Guia 5-Microscopía de Fluorescencia y Detección de Virus Por Inmunofluorescencia

Facultad de Ciencias Naturales
Laboratorio de Biología Celular
Alumno: _______________________________________________ Código: ___________

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Laboratorio 5: Microscopía de Fluorescencia y detección

de virus por inmunofluorescencia
OBJETIVOS:
1. Familiarizarse con el uso de la microscopia de fluorescencia para observar

células con el núcleo, los microfilamentos y las mitocondrias marcadas con
fluorescencia.
2. Familiarizarse con el uso de la técnica de inmunofluorescencia para detectar
células infectadas por virus.
3. Analizar los resultados de un artículo científico que usa las técnicas anteriores
y sacar conclusiones al respecto.
INTRODUCCIÓN
La inmunofluorescencia es una técnica en la que se utilizan anticuerpos conjugados con

fluorocromos para detectar un antígeno (una proteína contra la cual el anticuerpo ha sido
desarrollado). Dicha técnica se puede aplicar utilizando solo un anticuerpo marcado que
reconoce el antígeno, en cuyo caso se llama inmunofluorescencia directa; o utilizando dos
anticuerpos en serie, uno primario que reconoce el antígeno y uno secundario que reconoce
los fragmentos constantes del anticuerpo primario (fragmento Fc); en este caso, se conoce
como inmunofluorescencia indirecta.
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La inmunofluorescencia indirecta tiene varias ventajas; entre ellas, está el hecho de que los
anticuerpos secundarios son más fáciles de desarrollar, pues se generan en contra de
fragmentos del anticuerpo primario que son constantes en todos los anticuerpos producidos
por una especie animal. Por otro lado, la inmunofluorescencia indirecta amplifica la señal,
pues por cada anticuerpo primario se unen varios anticuerpos secundarios.
A continuación se presentan los principales pasos de un experimento de inmunofluorescencia

indirecta:
Protocolo de Inmunofluorescencia indirecta:
Lavado: Se realiza para retirar todo residuo del medio de cultivo en donde se
encontraban las células que presentan el antígeno.
Fijación: Busca finalizar todas las reacciones bioquímicas, en especial, inhibir las
enzimas proteolíticas que destruyen los tejidos biológicos y las células una vez el
tejido muere.
Lavado: Se realiza para retirar todo residuo de la solución de fijación.
Permeabilización: Cuando el antígeno esta dentro de la célula se utiliza un
detergente suave para romper la membrana plasmática y hacer que los anticuerpos
puedan interactuar con el antígeno.
Lavado: Se realiza para retirar todo residuo de la solución de permeabilización.
Bloqueo: En una célula existe una gran cantidad de proteínas, y siempre hay algún
grado de unión inespecífica entre los anticuerpos y proteínas diferentes al antígeno.
Este proceso tiene como finalidad disminuir estas uniones inespecíficas, para lo que
se incuba la célula con un bloqueador.
Lavado: Se realiza para retirar todo residuo de la solución de bloqueo.
Incubación con el anticuerpo primario
Lavado: Se realiza para retirar los anticuerpos primarios que no se han unido con el
antígeno.
Incubación con el anticuerpo secundario
Lavado: Se realiza para retirar los anticuerpos secundarios que no se han unido a
los anticuerpos primarios.
Observación de la muestra con el microscopio de fluorescencia
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Seguridad durante la práctica:
Normas de Seguridad: El estudiante debe referirse a la guía de laboratorio 1
Elementos de protección personal:
 Es INDISPENSABLE utilizar Bata de laboratorio durante el desarrollo de la

práctica.
MATERIALES Y REACTIVOS POR GRUPO DE DOS PERSONAS:
Equipos Cantidad
Microscopio de Epi-Fluorescencia Nikon 1 unidad por
salón de clase
Insumos Cantidad
Laminilla con muestra de células endoteliales 1 unidad por
bovinas marcadas con fluorescencia salón de clase
(1-FluoCells® de Thermo Scientific)
ACTIVIDAD 1: VISUALIZACIÓN DE LÁMINA CON CÉLULAS

ENDOTELIALES BOVINAS MARCADAS CON FLUORESCENCIA
Se realizará la observación de una laminilla con una muestra de células endoteliales bovinas
marcadas con fluorescencia (1-FluoCells® de Thermo Scientific). Luego de fijar,
permeabilizar y bloquear las muestras, estas se marcaron así: 1-Tinción con DAPI azul
fluorescente para el ADN en el núcleo. 2-Tinción verde fluorescente para los microfilamentos
de actina y 3-Tinción Roja fluorescente para las mitocondrias.
ACTIVIDAD 2: ANÁLISIS DE UN ARTÍCULO CIENTÍFICO EN EL QUE SE

UTILIZA INMUNOFLUORESCENCIA
Se analizarán los resultados del artículo científico c-Src protein kinase inhibitors block
assembly and maturation of dengue virus, en el cual se utilizan técnicas de
inmunofluorescencia y usted deberá sacar conclusiones al respecto.
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En este artículo se utilizan tres tipos de línea celular para evaluar la actividad antiviral de
dasatinib, un inhibidor de la cinasa c-Src. Las líneas celulares son C3/36 (derivadas de larvas
de mosquito), Vero (derivadas de riñón de simio) y Huh7 (derivadas de hígado de humanos).
La línea celular C6/36, que se obtiene de larvas del mosquito Aedes albopictus, es usada con
mucha frecuencia para aislar el virus del Dengue. El Dengue es una enfermedad viral que se
caracteriza por fiebre y dolor intenso en las articulaciones y músculos, inflamación de los
ganglios linfáticos y erupción ocasional de la piel. Se han identificado cuatro tipos del virus
del dengue (DENV-1, DENV-2, DENV-3 y DENV-4) todos pertenecientes al género
Flavivirus. El mosquito Aedes aegypti es el principal transmisor o vector, pero otras especies
como Aedes albopictus, sirven como vectores secundarios. El virus se transmite mediante la
picadura del mosquito hembra que ha picado previamente a alguien infectado o por
transfusión de sangre infectada.
Actualmente no hay ni un tratamiento antiviral efectivo ni una vacuna contra el dengue, es

por esto que los estudios del virus en líneas celulares como C6/36 son tan importantes.
Antígenos del dengue (proteínas de la cubierta del virus) pueden ser detectados por
anticuerpos conjugados con fluorocromos en células C6/36 infectadas. En esta práctica
analizaremos resultados de un artículo científico que usa el cultivo de células C6/36 y la
técnica de inmunofluorescencia para detectar inhibidores de la infección y la replicación del
virus. En el artículo se estudia principalmente el compuesto dasatinib, un inhibidor de la
cinasa c-Src. La cinasa c-Src está involucrada en la regulación de una gran cantidad de
procesos celulares entre ellos la migración, la división celular y la transcripción genética. Los
autores del artículo concluyen que sus resultados indican que dasatinib tiene potencial para
convertirse en una nueva clase fármaco anti-viral contra el dengue.
Las células que utilizaron para el estudio fueron infectadas con el virus del dengue (DENV);
después de 4, 5 o 6 días post-infección las células fueron fijadas y el protocolo de
inmunofluorescencia descrito previamente fue utilizado para detectar el virus con el
anticuerpo secundario conjugado a FITC (Fluoresceína isothiocyanate). La longitud de onda
de emisión de este compuesto es aproximadamente 521 nm por lo que este compuesto emite
una fluorescencia color verde. El DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol) es un pigmento
fluorescente que se une fuertemente al ADN. La longitud de onda de emisión de este
compuesto es aproximadamente 460 nm por lo que emite una fluorescencia color azul. El
DAPI es usado para detectar los núcleos de todas las células presentes en el campo de
observación.
La figura que se presenta a continuación muestra la fluorescencia de células expuestas a dos

tipos de tratamiento. Incubación con 0.25% DMSO o con 2.5 µM de dasatinib en 0.25%
DMSO. El DMSO (Sulfoxido de dimetil) es un compuesto que disuelve tanto compuestos
polares como apolares y por lo tanto se usa con frecuencia para hacer que los fármacos
puedan cruzar la membrana plasmática.
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En el siguiente gráfico se muestra la actividad antiviral de dasatinib en los tres tipos de
cultivo celular como función de la concentración del fármaco. En el eje X está la
concentración de dasatinib y en el eje Y la cuantificación de la cantidad de virus presente.
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PREGUNTAS:
Basado en su conocimiento y en la lectura de la guía, responda las siguientes preguntas:
1. ¿Cómo se transmite el virus del dengue?

2. ¿Por qué es importante estudiar este virus en la línea celular c6/36?
3. ¿Para qué se usa la inmunofluorescencia?
4. ¿Cuál es la ventaja de la inmunofluorescencia indirecta sobre la directa?
5. ¿Por qué se hace una fijación?
6. ¿Por qué se hace una permeabilización?
7. ¿Por qué se hace un paso de bloqueo?
Todas las preguntas anteriores valen un punto.
Todas las preguntas siguientes valen dos puntos.
Responda las siguientes preguntas según la figura que se mostró anteriormente

8. ¿Por qué se utiliza DAPI y porque es especialmente importante en la figura que se
muestra? ¿Qué indican las cabezas de flecha blancas?
9. ¿Qué es lo que los autores están evaluando en dicha figura?
10. ¿Por qué se utiliza DMSO? y ¿por qué es especialmente importante en la figura?
Responda las siguientes preguntas según la gráfica que se mostró anteriormente
11. ¿Qué es lo que los autores están evaluando en la gráfica?

12. Los autores del artículo concluyen que sus resultados indican que dasatinib tiene
potencial para convertirse en una nueva clase fármaco anti-viral contra el dengue.
Analizando los resultados de la figura y la gráfica explique por qué.
Página | 6
REFERENCIAS
c-Src protein kinase inhibitors block assembly and maturation of dengue virus. Chu
JJ, Yang PL. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007 Feb 27;104(9):3520-5.
Imágenes:
http://www.dermatologia.cat
http://albeitar.portalveterinaria.com
Elaborado por:
Fecha:
Página | 7

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1. Familiarizarse con el uso de la microscopia de fluorescencia para observar

La inmunofluorescencia es una técnica en la que se utilizan anticuerpos conjugados con

A continuación se presentan los principales pasos de un experimento de inmunofluorescencia

Protocolo de Inmunofluorescencia indirecta:

Normas de Seguridad: El estudiante debe referirse a la guía de laboratorio 1

Elementos de protección personal:

 Es INDISPENSABLE utilizar Bata de laboratorio durante el desarrollo de la

MATERIALES Y REACTIVOS POR GRUPO DE DOS PERSONAS:

ACTIVIDAD 1: VISUALIZACIÓN DE LÁMINA CON CÉLULAS

ACTIVIDAD 2: ANÁLISIS DE UN ARTÍCULO CIENTÍFICO EN EL QUE SE

Actualmente no hay ni un tratamiento antiviral efectivo ni una vacuna contra el dengue, es

La figura que se presenta a continuación muestra la fluorescencia de células expuestas a dos

Basado en su conocimiento y en la lectura de la guía, responda las siguientes preguntas:

1. ¿Cómo se transmite el virus del dengue?

Todas las preguntas anteriores valen un punto.

Todas las preguntas siguientes valen dos puntos.

Responda las siguientes preguntas según la figura que se mostró anteriormente

Responda las siguientes preguntas según la gráfica que se mostró anteriormente

11. ¿Qué es lo que los autores están evaluando en la gráfica?

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