Tesis Juan Luis Perez

Universidad Autónoma De Occidente
Departamento Académico de Investigación y Posgrado

Maestría en Fitopatología y Medio Ambiente
T E S I S:
Caracterización, virulencia y sensibilidad a fungicidas de aislados

de Colletotrichum spp. causantes de la antracnosis de los cítricos
(Citrus spp.) en el norte de Sinaloa
Que presenta:
Juan Luis Pérez Mora

Para obtener el grado de:
Maestro en Fitopatología y Medio Ambiente
Directores de tesis:
Dra. Guadalupe Arlene Mora Romero
Dr. Juan Manuel Tovar Pedraza
Los Mochis, Sinaloa, México. Noviembre de 2020

El presente trabajo de investigación titulado “Caracterización, virulencia y
sensibilidad a fungicidas de aislados de Colletotrichum spp. causantes de la
antracnosis de los cítricos (Citrus spp.) en el norte de Sinaloa.” realizado por el Ing.
Juan Luis Pérez Mora con matrícula 18021388, dirigido por los integrantes del
Comité de Tesis abajo indicados, ha sido aprobado por el mismo y aceptado como
requisito parcial, para la obtención del grado de Maestro en Ciencias.
COMITÉ DE TESIS:
_____________________________ _____________________________
Dra. Guadalupe Arlene Mora Romero Dr. Juan Manuel Tovar Pedraza
Directora de Tesis Director de Tesis
________________________________ ______________________________
Dr. Hugo Beltrán Peña Dr. Bardo Heleodoro Sánchez Soto
Asesor de Tesis Asesor de Tesis
Los Mochis, Sinaloa, Noviembre de 2020

Agradecimientos
A Dios por permitirme seguir creciendo personal y profesionalmente, y sobre todo

por darme salud.
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT), por el financiamiento

durante mi programa de estudios de maestría.
A la Universidad Autónoma De Occidente por permitirme realizar mis estudios de

maestría y la infraestructura que puso a disposición para elaborar mi proyecto de
investigación.
A la Dra. Guadalupe Arlene Mora Romero y al Dr. Juan Manuel Tovar Pedraza por
ser siempre unos excelentes guías en este proyecto de investigación.
AL Dr. Hugo Beltrán Peña y Dr. Bardo Heleodoro Sánchez Soto por sus asesorías
y conocimientos compartidos.
A la Dra. Elizabeth García, al Dr. José Luis Aragón y al MC. Gabriel Herrera por el
tiempo compartido en este proyecto y sus consejos.
A mis compañeros y amigos; Álvaro Moreno, Luis Felipe González, Abelard

Eliassain, David Cota, Edgar Palafox, Daniela Olivas, Héctor Leyva, Xavier
Verduzco, Omar Guerra.
DEDICATORIA
A: Mi hijo
mi familia
por toda esa motivación y el enorme apoyo que me brindaron todos los días.
ÍNDICE
ÍNDICE DE CUADROS ............................................................................................ i

ÍNDICE DE FIGURAS ............................................................................................. ii
RESUMEN GENERAL ............................................................................................ 1
GENERAL ABSTRACT .......................................................................................... 2
INTRODUCCIÓN GENERAL .................................................................................. 3
ANTECEDENTES ................................................................................................... 6
REVISIÓN DE LITERATURA ................................................................................. 7
Cítricos (Citrus spp.) ............................................................................................ 7
Origen y distribución de los cítricos .................................................................. 7
Importancia y usos de los cítricos .................................................................... 7
Taxonomía ....................................................................................................... 8
Países productores .......................................................................................... 8
Importancia económica .................................................................................... 8
Importancia económica en Sinaloa .................................................................. 9
Enfermedades de cítricos .................................................................................. 10
Enfermedades causadas por bacterias .......................................................... 10
Enfermedades causadas por nematodos ....................................................... 11
Enfermedades causadas por virus y viroides ................................................. 11
Enfermedades causadas por hongos ............................................................. 12
Colletotrichum spp. ............................................................................................ 12
Agente causal de la enfermedad .................................................................... 12
Importancia y distribución de la antracnosis................................................... 14
Síntomas de la enfermedad ........................................................................... 14
Condiciones favorables para la enfermedad .................................................. 15
Manejos de la enfermedad ................................................................................ 16
Control cultural de la enfermedad .................................................................. 16
Control biológico de la enfermedad ................................................................ 17
Control químico de la enfermedad ................................................................. 17
JUSTIFICACIÓN ................................................................................................... 18
OBJETIVOS .......................................................................................................... 19
OBJETIVO GENERAL ....................................................................................... 19
OBJETIVOS ESPECÍFICOS.............................................................................. 19
HIPÓTESIS ........................................................................................................... 19
REFERENCIAS..................................................................................................... 20
CAPÍTULO I. Diversidad de especies de Colletotrichum causantes de la
antracnosis de los cítricos en el norte de Sinaloa.
RESUMEN ............................................................................................................ 27
ABSTRACT........................................................................................................... 28
INTRODUCCIÓN .................................................................................................. 29
MATERIALES Y MÉTODOS................................................................................. 31
Colecta de muestras .......................................................................................... 31
Aislamiento y purificación .................................................................................. 32
Caracterización morfológica y cultural ............................................................... 33
Extracción de ADN, amplificación por PCR y secuenciación ......................... 34
Análisis filogenético ........................................................................................ 36
Prueba de patogenicidad ................................................................................... 37
Patogenicidad cruzada ...................................................................................... 37
RESULTADOS...................................................................................................... 38
Obtención de aislados ....................................................................................... 38
Caracterización morfológica y cultural ............................................................... 39
Análisis filogenético ........................................................................................... 44
Prueba de patogenicidad ................................................................................... 45
Patogenicidad cruzada ...................................................................................... 47
DISCUSIÓN .......................................................................................................... 50
CONCLUSIONES ................................................................................................. 53
REFERENCIAS..................................................................................................... 54
CAPÍTULO II. Sensibilidad a carbendazim en aislados de Colletotrichum spp.
causantes de la antracnosis de los cítricos en el norte de Sinaloa.
RESUMEN ............................................................................................................ 59
ABSTRACT........................................................................................................... 60
INTRODUCCIÓN .................................................................................................. 61
MATERIALES Y MÉTODOS................................................................................. 62
Origen y colección de aislados de Colletotrichum spp. ...................................... 62
Fungicida ........................................................................................................... 64
Sensibilidad de Colletotrichum spp. a carbendazim .......................................... 65
Análisis de datos................................................................................................ 65
RESULTADOS...................................................................................................... 66
DISCUSIÓN .......................................................................................................... 71
CONCLUSIÓN ...................................................................................................... 75
REFERENCIAS..................................................................................................... 75
ÍNDICE DE CUADROS
Cuadro 1. Producción e ingreso de la citricultura en el país, en los últimos tres años

(SIAP, 2019). .......................................................................................... 9
Cuadro 2. Producción e ingreso anual de los cítricos cultivados en México (SIAP,
2019). ..................................................................................................... 9
Cuadro 3. Producción e ingreso de los cítricos cultivados en el estado de Sinaloa
en el año 2018 (SIAP, 2018). ............................................................... 10
CAPITULO I.
Cuadro 1. Nombres de iniciado utilizados, secuencias, fragmentos (pb), gen,

temperatura de fusión (TM), referencia de los cebadores utilizados para
la identificación de diferentes especies de Colletotrichum ................... 36
Cuadro 2. Código de aislado, localidad, tejido infectado y especie de cítricos con
síntomas de antracnosis ....................................................................... 38
Cuadro 3. Características morfológicas y culturales de 35 aislados de
Colletotrichum obtenidos de tejido sintomático con antracnosis en
huertos comerciales de cítricos en el norte de Sinaloa. ....................... 40
Cuadro 4. Sitios de recolección de aislados de Colletotrichum spp. en partes
vegetativas con síntomas de antracnosis en especies de cítricos del norte
de Sinaloa. ........................................................................................... 44
Cuadro 5. Relación de aislados patogénicos en distintos frutos de cítricos
(inoculación cruzada). .......................................................................... 49
CAPITULO II.
Cuadro 1. Origen geográfico, cultivo, número y código de aislados de Colletotrichum

spp........................................................................................................ 63
Cuadro 2. Efecto de carbendazim en la inhibición del crecimiento micelial de
diferentes aislados de Colletotrichum spp. en PDA + carbendazim. .... 69
Cuadro 3. Rango de crecimiento y media de CE50 en aislados de Colletotrichum
spp. obtenidos de huertos comerciales de cítricos. .............................. 70
Cuadro 4. Media de concentración efectiva CE50 de carbendazim en aislados de
Colletotrichum spp. ............................................................................... 71
i
ÍNDICE DE FIGURAS
CAPITULO I.
Figura 1. Síntomas de antracnosis causados por Colletotrichum spp. en tejido de
cítricos. ................................................................................................. 31
Figura 2. Colonias con seis días de crecimiento en medio de cultivo papa dextrosa
agar (PDA). .......................................................................................... 42
Figura 3. Colonias con seis días de crecimiento en medio de cultivo extracto de
malta agar (MEA). ................................................................................ 43
Figura 4. Conidios formados en medio de cultivo papa dextrosa agar (PDA) después
de 8 días de incubación a 28°C en total oscuridad. A) C. gloeosporioides,
B) C. siamense y C) C. karstii............................................................... 43
Figura 5. Lesiones necróticas y hundidas típicas de antracnosis en frutos de
cítricos. ................................................................................................. 46
Figura 6. Diámetro medio de la lesión (mm) causada por tres especies de
Colletotrichum asociadas con antracnosis de cítricos en México, 10 días
después de la inoculación con herida más 25 µL de suspensión con
conidios. Barras sobre columnas son el error estándar........................ 47
Figura 7. Síntomas de antracnosis en diferentes especies de cítricos A) limón
mexicano .............................................................................................. 48
Figura 1. Distribución de frecuencia de valores de concentración efectiva de
carbendazim a la cual se inhibe 50% del crecimiento (CE50). .............. 66
Figura 2. Sitios de recolección de aislados de Colletotrichum gloeosporioides, C.
siamense y C. karstii asociados a la antracnosis de cítricos en tres
municipios del estado de Sinaloa. ........................................................ 67
Figura 3. Efecto del fungicida carbendazim a diferentes concentraciones sobre el
crecimiento micelial de especies de Colletotrichum, obtenidas de huertos
comerciales de cítricos, en el norte de Sinaloa. ................................... 68
ii
Caracterización, virulencia y sensibilidad a fungicidas de aislados de
Colletotrichum spp. causantes de la antracnosis de los cítricos (Citrus spp.)
en el norte de Sinaloa
RESUMEN GENERAL
La antracnosis, causada por Colletotrichum spp., es una de las enfermedades de

mayor importancia en la producción de cítricos, y se controla principalmente
mediante el uso de fungicidas sistémicos pertenecientes al grupo metil-
benzimidazol-carbamatos (MBC). En el México, la antracnosis en cítricos se ha
relacionado a Colletotrichum gloeosporioides y C. acutatum. El objetivo de este
estudio fue identificar las especies de Colletotrichum asociadas a la antracnosis en
huertos comerciales de cítricos en el norte de Sinaloa. Adicionalmente, se determinó
la sensibilidad in vitro al fungicida carbendazim en 35 aislados pertenecientes al
género Colletotrichum. La caracterización fenológica indicó que los aislados
obtenidos pertenecen a los complejos C. gloeosporioides y C. boninense. El análisis
filogenético identificó a las especies C. gloeosporioides y C. siamense
pertenecientes al complejo C. gloeosporioides, y a la especie C. karstii que
pertenece al complejo C. boninense. La prueba de patogenicidad en frutos, mostró
que todos los aislados fueron capaces de inducir lesiones típicas de antracnosis.
Los aislados presentaron valores de CE50 que variaron de 0.034–0.769 µg mL-1
(media = 0.086 µg mL-1). Estos resultados mostraron una alta sensibilidad al
fungicida carbendazim (MBC) en especies de Colletotrichum causantes de la
antracnosis en cítricos de huertos comerciales en el norte de Sinaloa. Los datos
obtenidos en este trabajo permitirán monitorear variaciones posteriores en la
sensibilidad de poblaciones de Colletotrichum de cítricos a fungicidas MBC.
Palabras clave: Citrus spp., Colletotrichum spp. Apn/Mat, virulencia, sensibilidad.
1
Characterization, virulence and sensitivity to fungicides of isolates of
Colletotrichum spp. Causes of citrus anthracnose (Citrus spp.) in northern
Sinaloa
GENERAL ABSTRACT
Anthracnose, caused by Colletotrichum spp., is one of the most important diseases

in citrus production, and it is controlled mainly through the use of systemic fungicides
belonging to the group methyl-benzimidazole-carbamates (MBC). In Mexico, citrus
anthracnose has been related to Colletotrichum gloeosporioides and C. acutatum.
The objective of this study was to identify the Colletotrichum species associated with
anthracnose in commercial citrus orchards in northern Sinaloa. Additionally, the in
vitro sensitivity to the fungicide carbendazim was determined in 35 isolates
belonging to the genus Colletotrichum. The phenological characterization indicated
that the isolates obtained belong to the complexes C. gloeosporioides and C.
boninense. In the phylogenetic analysis, they were identified the species C.
gloeosporioides and C. siamense belonging to the complex C. gloeosporioides, and
the species C. karstii which belongs to the complex C. boninense. The pathogenicity
test in fruits showed that all isolates are capable of inducing typical anthracnose
lesions. The isolates presented EC50 values that ranged from 0.034–0.769 µg mL-1
(mean = 0.086 µg mL-1). These results showed a high sensitivity to the fungicide
carbendazim (MBC) in Colletotrichum species that cause anthracnose in citrus fruits
from commercial orchards in northern Sinaloa. The data obtained in this work will
allow monitoring subsequent variations in the sensitivity of Colletotrichum citrus
populations to MBC fungicides.
Keywords: Citrus spp., Colletotrichum spp. Apn / Mat, virulence, sensitivity.
2
INTRODUCCIÓN GENERAL
México ocupa el cuarto lugar a nivel mundial en producción de cítricos, y aporta el
6 % del total de la producción, detrás de China (21 %), Brasil (18 %), Estados Unidos
(8 %) y la India (4.6 %) (FAOSTAT, 2017). En el país, la citricultura es una actividad
de gran importancia económica y social; se realiza en poco más de medio millón de
hectáreas en regiones con clima tropical y sub-tropical en 23 entidades federativas;
en los estados de mayor producción se han reportado pérdidas hasta del 30 % en
huertos comerciales de cítricos provocados por problemas fitosanitarios (SIAP,
2018).
En el estado de Sinaloa se cultivan 2,961 hectáreas de cítricos, como son naranja,
limón, y toronja, con una producción de 12,630 toneladas anuales, lo que genera un
ingreso de 43 millones de pesos al año (SIAP, 2019). Sin embargo, la citricultura en
México se ha visto afectada por problemas fitosanitarios ocasionados por;
nematodos, virus, bacterias y hongos en distintos huertos comerciales; esto afecta
de forma significativa la producción (CESAVESIN, 2018).
La antracnosis, es una enfermedad causada por Colletotrichum, de importancia en
etapas de pre- y postcosecha a nivel mundial; la incidencia de esta enfermedad en
el cultivo puede llegar a ser del 90 % bajo condiciones favorables (He et al., 2018;
Orozco, 2006). Y afecta distintas partes vegetativas tales como; hojas, ramas
jóvenes, flores y frutos (Orozco et al., 2013; Timmer et al., 2015). En ramas jóvenes
se observan síntomas de muerte regresiva o descendente, los cuales provocan una
marchitez en el ápice de la rama, y bajo condiciones favorables se llegan a producir
cuerpos fructíferos en el tejido enfermo (acérvulos). En las hojas se presentan
3
lesiones necróticas circulares e irregulares de color marrón claro con márgenes
purpuras prominentes, éstas no son delimitadas por las nervaduras, conforme
avanza la lesión se torna de color grisáceo. En flores, las lesiones son de color café-
rojizo, en condiciones avanzadas se pueden observar cuerpos fructíferos
(acérvulos) de color rosa salmón en los pétalos. El cáliz y botones permanecen
unidos al tallo, síntoma característico de la enfermedad. En frutos, la lesión se
presenta con un color marrón oscuro a negras de forma irregular y circular con un
hundimiento de las orillas, en condiciones severas de la enfermedad se pueden
observar acérvulos anaranjados a negros en las lesiones (Aiello et al., 2014;
Perrone et al., 2016; Rhaiem et al., 2016; Timmer et al., 2015; Uysal et al., 2019).
La identificación del agente causal de la antracnosis, con frecuencia ha sido
controversial, ya que estudios anteriores han identificado al género Colletotrichum
de acuerdo a sus características fenológicas, al hospedero presente y sus síntomas
(Cai et al., 2009; Hyde et al., 2009). Estudios recientes, en los que combinan los
análisis filogenéticos multi-locus y las características fenotípicas, han contribuido al
esclarecimiento de la taxonomía de las especies crípticas pertenecientes a
Colletotrichum presentes en cítricos, las cuales han sido agrupadas en diferentes
complejos, incluso estos estudios han contribuido también al registro de nuevas
especies (Damm et al., 2012; Lima et al., 2011; Lijuan et al., 2012; Phoulivong et al.,
2010). Así mismo, estos estudios han confirmado que el marcador Apn/Mat es más
específico al identificar especies pertenecientes al complejo gloeosporioides,
comparados con otros genes concatenados que se han utilizado para la
identificación de las especies de dicho complejo (Damm et al., 2012; Douanla-Meli
4
et al., 2017; Sharma et al.,2014; 2017; Vieira et al., 2017; Vieira et al., 2019). En el
manejo de esta enfermedad se ha implementado con frecuencia el uso de fungicidas
sistémicos pertenecientes al grupo químico metil-benzimidazol-carbamatos (MBC),
y se han alternado con fungicidas de contacto pertenecientes a la clase de los
dtiocarbamatos (De Goes et al., 2008; Moreira et al., 2019; Peres et al., 2004). Los
benzimidazoles inhiben la división mitótica, ya que infieren con la polimerización de
las subunidades β-tubulina de los microtúbulos, lo que ocasiona un fallo en la
división celular, y como consecuencia la muerte celular (Peres et al., 2004; Nakaune
et al., 2007; Vela et al., 2018). La resistencia a fungicidas MBC está asociada a
mutaciones en varios de los genes que codifican para la β-tubulina, las mutaciones
más comunes y significativas se presentan en los codones 198 y 200; en el cual se
sustituye el ácido glutámico por alanina, valina o glicina en la posición 198 y la
sustitución de fenilalanina por tirosina en la posición 200 (Moreira et al., 2019; Vela
et al., 2018). Debido a las aplicaciones excesivas, se ha reportado resistencia por
parte de aislados de Colletotrichum spp. a fungicidas MBC en huertos comerciales
de cítricos en EE. UU. y Brasil (Gama et al., 2019; Peres et al., 2004).
En este estudio, se realizó la identificación molecular y fenotípica, así como las
evaluaciones de virulencia y sensibilidad a carbendazim en 35 aislados de
Colletotrichum obtenidos de huertos comerciales de cítricos en el norte de Sinaloa,
esto confirmó que las especies de Colletotrichum gloeosporioides, C. siamense y C.
karstii están asociados a la antracnosis en diversas partes vegetativas. En nuestro
trabajo se observó que los 35 aislados fueron altamente sensibles al fungicida
5
carbendazim, ya que la concentración efectiva que inhibió el 50% (CE 50) de los 35
aislados cayó en un rango de 0.034–0.769 µg mL-1 (media = 0.086 µg mL-1).
ANTECEDENTES
Cai et al. (2009) reportaron una inconsistencia en las metodologías aplicadas para
la identificación morfológica de Colletotrichum spp. ya que presenta una gran
variación morfológica.
Vieira et al. (2017) observaron en aislados de Colletotrichum spp. obtenidos de
huertos de Brasil, una uniformidad en los tamaños de conidios desarrollados en
medio de cultivo Corn Meal Agar (CMA).
Vieira et al. (2019) optimizaron el uso de marcadores moleculares para la
identificación de especies crípticas de 13 complejos de Colletotrichum, ellos
observaron que los marcadores con mayor resolución para el complejo
gloeosporioides fueron; APN2/MAT-IGS, GAP2-IGS y APN2.
En conjunto de la identificación molecular y fenológica, Guarnaccia et al. (2017)
observaron que los aislados Colletotrichum gloeosporioides, C. karstii en frutos
desprendidos de cítricos presentaron síntomas de la enfermedad, y C. acuctatum
no causó síntoma.
Silva et al. (2016) determinaron la sensibilidad de 15 aislados de Colletotrichum
gloeosporioides obtenidos en huertos de cítricos en Brasil. Ellos observaron que
ocho aislados fueron resistentes ya que presentaron crecimiento mayor al 50 % a la
dosis de 0.1 µg mL-1.
6
REVISIÓN DE LITERATURA
Cítricos (Citrus spp.)
Origen y distribución de los cítricos
Los cítricos (Citrus spp.) son originarios del trópico y subtrópico de Asia, con el paso
del tiempo éstos se han dispersado por el mundo adaptándose a diferentes lugares,
se ha reportado tipos de hibridación de manera natural entre diferentes especies de
cítricos, como resultado el surgimiento de nuevas especies, que con el tiempo se
han ido diseminado en distintos lugares (Nicolosi et al., 2000). Fruta y semilla que
se abordada en barcos fue de la manera en que se propagó a distintos lugares
(Gmitter et al.,1990).
Importancia y usos de los cítricos
La producción de cítricos es de gran importancia a nivel mundial, esta se concentra
en los países productores; China con el 32 % de la producción total, seguido de
Brasil con el 20 % de producción, India 10%, México 8 %, EE. UU. 6 % y España 5
%, a nivel mundial se obtiene una producción de cítricos de 124 millones de
toneladas al año, esta fruta se ha considerado en el mercado internacional como
una de las de mayor consumo (FAOSTAT, 2018). Desde la antigüedad se ha
producido esta fruta, colocándose en distintos mercados en el mundo, pero los
principales son el mercado de fruto fresco y el mercado de frutos procesados
(García, 2013). Otros usos que se les ha dado a los cítricos son en una gran
cantidad de medicamentos por su aporte en la formación de colágeno, huesos,
dientes y glóbulos rojos, y porque favorecen la absorción del hierro de los alimentos
y la resistencia a las infecciones entre otros beneficios (De la Rosa-Hernández et
al., 2016). Estos frutos cuentan con una característica nutricional particular; la fuerte
7
presencia de ácido ascórbico, también conocido como vitamina C (Stampella et al.,
2018).
Taxonomía
Los cítricos pertenecen a la clase Angiospermae, a la subclase Dicotyledoneae,
orden Sapindales, familia Rutaceae y al género Citrus y cuenta con más de 145
especies, entre las que se destacan la naranja (Citrus sinensis), mandarina (Citrus
reticulata), limón (Citrus limon), lima (Citrus aurantifolia) y toronja (Citrus paradisi),
éstos se cultivan en más de 135 países (USDA, 2019).
Países productores
En el 2018 la principal producción de cítricos a nivel mundial se dividió en 10 países,
el primer lugar corresponde a China, seguido de Brasil, India, México, EE.UU.,
España, Egipto, Turquía, Argentina e Italia con una producción que corresponde a
32, 20, 10, 8, 6, 5, 4, 4, 2,2.5 millones de toneladas de cítricos en el orden respectivo
(FAOSTAT, 2017).
Importancia económica
En el país, la citricultura es una actividad de gran importancia económica y social;
se realiza en 568,188 hectáreas (SIAP, 2019). La principal producción de cítricos se
da en regiones con un clima tropical y subtropical, ésta se distribuye en 23 entidades
federativas. De dicha superficie el 80 % se destina a los denominados cítricos
dulces, cuya producción el 78.22 % se destina para el mercado de EE. UU.,
colocándose como el principal mercado en el objetivo de los productores citrícolas.
Los estados de mayor producción son Veracruz (55% del total nacional), San Luis
8
Potosí y Tamaulipas, que en conjunto representan 22% de la superficie sembrada
y cosechada, así como Puebla y Nuevo León (SIAP, 2019).
Cuadro 1. Producción e ingreso de la citricultura en el país, en los últimos tres años

(SIAP, 2019).
Ciclo de Superficie Producción Derrama económica

cultivo sembrada (ha) anual (t) ($)
2017 554,507 6,603,160 12,402,971

2018 560,787 7,467,781 13,310,813
2019 568,188 8,325,183 15,127,311
Cuadro 2. Producción e ingreso anual de los cítricos cultivados en México (SIAP,

2019).
Superficie
Producción Derrama económica
Cultivo sembrada
anual (t) ($)
(ha)
Limón 207,838 2,855,806 8,989,670
Naranja 342,885 4,639,140 6,727,470
Toronja 21,294 492,331 642,847
Total 568,188 8.325,183 16,359,987
Importancia económica en Sinaloa
En el estado de Sinaloa se cultivan 2,961 hectáreas de cítricos. Los cultivos de
cítricos establecidos en el estado se conforman por variedades de naranja, limón y
toronja, con una aportación total de 17,230 toneladas anuales, lo que genera un
ingreso de 43,230 millones de pesos al año. En el cuadro 3 se describen los valores
establecidos para cada cultivo en cuanto a producción e ingresos generados al
estado en el año 2019. El cultivo de naranja predomina, con una aportación del 70%
de la superficie sembrada de cítricos, seguido del cultivo de limón que se registra
con el 28 % de la superficie total y el cultivo de toronja se posiciona el tercer lugar
9
con el 1 %. En el año 2018 la producción en toneladas de cítricos en el estado fue
la siguiente, el cultivo de naranja toma el primer lugar en producción con 14,612.82
toneladas seguido de limón con 2,371.07 t., y del cultivo de toronja que sumó 184.1
t. (SIAP, 2019).
Cuadro 3. Producción e ingreso de los cítricos cultivados en el estado de Sinaloa

en el año 2018 (SIAP, 2018).
Producción Rendimiento Derrama

Cultivo Superficie (ha)
anual (t) (t/ha) económica ($)
Limón 605 2,371.07 4.6 9,119,538

Naranja 1,500 14,612.82 9.96 33,612,116
Toronja 23 184.1 8 351999
Total 2,140 17,230.97 43,230,665
Enfermedades de cítricos
El cultivo de cítricos con frecuencia presenta diversas enfermedades que pueden
atacar distintas etapas fenológicas de la planta, presentándose en diferentes
órganos como son; hojas, flor, fruto, ramas, tallo y raíces, desde plantas en vivero
a producción postcosecha. Se han obtenido numerosas perdidas en huertos de
cítricos donde la infestación de patógenos es elevada. Las principales
enfermedades en el cultivo se llegan a observar con síntomas de; tizón de flor y
ramas, muerte descendente y ascendente, gomosis, mohos de fruto y clorosis en
hojas. Esto llega a ser provocado por hongos, bacterias, nematodos y virus (Orozco
et al., 2013; Li et al., 2018; Lee et al., 2013).
Enfermedades causadas por bacterias
En el cultivo de cítricos, las enfermedades más importantes ocasionadas por
bacterias son: cancro de los cítricos (Xanthomonas subsp. Citri) (Lanza et al., 2018),
10
huanglongbing o enverdimiento de los cítricos (Candidatus liberabacter spp.) (Li et
al., 2018) y clorosis variegada de los cítricos (Xylella fastidiosa) (Mauricio et al.,
2018).
Enfermedades causadas por nematodos
El rendimiento en la producción de cítricos llega hacer afectado por nematodos
fitopatógenos, entre los que destacan; nematodo barrenador (Radopholus similis)
este ayuda a la expansión del decaimiento de los cítricos, Belonolaimus
longicaudatus, Pratylenchus coffe y Pratylenchus brachyurus que causan lesiones
en las raíces y son fuente de entrada de múltiples hongos. Nematodo daga
(Xiphinema vulgare) se alimenta en las puntas de las raíces el cual provoca una
hinchazón, retraso del crecimiento y destrucción de las puntas. El nematodo más
común y de mayor predominancia es el nematodo de los cítricos (Tylenchulus
semipenentrans) causante de la enfermedad conocida como decaimiento lento de
los cítricos (NEMAPLEX, 2018; CABI, 2018).
Enfermedades causadas por virus y viroides
En los cítricos se presentan enfermedades ocasionadas por diferentes agentes
patógenos, algunos de estos son los virus, como es el virus de la tristeza de los
cítricos (Citrus tristeza virus) esta enfermedad es la más importantes ocasionada
por virus en los cítricos, ya que se encuentra presente en plantas de vivero y llega
afectar la calidad del fruto (Lee et al., 2013). El virus de la psorosis de los cítricos
(Citrus psorosis virus) es una de las enfermedades más comunes en estos cultivos
ya que se transmite por injertos, el daño que ocasiona no es de manera directa, ya
que provoca un decaimiento lento en la producción y calidad de frutos (Achachi et
11
al., 2014). Citrus exocortis viroid (CEVd) y Citrus cachexia viroid (CCaVd) se
encuentran en diferentes cultivos de cítricos, los síntomas en la planta son similares:
reducción de crecimiento, desprendimiento y agrietamiento de la corteza, epinastia
de hojas y grietas en el peciolo, decoloración y disminución de tamaño de la hoja.
El tipo de transmisión del viroide es mediante yemas de injerto o de manera
mecánica (Alcántara et al., 2017; SENASICA,2018).
Enfermedades causadas por hongos
En cultivos de cítricos se han reportado con frecuencia enfermedades causadas por
hongos fitopatógenos, estos han provocado diversa sintomatología en distintas
partes vegetativas de estos frutales, los cuales afectan la calidad de frutos en pre y
postcosecha (Orozco et al., 2013; Timmer et al., 2004). Algunas enfermedades
precosecha son: antracnosis (Colletotrichum spp.), mancha negra (Alternaria citri),
la mancha negra de los cítricos (Phyllosticta citricarpa), la sarna del naranjo dulce
(Elsinoe fawsettii, E. australis), la melanosis de los cítricos (Diaporthe citri), Septoria
mancha de cítricos (Septoria citri). En postcosecha algunos de las enfermedades
más importantes son: antracnosis (Colletotrichum spp.), moho verde (Penicillium
digitatum), moho agrio (Geotrichum citri-aurantii), muerte descendente
(Lasiodiplodia theobromae) (Cheng et al., 2020; Frare et al., 2018; Khanchouch et
al., 2017; Ma et al., 2016; Moraes et al., 2019;).
Colletotrichum spp.
Agente causal de la enfermedad
Los caracteres morfológicos que presenta el género Colletotrichum como color y
forma de conidios y apresorios, presencia de setas, acérvulos y caracteres
12
culturales como son el color, tiempo de crecimiento y textura de la colonia han sido
base para la identificación de especies de este género (Hyde et al., 2009; Sutton et
al.,1992). Basándose en la identificación morfológica, en el pasado se asignaba a
Colletotrichum gloeosporioides como el responsable de la antracnosis en cítricos
(Lima et al., 2011). Sin embargo, este género presenta una gran similitud entre
especies lo cual ha hecho que los caracteres morfológicos de las especies de
Colletotrichum se confirmen con el uso de herramientas moleculares, las cuales han
mejorado la identificación de la diversidad de especies del género (Damm et al.,
2012a; Douanla-Meli et al., 2017; Lima et al., 2011; Weir et al., 2012).
En el desarrollo de la investigación de las enfermedades asociadas a Colletotrichum
se han cambiado de manera constante la clasificación y conceptos que se tenían
de especies pertenecientes a este género, esto con la aplicación de análisis multi
locus, con el cual, se han asignado complejos integrados por diferentes especies
crípticas, como el complejo C. gloeosporioides (C. fructicola, C. gloeosporioides, C.
kahawae subsp. ciggaro y C. siamense) (Huang et al., 2013; Liu et al., 2016; Weir
et al., 2012), el complejo C. acutatum (C. abscissum, C. acutatum, C. citri, C.
godetiae, C. johnstonii, C. limetticola y C. simmondsii) (Damm et al., 2012a; Huang
et al., 2013; Crous et al., 2015), y el complejo C. boninense (C. boninense, C.
citricola, C. constrictum, C. karstii y C. novae-zelandiae) (Damm et al., 2012b; Huang
et al., 2013). Para la determinación de las especies de Colletotrichum se utilizaba el
conjunto de genes concatenados (ACT, BT2, CAL, CHS, GAPDH, ITS), cabe
mencionar que la secuencia del locus APN/MAT2 ha aportado una mejor resolución
filogénica para la identificación de especies del complejo gloeosporioides (Liu et
13
al.,2015; Silva et al.,2012; Vieira et al.,2017; Vieira et al., 2019; Guarnaccia et al.,
2017).
Importancia y distribución de la antracnosis
La enfermedad conocida como antracnosis es causada por el hongo Colletotrichum
spp. esta se presenta de manera constante en cultivos de cítricos, es considerada
una de las enfermedades más importante, ya que afecta diferentes partes
vegetativas en la planta como son: ramas jóvenes, hojas, flores y frutos (James et
al., 2014; Mayorquín et al., 2019). La infección en las flores por Colletotrichum spp.
provoca una abscisión en frutales y flores, presenta una manera persistente en el
cáliz de la flor, de manera común se nombran como “botones”, esta sintomatología
es clave en el diagnóstico de la enfermedad, también se refleja una pérdida en
rendimiento en producción (Timmer et al.,2004; Aiello et al., 2014).
La antracnosis es una enfermedad que se encuentra presente en los cultivos de
cítricos en el mundo. En México se encuentra presente en los estados productores
de cítricos, y estos llegan a verse afectados en un 100 % en la producción cuando
las condiciones del ambiente son favorables para el patógeno, afectando distintas
partes vegetativas en diferentes etapas fenológicas (De Silva et al., 2017; Rojo et
al.,2017; Mayorquín et al., 2019; Timmer et al., 2015).
Síntomas de la enfermedad
En cítricos, la patología conocida como antracnosis, es producida por especies del
género Colletotrichum, los síntomas de esta enfermedad se pueden observar en
distintas partes vegetativas del hospedero. En ramas jóvenes se visualiza una
marchitez del ápice de la rama produciéndose una muerte descendente, bajo
14
condiciones favorables se llegan a producir cuerpos fructíferos en el tejido enfermo
(acérvulos). En hojas, se presentan síntomas necróticos de color marrón claro de
forma más o menos circulares con márgenes purpuras prominentes, el centro de
dichas manchas se vuelve color grisáceo y en un estado de la enfermedad
avanzado se puede llegar a observar manchas negras dispersas. En flores, las
lesiones son de color naranja-rojizo, en condiciones avanzadas se producen
cuerpos fructíferos (acérvulos) de color rosa salmón en los pétalos. El cáliz y
botones permanecen adheridos al tallo, síntoma característico de la enfermedad.
En frutos, las lesiones presentan color marrón oscuro a negras, una forma irregular
y hundidas en la superficie de los frutos, en condiciones severas de la enfermedad
se puede observar acérvulos negros en las lesiones (Uysal et al., 2019; Perrone et
al., 2016; Rhaiem et al., 2016; Aiello et al., 2014; Timmer et al., 2015)
Condiciones favorables para la enfermedad
Las enfermedades conocidas como antracnosis son unos de los problemas más
comunes en una amplia gama de cultivos de regiones tropicales y subtropicales, ya
que son zonas con una alta humedad relativa y esta favorece el desarrollo del
patógeno, observándose síntomas de color marrón necrótico a color naranja en
flores, y órganos de ésta, sin embargo, flores sin abrir pueden ser afectadas. En
hojas, ramas jóvenes y frutos en las cuales al secarse se manifiestan acérvulos de
color oscuro las cuales son consideradas unas de las principales fuentes de inóculo
(Anderson et al., 2012; Aiello et al., 2014; Timmer et al., 2015). El patógeno puede
llegar a crecer en temperaturas bajas como 15°C donde presenta un desarrollo
15
lento, ya que las temperaturas bajas pueden detener un poco el proceso de
infección y producción de conidios, la temperatura óptima oscila en 24-30°C y
humedad relativa (HR) >90 % (Lima et al., 2011; Raza et al., 2020; Timmer et al.,
2015).
Manejos de la enfermedad
Control cultural de la enfermedad
La producción de cítricos se lleva a cabo en zonas agrícolas, donde se presenta
una alta humedad relativa en épocas del año, lo que favorece la dispersión y
desarrollo de la enfermedad, ocasionando daños en la producción de flores, frutos
o cosecha. La presencia de antracnosis es común en un >90 % humedad relativa,
la fruta en desarrollo es posible que presente síntomas postcosecha (Raza et al.,
2019; Rocha-Peña et al., 2009). En el manejo cultural de la enfermedad se emplean
varias prácticas como son: desinfección de herramienta de cosecha, buen manejo
de corte, transporte, empaque y almacenamiento de la fruta, con el debido cuidado
de tener en exposición del patógeno el menor tiempo, el evitar daños mecánicos
que puedan facilitar la entrada de patógenos al fruto, el manejo de podas
(eliminación de material sintomático) en diferentes temporadas del frutal, evitar
árboles en declive ya que estos son propicios a florecer fuera de ciclos. La
disminución de riegos presurizados aéreos y en algunas zonas el riego en invierno
ha evitado la producción de flores a una primavera temprana (Dowling et al., 2020;
Jaouad et al., 2020; Timmer et al., 2015).
16
Control biológico de la enfermedad
Actualmente el uso del control biológico para Colletotrichum spp. en distintos
hospederos ha ido en aumento, se ha utilizado aplicaciones de algunos
microorganismos antagónicos como Rodhotorula minuta, Bacillus spp. y
Trichoderma spp. (Ryu et al., 2014; Vos et al., 2014) estas aplicaciones se han
alternado con un manejo Bio-racional lo cual ha tenido buen resultado el uso de lo
natural, se ha implementado algunos extractos de flores de brócoli (Brassica
oleracea var. Itálica), raíces de tomillo (Gliricida sepium) y extracto de semillas de
papaya (Carica papaya) el uso del control biológico puede ayudar en la prevención
de lesiones en los hospederos (Dowling et al., 2020; Hyden et al., 2009; Landero-
Valenzuela et al., 2017; Yoshida et al., 2002). Sin embargo, es necesario mas
estudios sobre los mecanismos de biocontrol que ejercen estos organismos.
Control químico de la enfermedad
En relación a la antracnosis de los cítricos, el control químico es el más utilizado ya
que es el que presenta un mayor resultado en la reducción del daño en diferentes
partes vegetativas sintomáticas a la enfermedad. Se recomienda el uso de
fungicidas de contacto como son mancozeb, maneb o thiram que pertenecen al
grupo de los ditiocarbamatos y se utilizan en un plan de medidas preventivas, se
han reportado hasta 20 aplicaciones de estos fungicidas desde la brotación de 25
mm hasta cosecha y 8 aplicaciones de productos sistémicos (Moreira et al., 2019;
Timmer et al., 2015). Respecto a fungicidas con actividad sistémica empleados en
el control de la antracnosis de los cítricos se incluyen a los siguientes ingredientes
activos: benomilo, carbendazim y tiofanato metílico. Estos pertenecen al grupo
17
químico de los metil benzimidazol carbamatos (MBC) en el cual se ha de mostrado
en varios estudios que son eficaces en la disminución de síntomas de la enfermedad
en el cultivo, sin embargo, el patógeno ha expresado tipos de resistencia a
productos MBC, por lo tanto, el manejo y las aplicaciones de éstos han sido de
manera alterna desde el 2002 (Gama et al.,2019; De Goes et al.,2008; McGovern
et al., 2012; Peres et al., 2004; Timmer et al., 2004).
JUSTIFICACIÓN
La antracnosis causada por Colletotrichum spp., es una de las enfermedades más
importante en cítricos a nivel mundial, controlada principalmente mediante el uso de
fungicidas químicos. En México, la antracnosis en cítricos se asocia al complejo de
hongos Colletotrichum gloeosporioides y Colletotrichum acutatum. En Sinaloa no
existen publicación conocida sobre la enfermedad. Por lo que la identificación de
especies y las pruebas de sensibilidad contribuirán en un manejo de la enfermedad
y establecimiento de medidas de control para reducir pérdidas significativas en
producción.
18
OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
Identificar, mediante técnicas de caracterización morfométrica y molecular, las
especies de Colletotrichum asociadas a la antracnosis de cítricos en el norte de
Sinaloa, así como determinar su virulencia y sensibilidad al fungicida carbendazim.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Caracterizar morfológica y molecularmente a las especies de Colletotrichum

spp. asociadas a la antracnosis de cítricos en el norte de Sinaloa.
2. Determinar la virulencia de los aislados de Colletotrichum spp. en frutos de

especies de cítricos.
3. Estimar la sensibilidad in vitro de los aislados de Colletotrichum spp. al

fungicida carbendazim.
HIPÓTESIS
De las especies de Colletotrichum que ocasionan la antracnosis en huertos
comerciales de cítricos en el norte de Sinaloa, al menos una pertenece a la especie
C. gloeosporioides y presenta resistencia al fungicida carbendazim.
19
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26
CAPÍTULO I
Diversidad de especies de Colletotrichum causantes de la antracnosis de los

cítricos en el norte de Sinaloa.
RESUMEN
La antracnosis de los cítricos, es ocasionada por especies de Colletotrichum y estas

se pueden presentar atacando diversas partes vegetativas de los frutales. En el
México, la antracnosis en cítricos se ha relacionado con C. gloeosporioides y C.
acutatum. El objetivo de este estudio fue identificar las especies de Colletotrichum
asociadas a la antracnosis en huertos comerciales de cítricos en el norte de Sinaloa.
Los cuatro huertos comerciales de cítricos (Citrus spp.) fueron muestreados durante
el 2019, de los que se obtuvieron 35 aislados de muestras sintomáticas. La
virulencia de dichos aislados se evaluó y se caracterizaron mediante morfología y
análisis filogeneticos para la identificación a nivel de especie. La prueba de
patogenicidad en frutos, mostró que todos los aislados fueron capaces de inducir
lesiones típicas de antracnosis. Asimismo, mediante patogenicidad cruzada se
observó el potencial patogénico para ocasionar lesiones en diferentes especies de
cítricos de la que fueron aislados. Los resultados de la caracterización morfológica
y cultural indicaron que los aislados obtenidos pertenecen al complejo C.
gloeosporioides y C. boninense. En el análisis filogenético identificó a las especies
C. gloeosporioides y C. siamense pertenecientes al complejo C. gloeosporioides, y
a la especie C. karstii que pertenece al complejo C. boninense.
Palabras clave: Citrus spp., Colletotrichum spp., filogenia, patogenicidad
27
CHAPTER I
Diversity of Colletotrichum species causing citrus anthracnose in northem

Sinaloa.
ABSTRACT
Citrus anthracnose, is caused by Colletotrichum species and these can occur by

attacking various vegetative parts of fruit trees. In Mexico, citrus anthracnose has
been related to C. gloeosporioides and C. acutatum. The objective of this study was
to identify the Colletotrichum species associated with anthracnose in commercial
citrus orchards in northem Sinaloa. Four commercial citrus orchards (Citrus spp.)
were sampled during 2019, from which 35 isolates of symptomatic samples were
obtained. The virulence of such isolates was evaluated, and they were characterized
morphologycally and phylogenetically by means of multilocus analysis for
identification at the species level. The pathogenicity test in fruits showed that all the
isolates are capable of inducing typical anthracnose lesions. Through cross
pathogenicity, the pathogenic potential to cause lesions in different species of citrus
from which they were isolated was observed. The results of the morphological and
cultural characterization indicated that the isolates obtained belong to the C.
gloeosporioides and C. boninense complex. In the phylogenetic analysis, they were
identified the species C. gloeosporioides and C. siamense belonging to the complex
C. gloeosporioides, and the species C. karstii which belongs to the complex C.
boninense.
Keywords: Citrus spp., Colletotrichum spp., phylogeny, pathogenicity
28
INTRODUCCIÓN
La producción de cítricos (Citrus spp.) es importante a nivel mundial, ya que son
frutos de consumo cotidiano, estos se producen en zonas del trópico y subtrópicos
(Guarnaccia et al., 2017; Huang et al., 2013; Ramos et al., 2016). En el 2017, México
se posicionó en el cuarto lugar en la producción de cítricos a nivel mundial
(FAOSTAT, 2017). En el país la citricultura se realiza en más de 568,188 ha y
Sinaloa ocupa el lugar número 13 en la producción de cítricos (SIAP, 2019).
La antracnosis es una enfermada causada por Colletotrichum spp., que se presenta
en cultivos de cítricos, en pre y postcosecha. Esta se considerada una de las
enfermedades más importante en los cítricos, la cual puede afectar diferentes partes
vegetativas en la planta con sintomatología variable que dependen de las
condiciones climáticas (Peres et al., 2004; Timmer et al., 1998). En las ramas se
presenta una muerte regresiva, que provoca marchitez del ápice, bajo condiciones
favorables se llegan a producir cuerpos fructíferos (acérvulos) en el tejido enfermo;
en hojas, se presentan síntomas necróticos de color marrón claro, de forma más o
menos circulares con márgenes púrpuras prominentes, con centro de color
grisáceo, y en la fase posterior de la enfermedad se pueden llegar a observar
manchas negras dispersas; en flores, las lesiones son de color café-rojizo, en
condiciones avanzadas los pétalos presentan acérvulos de color salmón, el cáliz y
los botones permanecen unidos al tallo, síntoma característico de la enfermedad, y
en frutos, se presentan lesiones de color marrón oscuro a negras de forma más o
menos circular con hundimiento en las orillas, en condiciones severas de la
enfermedad se puede observar acérvulos negros en las lesiones (Mayorquin et al.,
29
2019; James et al., 2014; Uysal et al., 2019; Perrone et al., 2016; Rhaiem et al.,
2016; Aiello et al., 2014; Frare et al., 2018; Timmer et al., 2015).
La identificación del agente causal de la antracnosis ha sido controversial, en
ocasiones anteriores se ha identificado a Colletotrichum de manera morfológica, de
acuerdo al hospedero y sus síntomas, cuyas especies se habían clasificado como
C. gloeosporioides o C. acutatum (Hyde et al., 2009). Estudios recientes, en los que
combinan los análisis filogenéticos multi-locus y las características fenotípicas, han
contribuido al esclarecimiento de la taxonomía de las especies de Colletotrichum
presentes en cítricos, las cuales han sido agrupadas en diferentes complejos,
incluso estos estudios han contribuido también al registro de nuevas especies
(Damm et al., 2012; Lima et al., 2011; Phoulivong et al., 2010; Lijuan et al.,2012).
Así mismo, estos estudios han confirmado que el marcador Apn/Mat es más
específico al identificar especies pertenecientes al complejo gloeosporioides,
comparados con otros genes concatenados que se han utilizado para la
identificación de las especies de dicho complejo (Sharma et al.,2014; 2017; Vieira
et al., 2017; Damm et al., 2012; Douanla-Meli et al., 2017; Vieira et al., 2019).
Mientras que para la identificación de las especies del complejo boninense los
marcadores CAL, TUB2 y GAPDH son los más recomendables (Damm et al., 2012b;
Vieira et al.,2019).
En este estudio, se realizó la identificación molecular y fenotípicas, así como las
evaluaciones de la virulencia de 35 aislados de Colletotrichum obtenidos de huertos
comerciales de cítricos en el norte de Sinaloa, esto confirmó que las especies de
30
Colletotrichum gloeosporioides, C. siamense y C. karstii están asociados a la
antracnosis en diversas partes vegetativas.
MATERIALES Y MÉTODOS
Colecta de muestras
Durante el transcurso del año 2019, se recolectaron muestras de material vegetativo
(ramas, hojas, flores y frutos) con síntomas de antracnosis (Figura 1).
Especies de cítricos como limón mexicano, limón persa, toronja y naranja fueron
muestreados en los municipios de Ahome, El Fuerte y Guasave, Sinaloa.
Figura 1. Síntomas de antracnosis causados por Colletotrichum spp. en tejido de
31
cítricos. A, B) Hojas con síntomas de necrosis irregular con halo color amarillento
alrededor en limón persa. C-E) Necrosis en brotes jóvenes, tizón de flores y necrosis
irregular y hundida en fruto de limón mexicano. F, G) Necrosis en brotes jóvenes,
necrosis irregulares y hundidas en fruto de toronja. H, I) tizón de flores y necrosis
irregulares y hundidas en fruto de naranja.
Aislamiento y purificación
La obtención de aislados de Colletotrichum spp. fue con base en la metodología
descrita por Huang et al. (2013) y por Frare et al. (2016). Cortes de 5 x 5 mm
tomados de diferentes tejidos infectados, procurando tomar parte sana e infectada,
se insertaron con navajas previamente desinfectadas; los cortes obtenidos se
desinfectaron por inmersión en hipoclorito de sodio al 3% (v:v) durante 2 min, se
enjuagaron tres veces con aguada destilada estéril y se secaron con papel
absorbente estéril. Los cortes desinfectados y secos se depositaron en cajas Petri
con medio papa dextrosa agar (PDA) con estreptomicina (100 µg mL-1), estas se
sellaron con parafilm y se incubación durante cinco días en total oscuridad a 28 °C.
Los cultivos monoconidiales se realizaron de acuerdo a la metodología descrita por
Gindin et al. (2000), con algunas modificaciones. Un conidio germinado en agar
agua (AA) se tomó y se transfirió a una caja Petri con medio PDA, bajo condiciones
asépticas.
Los aislados obtenidos se preservaron en glicerol al 20% a -4 °C en el Laboratorio
de Biotecnología, de la Universidad Autónoma de Occidente, Unidad Regional Los
Mochis.
32
Caracterización morfológica y cultural
Las muestras conservadas en glicerol al 20% se reactivaron y del crecimiento de
éstas se transfirió un disco de medio + micelio a una caja Petri con PDA, los que se
incubaron a 28°C en total oscuridad durante seis días, con el objetivo de inducir la
formación de caracteres micro y macroscópicos de los aislados de Colletotrichum
de cítricos.
Para determinar la tasa de crecimiento, se transfirieron a cajas Petri con PDA y MEA
(malt extract agar) discos de 5 mm de diámetro de cada aislado, éstos se tomaron
del punto de crecimiento de una colonia de seis días. Los aislados se incubaron
nuevamente a 28°C en total oscuridad por seis días. Las mediciones del diámetro
de crecimiento de la colonia se realizaron de manera perpendicular, estos datos se
tomaron cada 24 h durante seis días. Se analizaron tres repeticiones de cultivo de
cada aislado. En el periodo de incubación se medió el diámetro micelial de cada
colonia para determinar la tasa de crecimiento lineal y= k x + c (donde y es la
distancia, x es el tiempo y c el factor constante) y se expresó en milímetros por día
(mm día-1) (Zervakis et al., 2001). Las colonias de seis días de desarrollo se
caracterizaron de manera visual, se registró el color y forma de colonia y masas
conidiales. El experimento se realizó dos veces.
Para examinar la morfología de los conidios, se realizaron montajes de esporas en
ácido láctico, a partir de colonias de 10 días de crecimiento. Los conidios se
observaron en un microscopio (Axio Imager M2; Carl Zeiss, Gottingen, Germany)
para determinar la forma y el tamaño (largo y ancho), se midieron 50 conidios de
33
cada especie de Colletotrichum. Se calculó la media y desviación estándar para los
conidios de cada aislado.
Extracción de ADN, amplificación por PCR y secuenciación
El ADN de cada aislado, se extrajo de acuerdo al método de bromuro de cetil-
trimetril-amonio (CTAB), descrito por Doyle et al. (1991), con algunas
modificaciones. Para ello, los aislados se cultivaron en medio PDA por ocho días a
28°C en total oscuridad. Una pequeña cantidad de micelio aéreo se recuperó, en
tubos de microcentrífuga de 1.6 mL, mediante pequeños raspados a la colonia con
bisturíes estériles, el micelio se suspendió en 800 mL de solución CTAB al (2 % + 1
% de 2-Mercaptoetanol) y se maceró con pistilos estériles. Los microtubos se
pasaron por vórtex y se incubaron a 70°C durante 10 min, se centrifugaron durante
10 min a 12,000 rpm, se recuperó el sobrenadante, al que se le agregó 300 µL de
cloroformo, se mezcló en vórtex por 10 s y se centrifugó durante 10 min, se transfirió
el sobrenadante a un nuevo microtubo estéril y se agregó 0.7 volúmenes de
isopropanol, se mezcló por inversión y se incubó durante 10 min a temperatura
ambiente, después se centrifugó durante 10 min a 12,000 rpm. El sobrenadante se
decantó y se agregó etanol frio al 70%, se mezcló por vórtex y se centrifugó de
nuevo durante 10 min a 12,000 rpm, se decantó el sobrenadante. La pastilla se dejó
secar, durante 1 h dentro de una campana de flujo laminar, y se resuspendió en 30
µL de agua libre de nucleasas.
La integridad de ADN se corroboró por electroforesis en geles de agarosa al 0.8%
(p:v), teñido con bromuro de etidio, con buffer de corrida TAE 1 X, por 45 minutos a
34
90 volts. La calidad y concentración se midió por espectrofotometría con la
utilización de un nanodrop. Los valores de las relaciones 260/280 y 230/280 se
registraron. Al final el ADN se almacenó a - 4°C para su posterior uso.
El ADN de cada aislado se utilizó como templado para la amplificación de los genes
de interés por PCR con los iniciadores descritos en el Cuadro 1. La mezcla de
reacción se preparó a un volumen final de 25 μL; buffer de PCR 1x; 2.5 mM MgCl2;
0.2 mM dNTP; 0.8 μM de cada iniciador; 0.5 U de Taq ADN polimerasa (Invitrogen®
cat. no. 10342-020) y ~ 10 ng de ADN. La amplificación se llevó a cabo en un
termociclador (Apollo ATC 201, Bimedis, San Diego, California), con las siguientes
condiciones; desnaturalización inicial de 95 ºC 5 min, 35 ciclos de 95 ºC 40 s, 57 o
62 ºC 30 s, 72 ºC 1 min; y extensión final de 72 ºC por 5 min.
Del producto de PCR, se utilizaron 3 μL para electroforesis en un gel agarosa al 2
% teñido con bromuro de etidio, buffer de corrida TAE 1 X, por 45 minutos a 90 volts.
El producto de la amplificación se visualizó en un fotodocumentador (Gel Doc XR+
Gel Documentation System, Bio-Rad®).
35
Cuadro 1. Nombres de oligonucleótidos utilizados, secuencias, fragmentos (pb),
gen, temperatura de fusión (TM), Referencia de los iniciadores utilizados para la
identificación de diferentes especies de Colletotrichum.
Nombre Secuencia 5´-3’ Fragmento Gen Tm (°C) Referencia
(pb)
GDF GCCGTCAACGA ~ 277 GAPDH 57 Templeton
CCCCTTCATTG et al. (1992)
A
GDR GGGTGGAGTC
GTACTTGAGCA
TGT
CgDLF6 AGTGGAGGTGC ~ 877 APN2MAT 57 Rojas et al.
GGGACGTT (2010)
CgMAT1F2 TGATGTATCCC
GACTACCG
CL1 GARTWCAAGG ~ 650 Calmodulina 62 O'Donnell et
AGGCCTTCTC al. (2000)
CL2 TTTTTGCATCAT
GAGTTGGAC
Aproximadamente un volumen de ~ 20 µL se envió a servicio de purificación y

secuenciación a MACROGEN-Inc, Korea.
Análisis filogenético
La calidad de las secuencias de nucleótidos ensamblados se realizó usando el
paquete Staden (Staden et al., 1998). Los alineamientos multiples de secuencias de
cada gen se llevó a cabo usando ClustalW en MEGA 7 (Kumar et al., 2016), y fueron
manualmente ajustadas para permitir la máxima similaridad de secuencias. Las
estimaciones filogenéticas Bayesianas se infirieron con MrBayes 3.2.6 (Ronquist et
al., 2012) implementadas en CIPRES cluster
(https://www.phylo.org/portal2/home.action) usando el mejor modelo ajustado de
sustitución de nucleótidos seleccionado de acuerdo a AICc mediante MrModeltest
2.3 (Nylander, 2004). Cuatro corridas paralelas se realizaron con una fria y 3
36
calientes cadenas de Markov Monte Carlo (MCMC) en búsqueda por corrida de 5 ×
106 generaciones, muestreando cada 1000 generaciones. Las probabilidades
posteriores (PP) se calcularon después de descartar las primeras 25% de
generaciones. El árbol filogenético se visualizó con TreeView (Page, 1996).
Prueba de patogenicidad
Las pruebas de patogenicidad de aislados de Colletotrichum se realizaron en frutos
correspondientes a cada una de las especies de los cítricos. Cuarenta y cuatro
frutos se lavaron en agua corriente; se desinfectaron en hipoclorito de sodio al 1 %
durante 2 min; se asperjaron con etanol al 70 %, se enjuagaron con agua destilada
estéril dos veces y se secaron con papel absorbente estéril. Después se realizaron
tres heridas a cada fruto, a excepción del limón mexicano, que se realizó una herida
por fruto, para esto se utilizó un palito de madera estéril (0.5 mm de diámetro), en
la que se depositó 25 µL de una suspensión de conidios (105 esporas mL-1) del
aislado. Ocho frutos con herida se inocularon solo con agua destilada estéril, los
cuales sirvieron como testigos. Todos los frutos se incubaron a 28°C en charolas de
plástico sobre una base de cartón estéril, debajo de éstas se colocaron cinco capas
de papel humedecido con agua destilada estéril. Después de 10 días de incubación,
se registró la presencia de lesiones en frutos.
Patogenicidad cruzada
Con la finalidad de observar la capacidad de patogenicidad que tienen los aislados
de Colletotrichum obtenidos de cuatro diferentes especies de cítricos, se tomó el
aislamiento obtenido de una especie de cítrico, y se inóculo en frutos de diferentes
cítricos. Los frutos se desinfectaron de manera similar a la prueba de patogenicidad
37
en su hospedero, éstos se inocularon con 25 µL de suspensión de conidios (105
esporas mL-1), previo a esto se realizó una herida (0.5 mm de diámetro) con un
palillo de madera. Dos aislados por fruta se inocularon con tres repeticiones. Todos
los frutos se incubaron a 28°C en charolas de plástico, dentro de esta el fruto era
sostenido en con una base de cartón estéril. Después de 10 días de incubación, se
registró la presencia de lesiones en frutos.
RESULTADOS
Obtención de aislados
El total de 35 aislados se obtuvieron de cuatro huertos comerciales de diferentes
especies de cítricos; limón mexicano (Citrus aurantifolia), limón persa (Citrus
latifolia), naranja (Citrus sinensis) y toronja (Citrus paradisi), ubicados en diferentes
municipios del norte de Sinaloa (Cuadro 2) los aislados presentaron características
similares a las del género Colletotrichum.
Cuadro 2. Código de aislado, localidad, tejido infectado y especie de cítricos con
síntomas de antracnosis.
Código de
Número Localidad Parte vegetativa Cultivo
aislado
1 FAVF 350 Guasave Hoja Limón persa
2 FAVF 351 Guasave Fruto Limón persa
4 FAVF 353 Guasave Ramas Limón persa
6 FAVF 355 El Fuerte Flor Limón mexicano
7 FAVF 356 El Fuerte Ramas Limón mexicano
8 FAVF 357 El Fuerte Flor Limón mexicano
11 FAVF 360 El Fuerte Hoja Limón mexicano
38
14 FAVF 363 El Fuerte Hoja Naranja
15 FAVF 364 El Fuerte Ramas Naranja
16 FAVF 365 El Fuerte Fruto Naranja
18 FAVF 367 El Fuerte Flor Naranja
23 FAVF 372 El Fuerte Flor Naranja
26 FAVF 375 Ahome Fruto Toronja
28 FAVF 377 Ahome Ramas Toronja
29 FAVF 378 Ahome Ramas Toronja
31 FAVF 380 Ahome Hoja Toronja
Los aislados se utilizaron para futura caracterización fenotípica, patogénica y
análisis de secuencias Apn/MAT.
Caracterización morfológica y cultural
Los resultados de las características morfológicas de las colonias de los 35
aislados de Colletotrichum spp. obtenidos de cítricos, en el norte de Sinaloa, se
muestran en el Cuadro 3.
39
Cuadro 3. Características morfológicas y culturales de 35 aislados de
Colletotrichum obtenidos de tejido sintomático con antracnosis en huertos
comerciales de cítricos en el norte de Sinaloa.
Colonia Conidios (n=50)

Aislado Color TCa (mm dia-1) Ancho (µm)
Longitud (µm)
PDAb MEAc PDA MEA media (min- Forma
media (min- max)
max)
FAVF Bed Be 13.89 14 11.24-15.52(12.95) 4.25-6.54(5.20) Cilíndrica
350
FAVF
Sf B 11.94 11.41 14.41-14.72 (14.69) 5.21-6.57 (5.96) Cilíndrica
351
FAVF
Gg B 10.16 12 14.95-15.83 (14.52) 4.31-6.49 (5.53) Cilíndrica
352
FAVF
Be Be 14 11.76 11.85-12.79 (12.51) 4.01-5.19 (4.75) Cilíndrica
353
FAVF
S S 9.64 9.47 11.7-14.92 (13.30) 5.56-6.87 (6.16) Cilíndrica
354
FAVF
B B 9.3 9.8 11.19-14.02 (12.57) 5.57-7.56 (6.29) Cilíndrica
355
FAVF
G B 14 11.37 1036-12.92 (12.56) 6.24-7.2 (6.67) Cilíndrica
356
FAVF
Be Be 14 11.25 14.03-16.19 (14.29) 5.09-7.09 (5.94) Cilíndrica
357
FAVF
B S 14 11.8 11.98-17.16 (13.06) 5.14-5.23 (5.16) Cilíndrica
358
FAVF
B B 10.74 11.12 10.18-15.98 (14.12) 5.32-5.44 (5.37) Cilíndrica
359
FAVF
Be Be 8.65 11.45 11.47-12.18 (12.18) 5.47-5.67 (5.55) Cilíndrica
360
FAVF
B S 11.71 12.01 12.22-12.54 (12.40) 4.21-4.50 (4.32) Cilíndrica
361
FAVF
B B 14 14 12.55-12.95 (12.95) 4.58-4.85 (4.71) Cilíndrica
362
FAVF
S S 10.43 12.19 13.02-13.24 (13.18) 4.86-5.05 (4.95) Cilíndrica
363
FAVF
G B 11.4 11.2 13.02-13.52 (13.46) 5.67-5.90 (5.75) Cilíndrica
364
FAVF
G G 11.69 11.01 13.14-13.74 (13.49) 5.24-5.47 (5.33) Cilíndrica
365
FAVF
G G 9.87 10.31 13.82-14.22 (14.04) 5.47-5.61 (5.54) Cilíndrica
366
FAVF
B S 11.89 11.34 14.32-14.46(14.40) 5.63-5.73 (5.67) Cilíndrica
367
FAVF
B B 13.54 12.47 14.52-14.63(14.57) 5.94-6.06 (6.00) Cilíndrica
368
40
FAVF
Be S 11.84 10.89 14.68-14.96(14.83) 6.07-6.16 (6.13) Cilíndrica
369
FAVF
G Be 11.24 10.45 14.98-15.20(15.09) 6.19-6.30 (6.22) Cilíndrica
370
FAVF
Be S 11.2 10.65 15.25-15.44(15.34) 6.32-6.43 (6.37) Cilíndrica
371
FAVF
G S 10.21 9.47 15.67-16(15.82) 6.57-7.02 (6.85) Cilíndrica
372
FAVF
B S 11.74 10.22 16.12-16.99 (16.50) 7.15-7.56 (7.36) Cilíndrica
373
FAVF
G S 9.45 10.35 14.41-16.36(15.46) 5.39-6.47(5.94) Cilíndrica
374
FAVF
G S 10.76 10.8 14.36-15.12(14.88) 5.10-6.39(5.27) Cilíndrica
375
FAVF
B B 10.46 11.4 15.28-16.74(15.74) 6.31-7.49(6.81) Cilíndrica
376
FAVF
G Be 14 13.74 13.02-13.52 (13.46) 5.96-6.00 (5.97) Cilíndrica
377
FAVF
S S 10.34 9.3 13.57-13.66 (13.64) 6.04-6.49 (6.22) Cilíndrica
378
FAVF
B B 14 11.15 13.66-13.96 (13.91) 6.63-7.24 (6.82) Cilíndrica
379
FAVF
B B 9.86 12.11 14.02-14.37(14.22) 5.96-6.00 (6.22) Cilíndrica
380
FAVF
G S 11.12 11.49 13.92-14.22 (14.20) 6.11-6.35(6.21) Cilíndrica
381
FAVF
Be B 9.47 9.59 10.57-14.49(13.37) 6.04-6.49 (6.20) Cilíndrica
382
FAVF
S S 9.58 10.24 11.24-13.64(12.39) 6.32-7.67(6.83) Cilíndrica
383
FAVF
B B 11.94 11.07 11.10-14.52 12.846 6.63-7.24 (6.82) Cilíndrica
384
a= Tasa de crecimiento micelial (incubación a 28°C en oscuridad continua).

b= Medio de cultivo papa dextrosa agar (incubación a 28°C en oscuridad continua).
c= Medio de cultivo extracto de malta agar (incubación a 28°C en oscuridad
continua).
d= Color beige
e= Color blanco
f= Color salmon
g= Color gris
41
En medio de cultivo PDA, las colonias mostraron crecimiento denso, de color blanco
a gris y algunas de color salmón (Figura 2), con una tasa de crecimiento micelial de
8.65 a 14 mm dia-1(media= 11.49 mm dia-1) (Cuadro 3). Por otro lado, en medio de
cultivo MEA, las colonias presentaron una tasa de crecimiento micelial que oscilo
de 9.03 a 14 mm dia-1(media= 11.23 mm dia-1) (Cuadro 3); además el tipo de colonia
también varío ya que presentaron coloración blanco, beige y gris (Figura 3). Los
caracteres obtenidos del crecimiento de las colonias no pudieron ser comparados,
por la gran variación e inconsistencia de metodologías sugeridas en diversos
estudios de especies de Colletotrichum (Cai et al., 2009).
A) B) C)
Figura 2. Colonias con seis días de crecimiento en medio de cultivo papa dextrosa
agar (PDA). A) Colletotrichum gloeosporioides, B) C. siamense, y C) C. karstii.
aislados de tejido de cítricos con síntomas de antracnosis.
42
A) B) C)
Figura 3. Colonias con seis días de crecimiento en medio de cultivo extracto de

malta agar (MEA). A) C. gloeosporioides, B) C. siamense, y C) C. karstii, aislados
de tejido de cítricos con síntomas de antracnosis.
Todos los aislados presentaron conidios hialinos, unicelulares, cilíndricos, con
extremos redondeados (Figura 4) con un intervalo de la medición de largo y ancho
de conidio de 11.11 – 16.99 x 3.74- 7.56 µm.
Figura 4. Conidios formados en medio de cultivo papa dextrosa agar (PDA) después
de 8 días de incubación a 28°C en total oscuridad. A) C. gloeosporioides, B) C.
siamense y C) C. karstii.
43
En este estudio de identificación morfológica se midieron 50 conidios (largo y ancho)
de cada aislado de Colletotrichum, en la mayoría de la forma de los conidios se
observó similitud en especies del complejo gloeosporioides, sin embargo, un aislado
difirió del resto con algunas mediciones poco más pequeñas en largo y ancho, estas
características se relacionan al complejo boninense.
Análisis filogenético
La identidad de los 35 aislados se corroboró por análisis filogenético concatenado,
con diferentes marcadores, GPDH y Apn/MAT IGS para el complejo
gloeosporioides, mientras que para el complejo boninense GPDH y Cal, Cuadro 4.,
cuyas secuencias fueron depositadas en el GenBank.
Cuadro 4. Sitios de recolección de aislados de Colletotrichum spp. en partes

vegetativas con síntomas de antracnosis en especies de cítricos del norte de
Sinaloa.
Código de Especie de
Localidad Cultivo
aislado Colletotrichum
FAVF 350 Guasave Limón persa C. siamense
FAVF 352 Guasave Limón persa C. gloeosporioides
FAVF 355 El Fuerte Limón mexicano C. siamense
FAVF 363 El Fuerte Naranja C. gloeosporioides
44
FAVF 375 Ahome Toronja C. gloeosporioides
FAVF 376 Ahome Toronja C. siamense
FAVF 382 Ahome Toronja C. karstii
La especie que tuvo mayor presencia fue Colletotrichum siamense con 18 aislados
(51%), de acuerdo al análisis de secuencias Apn/MAT IGS. Esta especie no se
presentó en algún hospedero o alguna parte vegetativa específica, ya que se
encontró disperso en diferentes áreas y hospederos. En el mismo sentido, se tuvo
de C. gloeosporioides 16 aislados (46%), la cual no fue encontrada en alguno
hospedero específico, observándose síntomas en distintos hospederos y partes
vegetativas de éstos. Por otro lado, se obtuvo un aislado de la especie C. kastrii
(3%), de fruto de toronja.
Prueba de patogenicidad
Después de 10 días de la inoculación, todos los frutos presentaron lesiones
necróticas circulares ligeramente hundidas en el pericarpio, después se observaron
45
masas de esporas color naranja o salmón sobre algunas lesiones (Figura 5), lo que
confirmó la patogenicidad de los 35 aislados de Colletotrichum.
Figura 5. Lesiones necróticas y hundidas típicas de antracnosis en frutos de

cítricos. A) toronja, (B) naranja, (C) limón persa, (D) limón mexicano. Resultado
obtenido de la prueba de patogenicidad de diferentes aislados de Colletotrichum
spp. a diez días después de la inoculación artificial con una suspensión de 1x105
conidios mL-1.
Los resultados obtenidos en este estudio, confirman que las especies
Colletotrichum gloeosporioides, C. siamense y C. karstii son los causantes de esta
patología en distintas especies de cítricos en el norte de Sinaloa. En este
experimento hubo diferencia en el diámetro de la lesión en los frutos inoculados, C.
gloeosporioides tuvo un diámetro de 10.2 mm y C. siamense fue menos virulento ya
que tuvo un diámetro de 6.5 mm en la lesión (Figura 6).
46
Aislados de Colletotrichum spp.
14.00
12.00
Tamaño de lesión (mm)
10.00
8.00
6.00
4.00
2.00
0.00
C. gloeosporioides C. siamense
Figura 6. Diámetro medio de la lesión (mm) causada por tres especies de

Colletotrichum asociadas con antracnosis de cítricos en México, 10 días después
de la inoculación con herida más 25 µL de suspensión con conidios. Barras sobre
columnas son el error estándar.
Patogenicidad cruzada
Después de 10 días de la inoculación, algunos frutos presentaron lesiones
necróticas circulares ligeramente hundidas en el pericarpio, después se observaron
masas de esporas color naranja o salmón sobre algunas lesiones (Figura 7), lo que
confirmó la capacidad de los aislados de ocasionar síntomas en hospederos
distintos al de su origen.
47
Figura 7. Síntomas de antracnosis en diferentes especies de cítricos A) limón
mexicano, B) limón persa, C) naranja, D) toronja.
Cabe mencionar que, en la patogenicidad cruzada, 9 aislados del total de 35
provocaron síntomas en distintos hospederos del que fueron aislados (Cuadro 5),
se confirmó la capacidad de inducir síntomas en distintos hospederos con los
aislado de diversas especies de Colletotrichum en obtenidos en huertos comerciales
de cítricos en el norte de Sinaloa.
48
Cuadro 5. Relación de aislados patogénicos en distintos frutos de cítricos
(inoculación cruzada).
Especie de cítrico (fruto)

limón limón
Aislado naranja toronja
persa mex.
FAVF 350 - x ✓ x
FAVF 351 - x x x
FAVF 352 - x x x
FAVF 353 - x x x
FAVF 354 - ✓ x x
FAVF 355 x - x x
FAVF 356 x - x x
FAVF 357 x - ✓ ✓
FAVF 358 x - x x
FAVF 359 x - ✓ x
FAVF 360 x - x x
FAVF 361 x - x x
FAVF 362 x - x x
FAVF 363 ✓ ✓ - x
FAVF 364 x x - x
FAVF 365 x x - x
FAVF 366 x x - ✓
FAVF 367 x x - x
FAVF 368 ✓ x - ✓
FAVF 369 x x - x
FAVF 370 x x - x
FAVF 371 x x - x
FAVF 372 x x - x
FAVF 373 x x - x
FAVF 374 x x - x
FAVF 375 ✓ x ✓ -
FAVF 376 x x x -
FAVF 377 x x x -
FAVF 378 x x x -
FAVF 379 x x x -
FAVF 380 x x x -
FAVF 381 x x x -
FAVF 382 x x x -
FAVF 383 x x x -
FAVF 384 x x ✓ -
49
DISCUSIÓN
En este estudio se obtuvieron y caracterizaron por morfología, un total de 35
aislados de Colletotrichum con presencia de antracnosis en cítricos (toronja,
naranja, limón persa y limón mexicano) en diferentes huertos comerciales del norte
de Sinaloa. Los resultados obtenidos en los diferentes medios de cultivos fueron
diversos; en medio de cultivo PDA las colonias obtenidas de C. gloeosporioides
presentaron un crecimiento denso, de color blanco–gris, y alguno color salmón en
el medio, una tasa de crecimiento micelial fluctuó en rango y media; 9.45–14 mm
dia-1 (media= 11.67 mm dia-1), mientras que los conidios midieron 11.85–16.99x
4.01–7.56 µm en largo y ancho, en la mayoría de los conidios se presentó una forma
de cilindro, hialino, unicelulares con extremos redondeados, estos caracteres
morfológicos son similares con trabajos reportados por Rhaiem et al. (2016), Oo et
al. (2018) y Weir et al. (2012). En contraste, se obtuvo un aislado del cual las
características morfológicas difirieron del resto de lo aislados, éste presentó un
crecimiento de 13.14 mm dia-1, mientras que los conidios midieron 10.19–13.65 x
3.14–6.53 µm, los datos obtenidos de este aislado se relacionan con el complejo C.
boninense ya que presentan un tamaño ligeramente menor al complejo
gloeosporioides, estos datos coinciden con lo reportado con Damm et al. (2012) De
Silva et al. (2019) y Uysal et al. (2019). Sin embargo, la similitud morfológica de
estos complejos, y la existente variabilidad en metodológica para identificación
morfológica de especies de Colletotrichum presenta una inseguridad e
inconsistencia como lo reportó Cai et al. (2009).
50
Para nuestro análisis filogenético de 35 aislados se utilizó el marcador GPDH para
separar complejos, y el marcador Apn/Mat para la identificación de especies dentro
del complejo C. gloeosporioides, como resultado reveló la presencia de 16 aislados
de la especie C. gloeosporioides y 18 aislados de C. siamense, los cuales
pertenecen al complejo C. gloeosporioides. Datos similares se han reportado en
diversos estudios, ya que el marcador Apn/Mat aporta una buena especificad en la
identificación de especies dentro del complejo C. gloeosporioides (Sharma et al.,
2014, 2017; Vieira et al., 2017). Por otro lado, mediante el uso de los marcadores
GPDH y Calmodulina (CAL), indicó que uno de los 35 aislados correspondío a la
especie C. karstii, la cual pertenece al complejo C. boninense, esto coincide con
trabajos similares en los cuales reportan el uso de estos marcadores para la
identificación de especies del complejo boninense (Damm et al., 2012; Douanla-Meli
et al., 2017; Vieira et al., 2019). Estos marcadores asociaron estas especies a los
síntomas de antracnosis en cítricos en el norte de Sinaloa.
Los resultados de la prueba de patogenicidad confirmaron que las especies de C.
gloeosporioides, C. siamense y C. karstii son las causantes de la antracnosis de los
cítricos presentes en huertos en el norte de Sinaloa. En este trabajo, C.
gloeosporioides presentó una mayor virulencia después de haberse inoculado una
suspensión del patógeno en frutos, a los 10 días posteriores se observaron
síntomas de lesiones necróticas, circulares hundidas en el pericarpio de la fruta de
cada hospedante, se observaron masas de esporas color naranja o salmón sobre
algunas lesiones, estos resultados se asemejan con algunos estudios, donde C.
gloeosporioides presentó una mayor virulencia que C. karstii, observándose
51
síntomas bien diferenciados en poco tiempo (Aiello et al., 2014; Huang et al., 2013;
Guarnaccia et al., 2017; Rhaiemet al., 2016). Estos resultados discrepan de algunos
estudios, donde reportan a C. karstii como un patógeno con mayor virulencia que
C. gloeosporioides en limón (Aiello et al., 2014; Guarnaccia et al., 2017), ya que se
obtuvieron resultados con mayor significancia para C. gloeosporioides y C.
siamense en la prueba de patogenicidad cruzada, y C. karstii no presentó síntomas
en otros frutos, esto quizás porque fue aislado de hojas de toronja (Ben et al., 2019;
Lijuan et al., 2012; Ramos et al., 2016). Por otro lado, C. siamense presentó
síntomas en el resto de los frutos aparte del de su hospedante, esto se asemeja con
lo reportado por Phoulivong et al. (2012), quienes describieron a detalle la
patogenicidad cruzada de especies de Colletotrichum incluyendo naranja. En el
mismo sentido, C. gloeosporioides presentó síntomas bien marcados en diferentes
frutos, de manera similar a lo reportado por Ramos et al. (2016) y Sanders et al.
(2003).
En este estudio se determinó la virulencia de las especies de C. gloeosporioides, C.
siamense y C. karstii causantes de la antracnosis de cítricos en el norte de Sinaloa.
Sin embargo, la antracnosis es una enfermedad latente, en la cual el grado de
virulencia de esta patología puede ser variable, ya que depende de diversos factores
como temperatura, humedad relativa, tipo de hospedante y parte vegetativa (fruto,
hoja, flor, ramas) (Giblin et al., 2010; Lima et al.,2011; Sanders et al., 2003). Son
necesarios más estudios sobre el desarrollo y tipos de propagación de la
enfermedad causada por especies de Colletotrichum en el norte de Sinaloa, con el
objetivo de reforzar el conocimiento existente del agente causal de la antracnosis y
52
sus implicaciones en la producción de cítricos, y así poder definir estrategias de
manejo para la enfermedad.
CONCLUSIONES
La caracterización morfológica y cultural indicó que 34 aislados obtenidos de tejidos
de cítricos con síntomas de antracnosis pertenecen al complejo C. gloeosporioides
y un aislado al complejo C. boninense. Sin embargo, los caracteres morfológicos
de las colonias, no fueron útiles para determinar las especies pertenecientes a los
complejos.
El análisis filogenético reveló que las especies C. gloeosporioides, C. siamense y
C. karstii son las especies asociadas de los síntomas de antracnosis en los cítricos
en el norte de Sinaloa.
Las pruebas de patogenicidad confirmaron que C. gloeosporioides, C. siamense y
C. karstii son las especies responsables de causar la antracnosis en huertos
comerciales de cítricos en el norte de Sinaloa.
53
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58
CAPÍTULO II
Sensibilidad a carbendazim en aislados de Colletotrichum spp. causantes de

la antracnosis de los cítricos en el norte de Sinaloa.
RESUMEN
La antracnosis, causada por Colletotrichum spp., es una de las enfermedades de

mayor importancia en la producción de cítricos, y es controlada de manera principal
mediante el uso de fungicidas sistémicos pertenecientes al grupo metil-
benzimidazol-carbamatos (MBC). En el norte de Sinaloa, esta enfermedad es
causada por C. gloeosporioides, C. siamense y C. karstii. El objetivo de este estudio
fue determinar la sensibilidad in vitro al fungicida carbendazim en 35 aislados
pertenecientes a especies de los complejos C. gloeosporioides y C. boninense. Los
aislados fúngicos se recolectaron en cuatro huertos comerciales de cítricos
localizados en los municipios de Ahome, El Fuerte y Guasave, Sinaloa. Las
concentraciones evaluadas del fungicida fueron 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5 y 1 µg
mL-1. Placas Petri con medio de cultivo sin fungicida se usaron como testigo. La
sensibilidad al fungicida se determinó con base en la estimación de la concentración
efectiva que inhibe el 50% del crecimiento micelial (CE50) para cada combinación
aislado-fungicida. Los aislados presentaron valores de CE50 que variaron de 0.034–
0.769 µg mL-1 (media = 0.086 µg mL-1). El crecimiento de ningún aislado fue
significativo en la máxima concentración evaluada (1 µg mL-1), lo cual indicó que
existe una alta sensibilidad a carbendazim (MBC) en aislados de complejos de
Colletotrichum gloeosporioides y C. boninense en el norte de Sinaloa. Los datos
determinados en este estudio servirán para monitorear variaciones posteriores en
la sensibilidad a fungicidas MBC en poblaciones de Colletotrichum que afectan
cítricos.
Palabras clave: Colletotrichum spp., Citrus spp., sensibilidad, fungicidas.
59
CHAPTER II
Sensitivity to carbendazim in isolates of Colletotrichum spp. causants of

citrus anthracnose in north of Sinaloa.
ABSTRACT
Anthracnose, caused by Colletotrichum spp., is a mayor disease on citrus

production, and it is controlled mainly by systemic fungicides belonging to methyl 2-
benzimidazole carbamate (MBC) group. In northern of Sinaloa, this disease is
caused by C. gloeosporioides, C. siamense, and C. karstii. The objective to this
study was to determine the in vitro sensitivity to the fungicide carbendazim on 35
isolates of the C. gloeosporioides and C. boninense species complexes. The fungal
isolates were collected in four commercial citrus orchards in the municipalities of
Ahome, El Fuerte and Guasave, Sinaloa. The fungicide doses evaluated were 0.005,
0.01, 0.05, 0.1, 0.5 and 1 µg mL-1. Petri dishes containing culture media without the
fungicide were used as control. The sensitivity to the fungicide was determined
based on the estimation of the concentration of fungicide that inhibit the mycelia
growth by 50% (ED50) for each isolate-fungicide combination. The isolates shown
ED50 values that vary on 0.034–0.769 µg mL-1 (mean = 0.086 µg mL-1). Any isolate
growth was significant at the maximum concentration evaluated (1 µg mL-1), which
indicated that exists a high sensitivity to carbendazim (MBC) on the C.
gloeosporioides and C. boninense complexes in the north of Sinaloa. The data
determined in this study will be used to monitor subsequent variations in sensitivity
to MBC fungicides in Colletotrichum populations that affect citrus.
Keywords: Colletotrichum spp., Citrus spp., sensitivity, fungicide
60
INTRODUCCIÓN
La antracnosis, ocasionada por Colletotrichum spp., es una de las enfermedades de
mayor importancia en la producción de cítricos a nivel mundial (Damm et al., 2012;
He et al., 2018). Bajo condiciones favorables, la enfermedad puede tener una
incidencia >90% cuando la floración coincide con la temporada de lluvias (Lima et
al., 2011). En Sinaloa, México, la antracnosis en cítricos es causada por
Colletotrichum gloeosporioides, C. siamense y C. karstii, que afectan flores, hojas,
frutos y ramas jóvenes (Pérez-Mora et al., 2020). En el manejo de esta enfermedad
se ha implementado de manera común el uso de fungicidas sistémicos
perteneciente a la clase metil-benzimidazol-carbamatos (MBC), y se han alternado
con fungicidas de contacto pertenecientes a la clase de los ditiocarbamatos (Peres
et al., 2004; de Goes et al., 2008; Moreira et al., 2019).
Los fungicidas de acción sistémica pertenecientes a la clase MBC están
representados por benomilo, tiabendazol, carbendazim y tiofanato-metil. Los
benzimidazoles inhiben la división mitótica, ya que infieren con la polimerización de
las subunidades β-tubulina de los microtúbulos, lo que ocasiona un fallo en la
división celular, y como consecuencia la muerte celular (Peres et al., 2004; Nakaune
et al., 2007; Vela et al., 2018). La resistencia a fungicidas MBC está asociada a
mutaciones en varios de los genes que codifican para la β-tubulina, las mutaciones
más comunes y significativas se presentan en los codones 198 y 200; en el cual se
sustituye el ácido glutámico por alanina, valina o glicina en la posición 198 y la
sustitución de fenilalanina por tirosina en la posición 200 (Moreira et al., 2019; Vela
et al., 2018).
61
Debido a las aplicaciones excesivas, se ha reportado resistencia por parte de
aislados de Colletotrichum spp. a fungicidas MBC en huertos comerciales de cítricos
en EE. UU. y Brasil (Peres et al., 2004; Gama et al., 2019). En México, los
productores de cítricos realizan el manejo de la enfermedad, durante el periodo de
lluvias, usando combinaciones de productos sistémicos (de un sitio de acción) con
productos de contacto (multisitio) como son los ditiocarbamatos, o productos a base
de cobre (hidróxido de cobre) (Orozco et al., 2007; Rocha-Peña et al., 2009). Por
esta razón es necesario conocer la sensibilidad a fungicidas de las especies de
Colletotrichum causantes de la antracnosis en cítricos para definir estrategias de
manejo en pre y postcosecha. El objetivo de este estudio fue determinar la
sensibilidad a carbendazim en 35 aislados de Colletotrichum spp. obtenidos de
huertos comerciales de cítricos en el norte de Sinaloa.
MATERIALES Y MÉTODOS
Origen y colección de aislados de Colletotrichum spp.
El total de 16 aislados de C. gloeosporioides, 18 de C. siamense y un aislado de C.
karstii se obtuvieron a partir de muestras sintomáticas de antracnosis en huertos
comerciales de cítricos, limón mexicano (Citrus aurantifolia), limón persa (Citrus
latifolia), naranja (Citrus sinensis) y toronja (Citrus paradisi), ubicados en diferentes
municipios del norte de Sinaloa (Cuadro 1). Los aislados se identificaron
previamente mediante caracterización morfológica y análisis filogenético multilocus
(Pérez-Mora et al., 2020).
62
Cuadro 1. Origen geográfico, cultivo, número y código de aislados de Colletotrichum
spp. obtenidos de cítricos de huertos comerciales del norte de Sinaloa para
determinar la sensibilidad in vitro a carbendazim.
Código de Parte Especie de

Localidad Cultivo
aislado vegetativa Colletotrichum
FAVF 350 Guasave Hoja Limón persa C. siamense
FAVF 351 Guasave Fruto Limón persa C. siamense
FAVF 352 Guasave Hoja Limón persa C. gloeosporioides
FAVF 353 Guasave Ramas Limón persa C. siamense
FAVF 354 Guasave Hoja Limón persa C. siamense
FAVF 355 El Fuerte Flor Limón mexicano C. siamense
FAVF 356 El Fuerte Ramas Limón mexicano C. siamense
FAVF 357 El Fuerte Flor Limón mexicano C. siamense
FAVF 360 El Fuerte Hoja Limón mexicano C. siamense
FAVF 363 El Fuerte Hoja Naranja C. gloeosporioides
FAVF 364 El Fuerte Ramas Naranja C. gloeosporioides
FAVF 365 El Fuerte Fruto Naranja C. gloeosporioides
FAVF 367 El Fuerte Flor Naranja C. gloeosporioides
FAVF 372 El Fuerte Flor Naranja C. gloeosporioides
63
FAVF 375 Ahome Fruto Toronja C. gloeosporioides
FAVF 376 Ahome Fruto Toronja C. siamense
FAVF 377 Ahome Ramas Toronja C. siamense
FAVF 378 Ahome Ramas Toronja C. siamense
FAVF 379 Ahome Fruto Toronja C. siamense
FAVF 380 Ahome Hoja Toronja C. gloeosporioides
FAVF 381 Ahome Hoja Toronja C. siamense
FAVF 382 Ahome Fruto Toronja C. karstii
FAVF 383 Ahome Hoja Toronja C. gloeosporioides
FAVF 384 Ahome Hoja Toronja C. siamense
Los aislados fúngicos se conservaron como discos miceliales suspendidos en
glicerol al 20% a temperatura de -4 °C con el objetivo de almacenarlos a largo plazo.
Mientras que, para conservación a corto plazo, se colocaron discos miceliales en
agua destilada estéril a 4°C. Subcultivos frescos se obtuvieron mediante la
transferencia de discos miceliales a medio de cultivo Papa-Dextrosa-Agar (PDA)
(Difco®, Francia) e incubados a 28°C en oscuridad durante seis días.
Fungicida
En este estudio se utilizó el fungicida químico carbendazim (Derosal 500 SC®,
Bayer) y las concentraciones evaluadas fueron con base en el ingrediente activo.
64
Sensibilidad de Colletotrichum spp. a carbendazim
La sensibilidad a carbendazim en los 35 aislados de Colletotrichum se determinó
con base en ensayos de inhibición del crecimiento micelial. Se utilizó una solución
madre de carbendazim en agua destilada estéril, y una vez esterilizado el medio
PDA se agregó la solución madre en diferentes porciones para obtener las
siguientes concentraciones: 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5 y 1 µg mL -1. Placas Petri con
medio de cultivo sin fungicida se usaron como testigo. Las placas con PDA +
fungicida se prepararon 24 h antes de usarse en la prueba y se mantuvieron en
oscuridad continua a temperatura de 25°C.
Para la prueba, se transfirió un disco micelial de 5 mm de diámetro obtenido de una
colonia de siete días de crecimiento y se colocó en el centro de la placa Petri con
PDA + carbendazim a las concentraciones ya mencionadas. Las placas Petri se
incubaron durante seis días en oscuridad continua a 28°C. Para cada aislado, se
usaron tres réplicas por concentración. El diámetro de la colonia en cada placa Petri
se midió de forma perpendicular en dos direcciones y se promedió. El diámetro del
disco de agar de 5 mm de diámetro se restó del diámetro de la colonia, antes de
realizar el análisis de datos. El ensayo se realizó por duplicado.
Análisis de datos
La concentración efectiva que inhibe el 50% del crecimiento micelial (CE50) para
cada aislado se calculó con una curva de dosis-respuesta ajustada a los datos con
una regresión logística-log con el paquete R ezec (Kamvar, 2016) usando el modelo
LL.3 en el paquete R drc (Ritz et al., 2015). La normalidad de los datos de ambos
65
experimentos para cada fungicida se verificó con la prueba de Shapiro-Wilk. Los
análisis preliminares mostraron que las distribuciones de frecuencia de los valores
de CE50 fueron normales.
RESULTADOS
Los 35 aislados de Colletotrichum spp. presentaron valores de CE50 que variaron
de 0.034–0.769 µg mL-1 (media = 0.086 µg mL-1). Cabe mencionar que el 97% de
los aislados mostraron valores de CE50 que fueron de 0.034–0.115 µg mL-1(Figura
1).
12
10
Frecuencia de aislados (%)
0
0.020- 0.040 0.041-0.060 0.061-0.080 0.081-.0.100 0.101-0.120 >0.120
CE50 (µg mL-1)
Figura 1. Distribución de frecuencia de valores de concentración efectiva de

carbendazim a la cual se inhibe 50% del crecimiento (CE50). para 35 aislados de
Colletotrichum spp. obtenidos de huertos comerciales de cítricos en el norte de
Sinaloa.
66
El promedio de los valores de CE50 de carbendazim, difirió de manera significante
entre los aislados pertenecientes a huertos comerciales de limón mexicano (Citrus
aurantifolia), limón persa (Citrus latifolia), naranja (Citrus sinensis) y toronja (Citrus
paradisi), distribuidos en los municipios de Ahome, El Fuerte y Guasave (Figura 2).
Figura 2. Sitios de recolección de aislados de Colletotrichum gloeosporioides, C.

siamense y C. karstii asociados a la antracnosis de cítricos en tres municipios del
estado de Sinaloa. Los círculos representan la frecuencia de cada rango de
inhibición (CE50) en cada población muestreada, ‘’n’’ es el número de aislados
analizados en cada cultivo de cítricos de los municipios Ahome, El Fuerte y
Guasave.
Los aislados de C. gloeosporioides, C. siamense y C. karstii obtenidos de huertos
de cítricos, presentaron una alta sensibilidad a carbendazim (Figura 3).
67
Figura 3. Efecto del fungicida carbendazim a diferentes concentraciones sobre el
crecimiento micelial de especies de Colletotrichum, obtenidas de huertos
comerciales de cítricos, en el norte de Sinaloa. A) Colletotrichum gloeosporioides.
B) C. siamense. C) C. karstii.
68
Los aislados de Colletotrichum spp. presentaron diferentes valores de sensibilidad
al fungicida carbendazim (Cuadro 2).
Cuadro 2. Efecto de carbendazim en la inhibición del crecimiento micelial de

diferentes aislados de Colletotrichum spp. en PDA + carbendazim.
Código de CE50 Especie de

Localidad Cultivo
aislado (µg mL-1) Colletotrichum
FAVF 350 Guasave Limón persa 0.111 C. siamense
FAVF 352 Guasave Limón persa 0.047 C. gloeosporioides
FAVF 355 El Fuerte Limón mexicano 0.071 C. siamense
FAVF 363 El Fuerte Naranja 0.769 C. gloeosporioides
69
FAVF 375 Ahome Toronja 0.065 C. gloeosporioides
FAVF 376 Ahome Toronja 0.057 C. siamense
FAVF 382 Ahome Toronja 0.088 C. karstii
La inhibición media de los aislados obtenidos de distintos huertos de cítricos varió
entre cada hospedante (Cuadro 3).
Cuadro 3. Rango de crecimiento y media de CE50 en aislados de Colletotrichum

spp. obtenidos de huertos comerciales de cítricos.
Carbendazim
No. de
Origen de aislados Media CE50 Rango CE50
aislados
(μg.ml-1) (μg.ml-1)
Limón persa 5 0.076 0.0470 0.111
Limón Mexicano 8 0.070 0.071 0.107
Naranja 12 0.104 0.034 0.769
Toronja 10 0.084 0.057 0.115
70
La sensibilidad a carbendazim varió entre las especies de Colletotrichum
identificadas (Cuadro 4).
Cuadro 4. Media de concentración efectiva CE50 de carbendazim en aislados de

Colletotrichum spp.
Carbendazim
Especies de
No. de aislados Media CE50 Rango CE50
Colletotrichum
(μg.ml-1) (μg.ml-1)
C. gloeosporioides 16 0.097 0.034 0.769
C. siamense 18 0.076 0.047 0.113
C. karstii 1 0.088
DISCUSIÓN
En este estudio, se determinó la sensibilidad in vitro de 35 aislados de
Colletotrichum spp. al fungicida carbendazim. Los resultados de esta evaluación
indicaron que ningún aislado creció a la máxima concentración evaluada (1 µg mL-

1), confirmando una alta sensibilidad de los aislados de Colletotrichum spp.
obtenidos en huertos comerciales de cítricos en el norte de Sinaloa. Estos
resultados coinciden con diversos estudios donde se han utilizado concentraciones
mayores a 1 µg mL-1, como dosis para diferenciar sensibilidad y resistencia a
fungicidas MBC en diferentes aislados de Colletotrichum spp. (Cao et al., 2017;
Chung et al., 2010; Peres et al., 2004; Vieira et al., 2017; Ramdial et al., 2016 ;
Zhong et al., 2020).
La presencia de aislados de Colletotrichum spp. sensibles al fungicida carbendazim
puede ser debido al manejo integrado implementado para la prevención de diversas
71
enfermedades en los huertos comerciales de cítricos en Sinaloa (CESAVESIN,
2020). Por el contrario, en algunas regiones se ha reportado presencia de aislados
de Colletotrichum spp. con alguna resistencia a productos MBC en diferentes
hospederos, esto debido al uso excesivo de estos productos por largos períodos
para el manejo de la enfermedad en países como EE. UU. (Peres et al., 2004), Brasil
(Gama et al., 2019a; Lima et al., 2011; Silva et al., 2016) y China (Han et al., 2018;
Lin et al., 2016).
El uso de carbendazim se duplicó desde el año 2002, cuando se prohibió la
utilización de benomilo en sistemas de producción de cítricos en diversos países,
dando lugar a carbendazim el control del manejo de la antracnosis en cítricos (de
Goes et al., 2008; Timmer et al., 2015; Silva et al., 2014). Sin embargo, el uso
excesivo de este fungicida pudo generar resistencia por parte del patógeno en
algunos huertos de cítricos en Brasil (Brent y Hollomon, 2007; Gama et al., 2019b).
En este estudio, la CE50 a carbendazim en las especies C. gloeosporioides, C.
siamense y C. karstii fue de 0.034–0.769, 0.047–0.113 y 0.088 µg mL-1,
respectivamente, lo que demostró una alta sensibilidad a este fungicida de la clase
MBC. Sin embargo, la especie C. gloeosporioides presentó una menor sensibilidad
en comparación a las otras dos especies. De manera similar, en otros estudios se
han reportado resultados similares asociados a C. gloeosporioides ante productos
MBC. Por ejemplo, Peres et al. (2004), observaron una respuesta de sensibilidad
variable en aislados de C. acutatum y C. gloeosporioides a concentraciones de
0.1,10, 100 y 1000 µg mL-1 de benomilo, obtenidos de hospedante de naranja dulce
(Citrus sinensis) y fresa (Fragaria ananassa). De igual manera, Ramdial et al. (2016)
72
reportaron valores de inhibición de crecimiento de 100% a concentración de 10 µg
mL-1 de benomilo, en aislados de C. gloeosporioides obtenidos de pimiento
(Capsicum annuum) en campos de Trinidad y Tobago. Por el contrario, Chung et al.
(2010) registraron resistencia a este producto en aislados de C. gloeosporioides
provenientes de mango (Mangifera indica) y fresa (Fragaria ananassa) a
concentraciones de <10, 10–100, 100–500 y >500 µg mL-1, en las cuales el
crecimiento obtenido en cada una de las concentraciones se consideró como
sensibles, moderados resistentes, resistentes y mayor resistencia, respectivamente.
Los valores de CE50 presentados en este estudio para Colletotrichum karstii,
concuerdan con lo reportado por Aiello et al. (2014), quienes observaron una
inhibición del crecimiento de C. gloeosporioides y C. karstii para benomilo a
concentraciones de 0.1,1 y 10 µg mL-1, obtenidos de huertos de naranja roja (Citrus
sinensis) en Italia. Por otra parte, los valores de sensibilidad obtenidos para C.
siamense en este estudio, mostraron ser más sensibles a las concentraciones de
carbendazim, esto coincide con lo reportado por Hu et al. (2015), quienes reportaron
en aislados sensibles valores de CE50= 0.015–0.037 y 3.352-–5.951 µg mL-1 para
azoxystrobin y metil-tiofanato, respectivamente, y los aislados que presentaron
resistencia obtuvieron valores CE50 >100 µg mL-1. En el mismo sentido, Chen et al.
(2016) reportaron valores de CE50= 0.2–13.1 µg mL-1 en aislados de Colletotrichum
siamense y C. fruticola para seis productos inhibidores de la demetilación (DMIs).
Los resultados obtenidos en nuestra investigación respecto a la sensibilidad de
Colletotrichum spp. al fungicida carbendazim, se obtuvieron valores de CE50 bajos,
entre las especies de cítricos de huertos comerciales del norte de Sinaloa, éstas
73
presentaron una mínima diferencia entre ellas, los aislados provenientes de huertos
de limón persa y limón mexicano fueron más sensibles. Por otro lado, los aislados
provenientes de huertos de naranja y toronja presentaron una sensibilidad un poco
menor en comparación a los aislados ya mencionados, ya que se presentó una
sensibilidad poco variable entre aislados obtenidos del mismo hospedero. Cabe
mencionar que todos los aislados fueron sensibles a la concentración más elevada
1 µg mL-1, esto coincide con lo reportado por Lima et al. (2011), Silva et al. (2016) y
Aiello et al. (2014).
En este estudio se obtuvo una alta sensibilidad a carbendazim por parte de aislados
de Colletotrichum spp., por lo que es conveniente que este fungicida se aplique en
huertos comerciales de cítricos de manera racional, a través de un cronograma de
aplicaciones requerido basado en el monitoreo y diagnóstico temprano de la
enfermedad. Además, es conveniente la rotación de este producto con fungicidas
de contacto como mancozeb y maneb que pertenecen al grupo de los
ditiocarbamatos, y fungicidas sistémicos como trifloxystrobin inhibidor de la quinona
(QoI), + tebuconazol inhibidor de la síntesis de esteroles (DMI) (Timmer et al., 2015;
Gamma et al., 2019b). Cabe reiterar que el seguimiento con ensayos de sensibilidad
a futuro es de suma importancia, ya que los valores CE50 obtenidos en este ensayo
son bajos, lo cual permite que carbendazim tenga aún eficacia ante Colletotrichum
spp. sin embargo, se requiere de más estudios de sensibilidad para evitar una
resistencia del patógeno a productos MBC.
74
CONCLUSIÓN
La prueba de sensibilidad in vitro confirmó que los 35 aislados de especies de
Colletotrichum responsables de ocasionar la antracnosis en cítricos, presentaron
alta sensibilidad al fungicida carbendazim.
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78
CONCLUSIONES GENERAL
• Los análisis morfológico y filogenético revelaron que las especies

Colletotrichum gloeosporioides, C. siamense y C. karstii están asociadas a la
antracnosis en los cítricos en el norte de Sinaloa.
• Se estimó la virulencia de las especies de Colletotrichum gloeosporioides, C.

siamense y C. karstii inoculadas en frutos desprendidos de cítricos, siendo
los aislados de Colletotrichum gloeosporioides los más virulentos
comparados con los C. siamense y C. karstii.
• La prueba de sensibilidad in vitro confirmó que los 35 aislados de especies

de Colletotrichum spp. responsables de ocasionar la antracnosis en cítricos,
fueron altamente sensibles al fungicida carbendazim con rango de
sensibilidad 0.034–0.769 µg mL-1 (media = 0.086 µg mL-1).
79

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Universidad Autónoma De Occidente

Departamento Académico de Investigación y Posgrado

Caracterización, virulencia y sensibilidad a fungicidas de aislados

Juan Luis Pérez Mora

Los Mochis, Sinaloa, México. Noviembre de 2020

Los Mochis, Sinaloa, Noviembre de 2020

A Dios por permitirme seguir creciendo personal y profesionalmente, y sobre todo

Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT), por el financiamiento

A la Universidad Autónoma De Occidente por permitirme realizar mis estudios de

A mis compañeros y amigos; Álvaro Moreno, Luis Felipe González, Abelard

ÍNDICE DE CUADROS ............................................................................................ i

Cuadro 1. Producción e ingreso de la citricultura en el país, en los últimos tres años

Cuadro 1. Nombres de iniciado utilizados, secuencias, fragmentos (pb), gen,

Cuadro 1. Origen geográfico, cultivo, número y código de aislados de Colletotrichum

La antracnosis, causada por Colletotrichum spp., es una de las enfermedades de

Palabras clave: Citrus spp., Colletotrichum spp. Apn/Mat, virulencia, sensibilidad.

Anthracnose, caused by Colletotrichum spp., is one of the most important diseases

Keywords: Citrus spp., Colletotrichum spp. Apn / Mat, virulence, sensitivity.

México ocupa el cuarto lugar a nivel mundial en producción de cítricos, y aporta el

(8 %) y la India (4.6 %) (FAOSTAT, 2017). En el país, la citricultura es una actividad

de gran importancia económica y social; se realiza en poco más de medio millón de

hectáreas en regiones con clima tropical y sub-tropical en 23 entidades federativas;

en los estados de mayor producción se han reportado pérdidas hasta del 30 % en

huertos comerciales de cítricos provocados por problemas fitosanitarios (SIAP,

En el estado de Sinaloa se cultivan 2,961 hectáreas de cítricos, como son naranja,

ingreso de 43 millones de pesos al año (SIAP, 2019). Sin embargo, la citricultura en

México se ha visto afectada por problemas fitosanitarios ocasionados por;

nematodos, virus, bacterias y hongos en distintos huertos comerciales; esto afecta

de forma significativa la producción (CESAVESIN, 2018).

La antracnosis, es una enfermedad causada por Colletotrichum, de importancia en

etapas de pre- y postcosecha a nivel mundial; la incidencia de esta enfermedad en

se observan síntomas de muerte regresiva o descendente, los cuales provocan una

marchitez en el ápice de la rama, y bajo condiciones favorables se llegan a producir

cuerpos fructíferos en el tejido enfermo (acérvulos). En las hojas se presentan

purpuras prominentes, éstas no son delimitadas por las nervaduras, conforme

rojizo, en condiciones avanzadas se pueden observar cuerpos fructíferos

(acérvulos) de color rosa salmón en los pétalos. El cáliz y botones permanecen

unidos al tallo, síntoma característico de la enfermedad. En frutos, la lesión se

hundimiento de las orillas, en condiciones severas de la enfermedad se pueden

observar acérvulos anaranjados a negros en las lesiones (Aiello et al., 2014;

La identificación del agente causal de la antracnosis, con frecuencia ha sido

controversial, ya que estudios anteriores han identificado al género Colletotrichum

de acuerdo a sus características fenológicas, al hospedero presente y sus síntomas

análisis filogenéticos multi-locus y las características fenotípicas, han contribuido al

esclarecimiento de la taxonomía de las especies crípticas pertenecientes a

Colletotrichum presentes en cítricos, las cuales han sido agrupadas en diferentes

complejos, incluso estos estudios han contribuido también al registro de nuevas

específico al identificar especies pertenecientes al complejo gloeosporioides,

comparados con otros genes concatenados que se han utilizado para la

identificación de las especies de dicho complejo (Damm et al., 2012; Douanla-Meli

manejo de esta enfermedad se ha implementado con frecuencia el uso de fungicidas

sistémicos pertenecientes al grupo químico metil-benzimidazol-carbamatos (MBC),

y se han alternado con fungicidas de contacto pertenecientes a la clase de los

benzimidazoles inhiben la división mitótica, ya que infieren con la polimerización de

las subunidades β-tubulina de los microtúbulos, lo que ocasiona un fallo en la

más comunes y significativas se presentan en los codones 198 y 200; en el cual se

sustituye el ácido glutámico por alanina, valina o glicina en la posición 198 y la

et al., 2018). Debido a las aplicaciones excesivas, se ha reportado resistencia por

parte de aislados de Colletotrichum spp. a fungicidas MBC en huertos comerciales