Universidad Autónoma de Nuevo León: Facultad de Ciencias Químicas

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE NUEVO LEÓN
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
INMOVILIZACIÓN DE LA PRODIGIOSINA PARA APLICACIONES

BIOTECNOLÓGICAS
Por:
Patricia Hernández Velasco
Como requisito parcial para obtener el Grado de

MAESTRÍA EN CIENCIAS con Orientación
en Microbiología Aplicada
Noviembre, 2018.
i
BIOTÉCNOLOGICAS
Revisión de la tesis
_________________________________________
Dr. Juan Francisco Villarreal Chiu
ASESOR
_________________________________________
Dra. Melissa Marlene Rodríguez Delgado
CO- ASESORA DE TESIS
_________________________________________
Dra. Pilar del Carmen Morales San Claudio
COMITÉ TUTORIAL
_________________________________________
Dr. Ulrico Javier López Chuken
COMITÉ TUTORIAL
ii
BIOTÉCNOLOGICAS
Aprobación de la tesis
_________________________________________
Dr. Juan Francisco Villarreal Chiu
PRESIDENTE
_________________________________________
Dr. Ulrico Javier López Chuken
SECRETARIO
_________________________________________
Dra. Pilar del Carmen Morales San Claudio
VOCAL
_________________________________________
Dra. Ma. Araceli Hernández Ramírez
SUB-DIRECTORA DE ESTUDIOS DE POSGRADO
iii
RESUMEN
Patricia Hernández Velasco Fecha de grado: Noviembre, 2018
Universidad Autónoma de Nuevo León

Facultad de Ciencias Químicas
Título del estudio: INMOVILIZACIÓN DE LA PRODIGIOSINA PARA APLICACIONES
BIOTECNOLÓGICAS.
Número de páginas: 64 Candidato para el Grado de Maestría en
Ciencias con Orientación en
Microbiología Aplicada
Área de estudio: Microbiología Aplicada

La prodigiosina es un pigmento producido por Serratia marcescens. Posee una
estructura tripirrólica de naturaleza hidrofóbica. Tiene la característica de presentar
actividades biológicas importantes, como agente antimicrobiano, antioxidante, y
actividad anticancerígena.
Gran parte de las aplicaciones que se han desarrollado empleando este metabolito
son en su forma libre, lo que impide la recuperación y reutilización del mismo, por
lo que el presente proyecto se enfocó al desarrolló una metodología que permitió
realizar la inmovilización de la prodigiosina mediante adsorción física en 3
materiales: celulosa, dióxido de titanio (TiO2) y dióxido de silicio (SiO2), siendo estos
2 últimos, modificados superficialmente con dodecil sulfato de sodio (SDS) para
obtener una superficie hidrofóbica y así obtener la inmovilización de la prodigiosina
en dichos soportes.
Las cinéticas de inmovilización mostraron que los materiales que inmovilizan una
mayor cantidad de prodigiosina son la celulosa que es un material de naturaleza
hidrofóbica, inmovilizando 0.62mg de prodigiosina/g de material, y el SiO2, que
inmovilizó 1.14mg de prodigiosina/g de material. Análisis por FT-IR demostraron la
presencia de las bandas características del material prístino: celulosa, TiO 2 y SiO2,
del surfactante (en el caso del TiO2 y SiO2 modificados) y de la Prodigiosina.
Además, análisis por espectrofotometría de UV-vis, demostraron la presencia de
las bandas de absorción características de la prodigiosina a 543nm.
Finalmente se llevó a cabo el desarrollo de 2 pruebas concepto para la aplicación
del sistema inmovilizado; 1) mediante macro dilución se evaluó la actividad
antibacteriana del sistema contra cepas Gram negativas (E. coli) y Gram positivas
(Staphylococccus aureus), obteniendo un resultado negativo al mostrar aumento
en la densidad óptica de los cultivos, y 2) se realizó la sensibilización de una celda
iv
solar la cual presentó una actividad positiva en la transmisión de energía,
registrando un porcentaje de eficiencia de 0.01%.
Firma del asesor: _________________________
v
AGRADECIMIENTOS
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología CONACYT por la beca otorgada.
A la Universidad Autónoma de Nuevo León y a la Facultad de Ciencias Quimicas por
las instalaciones brindadas en donde se llevó a cabo el desarrollo de este proyecto.
Al Dr. Juan Francisco Villarreal Chiu por haberme permitido ser parte de su equipo
de trabajo, realizar el presente proyecto de Tesis bajo su dirección, así como por
su asesoría y apoyo.
A la Dra. Melissa Marlene Rodríguez Delgado por su apoyo, paciencia asesoría.
Al comité tutorial: las doctoras Pilar del Carmen Morales San Claudio, Alcione
García González y al Doctor Ulrico Javier López Chuken, por los aportes y la
retroalimentación recibida durante la realización del presente proyecto.
A la Dra. Ma. Elena Cantú Cárdenas, por todo el apoyo brindado desde el inicio de
esta etapa.
A los profesores del posgrado, por el tiempo y los conocimientos compartidos.
A mis compañeros y amigos del laboratorio quienes con su apoyo y amistad
permitieron que esta experiencia fuera más agradable.
vi
DEDICATORIA
A mi madre por el amor y apoyo incondicional.
A mis abuelos Bertoldo Velasco Orea✝ y Francisca Cruz por creer en mí.
vii
TABLA DE CONTENIDO
CAPÍTULO 1
INTRODUCCIÓN............................................................................................... 1
1.1 Serratia marcescens ................................................................................... 2
1.2 Prodigiosina ................................................................................................ 2
1.3 Inmovilización ............................................................................................. 4
CAPITULO 2
ANTECEDENTES ........................................................................................... 10
2.1 Aplicaciones de la prodigiosina ................................................................. 10
2.2 Usos de la prodigiosina inmovilizada ........................................................ 11
2.3 Celdas solares sensibilizadas con pigmentos microbianos ....................... 11
CAPITULO 3
HIPÓTESIS Y OBJETIVOS ............................................................................. 13
3.1 Aportación científica .................................................................................. 13
3.2 Hipótesis ................................................................................................... 13
3.3 Objetivo general ........................................................................................ 13
a) Objetivos específicos .................................................................................. 14
CAPITULO 4
METODOLOGÍA .............................................................................................. 16
4.1 Obtención, purificación y caracterización de la prodigiosina producida a
partir de cultivos de Serratia marcescens ................................................... 16
4.2 Modificación de los materiales (TiO2, SiO2) con SDS y caracterización
mediante FT-IR ........................................................................................... 20
4.3 Inmovilización de la prodigiosina y caracterización mediante FT-IR y UV-
vis ............................................................................................................... 21
4.4 Evaluación de la fotoestabilidad de la Prodigiosina ................................. 26
4.5 Comprobación de la estabilidad de los sistemas inmovilizados (SiO2
modificado con prodigiosina inmovilizada y celulosa con prodigiosina
inmovilizada) ............................................................................................... 26
4.6 Realización de pruebas de concepto ....................................................... 27
CAPITULO 5
RESULTADOS Y DISCUCIÓN ........................................................................ 32
partir de cultivos de Serratia marcescens ................................................... 32
viii
mediante FT-IR ........................................................................................... 33
5.3 Inmovilización de la prodigiosina y caracterización mediante FT-IR y UV- vis
.................................................................................................................... 35
5.4 Prueba de fotoestabilidad de la prodigiosina ............................................ 48
5.5 Comprobación de estabilidad de los sistemas inmovilizados. ................... 49
5.6 Realizar pruebas de concepto de los sistemas inmovilizados. ................. 51
CAPITULO 6
CONCLUSIONES ............................................................................................ 55
PERSPECTIVAS ............................................................................................. 57
BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................... 58
ANEXOS ......................................................................................................... 63
ix
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Materiales empleados como soportes para inmovilización ....................... 6

Tabla 2. Concentraciones de prodigiosina pura .................................................... 28
Tabla 3.Cantidades de material mg/ml y concentración de prodigiosina inmovilizada
en mg/L. ...................................................................................................... 28
Tabla 4. Constantes de adsorción de la prodigiosina en TiO2 modificado. ........... 45
Tabla 5. Constantes de adsorción de la prodigiosina en SiO2 modificado. ........... 47
Tabla 6. Constantes de adsorción de la prodigiosina en celulosa. ....................... 48
Tabla 7.Parámetros Electroquímicos de la Celda solar sensibilizada con
prodigiosna. ................................................................................................ 54
Tabla 8.Tabla comparativa de eficiencias de pigmentos naturales en celdas
orgánicas. ................................................................................................... 54
Tabla 9. Tabla de reactivos utilizados. .................................................................. 63
Tabla 10.Tabla de equipos utilizados. ................................................................... 64
x
LISTA DE FIGURAS
Fig. 1 Mecanismo de acción del grupo metoxilo de la Prodigiosina sobre la

membrana celular bacteriana. .................................................................... 3
Fig. 2. Espectro de absorción de la prodigiosina purificada. ........................... 33
Fig. 3. Espectro de FTIR TiO2 prístino y TiO2 modificado................................ 34
Fig. 4. Espectro de FT-IR SiO2 prístino y SiO2 modificado. ............................. 35
Fig. 5. Curva de calibración de la prodigiosina. ............................................... 36
Fig. 6. Interacción del material-SDS-prodigiosina. .......................................... 37
Fig. 7. Comparación de inmovilizacion de la PG en materiales de estudio. .... 38
Fig. 8. Espectro de FTIR de TiO2 prístino y TiO2 +SDS +PG. ......................... 40
Fig. 9. Espectro de FTIR de SiO2 prístino y SiO2 +SDS+PG. .......................... 41
Fig. 10. Espectro de FTIR de celulosa y celulosa +PG. .................................. 42
Fig. 11. Espectro de UV-vis del TiO2+SDS y TiO2+SDS+PG. ......................... 42
Fig. 12. Espectro de UV-vis del SiO2+SDS y SiO2+SDS+PG. ......................... 43
Fig. 13. Espectro de UV-vis de la celulosa y celulosa + PG. ........................... 43
Fig. 14. Grafico lineal de la adsorción de la prodigiosina en TiO2 modificado con
ajuste al modelo de Freundlich. ................................................................ 45
Fig. 14. Grafico lineal de la adsorción de la prodigiosina en SiO2 modificado con
ajuste al modelo de Temkin. ..................................................................... 46
Fig. 15. Grafico lineal de la adsorción de la prodigiosina en celulosa ajustado al
modelo de Langmuir. ................................................................................ 47
Fig. 17. Prueba de fotoestabilidad de la prodigiosina. ..................................... 49
Fig. 18. Liberación de la prodigiosina inmovilizada en celulosa. ..................... 50
Fig. 19. Liberación de la prodigiosina inmovilizada en SiO2 modificado con SDS.
........................................................................................................... 50
Fig. 20. Curva corriente -voltaje de celda solar sensibilizada con PG. ............ 53
xi
LISTA DE SIMBOLOS Y ABREVIATURAS
°C Grados Celsius
Abs Absorbancia
ml Mililitros
mg Miligramos
L Litro
nm Nanómetros
FTIR Espectrometría de Infrarrojo con Transformada de Fourier
SDS Dodecil Sulfato de Sodio
PG Prodigiosina
T° Temperatura
h Horas
Psi Libra por pulgada cuadrada
rpm Revoluciones por minuto
min Minuto
g Gramos
μl Microlitros
PEG Polietilenglicol
UFC Unidades formadoras de colonias
UV Ultravioleta
mV Milivolts
A Microamperio
ITO Oxido de Indio y Estaño (Indium Tin Oxide)
MIC Concentración Mínima Inhibitoria
xii
CAPÍTULO 1
INTRODUCCIÓN
En el campo de la microbiología moderna se han generado estudios sobre una
gran diversidad de productos metabólicos que pueden ser utilizados en
aplicaciones biotecnológicas, tales como enzimas, pigmentos, antibióticos, entre
otros (Giri,et al., 2004). Cabe destacar que los pigmentos obtenidos a partir de
microorganismos poseen características de gran importancia para la industria, ya
que pueden ser empleados como colorantes en alimentos, textiles, plásticos, etc.
(Darshan y Manonmani, 2015), así mismo, existen pigmentos que presentan
actividad antioxidante, así como algunas actividades biológicas tales como:
antimicrobiana e inclusive algunos que pueden presentar actividad
anticancerígena.
De igual manera existen otras tecnologías emergentes en las que pueden ser
empleados microorganismos, así como sus metabolitos. Como, por ejemplo, el
desarrollo de las celdas de combustible microbianas que consisten en la
transformación de la energía química en energía eléctrica a partir de un sustrato
presente. Así mismo, en los últimos años, se ha incrementado el interés en el
desarrollo de celdas solares orgánicas, que emplean pigmentos naturales que son
extraídos de diversas fuentes como: plantas, flores, vegetales (Hosseinnezhad et
al., 2018) y recientemente de algunas especies bacterianas (Órdenes et al.,2016),
dichos pigmentos se emplean para la sensibilización de las celdas solares,
1
permitiendo convertir la luz solar en electricidad (Wongcharee et al., 2007). Cabe
mencionar que la mayoría de los pigmentos extraídos de microorganismos no
presentan toxicidad y son biodegradables, lo que les confiere ciertas ventajas
tecnológicas comparadas con su contra parte de origen sintético (Usman et al.,
2017).
1.1 Serratia marcescens
Dentro del grupo de microorganismos capaces de producir pigmentos
sobresale la bacteria Serratia marcescens, que es una bacteria Gram negativa,
anaerobia facultativa y pertenece a la familia Enterobactericeae, suele estar
ampliamente distribuida en el ambiente, encontrándose comúnmente en suelo,
agua y plantas (De Araújo et al., 2010). Esta bacteria es reconocida por su
capacidad de producir enzimas tales como DNAsa, lipasas y quitinasas (Giri,et al.,
2004), así como su resistencia a los antibióticos colistina, cefalotina y ampicilina
(Grimont y Grimont, 2006). Bajo ciertas condiciones de cultivo, S. marcescens
posee la capacidad de producir prodigiosina (Giri,et al., 2004). Este metabolito
secundario ha sido estudiado ampliamente, encontrándose que factores como la
temperatura, pH, fuente de carbón, fuente de nitrógeno y la presencia de algunas
sales orgánicas beneficiaban su producción (De Araújo et al., 2010).
1.2 Prodigiosina
La prodigiosina es un pigmento hidrofóbico (Haddix et al., 2008) con estructura
tripirrólica, insoluble en agua y soluble en solventes orgánicos como cloroformo,
metanol, acetonitrilo y Dimetilsulfóxido (DMSO) (De Araújo et al.,2010).Este
2
pigmento puede ser producido además por otras bacterias, tales como:
Pseudoalteromonas sp., Haella chejuensis, Vibrio sp., Streptomyces coelicor
(Lapenda et al., 2014).
Este compuesto posee un amplio rango de actividades biológicas entre las que
se encuentran propiedades antibacterianas, antifúngicas e inmunosupresoras,
(Aruldass et al., 2014). Por esta razón, se han investigado metodologías que
permitan aumentar su producción, y por ende poder buscar nuevos campos de
aplicación para este metabolito.
A pesar de la gran diversidad de aplicaciones que puede tener la prodigiosina,
una de las más estudiadas es su actividad antibacteriana, la cual fue estudiada por
Arivizhivendhan et al., (2015) encontrando que el grupo metoxilo de la prodigiosina
es el encargado de romper los enlaces peptídicos presentes en la membrana
celular de las bacterias, provocando así su efecto antibacterial, tal como se observa
en la Fig. 1 (Arivizhivendhan et al., 2015).
Fig. 1. Mecanismo de acción del grupo metoxilo de la Prodigiosina sobre la

membrana celular bacteriana (Arivizhivendhan et al., 2015).
3
Debido a la funcionalidad de este grupo funcional, es necesario buscar métodos
que permitan mantener la estructura de la prodigiosina estable y bioaccesible para
aprovechar esta característica en el diseño de futuras aplicaciones biotecnológicas.
De tal manera que, aunque las aplicaciones de la prodigiosina como agente
antibacteriano han sido probadas de manera directa, han sido pocos los esfuerzos
por diseñar metodologías que permitan emplear el rehúso de esta molécula durante
varios ciclos a fin de disminuir los insumos y maximizar su efecto.
Con la finalidad de resolver dicha limitación, en el presente proyecto se ha
propuesto realizar la inmovilización de la prodigiosina en materiales inertes, lo
cuales se sabe que confieren ciertas ventajas a los metabolitos inmovilizados,
siendo algunas de las más importantes: el incrementar la estabilidad química, el
reúso del compuesto por varios ciclos, la fácil recuperación, entre otros (Sheldon,
2007).
1.3 Inmovilización
La inmovilización corresponde al confinamiento de un metabolito en una
determinada región definida en el espacio manteniendo sus propiedades y
actividades. Asimismo, de acuerdo con el tipo de inmovilización estos metabolitos
pueden ser inmovilizados de manera permanente o temporal (Fajardo et al.,2011).
Existen diferentes tipos de inmovilización, entre los cuales destacan:
Adsorción: el cual representa el método más fácil de inmovilización, donde el
metabolito es disuelto en una solución y el soporte sólido es puesto en contacto
con la solución durante cierto periodo de tiempo. El mecanismo de adsorción
4
está basado en enlaces débiles como las fuerzas de Van der Waals, enlaces
electrostáticos y/o interacciones hidrofóbicas, que no afectan la actividad del
metabolito (Sassolas, et al., 2012).
Entrecruzamiento: es un método ampliamente utilizado debido a su simplicidad,
consiste en el uso de reactivos bifuncionales que permiten formar uniones
intermoleculares irreversibles capaces de resistir condiciones extremas de pH y
temperatura. Este método presenta inconvenientes debido a que puede haber
perdida de actividad debido a las alteraciones químicas que se llevan a cabo
durante la inmovilización (Arroyo, 1998).
Unión covalente: este tipo de inmovilización se lleva a cabo mediante la unión de
grupos funcionales, por lo que el metabolito no puede ser lixiviado del soporte.
Este método de inmovilización tiene como desventaja la posible inactivación de
la molécula, volviéndola inutilizable (Sheldon, 2007).
Encapsulación: Consiste en la localización del metabolito dentro de una matriz ya
sea una fibra hueca o una microcápsula, el compuesto no está enlazado a la
matriz de ninguna forma, por lo que no hay una modificación de la actividad
biológica durante el proceso de inmovilización. Dentro de las limitaciones se
puede mencionar la lixiviación de los biocomponentes que son inmovilizados
(Sassolas, et al., 2012).
Debido a que el grupo metoxilo de la estructura de la prodigiosina es el
encargado de la actividad antimicrobiana, es importante emplear un tipo de
inmovilización que permita mantener la estructura original, para poder aplicar el
5
sistema inmovilizado como agente antibacteriano, por lo que la inmoviliación
mediante adsorción es la opción que responde a las necesidades de la
inmovilización de la prodigiosina.
Existen diversos estudios que demuestran que los procesos de adsorción
pueden ser evaluados mediante isotermas de adsorción (Dada et al., 2012) , las
cuales son curvas que permiten evaluar la retención de una sustancia en un solido
a varias concentraciones, siendo esta una herramienta importante para describir y
predecir la movilidad del adsorbato en el adsorbente (Limousin et al., 2007).
1.3.2 Soportes
Las características de los soportes son de gran importancia para determinar la
eficiencia del sistema inmovilizado, los materiales empleado deben incluir
propiedades como: resistencia física, biocompatibilidad, ser inertes entre los
metabolitos y bajo costo por mencionar lagunas (Fajardo et al.,2011).
En este contexto, la Tabla 1 muestra ejemplos de materiales comúnmente
empleados como soportes en distintas aplicaciones biotecnológicas (Tabla 1;
Arroyo, 1998):
Tabla 1. Materiales empleados como soportes para inmovilización
Soportes inorgánicos Soportes orgánicos

Piedra pómez Naturales Sintéticos
Sílice Celulosa Poliestireno
Óxidos de metales Almidón Poliacrilamidas
Alúmina Colágeno Poli metacrilatos
Cerámicas Queratina Poliamidas
6
De acuerdo con la clasificación anterior, los materiales propuestos para la
inmovilización fueron seleccionados conforme a las posibles aplicaciones del
sistema inmovilizado, así como por algunas características propias de estos
materiales, los cuales son 2 óxidos de metales (dióxido de Titanio, TiO 2 y dióxido
de silicio, SiO2) y la celulosa.
1.3.2.1 Dióxido de Titanio (TiO2)
El TiO2 es un material que ha sido ampliamente utilizado en diferentes tipos de
industrias, debido a su alta estabilidad química, su baja toxicidad y bajo costo,
debido a su coloración blanca es empleado en algunos casos como pigmento (Rajh
et al., 2014), de igual manera existen otras aplicaciones de este material como la
autolimpieza, purificación de aire y agua, así como también posee propiedades
antibacterianas debido a su alta hidrofilicidad y su fuerte actividad oxidativa en
presencia de luz (Abbas et al., 2016), cabe destacar que este material es capaz de
fotodegradar algunos contaminantes orgánicos como alcoholes, fenoles y ácidos
carboxílicos mediante radiación de luz UV-visible (Zeng et al., 2010).
De igual manera este material ha sido seleccionado como un elemento
indispensable para la elaboración de celdas solares, el cual, al ser combinado con
pigmentos naturales, es capaz de transformar la luz solar en energía eléctrica, esto,
debido a la coloración blanca del TiO2 que limita su capacidad de absorber la luz.
Algunos estudios han demostrado que al combinarse con colorantes naturales, se
aumenta la absorbancia luminosa por el material, logrando así una mayor
transferencia de electrones (Kazmi et al., 2016).
7
1.3.2.2 Dióxido de Silicio (SiO2)
El SiO2 es un material poroso, hidrofílico, con capacidad de conductividad
térmica (Nurten y Paksoy, 2017), presenta gran área superficial, buena
biocompatibilidad, abundantes cargas superficiales y tiene buena dispersión en
agua, dichas características permiten que este material sea empleado en diferentes
aplicaciones como desecante, como lecho filtrante para depuración de agua e
incluso para micro encapsulación.
Debido a su naturaleza hidrofílica, la interacción con la prodigiosina
(hidrofóbica) no sería posible, por lo que es importante encontrar metodologías que
permitan la interacción de los 2 compuestos.
Qiao et al., (2015) estudiaron la obtención de nanoparticulas de SiO2
hidrofóbicas a partir de una modificación superficial empleando dodecil sulfato de
sodio (SDS) como modificador, realizando de igual manera una comparación en la
modificación nanoparticulas de TiO2, para evaluar el efecto de la naturaleza de la
superficie, ya que estos compuestos son en cierto modo similares.
1.3.2.3 Celulosa
La celulosa, que es un polímero hidrofóbico, insoluble en agua y en diferentes
solventes orgánicos, ha sido empleada por su porosidad y su estabilidad mecánica
como medio filtrante. Al inmovilizar nanopartículas inorgánicas, se ha demostrado
que éstas mantienen sus propiedades eléctricas, magnéticas y óptica (Zeng et al.,
2010).
8
Existen diversos estudios que evalúan la capacidad de inmovilización de la
celulosa al ser empleada en la inmovilización de algunas enzimas. Sathishkumar,
et al. (2014), evaluó la inmovilización de lacasas en nanofibras de celulosa,
observando que este material es apropiado para estas aplicaciones debido a su
area superficial, porosidad de la fibrar internas y poca transferencia de masa,
finalmente el sistema inmovilizado presentó estabilidad termica, reutilización
durante varis ciclos y buena estabilidad a los cambios de pH.
9
CAPITULO 2
ANTECEDENTES
2.1 Aplicaciones de la prodigiosina
La prodigiosina ha sido ampliamente estudiada en su forma libre, siendo
utilizada en aplicaciones tales como colorante en industrias de alimentos donde ha
sido empleada en leche, yogurt y bebidas carbonatadas (Darshan & Manonmani,
2015), asi mismo ha sido aplicada como poigmento en la industría de poliolefinas
(Ryazantseva & Andreyeva, 2014) y algunos textiles como lana, seda, nylon y telas
acrilicas donde algunos materiales teñidos llegaron a mostrar propiedades
antibacterianas (Alihosseini et al., 2008).
Por otra parte, se han llevado a cabo estudios sobre la actividad
anticancerígena de la prodigiosina, como en el estudio desarrollado por Kavitha et
al., (2010) que realizó un estudio sobre la actividad contra el cáncer y la apoptosis
contra el cáncer de carcinoma de cuello uterino humano.
En cuanto a la actividad antimicrobiana del pigmento hay diversos estudios
como el realizado por Karbaschi et al., (2017) que evaluó la actividad antibacteriana
de la prodigiosina en bacterias aisladas (Staphylococcus aureus y Escherichia coli)
de muestras de alimentos procesados, encontrando que la prodigiosina puede ser
empleada en la industria de alimentos.
10
2.2 Usos de la prodigiosina inmovilizada
En los últimos años se ha desarrollado interés en la aplicación de la
prodigiosina inmovilizada, ya sea en el área farmacéutica, donde ha sido empleada
para tratar el cáncer junto con algunos medicamentos neoplásicos como es explica
en algunos estudios como los realizados por Danyuo et al., 2014) que diseño un
dispositivo biomédico implantable que tenía como objetivo la liberación programada
de concentraciones controladas de prodigiosina y medicamentos contra el cáncer
a través de microcanales. Así mismo Obayemi et al., (2016) donde estudió la
inmovilización de la Prodigiosina mediante la técnica de encapsulación, empleando
poli- ácido- láctico- co- glicólico (PLGA) y poli- vinil alcohol (PVA) junto con
medicamentos anticancerígenos para tratamiento de cáncer para la liberación
programada de los principios activos.
Por otra parte, se evaluó la capacidad de inmobilización de la Prodigiosina en
una matriz de celulosa, con el objetivo de eliminar bacteria patogenas de soluciones
acuosas, a travez de un reactor en columna obteniendo una eliminación del 97.3%
tanto para bacterias Gram negativas (E. coli), como para Gram positivas (B. cereus)
(Arivizhivendhan et al., 2015).
2.3 Celdas solares sensibilizadas con pigmentos microbianos
Gran parte de las celdas solares sensibilizadas con colorantes, emplean
pigmentos naturales tales como: antocianinas, flavonoides y carotenoides, siendo
estos últimos sintetizados tanto por plantas como por algunos microorganismos,
pero uso se ha limitado a los extraídos de plantas, por lo que en este contexto los
11
pigmentos de origen microbiano son una fuente que no ha sido muy explorada para
la sensibilización de este tipo de celdas solares.
Órdenes et al., (2016) estudíó el uso de pigmentos producidos por bacterias
antarticas, para la sensibilización de celdas solares, obteniendo pigmentos de color
amarilo y rojo, que corresponden a una mezcla de luteina y zeaxantina y
cantaxantina respectivamente. Con el uso de estos 2 pigmentos obtuvo un % de
eficiencia de 0.03%, siendo este uno de los primeros acercamientos para el
desarrollo de celdas solares sensibilizadas con pigmentos microbianos.
Con base a lo anterior, se puede observar que los estudios realizados tanto en
la inmovilización de la prodigiosina, como en la sensibilización de celdas solares
con pigmentos de origen microbiano son escasos, por lo que en el presente
proyecto se propone realizar la inmovilización de la prodigiosina en 3 materiales,
de los cuales los óxidos de metales son modificados superficialmente para lograr la
interacción con la prodigiosina, y de esta manera aprovechar las características
inherentes de cada uno de ellos y así poder realizar 2 pruebas concepto para la
aplicación del sistema inmovilizado.
12
CAPITULO 3
HIPÓTESIS Y OBJETIVOS
3.1 Aportación científica
La escasa información acerca del uso de la prodigiosina inmovilizada limita la
expansión de sus aplicaciones en la biotecnología, la cual hasta hace unos años
había sido solamente empleada de forma libre. Es por ello que, en e proyecto se
desarrolló por primera vez un protocolo de inmovilización de la prodigiosina basado
en la modificación superficial de 2 soportes sólidos (TiO2, SiO2), la cual se comparó
con la inmovilización en un material ya estudiado como la celulosa. Así mismo se
estableció su uso en dos pruebas concepto (1) como agente antibacteriano y (2)
como sensibilizador de una celda solar, siendo esta última la primera vez que se
propone el uso de la prodigiosina en la generación de energía.
3.2 Hipótesis
La modificación superficial de los soportes sólidos para ser anfifílicos permitirá
la inmovilización de la prodigiosina, permitiendo su uso en diversas aplicaciones
biotecnológicas tales como: (1) Antibacteriano y (2) Sensibilizador de una celda
solar.
3.3 Objetivo general
Inmovilizar la prodigiosina en celulosa, TiO2 y SiO2 modificados
superficialmente para la evaluación de su estabilidad y usos potenciales en
13
aplicaciones biotecnológicas mediante pruebas de concepto tales como: (1)
Antibacteriano y (2) Sensibilizador de una celda solar.
a) Objetivos específicos
3.4.1 Obtener, purificar y caracterizar la prodigiosina producida a partir de cultivos
de Serratia marcescens.
a) Reactivación de la cepa de S. marcescens
b) Producción y purificación de la prodigiosina
c) Caracterización de la prodigiosina
3.4.2 Realizar la modificación de los materiales (TiO2, SiO2) con SDS y realizar su
caracterización mediante FT-IR.
a) Modificación superficial del TiO2 y SiO2 con SDS
b) Caracterización de los materiales modificados
3.4.3 Realizar la inmovilización de la prodigiosina en los soportes modificados y la
celulosa, así como su caracterización mediante FT-IR y UV-vis.
a) Cinéticas de inmovilización
b) Caracterización mediante FT-IR y UV-vis
c) Isotermas de adsorción
14
3.4.4 Evaluar la fotoestabilidad de la prodigiosina.
3.4.5 Comprobar la estabilidad de los sistemas inmovilizados.
3.4.6 Realizar pruebas de concepto de los sistemas inmovilizados para las
aplicaciones biotecnológicas propuestas.
a) Antibacteriano.
b) Sensibilizador de una celda solar.
15
CAPITULO 4
METODOLOGÍA
partir de cultivos de Serratia marcescens
4.1.1 Reactivación de la cepa de Serratia marcescens
Debido a que la cepa a utilizar se encontraba preservada en glicerol, se
procedió con la reactivación; para lo cual se preparó caldo LB de acuerdo con las
instrucciones del fabricante, se vertieron 5-6 ml de medio en tubos Hosch y se
esterilizó durante 15 minutos a 121 °C y 15 psi de presión en una autoclave
automática (Tuttnauer 2540M). Posteriormente el medio se dejó atemperar para su
subsecuente inoculación empleando una alícuota de 50 μl tomada del tubo
ependorf que contenía la cepa en glicerol. El tubo con caldo nutritivo inoculado se
incubó a 28 °C durante 24 horas en una incubadora con agitación SHEL-LAB 1575.
A continuación de prepararon tubos con agar inclinado, el agar LB se preparó
siguiendo las instrucciones del fabricante, y se sembró por estría una asada del
tubo de caldo LB que se inoculó anteriormente. Los cultivos obtenidos de los tubos
inclinados se utilizaron en la producción de la prodigiosina.
Una vez que se realizó la reactivación y la resiembra de la cepa de S.
marcescens se llevó a cabo una tinción de Gram para comprobar que es una
bacteria Gram negativa.
16
La tinción de Gram se llevó a cabo tomando una asada del tubo inclinado y se
colocó en un portaobjetos, después se agregó una gota de agua y se dejó secar,
una vez que la muestra se secó, se agregó cristal violeta y se dejó durante 1 minuto,
transcurrido el tiempo el portaobjetos se enjuagó con agua destilada,
posteriormente se agregó lugol durante 3 minutos, seguido de la adición de alcohol-
acetona por 1 minuto, se enjuagó con agua destilada y se agregó safranina durante
1 minuto. Finalmente, la muestra se enjuagó y se dejó secar para su posterior
observación al microscopio empleando el objetivo 100X, mediante la adición de una
gota de aceite de inmersión.
4.1.2 Producción y purificación de la prodigiosina
La producción de la prodigiosina se lleva mediante la siembre de S. marcescens
en medio cacahuate, el cual se compone de aceite de cacahuate en agua destilada,
obteniendo una concentración final al 1 %.
La extracción del aceite consiste en retirar la cascara del cacahuate
(incluyendo el tegumento), posteriormente el cacahuate es triturado con ayuda de
un mortero con pistilo, para reducir el tamaño de partícula y poder extraer la mayor
cantidad de aceite posible. Enseguida el cacahuate triturado se colocó en un vaso
de precipitados y se agregó éter de petróleo hasta cubrir la totalidad del cacahuate,
se dejó reposar durante 2 horas y transcurrido el tiempo se filtró utilizando una gasa.
La solución filtrada es colocada en un rotavapor para facilitar la evaporación del
solvente y obtener el aceite de cacahuate puro (sin residuos de solvente). El aceite
17
obtenido se vertió en un tubo Falcon de 50 ml y se almacenó en refrigeración hasta
su uso.
Una vez que se extrajo el aceite se prepararon 10 ml de medio cacahuate al 1
% colocando en un vial de vidrio (0.1 g de aceite de cacahuate y 10 ml de agua
destilada) el cual se esterilizó en una autoclave. Una vez esterilizado el medio se
dejó enfriar a temperatura ambiente y se inoculó con una asada de la cepa tomada
de un tubo inclinado con agar LB sembrado por estría, el medio se incubó durante
24 horas a 28 °C a 150 rpm.
Transcurridas las 24 horas se realizó una resiembra en 10 ml de medio
cacahuate, y se inoculó tomando 4 ml del cultivo del escalamiento anterior, se
incubó durante 48 horas a 28 °C a 150 rpm. Pasadas las 48 horas de incubación
se prepararon 100 ml de medio cacahuate al 1 % en un matraz de 250 ml, se
esterilizó, se dejó enfriar a temperatura ambiente y se inoculó con 4 ml del medio
cultivo del ultimo escalamiento, se incubó 48 horas a 28 °C a 150 rpm.
Una vez terminado el tiempo de incubación se realizó la extracción del
pigmento. Para cada cultivo de 100 ml se utilizaron 2 tubos Falcon de 50 ml, se
colocaron 25 ml de cultivo en cada uno y se centrifugaron a 4000 rpm durante 10
min a una temperatura de 8 °C. Una vez centrifugado se retiró el sobrenadante y
se agregaron nuevamente 25 ml de medio en cada tubo, se centrifugaron a las
mismas condiciones y se retiró el sobrenadante. Posteriormente se agregaron 3 ml
de cloroformo a cada tubo Falcon y se sometieron a un tratamiento de
ultrasonicación durante 1 minuto, dejando 2 minutos de reposo para enfriar la
muestra, este proceso se repitió 3 veces con cada tubo Falcon. Una vez que todos
18
los tubos fueron ultrasonicados se centrifugaron a 4000 rpm durante 10 min a 8 °C,
después se recuperó la fase liquida que contenía el pigmento y se transfirió a otro
tubo Falcon, el cual se tapó con una gasa y se almacenó a resguardo de la luz
hasta la completa evaporación del solvente.
Una vez que el solvente se evaporó por completo, se procedió con la
purificación de la prodigiosina mediante cromatografía en columna, utilizando silica
gel en cloroformo como fase estacionaria, y una mezcla de cloroformo: metanol
(9:1) como fase móvil. La columna se preparó colocando un disco delgado de
algodón en el fondo de una bureta, posteriormente se le adicionó la fase
estacionaria, preparada con 13 g de silica gel en 50 ml de cloroformo, la cual se
dejó empacar por gravedad. Por otra parte, previa a su purificación, la prodigiosina
fue diluida en 1 ml de cloroformo.
Una vez compactada la fase estacionaria, se agregó la solución de prodigiosina
y se adicionó la fase móvil, hasta recuperar la fracción de la prodigiosina purificada,
la cual se recogió en un vial previamente secado y pesado.
Al terminar la recuperación del pigmento, se tapó el vial con una gasa y se
mantuvo en oscuridad hasta la completa evaporación del solvente, posteriormente
se conservó en refrigeración hasta su uso.
4.1.3 Caracterización de la prodigiosina
Una vez que se evaporó el solvente de la purificación se realizó un barrido
mediante espectrofotometría de UV- Vis para identificar la prodigiosina, la cual se
19
ha reportado que presenta absorbancia a una longitud de onda de 535~540 nm
(Guryanov et al., 2013).
mediante FT-IR
4.2.1 Modificación superficial del TiO2 y SiO2 con SDS
Para la modificación superficial de las nanoparticulas de TiO 2 (21 nm) y SiO2
(10-20 nm) (adquiridas de Sigma Aldrich) se siguió la metodología propuesta por
Sharma et al., (2015) pesaron 0.5 g de nanoparticulas y se suspendieron en 50 ml
de etanol al 70 %, la suspensión se acidificó con 3 gotas de HCl 0.2 N para obtener
un pH de 45 y se dejó agitando en un vaso de precipitados de 100 ml con ayuda
de un agitador magnético. Posteriormente se adicionó por goteo 10 ml de dodecil
sulfato de sodio (SDS) al 1 % y se dejó agitar durante 2 horas. Una vez transcurrido
el tiempo, la solución fue vertida en 2 tubos Falcon, se centrifugaron a 4400 rpm
durante 10 min, se retiró el sobrenadante y se realizaron 3 lavados utilizando etanol
al 70 % para eliminar el surfactante que no interaccionó con el material. Los lavados
se realizaron agregando 10 ml de etanol a cada tubo Falcon, se agitaron
vigorosamente durante 1 min y se centrifugaron a 4000 rpm durante 10 min, se
retiró el sobrenadante y se repitió el mismo procedimiento 2 veces más, después
se llevó a cabo un último lavado con 10 ml de etanol al 96 %, se agitaron los tubos
y la mezcla se transfirió a un vaso de precipitados de 100 ml. A continuación se
calentó en una estufa a 120 °C durante 2 horas para eliminar el etanol y secar el
material modificado (Sharma et al., 2015).
20
Una vez que el material modificado está completamente seco, se deja enfriar
en un desecador y se almacena hasta su uso, en un vial de vidrio previamente
secado, y pesado.
4.2.2 Caracterización de los materiales modificados
Una vez que los materiales fueron modificados, se realizó su caracterización
mediante espectrometría de FT-IR, para corroborar la presencia del surfactante
dodecil sulfato de sodio (SDS) en el material modificado.
4.3 Inmovilización de la prodigiosina en los soportes modificados y la
celulosa, así como su caracterización mediante FT-IR y UV-vis
4.3.1 Cinéticas de inmovilización
Antes de realizar las pruebas de inmovilización se llevó a la cabo la preparación
de una curva de calibración preparando soluciones de prodigiosina a diferentes
concentraciones a partir de una solución de 0.1 mg de prodigiosina por ml de
solvente (cloroformo). A partir de esta solución se realizaron diluciones para obtener
un rango de concentraciones de 0.09, a 0.01 mg/ml. Una vez que se obtuvieron la
soluciones se midió la absorbancia de cada una y se elaboró una gráfica de
absorbancia de las soluciones contra concentración de prodigiosina. La curva se
ajustó al modelo de regresión lineal, con la finalidad de ser usada en la medición
de cantidad de prodigiosina inmovilizada en los diferentes materiales.
21
Una vez lista la curva de calibración se realizaron las cinéticas de inmovilización
en los materiales prístinos y modificados (TiO2 y SiO2) con el objetivo de evaluar la
capacidad de inmovilización del material no modificado con respecto al modificado
con surfactante.
Debido a que el cloroformo es un solvente altamente volátil y el TiO 2 presenta
alta actividad fotocatalítica se contemplaron estos factores durante el proceso de
inmovilización, por lo que se empleó un recipiente color ámbar herméticamente
cerrado y en oscuridad para evitar la fotocatálisis del pigmento.
Las inmovilizaciones se realizaron por triplicado para cada material, se
prepararon 25 ml de solución de prodigiosina en cloroformo con una concentración
de 1.0 mg/ml, dicha concentración se evaluó con la curva de calibración utilizando
una dilución de 1:100 (20 μl de solución de prodigiosina:1980 μl de cloroformo).
Posteriormente se vertieron 7 ml de la solución de prodigiosina (1mg/ml) en un
vial de color ámbar, se pesaron 500 mg del material (celulosa, TiO2, SiO2 prístino o
modificado con SDS, según sea el caso) y se agregaron a los viales, los cuales se
mantuvieron en agitación constante. Se realizaron muestreos cada 45 minutos,
durante 8 horas continuas, posteriormente se dejaron agitar toda la noche y los
monitoreos se continuaron de 10 a 12 horas hasta completar las 24 horas desde la
primera lectura, para realizar las lecturas de la absorbancia se centrifugaron los
tubos a 4000 rpm, a 8 °C durante 5 min, y se tomaron 20 l de muestra y se
agregaron 1980 l de cloroformo y se leyó a 539 nm, esto para llevar a cabo la
cinética de inmovilización, conocer el tiempo en que se alcanza la estabilidad en la
22
adsorción del pigmento, así como para conocer la cantidad de prodigiosina
inmovilizada.
4.3.2 Caracterización mediante FT-IR y UV-vis
Una vez que la prodigiosina fue inmovilizada en los 5 materiales (celulosa, TiO 2,
TiO2 modificado, SiO2 y SiO2 modificado), se realizó la caracterización mediante
espectrometría de FT-IT y UV-vis, para evaluar la presencia de la prodigiosina
inmovilizada en el material.
4.3.3 Isotermas de adsorción
Las isotermas de adsorción se llevaron a cabo por triplicado, manteniendo
constante la concentración de las soluciones de prodigiosina y variando la cantidad
de material a utilizar (TiO2 modificado, SiO2 modificado y celulosa). Para realizar
las isotermas se realizaron inmovilizaciones empleando 100, 300, 500, 750 y 1000
mg de material, los cuales se colocaron en viales, donde se adicionaron 7 ml de
solución de PG a una concentración de 1 mg/ml, posteriormente se mantuvo en
agitación constante durante 20 h. Al concluir 20 horas se realizó una centrifugación
de la solución, a 4000 rpm, 8 °C por 5 min. Finalmente se realizó la medición de la
absorbancia para conocer la concentración final y así calcular la cantidad de
prodigiosina inmovilizada.
El valor de Qe (cantidad de soluto adsorbido en los materiales mg/g) fue
calculada mediante la ec.1 (Dada et al., 2012):
𝑉(𝐶0 −𝐶𝑒)
𝑄𝑒 = ........................................................ (ec.1)
𝑊
23
Donde:
Qe= Cantidad de soluto adsorbido de la solución (mg/g).
V= Volumen del adsorbato (L).
C0= Concentración inicial (antes de la adsorción) (mg/L).
Ce= concentración final (después de la adsorción) (mg/L).
W= Peso en gramos del adsorbente (g).
Una vez obtenido al valor de Qe, se realizó el ajuste para los 3 modelos a utilizar:
Langmuir, Freundlich y Temkin, los cuales cuentan con una ecuación linealizada
que permite realizar el análisis de los datos obtenidos.
4.3.3.1. Modelo de Langmuir
El modelo de Langmuir se representa en su forma lineal por la ec. 2 Xu et al.,
(2013):
1 1 1 1
= × + ........................................... (ec. 2)
𝑞𝑒 𝑞𝑚𝑎𝑥 𝑏 𝐶𝑒 𝑞𝑚𝑎𝑥
Donde:
qe = es la capacidad de adsorción al equilibrio (mg/g).
Ce = concentración final (después de la adsorción) (mg/L).
qmax = cantidad máxima de prodigiosina adsorbida en el adsorbente (mg/g).
b= es la constante de Langmuir relacionada con la afinidad de adsorción (L/mg).
24
Nota: la qmax y b se calculan a partir de la pendiente y la intersección de los
diagramas lineales de 1/qe vs 1/Ce.
4.3.3.2 Modelo de Freundlich
Este modelo se representa en su forma lineal por la ec. 3 Xu et al., (2013):
1
𝑙𝑜𝑔(𝑞𝑒 ) = 𝑙𝑜𝑔𝐾𝑓 + 𝑛 𝑙𝑜𝑔(𝐶𝑒 ).................................... (ec. 3)
Donde:
Kf = es la constante de capacidad de adsorción.
1/n= es la constante de intensidad de adsorción (factor de heterogeneidad).
Nota: estos valores se obtienen a partir de la pendiente y la intersección de la
gráfica lineal de log (qe) vs log (Ce).
4.3.3.3 Modelo de Temkin
Este modelo se representa en su forma lineal por la ec. 4 linealizada Zheng et
al., (2009).
𝑞𝑒 = 𝐵 𝑙𝑛𝐴 + 𝐵 𝑙𝑛𝐶𝑒 ........................................... (ec. 4)
Donde:
B= RT/b
b= es la constante de Temkin relacionada con la temperatura (J/mol).
A= es la constante de enlace de equilibrio térmico (L/g).
25
R= es la constante de gas (8.314J/mol K).
T= es la temperatura absoluta (K).
Nota: las constantes se obtienen a partir de la pendiente y la intersección de la
gráfica lineal qe vs ln Ce.
4.4 Evaluación de la fotoestabilidad de la Prodigiosina
Para evaluar la fotoestabilidad de la prodigiosina se preparó una solución de
prodigiosina con concentración de 1mg/ml, la cual fue expuesta a la luz solar
durante 4 días, evaluando la concentración cada 24 horas hasta completar los 4
días (96 h).
4.5 Comprobación de la estabilidad de los sistemas inmovilizados (SiO 2
modificado con prodigiosina inmovilizada y celulosa con prodigiosina
inmovilizada)
La prueba de estabilidad de los sistemas inmovilizados se realizó ajustando la
metodología propuesta por Arivizhivendhan et al., (2015), que consiste en poner en
contacto al sistema con agua destilada, bajo agitación, para garantizar el contacto
continuo del material con el agua. La prueba fue durante 4 días, realizando
muestreos de la concentración de prodigiosina en la solución acuosa cada 24
horas.
El muestreo se realizó mediante centrifugación a 4000 rpm, durante 5 minutos,
seguido de la toma de muestra (2 ml), la cual fue medida por espectrofotometría de
UV-vis para conocer la concentración de prodigiosina presente.
26
4.6 Realización de pruebas de concepto
4.6.1 Antibacteriano
Para llevar a cabo las pruebas antimicrobianas se implementó la metodología
de macrodilución empleando la técnica de espectrometría para la determinación de
la densidad óptica (DO), el medio de cultivo empleando fue caldo MH. Las cepas
empleadas fueron las cepas ATCC 11229 de E. coli y Staphylococcus aureus.
Las cepas se reactivaron en 50 ml de caldo Mueller Hilton (MH), el cual se
preparó de acuerdo con las indicaciones del fabricante, se esterilizó a 121 °C, 15
psi, durante 15 min, se dejó enfriar y se inoculó con 50 μl de la cepa conservada en
glicerol, enseguida el matraz se incubó a 28 °C, 150 rpm durante 20 h.
Posteriormente se realizó la lectura de la densidad óptica (D.O.) a λ= 650 nm,
utilizando diluciones 1:10 con solución salina, por lo que la lectura obtenida se
multiplicó por el factor de dilución (F. D. =10).
La actividad antibacteriana se evaluó tanto en la prodigiosina libre como en la
prodigiosina inmovilizada. En la tabla 2 se observan las concentraciones empleadas
para la prodigiosina libre, mientras que en la tabla 3 se observan las cantidades de
material empleadas para la prodigiosina inmovilizada.
Se prepararon los tubos con 4ml caldo MH, los cuales fueron inoculados con
0.01ml de cada bacteria (D.O.=1) se agregaron las cantidades de prodigiosina libre
y prodigiosina inmovilizada de acuerdo con la prueba a realizar y se incubaron a
28°C, 150 rpm durante 24 h. después de las 24 h se realizó la medición de la D.O.
27
a 650 nm, empleando como blanco el medio de cultivo con prodigiosina libre y el
medio de cultivo con prodigiosina inmovilizada sin bacterias (Danevčič et al., 2016).
Tabla 2. Concentraciones de prodigiosina pura

Prodigiosina (mg/ml)
100
200
300
1000
2000
3000
Tabla 3. Cantidades de material mg/ml y concentración de prodigiosina inmovilizada

en mg/L.
TiO2 SiO2
TiO2 SiO2 Celulosa
Material modificado modificado Celulosa
modificado modificado +PG
+ PG + PG
Cantidad material
172 172 64.1 64.1 219.7 219.7
(mg/ml)
Cantidad PG
inmovilizada NA 30 NA 50 NA 100
(mg/L)
4.6.2 Sensibilización de una celda solar
Una celda solar consta de un electrodo de trabajo, un electrodo de referencia y
una solución electrolítica. Para la elaboración del electrodo de trabajo se preparó
una pasta de TiO2 sin modificar y otra con TiO2 modificado para las que se utilizaron:
0.2 g de TiO2 (modificado o sin modificar según sea el caso), 0.4 ml de ácido nítrico
(HNO3) 0.1 M, 0.08 g de PEG y se agregó triton 100X gota a gota hasta obtener
una pasta ligeramente viscosa.
28
La pasta obtenida fue extendida sobre un vidrio recubierto con ITO, el cual es
un material conductor. Previamente el vidrio con ITO fue sometido a un tratamiento
de limpieza que consistió en: un lavado con jabón, enjuague con agua destilada,
posteriormente se sumergió en una mezcla de acetona y alcohol isopropílico 50: 50
y se sometió a un baño de ultrasonido por 5 minutos para eliminar los restos de
materia orgánica que pudieran quedar en la superficie. Una vez limpio, el vidrio con
ITO se cuadriculo en 9 partes iguales con ayuda de cinta plástica, cada uno de ellos
será un electrodo de trabajo, al cual se le aplicará la pasta de TiO 2. La pasta se
extendió uniformemente con ayuda de un portaobjetos hasta formar una capa
delgada de aproximadamente 2 mm de espesor.
Una vez que se secó la pasta, se retiró la cinta y se cortaron los electrodos con
ayuda de un cortador de vidrio. Cada electrodo se sometió a un proceso de
calcinación en una mufla a 500 °C durante 30 minutos y posteriormente se dejaron
enfriar. Por otro lado, se preparó una solución de prodigiosina a una concentración
de 10 mg/ ml, la cual se utilizó para sensibilizar los electrodos. La sensibilización
de los electrodos consiste en la adsorción del pigmento en la capa de TiO 2, la cual
se realiza por goteo (aprox. 5 gotas) de la solución de prodigiosina (10 mg/ml) sobre
cada electrodo.
Los electrodos de referencia se prepararon empleando una pasta de carbón
comercial, la cual se extendió en un vidrio cubierto con ITO, previamente lavado y
cuadriculado con ayuda de cinta plástica. La pasta se extendió con un portaobjetos
para obtener una capa uniforme de aproximadamente 2 mm de espesor.
29
El electrolito se preparó disolviendo 0.41 g de Yoduro de potasio (KI) y 0.038 g
de Iodo (I2) en 50 ml de etilenglicol, para obtener una solución de KI/I 2 0.5 M/0.03
M.
Ya listos los electrodos de trabajo y de referencia, se armaron las celdas solares
bajo un esquema tipo sándwich que consiste en colocar entre el electrodo de
trabajo (TiO2 con prodigiosina), el de referencia y la solución de electrolito.
El armado de la celda se realizó colocando entre el electrodo de referencia y
de trabajo, 10 l de electrolito; los electrodos se fijaron con ayuda de unas pinzas,
posteriormente se realizaron las pruebas de la celda, en un simulador solar
Sciencetech 55150 acoplado a un potenciostato Gamry PCI4-740A, para
registrar las curvas de corriente -voltaje y conocer la fotorespuesta. Las mediciones
se realizaron a condiciones constantes de temperatura e irradiación de un sol de
intensidad como fuente de energía (~100 mW·cm−2 y AM 1.5).
Existen distintos parámetros electroquímicos que ayudan a determinar la
eficiencia de una celda solar. La densidad de la corriente (Jmax) y el voltaje (Vmax)
para la potencia máxima (Pmax) se obtuvieron de las gráficas Corriente-Voltaje
medidas a través del simulador solar. De esta curva se obtuvieron los valores de la
densidad de corriente en circuito cerrado (Jsc, en unidades de mA·cm-2) y voltaje en
circuito abierto (Voc, en unidades de V). Estos últimos parámetros son empleados
para calcular el factor de llenado, FF (ec. 5) (Wongcharee et al., 2007).
(𝐽𝑚𝑎𝑥 × 𝑉𝑚𝑎𝑥 )
𝐹𝐹 = ................................................. (ec. 5)
(𝐽𝑠𝑐 ×𝑉𝑜𝑐 )
30
La eficiencia de conversión fotoeléctrica de la celda solar es obtenida mediante
la ec.6 (Wongcharee et al., 2007):
𝐽sc 𝑥 𝑉𝑜𝑐
𝜂= ........................................................... (ec. 6)
𝑃𝑖𝑛𝑐
31
CAPITULO 5
RESULTADOS Y DISCUCIÓN
partir de cultivos de Serratia marcescens
5.1.1Reactivación de la cepa de Serratia marcescens
La reactivación de la cepa de S. marcescens, se realizó exitosamente. Por otro
lado, la tinción de Gram permitió observar una bacteria Gram negativa y en forma
de bacilos.
5.1.2 Producción y purificación de la prodigiosina
La producción de la prodigiosina se realizó siguiendo una metodología
optimizada (Ávila, 2016), obteniendo un rendimiento de 0.05-0.06 mg de
prodigiosina/ml de medio de cultivo, obteniendo una producción total de ~2 g de
prodigiosina. Una vez que se extrajo la prodigiosina, fue purificada por
cromatografía de columna.
5.1.3 caracterización de la prodigiosina
La caracterización se llevó a cabo mediante un barrido de la muestra por
espectrofotometría de UV-vis en un rango de 300 a 800 nm para la identificación
del pigmento. En la Fig. 1 se muestra el espectro obtenido del barrido realizado,
donde se observa una señal a 539 nm, la cual corresponde a la prodigiosina, ya
32
que existen reportes en los que la prodigiosina en medio ácido es de color rojo y
presenta absorbancia de 535 a 540 nm (Guryanov et al., 2013).
Fig. 2. Espectro de absorción de la prodigiosina purificada.
mediante FT-IR
5.2.1 Modificación superficial y caracterización del TiO2 y SiO2 con SDS
Una vez que se llevó a cabo la modificación de los materiales (TiO 2 y SiO2) se
realizó un análisis de FTIR, para corroborar la presencia del SDS en la estructura
del material, en la Fig. 3, se observa el espectro Infrarrojo del TiO2 modificado,
donde se encuentran las siguientes bandas: de 500-600 cm-1 corresponde a
enlaces de flexión de Ti-O-Ti y a 1,650 cm-1 se encuentra la flexión del grupo -OH
atribuidos al TiO2 (Al-Taweel y Saud, 2016) , en cuanto al SDS se observan las
33
siguientes señales: a 1,214 cm-1 y 1,108 cm-1 el estiramiento asimétrico del S=O y
a 2,950 cm-1 estiramiento asimétrico del -CH3 (Chatterjee et al., 2014).
Fig. 3. Espectro de FTIR TiO2 prístino y TiO2 modificado.
En el caso del SiO2 en la Fig.4 se aprecia el espectro obtenido, donde se
observan las siguientes bandas: a 1,100 cm-1 y 800 cm-1 corresponde al
estiramiento simétrico del Si-O-Si , las bandas a 3,400 cm-1 y 958 cm-1 son
característica del Si-OH (Chen et al., 2013). En el caso del SDS se puede observar
una ligera banda a 2,950 cm-1 que indica estiramiento asimétrico de -CH3, hay otras
bandas características de estiramiento asimétrico y simétrico de S=O del SDS a
1,220 y 1,108 cm-1 CH3 (Chatterjee et al., 2014), los cuales pueden estar
empalmados con la banda a 1,100 cm-1 del estiramiento simétrico del Si-O-Si.
34
Fig. 4. Espectro de FT-IR SiO2 prístino y SiO2 modificado.
5.3 Inmovilización de la prodigiosina y caracterización mediante FT-IR y UV-
vis.
Antes de realizar las cinéticas se realizó la curva de calibración de la
prodigiosina, para conocer la cantidad de pigmento inmovilizada en los soportes.
La curva de obtenida presentó un coeficiente de determinación R2= 0.99 (Ver Fig.
5), lo que significa que el cambio de la variante absorbancia es explicada por el
modelo de regresión (Dozie-Nwachukwu et al., 2016).
35
0.250
y = 1.899x + 0.0109
0.200 R² = 0.99
Absorbancia
0.150
0.100
0.050
0.000
0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09 0.1 0.11
Concentración (mg/mL)
Fig. 5. Curva de calibración de la prodigiosina.
5.3.1 Cinéticas de inmovilización
La inmovilización de la PG se realizó en tres diferentes materiales: TiO2, SiO2 y
celulosa, de los cuales solo el TiO2 y el SiO2 fueron modificados con SDS con la
finalidad de poder obtener materiales anfifílicos (Qiao et al., 2016), y así, permitir la
inmovilización de la PG, cuya naturaleza es hidrofóbica.
La interacción de la prodigiosina con el material modificado con SDS se observa
en la Fig. 6, donde el SDS funciona como intermediario entre el material (al ser un
agente surfactante que consta de un grupo hidrofóbico y un grupo hidrófilo) y la
prodigiosina, ya que estos son de naturalezas opuestas, por lo que el SDS se va a
alinear de acuerdo con la naturaleza de cada material.
36
Fig. 6. Interacción del material-SDS-prodigiosina (Caligur, 2008), (Rossom et al.,
2016).
Se realizaron cinéticas de adsorción en los diferentes materiales y así conocer
el comportamiento de la inmovilización y el tiempo en que esta alcanza la
estabilidad.
En la Fig. 7 se muestra la cinética de inmovilización de la PG en los materiales
empleados. La cantidad de pigmento inmovilizado en el TiO2 prístino es la más baja
(0.09 mg), en comparación con los demás materiales. En cuanto al TiO 2 modificado
la cantidad de PG inmovilizado aumento ligeramente a 0.13 mg, casi similar a la
cantidad inmovilizada de pigmento en el SiO2 prístino (0.10 mg). Por otro lado, el
SiO2 modificado presenta un aumento sustancial en la cantidad de pigmento
adsorbido, el cual fue de 0.57 mg. En el caso de la celulosa, cuya naturaleza es
hidrofóbica (por ello no fue modificada) se logró inmovilizar 0.31 mg. Por otro lado,
en esta Figura se logra observar que los 5 materiales empleados para la
inmovilización llegan al equilibrio a partir de las 20-21h después de haber iniciado
la cinética (correspondiente a las mediciones número 10-11).
37
1.10
1.00
CONCENTRACIÓN mg/ml
0.90
0.80
0.70
0.60
0.50
0.40
0.30
0.20
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
MEDICIONES
SiO2 SiO2 MODIF TiO2 TiO2 MODIF CELULOSA
Fig. 7. Comparación de inmovilizacion de la PG en materiales de estudio.
Como se puede apreciar, los materiales modificados presentan mayor
inmovilización de pigmento en comparación con los materiales prístinos, siendo el
mejor el SiO2 modificado.
Lo anterior puede ser atribuido a que la modificación superficial del SiO2
permitió obtener una superficie hidrofóbica, debido a que la superficie del SiO2
presenta sitios de ácido de Bronsted, los cuales pueden proporcionar protones para
la unión con el modificador, esta unión se lleva a cabo debido a que el SDS se
hidroliza para producir dodecanol en el proceso térmico y este compuesto es
atacado por los protones de los sitios de ácido de Bronsted en la superficie de las
partículas de SiO2 para generar un carbocatión, que a su vez reacciona con el resto
del SiO de carga negativa para formar una estructura de Si-O-C y dar la
modificación hidrofóbica (Qiao et al., 2016).
38
En el caso del TiO2 modificado este mantuvo su superficie hidrofílica, esto
debido a que la superficie del TiO2 solo tiene sitios ácidos de Lewis y los sitios
ácidos de Bronsted pueden proporcionar protones para la reacción entre los grupos
de la superficie del material y el modificador (SDS).
5.3.2 Caracterización mediante FT-IR y UV-vis
Una vez que se realizaron las inmovilizaciones en los diferentes materiales, se
realizó una caracterización mediante espectrometría de FTIR, para comprobar la
adsorción de la PG.
En el caso del TiO2, se observa en la Fig. 8 el espectro de infrarrojo de la PG
inmovilizada en el material modificado. En la Figura observamos las siguientes
bandas: para el TiO2 de 500-600 cm-1 indica un enlace de flexión de Ti-O-Ti, a 1,650
cm-1 la flexión del grupo -OH (Al-Taweel y Saud, 2016), para el SDS las bandas
asignadas son las siguientes: 1,214 cm-1 y 1,108 cm-1 se encuentra el estiramiento
asimétrico del S=O, a 2,920 cm-1 estiramiento asimétrico del -CH3 (Chatterjee et al.,
2014). La PG presenta las siguientes bandas: la región de la huella dactilar a 1,734
cm-1 presenta un enlace C=O, a 1,452 cm-1 un enlace C-O, en 1,852 cm-1 presenta
una banda correspondiente al grupo metilo (C-O-CH3) (Arivizhivendhan et al.,
2015), lo que permite observar que el material fue modificado y hay presencia de
PG inmovilizada.
39
Fig. 8. Espectro de FTIR de TiO2 prístino y TiO2 +SDS +PG.
Para la PG inmovilizada en SiO2 la Fig. 9 muestra las bandas características
para el SiO2 prístino, SDS y PG, que son las siguientes: a 1,100 cm-1 y 800 cm-1 se
observa el estiramiento simétrico del Si-O-Si, a 3,400 cm-1 y 958 cm-1 son bandas
correspondientes al Si-OH (Chen et al., 2013), se observa una ligera banda a 2,950
cm-1 que indica estiramiento asimétrico de -CH3, así como 2 bandas más a 1,220 y
1,108 cm-1 que indican un estiramiento asimétrico y simétrico de S=O del SDS CH3
(Chatterjee et al., 2014), los cuales pueden estar empalmados con la banda a 1,100
cm-1 del estiramiento simétrico del Si-O-Si del SiO2. La PG presenta las siguientes
bandas: la región de la huella dactilar a 1,734 cm -1 presenta un enlace C=O, una
banda a 1,630 cm-1 correspondiente a un enlace C=C (Aruldass et al., 2014) y una
banda a 3,295 cm-1 para un enlace C-C (Arivizhivendhan et al., 2015) al observar
esta bandas, se puede observar que el material fue modificado así como que la PG
fue inmovilizada.
40
Fig. 9. Espectro de FTIR de SiO2 prístino y SiO2 +SDS+PG.
La Fig. 10 presenta las bandas características de la celulosa que son las
siguientes: a 3,391 cm-1 se asigna al estiramiento del -OH, a 2,906 cm-1
corresponde al estiramiento del C-H, la banda a 898 cm-1 es característica del
enlace β-glucosídico entre las unidades de glucosa que conforman la celulosa, a
1,061cm-1 se asigna al grupo -C-O de alcoholes secundarios y funciones de esteres
de la cadena principal de celulosa (Abderrahim et al., 2015), la vibración de flexión
C-H para el grupo -O-C-H se identificó por bandas de 1,389 cm-1 y 1,035 cm-1, la
vibración de estiramiento del grupo -C-O-C- se muestra a 844 cm-1 (Arivizhivendhan
et al., 2015). En cuanto a la PG existen bandas características que se encuentra a
los siguientes números de onda: 2,927 cm-1 asignado al CH aromático y a 1,135
cm-1 se encuentra el C-N (Aruldass et al., 2014), los cuales pueden estar
empalmados en las bandas correspondientes al -OH y al -C-O del espectro de la
celulosa, ya que estas son muy pronunciadas.
41
Fig. 10. Espectro de FTIR de celulosa y celulosa +PG.
En cuanto a la caracterización de los sistemas inmovilizados mediante
espectrofotometría de UV-vis se obtuvieron los siguientes espectros.
La Fig. 11 muestra una señal de absorción a 542 nm atribuido a la prodigiosina,
en comparación con el TiO2 modificado sin pigmento. La PG presenta una señal
característica de 535-540 nm (Guryanov et al., 2013), sin embargo el ligero
desplazamiento observado se debe a la interacción natural del pigmento con el TiO2
modificado.
1
0.9 TiO2+SDS TiO2+SDS+PG
0.8
0.7
Absorbancia
0.6
0.5
0.4
0.3
542nm
0.2
0.1
0
300 400 500 600 700
Longitud de onda (nm)
Fig. 11. Espectro de UV-vis del TiO2+SDS y TiO2+SDS+PG.
42
Para el SiO2 modificado con SDS se obtuvo el espectro de la Fig. 12 donde se
observa una banda a 543 nm correspondiente a la prodigiosina, mostrando el
mismo desplazamiento que en el TiO2.
0.9
0.8
SiO2+SDS SiO2+SDS+PG
0.7
Absorbancia
0.6
0.5 543 nm
0.4
0.3
0.2
0.1
0
200 300 400 500 600 700 800
Fig. 12. Espectro de UV-vis del SiO2+SDS y SiO2+SDS+PG.
Para la celulosa con prodigiosina inmovilizada se observa una señal a 543 nm
atribuida a la prodigiosina (Fig. 13).
0.7
Celulosa Celulosa + PG
0.6
0.5
Absorbancia
0.4
543 nm
0.3
0.2
0.1
0
300 400 500 600 700
Fig. 13. Espectro de UV-vis de la celulosa y celulosa + PG.
43
Con los espectros de FT-IR se comprueba la inmovilización de la prodigiosina
en los materiales propuestos, que a pesar de no presentar de manera clara las
bandas características de la prodigiosina en estos los espectros, los resultados de
UV- vis así como las cinéticas realizadas permiten corroborar la inmovilización ya
que muestran mayor cantidad de prodigiosina inmovilizada en los materiales
modificados en comparación con los materiales prístinos en el caso de los óxidos
de metales.
5.3.3 Isotermas de adsorción
Para conocer el mecanismo de adsorción del pigmento en los diferentes
materiales se llevaron a cabo isotermas de adsorción para cada material, cabe
mencionar que sólo se llevaron a cabo las isotermas para los materiales
modificados (TiO2 y SiO2) y la celulosa, ya que son los materiales que mostraron
mayor capacidad de adsorción. Las isotermas de adsorción de los 3 materiales
fueron ajustados a los 3 modelos mencionados en 4.3.3, pero solo se muestra el
grafico del modelo al que mejor se ajustó cada isoterma, así como sus respectivas
constantes de adsorción de acuerdo con el modelo correspondiente.
En la Fig. 14 se observa el grafico lineal del TiO2 modificado ajustado al modelo
de Freundlich, en la Figura se observa que este es el modelo que mejor se ajusta
al obtener un coeficiente de determinación R2= 0.92. El modelo de Freundlich
describe una adsorción no ideal e irreversible, que puede aplicarse a la adsorción
multicapa, donde la capacidad adsorbida es la suma de adsorción en todos los
sitios, donde los sitios de unión más fuerte son ocupados primero, hasta que la
44
energía de adsorción disminuye exponencialmente al completar el proceso de
adsorción (Foo y Hameed, 2010).
log Ce
3.5 4 4.5 5
-3.5
-3.7
-3.9
-4.1 R² = 0.926
-4.3
log Qe
-4.5
-4.7
-4.9
-5.1 y = 0.926x - 8.6453
-5.3
-5.5
Fig. 14. Grafico lineal de la adsorción de la prodigiosina en TiO2 modificado con

ajuste al modelo de Freundlich.
En la tabla 4, se muestran las constantes de adsorción de la prodigiosina en el
TiO2 modificado, ajustada al modelo de Freundlich donde: Kf es un indicador
aproximado de la capacidad de adsorción, obteniendo que 1 g de TiO2 modificado
inmoviliza aproximadamente 2.29X10-9 mg de prodigiosina/g de material, en cuanto
a valor de n =1 indica que la partición entre las 2 fases es independiente de la
concentración y el valor de 1/n= 0.926 indica que la inmovilización es de tipo normal
(Dada et al., 2012).
Tabla 4. Constantes de adsorción de la prodigiosina en TiO2 modificado.

Isoterma de Freundlich
𝟏 n 𝑲𝒇 (mg/g) 𝑹𝟐
𝒏
0.926 1.08 2.29X10-9 0.926
45
Para la inmovilización de la prodigiosina en SiO2 modificado se realizó el ajuste
lineal para los 3 modelos propuestos, resultando el modelo de Temkin el que mejor
se ajusta, en la Fig. 15 se muestra el ajuste del modelo lineal de Temkin para el
SiO2 modificado con prodigiosina inmovilizada.
El modelo de Temkin asume un comportamiento de adsorción caracterizado por
una distribución uniforme de energías de unión hasta alcanzar un valor máximo de
energía de unión (Johnson y Arnold, 1995).
0.00007
0.00006
R² = 0.9658
0.00005
0.00004
Qe
0.00003
0.00002 y = 5E-05x - 0.0003

0.00001
0
7 7.5 8 8.5 9
ln Ce
Fig. 15. Grafico lineal de la adsorción de la prodigiosina en SiO2 modificado con
ajuste al modelo de Temkin.
Con respecto a las constantes de este modelo, se muestran en la tabla 5, donde
A es la constante de equilibrio isotérmico, b es la constante de a isoterma, B es la
constante relacionada con el calor de adsorción y R2 es el coeficiente de
determinación.
46
Tabla 5. Constantes de adsorción de la prodigiosina en SiO2 modificado.
Isoterma de Temkin
A
(L/mg) b B 𝑹𝟐
2.47X10-3 4.96E+07 5X10-5 0.965
Para la celulosa el modelo que mejor se ajusta es el modelo de Langmuir, como
se muestra en la Fig. 16, este modelo describe que el comportamiento de adsorción
se basa en la adsorción de una monocapa (cuyo espesor es del tamaño de una
molécula), la cual solo ocurre en un numero finito de sitios localizados que poseen
la misma afinidad por el adsorbato, sin presentar interacciones laterales e
impedimento estérico entre las moléculas adsorbidas en los sitios adyacentes (Foo
& Hameed, 2010).
200000
180000
160000
y = -19.847x + 210991
140000
120000
1/Qe
100000
80000
60000
40000
R² = 0.9732
20000
0
0 2000 4000 6000 8000 10000
1/Ce
Fig. 16. Grafico lineal de la adsorción de la prodigiosina en celulosa ajustado al

modelo de Langmuir.
47
La tabla 6 muestra las constantes de adsorción del modelo de Langmuir, la qmax
es la cantidad máxima de prodigiosina adsorbida en el adsorbente, KL es la
constante de Langmuir, RL es el factor de separación, que en este caso al ser igual
a 1 quiere decir que la adsorción es de naturaleza lineal.
Tabla 6. Constantes de adsorción de la prodigiosina en celulosa.

Isoterma de Langmuir
qmax KL RL 𝑹𝟐
(mg/g) (L/mg)
4.73X10-6 -9.40X10-5 1 0.973
5.4 Prueba de fotoestabilidad de la prodigiosina
La prueba de fotoestabilidad permitió evaluar la estabilidad del pigmento en
respuesta a las radiaciones UV emitidas por la luz solar, como se observa en la
Fig.17 la concentración de la PG se mantiene constante durante las 120 h
monitoreadas , comprobando la fotoestabilidad de la prodigiosina y por ende su
potencial uso como sensibilizador en celdas solares orgánicas (Posadas Chincilla,
2009), cabe mencionar que existen estudios que emplean pigmento microbianos
para la sensibilización de celdas solares y realizan pruebas de estabilidad
empleando la misma metodología pero en tiempos menores como el realizado por
Órdenes et al., (2016), que hizo la evaluación durante 1 hora haciendo mediciones
en intervalos de 10 minutos.
48
1.100
Concentración (mg/ml)
1.050
1.000
0.950
0.900
0 24 48 72 96 120
Tiempo (h)
Fig. 17. Prueba de fotoestabilidad de la prodigiosina.
5.5 Comprobación de estabilidad de los sistemas inmovilizados.
La prueba de estabilidad se realizó en la celulosa con prodigiosina inmovilizada
(Fig. 18) y el SiO2 modificado con SDS y con prodigiosina inmovilizada.
En el caso de la celulosa la el porcentaje de prodigiosina que fue liberada fue
8.3 % con respecto a la concentración inicial de prodigiosina que había inmovilizada
en la celulosa, al realizar una comparación con el porcentaje reportado por
Arivizhivendhan et al., (2015) que realizó la imovilización de la prodigiosina en una
matriz de celulosa reporto una liberación de prodigiosina del 1.2 %, lo cual puede
ser atribuido a la dimensión de la matriz empleada que fue de 5 cm de diametro por
1 cm de espesor, lo que disminuye el area superficial de contacto del sistema
inmovilizado con respecto a las nanoparticulas empleadas en el presente proyecto
que eran de 20 nm, por lo que al disminuir el tamaño de particula el area superficial
se ve aumentada, facilitando el contacto del agua destilada con el sistema
inmovilizado.
49
102
100
98
% de prodigiosina
96
94
92
90
88
86
0 h 24 h 48 h 72 h 96 h
Tiempo
Fig. 18. Liberación de la prodigiosina inmovilizada en celulosa.
Para la prodigiosina inmovilizada en SiO2 modificado con SDS, el porcentaje de
liberación de prodigiosina después de 96 horas fue de 2.3 % con respecto a la
concentración inicial de prodigiosina que había inmovilizada, lo cual puede deberse
a que la cantidad de prodigiosina que había inmovilizada en este material es mayor
en comparación a la inmovilizada por la celulosa.
102
100
% de prodigiosina
98
96
94
92
90
0 h 24 h 48 h 72 h 96 h
Tiempo
Fig. 19. Liberación de la prodigiosina inmovilizada en SiO2 modificado con SDS.
50
5.6 Realizar pruebas de concepto de los sistemas inmovilizados
5.6.1 Antibacteriano
Las pruebas antibacterianas se llevaron a cabo tanto en prodigiosina libre como
en prodigiosina inmovilizada mediante metodología de macrodilución empleando la
espectrofotometría de UV- vis para realizar las mediciones de D.O.
Para la prodigiosina libre se emplearon 6 concentraciones diferentes (100, 200,
300, 1000, 2000 y 3000 mg/L), de las cueles todas mostraron un resultado negativo,
debido a que hubo crecimiento bacteriano en todas las pruebas realizadas, sin
embargo hay estudios que reportan concentraciones mínimas inhibitorias (MIC) de
la prodigiosina pura contra E. coli: 103.4±6.3 mg/L (Danevčič et al., 2016), y
Karbaschi et al., (2017) reporta una MIC para E. coli de 3,126 mg/L; al homologar
la concentración de prodigiosina pura no se observó el mismo efecto, lo cual puede
ser atribuido al efecto del pH, ya que se ha reportado que la prodigiosina presenta
mejor actividad antimicrobiana a pH ácido (pH 6) en comparación con un pH alcalino
(Gulani et al., 2012), lo que cual puede ser atribuido a que el solvente utilizado en
la presente investigación no permite realizar el ajuste del pH de la solución de
prodigiosina, lo cual puede ser un factor a considerar en estudios futuros.
En cuanto a la prodigiosina inmovilizada en los materiales (celulosa, TiO2, SiO2)
se probaron 3 concentraciones, las cuales no mostraron disminución de crecimiento
bacteriano en cuanto a la D.O, por lo que, como se comentó anteriormente la
concentración de prodigiosina inmovilizada que se empleó en las pruebas
realizadas fue baja en comparación con lo reportado en la literatura, así como cabe
51
mencionar que las concentraciones mínimas inhibitorias, reportadas en la literatura,
están basadas en prodigiosina de alta pureza. Sin embargo, en esta investigación
se realiza solo un proceso de purificación y no se evalúa el porcentaje de pureza
del pigmento, por lo cual la concentración empleada en esta prueba (la cual se trató
de homologar con lo reportado en la literatura) probablemente se encuentre diluida
por otros componentes presentes en la muestra, los cuales no pudieron ser
separados durante la purificación en la columna de cromatografía. Ya que incluso
en cromatografías por capa fina realizadas previamente (resultados no mostrados),
se pueden observar bandas que dan indicios a la posibilidad de tener distintos tipos
de prodigiosina. Por lo cual más estudios deben ser realizados para obtener una
mejor caracterización de la muestra.
5.6.2 Sensibilizador de una celda solar.
La Fig. 20 muestra la curva voltaje contra corriente obtenida de las mediciones
correspondientes a la celda orgánica sensibilizada con prodigiosina, bajo
condiciones del simulador solar. A partir la curva se obtuvieron los parámetros
electroquímicos: corriente en corto circuito Isc (mA-cm2) y Voltaje en circuito abierto
Voc (mV), que son empleados para calcular el factor de llenado ff (%) (Wongcharee
et al., 2007).
Los parámetros electroquímicos de la celda solar sensibilizada con prodigiosina
se muestran en la tabla 7. Con estos resultados observamos que hay un buen
almacenamiento de energía (195 mV), pero con una baja generación de corriente
eléctrica (2.27 mA-cm2), por lo cual, la eficiencia en la conversión de la energía solar
52
debe ser mejorada (0.01 %). Este representa un primer acercamiento al desarrollo
de celdas solares empleando la prodigiosina, lo cual no es común, puesto que
normalmente se emplean pigmentos extraídos de vegetales o frutas. El rendimiento
de la celda solar podría ser optimizado ajustando factores como el tipo de electrolito,
el electrodo de referencia y el solvente de extracción de la prodigiosina. En la Tabla
8 se muestra el rendimiento obtenido de celdas solares sensibilizadas con
pigmentos microbianos (Hymenobacter sp y Chryseobacterium) Órdenes et al.,
(2016) y un pigmento de origen vegetal (Blue pea) (Wongcharee et al., 2007) donde
se observa que el rendimiento obtenido con la prodigiosina se encuentra dentro del
rango reportado para estos pigmentos.
Fig. 20. Curva corriente -voltaje de celda solar sensibilizada con PG.
53
Tabla 7. Parámetros Electroquímicos de la Celda solar sensibilizada con prodigiosna.
Voltaje en
Pigmento Corriente en corto circuito abierto Factor de Eficiencia
circuito Isc (mA-cm2) Voc (mV) llenado ff (%) (%)
Prodigiosina 2.27 195 1 0.01
Tabla 8. Tabla comparativa de eficiencias de pigmentos naturales en celdas orgánicas.

Pigmento Eficiencia Ƞ (%)
Hymenobacter sp.(rojo) 0.03
Chryseobacterium 0.03
(amarillo)
Blue pea 0.05
54
CAPITULO 6
CONCLUSIONES
Se logró producir prodigiosina a partir de la cepa de S. marcescens, utilizando
medio cacahuate al 1 %, obteniendo un total de 2 g del pigmento, así mismo se
logró hacer la caracterización del pigmento mediante espectrofotometría de UV-vis,
obteniendo una banda a 539 nm, la cual se encuentra dentro de lo reportado por
otros autores.
Mediante FT-IR se analizaron los materiales modificados con SDS,
comprobando la presencia de este último compuesto en su estructura, obteniendo
así materiales anfifílicos.
Se logró la inmovilización de la prodigiosina en soportes sólidos de TiO2, SiO2
y celulosa, siendo el SiO2 modificado y la celulosa los que presentaron mejor
resultado inmovilizando 1.14 mg/g y 0.62 mg/g respectivamente, de igual manera
se realizó la caracterización mediante FT-IR, observando bandas características
del surfactante en los materiales modificados, y bandas de la prodigiosina. Así
mismo se evaluó el mecanismo de adsorción mediante las isotermas encontrando
que cada material se ajusta a un modelo diferente.
Se evaluó la fotoestabilidad de la prodigiosina durante 120 horas, obteniendo
como resultado que la concentración de la solución se mantuvo constante,
resultando un pigmento apto para su aplicación como posible sensibilizador de
celdas orgánicas.
55
La estabilidad de los sistemas inmovilizados se evaluó mediante inmersión de
los mismos en agua destilada durante 4 días, obteniendo una liberación del 8.2 %
para la prodigiosina inmovilizada en celulosa y 2.3 % para la prodigiosina
inmovilizada en SiO2 modificado.
Se implementó la metodología de macrodilución empleando espectrofotometría
de UV- vis para evaluar la D.O para evaluar la actividad antimicrobiana de la
prodigiosina pura y el sistema inmovilizado, obteniendo un resultado negativo a las
concentraciones empleadas durante las pruebas debido a que no se observó
disminución en la D.O.
Finalmente se desarrolló una prueba concepto de celda solar orgánica
sensibilizada con PG, la cual resultó con una eficiencia de conversión de 0.01 %,
valor comparable con el rango de eficiencia reportado para pigmentos naturales
(Órdenes et al., 2016). Mostrando así el potencial uso de este pigmento como
sensibilizador y abonando al escaso conocimiento que existe acerca del desarrollo
de celdas solares empleando pigmentos bacterianos, puesto que normalmente se
emplean pigmentos extraídos de vegetales o frutas.
56
PERSPECTIVAS
Realizar un proceso de caracterización de los compuestos que pudieran estar
presentes en la muestra, realizar un proceso de purificación más exhaustivo y
determinar la pureza del pigmento para posteriormente realizar las pruebas
antibacterianas.
Implementar una metodología que permita realizar una evaluación de viabilidad
de las bacterias después del tratamiento con prodigiosina, ya sea libre e
inmovilizada.
Llevar a cabo una optimización del rendimiento de la celda solar sensibilizada
con prodigiosina mediante la variación del electrolito, del tipo de electrodo de
referencia y el solvente utilizado, para obtener una mayor % de rendimiento, ya que
estos factores son de gran importancia para el buen desempeño de una celda solar.
57
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62
ANEXOS
Materiales y reactivos
Se trabajó con material básico de laboratorio como: tubos Falcon, tubos de
ensayo, micropipetas, cajas Petri, soportes universales, matraces, vasos de
precipitados, embudo de vidrio, etc.
Los reactivos utilizados se muestran en la siguiente tabla:
Tabla A-1. Tabla de reactivos utilizados.

Reactivo Marca
Cloroformo J. T. Baker
Metanol J. T. Baker
Caldo LB DIFCO
Agar LB DIFCO
Etanol Desarrollo de Especialidades Químicas
Éter de petróleo Desarrollo de Especialidades Químicas
Silica gel MERK
Ácido clorhídrico Desarrollo de Especialidades Químicas
Dodecil sulfato de sodio IBI Scientific
Triton 100X Amresco
Yoduro de potasio PQM
Yodo MERK
Caldo nutritivo BIOXON
celulosa Sigma Aldrich
Nanoparticulas de TiO2 Sigma Aldrich
Nanoparticulas de SiO2 Sigma Aldrich
Polietilenglicol MERK
Etilenglicol MERK
Alcohol isopropílico J. T. Baker
acetona J. T. Baker
Ácido nítrico Desarrollo de Especialidades Químicas
Caldo Müeller Hinton DIFCO
63
Equipos
Los equipos que se utilizaron en la realización del proyecto se muestran en la
siguiente tabla:
Tabla A-2. Tabla de equipos utilizados.

Equipo Marca Modelo
Centrifuga refrigerada Thermo Electron CENTRA CL 3 R
Utrasonificador Fisher Scientific FB120
Constant Speed Mixer Lab-line 1195
Espectrofotómetro UV-vis Spectronic 4001
Incubadora con agitación SHEL-LAB 1575
Autoclave automática Tuttnauer 2540M
Horno de Secado LAB LINE 3513
Plancha de calentamiento c/agitación Thermo Scientific SP13132
Balanza Analítica AND HR-200
Agitador para tubos grandes Thermolyne M107625
Campana de bioseguridad Labconco 36204-04w
Incubadora con agitación Barnstead SHK4000
international
Baño de ultrasonido Branson 1510R- DTH
Simulador solar Sciencetech 55150
Potenciostato Gamry PCI4-740A
64

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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE NUEVO LEÓN

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

INMOVILIZACIÓN DE LA PRODIGIOSINA PARA APLICACIONES

Patricia Hernández Velasco

Como requisito parcial para obtener el Grado de

Patricia Hernández Velasco Fecha de grado: Noviembre, 2018

Universidad Autónoma de Nuevo León

Área de estudio: Microbiología Aplicada

Firma del asesor: _________________________

Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología CONACYT por la beca otorgada.

A la Universidad Autónoma de Nuevo León y a la Facultad de Ciencias Quimicas por

las instalaciones brindadas en donde se llevó a cabo el desarrollo de este proyecto.

A la Dra. Melissa Marlene Rodríguez Delgado por su apoyo, paciencia asesoría.

retroalimentación recibida durante la realización del presente proyecto.

A los profesores del posgrado, por el tiempo y los conocimientos compartidos.

A mis compañeros y amigos del laboratorio quienes con su apoyo y amistad

permitieron que esta experiencia fuera más agradable.

A mi madre por el amor y apoyo incondicional.

Tabla 1. Materiales empleados como soportes para inmovilización ....................... 6

Fig. 1 Mecanismo de acción del grupo metoxilo de la Prodigiosina sobre la

En el campo de la microbiología moderna se han generado estudios sobre una

gran diversidad de productos metabólicos que pueden ser utilizados en

aplicaciones biotecnológicas, tales como enzimas, pigmentos, antibióticos, entre

microorganismos poseen características de gran importancia para la industria, ya

(Darshan y Manonmani, 2015), así mismo, existen pigmentos que presentan

actividad antioxidante, así como algunas actividades biológicas tales como:

antimicrobiana e inclusive algunos que pueden presentar actividad

empleados microorganismos, así como sus metabolitos. Como, por ejemplo, el

desarrollo de las celdas de combustible microbianas que consisten en la

transformación de la energía química en energía eléctrica a partir de un sustrato

presente. Así mismo, en los últimos años, se ha incrementado el interés en el

extraídos de diversas fuentes como: plantas, flores, vegetales (Hosseinnezhad et

al., 2018) y recientemente de algunas especies bacterianas (Órdenes et al.,2016),

dichos pigmentos se emplean para la sensibilización de las celdas solares,

mencionar que la mayoría de los pigmentos extraídos de microorganismos no

presentan toxicidad y son biodegradables, lo que les confiere ciertas ventajas

tecnológicas comparadas con su contra parte de origen sintético (Usman et al.,

1.1 Serratia marcescens

Dentro del grupo de microorganismos capaces de producir pigmentos

sobresale la bacteria Serratia marcescens, que es una bacteria Gram negativa,

anaerobia facultativa y pertenece a la familia Enterobactericeae, suele estar

ampliamente distribuida en el ambiente, encontrándose comúnmente en suelo,

2004), así como su resistencia a los antibióticos colistina, cefalotina y ampicilina

(Grimont y Grimont, 2006). Bajo ciertas condiciones de cultivo, S. marcescens

posee la capacidad de producir prodigiosina (Giri,et al., 2004). Este metabolito

secundario ha sido estudiado ampliamente, encontrándose que factores como la

temperatura, pH, fuente de carbón, fuente de nitrógeno y la presencia de algunas

sales orgánicas beneficiaban su producción (De Araújo et al., 2010).

La prodigiosina es un pigmento hidrofóbico (Haddix et al., 2008) con estructura

tripirrólica, insoluble en agua y soluble en solventes orgánicos como cloroformo,

metanol, acetonitrilo y Dimetilsulfóxido (DMSO) (De Araújo et al.,2010).Este

Pseudoalteromonas sp., Haella chejuensis, Vibrio sp., Streptomyces coelicor

(Lapenda et al., 2014).

se encuentran propiedades antibacterianas, antifúngicas e inmunosupresoras,

permitan aumentar su producción, y por ende poder buscar nuevos campos de

aplicación para este metabolito.

A pesar de la gran diversidad de aplicaciones que puede tener la prodigiosina,

Arivizhivendhan et al., (2015) encontrando que el grupo metoxilo de la prodigiosina

es el encargado de romper los enlaces peptídicos presentes en la membrana