gel apilamiento
disociado y tiene alta movilidad. La
Gel separación
muestra de proteína tiene movilidad
3 4
intermedia entre el cloro y la
glicina. Cuando se aplica un campo
eléctrico, el Cl- migra rápidamente,
mientras que la glicina va
lentamente dejando detrás una zona
de baja conductividad. Las
proteínas no se frenan por el tamaño del poro (poros grandes porque la concentración de
acrilamida es baja), pero tienen una movilidad reducida, y son “atropelladas” por la glicina que
avanza por detrás, por lo que les aumenta la movilidad y se paran al llegar al gel de separación
por el pequeño tamaño del poro de éste. Allí se concentran, en base a su movilidad individual.
En el gel de separación, a pH 8,8 la glicina se disocia mucho más y alcanza una movilidad
similar a la del Cl- y mucho más grande que la de la muestra. Los iones glicina adelantan a las
proteínas y éstas debido al tamaño reducido del poro se separan en base a su peso molecular.
Es importante que la muestra de proteínas reaccione eficientemente con el SDS, para
ello se calienta la muestra en buffer muestra (contiene SDS) durante 5 minutos a 100 ºC. El
buffer muestra también contiene:
- 2-Mercaptoetanol: rompe uniones bisulfuro (se puede reemplazar por DTT).
- Glicerol: aumenta la densidad de la muestra lo que facilita cargarla en el pocillo.
- Azul de bromophenol: es un colorante que nos marca el frente de la electroforesis.
Para obtener una buena estimación del peso molecular de las proteínas por SDS-PAGE es
importante que el SDS se una de forma constante a todas las proteínas.

Soluciones
(Todas las soluciones se prepararán con agua destilada).
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1. Soluciones stock:
- 40% acrylamida/0,8% bisacrylamida (comercial)
- SDS 10% (comercial)
- APS 10% (p/v) (persulfato de amonio) (1 ml) (………………g/1 ml).
- Tris 1,5 M pH: 8,8. (50 ml) (Pm Tris 121,14) (……......g Tris base/50 ml, (+2ml
ClH 5N) Ajustar pH).
- Tris 0,5 M pH: 6,8 (50 ml) (................g Tris base /50 ml, (+3ml ClH 5N),
Ajustar pH).
2. Solución del gel de separación al 7,5 % acrilamida, 0,1% SDS, (10 ml para 1 minigel):
Acrilamida stock 40% --------- ml
Agua 5,5 ml
Tris 1,5 M pH 8,8 (4x) --------- ml
SDS stock 10% ---------- ml
APS 10% * 0,05 ml
TEMED * 0,01 ml
* Se añaden en el último momento, cuando se tienen los cristales ya montados.

2. Solución del gel de apilamiento al 5 % de acrilamida, 0,1% SDS, (5 ml para 1 minigel):

Acrilamida stock 40% ----------- ml
Agua 3 ml
Tris 0,5 M pH 6,8 (4x) ------------ ml
SDS stock 10% ------------ ml
APS 10% * 0,05 ml
TEMED * 0,01 ml
* Se añaden en el último momento.
- Tampón de carrera: (25 mM Tris base, Glicina 192 mM, SDS 0,1%). (pH 8,3)
Preparar 1 litro: - …......... g Tris base (Pm Tris 121,14)
- …......... g Glicina (Pm Glicina 75,07)
- …........ ml SDS 10%

Material:
- Equipo de electroforesis
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- Fuente de poder
- Baño a 100 ºC.
Método:
- Montar los dos cristales, uno con los separadores incluidos (los cristales deben estar bien
limpios con agua y jabón, y posteriormente con etanol 70%). Se colocan en el aparato de
electroforesis.
- Añadir solución gel separación al 7,5%. (El APS y TEMED se añaden siempre en el último
momento, justo antes de colocar la solución entre los cristales). Rellenar hasta una altura de
aproximadamente ¾.
- Rellenar suavemente con agua la parte superior del gel.
- Dejar que polimerice a Tª ambiente.
- Retirar el agua.
- Preparar solución gel apilamiento.
- Añadir gel de apilamiento sobre el gel de separación hasta la parte superior del cristal. Evitar
la formación de burbujas de aire.
- Colocar el peine sobre el gel de apilamiento.
- Dejar polimerizar a Tª ambiente.
- Preparar las muestras:
En tubos de 1,5 ml bien etiquetados, mezclar la muestra de proteína con tampón de carga 5x: 4
vol muestra + 1 vol tampón carga 5x.
Por ejemplo:
Muestra basal: 160 microlitros muestra + 40 microlitros buffer carga 5x.

Muestra Tto IFN 1h: 160 microlitros muestra + 40 microlitros buffer carga 5x.

Hacer un agujero en el tapón del tubo con una aguja (cuidado de no pincharse), colocar los
tubos en un flotador y calentar 5 minutos a 100 C en el baño de agua. Poner los tubos en hielo
unos 5 minutos y darles un pulso en picofuga.
- Marcar los pocillos sobre el cristal antes de quitar el peine. Llenar el reservorio de arriba con
tampón de carrera y quitar el peine.
- Cargar las muestras (35 microlitros) y el marcador de peso molecular (PM, 6 microlitros) en
el gel, según el siguiente esquema:
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Gel:
Calle Calle Calle Calle Calle Calle 6 Calle Calle Calle Calle
1 2 3 4 5 7 8 9 10
PM Muestra Muestra -- PM Muestra Muestra -- -- --
basal Tto IFN basal Tto IFN
1h 1h

- Rellenar el reservorio inferior de la cubeta de electroforesis con tampón de carrera.

- Poner la tapa a la cubeta y conectarla a la fuente de poder (cable rojo, positivo, con entrada en
rojo de la fuente de poder; cable negro, negativo, con entrada en negro en la fuente de poder).
- Correr el gel a 80 V hasta que el bromophenol blue entre en el gel de separación. Después,
aumentar la corriente a 150 V. Vigilar que el frente no se escape del gel.
- Para sacar el gel de los cristales, es mejor con los guantes húmedos y con muchísimo cuidado
para que no se rompa. No dejarlo secar en ningún momento.

4. Transferencia proteínas del gel poliacrilamida a membrana

El western-blot consiste en la inmovilización de las proteínas en una membrana tras ser
separadas por pesos moleculares en una electroforesis. Las membranas pueden ser de
nitrocelulosa, PVDF ó nylon.
Soluciones
- Tampón de transferencia 1x (Glicina 192 mM, Tris base 25 mM, 20% metanol)
Preparar 1 litro ……….g Glicina/1 l (Pm glicina 75,07)
……….g Tris/1 l (Pm Tris 121,14 )
……….ml metanol/1 l
………ml agua
(No necesario ajustar pH)
Protocolo
- Cortar 2 papeles 3M del tamaño del gel.
- Cortar la membrana nitrocelulosa del tamaño del gel
- Sumergir la membrana de nitrocelulosa en una cubeta con agua destilada.
- Sumergir las esponjas y los 2 cortes de papel 3M en una cubeta con tampón de transferencia.
- Colocar sobre el marco negro y siguiendo el orden:
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1 esponja
1 papel 3M empapado en tampón transferencia
El gel de acrilamida
La membrana nitrocelulosa hidratada en agua (evitar la formación de burbujas)
1 papel 3M empapado en tampón transferencia
1 esponja
- Cerrar con el marco rojo
- Colocar el sándwich en la cubeta de transferencia. La membrana tiene que estar orientada
hacia el polo positivo ó ánodo (rojo).
- Conectar a la fuente de poder y transferir a 400 mA durante 1 hora.
- Extraer el sándwich de la cubeta, sacar la membrana y marcar con un lápiz las bandas del
marcador de peso molecular. (Las esponjas se lavan con agua y se dejan secar bien. El papel
3M se deshecha).
- Teñir la membrana de nitrocelulosa, que ahora ya contendrá las proteínas, con Rojo Ponceau
durante 5 minutos en agitación. Este colorante tiñe proteínas y nos permite visualizar si las
proteínas han sido transferidas correctamente a la membrana.
- Cortar la membrana por la calle 4, de tal forma que nos quedan dos membranas con las
mismas muestras: PM, muestra basal, muestra tto IFN 1h. Una la utilizaremos para la
inmunodetección del factor de transcripción Stat1 fosforilada en tyrosina y la otra para Stat1
total.

Calle 1 Calle 2 Calle 3

PM Muestra Muestra Tto
basal IFN 1h

Calle 5 Calle 6 Calle 7

PM Muestra Muestra Tto
basal IFN 1h

5 Inmunodetección
Consiste en detectar las proteínas transferidas a la membrana por una reacción específica
antígeno-anticuerpo. Los complejos antígeno-anticuerpo se revelan mediante la actividad de
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una enzima, peroxidada (HRPO) ó fosfatasa alcalina (AP), que se ha conjugado al anticuerpo
primario ó a un anticuerpo secundario, al ponerla en contacto con un sustrato.
Existen diferentes sustratos para estas enzimas, unos proporcionan color y otros luz (Ver tabla
inferior). Generalmente, los sistemas luminiscentes son más sensibles. Además, como el
producto de la reacción es soluble, se puede lavar fácilmente la membrana y volverla a incubar
con otro anticuerpo.

Sistema visualización Sustrato Comentario

Cromogénico
HRPO 4CN No muy sensible. Tweenn-20 inhibe
reacción.
DAB Más sensible 4CN. Potencialmente
carcinogénico.
TMB Más estable y menos tóxico que DAB.
AP BCIP/NBT
Luminiscente
HRPO Luminol/H2O2 Alta sensibilidad. Reacción rápida.
AP Lumigen-PPD
LumiPhos 530
Soluciones
- Kit ECL Western Blotting (Luminol/H2O2), (comercial)
- TBS 1x (20 mM Tris base, 137 mM NaCl, Ajustar pH a 7,6)
(1L) …………..g Tris base (Pm Tris 121,14)
…………..g NaCl (Pm NaCl 58,44)
Ajustar pH con ClH concentrado
………….ml Agua
(Ajustar pH a 7,6)
- TBS-Tween 20 (TBS+0,1% Tween 20) …………ml Tween 20/500 ml TBS
- TBS-Tween 20 + 5% leche …………..g leche/100 mL TBS-Tween 20
Protocolo
- Bloquear las membranas incubándolas con TBS-Tween-5% leche durante 1 hora a Tª
ambiente ó toda la noche a 4ºC, en agitación. Con ello se consigue ocupar todos los huecos que
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haya en la membrana y que no estén ocupados por proteínas, para después evitar uniones del
anticuerpo y bandeo inespecífico.
- Lavar 3x con TBS-T, lavados rápidos.
- Incubar, con agitación, durante 1 hora a temperatura ambiente con una dilución 1/2000 del
anticuerpo anti STAT1-tyr en TBS-T-5% leche una membrana y con una dilución 1/1000 del
anticuerpo anti STAT1 total en TBS-T-5% leche, la otra. (Los dos anticuerpos están hechos
en conejo y contra antígenos humanos, Huh7 es una línea humana).
- Lavar 3x con TBS-T, lavados rápidos; Luego, Lavar 3x con TBS-T, lavados 5 min y
agitación. (Para eliminar el anticuerpo sobrante).
- Incubar, con agitación, durante 1 hora a temperatura ambiente con una dilución 1/5000 del
anticuerpo secundario anti-Rabbit-HRP en TBS-T-5% leche.
- Lavar 3x con TBS-T, lavados rápidos; Luego, Lavar 3x con TBS-T, lavados 5 min y
agitación. (Para eliminar el anticuerpo sobrante).
- Revelado por quimioluminiscencia utilizando como sustrato luminol (Kit ECL Western
Blotting).
Mezclar volúmenes iguales de solución 1 (luminol) y solución 2 (agua oxigenada) en cantidad
suficiente para cubrir la membrana.
Colocar la membrana sobre un trozo de
papel de plástico. Añadir la mezcla
revelado cubriendo bien toda la
membrana. Incubar 1 minuto exacto a
temperatura ambiente. Tomar la
membrana con pinza, eliminar exceso
líquido. Colocarla en la cámara
Chemidoc y capturar imagen.
- Interpretar el resultado
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Práctica 2: Cuantificación de proteínas por ELISA

Introducción
La técnica ELISA ("Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay" ó Ensayo por inmunoabsorción
ligado a enzimas) se basa en la detección de un antígeno inmovilizado sobre una fase sólida
mediante anticuerpos que, directa o indirectamente, producen una reacción cuyo producto, por
ejemplo, un colorante, puede ser medido espectrofotométricamente. Este principio tiene
muchas de las propiedades de un inmunoensayo ideal: es versátil, robusto, simple en su
realización, y consigue, mediante el uso de la fase sólida, una separación fácil entre la fracción
retenida y la fracción libre.
Este método ha tenido una enorme aplicación en todos aquellos campos en los que se precisaba
la cuantificación de productos mediante anticuerpos: diagnóstico clínico, detección viral,
clasificación de anticuerpos en isotipos, búsqueda de anticuerpos monoclonales, etc.
Las 4 fases de un ensayo ELISA son las siguientes:
- Unión del antígeno (o del anticuerpo) a los pocillos. La unión de anticuerpos o antígenos se
realiza con facilidad a la superficie de plásticos tratados que tienen gran afinidad por proteínas.
- Formación de una o más capas de inmunocomplejos. En el caso del antígeno unido a la placa
se puede detectar mediante un anticuerpo anti-antígeno marcado (ELISA directo) o empleando
un anticuerpo primario anti-antígeno y un secundario anti primario marcado (ELISA
indirecto). Este segundo método permite la amplificación de la señal al poderse unir uno o más
anticuerpos secundarios a cada anticuerpo primario.
- Conjugación del anticuerpo o del antígeno con un enzima (peroxidasa, fosfatasa alcalina...).
El anticuerpo conjugado a la enzima se emplea en los ensayos directos e indirectos, sandwich,
etc.
- Revelado de la reacción enzimática. Después de un lavado para eliminar todas las moléculas
marcadas no fijadas en forma de inmunocomplejos se añade el sustrato enzimático en solución.
Se deja reaccionar y se lee la densidad óptica (D.O.) mediante espectrofotometría.

Tipos de ensayos ELISA Se han desarrollado múltiples variantes de ensayos ELISA que
permiten desde la cuantificación de un antígeno en solución, la detección de un anticuerpo en
una solución o la determinación de la subclase (idiotipo) de un anticuerpo. A continuación, se
describen los más comunes.
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- ELISA directo (ensayo ELISA simple de dos capas). Las placas ELISA se preparan
recubriendo los pocillos con las soluciones en las que se sospecha se encuentra el antígeno. Se
incuban con anticuerpos marcados (unidos a una enzima: peroxidas, fosfatasa alcalina, etc).
Indican la presencia de antígeno en la solución analizada. Es necesario incluir controles
negativos que serán muestras del mismo tipo de las analizadas (sangre, orina,...) pero en las
que se tenga la certeza de la ausencia del antígeno buscado. Asimismo, se incluyen controles
positivos (soluciones donde se encuentra el antígeno buscado).
- ELISA indirecto. Las placas ELISA se preparan de una forma idéntica a la anterior. Los
controles positivos y negativos son los mismos. El sistema de detección emplea dos
anticuerpos: uno primario contra el antígeno y uno secundario marcado contra el primario. La
detección tiene mayor sensibilidad por presentar una amplificación de señal debida a la unión
de dos o más anticuerpos secundarios por cada primario. Es el ensayo más popular, como lo es
la inmunofluorescencia indirecta, pues un mismo secundario marcado y un mismo sistema
enzimático permite cuantificar una gran cantidad de antígenos.
- ELISA sándwich (ensayo de captura de antígeno y detección mediante inmunocomplejos).
Se trata de un ensayo muy empleado en el que se recubre el pocillo con un primer anticuerpo
anti-antígeno. Después de lavar el exceso de anticuerpo se aplica la muestra problema en la
que se encuentra el antígeno, que será retenido en el pocillo al ser reconocido por el primer
anticuerpo. Después de un segundo lavado que elimina el material no retenido se aplica una
solución con un segundo anticuerpo anti-antígeno marcado. Así cada molécula de antígeno
estará unida a un anticuerpo en la base que lo retiene y un segundo anticuerpo, al menos, que
lo marca. Este ensayo tiene una gran especificidad y sensibilidad debido a la amplificación de
señal que permite el segundo anticuerpo.
Una variante de este sistema sándwich, es el empleo del método biotina-estreptavidina-
peroxidasa. Esta técnica se basa en la alta afinidad que tiene la estreptavidina, proteína
tetramérica que sintetiza la bacteria Streptomyces avidinii, por la vitamina biotina. Cada
subunidad de la estreptavidina puede unir una molécula de biotina. Esta propiedad permite
mejorar la intensidad del marcaje al amplificar la reacción. En este caso, el segundo anticuerpo
vendría unido a la biotina, y posteriormente se añadiría la estreptavidina unida a la enzima
peroxidada.
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En esta práctica, para determinar la cantidad de proteína IP10 secretada por las células Huh7
tras tratamiento con IFNalfa, vamos a usar un ELISA sándwich que utiliza el método biotina-
estreptavidina-peroxidasa.

Estreptavidina conjugada con enzima HRP

Anticuerpo 2 anti-IP10 unido a biotina

Antígeno: IP10
Anticuerpo 1 anti-IP10

Reactivos
- Tampón de tapizado (Coating buffer): 0,1 M carbonato sódico, pH 9,5
(50 ml) …………….. g Na2CO3 , Ajustar pH a 9,5; (Pm. Na2CO3:105,99)
- PBS 1x (2 mM KH2PO4, 8 mM Na2HPO4, 0,14 M NaCl, pH: 7,2)
(1 l) …………….g KH2PO4 (Pm KH2PO4: 136,09)
……………..g Na2HPO4 x12H2O (Pm Na2HPO4 x12H2O: 358,14)
……………..g NaCl (Pm NaCl: 58,44)
- Tampón de lavado (Wash buffer): PBS-0,05% Tween 20 (500 ml).
(500 ml PBS 1x + ……………..ml Tween 20)

- Reactivo de dilución (Reagent diluent): PBS 1x + 10% Suero fetal de ternera (20 ml).
(……………ml PBS 1x + …………………ml Suero fetal de ternera)
- Solución de parada (Stop solution): 2N SO4H2. (50 ml).
(2,7 ml SO4H2 + 47,3 ml Agua)
- TMB
- Kit ELISA IP-10.
- Placas 96 pocillos para ELISA.
- Lector de ELISAS
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1. Obtención muestra problema: Sobrenadante células Huh7 tratadas con IFN-alfa

Se realizó un tratamiento con IFNalfa, durante 24 h, a la línea celular Huh7 para determinar
la cantidad de proteína IP10 secretada al sobrenadante de cultivo (IP10 contiene secuencia
ISRE en su promotor, por tanto, es inducida su expresión tras tratamiento con IFNalfa, y es
una proteína secretada de la célula).
- Sembrar 1x105 células Huh7/pocillo, en placa de 24 pocillos, con 1 ml del medio de
cultivo. Sembrar 2 pocillos. Dejar que se adhieran al plástico y estabilicen unas 24h.
- Tras 24 h, retirar el medio y añadir medio nuevo con 500 U/ml IFNalfa en un pocillo. Al
segundo pocillo se añade medio nuevo sin IFNalfa (tratamiento basal).
- A las 24 horas postratamiento con IFNalfa, se recogen los sobrenadantes de ambos
pocillos y se guardan a -80 ºC, para posteriormente determinar la proteína IP10 por ELISA.

2. ELISA IP10:
- Tapizar 3 columnas de la placa de 96 pocillos con 100 μl/pocillo del anticuerpo de captura
(anticuerpo monoclonal anti-IP-10 humana) diluido 1:250 en tampón de tapizado.
(…….….μl anticuerpo de captura + 3,5 ml buffer carbonato).
Dejar incubar toda la noche a 4 ºC.
- Retirar el exceso de anticuerpo y lavar 3x con 200 μl/pocillo de buffer de lavado.
- Bloquear los pocillos con 200 μl/pocillo de reactivo de dilución. Incubar a temperatura
ambiente durante 30 minutos.
- Retirar el reactivo de dilución y lavar 3x con 200 μl/pocillo de buffer de lavado
- Durante la media hora de bloqueo, preparar la curva estándar de IP10 (proteína recombinante
IP-10 humana, stock: 40 ng/ml) y las diluciones de las muestras problema.
Curva estándar IP10: Descongelar el vial stock de IP-10 y dejar a temperatura ambiente unos
10 minutos antes de realizar las diluciones.
Haremos 8 diluciones seriadas ½ del estándar IP10, empezando por 1000 pg/ml y hasta 7,8
pg/ml.
Tubo 1: 1000 pg/ml IP10 (……….μl stock + 600 μl reactivo dilución). Agitar bien.
Tubo 2: 500 pg/ml IP10 (300 μl tubo 1 + 300 μl reactivo dilución). Agitar bien.
Tubo 3: 250 pg/ml IP10 (300 μl tubo 2 + 300 μl reactivo dilución). Agitar bien.
Tubo 4: 125 pg/ml IP10 (300 μl tubo 3 + 300 μl reactivo dilución). Agitar bien.
Tubo 5: 62,5 pg/ml IP10 (300 μl tubo 4 + 300 μl reactivo dilución). Agitar bien.
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Tubo 6: 31,25 pg/ml IP10 (300 μl tubo 5 + 300 μl reactivo dilución). Agitar bien.
Tubo 7: 15,6 pg/ml IP10 (300 μl tubo 6 + 300 μl reactivo dilución). Agitar bien.
Tubo 8: 7,8 pg/ml IP10 (300 μl tubo 7 + 300 μl reactivo dilución). Agitar bien.
La curva estándar la colocaremos por duplicado en las dos primeras columnas. (ver esquema
siguiente)
Muestras problema:
Para poder cuantificar con precisión la cantidad de IP10 producida por las células Huh7 tras
estímulo con IFNalfa, es necesario obtener unos valores de absorbancia de la muestra problema
que estén en el rango de la curva estándar, y así poder interpolar en ella el valor obtenido. Por
ello, realizaremos 3 diluciones de la muestra Huh7 tras estímulo con IFNalfa 24 h (1/2, 1/10,
1/50) en reactivo dilución. (Dilución ½: 150 microlitros muestra + 150 microlitros reactivo
dilución; Dil 1/10: 30 microlitros muestra + 270 microlitros reactivo dilución; Dil 1/50: 6
microlitos muestra + 294 microlitos reactivo dilución).
La muestra basal, sobrenadante Huh7 sin estímulo con IFNalfa, no se diluye.
- Tras el bloqueo y lavado de la placa, se añade 100 µl/pocillo de cada dilución del estándar y
de las diferentes diluciones de las muestras problema en las 3 primeras columnas de la placa
por duplicado (ver esquema)
Incubar 45 minutos a temperatura ambiente.
IP10 IP10 Basal
1000 pg/ml 1000 pg/ml
IP10 IP10 Basal
500 pg/ml 500 pg/ml
IP10 IP10 IFN24h
250 pg/ml 250 pg/ml Dil 1/2
IP10 IP10 IFN24h
125 pg/ml 125 pg/ml Dil 1/2
IP10 IP10 IFN24h
62 pg/ml 62 pg/ml Dil 1/10
IP10 IP10 IFN24h
32 pg/ml 32 pg/ml Dil 1/10
IP10 IP10 IFN24h
16 pg/ml 16 pg/ml Dil 1/50
IP10 IP10 IFN24h
8 pg/ml 8 pg/ml Dil 1/50
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- Retirar las muestras y lavar 5x con solución de lavado.

- Añadir 100 μl/pocillo del anticuerpo de detección (anticuerpo monoclonal anti-IP-10 humana
unido a Biotina), dilución 1:500 + streptavidina conjugada con peroxidada (HRP), dilución
1:250.
(……..μl anticuerpo de detección + 3,5 ml reactivo dilución; Agitar, +……μl
streptavidina-HRP, Agitar y dejar 15 minutos a temperatura ambiente antes de añadir a
los pocillos).
Incubar 45 minutos a temperatura ambiente.
- Lavar 7x con 200 μl tampón de lavado.
- Añadir 100 μl/pocillo solución TMB. Incubar aproximadamente 10 minutos a temperatura
ambiente (Se va observando la aparición de color azul con el tiempo en los diferentes pocillos.
Parar la reacción antes de que llegue a saturación: color azul muy intenso).
Solución TMB: Mezclar 2 ml reactivo A (peroxido de hidrógeno) + 2 ml reactivo B (3,3´,5, 5´
tetramethylbenzidine (TMB) en solvente orgánico).
(La peroxidada cataliza la reacción de oxidación del TMB, dando un producto de color azul.
La intensidad del color azul será proporcional a la cantidad de HRP, y por tanto, de la cantidad
de IP10 en la muestra).
- Parar la reacción con 50 μl de solución de parada. (El color azul se torna amarillo)
- Leer las absorbancias de los diferentes pocillos en un lector de ELISAS a 450 nm.
- Trazar una recta con las concentraciones conocidas del estándar de IP10 y sus respectivas
absorbancias (media del duplicado), y calcular la ecuación de la recta (Y = a X + b;
absorbancias en eje Y, concentración en eje X).
- Interpolar en la ecuación de la recta el valor de absorbancia de las muestras problema para
calcular su concentración (evitar los puntos saturados de la curva). (Tened en cuenta la
dilución de la muestra).
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Anexo I: Visualización de proteínas tras ser corridas en geles de poliacrilamida

Existen diversos métodos de tinción de geles para detectar proteínas previamente separadas por
electroforesis en geles de acrilamida:
- Tinción con azul de Coomasie: Se basa en la unión inespecífica del colorante azul de
Coomassie a las proteínas. El límite de sensibilidad es 0,3-1 g/banda de proteína.
- Tinción con plata: Todos los métodos de tinción con plata conllevan la reducción de
iones plata a su forma metálica. Los iones plata se unen a las proteínas y seguidamente este
proceso es revelado por la reducción a plata metálica en un medio ácido. La tinción con plata
para detectar proteínas es mucho más sensible que la tinción con azul de Coomassie. El límite
de detección es de 2-5 ng/banda proteína. Este método es más largo y laborioso que la tinción
con azul de Coomassie, pero mucho más sensible.
-Tinción con fluorocromos: SYPRO. Sensibilidad 1-2 ng/banda proteína. Sensibilidad
similar a la tinción con plata, más rápido.
- Tinción PAS (Periodic Acid-Schiff): Es una tinción específica de azucares, por tanto,
nos permite identificar proteínas glicosiladas tras ser separadas en un SDS-PAGE. Sensibilidad
25-100 ng de carbohidratos.
Ejemplos de tinciones sobre el propio gel de acrilamida:

- Transferencia a membrana e
inmunodetección. Consiste en la
transferencia de las proteínas del gel de
acrilamida a una membrana y posterior
detección de proteínas específicas por
reacciones antígeno-anticuerpo.
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Tinción de Coomassie blue para proteínas tras SDS-PAGE

La detección de bandas de proteína en un gel teñido con el colorante azul de Coomassie
se basa en la presencia de interacciones electrostáticas entre moléculas del colorante y grupos
amino de las proteínas en medio ácido. El límite de detección es de 0,3-1 g de proteína por
banda. Primero, las proteínas son precipitadas con una solución de fijación que contiene
metanol/ácido acético. Posteriormente, se tiñe el gel con la solución de azul de coomassie. Este
colorante teñirá todo el gel de un color azul intenso. Es necesario desteñir el gel para observar
las bandas azules de proteína sobre un fondo claro (el azul de Coomassie no se une a la
poliacrilamida.
Material:
- Gel de poliacrilamida
- Solución de Coomassie (500 ml) - 50 % metanol (.......ml)
- 10 % ácido acético (.........ml)
- 0,125% azul de coomassie R-250 (.............g)
- 40% agua (.............ml)
Disolver el azul de coomassie en metanol antes de añadir el ácido acético y el agua.
- Solución de desteñimiento-1: (500 ml) - 50% metanol (...........ml)
- 10% ácido acético (...........ml)
- 40% agua (.............ml)

- Solución de desteñimiento-2: (500 ml) - 5% metanol (..............ml)

- 7% ácido acético (.............ml)
- 88% agua (..............ml)
Método:
1. Colocar el gel de poliacrilamida en una cubeta de plástico y cubrirlo con solución de
coomassie durante 2-4 horas y en agitación.
2. Retirar la solución de coomassie y añadir solución de desteñimiento-1 durante 2 horas y en
agitación.
3. Retirar la solución de desteñimiento-1 y añadir la solución desteñimiento-2. Dejar en
agitación 2 horas o toda la noche hasta conseguir unas bandas azules sobre un fondo claro.
4. Fotografiar el gel o secarlo en un secador de geles durante 2 horas a 80ªC.
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Nombre y Apellidos:..............................................................................................................
ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS. CUESTIONES
1. ¿En cuántas muestras observas fosforilación de la proteína STAT1?. ¿Crees que el
resultado es correcto? Razona la respuesta.
2. Con la tinción azul de Coomassie del gel de acrilamida ¿podemos decir que el IFNalfa
fosforila la proteína Stat1?, ¿Qué nos permite observar esta tinción?
3. ¿Podemos afirmar que el IFNalfa induce la proteína IP-10 en la línea celular Huh7?.
¿Por qué?
4. ¿Qué cantidad de IP-10 se produce tras estimular la línea celular Huh7 con IFNalfa?
5. Se ha descrito que el coronavirus SARS-COV2 infecta y se replica en la línea celular
COS, sin generar efecto citopático. Utilizando las técnicas aprendidas en esta
asignatura, explica brevemente qué experimento realizarías y los diferentes pasos a
seguir, si queremos testar el efecto antiviral de dos fármacos frente a este coronavirus.
(Se dispone de los anticuerpos comerciales: mouse anti-SARS-CoV-2 Spike protein
antibody y mouse anti-SARS-CoV-2 nucleocapsid protein antibody)