FACULTAD DE CIENCIAS BÁSICAS Radicado

PROGRAMA DE MICROBIOLOGIA

TÍTULO Identificación del riesgo microbiológico en suelo, lodo residual y

PROPUESTA biosólidos generados en una planta de tratamiento de aguas residuales
domesticas en la ciudad de Santiago de Cali, utilizados como fertilizante
en el cultivo de Rábano.
DATOS DE LA PROPUESTA
Grupo de investigación Microbiología, Industria y Ambiente, GIMIA
Línea de investigación Microbiología ambiental

ESTUDIANTE (S)
Nombre: Angie Daniela Peláez Giraldo
Identificación 1007304236
Correo: Angie.pelaez00@usc.edu.co
Teléfono: 3222543812

Nombre: Luis Eduardo Agudelo Sánchez

Identificación 1113679571

Correo: Luis.agudelo02@usc.edu.co
Teléfono: 3242132271

DIRECTOR
Nombre: José Luis Cárdenas Talero
Identificación 80814754
Correo: jose.cardenas03@usc.edu.co
Teléfono: 3223791332
DIRECTOR 2
Nombre: Viviana Catalina Corredor
Identificación 1022358980
Correo: viviana.corredor00@usc.edu.co
Teléfono: 3017664253

1
1
 Identificación el riesgo microbiológico en suelo, lodo residual y
biosólidos generados en una planta de tratamiento de aguas
residuales domesticas en la ciudad de Santiago de Cali, utilizados
como fertilizante en el cultivo de Rábano.

Angie Daniela Peláez Giraldo

Luis Eduardo Agudelo Sánchez

Trabajo de grado presentada(o) como requisito parcial para optar al título de:
Microbiólogo

Director
MSc. José Luis Cárdenas Talero

Directora
MSc. Viviana Catalina Corredor

Línea de Investigación:
Microbiología ambiental

Grupo de Investigación:
Microbiología, industria y ambiente, GIMIA

Universidad Santiago de Cali

Facultad de Ciencias Básicas,
Programa de Microbiología
Cali, Colombia
2023
TABLA DE CONTENID

2
 O
Resumen.............................................................................................................................5

Abstract...............................................................................................................................5

Planteamiento de la pregunta o problema de investigación..........................................6

Justificación en términos de necesidades y pertinencia...............................................7

Marco teórico y estado del arte........................................................................................7

Lodos de aguas residuales...............................................................................................7
Tipos de lodos...................................................................................................................8
Lodo primario....................................................................................................................8
Lodo activado....................................................................................................................8
Exceso de lodo, lodo secundario......................................................................................8
Lodo terciario....................................................................................................................8
Biosólidos..........................................................................................................................8
Clasificación de biosólidos................................................................................................9
Aprovechamiento de biosólidos........................................................................................9
Parámetros microbiológicos importantes en biosólidos..................................................10
Coliformes Fecales.........................................................................................................10
Salmonella spp................................................................................................................11

Objetivos...........................................................................................................................11
Objetivo General:............................................................................................................11
Objetivos Específicos:.....................................................................................................11

Metodología Propuesta....................................................................................................11
I. Obtención de lodos y biosólidos..............................................................................11
II. Evaluación de Coliformes Fecales en lodo, biosólidos, suelo, mezclas pre-
postcosecha y Rábano (Raphanus sativus L.)................................................................12
III. Evaluación de Salmonella spp en lodo, biosólidos, suelo, suelo postcosecha y
rábano (Raphanus sativus L.).........................................................................................13

Controles de trabajo.........................................................................................................14
Control positivo del medio de cultivo...............................................................................14
Control positivo medios de cultivo Coliforme totales y fecales.......................................14
Control positivo medios de cultivo para Salmonella spp.................................................14
Control negativo del medio de cultivo.............................................................................15

Resultados/Productos esperados y potenciales beneficiarios...................................18

Bibliografía........................................................................................................................19
 LISTA DE TABLAS

Pág

Tabla 1. Microorganismos de prueba................................................................................14

Tabla 2. Medios de cultivos utilizados...............................................................................15

Tabla 3. Descripción de actividades..................................................................................15

Tabla 4. Descripción de actividades proyecto...................................................................17

Tabla 5. Descripción de los gastos de personal................................................................17

Tabla 6. Descripción de los equipos..................................................................................17

Tabla 7. Materiales e insumos...........................................................................................18

Tabla 8. Descripción de los gastos de salidas de campo..................................................18

LISTA DE FIGURAS
Pág
Figura 1. Metodología propuesta para análisis microbiológico.........................................13
Resumen
Las plantas de tratamiento de agua residual generan subproductos entre ellos
lodos residuales, estos contienen gran cantidad de materia orgánica y nutrientes,
material que por lo general no es aprovechado y es desechado sin darle un valor
agregado, como consecuencia de esto se incrementa su disposición final en los
rellenos sanitarios. Por lo anterior, en este trabajo pretende evaluar el riesgo
microbiológico en un lodo residual y biosólidos provenientes de una planta de
tratamiento de aguas residuales de la ciudad de Santiago de Cali, por medio de la
técnica número más probable (NMP) para la determinación de Coliformes Fecales
basados en el Standard Methods y determinación de Salmonella spp a través de
la NTC 4574, por medio de la cual determinarán estas características en el lodo
residual y biosólidos que serán aplicados como fertilizante en un cultivo de
Rábano.

Palabras clave: Agricultura, Lodos residuales, Biosólidos, Patógenos, Rábano.

Abstract
Keywords: Agriculture, Sewage Sludge, Biosolids, Pathogens, Radish.

5
Planteamiento de la pregunta o problema de
investigación

Los lodos son subproductos líquidos, sólidos o semisólidos producto del

tratamiento de las aguas residuales, los cuales están compuestos principalmente
de materiales orgánicos e inorgánicos, metales pesados, organismos como virus,
parásitos, hongos y bacterias (Comisión Europea, 2010). Las características de los
lodos dependen de los tratamientos que se les apliquen a las aguas residuales,
estos tratamientos pueden ser de diferentes clases según el tipo de agua a tratar
(Hernández et al., 2021). En las plantas de tratamiento de agua residual se
encuentran inicialmente los lodos crudos, estos son aquellos que no han sido
tratados ni estabilizados y generalmente producen malos olores. Por otra parte,
están los primarios, los cuales se producen durante los procesos de tratamiento
primario de las aguas residuales y contiene generalmente una gran cantidad
materia orgánica no digerida, también están los lodos secundarios que contienen
partículas no hidrolizables y una gran cantidad de biomasa producto del
metabolismo celular. por último, están los lodos terciarios que se producen a
través de procesos de tratamiento posterior como la adición de agentes floculantes
(Hernández et al., 2021)

Los lodos residuales al no ser tratados correctamente pueden generar problemas

ambientales y derivar en sanciones por parte de la autoridad ambiental
competente (Trejos & Agudelo, 2012). Un mal tratamiento o ausencia de este
conlleva a una disposición final en rellenos sanitarios y pueden alcanzar hasta el
50% de los costos operacionales de las estaciones de tratamiento (Bettiol &
Camargo, 2000). La generación de los lodos se ha convertido en un problema
ambiental porque presenta una alta concentración de agentes patógenos y pueden
contener sustancias tóxicas como metales pesados y compuestos orgánicos
recalcitrantes (Kefala et al., 2013).

Muchos países han optado por la disposición final de los lodos en la reutilización y
aplicación sobre suelos (Sastre et al., 2015), obteniendo resultados positivos en la
remediación de las deficiencias nutricionales proporcionando materia orgánica,
nitrógeno, fosforo y potasio en el suelo (Saffari et al., 2020; Moura Chagas et al.,
2021), sin embargo, por la presencia de patógenos se debe someter previamente
a procesos de estabilización para disminuir los riesgos ambientales y de salud
pública. (Hernández et al., 2021).

Los lodos producidos en las plantas de tratamiento de aguas residuales deben de

ser procesados, es decir convertidos en biosólidos antes de ser reutilizados. Este
proceso, denominado estabilización, ayuda a minimizar la generación de olores,
destruir los microorganismos patógenos, virus, parásitos y reducir las
probabilidades de atracción de vectores (Decreto 1287 de 2014),

6
Una alternativa viable en Colombia es utilizar los biosólidos en la agricultura
sostenible ya que presenta una gran cantidad de nutrientes representados en
materia orgánica, ello ayudaría a mejorar la fertilidad, textura y estructura de los
suelos, reducir la utilización de fertilizantes químicos, de tal manera que se podría
optimizar gastos, aumentar la producción de las cosechas y por ende las
ganancias (Arévalo et al., 2009).

Por último, el aprovechamiento de biosólidos se puede usar como fertilizante en el

sector agronómico, estos lodos y biosólidos s pueden emplear para el crecimiento
de hortalizas como el Rábano (Raphanus sativus L.) debido a que se ha reportado
un aumento de peso en la planta entre el 40% y 150% (Hernández et al., 2021), el
Rábano es una planta de rápido crecimiento y presentar un contacto directo entre
el sustrato y la parte comestible (Pisco & Arenas, 2006).

Pregunta problema
Por todo lo anterior se plantea la siguiente pregunta de investigación ¿Cuál es la
densidad bacteriana de Coliformes Fecales y Salmonella spp en la siembra de
Rábano (Raphanus sativus L.) utilizado como fertilizante el lodo residual y
biosólidos generados en una planta de tratamiento de agua residual?

¿Cuál es la densidad bacteriana de Coliformes Fecales y Salmonella spp en lodo

residual y biosólidos generados en una planta de tratamiento de agua residual que
serán utilizados como fertilizantes en la siembra de Rábano (Raphanus sativus
L.)?

Justificación en términos de necesidades y pertinencia

El aprovechamiento de los biosólidos es una práctica que se ha llevado a cabo en
diferentes países del mundo siendo el sector agrícola destinado para tal fin, esto
implica un reto económico y de ingeniería, debido a que requiere inversión en
infraestructura como también en investigación y desarrollo de nuevas tecnologías
(Hernández et al., 2021). El uso de biosólidos tiene grandes ventajas como su
utilización para mejorar la estructura y textura de los suelos y aumentar la
capacidad de absorción de agua y nutrientes por las plantas, esto asegura un
óptimo desarrollo de los cultivos y reduce los costos ocasionados por la aplicación
de fertilizantes (Mantilla, 2015). disminuir la aplicación de fertilizantes inorgánicos
comerciales es importante debido a que gracias a la alta solubilidad estos
presentan un alto riesgo de contaminación en acuíferos y lagos (Mata-González at
al., 2012) que a su vez cuya producción implica en algunas ocasiones otra fuente
de contaminación atmosférica (Mata-González et al., 2012)

7
La utilización de biosólidos en Colombia aportaría a una agricultura sostenible
debido a que estos contienen una gran cantidad de nutrientes presentes en la
materia orgánica (Hernández et al., 2021) y pueden ser utilizados en la
recuperación de suelos degradados en áreas de silvicultura (Zabotto et al., 2018).
Gracias a ello ayudaría a mejorar la fertilidad, textura y estructura de los suelos y
aumentar la producción de las cosechas y por ende las ganancias (Arévalo et al.,
2009).

Marco teórico y estado del arte

Lodos residuales

El tratamiento de las aguas residuales domesticas o industriales se lleva a cabo

por procesos químicos, físicos y biológicos con el objetivo de suprimir todos los
contaminantes presentes que puedan afectar la calidad del agua, existen una gran
cantidad de elementos eliminados por el proceso de tratamiento de las aguas
residuales, como arena, lodos y espuma (Oropeza, 2006). El lodo resultante del
proceso de tratamiento se clasifica como una mezcla de aguas negras y
sedimentos sólidos, por lo general son líquidos o un líquido-semisólido con 0.25-
12 % de solidos contenidos (Winkler, 2015), además contienen microorganismos
encargados de la remoción de materia orgánica, macro y micronutrientes, metales
pesados, patógenos y contaminantes orgánicos; la composición de estos lodos
puede ser diversa dependiendo de las características microbiológicas y
fisicoquímicas (Colín, 2004).

Tipos de lodos

Los lodos que se originan de los procesos de tratamiento de aguas residuales se

clasifican de la siguiente manera.

Lodo primario

El lodo primario es producido durante los procesos de decantación primaria, por

medio de la separación por gravedad de los sólidos en suspensión presentes en
las aguas residuales. La formación del lodo depende de las características del
área donde es recogida el agua, generalmente contiene una gran cantidad de
materia orgánica, residuos de frutas, vegetales, papel, etc. La consistencia se
caracteriza por ser un fluido denso con un porcentaje de agua que varía entre 92
% y 96% (Winkler, 2015).

Exceso de lodo, lodo secundario

El lodo secundario implica la degradación de materia orgánica por medio de

procesos biológicos, los cuales comprende el crecimiento y desarrollo de
microorganismos que emplean los contaminantes como alimento, aquí los

8
microorganismos, se reproducen y crean un lodo que es separado del líquido
clarificado. Estos lodos están compuestos principalmente por partículas biológicas
generadas por bacterias, además contiene solidos entre un 0,5% y un 4% que no
fueron eliminados por el tratamiento primario (Winkler, 2015).

Biosólidos

Los biosólidos son el resultado de tratamientos de estabilización de los lodos

provenientes de las plantas de aguas residuales, tratamientos que se efectúan con
el fin de disminuir su peligrosidad, actividad microbiana y la atracción de vectores
(Rodríguez, 2016). Según lo definido en el decreto 1287 del 2014, sobre el
cuidado al ambiente, de acuerdo con las características finales del biosólido
pueden ser aptos para su aprovechamiento.

Se estima que los biosólidos contienen un alto porcentaje de humedad, nutrientes

como el nitrógeno, fósforo y materia orgánica (Rodríguez, 2016), por lo tanto,
pueden ser empleados en la agricultura y la jardinería, aportando macro y
micronutrientes que fomentan el crecimiento de plantas de una manera más
rentable (Oropeza,2006).

Clasificación de biosólidos

Categoría A: Son biosólidos que han sido tratados hasta conseguir niveles muy
bajos de patógenos, estos se pueden aplicar al suelo sin ninguna restricción. Los
biosolidos de esta categoría deben tener una densidad de coliformes fecales por
debajo de 1000 NMP por gramos de solidos totales y una densidad de Salmonella
menor a 3 NMP por 4 gramos de solidos totales (Singh y Agrawal, 2008).

Son biosólidos con niveles bajos de contaminantes, con reducción de patógenos y

que pueden ser aplicados en el suelo sin ninguna restricción (Singh y Agrawal,
2008).

Categoría B: Son biosolidos que han sido tratados obteniendo una disminución de
patogenos pero no han sido eliminados, estos pueden ser aplicados al suelo con
mayores restricciones. Los biosolidos categoría B deben tener una densidad de
coliformes fecales menor a 2 x 106 NMP por gramo de solidos totales (Singh y
Agrawal, 2008).

Aprovechamiento de biosólidos

Los biosólidos resultantes del proceso de tratamiento de aguas residuales

contienen gran cantidad de biomasa importante, por esto resulta valioso generar
esfuerzos para implementar su aprovechamiento. La formación de abonos con
biosólidos provee material orgánico (60-70%), nutrientes como el nitrógeno(N),
fósforo(P) y potasio (K), magnesio (Mg), sulfuro (S) y micronutrientes (Macedo et
al., 2014), los cuales optimizan los aspectos físicos del suelo como la porosidad, la

9
densidad aparente (Mohapatra et al., 2016), aspectos que se verán reflejados en
la producción de cultivos más viables y rentables gracias a que se propicia un
buen desarrollo de las plantas sin necesidad de usar fertilizantes comercializados
que generan costos elevados y mayores efectos negativos sobre el medio
ambiente (Farooque et al., 2011).
No obstante, estos biosólidos pueden ser dañinos para la salud, ya que pueden
contener sustancias químicas, bacterias y virus que pueden ocasionar
enfermedades, es por esto por lo que precisan un manejo adecuado para
disminuir o eliminar agentes patógenos, e implementar procesos de estabilización,
filtración y secado, para prevenir eventuales impactos negativos para la salud
humana y para el medio ambiente y así poder ser empleados de una manera
positiva en la agricultura (Metcalf & Eddy et al., 2014).

Las limitaciones asociadas al procesamiento y aplicación de los lodos propenden

incrementarse acorde aumenta la probabilidad de estar en contacto con los seres
humanos, es por esto por lo que la normativa exige unos requisitos legales para su
aprovechamiento.

La legislación de los Estados Unidos (Kuchenrither, 1992; Bastian, 1994;

Goldstein, 1989; USEPA, 1993), es concreta y restrictiva en lo referente a las
particularidades microbiológicas de los biosólidos destinados a usos agrícolas,
definiendo dos niveles de calidad de biosólidos (clase A y clase B) teniendo en
cuenta la concentración de patógenos existentes, también define que para que un
biosólido sea aprovechable en agricultura debe cumplir, al menos, las
especificaciones clase B. También se establecen límites de metales pesados,
Incluye asimismo una lista de fases y formas de uso para reducir el contacto con
organismos vectores (EPA, 2003).

En nuestro país, Decreto 1287 del 2014 por parte del Ministerio de Ambiente,
Vivienda y Desarrollo Territorial “Por la cual se establecen los criterios de calidad y
uso para el aprovechamiento de los biosólidos generados en plantas de
tratamiento de aguas residuales municipales para su incorporación al ciclo
económico productivo, y se toman otras determinaciones”: Donde se establecen
las categorías A y B de los lodos analizados según la presencia de
microorganismos como Coliformes Totales, Salmonella sp y Huevos de helminto
(Ministerio de Ambiente, 2010).

Rábano (Raphanus sativus L.)

El Rábano es una especie de planta herbácea perteneciente a la familia

crucíferas, es una planta que se caracteriza por tener un rápido crecimiento, en un
lapso de 45 días, su desarrollo se da en zonas con clima templado. Es sensible a
la deficiencia de agua en especial después de su siembra, para su optimo

10
crecimiento es necesario conservar la humedad hasta el desarrollo de sus raíces y
ramificación (Sanchez,2018).

Sistema radical
Su sistema radical es poco desarrollado con raíz principal y finas raicillas laterales.
El engrosamiento que caracteriza el órgano de consumo del rábano, generalmente
se le llama raíz carnosa, se origina del hipocótilo y por esto se considera que es
una transformación del tallo y no de la raíz. En cuanto al color la superficie de la
corteza puede ser: Rosado, blanco, rojo, amarillo (Infoagro, 2014).

Hoja

Su morfología foliar es compuestas imparipinnadas presentan bordes dentados,

vellosas y de un color verde intenso (Infoagro, 2014).

Fruto y semillas

El fruto es una silicua indehiscente, contiene en su interior tejido parenquimatoso,

donde se sitúan las semillas, tienen superficie lisa y color de pardo claro a rojizo
(Infoagro, 2014).

Temperatura.

El rábano en su proceso de crecimiento y desarrollo responde a la relación entre la

temperatura y la intensidad luminosa. La germinación es óptima a 25 °C y la
formación de la raíz carnosa se da aproximadamente entre 16-17°C (Infoagro,
2014).

Luminosidad.

Es una planta exigente a la luz, deben recibir seis o más horas de luz solar, pero
también se le debe proteger del sol ardiente de la tarde (Infoagro, 2014).

Humedad del suelo.

El rábano es muy exigente a la humedad del suelo, si esto no sucede se afecta la

calidad de las raíces carnosas las que se tornan duras y pierden consistencia
(Infoagro, 2014).

Suelos.

Requiere de suelos de buena textura y retención de humedad, pero también

pueden cultivarse en suelos ligeros, arenosos y areno-arcilloso (Infoagro, 2014).

11
Parámetros microbiológicos importantes en biosólidos.

En biosólidos se analizan parámetros microbiológicos con el fin de establecer su

calidad y composición, en su mayoría estos parámetros se encuentran estipulados
en el Decreto 1287 del 2014 por parte del Ministerio de Ambiente, Vivienda y
Desarrollo Territorial “Por la cual se establecen los criterios de calidad y uso para
el aprovechamiento de los biosólidos generados en plantas de tratamiento de
aguas residuales municipales para su incorporación al ciclo económico productivo,
y se toman otras determinaciones”: Donde se establecen las categorías A y B de
los lodos analizados según la presencia de microorganismos como Coliformes
Totales, Salmonella sp y Huevos de helminto (Ministerio de Ambiente, 2010).

Coliformes Fecales

Los coliformes totales son bacterias Gram negativas con morfología bacilar,
fermentadoras de lactosa a temperaturas de 35 a 37 °C, producen acido láctico y
gas en un lapso de tiempo de 24 h. Los coliformes fecales son microorganismos
aerobios o anaerobios facultativos, oxidasa negativa, no esporulados y tienen
actividad enzimática ß-galactosidas. Hacen parte del grupo Escherichia coli,
Citrobacter, Enterobacter y Klebsiella (Carrillo & Lozano,2008).

Estos microorganismos están presentes en el ambiente y heces fecales de

humanos y animales homeotermos, se consideran indicadores de contaminación
en alimentos y agua (Washington State Department of Health, 2016).

Salmonella spp

Salmonella es un bacilo Gram negativo que se clasifica como anaerobio

facultativo, fermentan glucosa, puede crecer a una temperatura entre 7-49˚C,
crece a un pH que varía entre 4-9, son móviles gracias a la presencia de flagelos
perítricos, no encapsulados, no formadores de esporas puede ser transmitida
principalmente a los humanos por el consumo de alimentos contaminados (Kimura
et al, 2004) se estima que el 90-95% de los casos de salmonelosis están
asociados al consumo de alimentos contaminados (Noda et al, 2010).

Objetivos
Objetivo General:

12
Identificar el riesgo microbiológico en suelo, lodo residual y biosólidos generados
en una planta de tratamiento de aguas residuales domesticas en la ciudad de
Santiago de Cali, utilizados como fertilizante en el cultivo de Rábano.

Objetivos Específicos:

 Cuantificar la carga microbiana de Coliformes Fecales y Salmonella sp. en

muestras de suelo, lodo residual y biosólidos destinados para su uso como
fertilizantes en el cultivo de Rábano.

 Clasificar microbiológicamente los tipos de lodo y biosólidos en conformidad

con las regulaciones nacionales e internacionales aplicables para su
posterior aprovechamiento.

 Determinar el riesgo microbiológico asociado con la dosificación basada en el

contenido de nitrógeno en los lodos y los biosólidos después de la cosecha
del Rábano.

Metodología Propuesta
I. Obtención de lodos y biosólidos.

Los lodos se recolectarán de una planta de tratamiento de agua residual (PTAR)

en el sector de Cachipay de la ciudad de Cali, donde se tomará una muestra de
lodos deshidratados en lechos de secado. Además se tendrá en cuenta biosólidos
(Clase A y Clase B) ya tratados térmicamente, todas estas muestras serán
tomadas en bolsas ziploc de 14x20 cm y serán refrigeradas en neveras de 0-4°C
para su posterior análisis.
Obtención del suelo.

El suelo será tomado de los viveros presentes en la Universidad Santiago de Cali,

se recolectará en bolsas ziploc de 14x20 cm . Y luego de esto ¿???

I. Obtención de la semilla

Las semillas de Rábano serán desinfectadas con hipoclorito de sodio al 1% por 5

minutos y se lavará con agua estéril, posteriormente se sembrarán 5 semillas por
matera (0.7 L) a una profundidad de 2 cm, finalmente se realizará el riego con
agua

Para iniciar la fase de experimentación en el aprovechamiento de los lodos y

biosólidos, se realizará el análisis físico y químico inicial, en términos de materia
orgánica y nutrientes, en el suelo, lodo y biosólidos (Silva et al., 2013).

13
Diseño experimental

Se empleará un diseño experimental completamente al azar y se realizará un

montaje a escala de laboratorio. Se evaluarán los tratamientos por duplicado
(control sin ningún tipo de aplicación, aplicación de lodo y 2 tipos de biosólido).
Para el caso del lodo y biosólido se empleará la tasa (Venegas et al., 2019) en
función de los requerimientos de nitrógeno para el cultivo de Rábano. La dosis de
aplicación de biosólido será calculada a partir de la caracterización inicial del suelo
(N, P, CO, K, pH, Humedad) (Silva et al., 2013) y del requerimiento de nitrógeno
recomendado para el cultivo seleccionado y el nitrógeno disponible en el lodo,
como se indica en la siguiente ecuación (CETESB, 1999).

Nitrógeno recomendado para el cultivo (kgha ) Ec. 1

Dosis de Lodo (kgha )= Nitrógeno disponible en el lodo
( mg
kg )
*0.001

Con base en los resultados obtenidos, se realizará el análisis estadístico de los

datos empleando herramientas de la estadística descriptiva y análisis de varianza
ANOVA, se empleará la prueba de Tukey con p<0.05 para identificar diferencias
estadísticas significativas. Empleando el programa libre estadístico R (Silva et al.,
2013).

I. Caracterizacion microbiológica
II. Evaluación de Coliformes Fecales en lodo, biosólidos, suelo, mezclas
pre-postcosecha y Rábano (Raphanus sativus L.).

Para la determinación y analisis de resultados de Coliformes fecales en los

biosólidos, suelo y rábano (Raphanus sativus L.) descrita en la Figura 1, se
realizará siguiendo mediante el standard methods for the examination of waters
and wastewaters (APHA et al., 2005). la evaluación de la microscopia y concluir la
fase completa, se realizarán pruebas bioquímicas descritas en el punto 4.

Cuantificacion de la carga microbiana de Coliformes Fecales y Salmonella

spp. en muestras de suelo, lodo residual, biosólidos y Rábano (Raphanus
sativus L.). .

Para la determinación y cuantificación de coliforme fecales en las muestras de

suelo, lodo residual y biosolidos se utilizará la técnica de número más probable
basados en el método estándar para el análisis del agua y Aguas Residuales 7
edición. Este método recoge los mejores procedimientos empleados en la
actualidad por los analistas de aguas estadounidenses y pueden aplicarse de
forma generalizada en relación con los problemas habituales de purificación de

14
 aguas, eliminación de aguas residuales e investigaciones sanitarias (APHA et al.,
2005).
el rabano cosechado de la utilización de biosolidos como biofertilizantes será
analizado bajo la NTC 4516 de 2009 debido a que suministra directrices generales
para la detección, enumeración y cuantificación de coliformes en productos
destinados para consumo humano. Para el análisis y cuantificación de Salmonella
spp en todas las muestras junto con el rabano obtenido, se tomará como base la
NTC 4574 de 2007 ya que esta norma describe los métodos horizontales para la
detección y confirmación de Salmonella spp.

III.[II.] Evaluación de Salmonella spp en lodo, biosólidos, suelo, suelo

postcosecha y Rábano (Raphanus sativus L.).

Para la determinación Salmonella spp en lodo, biosólidos, suelo y Rábano

(Raphanus sativus L.) postcosecha se evaluará por medio de la técnica NTC 4574
de 2007. Finalizado el tiempo de incubación, mediante el uso de cuenta colonias
se realizará el conteo de UFC y se empleará la siguiente fórmula.

UFC Numero de colonias X Factor dilución

= Ecuación 2. Reporte de UFC/ml
mL Volumen de siembra

IV. Pruebas bioquímicas

Las pruebas confirmatorias para la determinación de Coliformes Fecales se

realizarán teniendo como base la NTC 4092 del 2009 específicamente el punto 12.
hasta el 12.3.4. de igual forma se realizará la prueba de indol que se describe en
el Standard Methods.

Para la confirmación de Salmonella spp se realizarán pruebas bioquímicas

convencionales para detección de Salmonella spp las cuales serían: agar hierro
tres azúcares (TSI), agar lisina hierro (LIA), urea, Voges-Proskauer (Ruiz et al.,
2018).

Controles de trabajo

Control positivo del medio de cultivo.

Para realizar los controles positivos en los medios de cultivo se utilizarán cepas
comerciales con concentraciones conocidas de los microorganismos (Tabla 1),
para lo cual inicialmente se calentará el fluido de hidratación (solución salina) a
una temperatura de 34°C a 38°C. Posteriormente, por medio de fórceps estériles
se transferirán los sedimentos celulares al fluido hidratante para luego, colocar la

15
suspensión a incubar durante 30 minutos a una temperatura entre 34°C y 38°C
para garantizar la hidratación completa. Posterior a la incubación, se someterá a
vortex para homogeneizar la suspensión de los microorganismos (Microbiologics,
2021).

Tabla 1. Microorganismos de prueba

MICROORGANISMO
Escherichia coli
Salmonella typhimurium

Control positivo medios de cultivo Coliforme totales y fecales

En tubos de ensayo con campana de Durham se agregaran 9 ml de caldo lauril

triptosa, verde brillante lactosa bilis, medio liquido EC, por separado en cada tubo.
posteriormente se agregara 1 ml de la suspensión de E.coli preparada
anteriormente. los tubos de caldo lauril triptosa se incubarán por 18-48 horas a 33-
37 °C, los tubos con verde brillante lactosa bilis se incubarán a 44,5 - 45,5 °C
durante 24 horas y los tubos con caldo EC se incubarán a 33-37 °C durante 24 -
48 horas, una vez finalizando el tiempo de incubación se verificará la presencia de
gas en la campana de Durham.

Control positivo medios de cultivo para Salmonella spp

En tubos de 10x100mm se agregarán por tubo separado 9 ml de caldo lactosado,

caldo Rappaport Vassiliadis, posteriormente se agregará 1 ml de la suspensión de
Salmonella typhimurium preparada anteriormente. Los tubos con caldo lactosado
se incubarán a 37 °C ± 1 °C por 24 horas, el caldo Rappaport Vassiliadis se
incubará a 41,5 °C ± 1,0 °C durante 24 h ± 3 horas.

En cajas de petri de 9 cm de diámetro se agregarán entre 15-20 ml de Agar Xilosa

Lisina Desoxicolato (XLD) y Agar Hektoen. Posterior a la cuagulacion del medio,
se añadirá 0,1 ml de las suspensiones de caldo lactosado y caldo Rappaport
Vassiliadis en cajas diferentes, finalmente se incubarán las cajas petri a 36 °C ± 1
°C y se examina después de 24 h ± 3 h.

Control negativo del medio de cultivo.

Para realizar los controles negativos se incubarán el 100% de los medios de

cultivo (Tabla 2) y se realizarán evaluación de control de calidad las cuales serían
de esterilidad y aspecto visual (Herrera & Campos, 2005).

Tabla 2. Medios de cultivos utilizados.

Medio de Cultivo Temperatura y tiempo de incubación
Caldo Lauril triptosa 33-37 °C por 18-48 horas
Caldo Verde Brillante 44,5 - 45,5 °C por 24 horas
Caldo EC 33-37 °C por 24 - 48 horas

16
 Caldo Rappaport Vassiliadis 41,5 °C ± 1,0 °C por 24 h ± 3 h
Caldo lactosado 37 °C ±1 °C por 24 h ± 3 h.
Agar Xilosa Lisina Desoxicolato 36 °C ± 1 °C por 24 h ± 3

Agar Hektoen 36 °C ± 1 °C por 24 h ± 3

Clasificación microbiológicamente de biosólidos

La clasificación de los biosólidos obtenidos se realizará bajo el decreto 1287 de

2014 el cual se establecen criterios (tabla 3) para el uso de los biosólidos
generados en plantas de tratamiento de aguas residuales municipales, los
biosolidos podrán ser clasificados como biosólido A y/o biosólido B.

Tabla 3. Criterios microbiológicos para biosolidos A y B.

Categoría Biosólido
Criterio Variable Unidad de Medida
Valores máximos
permisibles
A B
Unidades Formadoras
Coliformes de Colonias - UFC/g
<1,00 E <2,00 E
fecales de biosólido (base
seca)
(+3) (+6)
Huevos de Helmintos
Huevos de
viables/4 g de <1,0 <10,0
Relmintos Viables
Microbiológicos biosólido (base seca)
Unidades Formadoras
de Colonias - UFC / en <1,00 E
Salmonella sp. Ausencia
25 g de biosólido
(base seca) (+3)
Unidades Formadoras
de Placas – UFP/4 g
Virus Entéricos <1,0
de biosólido (base
seca)

Determinar el riesgo microbiológico asociado con la dosificación basada en el

contenido de nitrógeno en los lodos y los biosólidos después de la cosecha del
Rábano.

17
 Cronograma de actividades
Tabla 3. Descripción de actividades
No. Actividad Tiempo (meses) Duración
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 (semanas
o meses)
1 Revisión bibliográfica
2 Escritura de
anteproyecto
3 Recolección de lodos
4 Siembra de rábano
5 Proceso experimental

6 Análisis estadísticos
7 Análisis de resultados
8 Elaboración de
documento final

Presupuesto
Tabla 4. Descripción de actividades proyecto
RUBROS USC
EFECTIVO ESPECIE
PERSONAL $17.573.192
EQUIPOS Y SOFTWARE $181.488.000
MATERIALES $15.782.000
SALIDAS DE CAMPO $1.500.000
TOTAL 216.343.192

Tabla 5. Descripción de los gastos de personal (en miles de $).

RECURSOS
FUNCIÓN USC
NOMBRE DEL FORMACIÓN DEDICACIÓN
DENTRO DEL TOTAL
INVESTIGADOR ACADÉMICA (h/semana) Contrapartida
PROYECTO Especie

Viviana Catalina 2 horas /

Maestría Directora $ 66.343 6.899.672
Corredor Sáenz semana
José Luis Cárdenas 4 horas /
Maestría Director $ 51.315 10.673.520
Talero semana
Angie Daniela Peláez Estudiante Estudiante 20
Luis Agudelo Estudiante Estudiante 20
TOTAL $17.573.192

Tabla 6. Descripción de los equipos que se planea adquirir o utilizar, costo de compra o
servicio (en miles de $).

18
 EQUIPO JUSTIFICACION RECURSOS USC TOTAL

Efectivo Especie

Plancha de calentamiento Preparación de medios de 3.000.000 3.000.000

cultivo
Incubadora 35°C +/-2°C Incubación de 25.730.000 25.730.000
microorganismos
Cuenta colonias Recuento de colonias 7.100.000 7.100.000

Cabina de flujo laminar Plaqueo de medios de cultivo 12.654.000 12,654.000

Cabina de seguridad Manejo de cepas 27.980.000 27.980.000

biológica microbiológicas
Autoclave Para esterilizar el material y 75.500.000 75.500.000
medios de cultivo

Baño termostatado graduado Incubadora para caldo triptona 10.654.000 10.654.000

a 44.5°C o Ec

Balanza de precisión Para pesar medios de cultivo 4.050.000 4.050.000

Nevera 0-5 ° C Refrigeración de medios de 8.230.000 8.230.000
cultivo preparados
Microscopio Observar morfología de los 6.590.000 6.590.00
microorganismos
Total 181.488.000 181.488.000

Tabla 7. Materiales e insumos (en miles de $)

MATERIALES JUSTIFICACION RECURSOS USC TOTAL

Efectivo Especie

Micropipeta 100-1.000 Tomar volúmenes pequeños para 750.000 750.000

µL diluciones

Puntas para Tomar volúmenes pequeños para 60.000 60.000

micropipeta diluciones

Material de vidrio Indispensable para preparación de 700.000 700.000

medios de cultivo, realizar diluciones,
preparaciones de pruebas bioquímicas,
para fermentación Durham.

Asas redondas Para realizar siembra 30.000 30.000

Asas rectas Para realizar siembra 30.000 30.000

Laminas portaobjetos Realizar montaje de microscopia 7.000 7.000

Portaobjetos Realizar montaje de microscopia 5.000 5.000

Medios de cultivo Para llevar a cabo análisis 7.800.000 7.800.000

microbiológico por NMP y determinación
de Salmonella sp

Gradillas Para realizar montaje de pruebas en 50.000 50.000

tubos tapa rosca

Total 15.782.000 15.782.000

Tabla 8. Descripción de los gastos de salidas de campo (en miles de $).

19
 LUGAR /NO. DE
JUSTIFICACIÓN** TRANSPORTE ($) TOTAL
VIAJES

Planta de tratamiento de
agua residual Cali, Toma de muestras de lodo $ 500.000 500. 000
Sector Bochalema

Resultados/Productos esperados y potenciales

beneficiarios
El estudio permitirá el fortalecimiento de la línea de investigación de Microbiología
ambiental, al interior de la Universidad Santiago de Cali, además de la formación
de recurso humano a nivel de pregrado y generación de conocimiento mediante la
realización de un artículo.

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