b.

práctica # 3: Tinciones

i. Introducción:

El microscopio compuesto es una de las herramientas más útiles que tiene un personal Bioquímico.

Se basa en la observación directa de estructuras a través de microscopios de luz transmitida que

atraviesa el material objeto de estudio.

Para poder visualizar células y microorganismos es necesario recurrir a la coloración del mismo.
Aunque hay numerosos tipos podemos englobarlas en:

1) Tinciones panópticas. Se basan en la coloración inespecífica de todas las estructuras celulares

gracias a la utilización conjunta de colorantes ácidos y de colorantes básicos. Entre los más
empleados se encuentran la tinción de Hematoxilina-Eosina (para histología y anatomía patológica),
la de May-Grünwald-Giemsa y la de Wright (estas últimas para la sangre y el tejido hematopoyético).
Se utilizan de forma rutinaria para estudiar la forma, tamaño y las características morfológicas.

2) Tinciones específicas. Los colorantes utilizados tienen afinidad por alguna de las moléculas
presentes en las células. Se utilizan para demostrar la existencia o no de determinadas sustancias.
Dentro de este vasto grupo de tinciones destacaremos las de lípidos, carbohidratos, proteínas,
ácidos nucleicos, pigmentos y minerales, y las empleadas para Prácticas de Histología Humana 14
poner de manifiesto e identificar a distintos microorganismos.

La mayoría de los tejidos, sobre todo los de los animales, son incoloros y por ello necesitamos
teñirlos para observar sus características morfológicas con el microscopio óptico. Ello se consigue
con el uso de los colorantes, sustancias coloreadas que son capaces de unirse de manera más o
menos específica a estructuras del tejido aportándoles color. Estas tinciones se realizan
habitualmente sobre secciones de tejido, siendo las más utilizadas las secciones obtenidas a partir
de inclusiones en parafina u obtenidas en el criostato.

ii. Marco teórico

Colorantes

La molécula de un colorante tiene normalmente dos componentes importantes: uno que aporta el
color, denominado cromógeno, y otro que posibilita la unión a elementos del tejido
denominado auxocromo. El cromóforo es la organización molecular dentro del cromógeno
responsable de la absorción de un espectro determinado de longitudes de onda. El auxocromo que
se une al cromógeno puede influir en su coloración y muchos colorantes tienen más de un grupo
auxocrómico. El auxocromo puede ser un grupo ionizable, un grupo que reacciona químicamente
con iones metálicos (mordientes) o puede reaccionar químicamente con el sustrato, en este caso el
tejido. Los colorantes son normalmente hidrosolubles, aunque hay colorantes que carecen de
grupos ionizables y sirven para teñir sustancias grasas, como gotas de lípidos.
Según la naturaleza química del cromóforo hay varios tipos de colorantes: nitrosos, ozoicos,
derivados de la antroquinona, derivados de la acridina, derivados de iminas quinónicas, derivados
de diferrilmetano y triferrilmetano, derivados del xanteno y derivados de las talocianinas.

Según la naturaleza química del radical auxocromo los colorantes se clasifican en:

Básicos: son sales en las que la base, normalmente una amina, aporta el color, mientras que la parte
ácida es incolora. Es decir, son colorantes catiónicos. Tienen apetencia por sustancias ácidas del
tejido como el ADN o ciertos componentes de la matriz extracelular como los glicosaminoglicanos.
La unión es por atracción eléctrica. Así, ponen de manifiesto el núcleo y el ARN, sobre todo el ARN
ribosómico presente en los ribosomas por ser muy abundante, así como ciertas matrices
extracelulares ricas en componentes ácidos. Ejemplos de colorantes básicos son la tionina,
safranina, azul de toluidina, el azul de metileno o la hematoxilina.

Ácidos: son sales con el anión coloreado y la base incolora. Son derivados de grupos sulfónicos,
carboxilos o hidroxilos fenólicos. Tienen apetencia por sustancias básicas, sobre todo estructuras
proteicas localizadas en el citoplasma celular y también por el colágeno de la matriz extracelular. La
unión es por atracción eléctrica. Ejemplos de colorantes ácidos son la fucsina ácida, verde rápido,
naranja G o la eosina.

Colorantes mordientes: son aquellos que se usan en combinación con sales metálicas, que actúan
como mordiente. Estas sales se pueden emplear junto con el colorante, antes o después. En algunos
casos el colorante mordiente puede ser también aniónico o, menos frecuentemente, catiónico.
Normalmente se emplean para teñir los núcleos. Por ejemplo, la hematoxilina férrica de Heidenhain.

Neutros: poseen una porción ácida y otra básica, ambas con capacidad para aportar color. Por tanto
un mismo colorante puede teñir tanto las partes básicas como las ácidas de los tejidos. Por ejemplo,
el eosinato de azul de metileno.

Indiferentes o hidrofóbicos: realmente no se unen a elementos de los tejidos por afinidad química
sino porque se disuelven en ellos. Por ejemplo, el colorante Sudán se disuelve en los lípidos y por
tanto teñirá a las gotas de lípidos, especialmente en los adipocitos.

Los colorantes usados en histología se emplean a muy altas concentraciones y la cantidad que se
une al tejido es realmente pequeña. Por eso, una solución de colorantes se puede usar muchas veces
sin que se agote. La manera en cómo se consigue una tinción adecuada se puede dividir en dos tipos:
progresiva y regresiva. La tinción progresiva consiste en obtener una coloración adecuada
controlando el tiempo de la sección en el colorante, de modo que a más tiempo más coloración.
La tinción regresiva consiste en la eliminación lenta de colorante de una tinción que ha sido teñida
en exceso. Esta eliminación se consigue normalmente con soluciones alcohólicas y al proceso se le
denomina desteñido. La concentración de la solución y tiempo de diferenciación nos aporta la
coloración adecuada.

En algunas ocasiones necesitamos resaltar elementos tisulares de manera específica y para ello
usamos colorantes que tienen apetencia por dichas estructuras. Por ejemplo, la tinción denominada
azán contiene azocarmín y naranja-anilina-ácido acético que tiñen los núcleos de rojo y sobre todo
destaca el conectivo intensamente teñido de azul. Otra tinción combinada es el tricrómio de Mallory
que tiñe el colágeno de verde y las células musculares de rojo.

Cuando un colorante se une al tejido y aporta un color diferente al que tiene en solución se dice que
ha ocurrido un fenómeno de metacromasia. Esto se debe a que las propiedades de absorción de la
luz del colorante cambian al unirse a componentes celulares. Por ejemplo, el azul de toluidina se
vuelve púrpura cuando se une a ciertos gránulos de los mastocitos. Cuando el colorante unido al
tejido tiene el mismo color que en solución se denomina ortocromasia.

Tinción de Papanicolaou original (tinción de Papanicolaou)

Se pueden utilizar reactivos disponibles comercialmente. Es fundamental utilizar una solución de

hematoxilina completamente madura, ya que solo entonces se puede evaluar la estructura de la
cromatina nuclear, el criterio esencial de malignidad. Solo se deben usar frotis fijados en húmedo.
Cualquier artefacto de secado perjudica la evaluación citológica. Receta 1: Tinción de Papanicolaou
original

1. Etanol 96% 10 min

2. Serie descendente de etanol1 a. 96% b. 80% c. 60% re. 50% e. agua destilada
3. Hematoxilina
4. Agua destilada
5. HCl al 0,25 %
6. Azulado en agua del grifo
7. Serie ascendente de etanol a. 50% b. 60% c. 80% re. 96% 8. Naranja G
9. 96% etanol I
10. 96% etanol II
11. EA 50 12. 96% etanol I
13. 96% etanol II
14. Xileno I
15. Xileno II
16. Cubrir con cubreobjetos Utilice únicamente una solución de hematoxilina bien madura

Vea a continuación: Dos excelentes ejemplos de fijación y tinción perfectas establecidos en la red
iPath por colegas de Afganistán y Argentina.

Importante Los períodos de tiempo indicados en la receta deben respetarse estrictamente para
lograr un resultado de tinción óptimo.

Tinción de May-Grünwald-Giemsa (MGG)

Esta modificación del método de Romanowsky u otra como la tinción de Wright se utilizan en frotis
secados al aire, donde están bien representados los orgánulos del citoplasma plano extendido de
las células secadas al aire.

Ventajas:

• La realización es sencilla y los frotis están listos para microscopía en 10 min.

• El método es más útil en el diagnóstico de trastornos hematológicos y para diferenciar poblaciones
de células hematológicas en frotis de sangre o médula ósea y sedimentos de líquido de lavado
broncoalveolar.

• MGG tiñe la mayoría de los tipos de bacterias

Desventajas:

• La calidad del resultado de la tinción es difícil de estandarizar ya que depende del valor de pH del
agua

• Especialmente en muestras no hematológicas, no es posible distribuir las células de interés como

una monocapa. Los grupos a menudo tridimensionales de células de carcinoma en tales muestras
aparecen principalmente bajo el microscopio como masas azules no transparentes que impiden un
diagnóstico definitivo del tipo de tumor.

• La estructura de la cromatina nuclear no suele estar tan bien representada como en la tinción de
Papanicolaou.

Hematoxilina-eosina

Una de las tinciones más comúnmente usada en histología es la hematoxilina-eosina sobre cortes
de parafina (Figuras 1 y 2). Como vemos se usa un colorante básico (hematoxilina) y otro ácido
(eosina) para teñir de diferente color a las estructuras ácidas y básicas de la célula. Antes de
proceder a la tinción, si partimos de cortes de parafina, tenemos que llevar a cabo unos tratamientos
previos sobre las secciones como es el desparafinado y la hidratación, puesto que estos colorantes
son hidrosolubles. Si partimos de cortes de criostato esto no es necesario.

Sección de un glomérulo de un riñón de mamífero obtenida a partir de una inclusión en parafina y

teñido con hematoxilina-eosina. Los núcleos aparecen de color violáceo (hematoxilina) y el ci
toplasma de color rosado (eosina). Figura 2. Pasos que se siguen durante una tinción general de
hematoxilina-eosina. Los tiempos son aproximativos porque dependen del grosor de los cortes y de
la concentración de los colorantes. El desparafinado elimina el medio de inclusión, la parafina. El
paso por agua de grifo es típico de la hematoxilena y se denomina diferenciación. Las sales del agua
permiten obtener una coloración más violácea, en vez de púrpura. La deshidratación final es
necesaria porque el medio de montaje no suele ser hidrosoluble. Estos medios de montaje no
afectan al tejido, ni a los colorantes y tienen unas propiedades ópticas excelentes. Además,
conservan las preparaciones durante años en buenas condiciones. Tras el montado y secado
(evaporación del xileno), las secciones se puede observar con el microscopio óptico.Tinción con
hematoxilina y eosina

Tinción de Gram

En 1884 Christian Gram, bacteriólogo danés, desarrollo una técnica de tinción, la cual se le atribuye
a su apellido, esta técnica permitió separar a la bacterias en dos grandes grupos las gram positivas y
las gram negativas, dependiendo si retienen el colorante en su pared o no, después del proceso de
decoloración.

La tinción Gram está basada en la diferenciación de la composición química de la pared celular

bacteriana; para lo que se emplea 4 compuestos: cristal violeta, mordiente-lugol, decolorante
alcohol-cetona y colorante de contraste safranina.

Esto divide a las bacterias en Gram positivas que se tiñen de violeta pues tienen una gruesa capa de
peptidoglicano o mureína y Gram negativas que tienen una capa más fina por lo que no mantienen
el colorante primario (cristal violeta).

Los pasos a seguir para la tinción de las bacterias es hacer el frote, la fijación y la aplicación de las
soluciones colorantes. La amplia gama de colorantes que se pueden utilizar, ha obligado a separarlos
en tres grupos generales, los de trifenilmetano, los de oxacina y los de tiacina. Esta clasificación es
buena para la distinción de las familias de colorantes, pero en general se utiliza la clasificación de
acuerdo a su carácter ácido – base, es decir, ácidos, bases o neutros, debido a que de esto depende
mucho su comportamiento.

La coloración se da de acuerdo con a la acción de los iones complejos del colorante y los sitios activos
de la superficie o del interior de la célula.

Entre los diversos tipos de coloración de bacterias, están la coloración simple, diferencial y la tinción
negativa.

Preparación de un frotis para la tinción

En un portaobjetos de vidrio que debe estar completamente limpio y seco, si el material es líquido
se coloca una gota o si es un material diferente como el sarro dental se hace rodar el hisopo con el
que se tomó la muestra. Puede usarse una aguja estéril para colocar una pequeña cantidad de un
cultivo bacteriano en la superficie del portaobjetos. Este material es suspendido en una gota de
agua o solución salina previamente colocada sobre el portaobjetos. El material se frota
directamente sobre el portaobjetos, donde puede visualizarse con facilidad, el material colocado
debe de fijarse, es el proceso donde se conversan y se fijan las estructuras internas y externas de las
células, para la tinción Gram se realizará una fijación física, es decir, de calor con un mechero a una
temperatura resistente al tacto de nuestra mano

Fijación de Muestras

Fijación es el proceso donde se conversan y fijan en su posición las estructuras internas y externas
de las células. Se mata al microorganismo y se fija al portaobjetos cubriendolo necesariamente con
un cubreobjetos

Existen dos tipos de fijación:

1. Fijación física.- esta fijación solo requiere de factores físicos con el calor o el frío

2. Fijación química.- utiliza sustancias químicas como el metanol, acído acético y formaldehído

Pasos de Tinción de Gram

• Se coloca una pequeña gota de agua destilada en el portaobjetos

• Secar el agua sosteniendo el portaobjetos encima de un mechero o lámpara de alcohol.

• Colocar Cristal Violeta cubriendo la muestra por 1 minuto aproximadamente. Se lava la

muestra con agua

• Agregar el Lugol a la muestra se espera 1 minuto y luego se lava con agua.

• Cubrir la muestra con alcohol acetona para decolorar, se cubre la muestra en un tiempo de
15 a 30 segundos.

• Se agrega una tinción de contraste para teñir las bacterias que pierden el Cristal de Violeta.
Para esto agregamos Safranina cubriendo la muestra de 15 segundos a 1 minuto.

Cocos gram negativos (color rojo-rosado) muestra observada con lente 100x en el laboratorio de
biología celular de la Universidad de las Fuerzas Armadas ESPE Sangolquí-Ecuador

Utilidad de cada colorante en la Tinción Gram

Cristal de Violeta: Es el colorante catatónico que penetra en todas las células bacterianas tanto Gram
positivas como Gram negativas, a través de la pared bacteriana.

Lugol: Es un compuesto formado por Yodo en equilibrio con Yoduro de Potasio y Siulterio, los cuales
están presentes para solubilizar el Yodo, esto hace que el cristal de violeta se fije con mayor
intensidad. El Yodo entra en las células y forma un complejo insoluble en solución acuosa con el
cristal de violeta.

Mezcla de alcohol: Sirve para realizar la decoloración ya que en la misma el complejo Yodo/cristal
de violeta es soluble; las bacterias Gram positivos no se decoloran sino las bacterias Gram negativos.
Safranina: Se utiliza para hacer una tinción de contraste que pone de manifiesto las bacterias Gram
negativas. Al término del protocolo las bacterias Gram positivas se verán azul-violeta y las bacterias
Gram negativas rojas o rosas.

Mecanismo de la tinción Gram

• La diferencia entre Gram positivo (+) y Gram negativo (-) se debe probablemente a la
naturaleza física de sus paredes celulares

• El peptidoglicano actúa como barrera de permeabilidad evitando la pérdida de cristal

violeta.

• Se cree que el decolorante etanol o cetona en las Gram positivas (+), contrae los poros del
grueso peptidoglicano, reteniendo el cristal violeta. Mientras sucede lo contrario con el fino
peptidoglicano de las Gram negativas

Bacterias resistentes a la Tinción Gram

Las siguientes bacterias de naturaleza gram positiva se tiñen como gram negativas:

• Mycobacterias (están encapsuladas).

• Mycoplasmas (no tienen pared).

• Formas L (pérdida ocasional de la pared).

• Protoplastos y esferoplastos (eliminación total y parcial de la pared, respectivamente).

Recomendaciones para tinción Gram

Para obtener una buena lámina es necesario tomar en cuenta algunas precauciones tanto para la
preparación del frotis como en la observación del microscopio.

1.- Extendido.- se debe de tomar en cuenta que el extendido en la lámina con el cultivo bacteriano
(muestra) debe ser fina, caso contrario no será visible en el lente del microscopio, es decir, que las
estructuras no se podrán evidenciar.

2.- Fijación.- si no hay una correcta fijación del cultivo (muestro), es probable que las células
bacterianas se pierda durante el proceso de fijación.

3.- No perder de vista el lugar donde está la muestra, colocar de manera correcta el portaobjetos, y
de la misma forma una vez que la lamina está en la platina del microscopio.

5.- se debe observar en los diferente lentos objetivos, de manera que se pueden focalizar y
diferenciar las estructuras

Tinción de Ziehl-Neelsen
Es una técnica de tinción diferencial rápida y económica, se identifican microorganismos patógenos;
fue descrita por primera vez por los médicos alemanes, el bacteriólogo Franz Ziehl y el patólogo
Friedrich Neelsen.

Fundamento

Las paredes celulares de ciertos parásitos y bacterias contienen ácidos grasos de cadena larga que
les confieren la propiedad de resistir la decoloración ácido-alcohol, después de la tinción con
colorantes básicos; por esto se los denomina ácido-alcohol resistentes como por ejemplo las micro-
bacterias y los parásitos coccídeos. La coloración clásica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento
para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras; al suspender el
calentamiento y enfriar con agua, provoca una nueva solidificación de los ácidos grasos de modo
que el colorante ya no puede salir de las bacterias.

Procedimiento para la Tinción de Ziehl-Neelsen

• Hidratar y desparafinar los cortes.

• Colocar ác. periódico al 5% por 10 minutos.

• Lavar con agua destilada.

• Agregar fucsina fenicada por 15 minutos.

• Decolorar en alcohol ácido al 1%.

• Lavar con agua destilada.

• Poner la hematoxilina durante 10 minutos.

• Azulidificar con carbonato de litio.

• Deshidratar, aclarar y montar la muestra, la muestra puede ser histológica o citológica.

Tinción de ácido alcohol resistencia

Mycobacterium no se unen fácilmente a colorantes simples y hay que teñirlas con un tratamiento
más fuerte, este tratamiento se trata de calentar una mezcla de fucsina básica y fenol. Una vez que
la fucsina ha penetrado con la ayuda del calor y el fenol, las células ácido alcohol resistentes no se
decoloran con una solución ácido-alcohólica, permaneciendo de color rojo. Mientras que las
bacterias no ácido alcohol resistentes se decoloran con la solución y se tiñen de azul de metileno
(tinción de contraste).

ii. Resultados de aprendizaje:

Describe el fundamento teórico de los diferentes tipos de tinción para identificar diferentes células
y estructuras.

iii. Objetivo de la práctica:

 • Familiarizar al estudiante con los diferentes tipos de tinción citológicos e histológicos.

• Enseñar el cuidado y mantenimiento apropiado de los colorantes.

• Aprender los pasos de adecuados de los diferentes tipos de tinción.

iv. Material e insumos:

• Lectura del marco teórico para identificar

v. Procedimiento.

Descripción de los diferentes tipos de tinción mediante exposición.

Realizar una tabla indicando:

Nombre de la tinción

Descripción y características

Células o Tejidos a teñir

Color de la tinción

Dibujo

vi. Resultados.

Los estudiantes identifican los diferentes tipos de tinciones para empléalos en las siguientes
prácticas.

vii. Cuestionario o Trabajo Práctico:

1.- Los estudiantes deben esquematizar los procedimientos de los diferentes tipos de tinción
citológica: panóptico, Giemsa, Papanicolaou, Gram y Ziehl-Neelsen.
2.- Los estudiantes deben esquematizar los procedimientos de los diferentes tipos de tinción
histológica: hematoxilina eosina, PAS, tricromico de Masson, Mallory, Sudan y Feulgen.

3.- Explicar el fundamento de 2 tinciones citológica e histológica a selección personal.

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