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Seminario 2. Frotis y Tinciones

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BENEMÉRITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE PUEBLA

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS


LIC. QUÍMICO FARMACOBIÓLOGO

HEMATOLOGÍA I
SEMINARIO 2.
FROTIS SANGUÍNEO Y FUNDAMENTO DE
TINCIONES HEMATOLÓGICAS

PRESENTA:
ANDRADE LÓPEZ ALEJANDRO
VÁZQUEZ TRINIDAD BYRON DAVID
VELÁZQUEZ FLORES ELSA ELIENAI
FROTIS SANGUÍNEO

Es esencial para la evaluación precisa de la morfología


celular.
Esto nos ofrece datos importantes, si tenemos en
cuenta que sufren muchas alteraciones hematológicas,
por ello la importancia de la técnica.
PORTAOBJETOS EN CUÑA
MATERIAL:
 2 portaobjetos de vidrio limpios
 Sangre con anticoagulante EDTA – Tubo morado
1. Depositar una gota de sangre de unos 5 µL en un
portaobjetos, la gota no debe tener un tamaño
superior a lo 3 mm.
2. Colocar el segundo portaobjeto, sujeto por el
dedo índice y el pulgar, por delante de la gota,
formando un ángulo de 35° a 40°.
3. Se arrastra el segundo portaobjeto hacia atrás
hasta que entre en contacto con la gota de
sangre.
4. Esperar hasta que la sangre se distribuya
uniformemente por el borde del portaobjetos, la
sangre no debe llegar hasta los bordes de los
mismos.
5. Deslizar el portaobjetos hacia adelante realizando
la extensión hasta 1 cm del borde distal del
portaobjeto.
6. Secar la extensión agitando para que las células
no se estiren.

7. Rotular correctamente
ZONAS DEL EXTENDIDO
Cabeza: Zona más proxima al punto de partida, y la
mas gruesa.
Cuerpo: Zona intermedia, la distribución de células
es la adecuada para el recuento.
Cola: Zona más alejada del inicio, suele acabar de
forma irregulas “barbas”
CRITERIOS DE UN BUEN FROTIS
No cubre toda la superficie del portaobjeto
Su espesor disminuye de principio a fin
La sangre quede repartida de forma que no existen
huecos blancos en mitad de la extensión
Las bandas laterales son lisas
COLORANTES

Los colorantes se pueden clasificar según su origen o según su naturaleza


química. Si atendemos a su origen tenemos la siguiente clasificación:

Naturales: Los colorantes naturales se subdividen, a su vez, en


orgánicos e inorgánicos. Los orgánicos se subdividen, también, según
su naturaleza animal o vegetal.

Artificiales: También denominados colorantes sintéticos. Adquieren la


clasificación que se le atribuye a los colorantes tradicionales,
conformados por colorantes ácidos, básicos, neutros e indifirentes.
Actualmente, los centros de investigación de patologías orientados al estudio
anatomopatológico, emplean colorantes sintéticos para colorear diversos
tejidos con la finalidad de emitir un resultado certero. Sin embargo, el uso de
estos colorantes sintéticos implican riesgos en la salud del manipulador.

Por ejemplo, se sabe que la exposición a la hematoxilina, de acuerdo a su


composición, es toxico para el manipulador por contener etanol absoluto,
oxidantes artificiales, ácido acético glacial y sales metálicas, que pueden
alterar nuestro organismo y que de acuerdo con el tiempo de exposición y
frecuencia podría ser mortal. Por ello, se debe buscar formas de reducirlos
utilizando productos naturales
• La molécula de un colorante tiene normalmente dos componentes
importantes: uno que aporta el color, denominado cromógeno, y otro
que posibilita la unión a elementos del tejido denominado auxocromo.
• El cromóforo: es la organización molecular dentro del cromógeno
responsable de la absorción de un espectro determinado de longitudes
de onda.
• El auxocromo puede ser un grupo ionizable, un grupo que reacciona
covalentemente con iones metálicos (mordientes) o puede reaccionar
covalentemente con el sustrato, en este caso el tejido
Según la naturaleza química del cromóforo
• hay varios tipos de colorantes: nitrosos, ozoicos, derivados de
la antraquinona, derivados de la acridina, derivados de iminas
quinónicas, derivados de diferrilmetano y triferrilmetano,
derivados del xanteno y derivados de las talocianinas.
Según la naturaleza química del radical auxocromo
• Básicos: son sales en las que la base, normalmente una amina, aporta el
color, mientras que la parte ácida es incolora. Es decir, con colorantes
catiónicos.
• Ácidos: son sales con el anión coloreado y la base incolora. Son derivados
de grupos sulfónicos, carboxilos o hidroxilos fenólicos.
• Neutros: poseen una porción ácida y otra básica, ambas con capacidad
para aportar color. Por tanto un mismo colorante puede teñir tanto las
partes básicas como las ácidas de los tejidos.
• Indiferentes o hidrofóbicos: realmente no se unen a elementos de los
tejidos por afinidad química sino porque se disuelven en ellos.
EJEMPLOS
• Básico: tionina, safranina, azul de toluidina, el
azul de metileno o la hematoxilina.
• Acido: fucsina ácida, verde rápido, naranja G o la
eosina.
• Neutro: el eosinato de azul de metileno.
• Indiferente: sudán III
TINCIONES

Para visualizar las muestras sanguíneas es necesario realizar tinciones.

Los hematíes tienen un color rojo característico debido a la presencia de


hemoglobina, pigmento que da color a la sangre. Sin embargo, los glóbulos
blancos y las plaquetas carecen de pigmentos, por lo que es necesaria su
coloración para poder identificarlos al microscopio.

Las tinciones más utilizadas para teñir extensiones sanguíneas y de médula ósea
son las de Giemsa, May Grünwald-Giemsa, Wright y panóptico rápido.
• Estas tinciones son modificaciones de las tinciones de Romanowsky, las cuales contienen colorantes
ácidos (eosina) y colorantes básicos (azul de metileno y sus derivados, estos últimos corresponden a
los colorantes tipo azur)
La tinción de Giemsa es un tipo de coloración
de muestras clínicas, basada en la mezcla de
colorantes ácidos y básicos. Su creación estuvo
inspirada por el trabajo realizado por
Romanowsky, donde Gustav Giemsa, químico y
bacteriólogo originario de Alemania, la
perfeccionó agregando glicerol para estabilizar
los compuestos.
Los cambios generados a la técnica original de
Romanowsky permitieron mejorar
considerablemente las observaciones
microscópicas, por lo tanto la técnica fue
Diversas muestras teñidas con Tinción de Giemsa. A. Trypanosoma
evansi en sangre periférica. B. Células sanguíneas normales. C. bautizada con el nombre de tinción de Giemsa.
Borrelia theileri en sangre periférica. D. Linfoma de Burkitt.
Fundamento
• Los colorantes tipo Romanowsky tienen como
fundamento utilizar un contraste entre colorantes
ácidos y básicos, para lograr teñir las estructuras básicas
y ácidas respectivamente.
• El colorante básico utilizado es el azul de metileno y sus
derivados oxidados (Azure A y Azure B), mientras que el
colorante ácido es la eosina.
Las estructuras ácidas de las células son los ácidos nucleicos, los gránulos
de los segmentados basófilos, entre otras, por tanto serán teñidos con el
azul de metileno.

En este mismo sentido, las estructuras básicas de las células son la


hemoglobina y algunos gránulos como los contenidos en los
segmentados eosinófilos, entre otras; estos serán teñidos con la
eosina.

Por otra parte, debido a que el azul de metileno y el azure se


caracterizan por ser colorantes metacromáticos, estos pueden brindar
una tonalidad variable a las distintas estructuras de acuerdo a la carga
de polianiones que posean.
Es así como la combinación estratégica de colorantes básicos y ácidos
logran desarrollar una amplio espectro de colores, de acuerdo con las
características bioquímicas de cada estructura, paseándose por
tonalidades azules pálidas, azules oscuras, lila y púrpura en el caso de
las estructuras ácidas.

Mientras que la coloración que brinda la eosina es más estable,


generando colores entre rojizo- naranja y salmón.
Fuente: PanReac Applichem ITW Reagents. Tinción de Giemsa.
Versión 2: JMBJUL17 CEIVD10ES. Castellar del Vallés, España.
Previo a la coloración se debe tener listo el extendido de la muestra sobre un
portaobjetos limpio.

Las muestras pueden ser sangre, médula ósea, cortes de tejidos histológicos o
muestras cervico-vaginal. Se recomienda que los extendidos sean finos y tengan
1 o 2 horas de secado antes de colorearlos.

Sobre un puente de coloración se colocan todas las láminas que se tengan para
colorear. Se trabaja siempre en un mismo orden y se identifica bien cada lámina.

Colocar unas gotas de alcohol metílico al 100% (metanol) sobre el frotis y dejar
actuar por 3 a 5 minutos, con el fin de fijar y deshidratar la muestra.

Descartar el metanol presente en la lámina y dejar secar al aire.


Una vez seco colocar con un gotero la solución final de tinción hasta
cubrir la totalidad de la lámina. Dejar actuar por 15 minutos. Algunos
autores recomiendan hasta 25 min. Depende de la casa comercial.

Escurrir el colorante y lavar el frotis con agua destilada o con


solución buffer a 7,2.

Sobre un papel secante dejar secar las láminas al aire libre,


dispuestas en forma vertical con ayuda de un soporte.

Limpiar el dorso del portaobjetos con una gasa o algodón


humedecido en alcohol para eliminar cualquier resto de colorante.
Utilidades
La técnica de • Hematología
tinción de • Micología
Giemsa es • Bacteriología
utilizada en • Parasitología
diversas áreas, • Citología
• citogenética.
entre ellas:
Hematología
• Es la utilidad más frecuente que se le da a esta tinción. Con ella
se logran identificar todas y cada una de las células presentes
en muestras de médula ósea o sangre periférica. Así como
estimar el número de cada serie, pudiéndose detectar
leucocitosis o leucopenia, trombocitopenia, etc.
• Debido a que es sensible para identificar células inmaduras, es
relevante en el diagnóstico de leucemias agudas o crónicas.
También es posible hacer el diagnóstico de anemias, como la
anemia drepanocítica, falciforme, entre otras.
La tinción de May-Grünwald, al igual que la tinción de Giemsa o
la Tinción de Wright, está catalogada como tinción tipo Romanowsky.
Del mismo modo que su colorante, que da nombre a la tinción, está
catalogado también como colorante tipo Romanowsky.

El colorante de May-Grünwald es una solución en metanol de un


colorante ácido (eosina) y un colorante básico (azul de metileno).
Estos colorantes teñirán las estructuras celulares dependiendo de su
carácter ácido o básico.
Tinción de May Grünwald-Giemsa
• es una técnica de coloración diferencial que
mezcla los reactivos Giemsa y May Grünwald.
Ambos reactivos se derivan de la tinción tipo
Romanowsky, técnica que está basada en la
combinación de colorantes ácidos y básicos.
Fundamento.
• Sigue el fundamento de las tinciones de Romanowsky, en las que los
colorantes ácidos tienen afinidad selectiva por los componentes básicos
celulares y los componentes ácidos atraen a los colorantes básicos.
Procedimiento de tinción de frotis sanguíneos o de médula ósea
(modalidad clásica)
• Cubrir los frotis durante 2 o 3 minutos con la solución de May-Grünwald diluida.
• Lavar con agua destilada tamponada para eliminar la solución anterior.
• Cubrir con la misma solución de lavado tamponada y dejar por 1 minuto. La idea es que
el colorante anterior se fije a las estructuras y que, al mismo tiempo, se hidraten las
células.
• Agregar 12 gotas de tintura de Giemsa diluida sobre el agua tamponada y soplar para
mezclar y homogeneizar. Dejar reposar durante 15 o 20 minutos.
• Lavar los frotis con agua destilada tamponada y colocarlo a secar al aire.
• Enfocar y observar en un microscopio óptico las células sanguíneas teñidas utilizando el
objetivo de 40X. Si es necesario, puede usarse el de 100X.
(modalidad rápida)
• Cubrir el frotis con el colorante May Grünwald diluido
durante 1 minuto.
• Lavar con agua destilada tamponada.
• Cubrir con agua tamponada y dejar reposar por 1
minuto.
• Colocar el colorante Giemsa diluido y dejar por 5
minutos.
• Lavar con agua destilada tamponada y dejar secar al aire.
tinción de Wrigth
• es una técnica de coloración
creada por el patólogo
estadounidense James Homer
Wright, a partir de la tinción
de Romanowsky. Como la
tinción de Romanowsky era
inestable, Wrigth incorporó el
metanol como disolvente y
fijad
Fundamento.
Procedimiento.
• 1-Realizar el extendido de la muestra de forma que quede una película delgada, bien sea en portaobjeto o cubreobjeto.

• 2-Dejar secar al aire por 2 horas aproximadamente.

• 3-Colocar el frotis seco sobre el puente de coloración o cubeta de tinción con el extendido de la muestra hacia arriba.

• 4-Cubrir la lámina con el colorante de Wright gota a gota hasta abarcar toda la superficie. Dejar actuar durante 5 – 8 minutos.

• 5-El colorante deberá cubrir completamente el portaobjeto, sin que se derrame por los bordes. Si durante el tiempo de coloración se comienza a
evaporar se deberán colocar unas gotas adicionales.

• 6-Posteriormente adicionar una cantidad igual del amortiguador, soplar un poco hasta que aparezca el característico brillo metálico. Cronometrar 10 a 15
minutos.

• 7-Lavar con agua de grifo, colocando el chorro suave hasta que la lámina se vea rosada.

• 8-Con una gasa impregnada de alcohol eliminar el colorante adherido en el dorso del portaobjetos.

• 9-Dejar secar muy bien el frotis antes de colocar el aceite de inmersión para visualizarlo en el microscopio.
T inc ión Panópt ico Ráp ido
Los colorantes que forman el Panóptico Rápido combinan
la policromía y calidad de los métodos clásicos de tinción
hematológica (May Grünwald, Giemsa, Wright). Se trata
de una técnica que se realiza por immersión en las
soluciones colorantes.
Como en el resto de tinciones de tipo Romanowsky, los
colorantes básicos se unen a los componentes ácidos de
las células, ácidos nucleicos, gránulos en neutrófilos y
proteínas ácidas que se tiñen de un color rojo púrpura
más o menos intenso, mientras que los colorantes ácidos
se une a la hemoglobina, componentes básicos de las
estructuras celulares y los gránulos de los eosinófilos.
Su utilización permite la tinción diferencial de las células sanguíneas de sangre periférica,
médula ósea y muestras de esperma.
BIBLIOGRAFÍA
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Modulo I. Editorial MAD S. L.
 Carr, J. H., & Rodak, B. F. (2010). Atlas de hematología clínica. Argentina: Editorial Médica Panamericana
S.A.
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