Resistencia de Microorganismos Aislados de Kombucha A Condiciones Del Tracto Gastrointestinal in Vitro

Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y
Diseño del Estado de Jalisco, A.C.
“Resistencia de microorganismos aislados de kombucha a

condiciones del tracto gastrointestinal in vitro”
TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO ACADÉMICO DE
Maestra en Ciencias en Innovación Biotecnológica con opción

terminal de Tecnología Agroalimentaria
PRESENTA
LCA Mónica Aidee Guzmán Ortiz
Directora: Dra. Claudia Alvarado Osuna

Codirectora: Dra. Anahí Jobeth Borrás Enriquez
Codirector: Dr. Juan Campos Guillen
Asesor: Dr. Manuel Reinhart Kirchmayr
Asesor: Dr. Jorge Luis González Escobar
Zapopan, Jalisco. Enero del 2021

JUNTA DIRECTIVA
Directora de tesis: Doctora Claudia Alvarado Osuna

Co-directora: Doctora Anahí Borrás Enriquez
Co-director: Doctor Juan Campos Guillen
Asesor: Doctor Manuel Reinhart Kirchmayr
Asesor: Doctor Jorge Luis González Escobar
1
FOR-DI-08-43 r.0
Guadalajara, Jalisco a 3 de Dic de 2020
CONSEJO INSTITUCIONAL DE POSGRADO

DEL CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y ASISTENCIA EN TECNOLOGÍA Y DISEÑO
DEL ESTADO DE JALISCO, A.C.
PRESENTE
Los abajo firmantes miembros del comité tutorial del la estudiante Mónica Aidee
Guzmán Ortiz, una vez leída y revisada la Tesis titulada “RESISTENCIA DE
MICROORGANISMOS AISLADOS DE KOMBUCHA A CONDICIONES DEL
TRACTO GASTROINTESTINAL IN VITRO” aceptamos que la referida tesis revisada y
corregida sea presentada por la estudiante para aspirar al grado de Maestra en ciencias en
innovación biotecnológica con opción terminal en Tecnología Alimentaria durante el
examen correspondiente.
Y para que así conste firmamos la presente al día 3 del mes de diciembre del año dos mil
dieciséis.
Dra. Claudia Alvarado Osuna

Directora de tesis
Dra. Anahi Jobeth Borrás Enriquez

Co-directora de tesis
2
FOR-DI-08-43 r.0
Dr. Juan Campos Guillén

Co-director de tesis
Dr. Manuel Reinhart Kirchmayr

Asesor
Dr. Jorge Luis González Escobar

Asesor
3
Guadalajara, Jalisco, a 17 de diciembre de 2020
CP/1571/2020
MÓNICA AIDEE GUZMÁN ORTIZ

ESTUDIANTE DE LA MAESTRÍA EN
CIENCIAS EN INNOVACIÓN BIOTECNOLÓGICA
NÚMERO DE MATRÍCULA 1803MB6425
PRESENTE
Por este medio le informo que el trabajo de tesis “Resistencia de

microorganismos aislados de kombucha a condiciones del tracto
gastrointestinal in vitro” desarrollado bajo la dirección del siguiente
comité tutorial:
Dra. Claudia Alvarado Osuna. Directora de tesis

Dra. Anahí Jobeth Borras Enríquez. Co-directora de tesis
Dr. Juan Campos Guillén Co-director de tesis
Dr. Manuel Reinhart Kirchmayr. Asesor
Dr. Jorge Luis González Escobar. Asesor
ha sido aprobado para su impresión definitiva y defensa correspondiente para

la obtención del grado de Maestra en Ciencias en Innovación Biotecnológica.
Sin otro particular, aprovecho la oportunidad para enviarle un cordial saludo.
ATENTAMENTE
Mtra. Fátima Gabriela Ordóñez de la Cruz

Coordinadora de Posgrados
4
Agradecimientos
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT), institución que me brindó beca de

manutención para llevar a cabo mis estudios de Maestría y la presente tesis.
Al Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco, A.C.

(CIATEJ), en donde se me brindó acceso a la infraestructura indispensable para el presente
trabajo de investigación., así como el contacto con Investigadores de gran calidad humana y
profesional quienes sin duda fortalecieron mi experiencia y aprendizaje.
A Casa Belot Co. empresa que inspiró el tema de investigación aquí plasmado. Gracias por la
confianza y disponibilidad, por proveernos de muestras y compartir su conocimiento tan
abiertamente con nosotras.
Gracias a mi tutora, la Doctora Claudia Alvarado Osuna, quien me guió con paciencia y
compartió conmigo sus conocimientos, tiempo y confianza para que este proyecto se desarrollara
con éxito. Gracias por la inspiración profesional y personal.
Esta tesis es un trabajo de equipo realizado con mi comité tutorial, la Dra. Anahí Borrás y los
Doctores Juan Campos Guillen, Manuel Reinhart Kirchmayr y Jorge Luis González, quienes me
apoyaron durante todo el proceso. Gracias compartir sus saberes, por su accesibilidad y el tiempo
dedicado que me brindaron para alcanzar este logro.
A mi padre, José Roberto Guzmán Burrola y a mi madre, Norma Aide Ortiz Santiesteban, mis
grandes Maestros de vida, ejemplos de perseverancia y honestidad. Gracias por su amor
incondicional. A mis hermanas y hermano, quienes siempre están acompañando mis pasos y que
siempre van en mi corazón.
A Vaianu Bertin, padre de mi hija y amigo, por su acompañamiento en este proceso, por creer
siempre en mí, por su amor, comprensión y paciencia. A Gaia, nuestra hija, quien es mi estrella
polar, mi más grande inspiración y motivación, gracias.
A mis compañeros de maestría, quienes siempre creyeron en mí, que siempre estuvieron haciendo
brillar mi proceso académico y personal. Gracias por el acompañamiento y por hacer de esta una
experiencia preciosa.
A Arturo Moreno, quien con su amor y paciencia me ayudó a ver mi fuerza y a re-descubrir mi
poder. Gracias por tu amor incondicional, por tu paciencia y tu confianza en mí.
5
Dedicatoria
El tiempo y esfuerzo invertidos y reflejados en este trabajo se los dedico a mi hija, Gaia, quien
llena mi corazón de fuerza y amor para poder seguir mis sueños. Porque de todos mis Maestros
y Maestras tú eres la más grande, de todos mis espejos eres el más claro y de todas mis creaciones
eres la más divina. Espero ser fuente inagotable de inspiración como tu lo eres para mí.
Te amo.
6
I. ÍNDICE DE CONTENIDO
1. RESUMEN………………………………………………………………………… 13
2. INTRODUCCIÓN……………..………………..…….….………………………... 15
3. ANTECEDENTES………………...…..………………………………………….. 17
3.1 Alimentos y bebidas funcionales………………………………………………….. 17
3.1.1 Clasificación……………………………….………………….………………... 17
3.2 Probióticos………………………..……………………………………................. 18
3.2.1 Viabilidad de probióticos a condiciones del TGI………………………………. 19
3.2.1.1 Condiciones de la fase bucal………………..………………………………… 20
3.2.1.2 Condiciones de la fase gástrica ………………..……………………………… 20
3.2.1.3 Condiciones de la fase intestinal………………..…………………………….. 21
3.2.1.4 Características que mejoran la supervivencia de probióticos a condiciones del
TGI..……………..……………………………………………………………………. 23
3.2.2 Mecanismos de acción de los probióticos………………………………………. 24
3.3 Kombucha………………………………………………………..……………….. 25
4. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA………………………………………….. 31
5. JUSTIFICACIÓN…………………………………………………..……….……... 32
6. HIPÓTESIS…………………………………………..……………...……………... 33
7. OBJETIVOS………………………………………..……………………..……….. 34
7.1 Objetivo general…………..……………………………………………..……….. 34
7.2 Objetivos específicos…………………………………………………….……….. 34
8. METODOLOGÍA…………….………………………………………..….……….. 35
8.1 Esquema general de la metodología……………………………………...……….. 35
8.2 Materiales………………………………………………………………..……….. 35
8.3 Métodos………………………………………………………………….……….. 37
8.3.1 Muestreo……………………………………………………………….……….. 37
8.3.2 Monitoreo ambiental y caracterización fisicoquímica………………...……….. 37
8.3.3 Análisis microbiológicos……………………………….…..………………….. 37
8.3.3.1 Microbiología sanitaria………………..……………….…………….……….. 37
8.3.3.2 Identificación de microorganismos.……………..………….……….……….. 37
7
8.3.3.3 Dinámica poblacional microbiana…….………………...…………..……….. 39
8.3.4 Propiedades probióticas………………………………………………..……….. 39
8.3.4.1 Resistencia a condiciones del TGI in vitro ………………………….……….. 39
8.3.4.2 Formación de biopelícula en poliestireno…………………………………….. 43
9. RESULTADOS……………………………………………………………………. 44
9.1 Monitoreo ambiental y caracterización fisicoquímica…………………..……….. 44
9.2 Análisis microbiológicos………………………………………………..……….. 46
9.2.1 Microbiología sanitaria...………………………………………………………. 46
9.2.2 Identificación de microorgamismos..………………………………………….. 46
9.2.3 Dinámica poblacional………….……………………………………………….. 47
9.3 Propiedades probióticas………………………………………………….……….. 48
9.3.1 Resistencia de resistencia al TGI in vitro ……………………………..……….. 48
9.3.1.1 Resistencia de levaduras a condiciones del TGI in vitro…………………….. 49
9.3.1.2 Resistencia de bacterias a condiciones del TGI in vitro………………..…….. 52
9.3.2 Capacidad de formación de biopelícula……………………………….………... 55
10. DISCUSIÓN DE RESULTADOS…..…………………………..……..….……… 57
10.1 Monitoreo ambiental y caracterización fisicoquímica…………..……………… 57
10.2 Microbiología sanitaria………….………………………………………….…… 58
10.3 Identificación de microorganismos..………..………………………...………… 59
10.4 Dinámica poblacional microbiana…………………...………………..………… 59
10.5 Resistencia a condiciones del TGI in vitro………………………..…..……….... 61
10.5.1 Resistencia de levaduras a condiciones del TGI in vitro..…………..……….... 61
10.5.2 Resistencia de bacterias a condiciones del TGI in vitro…………..…..………. 64
10.6 Capacidad de formación de biopelícula……………..……………….…………. 66
11. CONCLUSIONES…..…………………………………………………..……..… 69
12. REFERENCIAS………………………………………………………………….. 70
8
II. ÍNDICE DE CUADROS Y FIGURAS
Índice de cuadros
Cuadro 1 Microorganismos mayormente comercializados como probióticos......... 12

Cuadro 2 Concentraciones de electrolitos recomendadas para cada fase del TGI
basadas en datos de humanos in vivo......................................................... 13
Cuadro 3 Microorganismos que se han reportado presentes en kombucha y
aquellos reconocidos como probióticos………………………….…….. 18
Cuadro 4 Composición de los medios de cultivo para aislamiento de
microorganismos de kombucha……………………………………...… 24
Cuadro 5 Interpretaciones de scores obtenidos para la identificación de
microorganismos de kombucha……………………………………...… 26
Cuadro 6 Medios y condiciones de cultivo de microorganismos de kombucha 27
Cuadro 7 Composición de jugos simulados del TGI in vitro.…………………..… 28
Cuadro 8 Composición de las soluciones de electrolitos para la simulación de
jugos del TGI in vitro……………………………………………..……. 29
Cuadro 9 Calidad sanitaria de kombucha comercial…………………………..….. 34
Cuadro 10 Aislamiento e identifiación de microorganismos de kombucha…….…. 35
Cuadro 11 Microorganismos seleccionados para pruebas de resistencia al TGI in
vitro…………………………………………………………………….. 36
Cuadro 12 Porcentaje de supervivencia de levaduras a condiciones del TGI in
vitro………………………………………………………………….…. 38
Cuadro 13 Porcentaje de sobreviencia de bacterias aisladas de kombucha a
condiciones del TGI in vitro………………………………………….… 41
Índice de figuras
Figura 1 Condiciones generales del TGI que pueden afectar la viabilidad de

probióticos….……………………………...…………………………… 13
Figura 2 Proceso de formación de biopelícula……………………………...……. 14
Figura 3 Proceso de elaboración de kombucha a nivel industrial………...……… 17
9
Figura 4 Registros de temperatura y humedad ambientales durante 240 horas de
fermentación….…..…………………………………………………….. 32
Figura 5 Comportamiento en la concentración de ácidos orgánicos y pH durante
240 horas de fermentación………………...…………………………… 33
Figura 6 Comportamiento de la concentración de azucares reductores totales
(ART) y ºBrix durante 240 horas de fermentación……......…………… 33
Figura 7 Dinámica de desarrollo durante 240 horas de fermentación de
kombucha comercial.………………….……………………………….. 36
Figura 8 Comportamiento de la viabilidad de las levaduras durante la
simulación del TGI in vitro ………………...………………………….. 37
Figura 9 Comparación de la viabilidad de levaduras durante la simulación del
TGI in vitro por fase……………………………………………………. 38
Figura 10 Porcentaje de reducción de viabilidad de levaduras a condiciones del
TGI in vitro por fase de simulación…………………………………….. 39
Figura 11 Comportamiento de la viabilidad de las bacterias durante la simulación
del TGI in vitro…………………...…………………………………….. 40
Figura 12 Comparación de la viabilidad de bacterias durante la simulación del
TGI in vitro por fase……………………………………………………. 41
Figura 13 Porcentaje de reducción de viabilidad de bacterias a condiciones del
TGI in vitro por fase de simulación…………………………………….. 41
Figura 14 Formación de biopelícula por levaduras en microplaca de poliestireno.. 43
Figura 15 Formación de biopelícula por BAL en microplaca de poliestireno…….. 44
Figura 16 Formación de biopelícula por S. hominis en microplaca de poliestireno. 44
10
III. ABREVIATURAS Y SÍMBOLOS
Abreviatura/símbolo Significado
ADN Ácido desoxirribonucléico
APD Agar papa dextrosa
ART Azucares reductores totales
AT Acidez titulable
BAA Bacterias ácido acéticas
BAL Bacterias ácido lácticas
BIF Agar Bifidobacterium
BSH Bile Salts Hydrolase
Ci Cuenta inicial
Cf Cuenta final
Cfb Cuenta fase bucal
Cfg Cuenta fase gástrica
Cfi Cuenta fase intestinal
CV Cristal violeta
D.O. Densidad óptica
D.O.c. Cut off de densidad óptica
EPS Exopolisacáridos
g Gramos
GYCA Glucose yeast and chalk agar
h Horas
HO Hanseniaspora opuntiae
HCl Ácido clorhídrico
L Litros
LF Lachancea fermentati
LM Leuconostoc mesenteroides
M Molar
MALDI-TOF Matrix assisted laser desorption/ionization- Time of
flight
mg Miligramos
mL Mililitros
MRS Agar Man Rogosa and Sharpe
pH Potencial de hidrógeno
PIAB Propionibacterium agar
PM Pichia manshurica
s. fan Sobrevivencia de la fase anterior
11
SC Saccharomyces cerevisiae
SCOBY Symbiotic consortium of bacteria and yeast.
SH Staphylococcus hominis
SII Síndrome de intestino irritable
TGI Tracto gastrointestinal
U Actividad enzimática
UFC Unidades formadoras de colonia
WV Weisella viridiscens
µL Microlitro
µm Micrometro
ºC Grados centígrados
ºBrix Grados Brix
12
1. RESUMEN
La kombucha es una bebida que ha ganado gran popularidad en los últimos años y que
actualmente se comercializa con diversas marcas en México. Esta bebida es producida mediante
la fermentación de una infusión azucarada de té (Camellia sinensis), la cual es inoculada con un
consorcio simbiótico de bacterias y levaduras, denominado SCOBY (por sus siglas en inglés), el
cual transfiere microorganismos potencialmente probióticos a la bebida. Los probióticos son
microorganismos vivos que al ser ingeridos en cantidades apropiadas confieren al huésped
efectos saludables. Las condiciones del tracto gastrointestinal (TGI) pueden afectar la viabilidad
de estos microorganismos, impidiendo que una cantidad adecuada llegue vivo al colon para
ejercer los mecanismos del efecto benéfico. Por lo anterior, el objetivo de la presente tesis fue
determinar la capacidad de resistencia a las condiciones del TGI de los microorganismos aislados
en la kombucha producida a nivel industrial mediante una simulación continua in vitro, así como
su habilidad de producir biopelícula.
Las características fisicoquímicas de la kombucha se monitorearon durante 240 horas (h) de

fermentación. Al final de las 240 h de fermentación, la acidez titulable (AT) incrementó de 0.6
g/L a 1.9 g/L; el pH disminuyó de 4.1 a 3.0; la concentración de azucares reductores totales
(ART) decrementó de 8.82 g/100 mL a 4.22 g/100 mL; finalmente los ºBrix disminuyeron de 12
a 5 ºBrix.
Para conocer la calidad sanitaria de la kombucha al final de la fermentación se determinaron las

concentraciones de mohos y levaduras, coliformes totales, fecales, Escherichia coli y Salmonella
spp. La kombucha comercial estudiada tuvo una buena calidad sanitaria al presentar valores
menores al límite de detección en grupos indicadores de contaminación fecal y ausencia de los
patógenos analizados.
Se realizaron aislamiento y recuento de microorganismos de kombucha mediante sembrado en 6

diferentes agares. Se identificaron mediante espectrometría de masas MALDI-TOF las levaduras
Saccharomyces cerevisiae (SC), Hanseniaspora opuntiae (HO), Lachancea fermentati (LF),
Pichia manshurica (PM), Debaryomyces hansenii, Cryptococcus flavescens así como las
bacterias Leuconostoc mesenteroides (LM), Weisella viridiscens (WV), Gluconobacter
13
oxydans, Staphylococcus hominis (SH) y Staphylococcus epidermis. A las 240 h de fermentación
las levaduras alcanzaron una concentración de 7 log (UFC/mL); las bacterias ácido-lácticas
(BAL) de 6.69 log (UFC/mL) y las bacterias ácido-acéticas (BAA) de 6.02 log (UFC/mL).
Quince cepas fueron analizadas para conocer su capacidad de resistencia a las condiciones del
TGI in vitro mediante la simulación de boca, estómago y colon. Las levaduras tuvieron un
porcentaje de sobrevivencia entre 86.96 % y 95.61 %, siendo SC1, LF2 y HO2 las más
resistentes; las bacterias fueron menos resistentes que las levaduras con porcentajes de
sobrevivencia de 67.24 % a 88.26 %, siendo LM2 y LM3 las más resistentes. Con los datos
obtenidos calculamos que una botella de 355 mL de la kombucha estudiada contiene
aproximadamente 5.94x109 UFC de levaduras y 1.48x109 UFC de BAL capaces de llegar vivos
al colon.
La capacidad de formar biopelícula puede darnos información sobre la capacidad de los

microorganismos de colonizar y permanecer en el colon. Esta capacidad se analizó mediante un
ensayo en microplaca de poliestireno por el método de tinción con cristal violeta al 0.1%. Las
levaduras tuvieron mayor capacidad para formar biopelícula que las bacterias. Las levaduras
PM1, SC3, HO1 y HO2 fueron fuertes productoras de biopelícula, SC2, LF2 y LF3 fueron
moderadas productoras de biopelícula y SC1 fue debil productora. Todas las BAL estudiadas
fueron débiles productoras de biopelícula, al igual que dos cepas de SH.
El presente trabajo de investigación demuestra que la kombucha en estudio contiene

microorganismos en cantidad apropiada para hacer el uso correcto de la declaración de propiedad
“contiene probióticos”. Además, la concentración de microorganismos aislados de kombucha
que son capaces de sobrevivir a las condiciones del TGI in vitro soporta un potencial probiótico.
14
2. INTRODUCCIÓN
La kombucha es una bebida fermentada tradicional de China que ha ganado una gran popularidad
en los últimos años debido a sus beneficios para la salud. En 2019, el valor de su mercado fue de
1,670 millones de dólares y se estima que para el 2027 alcanzará un valor de 7,050,000 millones
de dólares con un tasa de crecimiento anual de 19.7% (GVR, 2020). El proceso de elaboración
del té de kombucha se basa en la inoculación de un consorcio simbiótico de bacterias y levaduras
(SCOBY) contenido dentro de una matriz de exopolisacáridos microbianos. La inoculación del
SCOBY provoca la fermentación de una infusión de té (Camellia sinensis) azucarada
generalmente con sacarosa, y transferirá algunos de los microorganismos inmersos en él a la
bebida. Entre los microorganismos comunmente encontrados son levaduras de los géneros
Saccharomyces, Dekkra, Lachancea y Hanseniaspora, y bacterias de los géneros Gluconobacter,
Acetobacter, Oenococcus, Bifidobacterium, Lactobacillus, Leuconostoc y Propionibacterium
(Coton et al., 2017; Liu et al., 1996; Marsh et al., 2013). Algunas especies de Lactobacillus,
Leuconostoc y Saccharomyces aislados de fuentes diferentes a la kombucha han sido
ampliamente estudiadas por sus propiedades probióticas (Castro et al., 2019; Gómez et al., 2016;
Kumura et al., 2004; Lee & Kim, 2019; Nayak, 2011). Los probióticos son microorganismos
vivos que, cuando se proporcionan en cantidades adecuadas confieren un beneficio para la salud
del huésped (FAO & OMS, 2006). Estos microorganismos benéficos pueden estar contenidos en
alimentos y bebidas. En bebidas comerciales se requiere una concentración de 1x106 a 1x109
UFC/porción de cepas probióticas para hacer un uso correcto a la declaración de propiedad
"contiene probióticos". Esta concentración es requerida debido a que la viabilidad de los
microorganismos puede verse afectada durante su paso por el tracto gastrointestinal (TGI), en
donde se enfrentan a ambientes hostiles como cambios drásticos de pH, presencia de enzimas y
sales biliares.
La capacidad de producir biopelícula es una propiedad deseable en un probiótico, debido a que

se ha comprobado esta característica podría mejorar la sobrevivencia del microorganismo a las
condiciones del TGI. Además, se ha demostrado que la biopelícula producida por algunos
probióticos poseen propiedades inmunomoludadoras y la habilidad de inhibir el crecimiento de
patógenos (Aoudia, 2016). Es por ello, que el objetivo de este estudio fue determinar la capacidad
15
de resistencia a las condiciones del TGI de los microorganismos aislados en la kombucha
producida a nivel industrial mediante una simulación continua in vitro, así como su habilidad de
producir biopelícula.
16
3. ANTECEDENTES
3.1 Alimentos y bebidas funcionales

Un alimento funcional es aquel que, al ser consumido en una cantidad habitual referente a una
dieta, brinda un efecto benéfico relevante a la salud y/o riesgo de enfermedad. La funcionalidad
de un alimento se pude lograr mediante la adición, remoción o modificación de uno o más de sus
componentes y puede aplicar a todos los miembros de una población o a poblaciones específicas
(FUFOSE et al., 2018). La primera evidencia escrita del uso de alimentos y bebidas funcionales
se remonta al 1000 a.C. en China. En la literatura de la dinastía Han se refería comúnmente a los
“alimentos medicina” (100 a.C.) y más recientemente, cerca del 1000 d.C. la dinastía Song los
menciona como “alimentos especiales” (Tur & Bibiloni, 2016). Sin tener un concepto definido,
el ser humano era consciente de los beneficios a la salud que brindaban algunos alimentos y
bebidas fermentadas. Ejemplos de bebidas fermentadas con potencial probiótico son el tepache
y pulque en México; el fermento de soja en Indonesia, el Kvas de Rusia, el kimchi coreano, el
nato en Japón y el chucrut, la pasta miso y la kombucha en China. En los años ochenta, Japón se
vuelve pionero en investigación y desarrollo de alimentos funcionales al fundar 86 programas
bajo los temas “Systematic analysis and development of food functions”, “Analysis of
physiological regulation function of food” y “Analysis of functional foods and molecular
design”. Actualmente, el término japonés que incluye los diferentes tipos de alimentos que
coadyuvan al bienestar humano es FOSHU: Food for Specified Health Use. Lo alimentos
FOSHU deben tener un sólido respaldo sobre su efectividad y seguridad; no debe contener en
exceso ingredientes que afecten negativamente a la salud, como sal o azúcar (FUFOSE et al.,
2018).
3.1.1 Clasificación
Los alimentos funcionales pueden ser clasificados bajo varios criterios y un alimento puede
cumplir uno o más de uno de estos. Los alimentos y bebidas funcionales pueden clasificarse de
la siguiente manera:
a) Tipo de alimento (lácteos, bebidas y cereales)

b) Tipo de enfermedad que se espere prevenga o cure (diabetes, cáncer y colitis)
17
c) Su efecto fisiológico (actividad antioxidante, digestibilidad y actividad anti-tumor)
d) La categoría del compuesto bioactivo:
- Compuestos orgánicos (vitaminas, antioxidantes, lípidos y prebióticos)
- Compuestos inorgánicos (minerales)
- Microorganismos (probióticos)
e) Proceso de producción (fermentado, encapsulado y congelado)
3.2 Probióticos
En el siglo XX, Eli Metchnikoff notó que en las regiones de Bulgaria se consumían leches
fermentadas más de lo habitual y relacionó este hecho con el incremento de la longevidad. Los
trabajos de Metchnikoff fueron premiados con el Nobel de fisiología o medicina en 1908. Por su
lado, Henry Tissier en 1906 observó que en la microbiota en heces de niños sanos se encontraban
abundantes microorganismos, que hoy conocemos como bifidobacterias, mientras en niños
enfermos estas eran escasas. Los conocimientos generados por ambos científicos, así como los
de Fuller, Guarner y Schaafsma fueron fundamentales para la construcción del concepto de
probióticos. La palabra probiótico fue acuñada en 1960 y significa “a favor de la vida” y hace
referencia a “microorganismos vivos que, cuando se consumen en cantidades apropiadas,
confieren al huésped efectos saludables” (FAO & OMS, 2006). De este concepto se pueden
enfatizar tres características fundamentales: la viabilidad de los microorganismos, su cantidad de
consumo y el beneficio que proveen al huésped. En México no existe normatividad que regule
parámetros específicos para la producción y comercialización de probióticos, ni en
presentaciones farmacéuticas ni en alimentos y bebidas. Por otro lado, existe mucha información
científica nacional e internacional, así como regulatoria internacional que da pautas para dirigir
el presente trabajo. En el cuadro 1 se muestran algunas de las cepas que actualmente son más
comercializadas como probióticas.
18
Cuadro 1. Microorganismos mayormente comercializados como probióticos
Grupo de
Género y especie
microorganismo
Bifidobacterias B. adolescentis, B. animalis, B. animalis subsp. Lactis (Bb12), B. bifidum,
B. breve, B. longum subsp. infantis, B. longum subsp. Longum (BB536).
Lactobacilos Lactobacillus acidophilus (La5), L. casei (Shirota), L. ‘caucasicus’ = L.
kefiri, L. crispatus, L. delbrueckii subsp. delbrueckii L. delbrueckii subsp.
bulgaricus, L. delbrueckii subsp. lactis, L. helveticus, L. fermentum
(KLD), L. gallinarum, L. gasseri, L. johnsoni (La1), L. leichmanii = del-
brueckii subsp. lactis, L. paracasei (F19), L. plantarum (299v), L. reuteri
(SD2112), L. rhamnosus (GG), L. sakei, L. salivarius (UCC118), L.
sporogenes = Bacillus coagulans).
Otras bacterias Enterococcus faecalis, E. faecium (SF68), Lactococcus lactis,
ácido lácticas Leuconostoc. mesenteroides, Pediococcus acidilactici, P. pentosaceus,
Streptococcus salivarius, S. macedonicus, S. mitis, S. sanguis, S
thermophilu.
Bacilos Bacillus cereus (toyoi), B. clausii, B. coagulans, B. licheniformis, B.
mesentericus, B. subtillis.
Otras bacterias Clostridium butyricum, Escherichia coli (Nissle1917),
Propionibacterium freudenreichii.
Levaduras Saccharomyces cerevisiae subsp. cerevisiae, Saccharomyces cerevisiae
subsp. Boulardii.
(Foligné, Daniel & Pot, 2013; Ouwehand, Salminen & Isolauri, 2002).
3.2.1 Viabilidad de probióticos y condiciones del TGI

Una de las principales características que debe tener un probiótico es la de ser capaz de sobrevivir
a las condiciones del TGI hasta su llegada al órgano que está destinado. Existen probióticos
destinados a la salud bucal, por lo que estos solo tendrán que ser capaces de vivir a las condiciones
ahí encontradas. En el caso de alimentos y bebidas, se pretende que el beneficio se dé en
estómago o colon, por lo que los probióticos deben ser capaces de sobrevivir a las condiciones
de estos compartimentos y de permanecer el tiempo suficiente para ejercer el/los mecanismo(s)
19
de acción. En la figura 1 se resumen las condiciones generales del TGI y en el cuadro 2 se
especifica la composición de sales en los jugos digestivos.
3.2.1.1 Condiciones de la fase bucal

La digestión de los alimentos comienza en la boca con un proceso mecánico llamado masticación
el cual ocurre simultáneamente a la digestión química (acción de enzimas) (Minekus et al., 2014).
La masticación permitela trituración de los alimentos aumentando la superficie de contacto con
la saliva y potenciando la digestión química. Las glándulas salivales secretan saliva compuesta
por un 99.5% de agua, electrolitos, mucus y amilasa salival, enzima que degrada parcialmente el
almidón y se deglute junto con el bolo (Mataix, 2005). La amilasa salival tiene un pH óptimo de
actividad de 6.8, por lo que ésta es inhibida durante la etapa temprana de digestión en el estómago
en donde el pH se encuentra entre 2 y 3. El tiempo ideal de masticación es de 5 minutos pero
normalmente es de 2 minutos para alimentos sólidos, siendo para bebidas el tiempo de
permanencia en boca insignificante (Minekus et al., 2014). La mezcla resultante de la digestión
bucal es el bolo.
3.2.1.2 Condiciones de la fase gástrica

En el estómago el bolo y todos sus componentes, incluidos los microorganismos, se enfrentan a
un medio ácido (pH de 2-3) provocado por la secreción de ácido clorhídrico.
La acidez del estómago es la primer defensa contra microorganismos patógenos provenientes de
alimentos (Waterman, 1998). Por su lado, algunos microorganismos son capaces de llevar a cabo
mecanismos que les permiten sobrevivir a la acidez del estómago. Un ejemplo es el patógeno
Helicobacter pylori, causante de la gastritis, que es capaz de producir ureasa para degradar la
urea a amonio y dióxido de carbono neutralizando los ácidos. Este mecanismo de sobrevivencia
puede ser contrarrestado por algunas bacterias acido-lácticas probióticas capaces de producir
suficiente ácido láctico potenciando la acidificación del medio e inhibiendo la actividad de la
ureasa, así como la proliferación de H. pylori (Komatsu et al., 2016). El pH del estómago permite
que el pepsinógeno se active convirtiéndose en pepsina, enzima que lleva a cabo la degradación
de las proteínas (Mataix, 2005). La concentración de pepsina en el estómago durante la ingesta
de alimentos es de 0.5 – 1.0 mg/mL, concentración que puede afectar algunas proteínas de la
membrana celular y por ende la viabilidad de los microorganismos (Zhu et al., 2006). En un
20
estado de salud, los líquidos permanecen en el estómago entre 0.5 a 1 hora dependiendo de su
composición. La mezcla resultante de la digestón gástica es el quimo.
3.2.1.3 Condiciones de la fase intestinal

Luego del ambiente ácido del estómago, las proteínas y carbohidratos han sido parcialmente
digeridos. En el intestino delgado una serie de contracciones musculares mezclan el quimo con
las secreciones intestinales en donde es neutralizado por la acción de carbonato, cambiando el
pH a 6.5 – 7.5 (Mataix, 2005; Minekus et al., 2014). Los ácidos biliares son moléculas anfipáticas
derivadas del colesterol y producidas en el hígado, de donde son secretadas en sus formas
conjugadas (unidos a un aminoácido) hacia la vesícula biliar para su almacenamiento. Desde la
vesícula biliar, son secretados al interior del intestino delgado para realizar la digestión de lípidos
y ayudar en la absorción de los productos de digestión. La bilis emulsiona la grasa para facilitar
su digestión y tiene una fuerte actividad antimicrobiana, ya que provoca la desintegración de la
membrana lipídica y causa daño en el ADN. Algunos microorganismos probióticos (p. ej.
Lactobacillus, Bifidobacterium, Becteroides), así como patógenos y oportunistas (p. ej. Listeria
monocytogenes, Enerococcus faecalis y Zanthomonas maltophilia) son capaces de hidrolizar
sales biliares mediante la producción de la enzima BSH (por sus siglas en inglés: Bile Salts
Hydrolase) aumentando su capacidad de sobrevivencia en el intestino (Pavlovic et al., 2012). El
jugo pancreático, compuesto por una mezcla de enzimas, terminan la digestión de proteínas,
lípidos y almidón (Mataix, 2005).
21
Fase bucal
Temperatura: 37 ºC
pH: ~ 6.8±0.2
Enzima: Amilasa salival
Mezcla de electrolitos
(Cuadro 2)
Fase intestinal
Temperatura: 37 ºC
Fase gástrica pH: ~ 7±0.2
Temperatura: 37 ºC Enzima: Pancreatina
pH: ~ 2±1 Sales biliares
Enzima: Pepsina Mezcla de electrolitos
Mezcla de electrolitos (Cuadro 2)
(Cuadro 2)
Figura 1. Condiciones generales del TGI que pueden afectar la viabilidad de probióticos.
Cuadro 2. Concentraciones de electrolitos recomendadas para cada fase del TGI basadas en
datos de humanos in vivo
Fase bucal Fase gástrica Fase intestinal
Componente
(mmol/L) (mmol/L) (mmol/L)
K+ 18.8 7.8 7.6
Na+ 13.6 72.2 123.4
Cl- 19.5 70.2 55.5
H2PO4- 3.7 0.9 0.8
HCO3-, CO32- 13.7 25.5 85
Mg2+ 0.15 0.1 0.33
NH4+ 0.12 1.0 -
Ca2+ 1.5 0.15 0.6
Modificado de Minekus et al., 2014
22
3.2.1.4 Características que mejoran la supervivencia de probióticos a condiciones del TGI
Con el objetivo de protegerse de condiciones adversas y distribuir nutrientes y oxígeno, algunos
microorganismos tienen la capacidad de formar biopelículas, “comunidades estructuradas de
células bacterianas inmersas en una matriz polimérica auto-producida y adherida a una superficie
inherte o viva” (Costerton & Greenberg, 1999; Martínez et al., 2018). Esta matriz polimérica está
compuesta principalmente por exopolisacáridos (EPS) (Donlan, 2002). Los EPS forman una red
tridimensional que permite la distribución de nutrientes, oxígeno y agua a microorganismos que
se encuentran organizados y separados por canales o vacíos intersticiales (Lewandowski et al.,
1995). El proceso de formación de biopelícula se lleva a cabo en las siguientes 5 etapas:
1- Adherencia inicial
2- Adherencia irreversible (formación de EPS)
3- Formación de micro-colonias
4- Maduración
5- Dispersión
Figura 2. Proceso de formación de biopelícula (tomado de Monroe, 2007).
23
Estudios han sugerido que la capacidad fenotípica para producir biopelícula puede ser una
característica a tener en cuenta al momento de seleccionar probióticos (Aoudia et al., 2016)
debido a que puede estimular la colonización y aumentar la permanencia de las bacterias
benéficas en la mucosa del hospedero (Terraf et al., 2012). Además, Yahav et al. (2018)
demostraron que la biopelícula de exopolisacáridos formada por Bacillis subtilis puede protejer
a probióticos durante su paso por el TGI mejorando su sobrevivencia hasta llegar al colon.
En la etapa temprana de formación de biopelícula se lleva a cabo la adherencia, proceso que está
involucrado en la adhesión de los microorganismos a las células epiteliales y que involucra
mecanismos no específicos y específicos. Las fuerzas físicas de atracción y repulsión
(interacciones electrostáticas y de van der Waals) son mecanismos no específicos que impactan
directamente en la hidrofobicidad de la superficie celular y con ello en la capacidad de adhesión.
(Kos et al., 2003). La capacidad de adhesión de los probióticos se ha relacionado con su
mecanismo de acción contra patógenos por inhibición competitiva de los receptores o
impedimento estérico (Tuomola, Ouwehand, & Salminen, 1999).
3.2.2 Mecanismos de acción de probióticos

La Asociación Mexicana de Gastroenterología, en concordancia con la ISAPP (International
Scientific Association for Probiotics and Prebiotics), menciona que para que un alimento o
bebida pueda hacer uso adecuado de la declaración de propiedad “contiene probióticos”, su
contenido de cepas bacterianas reconocidas como probióticos debe ser de al menos 1x106-9 UFC
por porción (Valdovinos et al., 2017). Los mecanismos mediante los cuales los probióticos
ejercen un efecto benéfico a la salud del hospedero son diversos. Entre los más destacados se
encuentran la producción de sustancias que impiden el crecimiento de microorganismos no
deseados o patógenos y la modulación del sistema inmunitario (FAO & OMS, 2006). Además,
se ha relacionado la capacidad de adhesión de los probióticos a las células epiteliales con su
mecanismo de acción contra patógenos por inhibición competitiva de los receptores o
impedimento estérico (Tuomola et al., 1999). Se recomienda el uso de probióticos (cepas
específicas) en población adulta para reducir significativamente diarrea asociada a antibióticos y
aguda infecciosa; como tratamiento contra H. pilori; para evitar el estreñimiento crónico; en la
reducción de síntomas provocados por SII (distensión, dolor abdominal y flatulencia); como
24
tratamiento contra intolerancia a la lactosa; en el mantenimiento de la remisión de la pouchitis
después del tratamiento con antibióticos; prevención de infección por Clostridium dificile;
prevención de enterocolitis necrosante en niños prematuros; se sugiere su uso en pacientes con
esteatohepatitis y esteatohepatitis no alcohólica para mejorar la inflamación hepática y resistencia
a la insulina; su uso en el tratamiento de encefalopatía hepática oculta y manifiesta, entre otros
(Valdovinos et al., 2017). Los mecanismos de acción son específicos para cada cepa y deben ser
comprobados.
3.3 Kombucha
La kombucha es una bebida probiótica elaborada mediante la fermentación de la infusión
azucarada de té Camellia sinensis. La fermentación es iniciada por inoculación de una biopelícula
que contiene un consorcio simbiótico de bacterias y levaduras llamado “SCOBY”: Symbiotic
Consortium Of Bacteria and Yeast. Su aprovechamiento como bebida curativa se remonta hacia
el año 221 a.C, en China en donde era apreciada por la dinastía Qin, posteriormente, en el año
414 d.C., el Doctor Kombu lleva la bebida a Japón. Conforme se fueron abriendo las rutas
comerciales, la kombucha llega a Rusia y durante el siglo XX es introducida a Alemania, Francia,
norte de África e Italia. Es en Italia que alcanza una gran popularidad en consumo
aproximadamente en el año 1950 (Jayabalan et al., 2014). En Estados Unidos se comienza a
producir de forma casera y en 1995 se funda la primera empresa familiar de kombucha bajo la
marca GT, que distribuye kombucha en tiendas locales de productos saludables. En 2019 el valor
de mercado global de kombucha fue de 1,670 millones de dólares y se espera aumente a 7,050
millones de dólares para el 2027 con una tasa de crecimiento anual de 19.7% (GVR, 2020). En
México, se ha observado un surgimiento importante de empresas dedicadas a la producción de
esta bebida. Hasta ahora se han identificado 13 marcas de kombucha y en Guadalajara cerca de
70 puntos de venta.
El proceso de producción de kombucha (Figura 3) inicia con la elaboración de una infusión de té

negro y/o verde. La fermentación de la infusión azucarada da inicio con la inoculación del
SCOBY y de un inóculo líquido. El inóculo líquido es una reserva, porción de un lote anterior de
kombucha terminada, sin saborización y conservada en refrigeración. Los microorganismos
adicionados con las inoculaciones comienzan a metabolizar los sustratos del té endulzado, dando
25
lugar a fermentaciones de tipo alcohólica, láctica y acética. Se ha visto que el consumo de la
fuente de carbono incrementa linealmente durante la fermentación de la kombucha y de forma
paralela se forman celulosa, ácido acético y etanol (Kallel et al., 2012). Las levaduras llevan a
cabo la hidrólisis de la sacarosa en glucosa y fructosa mediante la enzima invertasa.
Posteriormente, ambos monosacáridos pueden ser utilizados como sustratos en la glucólisis
produciendo piruvato, el cual durante la fermentación alcohólica es convertido a acetaldehído y
luego a etanol por la enzima alcohol deshidrogenasa. Este proceso libera moléculas de CO2 que
se acumulan en el medio dando lugar a una bebida carbonatada. Otra parte de estos
monosacáridos es utilizada para la producción de ácidos orgánicos y la biosnítesis de celulosa.
La producción de ácidos disminuye el pH del medio permitiendo que las bacterias acido-
tolerantes se vuelven más abundantes. Las bacterias ácido acéticas (BAA) con capaces de
transformar fructosa y etanol en ácido acético mediante la oxidación del etanol durante la
fermentación acética en presencia de O2. Algunos estudios han reportado la presencia de
bacterias ácido-lácticas (BAL), las cuales pueden producir ácido láctico a partir del piruvato por
medio de una lactato deshidrogenasa (Bergström, 2018; Chen y Liu, 2000; Kallel et al., 2012).
26
Agua
Filtración
2 micras
Lámpara UV
Calentamiento
98 °C
Azúcar Vapor de agua
Mezclado manual
Solubilización
Té negro
Té verde
Lixiviación
98 °C/ 5 minutos
Bagazo de
Kombucha hojas
líquida Inoculación
7 días/ 25 °C
SCOBY
Fermetación aerobia
7 días/ 25 °C
SCOBY
Fermentación anaerobia
3 días/ 25 °C
Saborizantes
Saborización
naturales
CO2 Carbonatación
Embotellado
Figura 3. Proceso de elaboración de kombucha a nivel industrial.
27
Diversos estudios basados tanto en cultivos microbianos como en técnicas moleculares se han
realizado para identificar la microbiota de la kombucha. La mayoría de estos estudios se han
hecho en kombucha producida en laboratorio y se encontró solo un estudio que analizó la
microbiota de kombucha de producción a nivel industrial (Coton et al., 2017). En el cuadro 3 se
enlistan los microorganismos comúnmente encontrados en la bebida y además se presenta la
información sobre la capacidad probiótica de estas cepas de bacterias y levaduras aisladas de
otras fuentes.
Cuadro 3. Microorganismos que se han reportado presentes en kombucha y aquellos reconocidos

como probióticos.
Microorganismo Presencia en Capacidad probiótica reportada
kombucha
Lactobacillus Marsh et al., 2014 Sí, asilada de granos de kefir (Xing et al.,
kefiranofaciens sp. 2017)
Lactobacillus nagelii Coton et al., 2017 No reportado
Lactobacillus Coton et al., 2017 No reportado
satsumensis
Leuconostoc Marsh et al., 2014 L. mesenteroides aislados de de
aguamiel, pulque y kimchi (Castro et
al., 2019; Giles et al., 2016; Lee y Kim,
2019)
Leutococcus Marsh et al., 2014 No reportado
Bifidobacterium Marsh et al., 2014 Sí. Aislados de heces de infantes, nieve
y cepa comercial. B. bifidum, B. lactis
comercial (Chenoll et al., 2011; Hekmat
& McMahon, 1992; Invernici et al.,
2018)
Propionibacterium Marsh et al., 2014 Sí. Cepas comerciales, leche bronca y
quesos (Chaia, Zárate, & Oliver, 1999;
Huang & Adams, 2004)
Oneococcus oeni Coton et al., 2017 No reportado
28
Acetobacter sp. Hesseltine 1965; No reportado
Sievers et al., 1995
Acetobacter aceti Sievers et al., 1995 No reportado
Acetobacter intermedius, Boesch et al., 1998 No reportado
sp. nov
Acetobacter lovaniensis Coton et al., 2017 No reportado
Acetobacter Dutta & Gachhui, 2006 No reportado
nitrogenifigens
Acetobacter okinawensis Coton et al., 2017 No reportado
Acetobacter pasteurianus Liu et al., 1996; Sievers No reportado
et al., 1995
Acetobacter peroxydans Coton et al., 2017 No reportado
Acetobacter syzgil Coton et al., 2017 No reportado
Acetobacter tropicallis Coton et al., 2017 No reportado
Gluconoacetobacter Coton et al., 2017 No reportado
europaeus
hansenii
liquefaciens
rhaeticus
saccharivorans
Gluconobacter cerinus Coton et al., 2017 No reportado
liquefaciens
Gluconobacter oxydans Coton et al., 2017 No reportado
Komagataeibacter Marsh et al., 2014; No reportado
xylinus Sievers et al., 1995
29
Tantichaeroenia Coton et al., 2017 No reportado
sakaeratensis
Allobaculum Marsh et al., 2014 No reportado
Candida boidinii Coton et al., 2017 No reportado
Dekkera bruxellensis Marsh et al., 2014 No reportado
Kluyveromyces Marsh et al., 2014 No reportado
marxianus
Lachancea fermentati Marsh et al., 2014; No reportado
Chakravorty et al.,
2016
Pichia Marsh et al., 2014 No reportado
Saccharimycodes Sinisa et al., 2001 No reportado
ludwiggi
Saccharomyces Liu et al., 1996; Sinisa Sí. Aisladas de fruta, queso azuly cepas
cerevisiae et al., 2001 comerciales (Fakruddin et al., 2017;
Kumura et al., 2004; van der Aa Kühle
et al., 2005)
Saccharomyces bisporus Sinisa et al., 2001 No reportado
Saccharomyces uvarum Coton et al., 2017 No reportado
Torulopsis sp Sinisa et al., 2001 No reportado
Wallemia sebi Marsh et al., 2014 No reportado
Hanseniaspora Marsh et al., 2014 No reportado
Para determinar si un microorganismo es capaz de sobrevivir a estas condiciones, se han llevado

a cabo estudios con métodos in vitro, continuos y discontinuos. En microorganismos aislados de
kombucha se han realizados experimentos de resistencia a pH ácido y presencia de sales biliares
con modelos discontinuos (Bogdan et al., 2018; Puspawati & Arihanatana, 2016). Sin embargo,
debido a que en condiciones fisiológicas el sistema digestivo es continuo, se considera que estos
experimentos tienen limitaciones metodológicas y los resultados pueden ser dificilmete
extrapolados a la realidad.
30
4. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
En México existe un constante surgimiento de nuevas empresas, generalmente artesanales,

dedicadas a la elaboración y comercialización de kombucha a nivel local. Una de las estrategias
mercadotécnicas que ha impulsado el crecimiento de la industria de la kombucha es su
comercialización como bebida fermentada, no pasteurizada (viva) y probiótica. Sin embargo, los
estudios científicos hasta ahora realizados sobre el potencial probiótico responden a las
características de kombucha producida en laboratorio, haciendo que los resultados sean
dificilmente extrapolables a la realidad de producción a mayor escala. En este contexto, es claro
que crear y fortalecer vínculos entre la industria local de kombucha en desarrollo y la comunidad
científica es fundamental. De esta forma se facilitará la realización de estudios científicos que
verifiquen dicha propiedad en la marca de kombucha que se pretende posicionar como probiótica.
Esto, además de respaldar las estrategias de mercadotecnia, brindará información clara y
verdadera al consumidor y aumentará su confianza en la marca.
31
5. JUSTIFICACIÓN
La presencia de probióticos es una de las características que proporciona mayor valor agregado
a la kombucha comercial. El contenido de microorganismos vivos en una bebida fermentada no
garantiza el contenido de probióticos ni su efecto positivo a la salud de quien lo consume. La
funcionalidad probiótica de la kombucha se define por la cantidad de microorganismos
contenidos en ella que son capaces de llegar vivos al colon y que pueden ejercer los mecanismos
necesarios para proveer un efecto positivo a la salud del hospedero. Para que los
microorganismos lleguen vivos al colon, estos deben ser capaces de sobrevivir las condiciones
fisiológicas de la boca, el estómago y el intestino, es decir, al TGI. En el TGI, todo alimento,
bebida y sus componentes -inlcuidos los microorganismos- se enfrentan con amplios rangos de
pH (acidez y alcalinidad), presencia de enzimas y de sales biliares. En esto radica la importancia
de realizar pruebas científicas que permitan generar información sobre la capacidad de
sobrevivencia al TGI de microorganismos de kombucha.
32
6. HIPÓTESIS
La bebida de kombucha comercial contiene microorganismos capaces de sobrevivir a las

condiciones del TGI simuladas in vitro y de producir biopelícula.
33
7. OBJETIVOS
7.1 Objetivo general

Determinar la capacidad de resistencia a las condiciones del TGI de los microorganismos aislados
en la kombucha producida a nivel industrial mediante una simulación continua in vitro, así como
su habilidad de producir biopelícula.
7.2 Objetivos específicos.

1. Monitorear las características fisicoquímicas y condiciones ambientales durante la
fermentación de kombucha.
2. Analizar la dinámica de poblaciones microbianas de kombucha durante su fermentación.
3. Conocer la calidad sanitaria de la kombucha comercial en estudio.
4. Aislar e identificar microorganismos de kombucha con potencial capacidad probiótica.
5. Estudiar la capacidad de resistencia de aislados de kombucha seleccionados a condiciones
simuladas continuas del TGI in vitro.
6. Evaluar la capacidad de formar biopelícula de una selección de microorganismos aislados
de kombucha.
34
8. METODOLOGÍA
8.1 Esquema general de la metodología
Caracterización de kombucha durante

fermentación
Estudiar la dinámica poblacional durante 240 horas de fermentación
Aislamiento e identificación de microorganismos
Determinación de resistencia a Evaluación de capacidad para

TGI in vitro formar biopelícula
8.2 Materiales
El té de kombucha se obtuvo de una empresa local en Guadalajara, Jalisco, México. Para el
cultivo de microorganismos se utilizaron los siguientes medios de cultivos, Agar Papa Dextrosa
(APD) de la marca DIFCO; Man Rogosa and Sharpe (MRS) de Sigma-Aldrich. Tres de los agares
utilizados se elaboraron en el laboratorio: Glucose Yeast Chalk Agar (GYCA); Bifidobacterium
Agar (BIF) y Propionibacterium Agar (PIAB). Los reactivos utilizados para los medios
formulados fueron, para GYCA: agar bacteriológico (MCD LAB), peptona de caseína
(SOLBIOSA), extracto de levadura (Sigma-Aldrich), glucosa (Sigma-Aldrich), carbonato de
calcio (Fermont), etanol al 95%; BIF: agar base Columbia, glucosa (Sigma-Aldrich), lactulosa,
riboflavina (Sigma-Aldrich), HCl cisteina (Sigma-Aldrich), ácido propiónico y; PIAB: agar
bacteriológico, extracto de levadura, peptona de caseína (SOLBIOSA), lactato de sodio (Sigma-
Aldrich), fosfato dipotásico (Jalmek), sulfato de magnesio (Jalmek). MRS, GYCA, BIF y PIAB
fueron adicionados con natamicina (ZHEJIANG). La composición de los medios de aislamiento
se muestra en el cuadro 4. Las soluciones de electrolitos se prepararon con KCl (Fermont),
KH2PO4 (Fermont), NaHCO3 (Fermont), NaCl (Fermont), MgCl2(H2O)6 (Sigma-Aldrich) y
(NH4)2CO3 (Fermont). Las enzimas utilizadas fueron Amylase Licuamil® 1200 (ENMEX),
35
pepsina porcina 1:10,000 (Hycel) y pancreatina (Sigma-Aldrich). Las sales biliares se compraron
en Sigma-Aldrich.
Cuadro 4. Composición de medios de cultivo para aislamiento de microorganismos de

kombucha
Componente MRS APD GYCA BIF PIAB
pH a 25 °C (± 0.2) 6.5 5.6 6.8 5.5 7.0
Base agar Columbia (g/L) 42.5
Agar (g/L) 12 15 20 20
Almidón papa (g/L) 4
Peptona universal (g/L) 10 3
Extracto de carne (g/L) 5
Extracto de levadura (g/L) 5 5 10
Caseina enzimática (g/L) 10
D(+) Glucosa (g/L) 20 20 30 2.5
Lactulosa (g/L) 2.5
Riboflavina (g/L) 0.01
HCl-Cisteína (g/L) 0.5
Lactato de sodio (g/L)* 10
Fosfato dipotásico (g/L) 2 0.25
Citrato de amonio (g/L) 2
Acetato de sodio (g/L) 5
Sulfato de magnesio (g/L) 0.1 0.05
Sulfato de manganeso (g/L) 0.05
Carbonato de calcio (g/L) 10
Tween 80 (mL/L) 1
Etanol 95% (mL/L) 30
Ácido propiónico (mL/L) 5
Natamicina (g/L) 0.2 0.2 0.2 0.2
*Después de esterilizar. MRS: Agar Man Rogosa and Sharpe; APD: Agar papa dextrosa; GYCA:
Glucose Yeast and Chalk Agar; BIF: Agar Bifidobacterium; PIAB: Agar Propionibacterium.
36
8.3 Métodos
8.3.1 Muestreo
Las muestras fueron proporcionadas por la empresa BCC, la cual comercializa kombucha
embotellada en vidrio desde hace 6 años con inóculo original. Cuenta con marmitas de acero
inoxidable y un sistema de producción semi-cerrado. Las muestras se tomaron antes de llegar a
la etapa de saborización de forma estéril para evitar la interferencia de otras materias primas en
el experimento.
8.3.2 Monitoreo ambiental y caracterización fisicoquímica

Durante un ciclo completo de siete días de fermentación aerobia (0-168 horas) y tres días de
fermentación anaerobia (169-240 horas) se registraron temperatura y humedad con un
termohigrómetro digital (Acurite®). Los sólidos solubles y pH fueron medidos a las 0, 72, 168 y
240 h con un refractómetro Aramox y potenciómetro Hanna, respectivamente. A las 0, 168 y 240
horas de fermentación se determinó la acidez titulable (AT) por el método volumétrico con
hidróxido de sodio y fenoftaleína como indicador (A.O.A.C. 942.15). Los resultados se
expresaron como g/100 mL de ácidos orgánicos. También se determinaron los azúcares
reductores totales (ART) mediante el método Lane y Eynon descrito en la Norma Oficial
Mexicana (NOM-086-SSA1-1994) y los resultados se expresaron como g/100 mL en peso.
8.3.3 Análisis microbiológicos

8.3.3.1 Microbiología sanitaria
Se llevaron a cabo análisis para el conteo de hongos y levaduras según lo descrito en la NOM-
111-SSA1-1994. También se determinaron coliformes totales, coliformes fecales y la presencia
o ausencia de Escherichia coli y Salmonella spp se determinaron mediante el método descrito en
la NOM-210-SSA1-2014.
8.3.3.2 Identificación de microorganismos

Se sometieron a identificación de 3 a 5 de cada una de las diferentes morfologías de colonia
observadas en los cultivos en petri. La identificación de microorganismos se realizó mediante
espectrometría de masas con desorción/ionización asistida por matriz con analizador de tiempo
de vuelo (MALDI-TOF: Matrix- Assisted Laser Desorption/Ionization with Time Of Flight) en
37
un equipo Microflex LT/SH MALDI-TOF MS (Bruker Daltonics) con el softwre MALDI-
BIOTYPER RTC por el método de transferencia directa extendida (eDT) con lisis celular parcial
por ácido fórmico. El protocolo para la identificación se describe a continuación:
1. Se aislaron microorganismos de kombucha mediante la siembra de diluciones seriadas por

extensión en placa en los cinco medios sólidos anteriormente mencionados (cuadro 3) a
temperatura, tiempo y atmósfera específicas (cuadro 5). Las colonias seleccionadas por
morfología de colonia y celular se pasaron de medio al menos cuatro veces para conseguir
colonias axénicas. La pureza fue verificada mediante tinción Gram.
2. Biomasa de colonias axénicas de cultivos de 24 horas se pasaron por duplicado en una placa
MALDI TARGET de 96 spots de acero pulido.
3. Inmediatamente después se cubrieron con 1 µL de ácido fórmico al 70% y se dejó secar a
temperatura ambiente.
4. Se cubrieron los spots con 1 µL de 10mg/mL de HCCA (ácido α-ciano-4-hidroxicinamico)
mezclado en una solución estándar (acetonitrilo 50%, agua 47.5% y ácido trifluoroacético
2.5%). Se dejó secar a temperatura ambiente.
5. En el equipo, la biomasa se sometió a 240 disparos, lo que generó espectros de masas que
fueron analizados con el software Biotyper 3.1 y comparados con la base de datos BDAL
(Bruker Daltonics).
La confiabilidad de la interpretación se valoró según la puntuación obtenido como se muestra en

el cuadro 5
Cuadro 5. Interpretación de scores obtenidos para la identificación de microorganismos de

kombucha
Puntuación Interpretación
2.300-3.000 Identificación a nivel de especie altamente probable
2.000- 2.299 Identificación de género segura
1.700-1.999 Identificación de género probable
0.000-1.699 Identificación no confiable
38
Para la conservación de las cepas aisladas se mezcló el caldo con crecimiento de 18 horas con
glicerol al 50% y se almacenaron a -80 °C.
8.3.3.3 Dinámica poblacional microbiana

Las muestras se tomaron en condiciones asépticas a las 0, 72, 168 y 240 horas de fermentación.
Se realizaron siete diluciones seriadas de las muestras de kombucha en agua peptonada (0.1%
peptona + 0.85% NaCl). Para el conteo de las unidades formadoras de colonia por mL de
kombucha se llevó a cabo el método Miles Misra mediante el sembrado de gotas calibradas (10
µl) de las diluciones seriadas. Las gotas que presentaron crecimiento de entre 20 y 100 colonias
fueron seleccionadas para su conteo y expresión de resultados. La inoculación se llevó a cabo en
cinco medios de cultivo sólidos: MRS, APD, GYCA BIF y PIAB (Cuadro 6) por tiempo,
temperatura y atmósferas específicas (Cuadro 2) los resultados fueron expresados como unidades
formadoras de colonia por mililitro (UFC/mL) de kombucha.
Cuadro 6. Medios y condiciones de cultivo de microorganismos de kombucha

Condiciones de incubación
Microorganismo Medio de cultivo
(°C /tiempo/tipo de atmósfera)
Bacterias ácido lácticas MRS + natamicina 37 / 48-72 h / anaerobia
Levaduras APD 25 / 48 h / aerobia
Bacterias ácido acéticas GYCA + natamicina 30 / 72 h / aerobia
Propionibacterium PIAB + natamicina 30 / 11-14 días / anaerobia
Bifidobacterias BIF + natamicina 35- 37 / 72 h / anaerobia
MRS: Agar Man Rogosa and Sharpe; APD: Agar Papa Dextrosa; GYCA: Glucose Yeast and
Chalk Agar; BIF: Agar Bifidobacterium; PIAB: Agar Propionibacterium.
8.3.4 Propiedades probióticas

8.3.4.1 Resistencia a condiciones del TGI in vitro.
El proceso de selección de las cepas se basó en la evidencia bibliográfica científica que muestren
un posible potencial probiótico de las cepas aisladas. Se realizó un método continuo y estático
para la simulación de las condiciones gastrointestinales (fases oral, gástrica e intestinal), según
lo propuesto por Minekus et al., 2014 con algunas modificaciones. Las cepas seleccionadas de
bacterias y levaduras fueron reactivadas durante un 18 horas en medios líquidos MRS y papa
39
dextrosa, respectivamente. Los jugos salivales, gástricos e intestinales fueron preparados
mediante una mezcla de electrolitos, enzimas, agua y, en el caso del jugo intestinal, sales biliares
(Cuadro 7). Para el ajuste de pH se utilizaron soluciones de HCl 1M y NaOH 1M. Un stock
concentrado de electrolitos se preparó con cloruro de potasio (KCl), fosfato monopotásico
(KH2PO4), bicarbonato de sodio (NaHCO3), cloruro de sodio (NaCl), cloruro de magnesio
hexahidratado (MgCl2(H2O)6) carbonato de amonio ((NH4)2CO3) (Cuadro 8). Todas las
soluciones de enzimas se prepararon en agua destilada estéril. Las soluciones de enzimas se
prepararon a las siguientes actividades enzimáticas: amilasa para la fase oral a 75 U/mL; pepsina
para la fase gástrica a 2000 U/mL y de pancreatina para la fase intestinal a 100 U/mL. A la
mezcla final de jugo intestinal se le agregó un 0.3% de sales biliares. Una solución de cloruro de
calcio (CaCl2) a 0.3 M se adicionó a la mezcla de todos los jugos simulados con el inóculo al
final para evitar su precipitación. Todos los experimentos se realizaron en un ambiente estéril,
los materiales y soluciones se esterilizaron en autoclave a excepción de las soluciones de enzimas
que se esterilizaron por filtración (0.04 µm). Todos los experimentos fueron realizados por
duplicado.
Cuadro 7. Composición de jugos simulados de TGI in vitro

Fase oral pH Fase gástrica Fase intestinal
Componente
7.0 (%) pH 3.0 (%) pH 7.0 (%)
Medio líquido con cepa 50 50 50
Solución de electrolitos 35 37.5 27.5
Agua destilada/ HCl 1M ó NaOH 1M 9.75 4.25 2.75
Solución de CaCl2 0.3M 0.25 0.25 1
Solución de amilasa (1500U/mL del
5 - -
volumen final)
Solución de pepsina (250U/mL del
- 8 -
volumen final)
Solución de pancreatina (0.1% del
- - 12.5
volumen final)
Solución de sales biliares (0.3% del
- - 6.25
volumen final)
40
Cuadro 8. Composición de soluciones de electrolitos para la simulación de jugos del TGI
Stock Electrolitos Electrolitos Electrolitos
Componente concentrado para JSS para JGS para JIS
g/L mL/L del stock concentrado
KCl 37.3 30.2 13.8 13.6
KH2PO4 68 7.4 1.8 1.6
NaHCO3 84 13.6 25 85
NaCl 117 - 23.6 19.2
MgCl2(H2O)6 30.5 1 0.8 2.2
(NH4)2CO3 48 0.12 1 -
JSS: Jugo salival simulado; JGS: Jugo gástrico simulado; JIS: Jugo intestinal simulado.
Fase oral
Previo a llevar a cabo el experimento de la fase oral, la solución de electrolitos y el medio líquido
con crecimiento de 18 h se precalentaron a 37 °C en baño María. El JSS y el caldo con cada cepa
se mezclaron en un radio de 50:50 (cuadro 7) y cuando fue necesario el pH se ajustó a 7.0. La
simulación de fase oral se incubó en aerobiosis a 37°C durante 5 minutos. La mezcla luego de la
incubación se denominó bolo.
Fase gástrica
Una alícuota de bolo fue inmediatamente mezclada con el JGS precalentado a 37 °C en una
proporción 50:50. El pH se ajustó a 3.0 con HCl 1M (cuadro 7). La mezcla fue incubada durante
2 horas en anaerobiosis a 37 °C. La mezcla luego de la incubación se denominó quimo.
Fase intestinal
Una alícuota de quimo fue mezclada inmediatamente con el JIS precalentado a 37 °C en una
proporción de 50:50 y se ajustó el pH a 7.0 con NaOH 1M (cuadro 7). La mezcla fue incubada
durante 2 horas en anaerobiosis a 37 °C. La toma de muestras para el análisis de resistencia a
condiciones simuladas del TGI se tomaron en cuatro momentos: 1) Recuento inicial: En la mezcla
de fase oral antes de la incubación; 2) después de la incubación de fase oral; 3) después de la
41
incubación de fase gástrica; 4) después de la incubación de fase intestinal. De cada muestra se
sembraron diluciones seriadas por el método de Miles Misra en MRS y APS para bacterias láctica
y levaduras, respectivamente. Los resultados fueron expresados en log UFC/mL. Las fórmulas
utilizadas para la presentación de resultados fueron las siguientes:
Cf
% sobrevivencia = ∗ 100
Ci
En donde:
Cf= Cuenta final (log UFC/mL)
Ci= Cuenta inicial (log UFC/mL)
Cfb − Ci
% reducción Cuenta inicial a fase bucal = ∗ 100
Cfb
En donde:
Cfb= Cuenta fase bucal (log UFC/mL)
Ci= Cuenta inicial (log UFC/mL)
Cfg − Cfb
% reducción fase bucal a fase gástrica = ∗ %s. fan
Cfg
En donde:
Cfg= Cuenta fase gástrica (log UFC/mL)
Cfb= Cuenta fase bucal (log UFC/mL)
% s. fan= % de sobrevivencia de la fase anterior
Cfi − Cfg
% reducción fase gástrica a fase intestinal = ∗ %s. fan
Cfi
En donde:
Cfi= Cuenta fase intestinal (log UFC/mL)
Cfg= Cuenta fase gástrica (log UFC/mL)
% s. fan= % de sobrevivencia de la fase anterior
42
8.3.4.2 Formación de biopelícula en poliestireno
La capacidad para formar biopelícula se determinó mediante el método cristal violeta (CV) en
microplacas de poliestireno según lo propuesto por Ren y cols. (2013) con algunas
modificaciones. De 100 a 600 µL del caldo con un crecimiento de 18 h de los aislados se ajustaron
a densidad óptica (D.O.) de 0.15 a 600 nm (D.O.600) por dilución con medio de cultivo líquido.
En cada pocillo de las microplacas se agregaron un total de 160 µL del medio ajustado y medio
líquido estéril como control. Las placas se sellaron y se dejaron incubar en agitación a 200 rpm
durante 24 horas a 30 ºC. Posteriormente, se realizó un lavado con tampón de fosfato salino (pH
7.2) tres veces para eliminar el medio y las células libres. Se llevó a cabo una tinción con solución
acuosa de 0.1% de cristal violeta y se dejó reposar 20 minutos para después enjuagar tres veces
más en la solución de tampón fosfato salino. Finalmente, se dejó reposar durante 30 minutos con
etanol al 96%. La biopelícula disuelta en etanol se pasó a una nueva microplaca para evitar la
intervención del tinte que puediera haber sido absorbido por las paredes del poliestireno. La
absorbancia se midió a 590 nm en un lector de microplaca BIO RAD xMarkTM (Microplate
Spectrophotometer). La capacidad de formar biopelícula de los aislados seleccionadas se
clasificó, según Stepanovic et al., (2000), en las categorias “No formadora de biopelícula”, “débil
formadora de biopelícula”, “moderadamente formadora de biopelícula” o “fuerte formadora de
biopelícula”. Para las clasificaciones, el cut off de la densidad óptica obtenida (D.O.c.) se define
como tres desviaciones estándar sobre el promedio de la D.O. del control negativo (caldo MRS
sin inocular). Los aislados se clasificaron de la siguiente manera: D.O. ≤ D.O.c = no formadora
de biopelícula; D.O.c. < D.O < (2*D.O.c). = débil formadora de biopelícula; 2*D.O.c. < D.O. ≤
(4*D.O.c) = moderada formadora de biopelícula; (4*D.O.c) < D.O. = fuerte formadora de
biopelícula.
43
9. RESULTADOS
9.1 Monitoreo ambiental y caracterización fisicoquímica

Los registros de la temperatura ambiental durante 240 horas de fermentación se muestran en la
figura 4. La temperatura ambiental a la cual se llevó a cabo el proceso de fermentación osciló
entre 21 ºC y 30 ºC con un promedio de 24 ºC. La humedad se mantuvo entre 69% y 74% con un
promedio de 72%
31 74
29 73
Temperatura (ºC)
Humedad (%)
27 72
25 71
23 70
21 69
0 24 48 72 96 168 192 216 240
Tiempo (horas)
Temperatura Humedad
Figura 4. Registros de temperatura y humedad ambientales durante 240 horas de fermentación.
En la figura 5 se grafican los resultados de acidez titulable y pH y en la figura 6 los ART y °Brix,
ambos durante 240 horas de fermentación de kombucha.
La acidez titulable (AT) incrementó un total de 1.3 unidades durante las 240 h de fermentación.
Posterior a la adición de un inóculo líquido (kombucha fermentada de un lote anterior) la acidez
titulable fue de 0.6 g/L. A las 168 h alcanzó los 1.9 g/L, valor que se mantuvo hasta las 240 h
(final de la fermentación). El pH descendió un total de 1.1 unidades durante las 240 h de
fermentación. La infusión de mezcla del tés tuvo un pH de 6 (valor no graficado) y descendió a
4.1con el inóculo líquido. Este valor descendió a 3.5 a las 72 h y a 3.3 a las 168 h. El pH al final
de la fermentación fue de 3.0.
44
2.00 4.50
4.00
1.50
Acidez titulable (g/L)
3.50
pH
1.00
3.00
0.50 2.50
0 72 168 240
Tiempo de fermentación (horas)
Acidez titulable pH
Figura 5. Comportamiento en la concentración de ácidos orgánicos y pH durante 240 horas de

fermentación
En la figura 6 se muestran los resultados del contenido de azucares reductores totales y °Brix
durantre las 240 h de fermentación para la elaboración de kombucha a nivel industrial. Los
azúcares reductores totales decrementaron 4.6 unidades durante 240 horas de fermentación.
Inicialmente alcanzaron un valor de de 8.82 g/100 mL, a las 168 h fue de 7.73 g/100 mL y de
4.22 g/100 mL al final de la fermentación. Los °Brix disminuyeron un total de 7 unidades durante
las 240 horas de fermentación. Los ºBrix luego de la adición de la sacarosa fue de 12 y disminuyó
a 9 °Brix a las 72 h. A las 160 h el fermento alcanzó los 6 °Brix y al final de la fermentación a
un valor de 5 °Brix.
9 12
11
8
10
ART (g/100mL)
7 9
ºBrix
6 8
7
5
6
4 5
0 72 168 240
Tiempo de fermentación (h)
Azúcares reductores totales ° Brix
Figura 6. Comportamiento en la concentración de azucares reductores totales (ART) y °Brix

durante 240 horas de fermentación
45
9.2 Análisis microbiológicos
9.2.1 Microbiología sanitaria
Los resultados de calidad sanitaria de kombucha fueron contrastados con los límites para bebidas
saborizadas no alcohólicas y con los de quesos madurados a falta de normativa que regule una
bebida fermentada similar en México. El recuento de mohos como grupo indicador de prácticas
higiénicas se encontró cercano a lo permitido (Cuadro 9). Por otra parte, las levaduras se
observaron elevadas. Los indicadores de materia fecal, incluida la bacteria Escherichia coli,
fueron inferiores al límite de detección del método. Salmonella spp. estuvo ausente en 25 mL de
la bebida. Con base a los resultados se puede concluir que la kombucha presenta una buena
calidad sanitaria.
Cuadro 9. Calidad sanitaria en kombucha comercial

Bebidas Quesos frescos,
Determinación Resultado saborizadas no madurados y quesos de
alcohólicas* sueros**
Mohos (UFC/mL) 530 50

500
Levaduras (UFC/mL) 11 000 000 n.a.
Coliformes totales
< 0,3 10 <100
(NMP/mL)
Coliformes fecales
< 0,3 n.a n.a.
(NMP/mL)
Escherichia coli
< 0,3 n.a 100***
(NMP/mL)
Ausente en 25
Salmonella spp. Ausente en 25 mL Ausente en 25 mL
mL
* NOM-218-SSA1-2011; **NOM-243-SSA1-2010; ***para quesos frescos. n.a: no aplica.
9.2.2 Identificación de microorganismos

Se obtuvieron un total de 96 aislados en 3 medios de cultivo diferentes. Se identificó el % de los
aislados que pertenecen a 11 especies. Se encontraron en APD cinco géneros de levaduras de la
familia Saccharomycetaceae (Saccharomyces cerevisiae, Hanseniaspora opuntiae, Lachancea
46
fermentati, Pichia manshuria y Debaryomyces hansenii) y uno de la familia Tremellaceae
(Cryptococcus flavescens). En el medio de aislamiento GYCA se encontró la presencia de
Gluconobacter oxydans y Staphylococcus hominis y Staphylococcus epidermis. Leuconostoc
mesenteroides y Weissella viridiscens se aislaron del medio MRS. No se identificó la presencia
de propionibacterias ni bifidobacterias los medios PIAB y BIF, respectivamente, durante el
tiempo y condiciones de incubación determinados (cuadro 6).
Cuadro 10. Aislamiento e identificación de microorganismos de kombucha

Género y especie Número de aislados
Saccharomyces cerevisiae 12
Hanseniaspora opuntiae 11
Levaduras
Lachancea fermentati 12
Pichia manshurica 1
Debaryomyces hansenii 2
Cryptococcus flavescens 2
Leuconostoc mesenteroides 15
Weisella viridiscens 1
Bacterias
Gluconobacter oxydans 7
Staphylocccus hominis 11
Staphylococcus epidermis 1
9.2.3 Dinámica poblacional microbiana

Los microorganismos de interés identificados se agruparon en tres: Levaduras, bacterias ácido
lácticas (BAL) y bacterias ácido acéticas (BAA). En el caso del medio GYCA en el que tuvimos,
además del crecimiento de BAA, S. hominis y S. epidermis, se diferenciaron por morfología de
colonia comprobada por morfología celular y se contaron únicamente las correspondientes a las
BAA. En la figura 9 se muestra la dinámica poblacional de estos tres grupos de microorganismos
durante un periodo completo de fermentación de kombucha (240 horas). La tendencia general
fue de aumento en todas las poblaciones hasta el final de las 240 horas de fermentación. Las
concentraciones iniciales fueron de 5.35 log de levaduras, 4.03 log de BAL y 3.30 log de BAA.
Durante las 240 h de fermentación, las levaduras tuvieron un incremento total de 1.65 log, las
47
BAL de 2.66 log y las BAA de 2.72. Las concentraciones finales fueron de 7.00 log de levaduras,
6.69 log de BAL y 6.02 de BAA.
6
log (UFC/mL)
3
0 96 168 240
Tiempo (horas)
Levaduras BAL BAA
Figura 7. Dinámica de desarrollo microbiano durante 240 horas de fermentación de kombucha
comercial. BAL: Bacterias ácido lácticas; BAA: Bacterias ácido acéticas. A pie del eje de las
abscisas, líneas horizontales: fermentación anaerobia; líneas verticales: fermentación aerobia.
9.3 Propiedades probióticas

9.3.1 Resistencia a condiciones del TGI in vitro
En el cuadro 11 se presentan los diferentes géneros y especies de 9 levaduras y 6 bacterias
seleccionados para el análisis de resistencia a condiciones del TGI in vitro; así como los códigos
de identificación utilizados en este estudio para cada uno de los microorganismos seleccionados.
Cuadro 11. Microorganismos seleccionados para pruebas de resistencia al TGI in vitro.

Género y especie Código de ID
Pichia manshurica PM1
Levaduras
Saccharomyces cerevisiae SC1, SC2, SC3

Lachancea fermentati LF1, LF2, LF3
Hanseniaspora opuntiae HO1, HO2
Leuconostoc mesenteroides LM1, LM2, LM3
Bacterias
Weissella viridiscens WV1

Staphylococcus hominis SH1, SH2
48
9.3.1.1 Resistencia de levaduras a condiciones del TGI in vitro
Se realizó una simulación del tracto gastrointestinal in vitro de forma continua, es decir, un
volumen determinado fue recuperado de la fase bucal para exponerla a la fase gástrica y
finalmente a la fase intestinal. La figura 8 resume el comportamiento de la viabilidad de las
levaduras durante la simulación del TGI en log UFC/mL. De un total de 9 levaduras, 3 mostraron
una disminución significativa en su viabilidad entre la cuenta inicial y la fase bucal; 8 entre la
fase bucal y la fase gástrica y 4 entre la fase gástrica y la intestinal. De forma general se observó
una tendencia de reducción en la viabilidad de las levaduras al ser expuestas a la simulación del
TGI. La viabilidad de PM1, SC1, SC2, LF2, HO1 y HO2 se mantuvo igual entre la cuenta inicial
y la fase bucal, mientras en la de SC3, LF1 y LF3 se observó una diferencia. La fase gástrica
mostró un efecto reductor significativo para todas las levaduras, con excepción LF1 que se
mantuvo igual que en la fase bucal. La fase intestinal tuvo un efecto de reducción en la viabilidad
de PM1, SC3, LF1 y HO1, mientras SC1, SC2, LF2, LF3 Y HO2 se mantuvieron constantes.
8.00 aa ab abb ab aab

Viabilidad (log UFC/mL)
bb a abb cd c a abb cc c a abb

aab
c
6.00
4.00
2.00
0.00
PM1 SC1 SC2 SC3 LF1 LF2 LF3 HO1 HO2
Levadura
Cuenta inicial Fase Bucal Fase Gástrica Fase Intestinal
Figura 8. Comportamiento de la viabilidad de las levaduras durante la simulación del TGI in
vitro. Los resultados se muestran como el promedio de los log UFC/mL de 6 réplicas. Las
diferencias significativas se establecieron con un nivel de significancia P> 0.05 aplicando
ANOVA con la prueba de Duncan. Dentro del mismo aislado, barras con la misma letra son
estadísticamente iguales. PM: Pichia manshurica; SC: Saccharomyces cerevisiae; LF:
Lachancea fermentati; HO: Hanseniaspora opuntiae.
En la figura 9 se puede observar el resultado de la viabilidad de las levaduras en cada fase de la

simulación. Todas las levaduras tuvieron una cuenta inicial mayor a 6 log UFC/mL. PM1 tuvo
una concentración inicial de 6.30 log UFC/mL; SC2, LF2 y HO2 con concentraciones iniciales
de 6.71 a 6.82 log UFC/mL; el tercer grupo son SC3, HO1, LF3, SC1 Y LF1 con concentraciones
49
iniciales de 7.08 a 7.29 log UFC/mL. En todas las fases PM1 fue la de menor viabilidad al final
del experimento. En la fase bucal HO1 y SC1 tuvieron la mayor viabilidad mientras LF1 fue la
levadura de mayor viabilidad en las fases gástrica e intestinal.
8.00 cc cd cd cd de
bbbccc bc b e d e d c cd d b d cd d e
ab b de
e
a cc
a a
6.00
4.00
2.00
0.00
Fases gastrointestinales in vitro

PM1 SC2 LF2 HO2 SC3 HO1 LF3 SC1 LF1
Figura 9. Comparación de la viabilidad de levaduras durante la simulación del TGI in vitro por
fase. Los resultados de la viabilidad se muestran como el promedio de los log UFC/mL de 6
réplicas. Las diferencias significativas se establecieron con un nivel de significancia P> 0.05
aplicando ANOVA con la prueba de Duncan. Barras con la misma letra son estadísticamente
iguales entre diferentes levaduras en la misma fase. PM: Pichia manshurica; SC: Saccharomyces
cerevisiae; LF: Lachancea fermentati; HO: Hanseniaspora opuntiae.
En el cuadro 12 se muestra el porcentaje de sobrevivencia de cada una de las levaduras, así como
la concentración en log UFC/mL al final de la simulación. Las levaduras tuvieron un rango de
sobrevivencia de 86.96% a 95.61% y concentraciones finales entre 5.70 y 6.65 log UFC/mL.
Cuadro 12. Porcentaje de sobrevivencia de levaduras a condiciones del TGI in vitro.
ID Género y especie Porcentaje de Concentración final

sobrevivencia (%) (log UFC/mL)
PM1 Pichia Manshurica 90.39 5.70±0.12a
SC3 Saccharmonyces cerevisiae 86.96 6.16±0.05b
LF2 Lachancea fermentati 95.00 6.44±0.07c
50
SC2 Saccharmonyces cerevisiae 95.61 6.44±0.02c
HO1 Hanseniaspora opuntiae 91.11 6.49±0.07cd
HO2 Hanseniaspora opuntiae 95.16 6.51±0.04cd
LF3 Lachancea fermentati 92.21 6.57±0.03de
SC1 Saccharomyces cerevisiae 90.67 6.59±0.06de
LF1 Lachancea fermentati 90.61 6.65±0.01e
Los resultados de la concentración final son el promedio de 6 réplicas ± desviación estándar. Las
ANOVA con la prueba de Duncan. Resultados con diferente letra son estadísticamente
diferentes.
En la figura 10 se muestra el porcentaje de reducción de viabilidad de las levaduras durante el

experimento. La viabilidad de las levaduras SC3 y LF1 fue afectada en su mayoría durante la
fase oral con un 5.27 % y 5.20 % de reducción. De un total de 9 levaduras evaluadas, 6 tuvieron
un mayor porcentaje de reducción de viabilidad en la fase gástrica con un rango de 2.62 % y
6.62%. PM1 tuvo una ligera diferencia en la reducción de viabilidad en la fase intestinal (4.89
%) en comparación con su reducción en la fase gástrica (4.66 %).
Reducción de viabilidad
12
9
(%)
6
3
0
PM1 SC1 SC2 SC3 LF1 LF2 LF3 HO1 HO2
Levadura
Figura 10. Porcentaje de reducción de viabilidad de levaduras a condiciones del TGI in vitro por
fase de simulación. PM: Pichia manshurica; SC: Saccharomyces cerevisiae; LF: Lachancea
fermentati; HO: Hanseniaspora opuntiae.
51
9.3.1.2 Resistencia de bacterias a condiciones del TGI in vitro.
En la figura 11 se muestran los resultados de la viabilidad en log UFC/mL de todos los aislados
de bacterias por fase de simulación. La viabilidad de todos los aislados de Leuconostoc
mesenteroides y Weissella viridiscens se mantuvo estable entre la cuenta inicial y la fase bucal,
a diferencia de los dos aislados de SH que tuvieron diferencias significativas en la viabilidad de
estas dos fases. Todas las bacterias, excepto LM3, tuvieron un efecto de reducción en su
viabilidad significativo al exponerlas a la fase gástrica. Ambos aislados de Staphyloccocus
hominis fueron las bacterias más afectadas disminuyendo hasta una viabilidad de 0 en la fase
gástrica. La simulación de la fase intestinal marcó una diferencia significativa en la viabilidad de
todas las bacterias lácticas (LM1, LM2, LM3 y WV). Todas las bacterias lácticas (BAL) tuvieron
diferencias en sus viabilidades entre las fases gástrica e intestinal. LM3 tuvo una diferencia
significativa exclusivamente en la fase intestinal.
10.00 a a a a b a a b a a b
c
8.00 b c c a a b
b
c
6.00
4.00
2.00
c c c c
0.00
LM1 LM2 LM3 WV1 SH1 SH2
Bacteria
Figura 11. Comportamiento de la viabilidad de las bacterias durante la simulación del TGI in
vitro. Los resultados se muestran como el promedio de los log UFC/mL de 6 réplicas. Las
ANOVA con la prueba de Duncan. Dentro del mismo aislado, barras con diferente letra son
estadísticamente iguales. LM: Leuconostoc mesenteroides; WV: Weissella viridiscens; SH:
Staphylococcus hominis.
En la figura 12 se puede observar el resultado de la viabilidad de las bacterias en cada fase de la

simulación. Las cuentas iniciales de las bacterias en este experimento oscilaron entre 7.15 a 9.08
log UFC/mL. LM2 fue la bacteria de mayor viabilidad en todas las fases. SH1 y SH2 fueron las
52
bacterias de menor concentración en la cuenta inicial y en la fase bucal. La viabilidad e SH1 y
SH2 fue de 0 desde la fase gástrica.
10.00 c c
bc bc bc b b d
b c c d
8.00 a ab b c c
a a b
6.00
4.00
2.00
a a a a
0.00
Cuenta inicial Fase bucal Fase Gástrica Fase intestinal
Fases gastrointestinales in vitro
SH1 SH2 LM3 WV1 LM1 LM2
Figura 12. Comparación de la viabilidad de bacterias durante la simulación del TGI in vitro por
fase. Los resultados de la viabilidad se muestran como el promedio de los log UFC/mL de 6
réplicas. Las diferencias significativas se establecieron con un nivel de significancia P> 0.05
aplicando ANOVA con la prueba de Duncan. Barras con la misma letra son estadísticamente
iguales entre diferentes bacterias en la misma fase. SH: Staphylococcus hominis; LM:
Leuconostoc mesenteroides; WV: Weissella viridiscens.
En el cuadro 13 se presentan los porcentajes de sobrevivencia de cada una de las bacterias, así
como la concentración en log UFC/mL al final del experimento. Al final de la simulación todas
las BAL tuvieron sobrevivieron entre 67.24% y 88.26% y concentraciones finales entre 5.9 a
8.02 log UFC/mL.
Cuadro 13. Porcentaje de sobrevivencia de bacterias aisladas de kombucha a condiciones del

TGI in vitro.
ID Género y especie Porcentaje de Concentración final
sobrevivencia (%) (log UFC/mL)
SH1 Staphylococcus hominis 0 0a
SH2 Staphylococcus hominis 0 0a
WV1 Weissella viridiscens 67.24 5.90b
53
LM1 Leuconostoc 77.99 6.61c
mesenteroides
LM3 Leuconostoc 84.70 7.26d

mesenteroides
LM2 Leuconostoc 88.26 8.02e

mesenteroides
Los resultados de la concentración final son el promedio de 6 réplicas ± desviación estándar. Las
diferencias significativas se establecieron con un nivel de significancia p> 0.05 aplicando
ANOVA con la prueba de Duncan. Resultados con diferente letra son estadísticamente
diferentes.
En la figura 13 se presenta el porcentaje de reducción de las bacterias estudiadas por fase. De un

total de 6 bacterias analizadas, 3 tuvieron una mayor reducción en la fase gástrica y 3 en la fase
intestinal. La fase oral fue la menos agresiva para todas las bacterias (figura 13).
100
Reducción de viabilidad (%)
80
60
40
20
0
LM1 LM2 LM3 WV SH1 SH2
Bacteria
Figura 13. Porcentaje de reducción de viabilidad de bacterias a condiciones del TGI in vitro por
fase de simulación. LM: Leuconostoc mesenteroides; WV: Weissella viridiscens; SH:
Staphylococcus hominis.
54
9.3.2 Capacidad de formación de biopelícula
En la figura 14 se muestran la capacidad de levaduras aisladas de kombucha para formar
biopelícula en placa de poliestireno. Según su capacidad para producto biopelícula, 4 levaduras
se clasifican como fuertes productoras; 2 como moderadas y 1 como es débil productora. SC1 no
produjo biopelícula en poliestireno.
Figura 14. Formación de biopelícula por levaduras en microplaca de poliestireno. Los resultados
son el promedio de las absorbancias de 5 réplicas. Las diferencias significativas se establecieron
mediante ANOVA con un nivel de significancia de p> 0.05 con la prueba de Duncan. Barras con
la misma letra son estadísticamente iguales. PM: Pichia manshurica; SC: Saccharomyces
cerevisiae; LF: Lachancea fermentati; HO: Hanseniaspora opuntiae.
En la figura 15 se muestran los resultados de la capacidad productora de biopelícula de las BAL

y en la figura 16 de los aislados de S. hominis. Todas las BAL aquí estudiadas se clasifican como
moderadas productoras de biopelícula, mientras las S. hominis fueron débiles productoras.
55
0.400
Absorbancia 590 nm
0.300
b
0.200 ab ab
a
0.100
0.000
WV1 LM3 LM2 LM1
BAL
No productora Débil productora
Moderada productora Fuerte productora
Figura 15. Formación de biopelícula por BAL en microplaca de poliestireno. Los resultados son
el promedio de las absorbancias de 5 réplicas. Las diferencias significativas se establecieron
mediante ANOVA con un nivel de significancia de p> 0.05 con la prueba de Duncan. Barras con
la misma letra son estadísticamente iguales. LM: Leuconostoc mesenteroides; WV: Weissella
viridiscens.
0.300
0.250
Absorbancia 590 nm
0.200
0.150 a
a
0.100
0.050
0.000
SH1 SH2
Staphylococcus hominis
No productora Débil productora
Moderada productora Fuerte productora
Figura 16. Formación de biopelícula por S. hominis en microplaca de poliestireno. Los

resultados son el promedio de las absorbancias de 5 réplicas. Las diferencias significativas se
establecieron mediante ANOVA con un nivel de significancia de p> 0.05 con la prueba de
Duncan. Barras con la misma letra son estadísticamente iguales. SH: Staphylococcus hominis.
56
10. DISCUSIÓN DE RESULTADOS
10.1 Monitoreo ambiental y caracterización fisicoquímica

La temperatura y humedad durante la fermentación corresponden a la temporada de lluvias en
Guadalajara. Dichos factores no se controlan en el área de fermentación por lo que están dadas
por las condiciones ambientales así como la ventilación del espacio, el aislamiento térmico del
área y el calor producido por la maquinaria y la misma fermentación. Los resultados de AT
(acidez titulable) y pH se encuentran en la figura 6. La AT de la mezcla de té con el inóculo
líquido fue de 0.6 g/L y subió 0.13 g/L alcanzando una AT de 1.9 g/L a las 168 h, valor que se
mantuvo hasta al final de la fermentación a las 240 h. El incremento en la AT corresponde a la
generación de ácidos orgánicos por el metabolismo de microorganismos fermentadores. Los
resultados coinciden con los de Neffe et al. (2017) quienes elaboraron kombucha con 10% de
sacarosa y una mezcla de té verde y té negro. Los resultados de la cuantificación de ácidos al
final de la fermentación en su estudio fueron de 1.6 g/L de ácido acético y 0.7 g/L de la mezcla
de otros cinco ácidos, que dan un total de 2.34 g/L. En otro experimento, Loncar et al. (2006),
determinaron que una kombucha fermentada con 6.6% de sacarosa a 22 ºC con 10% de inóculo
líquido, tuvo una acidez total expresada como ácido acético de 2.0 g/L. Por otro lado, los
resultados obtenidos en este estudio contrastan con lo encontrado por Jayabalan et al. (2007) que
reportan una concentración de ácidos dependiente del tipo de té utilizado (verde o negro) en
kombucha elaborada con 10% sacarosa y 10% de inóculo líquido. La suma de las concentraciones
de ácidos acético, D-glucorónico y láctico en dicho estudio fue de 4.52 g/L al día 9 de kombucha
fermentada con té verde y de 5.22 g/L con té negro. Esta discrepancia podría deberse a factores
como la diferencia de poblaciones microbianas del SCOBY y el té utilizado (Jayabalan et al.,
2007; Loncar et al., 2006). De los ácidos orgánicos producidos durante la fermentación, se ha
reportado el acético como el de mayor concentración; seguidos por los ácidos quínico, oxálico,
málico, cítrico, D-glucorónico y láctico (Jayabalan et al., 2007; Neffe et al., 2017). El pH de la
infusión azucarada de té fue de 6.5 y decreció 2.4 unidades al adicionar 10% del inóculo líquido,
alcanzando un pH de 4.1. Ese decremento inicial se debe a que el inóculo líquido que le es
adicionado tiene un pH de ~3.0, resultado de una prolongada fermentación. El decremento total
de pH desde el inicio hasta el final de la fermentación fue de 1.1 unidades. El pH final de la
kombucha analizada fue de 3.0, valor que coincide con estudios anteriores (Chen & Liu, 2000;
57
Neffe et al., 2017). Un pH de ~3.0 es utilizado como valor de referencia para determinar el fin
del proceso y se ha comprobado que la calidad sensorial de la kombucha a este pH es adecuada
(Loncar et al., 2006; Neffe et al., 2017). La fuente de carbón más utilizada en kombucha es la
sacarosa que está asociada con los sólidos solubles de la kombucha representados por ºBrix. Los
resultados de concentración de ART y ºBrix se muestran en la figura 7. Luego de la adición de
la sacarosa y del 10% del inóculo líquido se obtuvo un valor inicial de 12 ºBrix, los cuales
disminuyeron 7 unidades a un total de 5 ºBrix a las 240 h. Los ºBrix se utilizan de forma rutinaria
en la industria de bebidas para determinar la cantidad de azúcar disuelta tomando en cuenta que
1 °Brix representa 1 g de sacarosa en 100 mL. El valor inicial en el proceso de elaboración de
kombucha coincide con el 10% de sacarosa adicionada a la bebida más la del 10% del inóculo
líquido. En este sentido, el valor inicial de sacarosa disminuye de 12 g/100 mL a 5 g/100 mL,
que corresponde a un 41%. Estos resultados se acercan a lo reportado por Loncar y colaboradores
(2006) quienes calcularon una reducción en la concentración de sacarosa entre ~33 y 70% según
las variables de tiempo, temperatura y concentración del inóculo líquido. Por otro lado, los
azúcares reductores totales se mantuvieron estables en un valor de 4 g/100 mL hasta las 168 horas
y disminuyeron a 2.08 g/100 mL al final de la fermentación.
10.2 Microbiología sanitaria

Las condiciones fisicoquímicas alcanzadas durante la fermentación mantuvieron un medio
adecuado para el desarrollo de bacterias y levaduras. En tema de inocuidad alimentaria, los
hongos y levaduras son indicadores de higiene durante el proceso de elaboración. La
concentración de levaduras en la kombucha superó el límite máximo de los parámetros
microbiologicos establecidos por la normatividad mexicana para bebidas. Lo anterior se explica
con la variedad de microbiota autóctona que pertenece a la bebida fermentada, misma que no
presenta un proceso de pasteurización; sin embargo, para este estudio, la concentración de
levaduras no puede ser utilizado como indicador de contaminación. La concentración de
coliformes totales, coliformes fecales, E. coli y Salmonella están asociadas a la contaminación
por materia fecal. Todos los indicadores de materia fecal fueron inferiores al límite de detección
del método. Salmonella spp., patógeno transmitido por alimentos, estuvo ausente en 25 mL de la
bebida (cuadro 8).
58
Los alimentos y bebidas fermentados no pasteurizados son un claro ejemplo de la aplicación de
la tecnología de barreras. La cual inicia con las buenas prácticas de manufactura e higiene en el
proceso de producción de kombucha, limitando el crecimiento de los microorganismos
específicos contenidos en los inóculos. Estos microorganismos son por sí mismos la primer
barrera para el desarrollo de microorganismos no deseados como degradadores de la calidad o
patógenos (Rahman, 2007). Se ha demostrado sensibilidad de Staphylococcus aureus,
Eschericha coli, Enterobacter cloacae, Staphylococcus epidermis, Campylobacter jejuni,
Salmonella spp, Helicobacter pylori y Listeria monocytogenes al incubarlos en presencia de
kombucha (Sreeramulu, et al., 2000). Los microorganismos deseados presentes en el SCOBY y
en el inóculo líquido se incrementan gracias al uso de los di y monosacáridos produciendo ácidos
orgánicos. El efecto bacteriostático de la kombucha se asocia con la presencia de ácido acético
así como con otros compuestos antimicrobianos que aún no se han identificado (Sreeramulu et
al., 2000).
10.3 Identificación de microorganismos

Los microorganismos que se reportan en el cuadro 9 coinciden con las publicaciones de diversos
autores que han identificado poblaciones microbianas en kombucha por técnicas moleculares y
basadas en cultivo (Coton et al., 2017; Marsh et al., 2014). Todas las levaduras encontradas están
asociadas con los procesos fermentativos, incluyendo kombucha y otras bebidas fermentadas
como el vino y la cerveza (Coton et al., 2017; Marsh, et al., 2014; Milla et al., 2013). Se encontró
la presencia de bacterias ácido lácticas (BAL) Leuconostoc mesenteroides y Weisella viridiscens.
Las BAL han sido encontradas en otras bebidas y alimentos fermentados de origen láctico y no
láctico como el kefir, tuba y tepache (De La Fuente et al., 2015; Simova et al., 2002).
Gluconobacter oxydans es una bacteria ácido acética que ha sido reportada como la responsable
de la generación del SCOBY (Jia et al., 2004; Valera et al., 2015). Staphylococcus hominis es
una bacteria reportada como inofensiva y se encuentra en la piel de brazos y piernas ausente de
vellos en humanos y otros animales (Sung et al., 2010).
10.4 Dinámica poblacional microbiana

Las levaduras, al igual que en varios estudios (Chen y Liu, 2000; Neffe et al., 2017) fue la
población de mayor concentración durante toda la fermentación y alcanzó una densidad máxima
59
de 7.3 log (UFC/mL) a las 168 horas, manteniéndose estable durante el resto de la fermentación
(figura 9). Las levaduras durante su metabolismo hidrolizan la sacarosa en monosacáridos y
producen etanol que son sustratos esenciales para el crecimiento de BAA (Cvetkovic et al.,
2008). En el caso del grupo de las BAA se observa un incremento constante hasta llegar a 6.02
log (UFC/mL) al final de la fermentación (figura 9). El resultado discrepa con el estudio realizado
por Chen y Liu (2000) quienes reportan concentraciones de BAA de 3 a 4 logaritmos en
diferentes muestras de kombucha entre los 6 y 14 días de fermentación. Las BAA son bacterias
aerobias estrictas, por lo que su crecimiento en una fase anaerobia no es de esperarse. Lo anterior
podría explicarse al estudiar la forma en que se lleva a cabo el proceso para realizar la
fermentación anaerobia. Después de las 168 horas la bebida es impulsada por una bomba
acoplada a una manguera hacia el segundo tanque de fermentación, en donde pasará 72 horas
más en fermentación anaerobia. Durante esta manipulación podría haber incorporación de
oxígeno lo que permitiría que las BAA continuaran su crecimiento durante la etapa tardía del
proceso. El aumento de BAA entre las 0 y 96 h fue de 0.17 log, mientras los incrementos mas
importantes de estas poblaciones fueron entre 96 y 168 h con 1.29 log y muy cercano al aumento
entre las 168 y 240 h (fermentación anaerobia), que fue de 1.25 log. Los estudios hasta ahora
encontrados sobre el comportamiento poblacional durante la fermentación de kombucha se han
realizado con muestras de la bebida sin aplicación de anaerobiosis. Los resultados obtenidos
sobre el crecimiento de las BAA en fermentación anaerobia fueron de utiliad para la empresa
para correjir dicho inconveniente.
En condiciones aerobias las BAA producen ácido acético, originando la acidificación del medio
(Chen & Liu, 2000; Kallel et al., 2012). Dicha acidificación pudo propiciar un medio ideal para
permitir que otras bacterias ácido tolerantes como las BAL se desarrollaran. El mayor incremento
de las BAL fue de 1.71 log durante las primeras 96 horas (figura 9), desencadenando por la
disponibilidad de nutrientes y gracias a su naturaleza anaerobia facultativa, lo que le permite su
tolerancia al oxígeno. Al final del proceso este grupo se pudo beneficiar por el aumento de
glucosa que la población de levaduras dejó disponible alcanzando una densidad final de 6.69
logaritmos.
60
10.5 Resistencia a condiciones del TGI in vitro.
La kombucha se ha considerado como una bebida funcional gracias a su contenido en probióticos.
En este contexto, el estudio de la dinámica poblacional podría marcar una pauta para una mejor
manipulación del proceso en dirección al desarrollo de las comunidades microbianas probióticas.
Las bacterias son los microorganismos con más estudios de actividad probiótica, sin embargo
también se han reportado algunas levaduras con dicho efecto (Bonatsou et al., 2018; Castro et
al., 2019; Castro et al., 2015; Fakruddin et al., 2017; Gómez et al., 2016; Kim et al., 2005; Lara
et al., 2019; Le & Yang, 2018; Nayak, 2011; Shukla et al., 2014). Una característica para poder
considerar a un microorganismo probiótico es que se mantenga vivo al final de su paso por el
TGI. En este estudio las levaduras tuvieron una mayor sobrevivencia que las bacterias, ya que
hubo staphylococcus (no lácticas) que cuya viabilidad redujo totalmente (SH1 y SH2), mientras
el menor porcentaje de sobrevivencia en levaduras fue de 86.96% al final de la simulación. Las
BAL sobrevivieron entre 67.24% y 88.26%.
10.5.1 Resistencia de levaduras a condiciones del TGI in vitro.

Mediante los experimentos llevados acabo se obtuvieron resultados sobre la capacidad que tienen
algunos microorganismos aislados de kombucha a sobrevivir al TGI in vitro. A continuación, se
comparan y discuten los porcentajes totales de sobrevivencia de cada una de las levaduras, así
como los porcentajes de reducción en cada una de las tres fases simuladas del TGI in vitro.
En la presente investigación P. manshurica tuvo una sobrevivencia de 90.39% con reducción de

viabilidad de 4.66 % en la fase gástrica y 4.89 % en la fase intestinal. Estos resultados son
similares a los obtenidos en tres cepas aisladas de la fermentación de aceite de oliva por Bonatsou
et al. (2018) quienes reportaron porcentajes de sobrevivencia de 78.4 % a 82.5 % y reducciones
que van del 7.3 % a 10 % en la fase gástrica y de 8.9 % a 10.5 % en la fase intestinal. Las
diferencias observadas entre los aislados de Bonatsou et al. y los nuestros podría atribuirse a la
aplicación de diferentes parámetros de pH y tiempo en las fases simuladas. En la fase gástrica se
aplicaron menor pH (pH 2.0) y mayor tiempo de exposición (2.5 h) comparados con los nuestros
(pH 3.0; 2 h). Mientras en la fase intestinal tanto el pH como el tiempo de exposición fueron
mayores (pH 8.0; 3.5 h) comparados con nuestros parámetros (pH 7.0; 2 h). En un estudio de
transcriptoma realizado en Pichia anomala sometida a un estrés por acidez (pH de 3.0 con HCl),
61
se encontró una alta expresión de genes de la bomba de protones en la membrana celular.
También se observó la expresión de subunidades de la ATPasa vacuolar que actúan en conjunto
con la bomba de protones para desacidificar el citosol. Todo este proceso tiene un alto costo
energético y en algún momento la producción de ATP es insuficiente para mantener otras
necesidades metabólicas, provocando la muerte celular. Sin embargo, esta levadura expresó
enzimas relacionadas con la generación de energía a través de la cadena de transporte de
electrones y fosforilación oxidativa, procesos que generan en la mitocondria gran cantidad de
ATP con alta eficiencia, mejorando su sobrevivencia. En P. anómala, es de destacar la presencia
del Complejo I que genera el 40% del gradiente electroquímico necesario para la conversión de
ADP a ATP en la mitocondria (Fletcher et al., 2015).
Saccharomyces cerevisiae es considerado como un organismo generalmente reconocido como

seguro (GRAS). La sobrevivencia de los aislados de S. cerevisiae se encontró en el rango de
86.96 % a 95.16 %, resultados similares a las cepas más resistentes de S. cerevisiae reportadas
por Bonatsou et al. (2018). La viabilidad de SC3 se vio mayormente reducida en la fase bucal
con una disminución de 5.27 %, mientras las viabilidades de SC1 y SC2 redujeron mayormente
durante la fase gástrica con 6.46 % y 2.62 %, respectivamente. Al igual que en el caso de P.
manshurica, las viabilidades de seis aislados de S. cerevisiae analizados por Bonatsou et al.
(2018) resultaron mayormente afectadas en la simulación de la fase intestinal (pH 8.0; 3.5 h), por
lo que el contraste entre resultados podría deberse a la diferencia en las condiciones de
experimentación. Se ha observado que S. cervisiae en un medio con bajo pH, al contrario de P.
manshurica, no sobreexpresa los genes encargados de codificar para ATPasas vacuolares, por lo
que la respiración no es su principal mecanismo para reducir el estrés por acidificación. Se ha
visto que S. cerevisiae es capaz de modificar la membrana celular para evitar el estrés por
acidificación extracelular con HCl; por ejemplo, evitando la entrada de hierro a la célula, el cual
se vuelve tóxico a un pH < 3.0. Además, una menor concentración de hierro en la célula provoca
su administración hacia las rutas metabólicas más importantes para sobrevivir a tales
condiciones, permitiendo el ahorro de energía (Fletcher et al., 2017). Una de las rutas metabólicas
que son dependientes de hierro y que, contrariamente, se ha visto sobre-expresada en condiciones
de acidez, tanto por ácidos orgánicos como inorgánicos, es la que sintetiza ergosterol (Fletcher
et al., 2017; Guo et al., 2018). El ergosterol es un esterol que se encuentra en la membrana celular
de eucariontes y provee de impermeabilidad a la célula. También se ha comprobado la
62
modificación de la composición de membranas mediante la acumulación de triacilgliceroles y la
degradación de estéril esteres (Guo et al., 2018). Una previa adaptación de los microorganismos
aislados de kombucha por el gradual descenso de pH causado por la generación de ácidos
orgánicos durante la fermentación podría ser un factor que mejora la sobrevivencia de estos. En
este sentido, se ha observado que una adaptación a pH bajos con ácidos orgánicos evita la
separación de las células durante el proceso de división celular, lo que promueve la formación
de estructuras multicelulares reduciendo el radio de difusión del ácido al interior de la célula.
También ante ácidos orgánicos, se fortifica la pared celular e incrementa la degradación de ácido
láctico (Fletcher et al., 2017).
El asilado de L. fermentati LF1 tuvo una sobrevivencia de 90.61 %, LF2 fue el aislado más
resistente de esta especie con un 95 % y LF3 sobrevivió en un 92.21 %. La viabilidad de LF1 se
redujo mayormente en la fase bucal con un 5.20 %, mientras las viabilidades de LF2 y LF3 se
vieron más afectadas en la fase gástrica con 3.17 % y 5.0 % de reducción, respectivamente. Se
ha reportado en L. fermentati aislada de kombucha una sobrevivencia de 85 % a 93 % al
exponerla a un pH de 3.0 (con HCl) durante 48 h (Bellut, et al., 2020). Estos porcentajes de
sobrevivencia son muy similares a los obtenidos en el presente trabajo durante la simulación
gástrica. La alta sobrevivencia de L. fermentati a medios ácidos puede estar asociada a su
capacidad para producir grandes cantidades de ácido láctico lo que hace que esté adaptada a la
constante exportación de protones de la célula. Además, se ha demostrado que la capacidad de
sobrevivencia de L. fermentati es menor a un pH de 3 con ácido láctico en comparación con la
encontrada al mismo pH con HCl. Esta diferencia en el efecto de diferentes ácidos se asocia a
sus propiedades químicas. El ácido láctico tiene un Pka de 3.86, mientras el del HCl es de -6.2;
esto implica que la cantidad de ácido láctico necesario para llegar al pH de 3 es mayor que el de
HCl, además de que la mayoría del acido láctico a estas condiciones se encuentra en su forma
protonada. Los ácidos en su forma protonada entran por difusión pasiva a la célula, en donde se
encuentran con un pH más alto provocando su desprotonación (Bellut, et al., 2020). Ante esta
situación la célula debe exportar el proton y el anión, productos de la disociación del ácido, con
un alto costo energético, limitando otras actividades metabólicas escenciales e induciendo a la
muerte de la célula. Al ser el HCl un ácido fuerte por su Pka, resulta más difícil que acidifique el
interior de la célula a un pH de 3.0.
63
Los aislados de H. opuntiae investigados en el presente estudio tuvieron sobrevivencias de 91.11
% y 95.16 % para HO1 y HO2, respectivamente. Ambos asilados de H. opuntiae fueron
mayormente afectados en la fase gástrica con reducciones de 6.62 % y 3.19 %. Lara y
colaboradores (2019) reportaron que H. opuntiae aislada de chile guajillo fermentado
espontáneamente ha demostrado sobrevivir a las condiciones del TGI in vitro. Se ha demostrado
en H. opuntiae capacidad antioxidante y de reducción de colesterol, así como actividad
antimicrobiana contra Salmonella entérica ser. Typhimurium y Candida albicans, sugiriendo que
es una cepa de importante potencial probiótico (Lara-Hidalgo et al., 2019). Dicha cepa también
se ha estudiado como probiótico para otros animales comprobando la estimulación de sistema
inmune y su actividad contra infecciones por Vibrio splendidus (Ma et al., 2013; Ma et al., 2014).
De las 9 levaduras expuestas a las condiciones simuladas del TGI in vitro, 6 presentaron una
mayor pérdida de viabilidad en la fase gástrica con reducciones desde 2.62 % a 6.62%. Según
lo demostrado en este trabajo y en otros estudios ya mencionados, el bajo pH del estómago es
uno de los factores que más afectan la viabilidad de los microrganismos durante su paso por el
TGI. La decadencia en la viabilidad de las levaduras por efecto del pH ácido depende de la
capacidad de cada una de las levaduras para ejercer mecanismos que le permitan mantener la
homeostasis del pH intracelular (Beales, 2004). Como se ha discutido anteriormente, entre estos
mecanismos se encuentran la restricción de entrada de protones a través de membranas altamente
impermeables; la generación de gradientes quimiosmóticos mediante ATPasas de potasio;
modulación del tamaño de los canales de membrana; activación de la bomba de protones y la
modulación de la composición de ácidos grasos en membrana (Guan & Liu, 2020). Además, una
previa adaptación de microorganismos a bajo pH por su exposición a los ácidos orgánicos
producidos durante la fermentación de kombucha pueden brindar una ventaja a los probióticos
para sobrevivir a la acidez del estómago.
10.5.2 Resistencia de bacterias a condiciones del TGI in vitro

A continuación, se presentan la comparación y discusión de la capacidad de sobrevivencia de las
bacterias durante la simulación, así como la reducción en cada una de las tres fases del TGI in
vitro.
64
L. mesenteroides y W. viridiscens son bacterias BAL. Los aislados de L. mesenteroides LM1,
LM2 y LM3 tuvieron una sobrevivencia de 77.9 %, 88.26 % y 84.70 %, respectivamente. Giles
et al., (2016) reportan sobrevivencias de 48.33 % a 74.98 % y en dos cepas de L. mesenteroides
aisladas de pulque luego de una exposición a un pH de 2.5 y concentraciones de 0.3 % y 0.1 %
de sales biliares durante 24 horas a 37 ºC. Los resultados anteriores son contrastantes con los de
Castro et al., (2015), quienes reportan en cuatro cepas de L. mesenteroides una sobrevivencia
máxima de 16.75 % (pH 2, 1 hora, 37 ºC y pH 6.5, 0.5 % de sales biliares, 1.9 mg/mL de
pancreatina, 90 minutos 37 ºC). Los resultados obtenidos en este estudio para W. viridiscens
muestran una sobrevivencia de 67.24%, resultado smiliar a los encontrados por Le y Yang (2018)
que reportan sobrevivencias de 77.4 % a 79.9 %. La fase bucal no afectó negativamente la
viabilidad de ninguna de las BAL, mientras en la fase gástrica todos los aislados de L.
mesenteroides mostraron una reducción en su viabilidad, siendo LM1 la más afectada en esta
fase con una reducción del 17.26 %. Otros estudios similares han mostrado reducciones en L.
mesenteroides de hasta un 39 % (pH de 3 por 3 horas a 37 ºC con 1000 U/mg pepsina) (Shukla
et al., 2014) y 59.10 % (pH 2 por 3 horas a 37 ºC sin enzimas) (Castro et al., 2015). Un menor
tiempo de exposición de los aislados de L. mesenteroides a la simulación gástrica en el presente
estudio (2 horas) podría explicar el menor porcentaje de reducción en comparación con los
estudios anteriormente expuestos (3 horas). Todas las BAL redujeron significativamente en la
simulación intestinal. Las BAL LM2, LM3 y WV1 fueron los aislados más afectadas en esta fase.
Dos de los tres aislados de LM sometidos a este experimento, mostraron reducciones de
viabilidad de 8.13 % a 8.90 %. Estos porcentajes se encuentran entre los 11.85 % a 10.64 % (0.5
% de sales biliares durante 4 horas), y el 0 % de reducción (0.3 y 1 % de sales biliares durante
24 horas) encontrados por otros autores (Castro et al., 2015; Giles et al., 2016). W. viridiscens
redujo un 30.01% de su viabilidad en la simulación del intestino en este estudio. Dichos
resultados contrastan con los de Le y Yang (2018), quienes observaron que dos aislados de W.
viridiscens murieron mayormente en la fase gástrica y no mostraron diferencias significativas al
exponerlas a la fase intestinal. L. mesenteroides ha demostrado inhibir microorganismos
entéricos, (Giles et al., 2016), posee actividad ß-galactosidasa y propiedad anticancerígena
(Shukla et al., 2014), actividad antioxidante, es coadyuvante en la disminución en los niveles de
colesterol (Lee y Kim, 2019) y en la disfunción metabólica en ratones (Castro et al., 2019). Por
65
lo anterior, se considera a L. mesenteroides como una bacteria presente en kombucha con un gran
potencial probiótico.
Ninguno de los aislados de S. hominis sobrevivieron a las condiciones simuladas del TGI in vitro,
ya que la reducción total de la viabilidad se observó en la fase gástrica. Sung et al., (2009)
estudiaron la sobrevivencia de S. hominis a un pH de 2.5 y de forma discontinua, a diferentes
concentraciones de sales biliares (0.3, 1.0 y 5.0 w/v) y observaron porcentaje de sobrevivencia
de 0.53%. Durante la fase gástrica se observó efecto del tratamiento de la fase bucal en la
viabilidad de ambos aislados de S. hominis, al reducirse en 9.82 % y 6.65 % en SH1 y SH2,
respectivamente. En la fase gástrica la viabilidad de ambos aislados redujeron 90.18 % para SH1
y 93.35 % para SH2.
Las sobrevivencias al final del experimento fueron entre 86.96 % a 95.61 % para levaduras y de
67.24 % a 88.26 para BAL. Se encontraron dos estudios realizados que reportan resistencia a las
condiciones de TGI de bacterias lácticas aisladas de kombucha pero hasta el momento ninguno
enfocado en levaduras. Puspawati et al., (2016) realizó un experimento discontinuo para conocer
la resistencia de 20 BALs aisladas de kombucha. Los autores observaron que en la fase gástrica
(pH de 2.0 durante 4 horas a 37 ºC sin enzimas) cuatro aislados resistieron entre 88.65 % y 65.48
%, once de ellas estuvieron por debajo de estos porcentajes y cinco no sobrevivieron. En los
resultados de la resistencia a las condiciones intestinales (4 horas en presencia de 0.5 % de sales
biliares), siete aislados redujeron en concentración en un rango de 0.07 a 6 log UFC/mL y siete
incrementaron. Bogdan et al., (2018) realizaron pruebas de resistencia a sales biliares a cinco
BALs aisladas de kombucha. Los resultados mostraron que a partir de una concentración de 3 %
se 3 aislados fueron altamente tolerantes y 2 fuertemente inhibidos. En dicho estudio se proponen
dos aislados de BAL como potenciales probióticos.
10.6 Capacidad de formación de biopelícula

La capacidad de sobrevivencia a las condiciones del TGI es el primer filtro para considerar a un
microorganismo probiótico. Paralelamante, la propiedad de producir biopelícula es importante
para la selección del probiótico ya que puede proporcionar información sobre su capacidad para
adherirse a las células del intestino y colonizar por mayor tiempo. Los resultados muestran que
66
las levaduras analizadas en este estudio tuvieron mayor capacidad para formar biopelículas que
las bacterias, las cuales fueron débiles productoras.
P. manshurica tuvo una fuerte capacidad de producir biopelícula en microplaca de poliestireno.
Perpetuini et al. (2018), encontraron que 11 cepas de P. manshurica aisladas de vino fueron
capaces de formar biopelícula en microplacas de poliestireno pero no se clasifican según los
parámetros utilizados en este estudio.
Dos de los tres aislados de S. cerevisae tuvieron baja o nula capacidad de producir biopelícula,
pero uno de los aislados se clasificó como fuerte. Nuestros resultados coinciden con lo reportado
por Sidari et al (2014), quienes encontraron amplias respuestas en la capacidad de aislados de S.
cerevisiae para formar biopelícula; algunos fueron no formadoras y otras fuertemente
formadoras. En dicho estudio analizaron si esta propiedad era afectada por presencia de
catequinas; encontrando que la mayoría de los aislados se vieron afectados en su capacidad para
producir biopelícula por este factor. Lo anterior podría dar indicios sobre una posible explicación
al fenómeno aquí observado, ya que en kombucha el té aporta catequina (Murugesan et al., 2002).
Ambos aislados de H. opuntiae (HO1 y HO2) tuvieron el mismo comportamiento en el
experimento, al igual que los dos aislados de Lachanchea fermentati (LF2 y LF3). HO1 Y HO2
fueron aislados con fuerte capacidad de producir biopelícula, mientras LF2 Y LF3 tuvieron una
capacidad moderada. No se han encontrado estudios para contrastar los resultados aquí obtenidos
de ninguna de las dos especies.
Se ha reportado que L. mesenteroides tiene la capacidad de producir glucansacarasas,

polisacáridos de importancia para la formación de biopelículas. Los resultados obtenidos de la
presente investigación son similares a los reportados en un estudio en donde se demostró que la
producción de biopelícula por L. mesenteroides varía entre cepas de la misma especie (Leathers
y Bischoff, 2011). En la presente investigación todos los aislados de L. mesenteroides fueron
débiles productores de biopelícula. W. viridiscens no mostró capacidad de formar biopelícula en
nuestro estudio, a diferencia de lo reportado por Gómez et al. (2016) quienes muestran una
capacidad moderada por parte W. viridiscens.
Los dos aislados de S. hominis analizados se clasificaron como débiles productores de
biopelícula. En un estudio anterior el 23.8 % de aislados del mismo género y especie mostraron
67
una débil capacidad para producir biopelícula pero la mayoría (47.6 %) mostraron una fuerte
capacidad para producirla (Mendoza et al., 2013)
68
11. CONCLUSIONES
Como resultado de los experimentos realizados en este trabajo se describieron los factores
fisicoquímicos durante la fermentación de 240 horas en kombucha, se identificaron
microorganismos que se desarrollan durante dicha fermentación y se generó información sobre
el potencial de algunas de estos microorganismos como probióticos.
La temperatura, el tiempo, la presencia o ausencia de oxígeno y concentración de ácidos
orgánicos son parámetros que influyen en la promoción o inhibición del crecimiento de algunos
microorganismos.
Considerando una concentración de aproximadamente 1.82x107 UFC/mL de levaduras y de

5.25x106 UFC/mL de BAL al final de las 240 horas de fermentación de kombucha; en una botella
de 355 mL existen un total de 6.49x109 UFC de levaduras y 1.86x109 UFC de BAL. Estas
concentraciones rebasan las concentraciones establecidas para poder hacer uso de la declaración
de propiedad “contiene probióticos”. Además, según los resultados obtenidos durante el presente
trabajo, un promedio de 91.96% de la mezcla de levaduras potencialmente probióticas sobrevive
a las condiciones del TGI, por lo que una botella contiene un aproximado de 5.94x109 UFC de
levaduras que van a llegar vivas al colon. En el caso de las BAL, un promedio de 79.54 % son
capaces de sobrevivir a las condiciones del TGI, representando un contenido aproximado de
1.48x109 UFC de BAL en una botella que capaces de llegar vivas al colon.
La mayoría de las levaduras estudiadas producen biopelícula en poliestireno, lo que da pauta a

estudios posteriores que confirmen su capacidad de adherencia a las células intestinales y mayor
tiempo de colonización.
La kombucha estudiada contiene una amplia diversidad de microorganismos que pueden proveer
de un beneficio a la salud del consumidor. Cada probiótico cumple una función diferente en el
organismo por lo que la variedad en el consumo de alimentos y bebidas fermentadas con la
kombucha es importante para aprovechar de sus propiedades benéficas a la salud.
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Resistencia de Microorganismos Aislados de Kombucha A Condiciones Del Tracto Gastrointestinal in Vitro

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CONSEJO INSTITUCIONAL DE POSGRADO

Dra. Claudia Alvarado Osuna

Dra. Anahi Jobeth Borrás Enriquez

Dr. Juan Campos Guillén

Dr. Manuel Reinhart Kirchmayr

Dr. Jorge Luis González Escobar

MÓNICA AIDEE GUZMÁN ORTIZ

Por este medio le informo que el trabajo de tesis “Resistencia de

Dra. Claudia Alvarado Osuna. Directora de tesis

ha sido aprobado para su impresión definitiva y defensa correspondiente para

Sin otro particular, aprovecho la oportunidad para enviarle un cordial saludo.

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Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT), institución que me brindó beca de

Al Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco, A.C.

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