Identificación de Hongos - Guia de Laboratorio

IDENTIFICACIÓN DE HONGOS - GUIA DE LABORATORIO
POR
SHEYLA ANDREA ORTEGA NAVARRO
DOCENTE
JOSÉ TORRES
UNIVERSIDAD DEL ATLÁNTICO
LIC. EN CIENCIAS NATURALES
MICROBIOLOGÍA G-16
VIII SEMESTRE
PRÁCTICA N°1
IDENTIFICACIÓN DE HONGOS
INTRODUCCIÓN
Los hongos son un grupo de organismos muy abundantes en la naturaleza que incluye especies
con patrones de distribución amplios, aunque también pueden existir otras con áreas de
distribución más restringidas. Se les puede encontrar prácticamente en cualquier tipo de sustrato
orgánico vivo o muerto. Actúan como descomponedores de la materia orgánica junto a bacterias
y artrópodos, desarrollándose frecuentemente sobre restos vegetales como cortezas, troncos,
hojas, semillas e inflorescencias. A su vez, degradan alimentos y productos industriales como
papel, plásticos, madera, textiles, etc. Muchos son patógenos de plantas y animales, incluido el
hombre. También son utilizados en la producción y obtención de numerosos metabolitos como
antibióticos, ácidos orgánicos, enzimas, alcohol y otros, siendo muy empleados en estudios
citológicos, genéticos y bioquímicos.
Muchas especies de hongos se pueden diferenciar, identificar y clasificar según su morfología,

estructura, mecanismo de formación y elementos formadores de las esporas. El conocimiento de
estas características puede ser suficiente para identificar especies que pertenecen al grupo de los
hongos filamentosos; sin embargo, cuando se trata de identificar especies pertenecientes al grupo
de las levaduras es imprescindible la aplicación de pruebas bioquímicas.
OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
Conocer e identificar la composición, morfología, función e importancia de los hongos en el
medio ambiente.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
- Reconocer los distintos medios utilizados para el cultivo de hongos y su preparación.
- Recopilar los parámetros mínimos para la descripción e identificación de las colonias de
hongos, teniendo en cuenta las técnicas de inoculación.
- Diferenciar técnicas de montaje y observación microscópica para hongos
FUNDAMENTO TEÓRICO
Los hongos pueden ser unicelulares o pluricelulares. Las levaduras son hongos unicelulares con
forma oval (5-30 µm), inmóviles y que se dividen por mecanismos diversos, especialmente por
gemación. Deben considerarse como hongos que han perdido su forma filamentosa y se han
convertido en organismos unicelulares.
La mayoría de los hongos, sin embargo, son pluricelulares o filamentosos y se caracterizan por
estar constituidos por filamentos ramificados o hifas que se desarrollan y entrelazan formando el
micelio. Existe un micelio vegetativo adosado a la superficie del sustrato (suelo, plantas,
alimentos) y un micelio aéreo o reproductor, donde se forman las esporas (asexuales y sexuales).
Los hongos filamentosos y levaduras son en su mayoría saprófitos, hallándose libres en la

naturaleza, especialmente en la materia orgánica en descomposición. Algunas especies son
parásitas, formando parte de la flora normal del hombre, como por ejemplo Candida albicans,
que es una levadura y puede comportarse como oportunista y resultar patógena cuando se
produce una disminución en los mecanismos de resistencia del individuo. Otras especies de
hongos pueden producir durante su desarrollo sustancias tóxicas o micotoxinas como, por
ejemplo, las aflatoxinas producidas por Aspergillus flavus, que es un hongo filamentoso. Por otra
parte, algunos hongos son difásicos, es decir, unas veces se comportan como hongos
filamentosos y otras pueden comportarse como levaduras.
Las condiciones necesarias para que un hongo crezca en una superficie son: existencia de
esporas, base nutriente, humedad. En la práctica, los hongos filamentosos y las levaduras
también se diferencian en el laboratorio en dos grupos según el aspecto macroscópico de sus
colonias: las levaduras forman colonias húmedas, cremosas, opacas o pastosas, y los hongos
filamentosos producen colonias algodonosas, lanosas o pulverulentas.
I. PRINCIPALES MÉTODOS DE IDENTIFICACIÓN DE HONGOS

FILAMENTOSOS
La identificación de los hongos filamentosos se basa en el examen microscópico de la colonia y
en sus características microscópicas. Semejanzas macroscópicas como la forma de la colonia, el
color de la superficie, la textura y la producción de pigmentos son muy útiles para la
identificación. En general, la morfología microscópica de los hongos es estable y presenta pocas
variaciones. La identificación definitiva se basa en la forma característica, método de producción
y ordenamiento de las esporas, siendo también importante conocer el tamaño y la disposición de
las hifas.
MATERIALES, REACTIVOS E INDUMENTARIA
- Colonia aislada de hongos.
- Cinta pegante transparente.
- Portaobjetos estériles.
- Cubreobjetos estériles.
- Asa.
- Azul de lactofenol.
- Microscopio.
- Mechero.
- Guantes.
- Cofia.
- Cubrebocas.
I.I PREPARACIÓN EN FRESCO

Se realiza empleando el procedimiento descrito a continuación:
Seleccionar una colonia aislada.
1. Calentar a la llama el alambre de un asa de siembra, y
doblar de forma que se convierta en un objeto cortante.
2. Con la ayuda del asa, extraer un fragmento triangular
de la colonia que contenga además un poco de agar en
la parte inferior.
3. Depositar el fragmento extraído sobre un portaobjetos
en el cual, previamente, se ha depositado una gota de
azul de lactofenol.
4. Cubrir con un portaobjetos y presionar suavemente
para dispersar la colonia y el agar; de esta forma, la
muestra está disponible para su observación al microscopio.
I.II PREPARACIÓN CON CINTA ADHESIVA
1. Apoyar el lado engomado de un trozo de cinta adhesiva transparente sobre la superficie
de una colonia.
2. Colocar la cinta bien extendida sobre una gota de azul de lactofenol o azul de anilina
colocada, a su vez, sobre un portaobjetos.
3. Observar al microscopio para conocer la forma y ordenamiento característico de las
esporas.
CULTIVO SOBRE PORTAOBJETOS

1. Cortar un bloque pequeño de un medio sólido adecuado (agar), que ha sido vertido en una
cápsula de Petri, hasta una altura de 2 cm. El bloque puede cortarse con la ayuda de un
bisturí estéril o con un tubo de ensayo estéril sin reborde (lo que permite obtener un taco
redondo).
2. Colocar un portaobjetos estéril sobre una capa de agar al 2% contenida en una cápsula de
Petri.
3. Colocar el bloque de agar sobre el portaobjetos.
4. Con una asa de siembra cuyo alambre ha sido doblado en ángulo recto, inocular los
cuatro cuadrantes del taco con el microorganismo a identificar.
5. Colocar un cubreobjetos estéril sobre la superficie del bloque de agar.
6. Tapar la cápsula de Petri que contiene el cultivo e incubar a 30o C.
7. Finalizado el período de incubación, retirar el cubreobjetos (este proceso debe realizarse
en una cabina de seguridad biológica), y colocarlo en un portaobjetos que contenga azul
de lactofenol o azul de anilina.
8. La observación al microscopio permite distinguir la forma y disposición de las esporas.
Nota: Si con este proceso no ha sido posible la identificación, el resto del cultivo
puede ser usado más adelante si se continúa incubando. Entonces se retira el bloque
de agar y se agrega una gota de azul de lactofenol o azul de anilina sobre la zona del
cultivo y se coloca un cubreobjetos sobre ella. Es recomendable realizar dos cultivos
sobre el mismo portaobjetos de modo que si en uno no se pueden observar las
características microscópicas puede disponerse del segundo después de un período
adicional de incubación.
II. PRINCIPALES MÉTODOS DE IDENTIFICACIÓN DE LEVADURAS
Se requiere una combinación de pruebas bioquímicas y morfológicas para identificar las
levaduras. En las características morfológicas debe incluirse el color de las colonias, la medida y
la forma de las células, la presencia de cápsulas, la producción de hifas o pseudohifas, y la
producción de clamidiosporas. Las pruebas bioquímicas incluyen la asimilación y fermentación
de azúcares y la asimilación de nitrato.
Si la prueba del tubo germinativo es positiva, el organismo es Candida albicans. Si se observa
una cápsula puede hacer pensar que el organismo es Cryptoccus neo formans. La prueba de la
ureasa es útil para la identificación de este organismo, pero debe complementarse con otras
pruebas adicionales. Si no se produce germinación en el tubo y no se observa la presencia de
cápsula, deben efectuarse otras pruebas bioquímicas y morfológicas.
MATERIALES, REACTIVOS E INDUMENTARIA.

- Agar leche.
- Solución acuosa de tinta India al 50%.
- Cloruro de benzalconio al 1%
- Cajas petri.
- Hisopo.
- Portaobjetos.
- Cubreobjetos.
- Microscopio.
- Guantes.
- Cofia.
- Cubrebocas.
II.I PRUEBA DEL TUBO GERMINATIVO
Se realiza de acuerdo con el siguiente procedimiento:
1. Suspender un inóculo muy pequeño de células de la levadura obtenidas a partir de una
colonia aislada en 0,5 ml de suero leche de oveja (o de suero humano, procedente de un
individuo sano).
2. Incubar los tubos a 35°-37°C, no superando las 3 horas.
3. Después de la incubación, tomar una gota de la suspensión y colocarla sobre un
portaobjetos. Observar con el microscopio a poco aumento la presencia de tubos
germinativos. Un tubo germinativo se define como un apéndice con la mitad de ancho y 3
a 4 veces el largo de la célula de la cual emerge. En la mayor parte de los casos no existe
constricción en el origen del tubo germinativo.
II.II PRUEBA SELECTIVA RÁPIDA PARA UREASA

Se realiza según el siguiente procedimiento:
1. Pasar un hisopo de algodón impregnado con un substrato con urea deshidratado sobre la
superficie de dos o tres colonias, de modo que la punta se cubra con el microorganismo.
2. Colocar el hisopo con la levadura dentro de un tubo que contenga 3 gotas de cloruro de
benzalconio al 1% (pH 4,86 ±0,01) y rotar con firmeza contra el fondo para poner en
contacto los microorganismos con las fibras de algodón.
3. Tapar el tubo e incubar a 45°C durante 30 minutos.
4. Examinar a los 10, 15, 20 y 30 minutos para detectar un cambio de color de amarillo a
púrpura. Un color rojo a púrpura indica producción de ureasa.
II.III PRODUCCIÓN DE CÁPSULA
El procedimiento se desarrolla del siguiente modo:
1. Tomar una pequeña cantidad del inóculo suspendiéndola en una gota de una solución
acuosa de tinta India al 50% en un portaobjetos.
2. Observar al microscopio la presencia de la cápsula, que se distingue como un halo claro
alrededor de las células.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Arenas, Roberto. Micología Médica Ilustrada. McGraw Hill. 2014. Quinta edición. México. D.F.
México
C. J. Alexopoulos & C. W. Mims (1985) Introducción a la Micología, Ediciones Omega,

Barcelona, 638 pp., ISBN 84-282-0747-X
Herrera Teófilo, et.al, 1998, El reino de los hongos micología básica y aplicada, Editorial fondo
de cultura económica, segunda edición UNAM, Pag: 25-36.
INEGOLD, S., BARON, E. Diagnóstico Microbiológico (Bayley/Scott) Ed. Médica

Panamericana, 7ª Edición, Buenos Ai res, 1989

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Muchas especies de hongos se pueden diferenciar, identificar y clasificar según su morfología,

Los hongos filamentosos y levaduras son en su mayoría saprófitos, hallándose libres en la

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CULTIVO SOBRE PORTAOBJETOS

MATERIALES, REACTIVOS E INDUMENTARIA.

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C. J. Alexopoulos & C. W. Mims (1985) Introducción a la Micología, Ediciones Omega,

INEGOLD, S., BARON, E. Diagnóstico Microbiológico (Bayley/Scott) Ed. Médica

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