St. Aureus

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Biología molecular: herramienta para estudios de ecología microbiana

aplicada a estudios ambientales
Chapter · January 2011
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Nathalie Cabirol Marcelo Rojas-Oropeza

Universidad Nacional Autónoma de México Universidad Nacional Autónoma de México
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Francisco J. Fernández
Metropolitan Autonomous University
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Impacto de la biología molecular y las
nuevas tecnologías en el conocimiento de
la función celular y sus aplicaciones
Francisco Fierro Fierro

Marcela Vergara Onofre
Editores
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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANA

Rector General
Dr. Enrique Fernández Fassnacht
Secretaria General
Mtra. Iris Edith Santacruz Fabila
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANA-XOCHIMILCO

Rector
Dr. Salvador Vega y León
Secretaria
Dra. Beatriz Araceli García Fernández
DIVISIÓN DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y DE LA SALUD

Director
Dr. Fernando de León González
Secretaria Académica
M. en C. Georgina Urbán Carrillo
Asistente Editorial
Lic. Zyanya Patricia Ruiz Chapoy
Comité Editorial
Dra. María Guadalupe Prado Flores
Dr. Hugo Ramírez Saad
Dra. Gabriela del Pilar Romero Esquiliano
M. en C. Jesús Sánchez Robles
Impacto de la biología molecular y las nuevas tecnologías en el conocimiento de la función

celular y sus aplicaciones
Primera edición: 2011
ISBN: 978-607-477-560-0
D.R. © UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANA

Unidad Xochimilco
Calzada del Hueso 1100
Col. Villa Quietud, Del. Coyoacán
C.P. 04960, México, D.F.
Tel.: 54 83 70 00 ext. 3783
D.R. © Coordinadores: Francisco Fierro Fierro, Marcela Vergara Onofre

D.R. © Diseño de portada Mtra. Martha Flores
Impreso y hecho en México
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ÍNDICE
A.- AVANCES RECIENTES EN MICROBIOLOGÍA Y BIOTECNOLOGÍA
Sistemas biosintéticos, genética y regulación del metabolismo secundario; nuevas
metodologías para su estudio................................................................................... 13
Dr. Francisco Fierro Fierro
Metabolitos secundarios de actinomicetos................................................................ 27

Dr. Armando Mejía Álvarez
Avances en la producción de antibióticos y otros metabolitos secundarios.............. 39

Dr. Javier Barrios González
Métodos actuales para el estudio de microorganismos en alimentos....................... 45

Dra. Gloria Díaz-Ruiz
Dra. Carmen Wacher
Identificación y tipificación molecular de Staphylococcus aureus en alimentos........ 55

Dr. Jaime A. Bustos Martínez.
Rutas de transducción de señales y regulación de la morfogénesis en hongos....... 67

B.- AVANCES RECIENTES EN ECOLOGÍA Y AGRONOMÍA

Biología molecular: herramienta para estudios de ecología microbiana
aplicada a estudios ambientales............................................................................... 77
Dr. Nathalie Cabirol
Dr. Marcelo Rojas-Oropeza
Dr. Francisco J. Fernández
Biorremediación de suelos contaminados por compuestos organoclorados............ 99

Dra. Araceli Tomasini Campocosio
Fertilizantes de liberación lenta y su aplicación en campo......................................111

Dr. Mayra González Hurtado
Generación, uso e implementación de organismos genéticamente

modificados para fines agrícolas: el caso del maíz en México............................... 123
Dra. Alma Piñeyro Nelson
Aplicación de técnicas de biología molecular para estudios de ecología

de actinomicetos halófilos en México...................................................................... 135
Dra. Araly A. Salgado Parra
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C.- PROCESOS CELULARES FUNDAMENTALES
Muerte Celular......................................................................................................... 145

Dra. Ana Ma. Rosales Torres
La participación de la asimetría fosfolipídica de la membrana plasmática

en diferentes tipos celulares, tomando como modelo al espermatozoide............... 155
Dr. Alejandro Ávalos Rodríguez
Dra. Clara Ortega Camarillo
Análisis genómico del repertorio inmunológico....................................................... 165

Dr. Jesús Martínez Barnetche
Participación de la ceramida en la implantación embrionaria................................. 175

Dr. Román Espinosa Cervantes
Dr. Adolfo Rosado García
D.- BIOMEDICINA
Desacoplamiento mitocondrial en diabetes tipo 2................................................... 187

Alejandro Ávalos Rodríguez
Alteraciones en la vía de la señalización de la insulina y su relación con

obesidad y diabetes................................................................................................ 203
Dra. Rebeca García Macedo
Carcinomas cerebrales, principios y mecanismos bioquímicos.............................. 213

Dra. Sonia Recillas Gispert
Enfermedades neurodegenerativas........................................................................ 223

Dra. Marcela Vergara Onofre
Bioquímica de los esteroides y su acción a nivel del sistema nervioso central...... 237
Dr. Emma Elisa Ortiz Islas
Posibles acciones tóxicas de heptacloro y epóxido de heptacloro vinculadas

al estrés oxidativo.................................................................................................... 247
Dra. Guadalupe Prado Flores
La dinámica compleja en electroencefalogramas.

Modelo animal de epilepsia..................................................................................... 261
Dra. Claudia Lizbeth Martínez González
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Farmacocinética y farmacodinamia......................................................................... 275
Dra. Mayra A. Álvarez Lemus
Farmacogenómica: medicina personalizada........................................................... 289

Dra. Marisol López López.
Alteraciones a nivel celular e inmunofenotipo en niños desnutridos....................... 299

Dra. Oralia Nájera Medina
Dra. María Cristina González Torres
Células troncales embrionarias............................................................................... 311

Dra. Teresa Florencia López-Murillo
Diferenciación sexual cerebral................................................................................ 327

Sistema de liberación controlada de medicamentos............................................... 335

Dra. Mayra González Hurtado
EPÍLOGO
Fronteras de la ciencia y universidad moderna....................................................... 349

Dr. Avedis Aznavurian
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PRÓLOGO
La biología molecular es una de las disciplinas que ha tenido un desarrollo más espectacular
durante los últimos años. La revista Science publica anualmente una lista de los que, en opinión de
sus editores y científicos colaboradores, han sido los avances científicos más relevantes del año.
En la lista de 2010, seis los diez descubrimientos pertenecían al ámbito de la biología molecular,
en áreas como la genómica, la ingeniería genética o la biología sintética. Dos trabajos de física,
uno de medicina y otro de biofísica completaban la lista. El número de publicaciones científicas
dentro del campo de la biología molecular no ha dejado de aumentar desde hace años, y las
más prestigiosas revistas científicas multidisciplinarias, como Science o Proceedings of the National
Academy of Sciences of the USA, publican en la actualidad de forma mayoritaria artículos donde
la biología molecular es protagonista. Resulta por tanto muy importante facilitar y apoyar
en nuestra Universidad el desarrollo de esta disciplina, tanto desde un punto de vista básico
como de la aplicación de las metodologías de la biología molecular a diferentes campos de
conocimiento de las ciencias biológicas en su sentido más amplio.
La realización de este libro permite contar con una serie de especialistas en diversos ámbitos,
que van desde la biomedicina a la ecología y la biotecnología, y en cuyos capítulos se tratan
temas, siguiendo un hilo conductor centrado en la biología molecular y los avances que las
metodologías de la biología molecular han supuesto para estos temas. Aprovechando la
experiencia de los autores de los capítulos de éste libro, en gran mayoría miembros del Sistema
Nacional de Investigadores, se cuenta con la oportunidad de publicar un libro que recoge en su
capitulado temas de actualidad en las diferentes disciplinas del área biológica.
Además de tratar temas relacionados con la biología molecular, se ha querido dar cabida
también a otras metodologías de creciente importancia para los temas tratados. Tal es el caso
de la nanotecnología, cuyo desarrollo emergente está adquiriendo cada vez mayor notoriedad
y que se prevé tenga un gran impacto en un futuro próximo en campos como la biomedicina.
Así, dos de los capítulos del libro tratan sobre la aplicación de la nanotecnología en agronomía
y en farmacología respectivamente.
El libro se estructura en cuatro secciones que agrupan los diferentes capítulos por su temática.
La primera de estas secciones lleva por título “Avances Recientes en Microbiología
y Biotecnología”, y en la misma se tratan aspectos sobre la producción de metabolitos
secundarios microbianos por un lado, y sobre microbiología de alimentos por otro. Los hongos
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Prólogo
y las bacterias del grupo de los Actinomicetos son los principales microorganismos productores
de metabolitos secundarios, muchos de los cuales encuentran una aplicación en medicina
humana o veterinaria como antibióticos o fármacos para tratar diferentes dolencias. En el
primero de los capítulos, “Sistemas biosintéticos, genética y regulación del metabolismo secundario; nuevas
metodologías para su estudio”, se introduce el tema de los metabolitos secundarios, analizando su
diversidad estructural, sus sistemas biosintéticos y la regulación de su biosíntesis. En otro de
los capítulos de esta sección se analiza la regulación del desarrollo morfológico en los hongos
filamentosos y la estrecha relación que este proceso tiene con el metabolismo secundario. Otro
de los capítulos, “Metabolitos secundarios de actinomicetos”, se centra en la biosíntesis de metabolitos
secundarios por parte de este importante grupo bacteriano, revisando aspectos como su
regulación y su conexión con el desarrollo morfológico. Y en el capítulo que lleva por título
“Avances en la producción de antibióticos y otros metabolitos secundarios” se analiza la tecnología de la
fermentación en medio sólido, de interés creciente y que está empezando a ser utilizada en
la producción de metabolitos secundarios como la lovastatina. En cuanto a la microbiología
de alimentos, el capítulo “Métodos actuales para el estudio de microorganismos en alimentos” hace una
revisión de las metodologías que en la actualidad se utilizan en esta disciplina, muchas de las
cuales son técnicas de biología molecular, y al final del trabajo “Identificación y tipificación molecular
de Staphylococcus aureus en Alimentos” describe la aplicación de algunas de estas metodologías en la
identificación y tipificación de esta bacteria patógena.
En la segunda sección, “Avances Recientes en Ecología y Agronomía”, se incluyen

capítulos que abordan problemas que se plantean actualmente en estas disciplinas y sus
posibles soluciones, desde la óptica de la biología molecular fundamentalmente. La sección se
abre con un amplio trabajo sobre la utilización de técnicas de biología molecular en el estudio
de la ecología microbiana. Otro de los capítulos aborda la utilización de estas metodologías
en el estudio de actinomicetos halófilos en México. El capítulo “Biorremediación de suelos
contaminados por compuestos organoclorados” se centra en los mecanismos moleculares que poseen
diferentes grupos de microorganismos para la degradación de este tipo de compuestos, y en la
utilización de la ingeniería genética para la mejora de las características de cepas que pueden
tener una aplicación en biorremediación de estos compuestos. Los otros dos capítulos de esta
sección abordan temas de agronomía, desde la óptica de las nuevas metodologías que se están
utilizando para el mejoramiento de las variedades de cultivo y de su rendimiento productivo.
En el capítulo “Generación, uso e implementación de organismos genéticamente modificados para fines
agrícolas: el caso del maíz en México” se analiza el tema de los transgénicos, centrándose en el caso
del maíz transgénico en México, y en el capítulo “Fertilizantes de liberación lenta y su aplicación en
campo” se describe como diferentes tecnologías basadas en nanotecnología pueden utilizarse en
una mejor aplicación de los fertilizantes en campo.
La tercera sección, “Procesos Celulares Fundamentales”, está dedicada al análisis de

algunos procesos fisiológicos primordiales como la apoptosis o la respuesta inmune, el primero
de estos como ciclo celular y la relación con la muerte celular fisiológica siendo un proceso
natural programado, controlado por mecanismos moleculares complejos, cuyo conocimiento
es un objetivo primordial de la biología y la medicina contemporánea y el segundo, explicando
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Dr. Salvador Vega y León
las interacciones desde el punto de vista molecular del individuo sano y su interrelación con
agentes antigénicos.
La cuarta y última sección, que lleva por título “Biomedicina”, está dedicada por completo
a esta disciplina, y se abordan diferentes problemas médicos desde un punto de vista de la
biología molecular, completándose la sección con algunos capítulos dedicados a aspectos
farmacológicos. Los dos capítulos que abren la sección se centran en una de las dolencias de
mayor incidencia y progresión en México, la diabetes, analizando aspectos moleculares de la
misma. Varios capítulos abordan temas de neurología, como los carcinomas cerebrales o las
enfermedades neurodegenerativas, centrándose en sus aspectos bioquímicos y moleculares. En
la misma línea se desarrolla el trabajo “Bioquímica de los esteroides y su acción a nivel del sistema nervioso
central”. Otros temas tratados en esta sección son las alteraciones celulares e inmunológicas en
niños desnutridos, las células troncales embrionarias y su importancia de cara al futuro en
el tratamiento de diferentes dolencias, y la epilepsia y su descripción mediante la dinámica
en electroencefalogramas. Finalmente, tres capítulos más abordan aspectos de farmacología,
como la farmacocinética y la farmacogenómica. Esta última disciplina, que se trata en el
capítulo “Farmacogenómica: medicina personalizada”, está adquiriendo un gran protagonismo en
el paulatino desarrollo de tratamientos personalizados; desde hace mucho tiempo se sabe
que diferentes individuos responden de manera dispar al mismo tratamiento para la misma
enfermedad, y hoy en día las bases genéticas y moleculares de estas diferencias comienzan a
dilucidarse y comprenderse.
Como epílogo, el capítulo “Fronteras de la ciencia y universidad moderna” discute los retos que en la
sociedad actual enfrenta la enseñanza universitaria, que debe reacomodarse permanentemente
a un desarrollo científico y tecnológico cada vez más dinámico y veloz.
En síntesis, el capitulado que compone este libro suponen un aporte al conocimiento sobre la
importancia e impacto que las nuevas tecnologías, principalmente la biología molecular, están
teniendo en diversos ámbitos de las ciencias biológicas, y esperamos que resulte de utilidad
para muchos profesores e investigadores de nuestra universidad y de otras casas de estudio.
Dr. Salvador Vega y León.

Rector de la Universidad Autónoma
Metropolitana-Xochimilco
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INTRODUCCIÓN
Los últimos avances obtenidos a partir de los análisis de datos, que se producen a través de
herramientas incluidas en los campos de la genómica, transcriptómica y proteómica, nos
permiten contar con una amplia colección de datos, que sin embargo, a veces no permiten
comprender de manera integral los mecanismos e interacciones subyacentes, que regulan las
funciones celulares y los sistemas biológicos.
Sabemos que las funciones celulares no pueden atribuirse a una sola molécula biológica, existe
una gran interacción de los diferentes elementos que se localizan en una célula, como son el
DNA, RNA y proteínas, así como moléculas químicas que actúan como segundos mensajeros,
de naturaleza muy diferente a los anteriores como es el caso del calcio. La meta última de esta
era post-genómica, es llegar a comprender como los componentes estructurales y su dinámica
funcional, pueden intervenir para llegar a hacer funcionar a una célula.
La finalidad de este libro es analizar como una o algunas moléculas puede llegar a provocar una
gran variedad de cambios fisiológicos, que incluyen cambios en las vías metabólicas, regulación
de la expresión de diversas proteínas, y establecer los posibles mecanismos que pueden llegar
a provocar estos efectos, incluyendo vías de transducción de señales y efectos epigenéticos,
que podrían deberse a nuevas formas de modificaciones en la expresión de genes. También
se intentará al mismo tiempo, vislumbrar el fundamento y alcances de algunas herramientas
tecnológicas, como la nanotecnología, que permitan correlacionar los avances tecnológicos con
los descubrimientos científicos, y estudiar algunas de sus aplicaciones en campos tan diversos
como la medicina y la agronomía.
La biología es sin lugar a dudas una de las disciplinas científicas que en la actualidad y a
lo largo de las últimas décadas, ha logrado avances más significativos, uno de cuyos hitos
más importantes ha sido la secuenciación del genoma humano, metiéndonos de lleno en la
era de la genómica. Estos avances, además de haber contribuido enormemente a nuestra
comprensión del funcionamiento de los sistemas biológicos, han tenido además consecuencias
importantes en nuestras vidas, tanto en temas relacionados con la salud y la medicina como
en la agricultura, ciencias veterinarias, nutrición, etc. La enseñanza en el Tronco Común
Divisional C.B.S., proporciona a los alumnos la base de los mecanismos que subyacen en
todos los sistemas biológicos que serán objeto de estudio en sus diferentes carreras. Resulta por
ello de gran importancia, que dicha enseñanza sea efectuada teniendo en cuenta los últimos
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Introducción
avances desarrollados en el campo de la biología molecular, la genómica y la proteómica, a

la luz también de otros avances tecnológicos de gran incidencia en diferentes campos de las
ciencias de la vida, todo ello enfocado hacia una comprensión más global del funcionamiento
celular y todas las interacciones subyacentes en los procesos biológicos. Resulta por tanto de
gran importancia, la actualización en el conocimiento de las nuevas técnicas moleculares y lo
que han supuesto para el avance multidisciplinario.
Los Editores
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Sistemas biosintéticos, genética y
regulación del metabolismo secundario;
nuevas metodologías para su estudio
Definición de metabolito secundario
Los metabolitos secundarios (MS) son compuestos microbianos y de plantas no esenciales

para el crecimiento y reproducción de los organismos productores. Cada metabolito secunda-
rio es producido por un número relativamente limitado de especies y sus genes biosintéticos se
encuentran agrupados en el genoma y son dispensables. Los MS tienen a menudo estructuras
químicas complejas e infrecuentes en la naturaleza, y pueden ser sintetizados como una fami-
lia de compuestos muy similares entre sí. En microorganismos son habitualmente producidos
al final de la fase exponencial de crecimiento y durante la fase estacionaria.
Estructuras químicas
Los metabolitos secundarios presentan una enorme diversidad química en su composición

(Martín et al. 2000), dentro de esta diversidad encontramos con frecuencia estructuras quí-
micas como las que se mencionan a continuación:
Aminoazúcares (aminoglicósidos): contienen unidades de mono-

sacáridos y ciclitoles, y son producidos mayoritariamente por Actino-
micetos. Ejemplo: la estreptomicina. Frecuentemente poseen activi-
dad antibiótica.
Quinonas: funcionan frecuentemente

como moléculas señal entre organismos en
la rizosfera (plantas y microorganismos),
especialmente entre raíces de plantas (ale-
lopatía)
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Sistemas biosintéticos
Isoprenoides: como por ejemplo la micotoxina tricoteceno, un

sesquiterpeno.

Phenazinas: frecuentes en bacterias como Pseudomonas, Strep-
tomyces, y Pantoea agglomerans. Se relacionan con la virulencia y
competitividad de los microorganismos productores.

Cumarinas: poseen un núcleo de benzo-2-pi-
rona (anillo B). Las aminocumarinas tienen tres
anillos: A (4-hidroxibenzoato), B (benzo-2-piro-
na), y C (desoxiazúcar). El aminoácido tirosina es
el precursor de los anillos A y B, mientras que el
anillo C (desoxiazúcar) deriva de la Glc-1-P. La
Novobiocina (en la figura) es un inhibidor de la
girasa bacteriana y por tanto un antibiótico.

Péptidos no ribosomales: son péptidos lineares o cir-
culares que se sintetizan por complejos enzimáticos de
una forma diferente a la síntesis habitual en ribosomas.
Suelen tener tamaños inferiores a los 3000 Da, y en su
estructura es frecuente la presencia de aminoácidos in-
usuales, como β-aminoácidos, iminoácidos, derivados
N-metilo, hidroxiaminoácidos y aminoácidos en con-
figuración D. Presentan gran resistencia a la digestión
por proteasas y frecuentemente poseen actividades de
tipo antibiótico, como el que se muestra en la figura: la
tirocidina.

Polikétidos: son un grupo de com-

puestos muy diverso con estructuras
complejas formadas por la adición
de unidades de acetato o propionato.
Son producidos principalmente por
bacterias del grupo de los Actinomi-
cetos y por hongos. Dentro de los po-

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likétidos encontramos macrólidos (como la anfotericina B en la figura), polienos, tetraciclinas,

aflatoxinas y otros muchos tipos de compuestos con actividades diversas.

Nucleósidos: como las Nikkomicinas (peptidil-nu-
cleósidos): son competidores específicos de la quitina
sintasa debido a su similitud estructural con la UDP-
N-acetilglucosamina, que es el sustrato natural de la
enzima, por lo cual poseen actividades antifúngicas,
insecticidas y acaricidas.

Implicaciones de las estructuras químicas de los metabolitos secundarios
Esta enorme diversidad en las estructuras de los MS tiene importantes implicaciones en cuan-
to a su modo de biosíntesis y la utilidad que presentan para el ser humano, podemos resumir-
las de la siguiente forma:
Complejidad. La complejidad de las estructuras químicas de los MS requiere sistemas enzi-

máticos complejos, cuyos genes se agrupan en forma de clusters. Dichos clusters biosintéticos
para un determinado metabolito secundario están presentes sólo en un grupo reducido de
especies, por lo general relacionadas, que sintetizan diferentes variantes químicas del meta-
bolito.
Familias de compuestos. Los MS suelen producirse como familias de compuestos similares

por un mismo microorganismo, esto es debido principalmente a la baja especificidad enzimá-
tica (broad substrate specificity) de las enzimas que participan en sus rutas biosintéticas. Como
ejemplo podemos mencionar cepas de Streptomyces sp. que producen hasta 32 antibióticos del
tipo antraciclina (un polikétido) muy similares.
Multitud de actividades biológicas. La complejidad y enorme variabilidad de sus estructuras

químicas hacen que los metabolitos secundarios posean una gran cantidad de actividades
biológicas diferentes. Muchas de ellas son de utilidad para el hombre, y muchos MS se uti-
lizan en la práctica clínica como antibióticos (penicilina, tetraciclinas, novobiocina) antitu-
morales (taxol), anticolesterolémicos (lovastatina), etc. En otras ocasiones son tóxicos para
las células humanas, como ocurre con las micotoxinas (ocratoxina, aflatoxinas), que pueden
aparecer sobre alimentos debido al desarrollo de hongos sobre los mismos.
Función de los metabolitos secundarios en la naturaleza
La función que los MS tienen para el organismo productor ha sido un punto de controversia
frecuente. Los principales puntos de vista que se han dado sobre su función en la naturaleza
se resumen en los siguientes:
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1- Posesión de una actividad biológica, predominantemente de tipo antibiótico, que confiere

a los productores una ventaja competitiva sobre otras especies.
2- Mecanismo para convertir intermediarios del metabolismo primario, que se acumulan al

llegar la fase estacionaria de crecimiento y pueden resultar tóxicos, en compuestos inocuos
(MS), permitiendo a su vez que parte del metabolismo primario permanezca operativo en
periodos de stress metabólico.
3- Sistema que tiene un microorganismo para sustraer nutrientes del medio en periodos de
escasez y de esta forma evitar que sean utilizados por competidores, a la vez que sintetiza
compuestos (MS) no utilizables como nutrientes por los competidores y que en muchos casos
son tóxicos para ellos. Esta hipótesis está en parte relacionada con la 1.
4- Los MS serían señales de comunicación intercelular del tipo quorum sensing.
La hipótesis 4 ha sido demostrada para algunos metabolitos secundarios, aunque no para la

mayoría. Hoy en día la hipótesis 1 es la más ampliamente aceptada, sin descartar la 3, que
es complementaria de la anterior. Evidencias en favor de la hipótesis 1 son las siguientes: 1)
Sólo organismos que carecen de sistema inmune producen MS (plantas y microorganismos),
que actuarían como un sistema de defensa. 2) A menudo los genes de resistencia para un
determinado antibiótico se encuentran agrupados en un cluster con los genes biosintéticos,
lo que demuestra la actividad de estos compuestos en condiciones naturales. 3) La extrema
complejidad y gasto energético de la biosíntesis de MS sugiere que éstos tienen funciones que
otorgan ventajas competitivas a los productores.
Sin embargo, a pesar de todas estas evidencias, se observa que la mayoría de los MS no pare-
cen tener ninguna actividad biológica en el momento de testarlos frente a diferentes microor-
ganismos. Firn y Jones (2000) propusieron un modelo para explicar esta aparente paradoja,
razonando que aunque es difícil que una única molécula posea en un momento determinado
de la evolución actividad biológica frente a organismos competidores, resulta conveniente
para el productor la posesión de la maquinaria biosintética de los MS, ya que una simple mu-
tación, o la adquisición de un gen pueden generar, gracias a la baja especificidad de sustrato
de las enzimas implicadas en su biosíntesis, una nueva serie de compuestos, multiplicándose
de esta forma la posibilidad de que alguno de ellos resulte eficiente frente a otros organismos.
La ventaja selectiva estaría en la posesión de una maquinaria biosintética capaz de generar
un elevado y cambiante número de estructuras, y no en la capacidad de sintetizar una deter-
minada y única estructura.
Biosíntesis de los metabolitos secundarios
Los metabolitos secundarios se sintetizan a partir de intermediarios del metabolismo prima-

rio. En microorganismos se producen durante la idiofase, esto es, después de que el cultivo
ha finalizado su fase exponencial de crecimiento y se encuentra en la fase estacionaria, en
contraste con la trofofase o fase de crecimiento.
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Pueden subdividirse las reacciones enzimáticas que dan origen a los metabolitos secundarios
en 4 grupos (Martín et al. 2000):
I- Reacciones de conversión de metabolitos primarios en precursores específicos del metabo-

lismo secundario
II- Reacciones que comprometen los precursores hacia rutas específicas del metabolismo se-
cundario (p.ej. mediante activación o modificación)
III- Reacciones de polimerización y condensación, que dan lugar a polikétidos, péptidos,
isoprenoides, etc
IV- Reacciones tardías (a posteriori) de modificación
El orden de los dos primeros grupos de reacciones (I. conversión en precursores y II. reaccio-
nes de compromiso) puede variar, a veces la primera reacción de conversión es una modifica-
ción que introduce al intermediario en una vía de metabolismo secundario.
Como cabría esperar, existe una gran diversidad en las rutas biosintéticas de los MS. Dos de
los más representativos sistemas enzimáticos, exclusivos del metabolismo secundario, son los
que se describen a continuación: péptido sintetasas y polikétido sintetasas
Péptido Sintetasas: son complejos multienzimáticos estructurados en módulos y dominios

(Fig. 1). Cada uno de los módulos selecciona y activa un aminoácido que formará parte de
la estructura del péptido. Cada módulo está a su vez constituido por una serie de dominios
con diferentes funciones: dominio de adenilación (activación del aminoácido mediante la for-
mación de un derivado adenilado), peptidyl carrier (en el cual está presente como cofactor una
molécula de fosfopanteteína, que transporta el aminoácido activado al siguiente dominio),
dominio de condensación (forma el enlace peptídico entre dos aminoácidos). Estos 3 dominios
constituyen un módulo mínimo, junto a ellos pueden aparecer otros en algunos módulos,
responsables de modificaciones químicas en los aminoácidos incorporados: p. ej. dominio
epimerasa, dominio metil-transferasa, dominio de ciclación, etc.
Figura 1. Estructura en módulos y dominios de las péptido sintetasas (modificado de Gutiérrez et al.
2002; y Konz et al. 1997). δ-(L-α-aminoadipil)-L-cisteinil-D-valina sintetasa (ACVS), gramicidina sinteta-
sa (GS), tirocidina sintetasa (TY), bacitracina sintetasa (BS)
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Polikétido sintetasas: Las polikétido sintetasas (PKS) tienen un funcionamiento seme-

jante al de las ácido graso sintetasas, con la salvedad de que en estas últimas los interme-
diarios son totalmente reducidos, mientras en los polikétidos algunas reacciones reductoras
no se dan en los diferentes intermediarios, pudiéndose originar entonces una gran variedad
de compuestos.
Todos los polikétidos están formados por unidades básicas de 2, 3 o 4 carbonos: acetato (de-
rivado del malonil-CoA), propionato (del metilmalonil-CoA) o más raramente butirato (del
etilmalonil-CoA). Están unidades se van agregando en sucesivos ciclos (condensación descar-
boxilativa), en cada uno de los cuales se llevan a cabo una, varias o ninguna de las siguientes
actividades: cetorreducción, deshidratación y enoilrreducción.
Las PKS se organizan también en forma de módulos y dominios. Cada uno de los módulos
incorpora y modifica una unidad de acetato, propionato o butirato. Los dominios que cons-
tituyen un módulo básico de una polikétido sintetasa son: Cetosintasa (KS), Aciltransferasa
(AT) y Acyl-carrier, con un cofactor de fosfopanteteína (ACP). Junto a éstos pueden aparecer
dominios para reducir el O de cada unidad incorporada: cetorreductasa (KR), deshidratasa
(DH), enoil reductasa (ER), y otros dominios con diferentes funciones: metiltransferasa (MT),
ciclasa (CYC), y tioesterasa (TE).
Las polikétido sintetasas pueden dividirse en dos tipos:

PKS modulares o de tipo I: consisten en una enzima modular multifuncional (Fig. 2), en cada
dominio catalítico se lleva a cabo una función una sola vez durante la síntesis, hasta que se
completa la estructura definitiva. Son más versátiles que las de tipo II en cuanto a los sustratos
que utilizan, y dan lugar a estructuras moleculares complejas, a menudo cíclicas (macrólidos).
PKS iterativas o de tipo II: consisten en un complejo multiproteico donde cada polipéptido
lleva a cabo una única actividad enzimática y es utilizado varias veces en sucesivas rondas,
incorporando una nueva unidad cada vez, hasta completar la molécula final. Forman meta-
bolitos secundarios con estructuras de anillos aromáticos, como las tetraciclinas. Usan casi
exclusivamente acetato y malonil-CoA.
Por lo tanto, existen muchas fuentes de variabilidad para generar las muy diversas estructuras
de los polikétidos:
- El número de unidades (acetato, propionato) incorporadas, que determinará el tamaño de

la molécula
- El tipo de unidad iniciadora (suele ser acetato) y extensoras
- Las actividades de cetorreducción, deshidratación y/o enoilrreducción que se llevan a cabo
en cada unidad incorporada, lo que da lugar a diferentes estados de oxidación (grupos hi-
droxilo, cetona) y dobles enlaces
- La presencia de residuos aminoacídicos en algunos polikétidos (rapamicina, virginiamici-
na); hay una interacción entre la polikétido sintasa y una péptido sintetasa no ribosomal
- Las modificaciones a posteriori: oxidaciones, glicosilaciones, metilaciones
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Figura 2. Esquema general del mecanismo de biosíntesis de una polikétido sintetasa (modificado de
Aparicio et al. 2002). Las líneas discontinuas representan cortocircuitos de la ruta que pueden ocurrir
en un determinado ciclo para dar lugar a (a) ceto, (b) hidroxi, (c) enoil, (d) metileno, diferentes estados
de reducción en la estructura final del polikétido. Dominios: AT, aciltransferasa; ACP, acyl carrier protein;
KS, cetosintasa; KR, cetorreductasa; DH, deshidratasa; ER, enoilrreductasa; TE, tioesterasa.
Genética de la biosíntesis de metabolitos secundarios
En los procariotas es frecuente que los genes pertenecientes a una determinada vía, anabólica
o catabólica, se encuentren agrupados, habitualmente disponiéndose en forma de un operón.
En eucariotas esto es mucho más infrecuente, sin embargo los genes de determinadas vías me-
tabólicas fúngicas sí se encuentran agrupados (Keller y Hohn, 1997). Estas vías metabólicas
son por lo general dispensables, aunque pueden ser importantes en la supervivencia del hongo
ya que funcionan normalmente en condiciones subóptimas o limitantes de crecimiento. La
mayoría de estas vías encajan en dos grandes grupos:
1- Vías catabólicas para la utilización de fuentes de nutrientes poco usuales (etanol, prolina,
nitrato).
2- Vías biosintéticas de metabolitos secundarios
Las razones por las cuales los genes de las rutas del metabolismo secundario se encuentran
agrupados se relacionan probablemente con la regulación simultánea de los mismos, como
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ocurre en el caso de los genes de aflatoxina regulados por LaeA en A. nidulans (Bok y Keller,
2004), regulación que se ha propuesto es de tipo epigenético, por modificación de la estructu-
ra de la cromatina (Bok et al. 2006a).
Los antibióticos β-lactámicos son producidos tanto por organismos procariotas (Streptomyces)
como por hongos (Penicillium chrysogenum, Aspergillus nidulans, Acremonium chrysogenum). El origen
de los genes biosintéticos de β-lactamas es procariota, y existen importantes evidencias de
que algunos de estos genes fueron transferidos horizontalmente a los hongos (Brakhage et al.
2005). Diferentes especies de hongos han desarrollado sus propias vías metabólicas combi-
nando la acción de las enzimas codificadas por los genes de origen procariota con otras de
origen eucariota, para producir antibióticos β-lactámicos diferentes a los sintetizados por las
bacterias, como la penicilina (P. chrysogenum, A. nidulans) y la cefalosporina (A. chrysogenum).
Resulta interesante observar como los genes de origen eucariota, como el gen penDE en P.
chrysogenum y los genes cefD1, cefD2 y cefG en A. chrysogenum, han llegado a agruparse con los de
origen procariota para formar los clusters biosintéticos de penicilina y cefalosporina respecti-
vamente (Fig. 3), es decir, evolutivamente se ha favorecido la agrupación de estos genes de ori-
gen diferente, lo que evidencia que existe una presión selectiva en favor de este agrupamiento
y que la formación de clusters de los genes β-lactámicos fúngicos tiene un sentido funcional, y
no es únicamente una herencia de la transferencia horizontal desde bacterias.
Los clusters de genes del metabolismo secundario suelen incluir, junto a los genes responsables
de la biosíntesis del compuesto, genes de transporte, reguladores, y en procariotas frecuente-
mente genes de resistencia si el compuesto tiene actividad antibiótica (Liras, 1999)
Figura 3. Estructura de los clusters de genes biosintéticos de β-lactamas en procariotas y eucariotas.

pcbAB y pcbC son genes de origen procariota transferidos horizontalmente desde procariotas a los hon-
gos. Los genes de origen eucariota se indican en color gris, y los de origen procariota en negro.
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Existen no obstante algunas excepciones a la regla general de la agrupación de los genes de

las rutas del metabolismo secundario. Por ejemplo en el caso de los genes biosintéticos de
melanina se observa que en la mayoría de los hongos donde se han estudiado sólo unos pocos
de los ellos están agrupados, siendo posiblemente Aspergillus fumigatus el más próximo a un
ancestro común al observarse una agrupación con la mayoría de los genes (Tsai et al. 1999).
Regulación de la biosíntesis de metabolitos secundarios
En procariotas se han encontrado claras evidencias de la relación entre la biosíntesis de

metabolitos secundarios y otros procesos morfológicos asociados, como el desarrollo de mi-
celio aéreo y la esporulación. Se han identificado moléculas denominadas autorreguladores,
como el factor A de Streptomyces griseus, una butirolactona, que actúa como una señal de co-
municación intercelular que regula simultáneamente el desarrollo morfológico y la produc-
ción de estreptomicina (Horinouchi y Beppu, 1994). Las butirolactonas son reconocidas por
proteínas receptoras de butirolactonas (GBRP) que regulan negativamente la expresión de
genes que participan en estos procesos; la unión de la molécula de butirolactona al receptor
permite la expresión de estos genes, que dirigen entonces la respuesta celular de producción
de metabolitos secundarios y esporulación.
Otras moléculas autorreguladoras que controlan la producción de metabolitos secundarios

y no pertenecen al grupo de las butirolactonas se han encontrado en varias especies bacte-
rianas, por ejemplo en Streptomyces natalensis, donde el factor PI, de naturaleza hidrofílica,
señaliza la producción de pimaricina (Recio et al. 2004).
Los genes del metabolismo secundario en procariotas son frecuentemente regulados por fac-
tores de transcripción del tipo denominado SARP (Streptomyces Antibiotic Regulatory Pro-
teins), como por ejemplo AfsR, un regulador general del metabolismo secundario de S. coeli-
color (Lee et al. 2002), o CcaR, que regula la biosíntesis de cefalosporina y ácido clavulánico
en S. clavuligerus (Santamarta et al. 2005).
En eucariotas los genes del metabolismo secundario se regulan por dos tipos de factores
transcripcionales: 1) narrow domain regulators, que son específicos de cada ruta, como por ejem-
plo AflR que regula la biosíntesis de esterigmatocistina en A. nidulans, o Cmr1, que regula la
biosíntesis de melanina en Colletotrichum, y 2) broad domain regulators, que son reguladores gene-
rales del metabolismo, como por ejemplo PacC, que regula genes expresados en condiciones
de pH alcalino y además los genes de la ruta de penicilina en Aspergillus nidulans y Penicillium
chrysogenum (Brakhage, 1998).
Recientemente se ha caracterizado la proteína LaeA en Aspergillus nidulans y Aspergillus fumi-

gatus. LaeA es un regulador general de todo el metabolismo secundario en hongos, y se ha
propuesto que su función puede ser la remodelación de la cromatina mediante su actividad
metiltransferasa (Keller et al. 2005). Este tipo de regulación epigenética puede ser uno de los
motivos de que los genes del metabolismo secundario se agrupen en clusters en los hongos.
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También en eucariotas se ha encontrado que existe una coordinación entre la producción de

metabolitos secundarios y el desarrollo morfológico que conduce al proceso de esporulación
asexual o conidiación (Calvo et al. 2002). Las subunidades α de proteínas G heterotriméricas
fúngicas participan en una ruta de transducción de señales que controla la conidiación y la
producción de metabolitos secundarios como la esterigmatocistina en A. nidulans (Hicks et
al. 1997). Sin embargo, estas subunidades α regulan de forma diferente distintos metabolitos
secundarios, ya que por ejemplo en A. nidulans, la subunidad α FadA regula negativamente la
esterigmatocistina pero positivamente otros metabolitos secundarios como la penicilina (Tag
et al. 2000). En Penicillium chrysogenum se ha observado que la subunidad α Pga1, homóloga a
FadA, regula negativamente la conidiación (García-Rico et al. 2007; García-Rico et al. 2008)
y a la vez estimula la producción de penicilina, demostrando que la función de estas subuni-
dades está bastante conservada en los hongos.
Nuevas metodologías en el análisis del metabolismo secundario
Las nuevas tecnologías de la era de la genómica han permitido avances considerables en el

estudio de la genética del metabolismo secundario, facilitando el descubrimiento de nuevos
clusters de genes biosintéticos, su organización y ubicación cromosómica, así como el análi-
sis de la regulación y expresión coordinada de los genes. A continuación se mencionan tres
ejemplos en los que la genómica y la tecnología de microarrays han sido aplicadas al estudio del
metabolismo secundario en procariotas y en eucariotas.
Proyectos genoma y localización de clusters de genes biosintéticos. La secuenciación

de genomas completos de bacterias y hongos ha permitido la identificación de nuevos clusters
del metabolismo secundario, responsables de la biosíntesis de MS cuya producción por par-
te de la especie analizada era en ocasiones desconocida, revertiendo así el orden clásico de
analizar en primer lugar la producción de compuestos y sus intermediarios y a continuación
clonar los genes biosintéticos.
La secuenciación del genoma de Streptomyces avermitilis ha permitido tener un panorama com-

pleto de todos los clusters de genes involucrados en su metabolismo secundario (Omura et al.
2001). Se encontraron un total de 25 clusters en un genoma de 8.7 Mb, lo que representaba
un 6.4% del total del genoma. Entre ellos se observaron 4 clusters para pigmentos tipo mela-
nina, 11 para la biosíntesis de polikétidos (8 de tipo I y 2 de tipo II) y 10 clusters para péptido
sintetasas. La secuencia de estos genes permitió deducir la función de muchos de los módulos
y dominios de las PKS y las NRPS, y en este último caso pudo identificarse en los módulos
correspondientes el aminoácido que se activaría.
En ocasiones el descubrimiento de clusters del metabolismo secundario se ha producido me-

diante genómica comparativa, como en el caso del cluster de los genes biosintéticos de glio-
toxina en Aspergillus fumigatus, identificados por homología con los genes de biosíntesis de
sirodesmina de Leptosphaeria maculans (Gardiner y Howlett, 2005).
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Uso de microarrays para analizar la expresión y delimitar clusters del metabolis-

mo secundario. Cuando se ha caracterizado el gen regulador de una ruta del metabolismo
secundario y se dispone de mutantes inactivados de dicho gen, pueden llevarse a cabo análisis
comparativos mediante microarrays utilizando cDNA de la cepa silvestre y de la cepa mutante
como sondas, los cuales nos darán mucha información sobre cómo se lleva a cabo la regula-
ción de la expresión de los genes del MS, además de servirnos para 1) delimitar los extremos
de un cluster, y 2) localizar genes involucrados en la biosíntesis aunque no estén agrupados con
el resto del cluster. Esta metodología se utilizó exitosamente en Streptomyces coelicolor para anali-
zar los genes biosintéticos de actinorrodina, undecilprodigiosina y el antibiótico dependiente
de Ca (Huang et al. 2001), y en Aspergillus parasiticus para localizar tres genes relacionados con
la biosíntesis de aflatoxina que no se encontraban agrupados con el resto del cluster, utilizando
un mutante delecionado en el gen aflR, el cual codifica un factor transcripcional que regula
la expresión de los genes de aflatoxina (Price et al. 2006).
Genome mining. Este término se refiere en general al hallazgo de nuevos genes involucra-
dos en determinadas rutas o procesos mediante análisis genómico. Bok et al. (2006b) desarro-
llaron un interesante método de genome mining consistente en la utilización de mutantes ΔlaeA
en el hongo Aspergillus nidulans. El gen laeA, como se mencionó con anterioridad, es un regu-
lador de todo el metabolismo secundario de Aspergillus, por lo que su ausencia mantiene re-
primidos los genes involucrados en el metabolismo secundario. De esta forma se identificó un
nuevo cluster para un MS no descrito previamente en Aspergillus, el antitumoral terrequinona.
Conclusiones
Los metabolitos secundarios son una de las principales fuentes de fármacos en la actualidad.
Los conocimientos sobre los mecanismos enzimáticos y los genes responsables de su biosínte-
sis han permitido la aplicación de técnicas biotecnológicas para la mejora de su producción a
nivel industrial. En la actualidad, la investigación sobre el metabolismo secundario ha expe-
rimentado un empuje de gran relevancia gracias a las nuevas técnicas derivadas de la genó-
mica, que han permitido la identificación de un gran número de clusters biosintéticos nuevos,
así como su delimitación y el estudio de su regulación.
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Metabolitos secundarios de actinomicetos
I. Metabolitos secundarios
Los metabolitos secundarios son moléculas sintetizadas por determinados organismos,

principalmente plantas y microorganismos, en este último caso normalmente se producen en
una fase tardía de su ciclo de crecimiento. Las características generales de los metabolitos
secundarios son (Demain y Fang, 2000; Shapiro, 1989):
• No son necesarios para el crecimiento del microorganismo que los produce. En estado
natural, sus funciones se hallan ligadas a la supervivencia de la especie.
• Cada uno de estos compuestos es producido por un grupo muy reducido de organismos.
• Generalmente se producen como mezclas de productos muy relacionados químicamente

entre sí. Por ejemplo, una única cepa de una especie del género Streptomyces produce 32
antraciclinas diferentes.
• La producción puede perderse fácilmente por mutación espontánea, particularmente

cuando son sacados de su hábitat natural, por esta razón son muy importantes las técnicas
de conservación de estos microorganismos.
Dentro de los metabolitos secundarios más importantes se encuentran los antibióticos, toxinas
(micotoxinas), feromonas, inhibidores enzimáticos, agentes inmunomoduladores, antagonistas
y agonistas de receptores, alcaloides (ácido lisérgico), pesticidas, agentes antitumorales,
promotores del crecimiento en animales y plantas (giberelinas) y pigmentos. Esta gran
variedad de compuestos producidos en la naturaleza se ve reflejada en cerca de los más de
23,000 metabolitos microbianos conocidos, de los cuales el 42% los producen hongos, 32%
actinomicetos y el resto producidos por otros grupos de bacterias (Lazzarini et al., 2000).
Los metabolitos secundarios mejor conocidos son los antibióticos, de los que se han descubierto
más de 5000, cifra que aumenta a razón de una media aproximada de 300 por año, aunque
la mayoría carecen de utilidad pues son tóxicos para blancos no deseados. Aproximadamente
el 75% de los antibióticos conocidos son producidos por actinomicetos (Challis y Hopwood,
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Metabolitos secundarios
2003; Demain y Fang, 2000). Algunas especies son excepcionales productores de antibióticos,
por ejemplo Streptomyces griseus produce al menos 40 antibióticos diferentes.
II. Un poco de historia
Desde la aparición de las civilizaciones urbanas comenzó a desarrollarse un amplio número

de remedios terapéuticos, se intentó racionalizar su utilización y comprender sus efectos
terapéuticos, dentro todavía de una concepción poco racionalizada de la acción medicamentosa
(Lozoya y Lozoya, 1982).
Los médicos egipcios utilizaron una amplia variedad de fármacos con fines antiparasitarios
y antisépticos y las investigaciones realizadas acerca de algunas sustancias o preparaciones
descritas en los papiros han permitido descubrir un cierto conocimiento empírico del fenómeno
de la antibiosis. Así lo demuestra la utilización en preparados de aplicación tópica de levadura
de cerveza, la cual contiene principios activos contra el estafilococo dorado, microorganismo
involucrado en la forunculosis, el impétigo y otras infecciones dermatológicas; también da
prueba de ello el uso de pan fermentado prescrito en algunas fórmulas para el tratamiento
de heridas purulentas, afecciones intestinales y urinarias, cuyo efecto beneficioso se debía a
la presencia de mohos con capacidad antibiótica (Demain y Fang, 2000; García-Rodríguez
et al., 1998).
Por su parte, los aztecas tuvieron vastos conocimientos en la herbolaria, y su legado es tan
importante, que la herbolaria mexica ha sido considerada como una de las más importantes
del mundo. A pesar de que empíricamente utilizaron algunas medicinas, fueron muy eficientes
en el tratamiento de enfermedades, por ejemplo, para dolores de estómago y diarreas muy
severas, utilizaban agua con cal; para el tratamiento de algunas infecciones, utilizaron maíz
agrio; en la actualidad los científicos han estudiado las propiedades de este, y han demostrado
que contiene penicilina (Lozoya y Lozoya, 1982).
Pero no fue sino hasta 1895, que Tiberio observó la acción antibiótica de diferentes extractos
de hongos (Aspergillus, Mucor, Penicillium) frente a diversos microbios in vitro (bacteridia, bacilo
tífico, colibacilo, vibrión colérico, estafilococos) e in vivo (ensayos con conejos inoculados con
bacilos tíficos coléricos), y en 1896, E.A. Duchesne atribuyó esta acción a la producción de
determinadas sustancias tóxicas. Ese mismo año, B. Gossio utilizó, por primera vez, el hongo
Penicillium glaucum en un intento fallido de producir una sustancia antibacteriana y el propio
Duchesne hizo notar que algunos gérmenes patógenos, como el bacilo de Eberth, podían ser
inhibidos incluso in vivo por Penicillium.
La irrupción de la penicilina en la terapéutica antiinfecciosa supuso un punto de inflexión

histórico al cambiar los modos terapéuticos al uso, resolver espectacularmente situaciones
mortales y evitar complicaciones graves a partir de accidentes banales, que antes de los años 40
conferían a la vida una mayor incertidumbre. La penicilina se convirtió en algo providencial,
milagroso en aquella época, y simboliza el comienzo de la era antibiótica. Fue además un
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modelo de planificación –de técnicas, de ensayos y de errores– del que se aprendió para el
desarrollo de las moléculas que le siguieron en una vertiginosa carrera que fue acelerándose
hasta llegar a nuestros días (García-Rodríguez et al., 1998).
El descubrimiento de la penicilina está asumido como un hecho casual, fortuito, al que se ha

rodeado de una romántica y atractiva leyenda. Nada más lejos de la realidad. Sería incluso
una injusticia científica y una agresión a los personajes que han hecho historia, incluidos los
científicos ligados a la penicilina. No hay un solo descubrimiento en la historia de la ciencia que
no estuviera precedido de la sólida formación científica del investigador o los investigadores, de
duros trabajos previos, errores corregidos, obstáculos superados y éxitos parciales no siempre
reconocidos.
La descripción del descubrimiento de la penicilina como la observación casual por Fleming de

un moho contaminante requiere las siguientes aclaraciones:
• No era la primera vez que se observaba y se describía este fenómeno.
• Fleming describe el fenómeno tras estudiar todos los cultivos que había reservado para su
observación durante unas vacaciones, como hacía habitualmente.
• La contaminación es una realidad habitual en cualquier laboratorio.
Pero muy pocas personas como Fleming tenían los conocimientos necesarios para interpretar
la actividad biológica del hongo y la curiosidad científica e interés práctico en sus trabajos para
profundizar en el tema.
Del aire llegó Penicillium y de la tierra los actinomicetos. Los microbiólogos más interesados por
los microorganismos que habitan la tierra saben las dificultades que tienen los microorganismos
patógenos para convivir con aquéllos. Ésta fue la razón por la que S. Waksman y R. Dubos
pensaron que debía existir algún antagonismo entre ambos, lo que favorecería una rápida
destrucción del patógeno. El estudio de los microorganismos del suelo fue una línea de
investigación permanente y principal en la vida de Waksman. Éste había nacido en Ucrania en
1888, emigrando a EE.UU. en 1910. Allí comenzó su carrera como microbiólogo agrícola y sus
primeros trabajos se dirigieron al conocimiento de los hongos y las bacterias que intervienen
en la fertilización de la tierra. Waksman identificó muchos de estos microorganismos como
actinomicetos, aislando y estudiando un gran número de ellos, entre los que destaca el
hallazgo en 1915 del Streptomyces griseus, del que en 1943 se obtendría la estreptomicina. Este
microorganismo también había sido descrito en 1914 por A. Krainsky. El descubrimiento del
antibiótico lo realizaron A. Schatz y S. Waksman, a partir de una cepa aislada de la garganta
de un pollo, y se publicó en 1945. El cultivo original no producía estreptomicina y fue su
irradiación y mutación lo que condujo a la elaboración de dicho antibiótico. La actividad de
este antibiótico sobre Mycobacterium tuberculosis abrió una etapa extraordinaria en el control de
esta enfermedad y por ello Waksman recibió en 1952 el Premio Nobel de Medicina.
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En el camino hacia el descubrimiento de la estreptomicina hay un acontecimiento importante.

Éste fue la identificación de la tirotricina, a partir de Bacillus brevis, por René Dubos, un discípulo
de Waksman. Aunque este antibiótico era tóxico despertó grandes expectativas sobre los
microorganismos del suelo y su aplicación en la terapéutica. Waksman pensó en los hongos y
actinomicetos como los más efectivos. En 1939, una compañía farmacéutica ofreció al investigador
un gran patrocinio, con medios químicos y de equipamiento y animales de experimentación,
para continuar su estudio sobre antibióticos del suelo en la Rutgers University (Nueva Jersey).
Una de las primeras sustancias identificadas fue la actinomicina A, en 1940. Con ella se relacionó
posteriormente la actinomicina D, de aplicación en la enfermedad de Hodgkin. Con la entrada
de EE.UU. en la II Guerra Mundial, el ejército americano planteó la necesidad de contar con
una gran cantidad de medicamentos para tratar las infecciones de los soldados heridos. El
grupo de Oxford había conseguido la penicilina con unos medios económicos y personales muy
limitados. En contraste, Waksman dispuso de grandes posibilidades para su investigación. Si la
penicilina representaba un buen fármaco para las infecciones por gérmenes Gram positivos,
había que buscar una alternativa eficaz ante aquellos otros microorganismos, generalmente Gram
negativos, que no cubría este antibiótico. En 1942, Waksman, en colaboración con H. Woodruff,
aisló la estreptotricina del Streptomyces levendulae. Era el primer compuesto de la familia, aunque
su toxicidad impidió la aplicación en humanos. El trabajo les llevó a probar miles de cultivos; de
ellos, seleccionaron cien sustancias, más tarde tan sólo diez y, de ellas, únicamente una probó ser
un excelente agente. Había sido descubierta la estreptomicina. Rápidamente se potenciaron los
estudios a gran escala bajo la vigilancia del National Research Council. La estreptomicina fue el
primer antibiótico en el mundo financiado con fondos privados. Con él se iniciaba la familia de
los aminoglucósidos (Demain y Fang, 2000).
La investigación de los microorganismos del suelo continuaba. Pronto una gran variedad de
antibióticos iba a surgir a partir de los habitantes de la tierra. El mundo de la terapia antiinfecciosa
se enriquecería con substancias como el cloranfenicol, la gentamicina, las tetraciclinas, los
macrólidos, la fosfomicina, la rifampicina, la novobiocina, etc. (Demain y Fang, 2000).
III. Actinomicetos
Los Actinomicetos son un grupo de bacterias filamentosas, generalmente Gram positivas, que
forman filamentos ramificados. Como resultado de un adecuado crecimiento y ramificación,
se forma una estructura ramificada de filamentos, denominada pseudomicelio, mismo que aún
siendo de dimensiones bacterianas es análogo al micelio que forman los hongos filamentosos.
Muchos actinomicetos forman esporas. Responden al oxígeno en diferentes formas, pues las
hay aerobias y anaerobias, dependiendo de la especie. Los actinomicetos son microorganismos
quimiorganotróficos (Shapiro, 1989).
Algunas características relevantes de los Actinomicetos son:

• Predominan en forma libre en suelos secos y cálidos en cantidades de millones por cada
gramo de suelo.
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• Son capaces de degradar muchas sustancias complejas y consecuentemente juegan un

papel muy importante en la química del suelo.
• La composición de bases del DNA de todos los miembros de los Actinomicetos caen dentro
de un límite relativamente estrecho de 63 a 78% G + C y tienen el porcentaje de G + C
más alto de cualquier bacteria.
• Los géneros predominantes de este grupo son Nocardia, Streptomyces y Micromonospora.
• Son los causantes del olor característico a tierra mojada, originado por la producción de
una serie de metabolitos de estreptomiceto denominados geosminos. Estas sustancias son
compuestos de sesquiterpenoides, anillos de carbono insaturados, oxígeno e hidrógeno.
La primera geosmina descubierta tiene el nombre químico de trans-1,10-dimetil-trans-
9-decanol. Las tierras alcalinas y neutras son las más favorables para el desarrollo de
Streptomyces que los suelos ácidos.
• La propiedad más notable, es el grado en que producen antibióticos. Está comprobado
que más de 500 sustancias antibióticas distintas son producidas por ellos, las cuales
tienen múltiples aplicaciones en medicina, veterinaria y agricultura. Muchos antibióticos
producidos son eficaces en el control de bacterias patógenas o infecciosas (Challis y
Hopwood, 2003).
IV. Estimuladores del metabolismo secundario de actinomicetos
Se cree que el agotamiento de los nutrientes y/o descenso de la velocidad de crecimiento genera
señales que producen una cascada de eventos regulatorios que conducen a la diferenciación
química (metabolismo secundario). La señal es a menudo una molécula inductora de bajo peso
molecular (factor auto-regulador) que se une a una proteína reguladora (proteína represora/
proteína receptora) que impide el metabolismo secundario durante el crecimiento exponencial
y en presencia de exceso de nutrientes. Estas señales activan probablemente un “gen maestro”
que actúa a nivel de traducción, el cual codifica para un tRNA raro y para un factor de
transcripción positivo (Demain, 1989; Gräfe, 1989).
Durante las pasadas tres décadas, diversas categorías de compuestos orgánicos biológicamente
activos han sido estudiados por su posible efecto sobre la biosíntesis de metabolitos
secundarios. Estos grupos incluyen vitaminas, intermediarios metabólicos, inhibidores
enzimáticos, antibióticos y otras clases de agentes medicinales. Para el caso particular de la
rifamicina se ha aislado un compuesto inductor denominado factor-B (Azuma et al., 1990).
Este compuesto se reporta como un elemento regulatorio esencial para la inducción de la
biosíntesis de rifamicina B, lo cual fue demostrado mediante el uso de mutantes deficientes
en la síntesis del antibiótico. Esta deficiencia fue revertida en un medio que contenía extracto
de levadura, de donde posteriormente fue purificado el factor-B. Finalmente se identificó
mediante análisis estructural y síntesis química como 3’-(1-butilfosforil) adenosina. Se
determinó también que la concentración de factor-B requerida para inducir la biosíntesis
del antibiótico es extremadamente baja, alrededor de 10 ng/mL. Kawaguchi et al. (1988)
encontraron también el factor-B en la cepa progenitora. Por su parte, Azuma et al. (1990)
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reportaron que una ribonucleasa cataliza la biosíntesis del factor-B a partir de RNA en
presencia de butanol y 2’, 3’-cAMP.
Otro compuesto que da una marcada respuesta estimulatoria, pero de origen exógeno, es el
5, 5-dietilbarbiturato (barbital o veronal), el cual fue primeramente reportado por Ferguson
et al. (1957), quienes observaron que a una concentración óptima de 13.5 mM, en un
medio sintético y adicionado al momento de la inoculación, se obtiene consistentemente un
incremento de cuatro veces en la producción de estreptomicina por S. griseus. Otros barbituratos
hipnóticos, como los derivados 5-etil-5-fenil y 5, 5-dietil-1-metil, no fueron activos, sin
embargo, en aquellos análogos del barbital que conservaron la substitución dialquil en el C-5
de la molécula, si mostraron actividad inductora. En estudios posteriores sobre la biosíntesis
de estreptomicina (Heding y Gurtu, 1977), el barbital no incrementó la producción de una
cepa industrial altamente productora de S. griseus, tanto en medio definido como en medio
complejo. El resultado fue similar con una cepa semi-industrial, sin embargo con una cepa
posterior en medio complejo, a una concentración de barbital de 8.14 mM, la producción de
estreptomicina se incrementó en un 29% (Heding y Gurtu, 1977). Otro aspecto interesante
es el hecho de que el barbital de alguna manera evitó o antagonizó el efecto inhibitorio de la
quinacrina y del 2, 4-dinitrofenol sobre la biosíntesis de estreptomicina por S. griseus.
En un sistema diferente, con Streptomyces galilaeus, el barbital estimuló la biosíntesis de galirubinas

(antraciclina) a una concentración de 22 mM, y un tiempo óptimo de adición de 12 h después
de la inoculación. El incremento varió desde 1.5 veces hasta 2.85, dependiendo de la cepa
(Královcová et al., 1977).
En la biosíntesis de rifamicina por Amycolatopsis mediterranei el barbital ejerce un efecto

extremadamente importante ya que los metabolitos secundarios generalmente son producidos
como familias de compuestos como resultado de la baja especificidad de las enzimas del
metabolismo secundario, sin embargo la abundancia relativa de uno de los miembros de
la familia puede incrementarse por la adición de ciertas sustancias (Demain, 1989). Tal es
el caso de la producción de rifamicina B (El-Tayeb et al., 2004), pues A. mediterranei bajo
condiciones normales (sin la adición de ningún modulador), produce una amplia gama de
rifamicinas, por lo que Margalith y Pagani desde la publicación de su trabajo clásico en 1961,
estudiaron el efecto de diferentes barbituratos y compuestos relacionados. Ellos monitorearon
la formación de 6 distintas rifamicinas durante el curso de la fermentación y encontraron
que el 5-etil-5-metilbarbiturato, el 5-fenil-5-etilbarbiturato, el 5-etil-5-isopropil-barbiturato y
el 5, 5-dietilbarbiturato (barbital) dirigen el metabolismo hacia la biosíntesis casi exclusiva de
rifamicina B, y dejan el resto de las rifamicinas en niveles prácticamente despreciables. La
explicación de este efecto es a nivel de cadena respiratoria, ya que se ha demostrado que el
barbital inhibe el consumo de oxígeno en el metabolismo central, lo cual genera una mayor
disponibilidad de oxígeno en la biosíntesis de rifamicina, particularmente en los pasos limitantes
catalizados por monooxigenasas del tipo de los citocromos P450 (Mejía et al., 2003).
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V. Un problema en común
Un problema recurrente en la producción de antibióticos a nivel industrial ha sido que las

cepas de alta producción tienden a producir caldos extremadamente viscosos, lo que ocasiona
una gran dificultad para proporcionar un adecuado mezclado y aporte de oxígeno en el
biorreactor; esta viscosidad es consecuencia de la forma filamentosa y ramificada en que crecen
los actinomicetos. La menor transferencia de oxígeno en edades avanzadas del cultivo provoca
el cese de la producción, ya que al tratarse de un metabolito secundario, es en esta etapa
cuando se inicia la producción y por lo tanto una mayor demanda de oxígeno. Para resolver
este problema en la producción de antibióticos como la cefalosporina, se ha demostrado que
la expresión intracelular del gen de la hemoglobina bacteriana (vhb, aislado de Vitreoscilla
stercoraria) en Acremonium chrysogenum incrementa la captación de oxígeno, también considerado
uno de los principales factores limitantes de la producción de este antibiótico (DeModena,
1993). El gen de hemoglobina bacteriana ha sido expresado exitosamente también en E. coli
y en Saccharopolyspora erythraea para la producción de eritromicina, al igual que en Amycolatopsis
mediterranei para la producción de rifamicina (Guerra et al., 2008).
VI. Represión catabólica
Los mecanismos moleculares de la regulación catabólica se esclarecieron en la década de los

70. Hoy sabemos que la regulación catabólica está mediada por el nivel intracelular de un
nucleótido especial, el adenosin monofosfato cíclico (AMPc), cuyo nivel intracelular es inverso a
la concentración de glucosa en el medio de cultivo. Mientras existe glucosa en el medio de cultivo
el nivel intracelular de AMPc es sumamente reducido, debido a que la glucosa inhibe la actividad
adenilciclasa, enzima que interviene en la síntesis de AMPc. Cuando la glucosa del medio se
agota, la concentración intracelular de AMPc aumenta rápidamente. El AMPc sintetizado forma
un complejo con una proteína existente en la célula, denominada “proteína receptora de AMPc.
Este complejo de proteína receptora y AMPc actúa sobre el gen promotor al objeto de inducir
la síntesis de los enzimas necesarios para la utilización de otras fuentes de carbono distintas a la
glucosa. La glucosa inhibe gran cantidad de metabolitos secundarios (Shapiro, 1989).
La represión catabólica también juega un papel importante en la determinación de la

concentración relativa de cada uno de los antibióticos de una misma familia química que se
producen en una fermentación. Este es el caso de la producción de estreptomicina por Streptomyces
griseus. El manano es el inductor de la manosidasa que convierte la manósido estreptomicina en
estreptomicina; sin embargo, esta enzima no se sintetiza si hay glucosa (>0,5%) en el medio,
debido a la represión catabólica. Sólo cuando la glucosa ha desaparecido se produce la enzima
que es inducida por manano. En este caso la represión catabólica juega un papel fundamental
en el porcentaje de manósido estreptomicina producido en esta fermentación (Shapiro, 1989).
VII. Regulación por fosfato
Otro camino mediante el cual se regula la formación de metabolitos secundarios implica la

inhibición y la represión de las fosfatasas por fosfato. Muchas fermentaciones se inhiben por
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ortofosfato (H3PO4) a concentraciones (>10 mM) que no son inhibidoras para el crecimiento.
En algunos casos se explica ya que los intermediarios de la ruta metabólica del producto que
nos interesa están fosforilados, aunque el producto final no lo esté. Las fosfatasas actuarían en
estos intermediarios (Bibb, 2005).
Un ejemplo lo tenemos en la biosíntesis de estreptomicina donde actúan varias fosfatasas en

la formación de estreptidina y en el último paso, desfosforilación de la estreptomicina fosfato,
donde la enzima que cataliza esta reacción también está inhibida por el fosfato inorgánico
(Shapiro, 1989).
VIII. Exportación
Durante la segunda mitad del siglo pasado se incrementaron los estudios para el
mejoramiento genético de actinomicetos con miras a incrementar los niveles de producción.
Se identificaron una gran cantidad de genes involucrados en el metabolismo secundario de
los actinomicetos. Dentro de ellos se han encontrado genes involucrados en la resistencia y
exportación de los antibióticos propios de cada microorganismo productor. Sin embargo,
se ha puesto poca atención al papel que juegan estos genes en la regulación de los niveles
de producción, ya que es importante considerar que puede presentarse un efecto tóxico
propio de la actividad del antibiótico que sintetizan cuando las concentraciones del mismo
son altas lo que marca un límite en la producción en cepas industriales de alta producción
(Demain y Fang, 2000).
En microorganismos eucariontes que producen antibióticos como Penicillium chrysogenum

productor de penicilina, los antibióticos son concentrados en vesículas membranales internas
que posteriormente son liberados al medio por exocitosis. Sin embargo los organismos
procariontes no son capaces de formar tales vesículas, por lo que tienen que exportar el producto
por un sistema de transporte de membrana. Se han identificado en muchos actinomicetos
proteínas de membrana que funcionan como una bomba exportadora de antibiótico. Tal es
el caso de Streptomyces pristinaespiralis, productor de pristinamicina en quien el gen ptr codifica
una proteína responsable de la exportación de dicho antibiótico mediante un sistema antiport,
pristinamicina/protón (Folcher et al., 2001).
Por otro lado, en 1998 August y colaboradores reportaron la secuencia de nucleótidos de los
genes involucrados en la biosíntesis de rifamicina. Dentro del cluster, encontraron 34 marcos
abiertos de lectura, uno de los cuales, denominado rifP presenta un 66.1% de homología con
el gen ptr de Streptomyces pristinaespiralis, mientras que a nivel proteico RifP y Ptr tienen una
similitud de 81.2%. La función de la proteína RifP fue demostrada mediante silenciamiento
del gen rifP, encontrándose que este silenciamiento ocasiona una disminución de la producción
de un 80 % (Absalón et al., 2007). Esto sugiere que un incremento en la expresión de este tipo
de genes podría mejorar la capacidad de producción del antibiótico.
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IX. Metabolismo secundario y diferenciación
Los actinomicetos presentan un ciclo de vida complejo que implica procesos de diferenciación
morfológica y fisiológica. Estas bacterias son capaces de colonizar sustratos formando una
red de hifas tabicadas ramificadas que dan lugar al micelio vegetativo. Estas hifas obtienen
los nutrientes de la degradación del material orgánico insoluble gracias a numerosas enzimas
hidrolíticas (Chater, 1984). En una primera etapa, las zonas más alejadas de la fuente de
nutrientes empiezan a acumular sustancias de reserva, hasta que en un determinado momento
y debido a la carencia de nutrientes, se reciben una serie de señales; justamente en esta zona,
que disparan la expresión de genes implicados en la formación del micelio aéreo. Se produce
así, el desarrollo de hifas que emergen del micelio vegetativo para dar lugar al micelio aéreo.
Estas hifas se van a nutrir de los productos de degradación del micelio vegetativo, y en una
segunda etapa van a sufrir un proceso de curvatura, enrollamiento, formación de septos y
engrosamiento de la pared celular para dar lugar a una cadena de esporas uninucleares, que se
liberarán al medio y que con las condiciones adecuadas, germinarán y desarrollarán un nuevo
micelio vegetativo (Elliot y Talbot 2004).
La iniciación de la biosíntesis de metabolitos secundarios usualmente ocurre cuando la tasa de

crecimiento se detiene y es acompañada por la transición morfológica del micelio vegetativo
hacia la formación de la hifa aérea. Un aspecto interesante es que se han encontrado una serie
de genes que interconectan o están involucrados en ambos procesos; la diferenciación y el
metabolismo secundario (Fernández et al., 2009).
El factor A (2-isocapryloyl-3Rhydroxymethyl g-butyrolactona) en Streptomyces griseus es uno

de los más representativos autorreguladores, el cual dispara el metabolismo secundario o la
formación de micelio aéreo o ambos (Kato et al., 2007). El factor A producido de manera
dependiente del crecimiento, se acumula hasta una concentración crítica (10-9 M) o cercana
a la mitad de la fase de crecimiento exponencial y entonces enciende la transcripción de
adpA. AdpA activa a un número de genes con varias funciones requeridas para el desarrollo
morfológico y el metabolismo secundario (Kato et al., 2007).
Por otro lado, los aminoácidos son la principal fuente de carbono y nitrógeno, por lo que su
limitación juega un papel central en la iniciación del metabolismo secundarios, desencadenando
un mecanismo conocido como “respuesta estricta” que consiste en la disminución de la síntesis
proteica, disminución de la estabilidad de los mRNA, aumento de la degradación de proteínas
y aumento de la producción de aminoácidos. El efector de esta respuesta es el 3,5 difosfato
de guanosina (ppGpp), sintetizado por una proteína asociada a ribosoma. ppGpp se une
a la subunidad catalítica de la RNA polimerasa, alterando el reconocimiento de una serie
de promotores llamados promotores estrictos. Este incremento en la cantidad de ppGpp se
correlaciona con la necesidad de entrar en metabolismo secundario (Hesketh et al., 2007).
Otras evidencias sobre la relación que guardan la diferenciación y el metabolismo secundario,

es la descripción sobre clonación de un fragmento regulatorio (SCO5749) de S. coelicolor,
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en S. lividans, el cual causa una sobreproducción de actinorrodina y undecilprodigiosina y

simultáneamente el cese de la esporulación bajo condiciones de estrés osmótico (Bishop et
al., 2004).
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Avances en la producción de antibióticos y otros
metabolitos secundarios
Los metabolitos secundarios son compuestos producidos principalmente por hongos y

actinomicetos, generalmente tarde en el ciclo de crecimiento (idiofase). Aunque los antibióticos
son los metabolitos secundarios (MS) más conocidos, hay otros con un enorme rango de
actividades biológicas diferentes (Barrios-González et al 2004b). Las últimas dos décadas han
sido una fase de rápido descubrimiento de nuevas actividades y desarrollo de importantes
compuestos de uso en diferentes campos industriales, principalmente: farmacéutico y
cosméticos, alimentos, agricultura y ganadería. Algunos ejemplos son: antiinflamatorios,
hipotensivos, antitumorales, anticolesterolémicos; pero también hay insecticidas, reguladores
del crecimiento vegetal y herbicidas y pesticidas amigables con el medio ambiente (Demain,
1999; Barrios-González et al 2004a).
Estos compuestos son producidos comercialmente por fermentación líquida sumergida (FL),
pero muchos de estos metabolitos podrían ser producidos ventajosamente por fermentación
sólida.
Aunque sistemas de fermentación sólida (FS) han sido usados desde la antigüedad en varios
países orientales, la FS ha sido transformada, en los últimos 25 años, para nuevos propósitos,
usando nuevos enfoques de microbiología, bioquímica e ingeniería bioquímica. Este mayor
grado de control, ha permitido el uso de la FS para producir sofisticadas y valiosas moléculas
como los MS (Barrios-González y Mejía, 1996; Barrios-González y Mejía, 2007; Barrios-
González y Mejía, 2009).
Hace 10 o incluso 5 años, las revisiones (reviews) de este campo señalaban que la FS era una
tecnología emergente con gran potencial para la producción de metabolitos secundarios a
escala comercial. Los autores comentaban que la morfología del micelio, asociada a los
microorganismos productores de MS, es muy apropiada o adaptada para el crecimiento en
soporte sólido. También que la FS presenta ventajas como mayor producción, a menudo en
tiempos más cortos, mayor estabilidad del producto, menores requerimientos de energía;
aunque también comentan desventajas como un más complicado escalamiento y dificultades
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Avances en la producción de antibióticos
para monitorear y controlar los parámetros del proceso (Barrios-González & Mejía, 1996;
Blakrishnan & Pandey, 1996; Robinson & Nigam, 2001).
Hoy la producción industrial de MS por FS es una realidad. Hace algunos años, una compañía
de la India comenzó la producción industrial de algunos MS; y se ha convertido desde entonces
en un exitosa empresa y la FDA de EEUU ha aprobado esta tecnología para la producción
de fármacos para aplicaciones industriales desarrolladas (Suryanarayan, 2003). En un futuro
próximo, la competencia entre el sistema convencional de FL (fermentación líquida) y el de FS
promete ser mucho más reñida e interesante.
Actualmente, se pueden distinguir 2 tipos de FS, dependiendo de la naturaleza de la fase sólida

utilizada: 1) FS en sustratos naturales, como salvado de trigo, harina de yuca, etc.; y 2) FS en
soportes inertes impregnados con medio líquido. Este último, fue desarrollado por nuestro
grupo (Metabolitos Secundarios e ingeniería genética, Depto. de Biotecnología, UAM-I) a final
de los años 80; y además de tener buena productividad, es un sistema que ha representado un
modelo conveniente para estudios básicos sobre la FS (Ooijkaas et al, 2000).
La investigación sobre producción de MS por FS de los últimos 10 años se ha caracterizado

no sólo por un incremento en el número de publicaciones, sino también por el incremento
en la proporción de MS con actividades biológicas diferentes a las de los antibióticos. Otro
interesante aspecto de esta etapa es la sorprendentemente alta productividad de MS obtenida
en los procesos desarrollados en estos estudios. Hace 10 años, las revisiones mencionaban
sólo un reporte en el que el nivel de producción logrado estaba por arriba de los 7 mg/g,
mientras que procesos con producciones mucho más altas son relativamente comunes en
publicaciones recientes (Barrios-González & Mejía, 1996; Barrios-González & Mejía, 2007;
Bhargav et al, 2008).
Adinarayana et al (2003), reportaron la producción de 22.3 mg de cefalosporina/g (de

cultivo seco) en una FS sobre ”rawa” de trigo (integral y quebrado), mientras que nuestro
grupo reportó una producción del fármaco utilizado para disminuir los niveles de colesterol
en sangre: lovastatina, de 20 mg/g en un sistema novedoso de FS en soporte inerte artificial
(Baños et al, 2008a). Posteriormente, la cepa de producción, una cepa silvestre de Aspergillus
terreus, fue mutada y sometida a un proceso de selección racional, se obtuvo una producción de
27.9 mg/g (Baños et al, 2009).
Investigaciones realizadas por nosotros y por otros autores han demostrado que la fisiología
de la idiofase (fase de producción) en FS comparte varias similitudes con la conocida fisiología
en medio líquido. De esta manera, similares estrategias deben ser adaptadas para desarrollar
procesos de producción eficientes; por ejemplo, evitar la regulación por carbono (catabólica),
nitrógeno o fosfato, además de incluir inductores y precursores en el medo sólido. No obstante,
hay importantes parámetros específicos para la FS que deben ser optimizados y que incluyen:
pretratamiento del sustrato o soporte, contenido de humedad inicial, concentración del medio
y aireación (Pandey et al, 2007).
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Sin embargo, nuestros estudios de respiración durante la producción de MS por FS han

contribuido a mostrar aspectos más sutiles de la fisiología de una producción eficiente en
contraposición con la de una producción ineficiente, en este sistema de cultivo (Domínguez et
al, 2000). Ésta y otras evidencias han indicado que hay ciertas particularidades de la fisiología
en FS que necesitan ser mejor entendidas; lo cual generaría un conocimiento que será la base
del desarrollo de procesos y estrategias de control más eficientes. Un impacto igual o incluso
mayor lo tendría la aplicación de dicho conocimiento al desarrollo de cepas microbianas
sobreproductoras de MS, particularmente efectivas en medio sólido.
Muchas de las ventajas de la FS, como que los metabolitos son a menudo producidos en
concentraciones mucho más altas que en FL, son una consecuencia de la diferente fisiología
mostrada por los microorganismos en FS, en relación a la presentada en FL (Barrios-González
y Mejía, 2009).
Las razones fisiológicas y moleculares que subyacen el diferente comportamiento de los

microorganismos en FS apenas comienzan a ser entendidas, pero se sabe que grandes grupos
de genes son expresados en forma diferencial cuando los hongos crecen en FS y en FL (Akao
et al, 2002; Te Biesebeke et al, 2005a). En cuanto a la producción de metabolitos secundarios,
estudios de mi grupo han demostrado que la mayor producción de lovastatina en FS es debida,
al menos en parte, a la mayor expresión de los genes de biosíntesis, en particular el factor
transcripcional del “cluster”, lovE (Barrios-González et al, 2008). Actualmente nuestro trabajo
se dirige a identificar las señales que recibe el hongo del medio ambiente y que le indican que
está en medio sólido; así como las vías de transducción de señales involucradas en inducir los
genes relacionados con la biosíntesis del metabolito.
Aunque el conocimiento básico de la fisiología del medio sólido es aún incipiente, ya empiezan
a surgir ejemplos de su aplicación al mejoramiento genético (Campos et al, 2008; Te Biesebeke
et al, 2005; Te Biesebeke et al, 2006; Barrios-González y Mejía, 2009).
En relación a las cepas utilizadas para procesos de FS, un análisis de la literatura indica que
aislamientos silvestres tienen un rendimiento sorprendentemente alto en FS (Rao et al, 2005;
Asagbra et al, 2005, Baños et al, 2004; Mahalaxmi et al, 2010; Baños et al, 2009). Es importante
señalar que sería imposible obtener estos rendimientos, con una cepa silvestre, en un proceso
de fermentación sumergida.
Sin embargo, a pesar de todo esto, el mejoramiento genético de las cepas es también muy
importante o incluso inevitable para el desarrollo de procesos de FS competitivos. En este
sentido es significativo que 8 de los 10 procesos de FS más productivos para MS fúngicos,
reportados en los últimos años, utilizaron cepas mejoradas. También interesante es que los 3
procesos de FS más productivos de MS de actinomicetos, también utilizan cepas mejoradas
genéticamente (Barrios-González & Mejía, 2007; Khaliq et al, 2009).
Hoy está claro que es necesario utilizar y generar cepas especiales, particularmente adecuadas
o convenientes para el medio sólido; tanto para la producción de MSs como de enzimas. Lo
41
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que no está tan claro es qué métodos o estrategias deberían usarse. Una estrategia que ha sido
usada, es partir de cepas hiperproductoras para FL y aislar mutantes que sean eficientes en
FS. Idealmente, esas mutantes combinarán la capacidad de alta producción con una buena
adaptación al medio sólido (Barrios-González et al, 1993).
Un estrategia alternativa, y que ha sido exitosa, es la de rastrear los mejores aislamientos

silvestres y después someterlos a un programa de mutación y selección (Murthy et al, 1999).
En relación a la genética molecular, si se logran identificar genes específicos, involucrados en la

adaptación al ambiente sólido y/o que tienen un impacto en su productividad en este medio,
un mejoramiento genético molecular también podría realizarse (Barrios-González y Mejía,
2009).
Recientemente, Te Bisebeke et al (2005b) estudiaron la relación entre el número de puntas de

hifa y la secreción de enzimas durante el crecimiento de A. oryzae en FS. Los autores razonaron
que el crecimiento del hongo en este medio involucra la modificación enzimática y posterior
penetración en el sustrato. Como la secreción de enzimas ocurre alrededor de la región apical y
subapical de la hifa que avanza, un incremento en la frecuencia de ramificación incrementaría
la producción de la enzima. Para probarlo, construyeron una cepa con mayor frecuencia
de ramificación debida a la interrupción de los genes pcla y pf/pi-ip. La cepa transformante
produjo 50% más amilasa, 100% más glucoamilasa y 90% más proteasas que la parental.
En nuestro laboratorio, se construyó una biblioteca genómica de P. chrysogenum en un cósmido

construido previamente en nuestro laboratorio (Iztapacos) y de ahí se clonó todo el “cluster” de
genes de la ruta biosintética de penicilina. Así, fue posible estudiar el efecto de introducir dosis
altas de estos genes en P. chrysogenum y probar su efecto en la producción del antibiótico en FS
y FL.
Los resultados mostraron un incremento en la producción de penicilina en ambos sistemas,

siendo el incremento superior en FS (Campos et al, 2008). La cepa de alta producción (P-2),
utilizada en este trabajo, fue desarrollada en la industria de FL por mutación clásica y se ha
demostrado que ya contiene 14 copias del “cluster” de biosíntesis de penicilina. Transformantes
de esta cepa, mostraron un incremento de 92.9% en FL y 158.4% en FS. Estos resultados
demostraron que la estrategia de incrementar la dosis génica es efectiva aún en cepas de alto
número de copias; y que de este modo se pueden obtener mutantes sobreproductoras de
penicilina, y muy probablemente de otros metabolitos secundarios.
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44
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Métodos actuales para el estudio de
microorganismos en alimentos
Dra. Gloria Díaz-Ruiz

Dra. Carmen Wacher
Introducción
Los microorganismos son probablemente los seres vivos más antiguos y colonizan cualquier
ambiente en la tierra. Han jugado papeles centrales en su evolución climática, geológica,
geoquímica, biológica (Xu, 2006). Los alimentos entonces están también colonizados,
generalmente con microbiotas complejas. Dentro de ésta pueden encontrarse microorganismos
indeseables: los que causan enfermedades, los que alteran los alimentos, y los deseables: los que
los fermentan, los que los hacen funcionales, como los probióticos, y también los comensales
que no causan problemas ni son útiles.
Los microorganismos han actuado en los alimentos siempre, pero debido a su tamaño se
conocieron hasta que Antonie van Leeuwenhoek los observó con una lente. Más tarde
Louis Pasteur descubrió la relación entre los microorganismos, la descomposición y la
fermentación de los alimentos. Debido a esto se le considera el padre de la microbiología de
alimentos (Jay, 2007).
Estudio de los microorganismos en los alimentos.
Los microorganismos son microscópicos, difíciles de observar, de contar, entonces se desarrolló

un método para aislarlos y cuantificarlos, inoculando rebanadas de papa, en las que se forman
colonias de microorganismos. El principio de este método (cada colonia se forma a partir de
una célula o de un agregado de células, o de una espora, etc., que se llama unidad formadora de
colonias o ufc) se sigue usando en la actualidad, con medios de cultivo en vez de rebanadas de
papa. Con esta técnica fue posible también obtener cultivos puros de los microorganismos, lo
que fue esencial para determinar cuáles microorganismos eran los causantes de enfermedades
(Tortora et al., 2006).
A diferencia de los animales y las plantas, no había sido posible determinar las relaciones
filogenéticas entre los microorganismos, ya que no contaban con caracteres como los de los
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Métodos actuales para el estudio de microorganismos en alimentos
organismos superiores (presencia de alas, picos, etc.), hasta que se ideó comparar las secuencias
del ADN de los microorganismos, que es lo que los hace diferentes. Debido a la dificultad para
comparar las secuencias del ADN total de un aislado, surgió la necesidad de seleccionar un
gen. Este debe cumplir con ciertas características: que esté distribuido universalmente, que sea
funcionalmente homólogo en todos los organismos a comparar, que cuente con regiones de
homología y regiones de heterogeneidad, que la velocidad de cambio de la secuencia sea
proporcional a la de la distancia evolutiva medida. Algunos genes que cumplen con estos
requisitos son: genes que codifican ATPasas, RecA (relacionado con la recombinación)
y los genes de rRNA (sobre todo el 16S es el que más se ha usado) (Tortora et al., 2006;
Ludwig, 2008).
Woese (1987) usó este método para determinar las relaciones filogenéticas entre los organismos
que tienen células. El menciona que: “La célula es un documento histórico, y obteniendo la capacidad
de leerlo (secuenciando sus genes) no podemos más que alterar drásticamente la manera de ver la biología”.
Entonces se agruparon en 3 dominios: Bacteria, Archaea y Eukarya, a diferencia de los 5 reinos
en los que se clasificaban. Debido a que esta nueva clasificación está basada en la historia de
los microorganismos se considera una clasificación más natural.
Por otra parte, si lo que se requiere es comparar las secuencias de los genes ribosomales de
los microorganismos, éstas pueden obtenerse directamente del ADN de una muestra, sin la
necesidad de aislar los microorganismos. A partir del ADN extraído, se amplifican mediante la
reacción de PCR regiones de los genes ribosomales. Estos amplicones pueden ser secuenciados
e identificados mediante la comparación de su secuencia con la de una base de datos, como el
GenBank.
Al usar esta técnica, que no requiere del cultivo de los microorganismos, se descubrió que la
microbiota presente en los ambientes naturales es más compleja de lo que se creía, ya que
una proporción muy baja, alrededor del 1%, se recupera en los medios de cultivo usados
tradicionalmente (Hugenholtz et al., 1998). Esto ocurre por ejemplo en el suelo. La diversidad
microbiana describe la complejidad y variabilidad a diferentes niveles. Variabilidad genética
entre los taxones (especies), el número (riqueza) y abundancia relativa (uniformidad) de
los taxones y grupos funcionales (asociaciones) en las comunidades. El tipo de proceso y
complejidad de interacciones. El estudio de todo lo anterior debe incluir múltiples métodos
que se dirijan a determinar la estructura y la función (Torsvik y Ovreås, 2002).
Dentro de las razones por las cuales no todos los microorganismos se recuperan en medios
de cultivo se mencionan: no se sabe cómo cultivarlos y no crecen debido a que les falta o les
sobra algún nutrimento en el medio, la atmósfera no es adecuada, no se pueden desarrollar
en cultivo puro, o entran en un estado conocido como viable pero no cultivable, al cual
entran cuando se encuentran ante una situación de estrés y no crecen en medios de cultivo,
a pesar de estar vivas (Roszak y Colwell, 1987; Colwell, 2000). Esto ha venido a cambiar los
criterios para determinar si un microorganismo está muerto o vivo, ya que anteriormente
se consideraba que los viables eran aquéllos capaces de desarrollarse en medios de cultivo.
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Dr. Gloria Díaz-Ruiz y Col.
Figura 1. Métodos dependientes e independientes del cultivo para el análisis microbiológico de alimentos
(Díaz-Ruiz y Wacher, 2003).
Surge entonces la necesidad de redefinir la muerte microbiana, ya que el concepto tradicional

ya no es válido.
Se han ideado entonces una gran variedad de métodos con base en la biología molecular y en la
filogenética. Si bien fue muy importante la obtención de cultivos puros, con el descubrimiento
de que los ambientes son más complejos de lo que se pensaba, ahora se reconoce que los
microorganismos no funcionan como seres individuales, sino como miembros de comunidades
y éstas influyen en su desarrollo (Harwood y Buckley, 2008). Entonces se usa un enfoque
ecológico para estudiarlos (Ercolini, 2004).
En la Figura 1 se resumen algunos de los métodos que se usan actualmente en microbiología

de alimentos (Díaz-Ruiz y Wacher, 2003).
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Métodos dependientes del cultivo
Existen métodos basados en el cultivo de los microorganismos y métodos independientes

del cultivo. Dentro de la primera categoría se encuentran los que se conocen como de
“huella digital”, que se basan en la tipificación, o identificación más allá de la especie, de los
microorganismos.
Existe una gran variedad de métodos de “huella digital” y dentro de éstos se pueden mencionar:
RFLP (polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción). Se basa en obtener,

a partir del ADN aislado de cada microorganismo, un patrón de bandas de diferente tamaño
después de digerirlo con una enzima de restricción. Estas enzimas cortan el ADN únicamente
cuando encuentran una cierta secuencia. De esta manera, dos cepas pertenecerán al mismo
grupo si tienen patrones idénticos. De acuerdo con la similitud entre los diferentes patrones de
bandas se construye una matriz de distancias y con ésta un dendrograma, en el que se agrupan
los microorganismos de acuerdo con su similitud (Busse et al., 1996).
Ribotipificación y ARDRA (análisis de restricción de ADN ribosomal amplificado).

Debido a que se trabaja con el ADN total del microorganismo, los patrones de RFPL son
complejos y difíciles de analizar. Para evitar este problema, puede trabajarse con un gen,
como el del rRNA 16S. Para hacer una ribotipificación se parte del patrón de RFLP, el cual
se transfiere a una membrana, la cual se hibrida con una sonda del gen ribosomal 16S. De
esta forma se seleccionan solamente las bandas que contengan zonas complementarias a la de
la sonda y el patrón será más sencillo. Por otra parte, el ARDRA (análisis de restricción de
ADN ribosomal amplificado) ADN consiste en amplificar por la reacción de PCR, a partir del
ADN total de cada microorganismo, el gen ribosomal 16S y éste se digiere con una enzima
de restricción, con la que se logrará obtener patrones más sencillos que los de RFLP (Barret y
Gerner-Smidt, 2007).
PFGE (electroforesis en gel con campos pulsados). En ocasiones, cuando se usan enzimas
de corte raro, se obtienen fragmentos demasiado grandes que no migran adecuadamente en el
gel. Para promover o facilitar el movimiento de los fragmentos a través del gel, la electroforesis
es en varios sentidos, de manera que se va forzando a la molécula a moverse a través del gel,
siendo finalmente su movimiento en línea recta como la electroforesis convencional. Este es un
método muy reproducible y ha sido el seleccionado para usarse en programas epidemiológicos
nacionales, como el Pulsenet en Estados Unidos (Swaminathan et al., 2001).
Estos métodos son muy útiles para: a) Agrupar microorganismos antes de identificarlos (de
esta manera se puede seleccionar uno de cada grupo para identificar), b) Para determinar las
fuentes de contaminación de alimentos por ejemplo con bacterias patógenas, c) Para determinar
a partir de cuáles alimentos se produjo un brote, al aislar el mismo tipo del microorganismo
del alimento y de muestras clínicas de las personas enfermas. Estos métodos se usan entonces
para comprender la transmisión de las enfermedades transmitidas por alimentos y la seguridad
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Figura 2. Ribotipos de aislados de L. monocytogenes del procesador D. Las muestras ambientales (E),
de materia prima (R), en proceso (IP) y producto terminal (F), agrupados por visita. * ribotipo aislado más
frecuentemente de las muestras del procesador D. (Norton et al., 2001)
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microbiológica de alimentos (Whittam y Bergholz, 2007). Norton et al., (2001) estudiaron la

ecología microbiana de Listeria monocytogenes en diversos ambientes de procesamiento de pescado
de 3 industrias. Para esto tomaron muestras del producto en diferentes puntos del proceso
(pescado crudo, durante el proceso de ahumado frío, producto final y muestras del ambiente).
Usando un método comercial basado en la PCR, 17.9% de las muestras dieron positivas a la
bacteria, de éstas, 17.7% fueron ambientales, 7.8% del pescado crudo, 18.1% de pescado en
diversas etapas durante el procesamiento y 7.3% del producto terminado. Aislaron cepas de
las muestras que dieron positivas y realizaron una ribotipificación para determinar el origen
de la contaminación. Encontraron 15 ribotipos diferentes y de acuerdo con la distribución de
los aislados, fue posible concluir que cada industria tenía su microbiota diferente, que algunos
tipos de la bacteria permanecían hasta el final del procesamiento y que el pescado crudo y el
ambiente del proceso eran las fuentes potenciales de contaminación. Con esta información
sería posible emitir recomendaciones para mejorar la calidad microbiológica del producto. La
cepa DUP-1039C (Fig. 2) permaneció en la planta durante los 6 meses que duró el muestreo
y se encuentra en casi todas las muestras. Esto sugiere que forma parte de la microbiota del
ambiente de procesamiento y que no se elimina con los procedimientos de limpieza usados.
Métodos independientes del cultivo
Por las razones explicadas anteriormente, es importante usar métodos que no requieran del
cultivo de los microorganismos. Se extrae entonces el ADN de las muestras y se amplifica por
PCR una región del gen ribosomal 16S, o de otro gen. La especificidad estará determinada
por los cebadores, que pueden ser tan generales como un dominio o tan específicos como
una especie. Si se usan cebadores universales para Bacteria, el producto de la PCR será una
mezcla de fragmentos de miembros de este dominio. Son entonces del mismo tamaño, pero
con secuencias diferentes. Para separarlos y determinar qué bacterias se encuentran en la
mezcla, se puede hacer una biblioteca de clonas en E. coli, para después aislar las cepas que
hayan adquirido el fragmento y secuenciarlo. Otra alternativa es separarlos de acuerdo con
su secuencia usando geles de poliacrilamida y correrlos en una electroforesis con gradiente
de temperatura (TTGE) o de urea-formamida (DGGE, electroforesis en gel con gradiente
desnaturalizante). Se obtiene para cada muestra un patrón de bandas en el que idealmente
cada banda representa un microorganismo diferente y la intensidad de las bandas da una idea
de su proporción relativa en la muestra; sin embargo no es un método cuantitativo (Muyzer
et al., 1993). El SSCP (polimorfismo de conformación de bandas sencillas) se basa en la
separación de bandas sencillas de ADN de acuerdo con su conformación (que a su vez depende
de su secuencia). Para identificar cada banda del patrón se puede determinar la posición de
la banda que producen cepas aisladas e identificadas o se corta la banda, se extrae el ADN,
se reamplifica por PCR, se secuencia y se compara con una base de datos para identificar el
microorganismo al que corresponde (Schwieger y Tebbe, 1998).
Con el fin de determinar cuáles microorganismos están metabólicamente activos, se extrae

en vez del ADN el ARN, que es muy inestable y por lo cual no se esperaría obtenerlo de un
microorganismo no viable. Se obtiene el cADN mediante el uso de la transcriptasa inversa y
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con éste es posible usar los métodos mencionados anteriormente. De esta manera es posible
determinar la estructura de las poblaciones microbianas, distinguir los microorganismos activos
metabólicamente y se puede determinar su función, si se trabaja con genes funcionales.
Estudiaron la diversidad y la dinámica de crecimiento microbiano durante la fermentación

del queso italiano artesanal Ragussano, (Randazzo et al., 2002). Se usaron los métodos
convencionales, PCR, PCR transcriptasa inversa y DGGE, basados en las secuencias del gen
ribosomal 16S, usando cebadores específicos para bacteria y para Lactobacillus. Se observaron
cambios dramáticos en la estructura bacteriana (Fig. 3); en la leche predominaron Leuconostoc,
Lactococcus lactis y Macrococcus caseolyticus, durante la fermentación Streptococcus thermophilus.
Los patrones de RT-DGGE demostraron que no todas las cepas se encontraban activas. A
permanece activo en la leche y en la cuajada, mientras que B y C ya no se observan en la
cuajada. Todos los microorganismos detectados en el queso mediante DGGE se encuentran
activos. Este método (DGGE) es entonces ideal para determinar cambios en los patrones
microbianos durante procesos de fermentación.

Figura 3. Comparación entre patrones de PCR-DGGE, y RT-PCR de productos de las regiones V6 a V8
de aislamientos de ADN y rARN de leche, cuajada y queso madurado 15 días, del productor I. Las bandas
pertenecen a: A, Macrococcus caseolyticus; B, Lactococcus lactis; C, Leuconostoc mesenteroides; D,
Streptococcus thermophilus; E: Streptococcus bovis; F, G, H, I, and J, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus;
K, Lactobacillus fermentum; L, Lactobacillus casei; and M, Enterococcus hirae. (Randazzo et al., 2002).
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Cuantificación de microorganismos
Debido a su naturaleza no lineal, no es posible relacionar directamente la concentración de los

productos de PCR con la concentración de ADN en el templado. El método más usado para
cuantificar microorganismos es la reacción de PCR en tiempo real (RT-PCR). A diferencia de
la PCR en tiempo final, en la cual es necesario esperar a que concluya el programa establecido,
con el número de ciclos establecido, para determinar la presencia o ausencia de amplicones
mediante una electroforesis en gel de agarosa, se detecta el producto de PCR mientras ocurre
la reacción. Para esto se usan diferentes tipos de reacciones mediante las cuales se detecta el
amplicón marcándolo de diferentes formas. Además de las ventajas del PCR convencional,
el RT-PCR proporciona rapidez, sensibilidad, reproducibilidad. Estas características son de
gran valor para la industria de alimentos; la desventaja del método es el costo, tanto del equipo
como de los reactivos (Mustapha y Li, 2006).
Localización de los microorganismos
En general, para realizar el análisis de algún alimento se toma una muestra y se homogeniza.
Para el caso de las muestras sólidas, con esto se pierde la información sobre la localización
de los microorganismos, que puede ser de gran importancia. Se usan entonces métodos in
situ, como el FISH (Hibridación fluorescente in situ). Se basa en la hibridación de sondas
de ADN marcado complementaria a regiones del gen ribosomal. Los microorganismos
marcados podrán ser detectados mediante microscopía de fluorescencia o citometría de flujo.
Es una técnica muy rápida y sensible, considerada una herramienta poderosa para identificar
microorganismos en comunidades microbianas complejas.
Mediante el método de FISH se detectan secuencias de ácidos nucleicos marcadas con

fluorescencia. Estas son lo suficientemente pequeñas como para penetrar las membranas
celulares e hibridar específicamente el rRNA intracelular sin alterar la morfología o la
integridad de la célula. Es posible entonces detectar y cuantificar microorganismos mediante
esta prueba, que no es destructiva; visualizar la distribución temporal y espacial, acoplada con
la microscopía confocal láser de barrido se pueden observar las comunidades microbianas
en su ambiente. Mejoras recientes a esta técnica incluyen el FISH múltiple. Se realizan
hibridaciones múltiples, una para cada tipo de microorganismo (Girafa y Carminati, 2008).
El conocimiento de la distribución de los microorganismos en sus ambientes naturales,

además de su composición, es importante en ecología microbiana y en aspectos de
seguridad microbiológica de alimentos (Bottari et al., 2006), Recientemente, Tuohy et al.
(2007) demostraron que una cepa probiótica de Lactobacillus casei sobrevive bien en el tracto
gastrointestinal de humanos y Moroni et al., (2006) visualizaron la competencia entre una
cepa de Bifidobacterium aislada de un neonato y una de Listeria monocytogenes, bloqueando la
primera la invasión por Listeria.
Mediante el uso de estos métodos, junto con los tradicionales, ha avanzado la comprensión de
la estructura y la función de la compleja microbiota presente en los alimentos, haciendo posible
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planear de manera más racional su control, en el caso de los indeseables o su desarrollo, en el

caso de los responsables de la fermentación de los alimentos.
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Identificación y tipificación molecular de
Staphylococcus aureus en alimentos.
Dr. Jaime A. Bustos Martínez
Las enfermedades de origen alimentario (EOA), las ha definido la OMS como “enfermedades
por infecciones o toxinas naturales causadas por el consumo de agua o alimentos”. Se conocen
más de 250 EOA, sus síntomas varían dependiendo del agente etiológico. La diarrea y el
vómito son los síntomas más comunes. El número de casos, hospitalizaciones y muertes es
elevado (Le Loir et al., 2003).
Las bacterias son una de las principales causas de las EOA, debido a que su patogénesis se
centra en su habilidad para penetrar, sobrevivir y multiplicarse en las células huésped. La
patogénesis en gran medida depende de la capacidad de la bacteria para producir toxinas
después de la ingestión (en el tracto digestivo) o antes (toxinas preformadas en los alimentos).
Dentro de las bacterias Gram-positivas que causan EOA se encuentra Staphylococcus aureus. (Le
Loir et al., 2003)
Staphylococcus aureus es una de los principales agentes etiológicos de gastroenteritis causada por
el consumo de alimentos contaminados. La intoxicación alimentaria por estafilococos (IAE) se
debe a la absorción de las enterotoxinas estafilocócicas (SEs) preformadas en los alimentos (Le
Loir et al., 2003; Alarcón et al., 2006).
Staphylococcus aureus: características y enterotoxinas
S. aureus es un coco Gram-positivo anaerobio facultativo, no es móvil, es coagulasa y catalasa

positivo. Las células son esféricas, se encuentran solas, en pares o formando agrupaciones
como racimos de uvas (staphylo significa uva en griego). La pared del estafilococo es resistente a
la lisozima y sensible a la lisostafina, la cual rompe específicamente los puentes de pentaglicina
del estafilococo.
Las cepas de S. aureus se pueden clasificar en biotipos de acuerdo a su origen animal o humano.
Se han desarrollado esquemas basados en sus características bioquímicas que incluyen seis
biotipos diferentes: humano, humano no β-hemolítico, aviar, bovino, ovino y no específico
(Devriese, 1984: 215-220).
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Identificación y tipificación molecular
Algunas cepas de S. aureus son capaces de producir enterotoxinas estafilocócicas, estas cepas son
los agentes causales de la intoxicación alimentaria por estafilococos. S. aureus no forma esporas,
por lo que su contaminación puede ser rápidamente eliminada al tratar con calor la comida.
Sin embargo, permanece como una causa principal de EOA debido a que puede contaminar
productos alimenticios durante su preparación y procesamiento.
S. aureus se puede encontrar en las narinas, piel y cabello de los animales de sangre caliente.
Entre el 30 y 50% de la población humana son portadores de S. aureus (Bustos et al., 2006).
S. aureus es capaz de crecer en un rango amplio de temperatura (7 a 48.5°C con una temperatura
óptima de 30 a 37°C) (Schmitt et al., 1990). Puede crecer a pH de 4.2 a 9.3 con un pH óptimo
de 7 a 7.5 (Le Loir et al., 2003). Crece en altas concentraciones de cloruro de sodio (arriba
del 15% de NaCl). Estas características lo hacen capaz de crecer en una amplia variedad de
alimentos. Además su nicho ecológico, explica fácilmente su incidencia en los alimentos que
requieren manipulación durante el proceso, incluyendo alimentos fermentados como el queso.
S. aureus es una bacteria patógena importante debido a su virulencia, mediada por la combinación
de sus toxinas, sus factores de invasividad y su resistencia a los antibióticos. Por lo que el espectro
de infecciones que produce es muy variado, causa desde furúnculos hasta el síndrome del shock
tóxico y sepsis, infecciones nosocomiales e infecciones adquiridas en la comunidad. Varios
de estos padecimientos dependen de numerosos factores de virulencia (Bustos et al., 2006;
Bachert et al., 2002). Sin embargo, por otra parte, la intoxicación alimentaria por estafilococos
(IAE), depende principalmente de un tipo de factor de virulencia: las SEs. Los síntomas de
IAE son dolor abdominal, nausea, vómito, algunas veces seguido de diarrea (nunca diarrea
solamente). La aparición de los síntomas es rápida (de 30 min a 8 h) y se observa generalmente
una remisión espontánea después de 24h (Balaban et al., 2000; Le Loir et al., 2003).
Se encuentran descritos más de 20 tipos de enterotoxinas estafilocócicas (SEs) y enterotoxinas

estafilocócicas-similares (SE-like, SEl), las primeras se nombran de la A a la E y G, las segundas
de la H a la U (Bohach, 2006:464-485). Las SEs son proteínas pequeñas (entre 24 y 28kDa),
secretadas en el medio y solubles en agua. Son ricas en lisina, ácido aspártico, ácido glutámico
y tirosina. Muchas poseen un loop de cisteína que se requiere para su reconocimiento y su
actividad emética. Son proteínas muy estables, resisten muchas enzimas proteolíticas como
la pepsina, la tripsina, la quimiotripsina, la renina, por lo que pueden mantener su actividad
en el tracto digestivo después de la ingestión (Le Loir et al., 2003; Bachert et al., 2002). Las
SEs también son muy resistentes al calor y al pH bajo (Bennet, 1992). Por lo que estás toxinas
resisten las condiciones que destruyen fácilmente a la bacteria que las produjo.
Los genes que codifican las SEs se localizan en diferentes partes, principalmente en elementos
genéticos móviles. Se pueden encontrar en profagos, plásmidos, transposones, islas de
patogenicidad y en el cromosoma (Le Loir et al., 2003; Bustos et al., 2006).
El principal sistema regulador que controla la expresión de los genes de los factores de
virulencia en S. aureus es el regulador de genes accesorios (accessory gene regulator, agr), que
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actúa en combinación del regulador accesorio estafilocócico (staphylococcal accesory regulator,

sar) (Bronner et al., 2004). La producción de SEs dependientes de agr en alimentos, depende
de la habilidad de S. aureus de alcanzar una alta densidad celular en los alimentos (se estima
de 106 ufc/g). S. aureus se considera una bacteria exigente en términos de requerimientos
nutricionales, necesita valina para su crecimiento, además de arginina y cisteína tanto
para crecer como para producir las SEs (Onoue et al., 1997). Glucosa y pH bajo tienen un
efecto inhibitorio sobre la expresión de agr. La producción de SEs es óptima a pH neutro
y disminuye en pH ácido, generalmente la producción se inhibe a pH menor de 5 (Novick,
2006; Bronner et al., 2004).
S. aureus es muy sensible a la competencia microbiana. Este efecto se ha estudiado bien en

productos alimenticios fermentados, se ha demostrado que ha mayor concentración de
microorganismos competidores en la leche, disminuye la velocidad de crecimiento de S. aureus
y la producción de SEs (Genigeorgis, 1989:327-360).
La mayoría de las SEs presentan dos actividades principales: la actividad emética y la de

superantígeno. Estas funciones se localizan en dominios separados de la proteína (Dinges et al.,
2000). Debido a su actividad de superantígeno producen reacciones cruzadas que dan como
resultado la activación no específica y la proliferación de linfocitos T, dando como resultado
la secreción masiva de interleucinas que pueden estar involucradas en los mecanismos
de toxicidad de las SEs. Las SEs activan células T en órdenes de magnitud superiores a la
activación antígeno-específica. Esta dramática activación causa el síndrome del shock tóxico
(McCormick et al., 2001).
El efecto emético no está bien caracterizado. Además, poco se conoce de cómo las SEs causan
los síntomas de envenenamiento alimentario, es posible que las SEs presenten un efecto directo
sobre el epitelio intestinal y sobre el nervio vago, causando estimulación sobre el centro emético
y el tránsito intestinal (Arbuthnott et al., 1990).
Intoxicación alimentaria por estafilococos
En todos los casos de IAE, el alimento o uno de sus ingredientes se hallaba contaminado
con cepas de S. aureus productoras de SE y fueron expuestos, al menos por un tiempo, a
temperaturas que permiten el crecimiento de S. aureus. Esto puede deberse a fallas en el proceso
de refrigeración o porque se requieren temperaturas permisivas de crecimiento durante el
proceso de fabricación (por ejemplo, la producción de queso). Muchos y variados alimentos
pueden ser un buen medio de crecimiento de S. aureus y por lo tanto implicar la IAE, se incluyen:
leche, crema, mantequilla, jamón, quesos, salchichas, carne enlatada, ensaladas, sándwich y
platos de comidas (Le Loir et al., 2003).
Es importante eliminar cualquier fuente de contaminación durante el procesamiento y

refrigeración de los alimentos y sus ingredientes. Los alimentos deben refrigerarse antes y
después del tratamiento con calor (pasteurización). En el caso de alimentos enlatados estos
deben procesarse correctamente y se deben destruir las bacterias y las SEs.
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Los alimentos que más involucran IAE difieren de un país a otro, en el Reino Unido se debe
al jamón (Wieneke et al., 1993), en Francia los quesos y en Estados Unidos las carnes rojas
(Genigeorgis, 1989:327-360). En todos los casos de IAE, la principal fuente de contaminación
de los alimentos son los humanos, contaminación vía contacto por manos o vía aparato
respiratorio por tos o estornudo. La contaminación ocurre después del tratamiento con calor
de los alimentos. No obstante los alimentos como carne cruda, salchichas, leche cruda y
quesos de leche cruda, se contaminan de los animales de origen y con mayor frecuencia
cuando el animal es portador o se encuentra con infección por S. aureus, por ejemplo, la
mastitis (Akineden et al., 2001).
Los alimentos y sus ingredientes deben estar sujetos regularmente a control microbiológico. Entre
las cepas de S. aureus aisladas de muestras de alimentos, el porcentaje de cepas enterotoxigénicas es
de alrededor del 25% (Le Loir et al., 2003). Sin embargo, esta estimación varía dependiendo del
tipo de alimento y del lugar del muestreo. Uno de los factores importantes en productos lácteos es la
presencia de vacas con mastitis, por ejemplo en un reporte de Alemania se encontró que el 72.8%
de las cepas aisladas eran enterotoxigénicas, productoras de SEA a SEJ (Akineden et al., 2001).
Actualmente en la mayoría de los lugares sólo se buscan las toxinas clásicas SEA a SEE, sin embargo
utilizando técnicas de biología molecular, se amplía el número de cepas enterotoxigénicas cuando
se buscan las SEs descritas recientemente (Le Loir et al., 2003). Esto demuestra la importancia de
cuantificar adecuadamente la producción de todas las SE en los alimentos para tener una idea clara
de la relación entre las SE descritas recientemente y la intoxicación alimentaria.
Una concentración de 106 a 108 ufc de S. aureus por gramo de alimento es suficiente para
producir IAE. Una dosis de menos de 1μg de enterotoxina, la cual puede ser producida por 105
ufc/gramo, en alimentos contaminados puede producir síntomas después de 1 a 6 horas de la
ingestión (FDA, 2007). La dosis infectiva requerida para inducir IAE se estima en alrededor de
0.1μg y puede variar por la sensibilidad del paciente (Evenson et al., 1988).
En muchos países las normas oficiales solicitan la ausencia de S. aureus en 1 g o ml de alimento

como en productos basados en huevo o alimentos listos para comer. También pueden solicitar
un bajo nivel de contaminación 102 o 103 ufc/g, en productos que van a ser cocinados como
la carne molida y las salchichas (Alarcón et al., 2006). De igual manera en productos frescos
como los quesos, ya que en estas concentraciones no se considera un riesgo para la salud, como
en México (Secretaria de Salud, 1994) y Francia (AFNOR, 2004).
Métodos moleculares de identificación de S. aureus en alimentos
La identificación microbiológica clásica de S. aureus en alimentos, implica la detección y

cuantificación de estafilococos coagulasa positivos en un medio selectivo, generalmente
el medio Baird-Parker. La sensibilidad de estas pruebas es de alrededor de 102 ufc/g para
alimentos sólidos y de 10 ufc/g para muestras líquidas (Baird et al., 1995).
Regularmente se realiza una cuenta directa o se recuperan colonias aisladas después del
enriquecimiento en un caldo selectivo por 24-48h a 37°C. A las colonias sospechosas se les
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realiza la prueba de coagulasa y DNasa y se identifican por pruebas bioquímicas, como el

método de identificación con galerías API de bioMérieux. Esta metodología convencional
toma de cinco a seis días.
Los métodos de identificación microbiológica han sido considerados como estándar de oro en
la identificación de bacterias. En muchos laboratorios también se incluye el análisis basado en
características fenotípicas utilizando pruebas bioquímicas, serológicas y perfiles enzimáticos.
Sin embargo, existen varias desventajas asociadas con los métodos microbiológicos. Se pueden
encontrar resultados negativos si el número de patógenos en la muestra es muy bajo. Cultivos
negativos también pueden obtenerse a partir de muestras obtenidas después de una terapia
con antibióticos ya que las muestras pueden contener residuos de antibióticos. La presencia
de leucocitos en la leche de casos clínicos con mastitis puede producir resultados negativos
(Gillespie et al., 2005).
Estos métodos requieren de más de 48 horas para obtener el resultado. Además la inadecuada
detección del patógeno o la realización de pruebas de confirmación aumentan el tiempo para
intervenir y controlar la contaminación y su diseminación (Gillespie et al., 2005).
La utilización de ensayos basados en el DNA resuelve varios de los problemas asociados con
los procedimientos microbiológicos convencionales. La mayor ventaja es que los métodos
diagnósticos basados en el DNA están enfocados a la composición única de los ácidos nucleicos
del genoma bacteriano, más que a la expresión fenotípica de los productos codificados por los
ácidos nucleicos. Por lo tanto, los ensayos basados en el DNA están sujetos a menos variabilidad
comparados con los métodos basados en la caracterización fenotípica. Los sistemas de
identificación basados en el DNA están dirigidos para patógenos específicos, se puede realizar
un escrutinio rápido de un número grande de patógenos de manera simultánea y proporcionar
una confirmación definitiva de los patógenos.
El método más utilizado actualmente para la detección de microorganismos patógenos es la

reacción en cadena de la polimerasa (PCR), inventada por Kary Mullis en la década de los
ochenta (Mullis et al., 1986). Este método puede identificar bacterias en unas cuantas horas.
El método se basa en amplificar millones de veces una secuencia de DNA a partir de una copia
del gen que se está buscando. Para esto se utiliza una DNA polimerasa que puede realizar este
proceso de manera eficiente, la llamada taq polimerasa, la cual es una enzima termoestable
aislada de una bacteria termorresistente.
La técnica de PCR se ha utilizado ampliamente para la identificación de S. aureus, en

especial se han utilizado para su detección genes esenciales o “housekeeping”, como el gen
nuc que codifica para una nucleasa termoestable (Brakstad et al., 1992). Genes del rRNA
como: las regiones espaciadoras del rDNA 16S-23S (Saruta et al., 1997); el gen del rRNA
23S (Straub et al., 1999: Akineden et al., 2001). Genes de resistencia a los antibióticos
como: el gen mecA, que confiere resistencia a la meticilina (Oliveira et al., 2002:); el gen van,
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que da resistencia a la vancomicina (Depardieu et al., 2004). Genes de virulencia como: el gen
coa, que codifica para la coagulasa y el gen spa, que codifica para la proteína A (Kalorey et al.,
2007; Akineden et al., 2001). Genes de toxinas como: los genes sea, seb, sec de enterotoxinas
(Nakayama et al., 2006; Akineden et al., 2001); el gen tst de la toxina del síndrome del shock
tóxico (Jonson et al., 1996; Akineden et al., 2001); los genes eta y etb, que codifican toxinas
exfoliativas (Johnson et al., 1996; Akineden et al., 2001).
En el caso de los alimentos si se quiere detectar por PCR la presencia de la bacteria se utilizan
los genes nuc, coa y spa (Kalorey et al., 2007; Alarcón et al., 2006), si lo importante es determinar
la presencia de las toxinas de S. aureus, se utiliza principalmente la detección de los genes de
las SE (Akineden et al., 2001: Nakayama et al., 2006). Esta metodología se ha empleado en
alimentos como: leche (Cremonesi et al., 2005; Jorgensen et al., 2005); queso (Jorgensen et al.,
2005; Ercolini et al., 2004); salchichas (Holecková et al., 2002, Alarcón et al., 2006); pollo (Pepe
et al., 2006), pescado (Herrera et al., 2006), carne, ensaladas y una gran variedad de alimentos
(Alarcón et al., 2006).
A fines del siglo pasado Higuchi y colaboradores describen la PCR en tiempo real, la cual
vuelve a revolucionar la metodología para la detección de agentes infecciosos (Higuchi et al.,
1993). La diferencia con la PCR normal o también llamada de punto final, es que en la PCR
el producto de la reacción se puede observar hasta el final mediante electroforesis en un gel de
agarosa teñido normalmente con bromuro de etidio, mientras que en la PCR en tiempo real
se va observando la amplificación del DNA ciclo a ciclo, no se necesita esperar a que finalice la
reacción para saber si la muestra analizada contiene el gen que se busca, por lo que el resultado
se obtiene inmediatamente sin necesidad de realizar la electroforesis del producto final. Esta
metodología es más sensible y puede hacerse una determinación cuantitativa, de tal manera
que se puede saber el número de copias del gen que se está buscando en la muestra analizada.
También se requiere menos tiempo para la detección (aproximadamente una hora y media). Es
un método muy reproducible y con alta sensibilidad, al igual que en la PCR se pueden llevar a
cabo reacciones para detectar varios genes al mismo tiempo (reacción multiplex).
La detección del gen de interés se puede realizar por varias técnicas basadas en: sustancias
intercalantes del DNA como el SYBR green; en iniciadores marcados como los LUX; sondas de
hibridación como Hybprobes o sondas de hidrólisis como TaqMan.
Utilizando la tecnología de la PCR en tiempo real se ha determinado y cuantificado la

presencia tanto de S. aureus (Goto et al., 2007), como sus toxinas (Cremonesi et al., 2005). Se
han desarrollado pruebas multiplex para la detección simultánea de varios agentes patógenos
incluido S. aureus (Gillespie et al., 2005).
La detección de S. aureus utilizando la PCR en tiempo real se ha realizado en múltiples alimentos

como queso (Hein et al., 2001; Poli et al., 2007), leche (Ikeda et al., 2005; Goto et al., 2007;
Gillespie et al., 2005), carne, salchichas, ensaladas, salmón ahumado, paté, huevos preparados
y helados entre otros (Alarcón et al., 2006; Berrada et al., 2006).
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Tipificación molecular de S. aureus
Las epidemias de enfermedades infecciosas resultan de la exposición de un agente etiológico

común. Generalmente, este agente se deriva de una sola célula cuya progenie es genéticamente
idéntica o cercanamente relacionada. En términos epidemiológicos, los organismos
involucrados en las epidemias están relacionados clonalmente, es decir, tienen un origen común.
Los organismos relacionados clonalmente son miembros de la misma especie que comparten
factores de virulencia, rasgos bioquímicos y características genómicas. Sin embargo, existe
suficiente diversidad a nivel de especie para qué organismos aislados de diferentes fuentes y/o
en diferentes regiones geográficas pueden ser diferenciados y clasificados en subtipos o cepas.
El proceso de tipificación es de gran importancia epidemiológica para reconocer entre otras

cosas: epidemias, detección de transmisión cruzada de patógenos nosocomiales, determinación
de la fuente de infección, reconocimiento de cepas particularmente virulentas y monitoreo de
programas de vacunación (Olive et al., 1999).
Cualquier método de tipificación debe tener un elevado poder de diferenciación, debe ser
capaz de diferenciar claramente cepas no relacionadas, como aquellas que provienen de
diferente lugar, pero al mismo tiempo debe demostrar la relación de todos los organismos
aislados de individuos infectados de la misma fuente.
En un sistema de tipificación, la velocidad de mutación puede influenciar directamente la

estabilidad de los patrones durante los ciclos de replicación de una clona bacteriana. La
velocidad de mutación, incluye mutaciones puntuales, rearreglos genéticos y transferencia
horizontal de elementos genéticos móviles, como fagos y transposones, y es diferente de una
especie bacteriana a otra (Olive et al., 1999).
Las cepas de S. aureus pueden variar considerablemente en virulencia y potencial epidemiológico.

Para controlar la diseminación de las infecciones estafilocócicas, se debe identificar la fuente
de contaminación y los mecanismos de transmisión. Los estudios epidemiológicos y de
patogenicidad, dependen de la habilidad de los sistemas de tipificación para poder diferenciar
entre cepas que pertenecen a la misma o diferente especie bacteriana.
S. aureus causa brotes epidémicos de intoxicación alimentaria que involucran un número elevado
de personas, con hospitalizaciones y muertes (Le Loi et al., 2003; Do Carmo et al., 2004). En
estos casos es de suma importancia identificar el alimento contaminado y la cepa causante
del brote. Debido a la importancia clínica y epidemiológica de S. aureus, se han realizado
numerosos estudios de tipificación molecular de este microorganismo. Dentro de los métodos
utilizados se encuentran: el análisis de DNA polimórfico amplificado al azar (RAPD) (Van
Leeuwen et al., 1996); el análisis del polimorfismo longitudinal de fragmentos de restricción
(RFLP) (Yugueros et al., 1999); la tipificación de secuencias multilocus (MLST) (Rabello et al.,
2007). Sin embargo, ha sobresalido la electroforesis en gel de campos pulsados (PFGE) y se
le considera como el “estándar de oro” en la tipificación (Olive et al., 1999). La PFGE se ha
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utilizado ampliamente en la tipificación de cepas de S. aureus tanto en infecciones nosocomiales

(Mulvey et al., 2001) como en intoxicaciones alimentarías (Kluytmans et al., 1995).
La caracterización de cepas de S. aureus enterotoxigénicas causantes de brotes epidémicos de

intoxicación alimentaria se ha estudiado ampliamente, tanto por RAPD como por PFGE y
MLST (Kérouanton et al., 2007:369-375; Martin et al., 2004; Smith et al., 2005). No sólo se
analizan los alimentos, sino también a las personas que los preparan, ya que éstas pueden ser
las portadoras de las cepas enterotoxigénicas (Fueyo et al., 2005; Colombari et al., 2007:).
Conclusiones
Las nuevas tecnologías de análisis microbiológico basadas en el estudio del DNA han
revolucionado la manera de identificar y caracterizar a los microorganismos. En el caso
particular de S. aureus, bacteria causante de múltiples enfermedades debido a que presenta
una gran cantidad de factores de virulencia y resistencia a los antibióticos, es en estos genes
que codifican los factores de virulencia en donde se basa principalmente la identificación y
tipificación de las cepas enterotoxigénicas que se encuentran en los alimentos y que causan la
intoxicación alimentaria por estafilococos. Por lo que el conocer y manejar la tecnología del
DNA es de gran importancia en la actualidad.
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Rutas de transducción de señales y regulación
de la morfogénesis en hongos

Los hongos filamentosos
Los hongos filamentosos, en contraposición a las levaduras unicelulares, presentan un desarrollo

morfológico y un ciclo de vida más complejo, con la formación frecuentemente de esporas
tanto de origen sexual como asexual. La mayoría de los hongos pertenecientes a la División
de los Ascomicetos son filamentosos, caracterizados por tener hifas regularmente septadas
y formar colonias compactas, en contraposición a los Zigomicetos, con hifas cenocíticas y
colonias de morfología más laxa. Los Ascomicetos filamentosos se caracterizan además por la
formación de estructuras de origen sexual denominadas ascas, que contienen las ascosporas, y
la formación de conidios (esporas asexuales) exógenos, que aparecen sobre hifas especializadas
denominadas conidióforos.
Los hongos filamentosos tienen una gran importancia para el ser humano, ya que participan
en numerosos procesos relacionados con actividades humanas, por ejemplo:
Ecología: remineralización de materia orgánica, biorremediación
Biotecnología: producción de antibióticos, fármacos, enzimas, etc.
Microbiología de alimentos: participación en procesos de maduración de muchos
alimentos, como el queso (Penicillium roqueforti, P. camemberti), salamis (P. nalgiovense) y otros.
Patógenos: humanos (Aspergillus fumigatus, Penicillium marneffei) y fitopatógenos
(Fusarium spp., Magnaporthe grisea, Botrytis cinerea, etc)
El principal sistema de propagación de los hongos filamentosos es a través de esporas asexuales.

En años recientes se han realizado importantes avances en la comprensión de los mecanismos
que controlan el proceso de formación de estas esporas, denominado comúnmente proceso
de conidiación, habiéndose caracterizado un buen número de genes que regulan este proceso,
principalmente en el hongo ascomiceto Aspergillus nidulans.
Estímulos ambientales de la conidiación
El desarrollo vegetativo de los hongos filamentosos comienza con la germinación de una

espora, la cual produce inicialmente una hifa que crece de forma polar mediante extensión
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Rutas de transducción de señales y regulación de la morfogénesis en hongos
apical. A medida que crece longitudinalmente la hifa se ramifica, y el resultado final es una
red de células interconectadas que se denomina micelio. Este micelio forma una colonia que
crece radialmente a una velocidad constante. En Aspergillus nidulans, unas 16 h después de la
germinación surgen en el centro de la colonia hifas especializadas denominadas hifas aéreas
(Champe y Simón, 1992), muchas de las cuales se diferenciarán posteriormente para formar
conidióforos. Los conidióforos forman una “vesícula” (hinchamiento) en la parte apical (Fig.
1), sobre la que se desarrolla una corona de células denominadas “métula”, y sobre éstas las
fiálides, células especializadas con forma de matraz que sufren mitosis sucesivas en su parte
apical generando los conidios en una sucesión basipétala. En Penicillium el conidióforo no forma
una vesícula sino que se ramifica en la parte apical originando las “métula” y a continuación
las fiálides, que producirán los conidios.
La formación de conidióforos y conidios está sujeta a unas determinadas condiciones fisiológicas,

la más importante de las cuales es la exposición al aire (Law y Timberlake, 1980). Cuando el
micelio se expone al aire se producen una serie de importantes cambios en las propiedades de
superficie del micelio, como la aparición de una capa hidrófoba formada principalmente por
proteínas denominadas hidrofobinas (Wessels, 1997), las cuales son muy abundantes en los
conidios. Por norma general, los hongos filamentosos no conidian en cultivos sumergidos, si
bien puede inducirse la conidiación estableciendo condiciones específicas, entre las que cabe
citar la limitación de determinados nutrientes, una alta osmolaridad y la adición de iones Ca2+
en especies de Penicillium (Roncal y Ugalde, 2003).
Otro estímulo ambiental que induce la conidiación en determinadas especies como Neurospora
crassa, Trichoderma viridae y Aspergillus nidulans es la exposición a la luz. En Neurospora crassa la
proteína White Collar-1 (WC-1), que contiene FAD como cofactor, se ha identificado como
el receptor de luz azul que media la inducción por la luz del reloj circadiano (Froehlich et al.
2002; He et al. 2002).
conidióforo y estructuras formadoras de los conidios en los géneros Penicillium

Figura 1. Morfología del
y Aspergillus.
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Inductores endógenos
Además de los estímulos ambientales se han identificado inductores endógenos, o autoinductores,

moléculas de bajo peso que son producidas por el propio hongo y que inducen la conidiación,
actuando aparentemente de forma similar a los sistemas de Quorum Sensing descritos en
bacterias (Swift, 1996). En Penicillium notatum se observó que eran necesarias 7 h de crecimiento
vegetativo para inducir conidiación en cultivo sumergido mediante adición de iones Ca2+, sin
embargo este periodo de incubación era innecesario si el micelio se cultivaba en un medio
donde previamente se había crecido el hongo (Hadley y Harrold, 1958). Posteriormente se
obtuvieron estos mismos resultados en Penicillium cyclopium y se aisló un compuesto diterpeno
que era responsable de la actividad observada, y al cual se denominó conidiogenona (Roncal
et al. 2002). Se comprobó que la conidiogenona era suficiente y necesaria para inducir la
conidiación en cultivo sumergido, y que por tanto el papel de los iones Ca2+ en la inducción era
meramente auxiliar, reduciendo el umbral de concentración de conidiogenona necesario para
inducir conidiación entre 5 y 6 veces. La inducción de la conidiación por la conidiogenona
ofrece una explicación al requerimiento de la exposición aérea para que se produzca la
conidiación; en cultivo sumergido el autoinductor difunde en el medio y no llega a alcanzar la
concentración umbral que desencadena el proceso de diferenciación, sin embargo en cultivo
sólido, la conidiogenona no difunde de la misma forma, y alcanza una concentración en la
zona del micelio aéreo suficiente para inducir la diferenciación y posterior conidiación.
Otros posibles inductores endógenos han sido encontrados en otros hongos, como el esporógeno-
PF1, de Penicillium funiculosum, cuya síntesis es estimulada por la luz azul, y que es capaz de
inducir conidiación en condiciones de oscuridad (Katayama, 1989). En Aspergillus nidulans se
postula la existencia de una molécula autoinductora en cuya síntesis estaría involucrado el gen
fluG, ya que un mutante en este gen es aconidial, pero sin embargo es capaz de conidiar cuando
crece en presencia de la cepa silvestre, formando un número normal de conidios en el borde de
la colonia próximo a la silvestre (Lee y Adams, 1994).
Regulación genética de la conidiación
El proceso de desarrollo morfológico que conduce a la formación de conidios en los hongos

filamentosos se ha estudiado principalmente en Aspergillus nidulans. Se trata de un proceso
secuencial, en el cual las diferentes estructuras van apareciendo y desarrollándose bajo el control
de una serie de genes que definen la denominada: vía reguladora central de la conidiogénesis
(Adams et al. 1998).
Esta vía reguladora central de la conidiogénesis consiste en 3 genes que fueron identificados
mediante el estudio de mutantes bloqueados en diferentes fases del proceso de la conidiación:
brlA, su expresión es necesaria y suficiente para desencadenar la conidiogénesis. Controla

directamente la expresión de genes implicados en las primeras etapas del proceso y la del
segundo gen de la vía reguladora central: abaA. Los mutantes brlA son incapaces de completar
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la diferenciación de los conidióforos, los cuales crecen hasta una longitud 20 o 30 veces mayor
que los silvestres; estos mutantes son denominados bristle (erizados) por la apariencia de sus
colonias, consecuencia del excesivo desarrollo sin diferenciación de los conidióforos. brlA
codifica una proteína que contiene un motivo de unión a ADN de tipo Zinc-finger, se trata por
tanto de un factor de transcripción que se une a la secuencia consenso BRE (BrlA Response
Elements) en los promotores de los genes que controla (Chang y Timberlake, 1992)
abaA, implicado en las etapas intermedias del proceso. Regula la expresión de numerosos
genes específicos de la conidiación y del último de los genes de la vía central, el gen wetA.
Los mutantes abaA se denominan “abacus”, ya que desarrollan conidióforos normales pero las
“métula” y fiálides son anormales y no producen conidios, formando en su lugar estructuras
alargadas compuestas de cadenas de células con abultamientos que asemejan la forma de
un ábaco. abaA codifica un polipéptido que contiene un dominio de unión a ADN similar
al de factores de transcripción como el simian virus 40 enhancer factor TEF-1 (Andrianopoulos
y Timberlake, 1991), y una posible cremallera de leucina para dimerización. El factor AbaA
se une específicamente a la secuencia consenso 5’-CATTCY-3’ (ARE), que está presente en
muchos genes específicos de la conidiación incluido wetA.
wetA, se expresa con posterioridad a los otros dos y regula las etapas finales del proceso y
la formación de conidios, controlando entre otros la expresión de genes de biosíntesis de
componentes de la pared celular. El fenotipo de los mutantes wetA se describe como wet-white
(húmedo-blanco), caracterizado por la formación normal de conidióforos pero con conidios
no pigmentados y que se autolisan. wetA codifica un polipéptido que no muestra similitudes
importantes con otras proteínas en bases de datos, pero se postula que su función es la de
controlar la expresión de genes específicos de los conidios (Marshall y Timberlake, 1991).
En A. nidulans se han aislado además muchos mutantes con fenotipos aconidiales, que se
denominan fluffy, y que definen reguladores tempranos del proceso conidiogénico. Martinelli y
Clutterbuck (1971) propusieron que en torno al 83% de los mutantes en esporulación estaban
alterados en su capacidad para iniciar el proceso antes de la formación de la vesícula del
conidióforo, y presumiblemente antes de la activación de la expresión de brlA.
Mediante un extensivo análisis genético de mutantes fluffy recesivos se lograron identificar 6

genes: fluG, flbA, flbB, flbC, flbD, y flbE (Wieser, 1994). Mutaciones de pérdida de función en
cualquiera de estos genes causaban fenotipos tipo fluffy y una clara disminución del primer gen
de la vía reguladora central de la conidiogénesis. Estos 6 genes han sido aislados y estudiados.
El gen fluG, como se dijo con anterioridad parece estar involucrado en la síntesis de una señal
extracelular que actúa como un autoinductor de la conidiación. fluG codifica una proteína
relacionada con la glutamina sintetasa I procariota. Los genes flbB, flbC y flbD codifican
proteínas de unión a ácidos nucleicos, y probablemente actúan activando la transcripción de
otros genes reguladores del desarrollo, como el propio brlA, en respuesta a señales inductoras
de la conidiación. Los transcritos de los genes fluG, flbB, flbC, flbD y flbE están presentes durante
el desarrollo vegetativo y se mantienen en niveles aproximadamente constantes durante las
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distintas etapas de la diferenciación. Por su parte, flbA codifica un polipéptido de 719 aminoácidos
que muestra similitud con una familia de proteínas que comparten un dominio C-terminal
conservado de 120 aminoácidos, el cual ha sido denominado RGS (Regulator of G-protein
Signaling) (Dohlman y Thorner, 1997). El dominio RGS tiene una función reguladora de la
señal mediada por proteínas G heterotriméricas, al activar la actividad GTPasa endógena de
la subunidad a de estas proteínas, lo que lleva a su inactivación temporal.
La función de flbA quedó establecida cuando se caracterizó otra mutación dominante en otro
gen, fadA. Esta mutación correspondía a un cambio de un residuo glicina por una arginina en
la posición 42, dando lugar al alelo mutante fadAG42R, el cual causa un fenotipo fluffy y autolítico
similar al de los mutantes flbA (Yu et al. 1996). fadA codifica la subunidad a de una proteína G
heterotrimérica. Las proteínas G heterotriméricas están compuestas de 3 subunidades: a, b y g.
En su estado inactivo la proteína se encuentra formando un trímero, asociada a la membrana
plasmática, y la subunidad a tiene unida una molécula de GDP. Cuando un receptor de
membrana denominado G protein-coupled receptor es activado por una señal, la subunidad a de
la proteína G heterotrimérica sufre un cambio conformacional que provoca su separación del
dímero bg y el intercambio de GDP por GTP (Hamm, 2001). La subunidad a y el dímero bg
por separado están entonces activos para interaccionar con sus efectores correspondientes.
Pero esta activación es temporal, la subunidad a posee una actividad GTPasa endógena que
hidroliza GTP en GDP, y cuando esto sucede la subunidad vuelve a unirse al dímero bg para
formar el trímero inactivo. La mutación G42R provoca la inactivación de la actividad GTPasa
de FadA, y consecuentemente produce una subunidad a constitutivamente activa, la cual
inhibe permanentemente el proceso de conidiación dando lugar a un mutante fluffy. FadA es
por tanto un regulador negativo del proceso de conidiación, mientras que el papel de FlbA
es antagonista de FadA, estimulando la actividad GTPasa de esta última, lo que provoca su
inactivación, y consecuentemente la estimulación de la conidiación. La inactivación de flbA
hace que FadA permanezca activa durante mucho más tiempo, reprimiendo la conidiación y
generando un mutante fluffy.
En base a estos resultados se postuló la existencia de dos rutas antagonistas de control del
proceso de conidiogénesis (Adams et al. 1998) (Fig. 2). La proteína G heterotrimérica con la
subunidad a FadA bloquea la conidiación, favoreciendo el desarrollo vegetativo; para que
se produzca la conidiación FadA debe ser al menos parcialmente inactivada mediante la
actividad de FlbA. Por otro lado, una señal extracelular dependiente de la actividad de FluG
activa otras rutas de transducción de señales que conducen a la conidiación, y entre cuyos
componentes están los productos de los genes flbB, flbD, flbE y flbC. Estos genes se transcriben
constitutivamente pero su actividad es específica del proceso de esporulación, por lo que la
señalización mediada por FluG posiblemente incluya la modificación transcripcional de los
productos de estos genes para activarlos.
La subunidad a FadA actúa a través de la proteína kinasa dependiente de AMPc, PkaA (Shimizu
y Keller, 2001). Esta kinasa actúa promoviendo el crecimiento vegetativo y bloqueando la
esporulación.
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El gen que en Aspergillus nidulans codifica la subunidad b de la proteína G heterotrimérica se

denomina sfaD. Los mutantes DsfaD tienen un fenotipo caracterizado por la sobreproducción
de conidios, por lo que se deduce que también la subunidad b es un regulador negativo de la
esporulación asexual (Rosén et al. 1999).

Figura 2. Modelo de regulación de la esporulación asexual en Aspergillus nidulans a través de dos rutas
antagónicas. Modificado de Adams et al. (1998), Lengeler et al. (2000), Shimizu y Keller (2001) y Rosén
et al. (1999).
Relación entre el desarrollo morfológico y el metabolismo secundario
Además de su función como inhibidor del desarrollo morfológico y la conidiación, la

subunidad a FadA de Aspergillus nidulans regula la producción de metabolitos secundarios
como la esterigmatocistina (Calvo et al. 2002). Mutantes con el alelo fadAG42R, que produce una
subunidad a constitutivamente activa, presentan además de su fenotipo fluffy la incapacidad
de producir esterigmatocistina (Hicks et al. 1997).
El control de estos dos procesos se lleva a cabo principalmente a nivel transcripcional; en

mutantes fadAG42R se encuentra reprimida la expresión de los genes brlA, primero de la vía
reguladora central de la conidiogénesis, y aflR, que codifica un factor transcripcional específico
que activa los genes biosintéticos de esterigmatocistina. Este control es mediado por la proteína
kinasa PkaA (Shimizu y Keller, 2001), tanto a nivel transcripcional como post-transcripcional.
Sin embargo, FadA tiene un efecto opuesto en la regulación de la biosíntesis de diferentes

metabolitos secundarios, así mientras reprime la síntesis de esterigmatocistina, regula
positivamente la síntesis de penicilina por una vía aún no caracterizada (Tag et al. 2000).
Este fenómeno no es exclusivo de Aspergillus nidulans, ya que se han descrito otros ejemplos de
regulación diferencial de la síntesis de metabolitos secundarios por subunidades a homólogas a
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FadA en otros hongos, así por ejemplo, en Trichoderma atroviride, la subunidad a Tga1 tiene una
función opuesta en la regulación de diferentes sustancias antifúngicas (Reithner et al., 2005).
Además del desarrollo morfológico y la producción de metabolitos secundarios, las proteínas G

heterotriméricas también están implicadas en procesos de virulencia en hongos fitopatógenos,
como ocurre en Magnaporthe grisea o Cryphonectria parasitica (Lengeler et al. 2000).
Caracterización de la subunidad a Pga1 de Penicillium chrysogenum
El gen pga1 codifica una subunidad a de una proteína G heterotrimérica en Penicillium chrysogenum.
Pga1 pertenece al grupo I dentro de las subunidades a de los hongos (Bölker, 1998), y presenta
una alta similitud con la proteína FadA de A. nidulans (García-Rico et al. 2007).
La caracterización de Pga1 se llevó a cabo mediante la interrupción génica del gen, generando
la cepa Dpga1, y la obtención de cepas transformantes portadoras del alelo pga1G42R, que
produce una subunidad a constitutivamente activa, y otras portadoras del alelo pga1G203R,
que produce una subunidad a mutada la cual es incapaz de separarse del dímero bg, y por
tanto está permanentemente inactivada (García-Rico et al. 2007).
Las cepas pga1G42R presentan un fenotipo de tipo fluffy, con muy pocos conidios, mientras
las cepas Dpga1 y pga1G203R muestran un fenotipo hiperconidiante en medio sólido, y además
también conidian en medio líquido, una condición en la que P. chrysogenum no desarrolla
habitualmente el proceso de conidiación, lo que indica que Pga1 es un regulador negativo de la
conidiogénesis (García-Rico et al. 2008). El control sobre la conidiación se lleva a cabo mediante
la regulación de la expresión de los genes brlA y wetA, pertenecientes a la vía reguladora central
de la conidiogénesis. En las cepas pga1G42R la expresión de brlA y wetA se encuentra reprimida,
en cambio en las cepas Dpga1 y pga1G203R la expresión de estos genes es más alta que en la
parental, lo que provoca el fenotipo hiperconidiante en cultivos en medio sólido. Además, en
medio líquido, mientras en la cepa parental no hay expresión de brlA y wetA, en las cepas Dpga1
y pga1G203R se induce la expresión de ambos genes, dando lugar al desarrollo de las estructuras
conidiogénicas y cadenas de conidios que se observan en dichas cepas en esta condición.
Existen varios trabajos que describen la implicación del AMP cíclico (AMPc) en el proceso de
conidiación en hongos filamentosos. En Aspergillus nidulans, la regulación de la esporulación
asexual por la subunidad a FadA se produce a través de la proteína kinasa dependiente de
AMPc PkaA (Shimizu y Keller, 2001). También en Aspergillus niger (Bencina et al. 1997) y en
Penicillium marneffei (Zuber et al., 2002) se ha reportado un efecto negativo del AMPc en la
conidiación. Sin embargo, en Penicillium chrysogenum la vía señalizadora mediada por AMPc tiene
poca relevancia en el control negativo de Pga1 sobre la conidiación (García-Rico et al. 2008).
Pga1 sí modula la concentración intracelular de AMPc, al igual que ocurre en otros hongos,
pero el incremento inducido de la concentración de AMPc en la cepa parental, mediante la
utilización del análogo funcional dibutiril-AMPc y el inhibidor de fosfodiesterasas teofilina,
causó una disminución en el número de conidios de sólo un 25%, mientras que en las cepas
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portadoras del alelo dominante activador pga1G42R la disminución fue hasta de un 95%. Este
resultado indica que la represión de la conidiación por Pga1 se lleva a cabo principalmente
por mecanismos independientes de la vía señalizadora del AMPc. En contraste, en Penicillium
marneffei las altas concentraciones de AMPc intracelular producen un fenotipo totalmente
aconidial (Zuber et al., 2002). Por tanto, aunque los mecanismos básicos de regulación de la
conidiación son similares en los hongos filamentosos, existen diferencias en las vías a través de
las cuales se ejerce esta regulación, estando el AMPc implicado de manera diferente según la
especie de que se trate.
Como se mencionó con anterioridad, en Aspergillus nidulans el dímero bg regula también

negativamente la conidiación, ya que la deleción del gen sfaD, que codifica la subunidad
b, provoca la conidiación en cultivo sumergido (Rosén et al. 1999). De forma similar se ha
relacionado la actividad del dímero bg con el control sobre la conidiación en Cryphonectria
parasitica y Neurospora crassa. En Penicillium chrysogenum, el diferente comportamiento en cuanto
a la conidiación en medio líquido de las cepas Dpga1, donde el dímero bg se encuentra libre y
es activo, y pga1G203R, en la cual el dímero se encuentra asociado permanentemente a Pga1 y es
inactivo, sugiere también que el dímero bg tiene un papel en la regulación de la conidiogénesis.
La cepa pga1G203R muestra un fenotipo más extremo que la cepa Dpga1, formando un mayor
número de conidios en cultivo sumergido y mostrando una mayor expresión de los genes brlA y
wetA, lo que parece indicar que la presencia del dímero bg en su forma activa en la cepa Dpga1
está ejerciendo un efecto represor sobre la conidiación que no tiene lugar en la cepa pga1G203R.
Además de su participación en el control de la conidiación, Pga1 también regula la producción

de penicilina en Penicillium chrysogenum, al igual que su homólogo FadA en Aspergillus nidulans. La
activación constitutiva de la subunidad a Pga1 tiene como resultado una mayor producción de
penicilina y una mayor expresión de los genes biosintéticos de este antibiótico, mientras que la
deleción de pga1 o la inactivación constitutiva de la subunidad a provocan una disminución tanto
en la biosíntesis de penicilina como en la expresión de los genes (García-Rico et al. en prensa).
El control de Pga1 sobre la producción de penicilina no se lleva a cabo a través del AMPc. Así
mismo, cuando se transforma una cepa de Penicillium roqueforti con el alelo pga1G42R se produce un
incremento en la producción de roquefortina; este resultado es similar al observado en Fusarium
sporotrichioides respecto a la producción de trichoteceno cuando es transformado con el alelo
fadAG42R de A. nidulans (Tag et al. 2000). Estos resultados muestran que la función de las proteínas
G heterotriméricas está bastante conservada en hongos, y que las subunidades a regulan el
metabolismo secundario, aunque como se indicó con anterioridad, esta regulación es positiva en
algunos casos (penicilina) y negativa en otros (esterigmatocistina en Aspergillus nidulans).
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Biología molecular: herramienta para estudios
de ecología microbiana aplicada a estudios
ambientales
Dr. Nathalie Cabirol

Dr. Marcelo Rojas-Oropeza
Dr. Francisco J. Fernández
Introducción
Tradicionalmente, el análisis de las comunidades microbianas en el ambiente se relacionaba

con técnicas clásicas de cultivo, para lo cual se dispone de una gran variedad de medios. Sin
embargo, sólo del 0.001 al 15% de los microorganismos han sido estudiados por estos métodos
(Hill et al., 2000; Spring et al., 2000; Smith et al., 2001). Con estas técnicas, además, se puede
favorecer el crecimiento de grupos microbianos poco representativos del ecosistema estudiado,
sin realmente aislar los más importantes, lo que influiría en la interpretación del papel ecológico
de los microorganismos. En otros términos, los métodos de cultivo tradicionales no permiten
estudiar objetivamente la estructura y función de las comunidades microbianas, ya que en
general se altera el número y las actividades de los microorganismos, de manera negativa o
positiva (Atlas y Bartha, 2002; Nocker et al., 2007).
En la actualidad se dispone de métodos más sensibles para el análisis de comunidades

microbianas, en la naturaleza o en ingeniería ambiental. Uno de los mejores procedimientos es
el que se basa en la detección de los ácidos nucleicos, técnicas que se denominan moleculares.
La aplicación de técnicas moleculares en muestras ambientales ha producido avances muy
importantes en ecología microbiana en los últimos años. El desarrollo de estas técnicas permite
detectar poblaciones microbianas concretas y sus actividades, sin necesidad de cultivar los
microorganismos (Atlas y Bartha, 2002; Madigan et al., 2004). Estos métodos moleculares se
basan en sondas o secuencias de ácidos nucleicos, que pueden ser un pequeño fragmento de
ácido desoxirribonucleico (ADN) o ribonucleico (ARN) (en general de unos 20 nucleótidos)
complementario en la secuencia de bases a una parte de un gen, el objeto de estudio. La
utilización de ADN o ARN tiene dos alcances diferentes: el seguimiento de las comunidades
microbianas mediante secuencias de tipo ADN permite la detección de los microorganismos
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Biología molecular
implicados, sin obtener indicación de su estado fisiológico, mientras que mediante el análisis
del ARN es posible evaluar la actividad de dichos microorganismos.
Para poder aplicar las técnicas moleculares es necesario extraer el ADN o ARN de las muestras
ambientales a estudiar. El primer paso es el rompimiento mecánico o químico de las paredes
y membranas de los microorganismos a estudiar. Las etapas siguientes son de limpieza de la
muestra, seguidas al final por la precipitación y purificación del material genético.
Sondas de ácidos nucleicos (Cebadores o Primers)
Las técnicas de este tipo se basan en la búsqueda de “secuencias blanco” determinadas

mediante hibridación con fragmentos específicos de ADN (las denominadas sondas). Entre
los muchos fragmentos de ADN utilizados para estimar la composición y diversidad de las
comunidades de bacterias y arqueas en
hábitats complejos, el caso más utilizado es el del gen que codifica para el ARN ribosomal
(ARNr) 16S de los procariotas (Madigan et al., 2004). Esta molécula se ha elegido como “reloj
evolutivo” debido a que presenta algunas características que permiten hacer una diferenciación
adecuada entre los microorganismos a diferentes niveles taxonómicos:
- es universal y abundante en los seres vivos (existen 103-105 ribosomas/bacteria).

- tiene alta conservación en los diferentes niveles taxonómicos, por lo cual permite
correlacionar directamente los microorganismos cercanos desde el punto de vista
filogenético.
- registra los principales cambios que han sufrido los microorganismos durante su
evolución, debido a la presencia de regiones de variabilidad. Por esta razón, permite
diferenciar entre ellos incluso al nivel de especie.
- su tamaño es adecuado para hacer tratamientos estadísticos (Stahl et al., 1988;
Witzingerode et al., 1997; Jan y Le Borgne, 2001; Sanz y Köchling, 2007).
El análisis de este gen permite caracterizar más del 90% de los microorganismos sin cultivarlos,
lo cual refuerza el interés de las técnicas moleculares (Hill et al., 2000; Madigan et al., 2004).
Además, la base de datos de secuencias de ARNr disponibles es muy amplia, lo cual facilita la
identificación de los microorganismos: por ejemplo, el sitio en Internet del National Center for
Biotechnology Information (NCBI) contiene ya más de 61,132,599 secuencias de ADNr 16S en la
base de datos Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Usando dichas bases ha sido posible la
obtención de cebadores específicos para cinco géneros de arqueas metanógenas, con el objetivo
de seguirlos de manera rápida en muestras ambientales, tales como lodos anaerobios de interés
para su uso industrial en plantas de tratamiento de aguas residuales (Cabirol et al., 2003).
Aparte de este gen, se pueden elegir otros genes o secuencias específicas como base para el diseño
de sondas de ácidos nucleicos. Éste es el caso de los denominados “genes de función”, como
por ejemplo el gen codificador de la nitrito reductasa (nirS y nirK) en bacterias desnitrificantes
y él de la metil-coenzima M reductasa (mcrA) en bacterias metanógenas. Los productos de estos
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Dr. Nathalie Cabirol y cols.
genes intervienen en procesos de tratamiento de aguas residuales por digestión anaerobia.

Otro gen interesante es el que codifica para la amonio mono-oxigenasa (amoA) en bacterias
nitrificantes (Kowalchuk y Stephen, 2001; Luton et al., 2002; Tiquia et al., 2006). En nuestro
laboratorio del Instituto de Ingeniería (UNAM), hemos podido amplificar el gen amoA en
suelos salinos sódicos del Ex-Lago de Texcoco (Edo. de México, México), con el fin de estudiar
la diversidad de las bacterias nitrificantes.
PCR, reacción en cadena de la polimerasa (Polimerase Chain Reaction)
Esta técnica, base en casi todos los procesos de identificación molecular que se verán con
posterioridad, se fundamenta en el mecanismo de replicación natural del ADN. El resultado
principal es la amplificación del ADN, al aumentar artificialmente el número de veces que éste
se replica. Esto permite obtener una elevada cantidad del fragmento o fragmentos deseados.
La técnica consiste en la amplificación enzimática “in vitro” de una secuencia de ADN ubicada
entre dos cebadores, compuestos por oligonucleótidos, que sirven de inicio de la replicación,
y por lo tanto constituyen los extremos terminales del fragmento amplificado. El tamaño de
los fragmentos amplificados está determinado por la distancia entre las posiciones que ocupan
dichos oligonucleótidos (cebadores o “primers”) sobre la molécula de ADN, siendo la secuencia
de estos cebadores conocida y complementaria al gen o a la región que se pretende amplificar
(Mullis et al., 1994; Sambrook y Russell, 2001). La PCR permite una detección altamente
sensible del gen considerado, incluso en muestras heterogéneas de ADN como son el lodo, el
agua o el suelo (Dussurget y Roulland-Dussoix, 1994).
El protocolo de la técnica se puede describir como sigue: extracción de ADN total y repetición
(comúnmente, entre 25 y 35 veces) de un ciclo compuesto de:
a) desnaturalización de las cadenas de ADN,

b) alineamiento de los cebadores con las cadenas diana (ADN molde) y
c) síntesis de las cadenas complementarias por medio de una ADN polimerasa termoestable
(Taq Polimerasa, por ejemplo) (Figura 1).
Los componentes esenciales de la mezcla de reacción son la ADN polimerasa, los

cebadores oligonucleotídicos, los desoxirrobonucleótidos trifosfato libres (dNTPs), el ADN
molde e iones de magnesio (Mg2+). El producto amplificado se separa mediante electroforesis
horizontal en gel de agarosa y se visualiza con un marcador fluorescente con afinidad para el
ADN (bromuro de etidio, por ejemplo). El tamaño de los fragmentos amplificados se determina
mediante el uso de un marcador de peso molecular conocido (Mullis et al., 1994; Sambrook y
Russell, 2001).
Los principales factores que pueden afectar la eficiencia de la reacción son: el diseño
del cebador (considerando la secuencia y el grado de homología con el ADN blanco),
concentración del cebador, concentración y pureza del ADN molde, temperaturas de
desnaturalización y alineamiento, duración de cada etapa, tiempo para el cambio de
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Biología molecular
ADN
94°C
Alineamiento
de cebadores °C variable
ADN 72°C (Taq Pol)

polimerasa
20-35 ciclos
Múltiples copias
Figura 1. Diagrama general de la reacción de PCR.
la temperatura (debido al termociclador) y la concentración del ión magnesio (Mg2+)

(Sambrook y Russell, 2001).
Métodos de análisis de comunidades microbianas con técnicas de ADN
Con el objetivo de analizar las comunidades microbianas y detectar los microorganismos, desde
los más hasta los menos representativos, el ADN total obtenido de una muestra ambiental se
amplifica por PCR. A continuación, los diferentes amplicones o grupos amplificados, deben ser
separados para poder distinguir y secuenciar cada uno (Hill et al., 2000). Existen diferentes
métodos de análisis de la diversidad microbiana, que utilizan distintas formas de separar los
productos obtenidos por PCR.
Clonación y secuenciación
Esta técnica es aún la más utilizada en el estudio de las comunidades microbianas. Implica la
extracción de los ácidos nucleicos, amplificación y clonación de los genes estudiados (por ejemplo
del ARNr 16S), la secuenciación de dichos genes y la utilización de programas filogenéticos
para determinar la filiación del clon aislado en base a las secuencias obtenidas a partir de
bancos de datos (NCBI, EBI (www.ebi.ac.uk), etc.) (Sanz y Köchling, 2007). Lo extendido del
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uso de esta técnica hace que, hoy en día, unas dos terceras partes de las 61,132,599 secuencias
depositadas en los bancos de datos citados no pertenezcan a organismos aislados.
La clonación molecular corresponde al aislamiento e incorporación de un fragmento de ADN

dentro de un vector en el cual puede replicarse (Madigan et al., 2004). El procedimiento de
clonación puede usar una gran variedad de vectores para Escherichia coli, y es el método más
tradicionalmente utilizado para separar fragmentos de ADN amplificados por PCR, sobre
todo aquellos que tienen longitud idéntica pero secuencia diferente (Wintzingerode et al.,
1997; Hill et al., 2000). Los vectores de clonación, en general plásmidos o bacteriófagos, están
generalmente diseñados de forma que permiten la recombinación del ADN foráneo en un
sitio de restricción que corta el vector sin afectar a su replicación. La etapa de inserción del
fragmento del ADN en el vector se llama ligación. Luego, dichos vectores están introducidos
en un organismo hospedero, etapa llamada transformación.
En el vector de clonación, el sitio de restricción utilizado para la ligación suele encontrarse dentro
de un gen definido, lo que provocará la aparición de un fenotipo conocido al microorganismo
transformado con el vector. Dicho gen de selección puede ser un gen de resistencia a antibiótico
(p. ej. el plásmido pBR322, con genes de resistencia a la ampicilina y la tetraciclina), o un gen
catabólico (p. ej, el plásmido pGEM‑T con un gen para la β-galactosidasa, lacZ) (Figura 2)
(Madigan et al., 2004).

Figura 2. Vector de clonación, producto Promega, http://www.promega.com
El fragmento de ADN a secuenciar se inserta por ligación dentro de gen de selección, lo cual
inactiva su expresión fenotípica. En el caso del vector pGEM-T, la bacteria que contiene el
vector con el fragmento de ADN amplificado no presenta el gen lacZ activo, lo cual permite
una selección colorimétrica (colonias azules: Lac+ y crema: Lac-). Cada colonia bacteriana
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Biología molecular
corresponde a un clon, es decir una población de células que descienden todas de una única
célula. Cada colonia bacteriana contiene así un único fragmento de ADN a secuenciar
(Madigan et al., 2004).
Una vez obtenidos los clones, el fragmento de interés se amplifica por PCR usando cebadores
universales, que se unen a secuencias del vector y permiten amplificar cualquier fragmento
insertado en él: en el caso del vector pGEM-T, se utilizan los primers T7 y SP6 (Figura 2). Los
diferentes clones serán explorados, por comparación de los perfiles de los fragmentos generados
tras la digestión del plásmido con una enzima de restricción definida. A partir de este screening,
sólo se secuenciarán los plásmidos de los clones que presenten perfiles de restricción diferentes,
pues los perfiles idénticos podrían corresponder a un mismo microorganismo. En general, la
secuencia de los diferentes plásmidos se determina con un secuenciador automático, usando el
método de Sanger (método enzimático o de los didesoxinucleótidos), que consiste en hacer una
copia de ADN monocatenario con la enzima ADN polimerasa (Madigan et al., 2004). Cada
secuencia correspondiente a un clon se compara con las secuencias disponibles en bases de
datos en Internet, con el fin de identificar al microorganismo. El análisis de la microbiota total
se obtiene mediante la construcción de un árbol filogenético por el método de Jukes y Cantor
(1969), en el cual la longitud de las ramas entre las secuencias estudiadas se relaciona con el
número de cambios moleculares que han ocurrido entre dos nudos, es decir entre dos unidades
taxonómicas como especie o género (Prescott et al., 2000).
Desde su introducción a principios de los años 90 del siglo pasado (Ward et al., 1990), esta
estrategia ha sido utilizada masivamente y con éxito, ya que permite elaborar árboles
filogenéticos y estudiar exhaustivamente las muestras con un elevado nivel de detección,
facilitando el diseño de sondas para otro tipo de técnicas. Su principal desventaja es que supone
un trabajo y consumo de tiempo importante, por lo que resulta poco práctica para múltiples
muestras, por ejemplo para seguir la evolución de las poblaciones microbianas de un reactor
o comunidad natural a lo largo del tiempo, especialmente si se consideran distintos puntos de
muestreo (Mullis et al., 1994; Godon et al., 1997; Sanz y Köchling, 2007).
A pesar de su amplia utilización para el estudio de las comunidades microbianas de ambientes

naturales, su aplicación en el campo de la ingeniería ambiental es menor. Esta falta de
popularidad reside, probablemente, en la necesidad de conocimientos avanzados y equipos
específicos para biología y genética molecular, así como en el tiempo necesario de trabajo, lo
que hace difícil su aplicación en departamentos de ingeniería, química y otros similares. La
técnica, por esas mismas razones, puede resultar demasiado compleja para ser considerada
como una simple herramienta de apoyo en las tareas diarias de operación y control de
plantas potabilizadoras, de tratamiento de agua residual, y de uso común por organismos
gubernamentales controladores de descargas de aguas negras y tratadas en cuerpos de agua
y suelo. A pesar de ello, se pueden citar algunos casos que permiten formarse una idea de
su potencial en este campo, todos ellos ejemplos exitosos obtenidos en centros e institutos de
investigación científica y aplicada. En concreto, ha sido utilizada para definir la diversidad
microbiana en diferentes reactores anaerobios usados en tratamiento de vinazas (Godon et
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al., 1997), o en gránulos de diferentes tratamientos mesofílicos y termofílicos (Sekiguchi et

al., 1998), para determinar que la diversidad en biorreactores metanogénicos termofílicos es
menor a la observada en los mesofílicos tratando residuos sólidos (Leven et al., 2007), o también
para establecer con precisión la posición filogenética de bacterias filamentosas detectadas
en un lodo granular y previamente adscritas, mediante hibridación “in situ”, al grupo de las
bacterias verdes no del azufre (Sekiguchi et al., 2001). También se ha aplicado para determinar
la filogenia de Desulfitobacterium, género que incluye especies participantes en la degradación de
compuestos tóxicos clorados (Villemur et al., 2006).
El análisis del metagenoma, o biblioteca genómica completa de toda la comunidad participante

en la digestión anaerobia por ejemplo, podría permitir el estudio funcional del ADN total
extraído de una muestra de lodos anaerobios, sin necesidad de la etapa de cultivo (Figura 3). Esta
herramienta es una buena opción para una mejor comprensión de los ecosistemas, así como
también para el aislamiento de nuevos o mejores biocatalizadores con utilidad biotecnológica
(Cowan et al., 2005; Schmeisser et al., 2007). Por ejemplo, a partir de un metagenoma de
digestores anaerobios en tratamiento de aguas residuales, Wexler y colaboradores (2005) han
aislado el gen de una nueva enzima de tipo alcohol/aldehído deshidrogenasa.
En general, se puede afirmar que la clonación y la creación de bibliotecas de genes de ARNr

se ha utilizado en el campo de la ingeniería ambiental para confirmar con mayor precisión la
posición filogenética de microorganismos cuya presencia ha sido detectada previamente por
otras técnicas (hibridación in situ [FISH] o incluso electroforesis desnaturalizante [DGGE]), así
como para el diseño de sondas específicas que permitan detectar y cuantificar un determinado
organismo. Un ejemplo de esta última aproximación es el trabajo de Chouari y colaboradores
(2005b), quienes a partir de las secuencias completas de los ARNr 16S obtenidos de la biomasa
extraída de un digestor de lodos de una planta de tratamiento de aguas residuales, estudiaron
(por la técnica de FISH) la diversidad de la división Planctomicetales.
Dichos estudios les permitieron definir dicho grupo como una nueva división o subphylum
dentro del dominio Bacteria, así como determinar su función en los ciclos biogeoquímicos
dentro del digestor, en relación directa con su diversidad. Algo semejante había sido realizado
previamente por Liu y colaboradores (2002a) para evaluar la diversidad microbiana en lodos
granulares de tratamiento de aguas residuales de cervecería. Por último, la clonación del gen
para el ARNr 16S se ha complementado también con la técnica de reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) en tiempo real, con el fin de cuantificar, además de definir, la diversidad
microbiana (Yu et al., 2005; Shigematsu et al., 2006).
Técnicas de “huella genética”
Las interrelaciones entre cepas microbianas de varios tipos de hábitat pueden estudiarse
analizando el ADN para obtener su “huella genética” (“Genetic fingerprint”). Estas técnicas
permiten la obtención de un patrón de bandas y el patrón obtenido es característico de cada
grupo microbiano, pudiendo llegarse a discernir de este modo, y dependiendo del tipo de
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Biología molecular

Figura 3. Esquema de elaboración del metagenoma de una muestra ambiental para el estudio de una
comunidad microbiana. La secuencia de trabajo comprende: i) extracción directa de los ácidos nucleicos,
sin necesidad del aislamiento previo y cultivo microbiano; ii) ligación del ADN extraído en un vector
apropiado y clonación dentro de una bacteria huésped; iii) análisis funcional mediante la expresión del gen
y producción de una nueva enzima o compuesto dentro de diferentes bacterias huésped; iv) análisis de
la secuencia por bases de datos de ADN, para la comprensión del potencial metabólico de la comunidad
estudiada (Adaptada de Schmeisser y colaboradores (2007)
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cebadores usado, hasta el nivel taxonómico de especie. Cada banda diferencial en la huella
puede analizarse mediante análisis directo de la secuencia de ADN o por clonación previa.
Por ello, durante el seguimiento de la dinámica microbiana dentro de un digestor, mediante
una técnica de “huella genética” bastaría con buscar una banda ya conocida por su tamaño y
a continuación comparar los diferentes patrones en función del tiempo (Oude Elferink et al.,
1998; Dabert et al., 2002; Angenent et al., 2005).
Durante la electroforesis, el patrón de bandas genéticas se traduce en la separación de los

fragmentos de ADN amplificados previamente por PCR. Esta separación puede basarse en
varios aspectos, como por ejemplo en las diferencias conformacionales entre estas moléculas,
observables tras la migración a través de un gradiente de desnaturalización químico o térmico,
en el polimorfismo de la conformación de la hebra sencilla de ADN de estas moléculas, en
la amplificación al azar de ADN polimórfico, en el polimorfismo en longitud de fragmentos
de ADN (polimorfismo que se obtiene de manera artificial por digestión enzimática con
endonucleasas de restricción), o de manera natural mediante la amplificación de genes
o espacios intergénicos con tamaño variable entre las distintas especies bacterianas y en la
carga eléctrica de estas moléculas, modificada por medio de una cromatografía líquida
desnaturalizante de alto rendimiento, junto con reactivos químicos (DHPLC, Denaturing High-
performance Liquid Chromatography). Este método es relativamente nuevo por lo cual aún no se
han reportado aplicaciones en ingeniería ambiental (Atlas y Bartha, 2002; Dabert et al., 2002;
Nocker et al., 2007).
Separación por electroforesis en gradiente de gel desnaturalizante o térmico (DGGE, TGGE: Denaturing/
Thermal gradient gel electroforesis). La electroforesis en gradiente de gel desnaturalizante (DGGE)
y la electroforesis en gradiente de gel térmico (TGGE) fueron introducidas hace unos años en
microbiología ambiental y son ahora usadas de manera rutinaria como método molecular para
el estudio de comunidades microbianas y de dinámica de poblaciones en ecología microbiana
(Muyzer et al., 1993; Giraffa y Neviani, 2001). Las dos técnicas consisten en la separación de los
fragmentos de ADN amplificados utilizando los cambios conformacionales de estas moléculas
a lo largo de un gradiente de desnaturalización. Esta separación se basa en la disminución
de movilidad electroforética de los fragmentos de ADN parcialmente fusionados o de doble
cadena en un gel de electroforesis que contiene un gradiente linear de un desnaturalizante
químico para el ADN (DGGE) o un gradiente linear de temperatura (TGGE) (Giraffa y
Neviani, 2001). A lo largo del gradiente, las moléculas de ADN con diferentes secuencias y
de una misma longitud presentarán comportamientos de fusión de las cadenas bicatenarias
particulares (melting) y, por lo tanto, detendrán su migración en diferentes posiciones del gel
(Giraffa y Neviani, 2001; Madigan et al., 2004).
Utilizando estas técnicas, Cytryn et al. (2000) estudiaron la diversidad dentro del dominio Archaea
en muestras de un lago hipersalino a partir de una sonda de ADNr 16S; Duinevel et al. (2001)
evaluaron la presencia y la actividad del ecosistema de una rizósfera de Chrysanthemum por
comparación de los perfiles obtenidos a partir de ADNr 16S y de ARNr 16S. Como ejemplo
de estudios sobre dinámica poblacional, podrían destacarse los seguimientos de las bacterias
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Biología molecular
nitrificantes (Bruns et al., 1999; Laverman et al., 2001; Kowalchuk et al., 1998; Kowalchuk et
al., 2000; Nicolaisen y Ramsing, 2002). Roest y colaboradores (2005) demostraron mediante
DGGE acoplada a una serie de diluciones, que las bacterias sintróficas responsables de la
producción de H2 tienen el mismo papel en reactores anaerobios termofílicos que en los
mesofílicos. Liu y colaboradores (2002a), por su parte, determinaron por medio de la DGGE
la estructura de la comunidad microbiana en un lodo granular de un reactor tipo UASB
(Upflow Anaerobic Sludge Blanket) en tratamiento de efluentes de cervecería. Con base a 18
bandas, cada una equivalente a una unidad operacional taxonómica (OTU), se determinó
la composición cualitativa del inóculo a nivel dominio (Bacteria, Archaea), a nivel de grupo
(bacteria Gram + con bajo porcentaje en GC, Proteobacteria [subclase d y g], Cytophaga,
etc.), hasta llegar al nivel de especie (Methanobacterium formicicum y Methanosaeta concilii, por
ejemplo). Liu y colaboradores (2002b) compararon la comunidad microbiana en dos digestores
acidógenos, uno bajo condiciones de mesofilia y otro bajo condiciones de termofilia, durante su
arranque. En este caso, la técnica de DGGE fue eficaz para detectar el cambio del consorcio
microbiano, así como para identificar filogenéticamente las bacterias metanógenas dominantes
en el consorcio. Arkasubasi y colaboradores (2005) identificaron cinco unidades taxonómicas
diferentes del dominio Archaea, dos de ellas estrechamente relacionadas con Methanosaeta concilii
y Methanobacterium formicicum, con una distribución dependiente del tipo de sustratos a degradar
(de destilería a farmacéutico) en el digestor de lodos. En reactores anaerobios de doble fase
(acidogénico/metanogénico) la técnica de TGGE permitió definir una mayor diversidad del
dominio Bacteria en el reactor ácido, detectando la dominancia del género Coprothermobacter
(clostridia, dentro del phylum Firmicutes (bajo G+C Gram-positive bacteria)) participando en
la hidrólisis y/o acidogénesis, lo cual puede explicar la pérdida de diversidad bacteriana en los
reactores metanogénicos-mesofílicos (Noyola et al., 2007). Mediante el TGGE, se ha podido
detectar la presencia de Thiobacillus sp. UAM-I (99% similitud) en biofiltros que tratan H2S
(Cabirol, publicación en curso).
Método de polimorfismo de conformación de hebra simple (SSCP, Single strand conformation polymorphism).
El análisis del polimorfismo de conformación de hebra simple permite estudiar la diversidad
microbiana y la estructura de poblaciones complejas como los biorreactores (Leclerc et
al., 2001). El SSCP detecta variaciones de secuencia entre diferentes fragmentos de ADN,
normalmente amplificados con base en la región variable del gen ADNr 16S. Esta técnica
está esencialmente basada en la diferente movilidad de los fragmentos de ADN, debida a su
tamaño y su estructura secundaria. La conformación secundaria depende del fenómeno del
plegado de la hebra simple de la molécula de ADN, que es función de la secuencia de esta
cadena. Secuencias específicas se traducen en una velocidad de migración específica para
cada molécula. Se puede utilizar un primer fluorescente, lo cual permite obtener la secuencia
de ADN directamente. Sin embargo, el análisis requiere un electroforesis uniforme, a baja
temperatura y sin gradiente desnaturalizante, con el fin de no alterar la estructura secundaria
(Giraffa y Neviani, 2001; Leclerc et al., 2004).
Zumstein y colaboradores (2000) observaron, durante un seguimiento de 2 años, el dimorfismo

de la comunidad microbiana, ya que el consorcio de las arquebacterias presenta menos variación
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en su composición que las eubacterias. En otro trabajo, se pudo relacionar una acumulación
de ácidos grasos volátiles en el proceso anaerobio, con una dominancia de Methanobacterium
formicicum sobre Methanosaeta concilii, con lo que se concluye que un buen equilibrio entre esas
dos especies provee una mejor capacidad de amortiguamiento en el sistema que se traduce
en una mayor eficacia de la digestión anaerobia (Leclerc et al., 2001; Bouallagui et al., 2004).
Delbès y colaboradores (2001) estudiaron, durante una acumulación de acetato, el papel de las
bacterias de tipo Synergistes y Spirochetes, organismos difíciles de cultivar, mediante el análisis de
su actividad a través de la extracción de ARN.
Método del ADN polimórfico amplificado al azar (RAPD, Random amplified polymorphic DNA). Esta otra
técnica se usa en muestras ambientales; no obstante es una de las más exitosas en sistemática
para la clasificación de bacterias (Franklin et al., 1999; Wikström et al., 2000; Yang et al., 2000;
Giraffa y Neviani, 2001). La amplificación al azar consiste en amplificar por PCR una región
de ADN escogida de manera arbitraria mediante un primer pequeño, generalmente de 8-10
nucleótidos. En una misma molécula de ADN, el primer se puede fijar en diferentes sitios, ya que
la sonda es corta. Por lo tanto, los fragmentos de ADN amplificados presentan polimorfismo
de longitud. En el caso de un cultivo bacteriano puro, un perfil similar indica un genoma
similar; sin embargo, actualmente este método aún se aplica a la evaluación de comunidades
microbianas (Franklin et al., 1999; Giraffa y Neviani, 2001).
Métodos basados en el polimorfismo en la longitud de fragmentos de ADN. Todas estas técnicas permiten
estudiar la diversidad total de comunidades microbianas. Permiten también realizar estudios
o seguimientos de poblaciones específicas. (Giraffa y Neviani, 2001; Atlas y Bartha, 2002;
Angenent et al., 2005; Sanz y Köchling, 2007). El polimorfismo en la longitud de fragmentos
de restricción (RFLP, Restriction fragment length polymorphism) se obtiene, a partir de cualquier gen
amplificado por PCR, tras digestión con endonucleasas de restricción concretas, de lo cual
resulta un perfil específico para la muestra. La separación de los fragmentos de ADN obtenidos
en un gel de electroforesis se puede acoplar a un Southern blot (se presentará más tarde) con lo
que se podría identificar a los microorganismos. Åakra et al. (1999) estudiaron de esta manera la
población de bacterias nitrificantes. Rangarajan et al. (2002) observaron el efecto de la salinidad
sobre Pseudomonas spp. en la rizósfera de arroz, utilizando solamente la técnica de RFLP. Imachi
y colaboradores (2000) estudiaron por RFLP la asociación sintrófica entre Desulfotomaculum y
Methanobacterium para la degradación del propionato.
En el caso de la amplificación del gen del ARNr 16S, el RFLP se puede denominar
específicamente como análisis de restricción de ADN ribosómico amplificado (ARDRA,
Amplified ribosomal DNA restriction análisis) (Giraffa y Neviani, 2001; Atlas y Bartha, 2002). Como
ejemplos de su uso, Cheneby et al. (2000) compararon poblaciones de bacterias desnitrificantes
en tres suelos agrícolas. Heyndrieckx et al. (1996) describieron que la técnica de ARDRA
permite la detección de variabilidad entre especies o entre cepas. Klocke y colaboradores
(2007) estudiaron la diversidad de un consorcio anaerobio que participaba en la degradación
de ensilaje de betabel en un reactor totalmente mezclado: se aislaron 60 clones y se identificaron
hasta el nivel de clase; cuatro de ellos pertenecieron al dominio Archaea y 56 al dominio Bacteria.
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El alcance de este trabajo fue muy similar al estudio realizado por Godon y colaboradores
(1997), que emplearon la técnica de amplificación, clonación y secuenciación. Sin embargo, el
análisis del perfil ARDRA de cada clon permite descartar los clones repetidos, aunque es más
laborioso (Nocker et al., 2007).
Otro variante de RFLP es el polimorfismo de longitud del fragmento de restricción terminal

(T-RFLP, Terminal-restriction fragment lenght polymorphism). La particularidad de este método
la da el uso de un primer iniciador (forward primer) fluorescente en su extremo 5’ durante la
PCR (Giraffa y Neviani, 2001).Esta técnica es independiente de la clonación, es decir que la
determinación de las bandas de ADN se hace directamente en un secuenciador automático,
sin una etapa previa de clonación (Giraffa y Neviani, 2001). Este método es una herramienta
poderosa y rápida en ecología microbiana, sobre todo para estudios filogenéticos relacionados
con bacterias en ecosistemas cerrados; Bruce (1997) y Horz et al. (2000) reportaron el uso de
la T-RFLP para el análisis de los genes mer y amoA, respectivamente, en estudios de análisis de
la estructura de poblaciones específicas de varios sitios ambientales. La densidad y actividad
de bacterias sintróficas se determinó por T-RFLP, siendo capaz de diferenciar la población
bacteriana marcada por 13C después de la introducción de palmitato-13C (Hatamoto et al.,
2007). Briones y colaboradores (2007) demostraron por esa misma técnica la competencia entre
representantes de las familias Methanobacteriacaea y Methanospirillaceae después de un aumento de
sulfatos en la carga orgánica. Se han realizado estudios de los genes nirS y nirK en sedimentos
marinos (Tiquia et al., 2006) y suelos (Kandeler et al., 2006). También se han hecho estudios
por T-RFLP del gen mcrA para poblaciones de bacterias metanógenas en diferentes ambientes,
por ejemplo en reactores de laboratorio (Shigematsu et al., 2004), en suelo de campo de arroz
(Friedrich, 2005) y en turba (Juottonen et al., 2006).
Análisis del espacio intergénico de los genes 16S y 23S (RISA, rDNA internal spacer analysis) corresponde
a la amplificación por PCR de dicho espacio intergénico ITS/IGS (Figura 4).

Figura 4. Operón ribosomal bacteriano
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El espacio intergénico ITS/IGS tiene una velocidad de evolución diez veces más elevada
que el gen ADNr 16S, lo cual permite realizar una identificación más segura de una cepa.
Puede revelar eventos evolutivamente recientes (Åakra et al., 1999). Esta región ITS/IGS es
extremadamente variable en tamaño y secuencia, aún dentro de un grupo taxonómico (García-
Martínez et al., 1999). Esta variabilidad de tamaño permite separar directamente el producto
de PCR proveniente de Bacteria o Archaea. Esta técnica ha sido reportada en distintos estudios,
como por ejemplo para evaluar la diversidad microbiana total en microagregados de suelo, o la
biodiversidad de Archaea (Ranjard et al., 2000; Benlloch et al., 2001). También se ha usado para
estudios de poblaciones específicas, como es el caso del estudio de una población bacteriana
reductora del mercurio y de la población nitrificante (Åakra et al., 1999; Canstein et al., 2001).
La principal característica que se explota en esta técnica es la variabilidad en la longitud de

la secuencia. De esta forma, RISA se basa en el polimorfismo natural, sin usar enzimas de
restricción (García-Martínez et al., 1999). Dentro de los métodos basados en el polimorfismo
de tamaño, RISA es fácil de realizar, permitiendo un rápido examen de la composición y
complejidad de la comunidad bacteriana. También es importante que no requiera un equipo
específico y costoso (Ranjard et al., 2000), disminuyendo el costo y el tiempo de realización (el
producto de PCR se separa directamente en gel de electroforesis de agarosa sin tratamiento
previo).
Sin embargo, para la identificación de cada banda se requiere de la técnica de clonación y

secuenciación, como también ocurre en los casos de ARDRA, RFLP clásica, y RAPD. Con
el fin de evitar esta laboriosa etapa, existe una variante automatizada de RISA denominada
ARISA. Como en la T-RFLP, se usa un primer iniciador marcado, lo cual permite analizar
directamente la muestra en un secuenciador automático (Giraffa y Neviani, 2001). El limitante
actual de esta técnica es la baja disponibilidad de secuencias registradas en las bases de datos
en Internet, en comparación con las disponibles para el gen ADN16S.
RISA presenta una ventaja para estudios en ambientes extremos. Los microorganismos han
habitado prácticamente todas las superficies existentes en la tierra y con ello han dado lugar a
una gran diversidad de estrategias metabólicas, una enorme biodiversidad de microorganismos
y también de microbiotas (Madigan et. al., 2004). Esta gran biodiversidad es el resultado del
éxito de adaptación a factores ambientales muy heterogéneos. Y se debe, desde su inicio, a la
supervivencia de microorganismos a condiciones extremas que son desfavorables para la gran
mayoría de las especies existentes. Estos microorganismos se ubican principalmente dentro del
grupo Archaea, que a diferencia de Bacteria y Eukarya han evolucionado muy lentamente y son
considerados como los primeros habitantes verdaderos de la tierra. Puesto que la región del
ADNr 16S tiene una evolución menor al espacio intergénico 16S-23S, RISA permite detectar
una mayor biodiversidad en ambientes extremos (Åakra et al., 1999).
Cada una de las técnicas de “huella genética” tiene sus ventajas y desventajas, aunque
la información que se obtiene es similar en todos los casos (Nocker et al., 2007). Permiten
estudiar de manera rápida y sencilla la variabilidad espacio-temporal de las poblaciones (Sanz
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Biología molecular
y Köchling, 2007). Otra ventaja es su adecuación para analizar un gran número de muestras
(comparado con la clonación). Sin embargo, el número de copias del ADN, dependiente
de la abundancia del microorganismo y de la facilidad para la amplificación del gen para
el ARNr 16S, puede ser muy diferente, lo que da lugar a bandas en el gel de electroforesis
con intensidades muy distintas (Sanz y Köchling, 2007). Por otra parte, el número de bandas
detectadas es normalmente pequeño, por lo que el número de especies identificadas también
lo es, y corresponden, aunque no necesariamente, a las especies mayoritarias presentes en la
muestra original. La mayor limitación de estas técnicas reside en que no permiten cuantificar
cada OTU identificada (Sanz y Köchling, 2007).
Técnicas de hibridación
Estas técnicas consisten en hibridar (o aparear) moléculas de ADN-ADN, así como ADN-
ARN; ambas opciones son herramientas poderosas para el estudio de comunidades
microbianas. Son técnicas de elevada precisión y sensibilidad en la detección y cuantificación
de microorganismos y tienen como fundamento el uso de las secuencias específicas del gen
ADNr 16S. La hibridación se detecta por fluorescencia o por marcaje con fósforo radiactivo en
el extremo terminal 5´ de la sonda (Raskin et al., 1994; Sanz y Köchling, 2007).
Existen dos tipos principales de hibridación, que ofrecen un acercamiento diferente en el

estudio de la diversidad y de la dinámica de poblaciones microbianas específicas:
• hibridación ex situ: sobre una membrana, se procede a la hibridación de tipo ADN:ADN

(Southern Blot) o ADN:ARN (Slot Blot, Northern Blot). En el caso de las bacterias metanógenas,
la técnica más usada es la hibridación “Slot Blot”, la cual consiste en la extracción de ARN
total de la muestra y la elaboración de manchas (spot) del producto sobre una membrana,
seguida a continuación por la hibridación con los cebadores seleccionados. Esta técnica
permite tanto la identificación como la cuantificación (McMahon et al., 2004; Zheng et al.,
2006),
• hibridación in situ o FISH (Fluorescence in situ hybrization): se trata de secuencias de ADN

marcadas con un cromóforo fluorescente que reconocen secuencias del ARNr 16S,
hibridando (apareamiento ADN:ARN) in situ en las células completas, lo que permite su
identificación, localización y posterior cuantificación (Nakamura et al., 2006; Miura et al.,
2007).
Mediante la hibridación ex situ de tipo “Slot Blot” de las bacterias sintróficas y metanógenas,
McMahon y colaboradores (2001) determinaron el efecto inhibidor de la agitación dentro
del reactor sobre la oxidación sintrófica de los ácidos grasos volátiles. La digestión anaerobia
de desechos de cerdos es posible con niveles de amonio superiores a 3,500 mg.L-1, gracias a
la capacidad de las bacterias metanógenas hidrogenófilas del orden Methanomicrobiales de
adaptarse a esas concentraciones de amonio (Angenent et al., 2002). Zheng y colaboradores
(2006) relacionaron la abundancia de Methanosaeta concilii junto con el crecimiento de los
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gránulos. Del mismo modo ha podido detectarse que un aumento en la temperatura de 55 a

65ºC provocó una disminución en las poblaciones de las eubacterias y un incremento de las
arquebacterias en un lodo anaerobio (Ahring et al., 2002). Chouari y colaboradores (2005a)
pudieron observar con estas técnicas un nuevo grupo de Archaea predominante en un digestor
anaerobio de lodos.
La hibridación in situ ha permitido obtener fotografías de la estructura microbiológica de

los gránulos anaerobios para grupos específicos o especies, así como la morfología de los
microorganismos estudiados (Yamada et al., 2005; Díaz et al., 2006; Fernández et al., 2006;
Abreu et al., 2007; Del Nery et al., 2007). En particular, Zheng y colaboradores (2006)
detectaron el papel de núcleo de Methanosaeta concilii en el desarrollo de los gránulos. Syutsubo
y colaboradores (2001) correlacionaron la cuantificación de familias metanógenas específicas
por FISH con la técnica un digestor tipo UASB, para una mejor comprensión del mecanismo
de granulación. Se han realizado microautorradiografías (MAR-FISH, FISH combinado con
el uso de sustratos marcados [3H, 14C]) para el estudio de las bacterias oxidantes del propionato,
grupo perteneciente a las bacterias productoras obligadas de hidrógeno (OHPA por sus siglas en
inglés, Obligate Hydrogen-producing Acetogen). En estos estudios se observó una respuesta funcional
y dinámica de dicha población durante cambios de concentración del sustrato carbonado
(Ariesyady et al., 2007b). Ariesyady y colaboradores (2007a) identificaron, además, dominancias
de diferentes grupos (Chloroflexi, Smithella, Syntrophomonas y Methanosaeta) en el mismo reactor
anaeróbico, capaces de degradar, respectivamente, glucosa, propionato, butirato y acetato,
lo que contribuye a una mejor comprensión de la digestión anaerobia. Jung y colaboradores
(2007) determinaron los factores que afectan la actividad de las bacterias anaerobias oxidantes
del amonio (bacterias ANAMMOX) durante el arranque de un reactor de tipo UASB.
Las técnicas de hibridación son muy sencillas y rápidas, si se dispone de las sondas adecuadas
(en muchos casos ya están descritas), las cuales permiten cuantificar grupos microbianos
específicos, frente a las técnicas tradicionales que, generalmente, no lo permiten. En el caso de
las hibridaciones ADN:ARN, la técnica permite la detección de únicamente microorganismos
activos. Sin embargo, para hacer un estudio completo de un ecosistema es conveniente tener
una idea de la composición del mismo o de lo que cabe esperar (puede ser necesaria combinarlas
con otras técnicas). El límite mínimo de detección con la técnica FISH es de 104 células.mL-1, lo
cual impide detectar poblaciones menos numerosas. Para estudiar la estructura/arquitectura
de un agregado (lodo granular, biopelículas), se necesita un microscopio confocal y, de ser
posible, hacer análisis de imágenes, lo cual es costoso y requiere de personal calificado (Bottari
et al., 2006).
Conclusión
En conclusión, los tres grupos de técnicas moleculares descritas no son mutuamente excluyentes,
sino que son y deben ser consideradas como complementarias. Esta es la filosofía del presente
trabajo. Lo ideal sería la utilización conjunta de varias de ellas cuando el trabajo lo requiera, de
tal manera que las técnicas basadas en la PCR y secuenciación permitan construir una librería
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Biología molecular
de genes del ARNr (identificación pero no cuantificación de los microorganismos presentes en

el sistema) y el diseño de sondas específicas para utilizarlas en dicho sistema y en otros similares
(cuantificación y arquitectura de la muestra). Lo anterior, en conjunto, se denomina el ciclo
completo del ARNr (full cycle rRNA approach, Wilderer, 2002). Los resultados obtenidos de dichas
investigaciones pueden permitir el desarrollo de microarreglos, que se pueden definir como
placas moleculares que permitirían un método de análisis de rutina en serie (los equivalentes
moleculares a las placas API o BIOLOG utilizadas en microbiología clásica). Los microarreglos
pueden ser de varios tipos: filogenético, funcional o ecológico, según el diagnóstico deseado
(Bae y Park, 2006; Gentry et al., 2006). Recientemente, Scholten y colaboradores (2007) han
desarrollado un microarreglo para dos bacterias sintróficas y dos arquebacterias metanógenas,
aplicable al análisis de la expresión genética global de una comunidad microbiana anaerobia en
respuesta al estrés oxidativo. Su aplicabilidad inmediata e in situ, en condiciones de operación
y en reactores a escala real, es indiscutible para la toma de decisiones rápidas en ingeniería
ambiental.
Agradecimientos
Los autores agradecen a la Lic. Guillermina Sánchez Nahuacatl y su equipo para el apoyo
bibliográfico
Referencias
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Biorremediación de suelos contaminados por
compuestos organoclorados
Introducción
Existen gran cantidad de compuestos orgánicos tóxicos como fungicidas, herbicidas,

plaguicidas, algunos colorantes, plásticos, y aceites industriales, que se acumulan en el agua,
suelo y aire, y causan grandes daños a los ecosistemas biológicos y al hombre.
Muchos de estos compuestos no existen en la naturaleza, y son producidos por el hombre

para un uso específico, por ejemplo, para la eliminación de maleza indeseable y de hongos
fitopatógenos, para el control de insectos y para coloración de fibras textiles. Otros se obtienen
como producto de la actividad industrial como los compuestos tóxicos generados durante la
incineración de aceites empleados en los transformadores eléctricos. A estos compuestos no
naturales se les conoce como xenobióticos. Existen otros compuestos que aunque son de origen
natural, como los hidrocarburos del petróleo y sus derivados, pueden acumularse, causando
graves problemas a los ecosistemas al igual que los compuestos xenobióticos. A los compuestos
orgánicos tóxicos, sintéticos y naturales que se acumulan en el medio ambiente, porque no
pueden ser eliminados de una manera rápida, se les conoce como compuestos recalcitrantes.
Estos compuestos son generalmente tóxicos para la mayoría de los diversos sistemas biológicos,
entre ellos podemos mencionar a los organohalogenados, hidrocarburos policíclicos, bifenilos
clorados, aromáticos nitrogenados y sulfurados. Los organoclorados, que son el tema de estudio
propuesto, pertenecen al primer grupo mencionado. El objetivo del presente trabajo es dar una
visión actual de los avances que se han hecho para la eliminación, por procesos biológicos
empleando hongos, de estos compuestos tóxicos que se encuentran acumulados en el suelo.
Eliminación de compuestos organoclorados
El proceso para la eliminación de compuestos tóxicos se conoce también como remediación,

y se refiere a las acciones químicas, físicas o biológicas implicadas durante la eliminación o
movilidad de los tóxicos, o bien la reducción de la toxicidad por cambios en las moléculas de los
compuestos tóxicos o en la disminución de la concentración de éstos en un sitio contaminado
sea este suelo, agua o aire. La eliminación de los compuestos organoclorados por medios
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Biorremediación de suelos contaminados
físicos o químicos se conoce como procesos abióticos. Mientras los procesos que implican a
los organismos se conocen como procesos bióticos, con la intervención de organismos o una
combinación de ambos (figura 1). La eliminación abiótica de los compuestos orgánicos tóxicos
(COT) se realiza mediante mecanismos como la foto-descomposición, la volatilización a la
atmósfera o la percolación. Por ejemplo, la degradación troposférica la cual ocurre en la parte
baja de la atmósfera por la oxidación a través de radicales hidroxilo y otros agentes oxidantes
naturales los cuales transforman los compuestos tóxicos en dióxido de carbono, agua y cloro. La
eliminación biótica se refiere a la transformación de los COT por plantas y microorganismos,
éstos últimos tienen la capacidad de desarrollarse en medios con oxígeno y/o sin oxígeno.
ABIOTICA BIOTICA
Insecticidas
Transformación/
movilidad
Volatilización Herbicidas
Vegetal
Fungicidas
Fotodescomposición Hidrocarburos y derivados
Transformación
Compuestos Halogenados Microbiana
Degradación Preservativos de la madera

Percolación Industria eléctrica (BPCs) Acoplamiento
Solventes Industriales
oxidativo al humus
Figura 1. Eliminación natural de compuestos xenobióticos.
Los microorganismos transforman los COT en moléculas más simples como el dióxido de
carbono, o bien, en moléculas más complejas que ayudan a la formación del humus del suelo.
La transformación de compuestos tóxicos por microorganismos es importante debido a que es
mucho más rápida que la transformación abiótica, ya que ésta última es extremadamente lenta
a causa de las limitaciones inherentes de las reacciones químicas, sobre todo, en la degradación
de sustancias recalcitrantes, tales como los pesticidas organoclorados, esta eliminación natural
es todavía más lenta y puede llevar muchos años. La elevada concentración actual de estos
COT por el uso excesivo de pesticidas, fungicidas, plásticos, explosivos, etc. y por la creciente
actividad industrial, ha rebasado por mucho la capacidad de la flora y microflora natural para
degradarlos. Debido a ello, es muy importante proponer procesos para eliminar de forma más
rápida y eficiente dichos compuestos del medio ambiente.
Biodegradación
La biodegradación de compuestos tóxicos se lleva a cabo empleando plantas, y microorganismos.

EL proceso con el empleo de plantas se conoce como fitorremediación. Este proceso puede ser
por movilidad de los compuestos tóxicos del suelo hacia la raíz u hojas de las plantas, como el
caso de los metales pesados, o también puede llevarse a cabo una transformación de los tóxicos
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en compuestos de menor toxicidad o nula (Jackson et al., 2005; Ucisik et al., 2007; Smith et al.,
2007). Sin embargo, por no ser tema de este trabajo no se mencionará durante este resumen.
Se verá con más detalle la biodegradación de compuestos organoclorados por bacterias y
hongos, así como las enzimas que intervienen en estos procesos.
Compuestos Orgánicos Halogenados
Los compuestos orgánicos halogenados se refieren a los compuestos alifáticos, aromáticos y

poliaromáticos que contienen átomos de cloro o de flúor en su molécula, como los clorofenoles
y los fluorofenoles, que pertenecen a los aromáticos. El principal uso de estos compuestos es
como plaguicidas, herbicidas, fungicidas y bactericidas. Por otro lado, muchos de ellos son
producto de la actividad industrial del hombre, principalmente, de las industrias petroquímica,
textil y del papel. Como ejemplo de clorofenoles se puede mencionar al pentaclorofenol (PCP),
que es un compuesto que se usa ampliamente en la preservación de la madera. En países de la
Comunidad Europea y Estados Unidos su uso ya está restringido desde hace varios años, sin
embargo, en otros como en México, aún se usa indiscriminadamente. Además, es un producto
de desecho de la industria del papel, ya que se produce, al igual que otros clorofenoles y
cloroligninas, durante el blanqueo de la pulpa con cloro, y es liberado en las aguas de desecho.
Es interesante mencionar que en algunos países ya no se usa el cloro para blanquear la pulpa
y en su lugar se usa enzimas de tipo peroxidasas y fenoloxidasas. Así se evita la producción a
gran escala de compuestos altamente tóxicos como los mencionados. A estas tecnologías se les
conoce como tecnologías limpias.
Características físico-químicas de los clorofenoles
Los clorofenoles son ácidos débiles y existen en la naturaleza como fenoles neutros o como iones
fenóxido disociados. Las propiedades, así como el destino de estos compuestos en el ambiente
difiere marcadamente si se encuentra en forma neutra o ionizada, afectando principalmente la
solubilidad y sorsión, por lo tanto la movilidad de los clorofenoles en el suelo.
Los clorofenoles empleados como herbicidas y el pentaclorofenol (PCF) usado en la preservación

de la madera contienen impurezas como dioxinas, dibenzofuranos, fenoxifenol policlorados y
bifenilos policlorados. Todos ellos son también tóxicos para los diversos sistemas biológicos.
Los clorofenoles son moléculas recalcitrantes y se encuentran ampliamente distribuidos en el

ambiente, aun después de que el uso de estos compuestos se ha prohibido. Los clorofenoles se
incorporan al suelo por mecanismos de sorsión y de acoplamiento oxidativo, afectando, de esta
manera, su biodisponibilidad y por lo tanto si biodegradación.
Biodegradación de Clorofenoles
Los clorofenoles pueden ser hidroxilados, metoxilados o polimerizados por la acción de los
microorganismos, es decir pueden formar a partir de la o-metilación los correspondiente
cloroanisoles, o sufrir dimerización o polimerización entre otras alternativas metabólicas. Los
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productos de biotransformación causan riesgos e impactos ecotoxicológicos en el suelo. Por

ejemplo, la metilación de los clorofenoles produce los anisoles clorados que son más lipofílicos
y por lo tanto son más susceptibles a la bio-acumulación (Laine et al., 2003).
Degradación por bacterias
Varias bacterias son capaces de mineralizar los clorofenoles. La mineralización puede llevarse a
cabo aeróbicamente o por la vía de dehalogenación reductiva, ésta última no siempre conduce
a una mineralización completa, formando en éste caso productos más o menos tóxicos, que
pueden acumularse en el ambiente. Se han aislado, de suelo contaminado, tanto bacterias
Gram-positivas como Gram-negativas y se ha observado que las bacterias Gram-negativas
toleran mayor concentración de PCF que las positivas. Se ha demostrado que especies de
Shinogobium y Novoshingomonas, bacterias Gram-negativas, toleran y degradan PCF (Takeuchi et
al., 2001; Tiirola et al., 2002). También bacterias del género Pseudomonas y Sphingomonas pueden
degradarlo por vía aeróbica (Tiirola y cols., 2002). Muchas bacterias Gram-negativas tienen
un paso común para degradar PCP y otros fenoles altamente clorados. El paso involucra una
declorinación oxigenolítica para formar a parir del PCP el tetracloro-p-hidroxi benzoquinona
a través de una PCP-monooxigenasa. Las hidroquinonas cloradas formadas, pueden ser
degradas por bacterias Gram-positiva, incluyendo Mycobacterium chlorophenolicum, M. fortutim y
Streptomyces rochei siguiendo diferentes rutas de degradación que incluyen la oxidación de mono o
diclorofenoles a los correspondientes clorocatecoles seguida de dehalogenación y rompimiento
del anillo (Häggblo, et al., 1994, Golovela et al., 1992;Nohynek et al., 1993).
Los herbicidas del grupo n-clorofenoxi-propiónico, compuestos halogenados, son degradados

por las enzimas oxigenasas producidas por la bacteria Delftia acidovorans (Benndorf y Babel, 2202).
Otros compuestos organoclorados son los bifenilos policlorados (BPC) que tienen un amplio
uso industrial, principalmente, en la transferencia de calor en los fluidos dieléctricos e
hidráulicos. Se presentan con diversos nombres comerciales como Acrolor, Clofen y Delor,
y están constituidos de una mezcla de compuestos relacionados que difieren en el número y
posición de los átomos de cloro sobre los núcleos bifenilos.
Las bacterias como Pseudomonas, Vibrio, Aeromonas, Micrococcus, Acinetobacter, Bacillus y Streptomyces, son
bacilos Gram negativos y aerobias estrictas, degradan los bifenilos mono-, di-, tri- y tetraclorados
utilizando la enzima denominada 2,3-dioxigenasa, transformando al BPC, a través de diferentes
pasos de degradación a compuestos como los clorobenzoatos. A partir de los cuales, en presencia
de un consorcio bacteriano, se transforman finalmente en dióxido de carbono.
Degradación por hongos
Los hongos son capaces de colonizar un amplio rango de organismos vivos y muertos, incluyendo
plantas, animales, madera y papel, por lo que son agentes primarios muy importantes en la
descomposición de la materia orgánica teniendo así un papel en el ciclo del carbono, del
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nitrógeno y del azufre. Los hongos secretan gran diversidad de enzimas con extraordinaria
acción catalítica. Por esta razón, la degradación fúngica de compuestos organoclorados es de
importancia en la biorremediación y el papel de los hongos en la remoción de compuestos
tóxicos del ambiente ha sido ampliamente estudiado en las últimas décadas.
Los hongos de pudrición blanca son los agentes degradadores de lignina más activos. La
lignina es el polímero estructural clave en las plantas y uno de los polímeros más abundantes
y resistentes que existen en la naturaleza. Estos hongos, capaces de degradar la lignina han
sido usados para degradar un amplio espectro de contaminantes ambientales debido a su
sistema enzimático no específico, constituido principalmente por oxidasas. Estas enzimas
son conocidas también como enzimas ligninolíticas e incluyen a la lignina peroxidasa (LiP),
manganeso peroxidasa (MnP), versátil peroxidasa, glioxal oxidasa, aril-oxidasa y lacasa;
producidas por basidiomicetos, principalmente los de pudrición blanca y café. Phanerochaete
chrysosporium, un hongo de pudrición blanca, es uno de los más estudiados para la degradación
de compuestos xenobióticos incluyendo la degradación de clorofenoles. Se ha demostrado
que P. chrysosporium degrada y mineraliza el pentaclorofenol (PCP) cuando éste se encuentra
en concentraciones iniciales de 1 a 500 mg l-1 (Lamar et al. 1990; Lamar 1992; Lin et al.
1989; Mileski et al. 1988). A pesar de que P. chrysosporium fue de los primeros basidiomicetos
propuestos para fines de biorremediación, se han estudiado gran diversidad de basidiomicetos
capaces de degradar PCP como Inonotus dryophilus, Perenniporia medulla-panis, Trametes versicolor,
Phellinus badius, Ganoderma oregonens, Pleurotus ostreatus and Lentinula edodes (Alleman et al. 1992;
Okeke et al. 1996; Fahr et al., 1999). El tiempo de degradación depende de la concentración
inicial de PCP, del género y especie del hongo, de la biomasa inicial y de la edad del micelio
(Alleman et al. 1992; Lamar et al. 1990).
En 1996, Aitken y Logan, estudiaron la degradación del PCF por P. chrysosporium, observando
una degradación del 72 al 75% del compuesto. Los autores propusieron que la deshalogenación
del PCF era mediada por la actividad extracelular de la enzima lignina peroxidasa (LiP). Por
otro lado, Fahr et al. (1999), estudiaron la degradación del 2,4-diclorofenol y del PCF por
hongos de pudrición café (Gloeophyllum striatum y G. trabeum). En estos cultivos no detectaron
actividad lacasa ni otra peroxidasa normalmente involucrada (la manganeso peroxidasa); sin
embargo, la degradación de ambos clorofenoles se llevó a cabo.
Law et al. (2003) reportaron un 89% de degradación del PCF por una cepa de Pleurotus
pulmonarius, aunque esta cepa presenta el inconveniente de que tarda mucho tiempo en
propagarse para su uso (10 días). Walter et al. (2004) reportaron dos hongos, P. chrysosporium y
Trametes versicolor, aislados a partir de desechos ligninolíticos con capacidad de degradar el PCF,
en este trabajo también se reportó la actividad de peroxidasas extracelulares.
También se ha propuesto el uso de otros hongos, diferentes a los basidiomicetes, para la

degradación del PCF con la ventaja de que son hongos que crecen más rápido por lo tanto el
proceso de degradación puede ser más corto y por ende más económico. Seigle-Murandi et
al., (1993) reportaron un gran número de cepas pertenecientes a diversos grupos taxonómicos,
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como los zigomycetos, los ascomycetos, y los mucorales capaces de degradar PCF con diferentes
eficiencias cada cepa.
Nagarathnamma y Bajpai (1999) reportaron la decoloración de aguas residuales de la industria

de la pulpa y el papel por Rhizopus oryzae, en el mismo trabajo demostraron que esta cepa es
capaz de remover entre 50 a 100% de los diversos clorofenoles presentes en esta agua, pero no
reportan actividades enzimáticas.
Tomasini et al., (1996) aislaron una cepa de Amylomyces rouxii, a partir de aguas residuales
de la industria de la pulpa y del papel. Esta cepa tiene la característica de ser resistente al
pentaclorofenol (PCF). Los mismos autores demostraron que A. rouxii tolera dos veces más de
PCF que P. chrysosporium, y que es capaz de degradar este tóxico en cultivo sumergido aunque
con menor eficiencia que el basidiomiceto. Se observó que A. rouxii degrada 65% del PCF
inicial en 192 h, mientras que P. chrysosporium lo hace en 144 h, bajo las condiciones ensayadas
(Tomasini et al., 2001).
Más recientemente, Szewczyk et al. (2003) publicaron un estudio realizado con 15 cepas de
hongos, aisladas de áreas contaminadas con compuestos xenobióticos provenientes de desechos
de aceite, efluentes de curtidurías y petróleo crudo. Estas cepas se incubaron en medios que
contenían fenantreno, antraceno y PCF, para determinar su capacidad de degradación. En
este trabajo lograron identificar algunas cepas capaces de degradar PCF, determinando que se
trataba de Mucor ramosissimus, aunque no identificaron ninguna actividad enzimática.
Rhizopus oryzae ENHE, aislado a partir de suelo contaminado con PCF, también es capaz de
degradar PCF. Se demostró que R. oryzae ENHE degrada entre el 85-95 % del PCF en 24
h, con una concentración inicial de 12.5 mg PCP l-1, además se determinó producción de
tirosinasa y LiP. (León-Santiesteban et al., 2008).
Degradación por levaduras
Tsai y col. (2005) revelan que levaduras del suelo poseen gran capacidad para la degradación
de compuestos aromáticos de bajo peso molecular, pero este tipo de reportes son escasos.
Se han reportado levaduras aisladas de suelo con capacidad de degradación del fenol a
concentraciones altas para el uso posterior de estos microorganismos en el tratamiento de
aguas residuales y del suelo. Las levaduras que reportan pertenecen a géneros de Candida,
Trichosporon, Pichia, Hansenula, Yarrowia y Rhodotorula. (Kaszycki et al. 2006; Ahuatzi et al. 2004;
Polnisch et al. 1992)
Tsai et al. (2005) demuestran que la cepa de Candida albicans TL3 tiene una mejor eficiencia
para degradar fenol y formaldehído que cepas de Pseudomonas y Buckholderia cepacia y Candida
tropicallis mutante. Además mencionan que es de las pocas levaduras reportadas con capacidad
para degradar ambos compuestos.
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Juárez et al. (2001) evaluaron una cepa inmovilizada de C. tropicallis en un reactor de lecho
fluidizado para la degradación de fenol, en donde ellos obtienen eficiencias de degradación de
casi 100%, cuando las concentraciones de fenol son de hasta 1560 mg l-1.
Romero et al. (2001), mencionan que fueron seleccionadas cepas de levaduras nativas para
la degradación de bifenilo (BF), en donde se evaluó la capacidad de degradación de 24 cepas
de los géneros Candida spp., Cryptococcus spp., Pichia spp., Rhodotorula spp., Trichosporon spp., R.
glutinis y Yarrowia spp, provenientes de sedimentos contaminados; además, R. glutinis había sido
mencionado como capaz de degradar otros hidrocarburos aromáticas y tenía alta importancia
en experimentos de biorremediación.
Cabral et al. (2003) utilizan a Saccharomyces cerevisiae para evaluar la respuesta adaptativa al
herbicida ácido 2-metil-4-clorofenoxiacetico (MCPA). En este trabajo se proponen los efectos
tóxicos del herbicida MCPA y el mecanismo fisiológico de adaptación a dicho herbicida. Los
resultados pueden ser útiles para aclarar los mecanismos de adaptación a este compuesto
xenobiótico en eucariontes. También mencionan el uso de las levaduras como sistema
de bioensayo para determinar la toxicidad del herbicida de ácido fenolacético y de otros
xenobióticos lipofílicos.
Yan y col. (2006) mencionan la degradación de fenol y m-cresol usando cultivos puros de
Candida tropicalis, sus resultaron muestra que C. tropicalis puede degradar 2000 mg l-1 de fenol
y 280 mg l-1 de m-cresol en solo 66 y 52 h, respectivamente. Ellos encuentran que cuando se
aumenta la concentración de m-cresol se inhibe en gran medida la degradación de fenol, solo
se degradan 1000 mg l-1 de fenol, en presencia de una concentración mayor a 280 mg l-1 de
m-cresol.
Meléndez et al. (2005) reportaron que se seleccionaron 44 levaduras a partir de suelo de un

aserradero contaminado con PCF. Estas levaduras toleran PCF en diferentes concentraciones,
hasta 150 mg l-1 y demostraron que 4 de ellas tienen la capacidad de degradar PCF, en medio
con 15 g glucosa l-1 y 25 mg PCF l-1 inicial.
Enzimas que intervienen en la degradación de PCF
Como se mencionó anteriormente, entre las enzimas más comunes que intervienen en la
degradación del PCF están las peroxidasas, principalmente la manganeso (MnP) y la lignina
peroxidasa (LiP). Estas enzimas realizan, en presencia de H2O2, la oxidación de la lignina
(Kirk y Farrell, 1987; Gold et al., 1989; Higuchi, 1990).
Las manganeso peroxidasas son proteínas con grupo hemo que catalizan la oxidación
del Mn2+. La MnP (EC 1.11.1.13) es oxidada por 2 electrones del H2O2 para generar un
intermediario conocido como compuesto I. El compuesto I puede oxidar Mn2+ a Mn3+ o
puede oxidar substratos fenólicos a sus correspondientes radicales, siendo la enzima reducida
al intermediario oxidado con un electrón, conocido como compuesto II. El compuesto II
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requiere de Mn2+ como reductor, y por la oxidación de Mn2+ a Mn3+ la enzima pasa a su estado
reducido (Kuan et al., 1993). El Mn3+, quelado por un ácido orgánico, es un oxidante capaz de
oxidar gran variedad de substratos fenólicos (Kishi et al,. 1994).
Por otro lado, la lignina peroxidasa (LiP) (EC 1.11.1.14) es una glicoproteína, inespecífica y
extracelular, dependiente de H2O2. Contiene un mol de protohemo IX por mol de enzima y se
encuentra como una serie de isoenzimas (pI 3.2-4.0) (Wariishi y Gold, 1990). Esta enzima actúa
por extracción de electrones sencillos de anillos aromáticos de lignina, llegando a la generación
de un radical catiónico y al subsecuente rompimiento de los anillos (Bonnarme y Jeffries, 1990).
La enzima interviene también en reacciones de degradación de varios compuestos aromáticos.
Otro tipo de enzimas, específicamente las fenoloxidasas (lacasas y tirosinasas), tienen la

capacidad de oxidar también los compuestos fenólicos.
Las lacasas (EC 1.10.3.2) pertenecen al grupo de las oxidasas azules de cobre. Son enzimas de
tipo fenoloxidasa cúprica que contienen cuatro átomos de cobre, los cuales tienen un papel
importante en los mecanismos catalíticos de la enzima. Los átomos de cobre se distribuyen
en diferentes sitios de la molécula. Las lacasas se han clasificado en tres tipos: lacasa tipo 1 ó
azul, tipo 2 ó normal y tipo 3 ó cobre binuclear. En la reacción típica de una lacasa fúngica,
el substrato está sujeto a la oxidación de un electrón para dar un radical oxi-aril: por ejemplo,
el fenol se oxida para formar el radical fenoxilo, acompañado de la reducción del oxígeno
molecular a agua. Las lacasas catalizan la oxidación de tanto compuestos fenólicos como
no fenólicos (Bourbonnais y Paice, 1990) y son capaces de mineralizar un amplio rango de
colorantes sintéticos (1999; Abadulla et al., 2000).
La enzima tirosinasa o polifenoloxidasa (PPO, monofenol, o-difenol:oxígeno reductasa,

EC.1.14.18.1), también presenta cobre en su molécula. Los sitios activos de la tirosinasa
contienen dos átomos de cobre, aunque su estructura espacial completa es aún desconocida.
Esta enzima se ha estudiado principalmente en humanos, debido a su gran importancia en
la pigmentación por melanina. También el oscurecimiento enzimático de las frutas y los
vegetales es causado por la actividad de la tirosinasa en los tejidos de las plantas, por lo que
esta enzima juega un papel importante en el procesamiento de frutas y verduras y durante el
almacenamiento de alimentos procesados. La enzima cataliza la hidroxilación de monofenoles
(actividad monofenolasa) y la oxidación de o-difenoles a o-quinonas (actividad difenolasa). Los
zigomicetos de las especies Rhizopus y Mucor presentan actividad fenoloxidasa (Thompson and
Cannon., 1984).
Mejoramiento genético de cepas por expresión heteróloga de peroxidasas
Gracias al conocimiento de la participación de las peroxidasas en el proceso de degradación

de compuestos fenólicos, como el PCF, se han realizado trabajos en los que se han expresado
genes que codifican para dichas enzimas en otros microorganismos que presentan ventajas
en cuanto a su crecimiento y manipulación. Un ejemplo de estos trabajos es el reportado
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por Ruíz-Dueñas et al. en 1999, donde se realiza la expresión heteróloga de peroxidasas de

Pleurotus eryngii en Aspergillus nidulans, encontrándose que éste último hongo es capaz, después de
la transformación, de oxidar Mn2+ y otros substratos aromáticos, casi con la misma eficiencia
que las enzimas nativas.
También se han realizado trabajos acerca de la sobreexpresión de genes para la Mn-peroxidasa,

como el reportado por Mayfield et al. en 1994, en el que se estudió la expresión homóloga
de la Mn-peroxidasa recombinante en P. chrysosporium. Los autores encontraron que la Mn-P
recombinante no se veía influenciada por el nivel de Mn en el medio, como ocurría en el tipo
silvestre, y que la cantidad de Mn-P expresada y secretada en este sistema es comparable a la
cantidad de enzima expresada por la cepa de tipo silvestre en condiciones ligninolíticas.
Yasushi et al. (2000) obtuvieron la expresión heteróloga eficiente de una peroxidasa con
capacidad de decoloración de colorantes de Geotrichum candidum Dec1 en Aspergillus oryzae,
usando el promotor del gen para la a amilasa de A. oryzae. En este caso, la actividad de la
peroxidasa recombinante fue 42 veces mayor a la actividad presentada por la enzima nativa.
Asimismo, Stewart et al. en 1996 reportaron la expresión heteróloga de un gen para la
manganeso peroxidasa (mnp1) de P. chrysosporium en Aspergillus oryzae. En este caso, la expresión
se consiguió fusionando el ADNc del gen mnp1 con un promotor de la taka-amilasa y una señal
de secreción, obteniendo la secreción de la enzima en forma activa con propiedades físicas y
cinéticas similares a las de la proteína nativa.
En 2001, Larrondo et al. reportaron la multiplicidad de isoenzimas y la caracterización de

una manganeso peroxidasa recombinante de Ceriporiopsis subvermispora y de P. chrysosporium. En
este trabajo expresaron en Aspergillus nidulans los ADNc que codifican para las MnPs de los
basidiomicetos C. subvermispora (MnP1) y P. chrysosporium (H4) bajo el control de un promotor
para la a amilasa de Aspergillus oryzae. Encontraron que las MnPs recombinantes obtenidas
tienen masas moleculares y se expresan de manera similar a las enzimas obtenidas de las cepas
parentales.
Recientemente se reportó la expresión heteróloga de la Li-P de P. chrysosporium en la levadura

Pichia methanolica, obteniéndose niveles de expresión de 100 mg Li-P H8/L (Wang et al., 2004).
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Fertilizantes de liberación lenta y su aplicación
en campo
Aspectos generales
En la última década han tomado importancia las llamadas tecnologías de liberación controlada
o “controlled release”. Esta tecnología puede definirse como la transferencia lenta, moderada
o gradual, de un material activo desde un sustrato de reserva a otro medio, con el fin de
conseguir sobre el mismo una acción determinada.
Con la aplicación de esta tecnología se busca aumentar la eficiencia de la sustancia aplicada

alargando su acción en el tiempo, evitando pérdidas de todo tipo tales como lixiviación,
volatilización, etc.
Por otra parte según la Asociación Americana del Control Oficial de Planta y Alimentos
(AAPFCO, 1995), los fertilizantes de acción lenta o controlada, son aquellos fertilizantes que
disponen de los nutrientes para las plantas de las siguientes formas:
A- Retardando y modulando la disponibilidad de éstos, al ser captados por las plantas.

B- Permitiendo una disponibilidad adecuada de estos nutrientes para las plantas y se mantenga
por un período largo de tiempo, con respecto a los nutrientes del fertilizante tradicional.
No hay una diferencia oficial entre el término liberación lenta y liberación controlada. La
AAPFCO usa ambos términos y definiciones. Sin embargo, la descomposición microbiológica
de productos nitrogenados como UFs (urea-formaldehídos), normalmente se comercializan
como fertilizantes de liberación lenta y los productos recubiertos o encapsulados como
fertilizantes de liberación controlada
Este retardo o prolongación del tiempo de disponibilidad de los nutrientes puede ocurrir por
varios mecanismos: por recubrimiento semipermeable, oclusión, por polímeros insolubles en
agua, organismos nitrógenos naturales, u otras formas químicas así como, por la hidrólisis lenta
de compuestos solubles o de poco peso molecular (100-200 unidades estructurales) que actúan
por otros mecanismos no conocidos en los cuales influyen la solubilidad del material en agua.
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Fertilizantes de liberación lenta
Existen diferentes factores que influyen en el aporte de nutrientes por los fertilizantes de
liberación lenta siendo éstos los siguientes (Fujita, 1992):
- Calidad del recubrimiento: El recubrimiento es más eficaz cuanto más duro,

homogéneo y resistente sea. Todos los métodos de fabricación apuntan a estas características;
sin embargo, las tecnologías más modernas señalan recubrimientos más delgados y más
eficaces, haciendo de esta manera, más eficiente la aplicación.
Dentro de los medios de incubación los más importantes son el pH y la temperatura.
- Temperatura: Es bien conocida la acción de la temperatura sobre la disolución de

sustancias. Resumidas estas acciones podemos indicar.
a) El incremento de solubilidad de la sustancia fertilizante en agua
b) Aumento en la velocidad de difusión del fertilizante en la solución del suelo.
c) Aumento en la velocidad de degradación del recubrimiento.
- pH: Este factor ejerce su influencia sobre el recubrimiento o sobre el lavado y absorción
de los iones.
- Método de aplicación: Este aspecto es aún discutido. Existen razones a favor

y en contra respecto a la conveniencia de colocar el producto cerca de la superficie o más
profundamente. Las pérdidas de nitrógeno por volatilización de amoníaco (NH3) son más
importantes si la aplicación es superficial, por otro lado la puesta a disposición del nitrógeno
a la planta por degradación de la cubierta es más rápida cuando los gránulos están mezclados
con el suelo. Estos fenómenos están influenciados además por el grado de humedad.
- Actividad microbiana: El accionar de los microorganismos influye fundamentalmente

en la disolución del fertilizante, por la acción que tienen éstos sobre la cubierta. Existen algunos
recubrimientos, como los plásticos, que no sufren el ataque de los microorganismos, pero otros
sí lo sufren y es el caso de los recubrimientos a base de azufre. En los casos donde la acción de
los microorganismos es muy intensa se incorporan a los recubrimientos sustancias microbicidas
que atenúan este ataque retardando de esta manera la degradación de la cubierta.
Los fertilizantes de liberación lenta y controlada reúnen estos requisitos de fertilizante

ideal, siendo sus principales ventajas (Hauck, 1993):
• Reducción de la toxicidad (particularmente en los semilleros) que es causada por

las altas concentraciones iónicas producidas por la disolución rápida de los fertilizantes
convencionales solubles por lo que de esta forma se contribuye a una mejor seguridad
agronómica.
Debido a la reducción de la toxicidad y al volumen de sal de los sustratos se puede realizar

una mayor aplicación del fertilizante (reduciéndose la frecuencia de aplicación) en comparación
como los fertilizantes convencionales solubles.
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• Significación económica elevada, pues disminuye las labores en el campo y permite

la utilización de fertilizantes más conveniente. Representando esto la mayor ventaja para el
consumo de los fertilizantes de liberación lenta y controlada, contribuyendo a un avanzado
programa de sistema de cultivo con una sola aplicación del fertilizante. Permite además ser
utilizado en cultivos protegidos al suministrar la cantidad de nutrientes necesarios con una sola
aplicación del fertilizante.
• Reducción de las posibles pérdidas de nutrientes, particularmente las pérdidas

de nitrógeno que se producen entre aplicaciones y permite captar los nutrientes por la planta
de manera gradual.
Disminución substancial del riesgo a la contaminación medioambiental, permite

reducir las pérdidas por evaporación del amonio, contribuyendo así a reducir las emisiones de
gases (N20) a la atmósfera, ya que como es conocido el nitrógeno fijado en forma de amoníaco
y nitratos es absorbido directamente por las plantas e incorporado a sus tejidos en forma de
proteínas vegetales. Cuando las plantas y los animales mueren, los compuestos nitrogenados se
descomponen produciendo amoníaco y dando lugar a un proceso llamado amonificación. Parte
de este amoníaco es recuperado por las plantas; el resto se disuelve en el agua o permanece en
el suelo, donde los microorganismos lo convierten en nitratos o nitritos en un proceso llamado
nitrificación. Los nitratos pueden almacenarse en el humus en descomposición o desaparecer
del suelo por lixiviación, siendo arrastrado a los arroyos y los lagos.
La lixiviación del nitrógeno de las tierras de cultivo demasiado fertilizadas, la tala indiscriminada
de bosques, los residuos animales y las aguas residuales han añadido demasiado nitrógeno a
los ecosistemas acuáticos, produciendo un descenso en la calidad del agua y estimulando un
crecimiento excesivo de las algas.
La lixiviación además es responsable de un problema medioambiental muy grave, ya que

produce la contaminación de los suelos y de las aguas subterráneas o superficiales cuando el
agua de lluvia arrastra sustancias contaminantes presentes. Se suelen acumular carbonatos,
nitratos y sulfatos de hierro, calcio o aluminio.
Los fertilizantes químicos arrastrados por el agua desde los campos de cultivo pueden ser los
responsables de estos graves problemas. El proceso de eutrofización puede ocasionar problemas
estéticos, como mal sabor y olor, y un cúmulo de algas o verdín desagradable a la vista, así
como un crecimiento denso de las plantas con raíces, el agotamiento del oxígeno en las aguas
más profundas y la acumulación de sedimentos en el fondo de los lagos, así como otros cambios
químicos, tales como la precipitación del carbonato de calcio en las aguas duras (Hauck, 1993).
La agricultura, es la fuente de muchos contaminantes orgánicos e inorgánicos de las aguas

superficiales y subterráneas. Estos contaminantes incluyen tanto sedimentos procedentes
de la erosión de las tierras de cultivo como compuestos de fósforo y nitrógeno que, en parte
proceden de los residuos animales y los fertilizantes comerciales, por lo que el principal peligro
que representan es el de la filtración y las escorrentías.
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Teniendo en cuenta lo anteriormente expresado se puede plantear que hoy en día el mundo
experimenta un progresivo descenso en la calidad y disponibilidad del agua. Casi el 75% de la
población rural del mundo y el 20% de su población urbana carece de acceso directo a agua
no contaminada, ya que en muchas regiones, las reservas de agua están contaminadas con
productos químicos tóxicos y nitratos, por lo que las enfermedades transmitidas por el agua
afectan a un tercio de la humanidad y matan a 10 millones de personas al año, por lo que este
aspecto se considera de suma importancia para la salud mundial (Ferry, 1990).
Sin embargo, hoy en día se está trabajando en países tales como Japón E.U.A, Francia y
Alemania en búsqueda de producir fertilizante más ecológicos y que a su vez sean de bajo
costos, pues su principal desventaja son sus altos precios a que se cotizan, debido a la mayor
complicación para obtener capas perfectas de encapsulado o recubrimiento, al ser comparados
con la producción de los fertilizantes minerales convencionales (Trenkel, 1993).
El principal proceso de obtención de los fertilizantes de liberación lenta y controlada está dado
en proteger por recubrimiento o encapsulación un fertilizante convencional soluble haciéndolo
un material insoluble, semipermeable o impermeable, controlando la penetración del agua y el
por ciento de dilución y de liberación de nutrientes de acuerdo a las necesidades de las plantas
(Amberger, 1996).
Las más importantes vías de producción son (Trenkel, 1993):
• Materiales que liberan a los nutrientes a través de su poca solubilidad dada la estructura
química del complejo de alto peso molecular.
• Materiales que liberan los nutrientes a través de la superficie recubierta por una película.
• Materiales que liberan los nutrientes a través de la membrana, la cual puede ser o no
soluble (encapsulado).
• Materiales que liberan los nutrientes incorporados dentro de una matriz la cual puede
ser recubierta.
• Materiales que liberan los nutrientes en forma retardada, debido a la pequeña relación
superficie volumen (pellet, tabletas, clavos, aglomerados)
Otros materiales clasificados como fertilizantes de liberación lenta y que no están

ampliamente difundidos son:
• Sustancias orgánicas, ejemplo: residuos de cosechas, estiércol, mezcla pastosa, composta,
lodo albañal, etc.
• Fosfatos metal-amonio, ejemplo: fosfato amónico de magnesio.
Los grupos más importantes de fertilizantes de liberación lenta y controlada según su

proceso de producción son:
• Productos de la condensación de urea y urea-aldehído (fertilizantes de liberación lenta).
• Fertilizantes recubierto o encapsulados (fertilizantes de liberación controlada).
Entre los fertilizantes de liberación lenta, la urea-formaldehído ocupa un papel mundialmente

importante. Éste es el primer producto en que se investigó la liberación lenta del nitrógeno.
En 1924, Badische Anilin & Soda-Fabrik AG (hoy día BASF) en Alemania recibió la patente
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del mismo (DRP 431 585) en la producción de fertilizantes por condensación de la urea-
formaldehído (Abraham, et Col, 1996). En 1947 fue usada por los Estados Unidos esta patente
por primera vez. La producción comercial empezó en 1955 y presentaba distintas formas de
fabricación (Folleto Aglukon Nutralene, 1993).
La urea-formaldehído se obtiene por la reacción de formaldehído con urea en exceso bajo

condiciones controladas (pH, temperatura, relación molar, tiempo de la reacción, etc),
produciendo una mezcla de polímeros de cadenas largas diferentes. El costo de producción de
esta síntesis es considerado elevado debido a la rigurosidad en las condiciones de la reacción
que hay que mantener durante todo el proceso de obtención (Trenkel, 1997).
El problema principal de su obtención es producir por medio de una condensación, oligómeros

en una proporción deseada.
El modelo de liberación lenta del nitrógeno en el fertilizante Ureaform es un proceso que

incluye dos pasos (disolución y descomposición).
En general los fertilizantes de urea-formaldehído muestran una liberación lenta de nitrógeno

combinado con una buena compatibilidad con la mayoría de las cosechas. Debido a su baja
solubilidad la planta no se quema ni interfiere en la germinación.
Su eficiencia se hace mayor a temperatura más alta, por lo que se usa ampliamente en climas
más calurosos (en la región mediterránea en Europa y en la región del sur y del suroeste de los
Estados Unidos).
Diferentes trabajos fueron desarrollados por los científicos con el objetivo de obtener la
Ureaform de manera menos laboriosa, así fue el trabajo desarrollado por (Waters y Col, 1966)
sobre las suspensiones de NPK con Ureaform como portador de nitrógeno. En éste se plantea
que una cantidad calculada de monómeros solubles (urea formaldehído) se hacen reaccionar
“in situ”, para producir suspensiones estables, siendo necesario trabajar con una agitación
adecuada para obtener una suspensión con la estabilidad deseada.
Fertilizantes de liberación controlada encapsulados con polímero-cubiertos
Una serie de fertilizantes de liberación controlada han surgido y otros se han modificado
mediante diferentes métodos desarrollados. Los problemas principales en la producción del
polímero recubierto están dados por el material de la capa que se usa para recubrir y la técnica
aplicada para ésta (Moore, 1986).
El proceso de liberación de los nutrientes a través de la membrana/cápsula que forma el

polímero no se ve afectada por el pH, salinidad de la tierra, actividad microbiana y la fuerza
potencial redox sino que depende de la temperatura y de la permeabilidad a la humedad del
polímero que cubre al fertilizante, siendo posible predecir la liberación de los nutriente durante
un tiempo dado (Shoji, 1992).
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La permeabilidad a la humedad puede ser controlada cambiando la composición del polímero

que cubre el material usado.
El tiempo de duración del producto recubierto con el polímero depende del espesor de la capa
usado en el recubrimiento. Los productos obtenidos deben indicar el tiempo de liberación y
la temperatura a la que ésta se realiza preferentemente. En caso que en la formulación NPK
a recubrir existan compuestos secundarios no se declara el tiempo de liberación del producto,
ya que es muy difícil determinar exactamente el mecanismo del descargo para estos elementos
(González, 2004).
Al recubrir con materiales poliméricos biodegradable los fertilizantes, se producen unos

procesos de descomposición fotoquímica muy rápidos en la tierra. Sin embargo, cuando se
usan polímeros de poca solubilidad y difícil degradación estos problemas no se observan con
gran facilidad siendo una característica del material sintético utilizado en la encapsulación.
Una amplia recopilación de los procesos técnicos para la obtención de estos productos es la
ofrecida por (Goertz, 1993). Por otro lado los detalles de los procesos industriales empleados
en Japón son mostrados por (Gandeza y Shoji 1992). Las tecnologías más amplias se muestran
a través de (Pursell Inc, 1995). así como los modelos de liberación de estos fertilizantes
desarrollados en Israel son descritos por (Shavit, 1994) y colaboradores, (Lupu, 1996).
A pesar del alto costo de fabricación de estos polímeros comparados con los fertilizantes
convencionales, su consumo ha aumentado durante los últimos 15 años, siendo éste mayor (10
% por año) comparado con la Ureaform recubierta con azufre (2 % por año).
El consumo de estos fertilizantes en Japón ha aumentado por encima de 47% durante el período
1985 a 1994. Sin embargo, Europa está retrasada con un crecimiento anual de sólo 6.5%.
Una de las técnicas más usadas en Alemania y Japón está relacionada con la mezcla de
fertilizantes encapsulados con otros no encapsulados, es decir, con fertilizantes convencionales
los cuales ofrecen mayor flexibilidad y mejoras económicas (Kluge, 1996).
Fertilizantes de liberación controlada en una matriz
Las partículas de fertilizantes están incorporadas dentro de una matriz portadora, para lograr
un efecto de liberación lenta deseada, se necesita gran cantidad del material portador (40%).
Por consiguiente las formulaciones de fertilizante de baja cantidad de nutrientes posibles a
utilizar son: (NPK 10-10-10 o NPK 5-15-10).
En general el material portador es una mezcla de cera fundida, surfactantes, y polietilen glicol.
Otras matrices poliméricas, son formuladas con caucho, estireno-butadieno y otros.
Teniendo en cuenta lo anteriormente planteado, nos dimos a la tarea de trabajar con una
suspensión polimérica de peso molecular a base de urea-formaldehído en condiciones y
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relaciones tales que nos permitiera, recubrir un fertilizante convencional, convirtiendo a éste
en un material poco soluble o semipermeable permitiendo la liberación de los nutrientes de
acuerdo a las necesidades de las plantas.
Los primeros estudios que se realizan en este tipo de materiales son los estudios “in vitro”,
los cuales constituyen la clave del conocimiento para poder predecir el posible mecanismo
y comportamiento de estos materiales en el suelo, una vez analizados los mismos en estas
condiciones “ideales”. A continuación se comprueba en campo “en vivo” la efectividad de estos
fertilizantes para lo cual se trabajó con el cultivo de tomate y el gladiolo. Estas evaluaciones
se llevaron a cabo en áreas del Instituto de Investigaciones Hortícola “Liliana Dimítrova”,
ubicado en la Habana, Cuba.
El estudios en vivo efectuado en parcelas en el cultivo de tomate (Lycopersicon esculentura)

fue realizado en un suelo ferralítico rojo con textura arcillosa con un contenido de materia
orgánica de 3.1 % y un pH en agua de 7.4, los fertilizantes se aplicaron a los 15 días después
del transplante en el cultivo de tomate donde se fertilizaron 200 plantas por tratamiento, con 2
réplicas de 100 plantas cada una ocupando un área total de 30 m2.
Tratamientos:
Tratamiento I FERLENT (12-5-16) (una sola aplicación)
Tratamiento II Fertilizante convencional (12-5-16) (dos aplicaciones)
Las evaluaciones realizadas durante el desarrollo de la plantación fueron:
• Altura de planta.
• Número de racimos.
• Rendimiento.
Al evaluar los resultados agronómicos en parcelas en el cultivo de tomate a través de los

parámetros de altura de la planta y rendimiento (Fig.1), se pudo comprobar la superioridad
del FERLENT el testigo, ya que en el mismo existe una barrera física que impide la liberación
61.4 a 60.89 a
57.4
b
32.36 b
bbbbbb
22 a
bbbb
9b
Figura 1. Comparación Agronómica del FERLENT y el fertilizante testigo.
117
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instantánea de los nutrientes, la cual los pone a disposición de las plantas durante un período
más largo, facilitando su asimilación más lenta y evitando las posibles pérdidas lo cual se
traduce en mayores beneficios para el desarrollo y productividad de cada cosecha.
Otro estudio realizado con este fertilizante fue, en el cultivo de gladiolo (gladiolus spp. Var.
Rosado), para lo cual se trabajó en un suelo Ferralítico Rojo compactado con fertilidad de
media a alta (Tabla.1). Las variantes quedaron distribuidas en un diseño de bloque al azar con
3 réplicas en parcelas de 8.10 m2. Se utilizó un marco de plantación de 0.90 x 0.05 m y las
labores agrotécnicas se realizaron según lo establecido para el cultivo (Álvarez, 1976).
Tabla 1. Características agroquímicas del suelo
Materia Orgánica PH (H2O) K+ Ca2+ Mg2+ P

(%) (%) (cmol/kg) (%) (ppm )
1.36 7.6 0.37 11 1.0 250
Tratamientos:
Tratamiento I FERLENT (14-5-12) (una sola aplicación) a razón de 40 g/m2 y aporta 70-
25-60 kg NPK/ha.
Tratamiento II Fertilizante convencional, 70-70-70 kg de NPK/ha según lo
recomendado (Álvarez, 1976) con fertilización nitrogenada fraccionada ½ en la plantación
y ½ a los 45 días posteriores. Todo el fósforo y el potasio se aplicaron en el momento de la
plantación
Durante el desarrollo de la plantación, se realizaron las siguientes evaluaciones:

• Altura de la planta a los 60 días después de la plantación (cm).
• Calidad del cormo (cm).
• Porcentaje foliar de macroelementos (%).
La evaluación agronómica realizada al cultivo de Gladiolo son reflejados en la Fig. 2 donde

se grafican la altura de la planta y el número de hojas a los 60 días después de la plantación,
momento que coincide con el máximo desarrollo vegetativo del cultivo del gladiolo. Para estas
variables de crecimiento se observó que la aplicación de FERLENT produjo valores de altura
estadísticamente superiores a la variante testigo con incrementos de 15.69 % con relación a la
fertilización recomendada para el cultivo en estos tipos de suelos.
Por otro lado se observó que para el número de hojas, a pesar de no encontrarse diferencias
significativas estadística entre los dos tratamientos en estudio la aplicación del FERLENT
provocó ligeros incrementos en esta variable de crecimiento (8.75%) con relación a la
fertilización tradicional.
De lo anterior se deduce que desde el punto de vista agronómico la utilización del FERLENT
estimula el crecimiento del gladiolo. A los 60 días de la plantación, momento que coincide con
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el máximo de desarrollo del cultivo, la planta se encuentra con un mayor desarrollo vegetativo
por tanto mejor preparada para enfrentar el proceso de floración que se inicia justo a los 60
días, y con menor posibilidad de sufrir los estrés que se pueden presentar en las condiciones de
desarrollo y con mayor acumulación de masa vegetal y sustancias de reservas, ésta última se
movilizan hacia el cormo durante el proceso de engrosamiento y favorecerá la formación de
materias de alta calidad, aspecto que será corroborado más adelante. El proceso de crecimiento
del cormo se inicia aproximadamente a los 93 días de la plantación coincidiendo con el final
del periodo de floración

Figura 2. Altura de la planta y número de hojas a los 60 (días después de la plantación) DDP.
El cormo del gladiolo es un tubérculo de estructura sólida, forma redondeada y algo achatada,
en él se localizan las yemas que dan lugar a las futuras plantas, se reversa en cada plantación y
sus restos permanecen en la base del nuevo formado.
El engrosamiento del nuevo cormo se produce por migración de los productos de la fotosíntesis
contenidos en las hojas y conjuntamente dan lugar a multitud de bulbillos denominados perlitas
o cormelos.
Al analizar los indicadores de calidad del cormo, material que se utilizará en las futuras
plantaciones, se encontró que FERLENT favoreció la producción de cormos con diámetros
superiores a 5 cm (categoría Jumbo), e inversamente, disminuyeron los porcentajes de cormos
ubicados en la categoría grande cuyos diámetros se ubican entre 3 y 5 cm lo cual se corresponden
con materiales de plantación de alta calidad.
En este sentido hay que destacar que la obtención de cormo con calibres superiores (Fig. 3)
influye en la calidad del cultivo del gladiolo, a nivel internacional se comercializan bulbos
con diámetros mínimos de 8 cm si se pretende obtener flores grandes, por otro lado se ha
comprobado que el ciclo del cultivo suele ser más corto si los calibres son mayores, por tanto el
grosor del cormo es un factor de precocidad. El órgano comercial del gladiolo está constituido
por una inflorescencia en la espiga si el interés es obtener flores cortadas, pero si por el
contrario el fin de la plantación es formar semillas las labores están dirigidas a cosechar cornos
de calidad. De aquí la importancia que esto representa en el estudio realizado.
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Figura 3. Porcentajes de cormos por categorías.
Al evaluar el estado nutricional del cultivo a los 60 días después de la plantación (Fig.4), se
obtuvo un mayor porcentaje de acumulación de potasio, seguido por el nitrógeno y del fósforo,
que según estudios realizados para las condiciones de Cuba los contenidos de N, P, y K foliares
oscilan entre 0.97–2.22%, 0.19–0.85% y 1.45–3.25% respectivamente coincidiendo con las
determinaciones en esta experiencia. Al comparar ambos tratamientos se obtuvo que con
el FERLENT se favoreció la acumulación de nitrógeno y potasio en plantas de Gladiolo, al
encontrarse un porcentaje significativamente superior de estos macroelementos en las plantas
(11.61 y 26.34 %) respectivamente en comparación con la fertilización tradicional. Además
con estos resultados se pudo comprobar el aprovechamiento de los nutrientes por la planta,
lo que impide que éstos sean lixiviados o volatilizados contribuyendo a la disminución de la
contaminación ambiental.
Figura 4. Porcentaje foliares de macroelementos a los 60 DDP.
Con todos estos análisis se pudo demostrar que con la utilización de FERLENT como
alternativa de nutrición en el gladiolo permite obtener indicadores de calidad de la espiga y de
crecimiento superiores que la fertilización tradicional recomendada para este cultivo en suelos
ferralíticos rojos, esto favorece además la producción de cormos de mayor calibre y plantas con
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un mayor contenido de nitrógeno y potasio foliar lo que influye en la calidad comercial de la

planta obtenida.
Es de destacar, que con la utilización de FERLENT se pueden aplicar los nutrientes que la
planta requiere durante todo su ciclo de una sola vez, ya que es un fertilizante que se suministra
de fondo sin necesidad de fraccionamiento y su acción de liberación progresiva le permite a
la planta tomar los nutrientes contenidos en su formulación a medida que ésta lo necesita, por
lo que este efecto redunda en una disminución del número de aplicaciones y por tanto en
un resultado positivo por el concepto de costo, al reducir los gastos en mano de obra que se
requieren para realizar el segundo fraccionamiento de fertilizantes.
Conclusiones
1- Se encontró una metodología de síntesis para la obtención de un material polimérico que

permitió la microencapsulación de un fertilizante convencional y obtener así un fertilizante
de liberación lenta y controlada registrado en la Oficina Cubana de la Propiedad Intelectual
como FERLENT.
2- Con la producción de un fertilizante de liberación lenta y controlada se logra hacer más

insoluble el compuesto más soluble (KCl) presente en el fertilizante convencional y de esta
manera la planta logra asimilar este nutriente con un nivel de aprovechamiento elevado, por
un espacio de tiempo más prolongado. Todo lo anterior es válido para el caso de los restantes
nutrientes.
3- Los resultados agronómicos demostraron la superioridad del FERLENT con respecto a

la fertilización tradicional para todos los cultivos aquí analizados con lo que se garantiza la
seguridad agronómica en cada producción, al disminuir el número de aplicaciones y por
consiguiente los gastos en mano de obra que se requieren con el fertilizante convencional,
produciendo un ahorro económico por este concepto.
4-Con estos estudios se comprobó que con el fertilizante microencapsulado se logra un marcado
efecto ecológico al reducir las emisiones de gases de N2O y NxO a la atmósfera, sin lo cual
podría traer consigo que los nitratos puedan almacenarse en el humus en descomposición o
desaparecer del suelo por lixiviación, siendo arrastrado a los arroyos y los lagos, contaminándose
los mismos.
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122
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Generación, uso e implementación de
organismos genéticamente modificados para
fines agrícolas: el caso del maíz en México

Introducción
Los Organismos Genéticamente Modificados (OGMs) son producto de la llamada “biotecnología

moderna”, concepto que engloba procesos donde se utiliza la ingeniería genética para aislar,
manipular y reinsertar en nuevos organismos genes que confieren propiedades (expresión de
proteínas recombinantes o regulación diferencial de la transcripción) de interés para fines de
investigación o comerciales. Desde 1996 existen diferentes líneas de cultivos genéticamente
modificados que han sido liberados al ambiente y sembrados de manera masiva en diferentes
partes del mundo, dentro de los cultivos con mayor extensión, está el maíz transgénico, cuya
introducción en México ha generado un gran debate entre diferentes sectores de la sociedad,
la industria, y los tomadores de decisiones.
En esta aportación se abordará este tema tomando en cuenta las condiciones agrícolas
y sociales que están presentes en México, no sin antes hacer un breve punteo sobre los
métodos de transformación genética de plantas, las herramientas moleculares que se
utilizan para caracterizar los transgenes una vez insertados en un nuevo genoma, las
limitaciones del biomonitoreo. Finalmente, los puntos anteriores serán discutidos en el
contexto de nuestro país.
La ingeniería genética y los Métodos de transformación de plantas
La ingeniería genética entendida como la manipulación directa del material de la

herencia y sus productos (proteínas), fue posible a partir del descubrimiento de la molécula
fundamental de la herencia, el Ácido Desoxirribonucleico (ADN), en 1953 y después de ello,
la caracterización y aislamiento de la molécula mensajera de Ácido Ribonucleico (ARN) así
como las enzimas (proteínas) de restricción capaces de cortar el ADN en sitios con motivos
específicos, así como las ADN Polimerasas (enzimas con capacidad de copiado de ADN)
hicieron posible la obtención, edición y transformación del ADN de diversos organismos.
Los primeros estudios que utilizaron esta tecnología se llevaron a cabo en bacterias y para
123
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Generación, uso e implementación de organismos genéticamente modificados para fines agrícolas
1986 se creó la primera planta genéticamente modificada o transgénica (aquí se usará

indistintamente el término): una planta de tabaco que expresaba una luciferasa y por lo
tanto, fluorecía en la oscuridad (Ow et al, 1986).
En la actualidad, existen diferentes técnicas de transformación vegetal que utilizan métodos

físicos, químicos o biológicos (vectores) para introducir una secuencia de ADN exógeno o
transgen al genoma de una planta que al incorporarlo se vuelve transgénica. Las secuencias
producto de la tecnología de ADN recombinante son quiméricas ya que contienen secuencias
de distintos organismos que fueron cortadas mediante enzimas de restricción a partir de
extractos de ADN o cADN1. Estas secuencias quiméricas o casettes de transformación están
constituidos, como mínimo, por un promotor que dirige la expresión espacio-temporal del
gen de interés, el gen de interés y una secuencia de término o terminador de la transcripción.
Además, las líneas que han sido transformadas mediante cultivos bacterianos contienen
secuencias flanqueadoras (ADN-T) que permiten la inserción de un fragmento exógeno en un
genoma blando de transformación.
En la mayoría de las plantas transgénicas y en particular en maíz, todas las líneas transgénicas
comerciales tienen además de los elementos mencionados arriba, genes que confieren resistencia a
algún sustrato, comúnmente, a antibióticos (llamados marcadores de selección). Esta característica
se usa para seleccionar las líneas que hayan incorporado de manera exitosa un transgen.
Hay dos estrategias generales para transformar plantas, en la primera se utilizan cultivos
celulares de tejidos poco diferenciados que pueden ser de origen esporofítico o gametofítico
que después de habérseles introducido la construcción de interés, son regenerados en plantas
completas mediante diferentes tratamientos hormonales; la segunda se basa en la introducción
de ADN en el gametofito u otros tejidos que lo conforman (transformación in planta). Para una
síntesis de los métodos de transformación más utilizados en cereales, así como sus ventajas y
desventajas metodológicas, ver tabla 1.
En el primer caso, la secuencia quimérica se inserta en el núcleo de una célula totipotencial

ya sea de callos indiferenciados, tejidos en cultivo o meristemos aéreos por métodos físicos o
químicos, mientras que en el segundo caso el método de transformación se basa en infección
por parte de cultivos de la bacteria Agrobacterium tumefaciens, la que contiene plásmidos propios
que son previamente modificados con construcciones quiméricas. Aquí, la construcción es
incorporada al genoma de la planta receptora mediante procesos de recombinación ilegítima
o no homóloga que son mediados por la maquinaria subcelular de reparación del ADN.
Técnicas moleculares de detección de transgenes y sus productos
Después de transformar un cultivo celular o planta es necesario averiguar si la transformación

fue exitosa. Una de las formas de determinarlo es analizar la expresión del marcador de
1
El ADNc (complementario) es producto de la extracción de ARN y retrotranscripción para obtener cade-
nas de ADN sin intrones, es decir, la parte codificante de un gen
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Tabla 1. Métodos más utilizados para la transformación de gramíneas.
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Uso de Uso
Método tejido utilizado Ventajas Desventajas
MS FT
Alto porcentaje de plantas - Necesario uso de Suspensiones de
transformadas con células embrionarias que:
Células expresión estable; útil - Pierden su capacidad embriogénica
Transformación
indiferenciadas en Necesario Sí para probar vectores de con el tiempo
de protoplastos
suspensión transformación y - Acumulan anormalidades
seleccionar en etapa de - Tendencia a que se inserten muchas
cultivo de tejidos copias del transgen
Vórtex con
Células Método simple
fibras de Restringido a tejidos particulares
embriogénicas en Necesario Sí Uso de poco equipo
carbamida de Las fibras son dañinas para la salud
suspensión especializado
silicón
Células
indiferenciadas en Diversidad de tejidos
suspensión, útiles Técnicamente más complicado
Electroporación callos, explantes: Necesario Sí Tendencia a presentar Manejo de tejidos post transformación
embriones bajo número de copias es complicado
inmaduros, del transgen
inflorescencias
Es independiente del tipo
tejido y especie/genotipo
Meristemos Requiere poca El tejido u órgano debe ser separado
Biobalística apicales, Necesario Sí preparación del tejido a
de la planta
embriones, callos transformar
Método más exitoso para
transformar cereales
Alta eficiencia de Transferencia de fragmentos
transformación estable indeseados del plásmido Ti
Infección con Botones florales,
Tendencia a presentar Necesario pasar de vector primario a
Agrobacterium callos, tejido Necesario No
bajo número de copias secundario
tumefaciens vegetativo
del transgen Cereales solían ser recalcitrantes a
Posibilidad de transferir infección
Se resumen los métodos de transformación más exitosos en gramíneas, haciendo especial énfasis en la transformación con A. tumefaciens y
125
biobalística, que son las técnicas más utilizadas a la fecha. Claves: MS, marcadores de selección; FT, fitohormonas. Información sacada de:
Lazzeri, PA y Barceló, P. (2003). Tabla modificada de Piñeyro-Nelson (2007).
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Tabla 2. Técnicas de detección de transgenes en plantas.
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Molécula Sensibilidad
Método Costo Capacitación
que Especificidad M. M. Restricciones analíticas
técnica
detecta Individual Agregada
Buena calidad del ADN necesaria para
** media Alta alta media resultados reproducibles. Muy sensible
PCR cualitativo
a pequeñas cantidades contaminantes
de templado
PCR Buena calidad del ADN necesaria para

** media Alta alta media resultados reproducibles. Muy sensible
cuantitativo de
a pequeñas cantidades contaminantes
punto final
de templado
Buena calidad del ADN necesaria para
resultados reproducibles. Sensible a
PCR
ADN *** alta Alta alta alta pequeñas cantidades contaminantes de
cuantitativo de
templado; gen reportero puede ser
tiempo real
problemático (más de 1 copia en
diferentes razas de la misma especie).
Buena calidad y cantidad de ADN
necesaria para resultados
Southern blot *** Alta Alta baja baja reproducibles, digestión y transferencia
a membrana delicados. Sonda debe
tener actividad específica precisa.
Secuencia-específico. Sensible a
Genosensores * Baja Alta alta baja pequeñas cantidades contaminantes de
templado
No útil para alimentos procesados
ELISA ** Media Media media media donde la proteína se haya degradado.
Proteína Puede presentar resultados
artefactuales
Buena calidad de ARN necesaria para
resultados reproducibles; cantidad de
Western blot *** Alta Alta baja baja ARNm necesario es alta, transferencia
a membrana delicados. Sonda debe
tener actividad específica precisa
Un mayor número de asteriscos implica mayor costo de la técnica, tanto por los reactivos involucrados, como por la infraestructura im-
plicada. La información para esta tabla está basada en los artículos de Anklam et al, 2002; Shehata, M., 2005 y Tripathi, L., 2005. Tabla
modificada de Piñeyro-Nelson (2007).
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selección. Hay que señalar que este permite saber si el transgen que codifica para el marcador
de selección ha sido incorporado adecuadamente y no garantiza la correcta expresión de
otro transgen con el que se haya cotransformado a una planta. En algunos casos, el gen de
resistencia puede haberse insertado pero no se expresa por silenciamiento transcripcional (no
hay ARN) o postranscripcional (el ARN es degradado antes de ser traducido). Para detectar
la presencia del ADN insertado la técnica más utilizada es la Reacción en Cadena de la
Polimerasa o PCR (por sus siglas en inglés), con la que se detecta el gen de interés, ya que si
éste se encuentra presente, habrá una amplificación exitosa al llevar a cabo una reacción de
PCR utilizando oligonucleótidos específicos para la secuencia que se busca. Con variantes de
esta misma técnica se pueden determinar, además, las secuencias flanqueantes al transgen, ya
sea por PCR inverso o TAIL-PCR2
Otra técnica ampliamente utilizada en el análisis pos-transformación es la hibridación DNA-

DNA tipo Southern blot, con la cual se puede determinar el número de copias del transgen o
secuencias reguladoras no codificantes (promotores y terminadores) que han sido incorporadas
al genoma de una planta transformada, mientras que por otra técnica similar llamada Northern
blot que implica una hibridación ADN-ARN, se puede determinar la cantidad de RNAm
producido por un gen particular y por ende estimar cualitativamente el grado de expresión de
un transgen. Esta última técnica sirve únicamente para observar los productos de secuencias
codificantes; no es útil para determinar la presencia de secuencias reguladoras. La técnica
de PCR sí permite amplificar ADN genómico para buscar si están insertadas secuencias
reguladoras exógenas.
Para determinar el nivel de expresión de las proteínas recombinantes se usan métodos de

inmunoensayo mediante hibridación proteína-proteína (anticuerpos específicos), llamada
Western blot, que sirve para determinar si se expresa una proteína recombinante particular
y en qué nivel. Otra técnica usada se basa en una reacción inmunológica donde la proteína
de origen recombinante es detectada por una reacción antígeno-anticuerpo específica. Esta
técnica, conocida como ELISA (Enzyme Linked Inmunobsorbent Assay) por sus siglas en
inglés, se puede montar para cualquier proteína y actualmente existen varios kits comerciales de
detección de las proteínas recombinantes más comunes presentes en los cultivares transgénicos
comerciales, como son las diferentes versiones de proteínas Cry, EPSPS y PAT (por ejemplo, la
empresa Agdia ofrece kits que son capaces de detectar diferentes combinaciones de proteínas
recombinantes: http://www.agdia.com/gmo.html).
En el caso del maíz genéticamente modificado, varias secuencias han sido ampliamente
utilizadas para transformar las diferentes líneas de maíz transgénico presentes en el mercado:
1
El PCR inverso y el TAIL-PCR se basan en diseñar oligonucleótidos o cebadores que se anclan dentro
de una secuencia conocida (por ejemplo, el promotor, el transgen o el terminador) pero en lugar de que
uno de los oligonucleótidos se dirija en dirección 3` a 5` y el otro en dirección 5à 3`, ambos se dirigen en
dirección 5à 3`, es decir, hacia fuera de la secuencia conocida, con lo cual empezarán a amplificar una
parte de la secuencia desconocida que se quiere determinar. Cada técnica tiene sus variaciones, sin em-
bargo, en ambos casos, se pueden aislar y clonar los fragmentos de PCR amplificados y secuenciar con
el fin de determinar las secuencias adyacentes.
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la de mayor uso ha sido el promotor 35S del Virus del Mosaico de la Coliflor (CaMV, por sus
siglas en inglés), presente en 86% de los eventos transgénicos reportados y en menor medida
(60%)3, el terminador de la transcripción de la enzima Nopalina Sintetasa (tNOS), aislada
de Escherichia coli, así como ciertos genes que codifican para la resistencia a antibióticos o
herbicidas aislados de diversos organismos. Por ejemplo, el gen PAT, aislado de Streptomyces
viridochromogenes. Si se realiza pruebas de PCR para amplificar tanto el promotor 35S así como
el tNOS, se abarca el 96% de los eventos comerciales de maíz transgénico liberados al medio
ambiente en Estados Unidos4, que es el principal productor de OGMs del mundo.
Estas mismas técnicas, más otras que se mencionan en la tabla 2, han sido utilizadas para llevar
a cabo labores de biomonitoreo de OGMs, es decir, detectar la presencia de transgenes en
plantas y semillas de eventos transgénicos liberados al medio ambiente, así como sus derivados
(alimentos procesados, aceites, etc.) tomados de distintas partes de la cadena productiva y
alimenticia (campo, contenedores industriales, harinas, alimentos procesados). El biomonitoreo
de plantas transgénicas también se puede hacer mediante métodos de observación indirecta
en campo, al caracterizar la respuesta fisiológica de plantas vivas después de la aplicación de
herbicidas u otros marcadores de selección. Sin embargo, es más confiable determinar si están
presentes las proteínas o genes recombinantes mediante las técnicas moleculares enlistadas
arriba, pues la gran mayoría de los organismos transgénicos no se distinguen visualmente de los
no transgénicos y las respuesta fisiológica a determinada sustancia puede variar dependiendo
de condiciones ambientales. Ahora bien, las técnicas de detección moleculares pueden verse
afectadas y presentar falsos negativos si la secuencia de interés –en el caso de análisis basados
en ARN- se encuentra silenciada, vía metilación de residuos de citosina, o si ha sido blanco de
recombinación, en el caso del ADN, así como si fue integrada de manera truncada. En el caso
de técnicas de detección basadas en la presencia de proteínas recombinantes, éstas también
pueden presentar modificaciones en el epítope de reconocimiento, degradación proteica, o
demasiada o muy poca proteína, que pueden generar falsos negativos y en ocasiones, falsos
positivos, disminuyendo así la certidumbre de las pruebas de ELISA.
Por último, no se sabe si el cambiar de contexto genómico –es decir, pasar de estar en un
híbrido comercial a una raza criolla- afecta la sensibilidad de los ensayos de laboratorio, dada
la presencia de metabolitos secundarios no considerados o por los procesos de silenciamiento
transcripcional o postranscripcional. Los fenómenos bioquímicos mencionados provocan que
el llevar a cabo labores de biomonitoreo sea potencialmente mucho más complejo e impreciso
de lo previsto, por lo que es aconsejable corroborar la robustez de las diferentes técnicas a
emplear y en su caso, estandarizarlas para el caso específico del cultivar bajo monitoreo, así
como sus variantes (en el caso del maíz, las razas criollas e híbridos no convencionales). En la
siguiente sección se presentan los caracteres más utilizados en plantas agrícolas transgénicas así
como los patrones de adopción de estos cultivares a nivel mundial.
3
Según información consultada en www.agbios.com en Mayo, 28, 2008.
4
Ibid.
128
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Transgénicos sembrados a nivel mundial
Los principales cultivares transgénicos sembrados desde 1996 han sido, en orden de extensión:
soya, maíz, algodón y colza. Las características de origen transgénico en estos cultivares han
sido primordialmente la tolerancia a herbicidas (glifosato y glufosinato, principalmente) y la
resistencia a insectos (Lepidópteros y Coleópteros), seguidas por cultivos con genes apilados
para ambas. Así, en 2005, la tolerancia a herbicidas, introducida en maíz, colza y algodón,
ocupó 71% de la superficie total plantada con OGMs, (63.7 millones de hectáreas de las 90.0
millones de hectáreas de transgénicos a nivel mundial) mientras que 16.2 millones de hectáreas
(18%) se sembraron con cultivos resistentes a insectos, comúnmente llamados Bt (con alguna
variante de proteínas Cry) y 10.1 millones de hectáreas (11%) con cultivos que contienen ambos
genes apilados. Estas últimas líneas fueron las que tuvieron una representación proporcional
mayor en 2004 y 2005, con 49% de aumento con respecto a años anteriores en comparación
con un 9% de aumento para las líneas tolerantes a herbicidas y 4% para aquellas resistentes a
insectos” (p. 4-5 James, 2005).
A decir de los proponentes del uso a gran escala de organismos genéticamente modificados
en la agricultura, la intención es que en los siguientes diez años los cultivos transgénicos pasen
de estar concentrados en países desarrollados (Estados Unidos concentra casi el 55% del área
mundial sembrada con OGMs) a estar preponderantemente en países en vías de desarrollo, en
particular, países de África, América Latina (además de Argentina y Brasil, cuyo uso de soya
resistente a glifosato es muy alto) y del continente Asiático, en particular China e India (para
más información ver James, 2005). Para ello, las corporaciones productoras y comercializadoras
de OGMs están llevando a cabo una intensa campaña de propaganda y cabildeo con los
gobiernos de los diferentes países blanco. Esto también implicaría el desarrollar transgénicos
de otras especies según las necesidades de estos países. El maíz es uno de los cultivares blanco,
ya que este cultivo es fundamental en muchos países del tercer mundo y actualmente las
variedades transgénicas comercializadas sólo representan menos del 14% del área mundial
plantada. Bajo este panorama, México es sin duda, uno de los países más importantes para
promover la siembra de maíz transgénico, ya que nuestro país se encuentra en los primeros
lugares de producción de este grano a nivel mundial y el maíz representa las dos terceras partes
de los cereales cultivados en México.
Dado lo anterior, a continuación se hará una breve síntesis de las características biológicas,
sociales, económicas y culturales que hacen que el uso de maíz transgénico en México sea
potencialmente nocivo.
Importancia del maíz para México
El maíz es un cultivo nodal para México, pues es la base de la dieta mexicana. A la vez, nuestro
país es centro de origen y diversificación del maíz (Vavilov, 1992; Doebley e Iltis, 1984; Wang
et al, 1999; Matsuoka et al. 2002;) y actualmente cuenta con al menos 41 razas catalogadas
(Ortega, 2003) que representan un importante reservorio de diversidad genética que es
fundamental conservar.
129
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En cuanto a su biología, el maíz (Zea mays ssp. mays) es una planta monocotiledónea anual,
monoica, con un tallo que termina en una inflorescencia masculina llamada panícula o espiga
mientras que la inflorescencia femenina, conocida por su fruto como “mazorca” se forma a
partir de meristemos laterales presentes en las axilas de las hojas, generalmente a mitad de la
longitud del tallo. La polinización se lleva a cabo por viento y es generalmente cruzada. El
polen es viable hasta por 8 horas después de haber sido dispersado de la panícula y puede
viajar entre 2 a 20Km, dependiendo de las condiciones climatológicas.
El maíz, es una planta que a diferencia de otros cultivos, como el trigo y la cebada, no tiene
variedades silvestres y depende del ser humano para completar su ciclo biológico (en particular,
en el proceso de eliminación de brácteas que cubren la mazorca y la dispersión de semillas).
Estudios recientes, tanto en genética del desarrollo como evolución molecular y arqueología,
están aportando evidencia empírica y experimental que apoya la hipótesis postulada por
George Beadle para explicar el origen biológico del maíz: Beadle propuso que esta planta es
el producto de la selección artificial del hombre sobre poblaciones de una especie de teocintle
(Zea mays ssp. parviglumis) presente en el valle del río Balsas hace 10, 000 años (Buckler y Stevens,
2006). Algo importante que se desprendía de esta hipótesis es que el cambio drástico en la
ontogenia y morfología del teocintle al maíz, en particular del fruto (la mazorca), se debe
a cambios pequeños en genes “maestros” (homeóticos) que son responsables de establecer
los patrones de desarrollo presentes en diferentes especies. Investigaciones recientes han
comprobado que éste es el caso para el maíz (Wang et al, 1999; Matsuoka et al. 2002)
Un grupo de herbáceas silvestres que se asemejan en estructura al maíz, los teocintles, son
considerados los parientes más cercanos del maíz pues aunque la mazorca de maíz y la
infrutescencia de las diferentes especies y subespecies de teocintles presentes en el territorio
nacional son muy distintos entre sí, su cercanía genética se ha comprobado (Doebley, 2004).
Actualmente se siguen encontrando híbridos maíz-teocintle, prueba de que el flujo génico
entre ambos, continúa y muchos teocintles crecen como herbáceas invasoras en sembradíos
del país. (Ellstrand et al, 1999) Lo anterior, abre la puerta a la posibilidad de introgresión de
transgenes en los teocintles presentes en México.
Los registros fósiles más antiguos de mazorcas de maíz “modernas” (con las características que
conocemos actualmente) son de hace aproximadamente 10,000 años (Benz, 2001). A partir de
estas primeras mazorcas “ancestrales”, el mejoramiento continuo por parte de los agricultores
mesoamericanos prehispánicos (para los cuales el cultivo de esta planta y otras llevó al
sedentarismo necesario para la construcción de las diferentes civilizaciones documentadas en
Mesoamérica) así como los actuales, asentados en áreas con condiciones edáficas, climáticas,
altitudinales y agroecológicas contrastantes, ha generado una enorme variedad de razas y
poblaciones nativas adaptadas a diversas condiciones y requerimientos agronómicos (Ortega,
2003). El mejoramiento de estas poblaciones no es un proceso acabado y se sigue llevando
a cabo en un proceso de “mejoramiento autóctono continuo”, término acuñado por el Dr.
Antonio Turrent para sintetizar el proceso realizado por los agricultores de comunidades
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rurales tradicionales (Turrent y Serratos, 2004). Éstos conservan semilla de un ciclo agrícola
a otro, seleccionando en cada generación aquellas mazorcas con características deseadas
como tamaño de la mazorca, tamaño del grano y olote, color, consistencia, precocidad, etc.
También, intercambian semilla con vecinos y parientes y en ocasiones, adquieren semilla de
lugares lejanos si ésta les parece atractiva. Este proceso ha dado como resultado al menos 41
razas distintas de maíz (Sánchez 2000, citado por Ortega, 2003) aunque nuevas razas se siguen
descubriendo y caracterizando (Astier y Barrera, 2006). En nuestro país, 75% de las tierras
sembradas con maíz lo son con variedades criollas. (Turrent y Serratos 2004) Además, este
cultivo ocupa las dos terceras partes de tierras cultivadas en México (www.sagarpa.gob.mx),
mientras que a nivel mundial, es el segundo cultivo (después del arroz) más sembrado.
Discusión: manejo de maíz en México y relación con el potencial flujo de

transgenes a razas criollas.
La dinámica de mejoramiento continuo por parte de agricultores, genera problemas claros

para el aislamiento de un cultivar de maíz transgénico de uno no transgénico mientras que las
limitaciones de las técnicas moleculares utilizadas para realizar biomonitoreo consecuencia
de diferentes fenómenos bioquímicos y fisiológicos que han sido documentados en plantas
transgénicas (Anklam et al 2002), aunado al hecho de que para implementar este tipo de ensayos
de laboratorio, es necesario tener personal altamente calificado, así como una infraestructura,
equipo, material e insumos relativamente costosos, ocasiona que el biomonitoreo de la
introducción de líneas de maíz transgénico a campo abierto en nuestro país sea poco eficiente
y por ende, la implementación de estrategias para restringir el flujo génico entre variedades
transgénicas y no transgénicas de maíz sean tardías o insuficientes. Esto, tanto por el hecho de
que si no se puede detectar la presencia y estimar la frecuencia de un transgen en una población
de manera consistente y expedita, se pierde tiempo para aplicar las medidas de contención
necesarias que permitan evitar y/o disminuir el flujo génico, el cual, a su vez, se puede ver
potenciado por las dinámicas de intercambio de semillas comunes a un alto porcentaje de
agricultores mexicanos, quienes de manera involuntaria podrían potenciar este flujo ya que
a la fecha, las líneas de maíz transgénico son fenotípicamente iguales que sus contrapartes no
transgénicas, por lo que visualmente no se pueden discriminar.
Bajo este panorama, la legalización y consecuente liberalización de la siembra de líneas de

maíz GM puede llevar a una difusión inadvertida de este material vía las redes de intercambio
campesino. Más aún, mientras que las líneas de maíz GM actuales no han presentado daños
claros a la salud (si bien no se han realizado estudios epidemiológicos a largo plazo), lo que sí
se sabe es que éstas y todas las otras líneas comerciales de OGMs para uso agrícola presentan
derechos de patente sobre las secuencias transgénicas y son sujeto de contratos restrictivos
que obligan al agricultor a pagar un sobreprecio por la tecnología presente en la semilla, así
como el comprometerse legalmente a que acabado el ciclo agrícola, no guarde semilla para
sembrar en un ciclo posterior. Lo anterior, en el escenario de flujo génico fortuito de variedades
transgénicas patentadas, puede representar una seria amenaza a la conservación de semillas
tanto por los agricultores (in situ) como en bancos de germoplasma (ex situ) por las implicaciones
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legales de infringir un derecho de patente. Otro aspecto aún más preocupante se refiere al
hecho de que ya existen otras líneas de maíz transgénicos que expresan fármacos, solventes,
plásticos, sustancias de uso industrial o terapéutico que eliminan la vocación alimenticia de este
cultivo y que además, de llegar a la cadena trófica podrían tener consecuencias desastrosas. Esta
posibilidad se incrementa dado el hecho de que en Estados Unidos, con quien compartimos
una frontera grande y porosa, ya tiene sembrados miles de acres con este tipo de OGMs1. Esta
posibilidad ha sido advertida en diferentes foros, así como por un panel trinacional de expertos
consultados por parte de la Comisión de Cooperación Ambiental de América del Norte (2004),
quienes han recomendado la moratoria a la siembra de este tipo de cultivos.
Dado lo anterior, más el hecho de que México, en su calidad de Centro de origen y diversificación
cuenta con un reservorio genético sobresaliente en lo referente a este cultivar, aunado a la
importancia alimenticia, social y económica que tiene el maíz en nuestro país, la política más
sensata a la fecha es declarar una moratoria indefinida a la siembra a campo abierto de maíz
transgénico.
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5
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Aplicación de técnicas de biología molecular
para estudios de ecología de actinomicetos
halófilos en México
BIOLOGÍA DE LOS AMBIENTES EXTREMOS: LOS EXTREMÓFILOS
A lo largo de las últimas décadas, hemos descubierto que en la Tierra existen ambientes ini-
maginables, y lo que era aún más difícil de esperar, se ha descubierto que existen organismos
que viven ahí. No es que estos organismos sobrevivan en estas condiciones, sino que estos am-
bientes extremos son su hábitat natural, es por ello que se les ha denominado extremófilos. Este
término fue usado por primera vez por Maceroy hace tres décadas (MacEroy, 1974).
Cuando las condiciones del medio son tales que el individuo se encuentra en situación de stress,
estamos hablando de un ambiente extremo (Rossi et al, 2003). Ante esta situación y para no
morir los organismos pueden generar distintas estrategias, una de ellas es por ejemplo aislarse
del medio; así Cyanidium caldarium y Dunaliella acidophila que se encuentran en un pH de 5 tiene
un citoplasma neutro, aunque eso sí sus proteínas externas son ácido tolerantes.
Existen diferentes tipos de organismos extremófilos:
• Psicrófilos: Se desarrollan en ambientes fríos, próximos al punto de congelación del agua

(Madigan et al. ,2003).
• Termófilos: Viven y se reproducen en ambientes de elevada temperatura, por arriba de los
80º C (Niehaus et al., 1999).
• Acidófilos: Viven en sitios de pH ácido, menor a 5
• Alcalófilos: Viven en sitios de pH básico, por encima de 9 (Madigan et al. ,2003).
• Barófilos (piezófilos): Crecen en ambientes con alta presión como suelos profundos (Abe y
Hirikoshi, 2001).
• Metalófilos: Habitan en medios con altas concentraciones de metales pesados.
• Xerófilos: Crecen en ambientes con baja humedad (Madigan y Marrs, 1997).
• Halófilos: Viven en ambientes con elevada concentración salina.
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HALÓFILOS
El microbiólogo británico Anthony Walsby descubrió en un estanque hiper-salino cerca del

Mar Rojo, bacterias que viven en ambientes con altísimas concentraciones de sales, este tipo
de microorganismos fueron llamados halófilos (amantes de la sal).
Los microorganismos capaces de crecer tanto en ausencia como en presencia de sal, son lla-
mados halotolerantes y los que requieren sal para su crecimiento son llamados halófilos. De
acuerdo a la definición de Kushner (1978), es posible distinguir entre halófilos débiles, como lo
son la mayoría de los organismos marinos, considerando que el agua de mar contiene cerca de
3% (w/v) de NaCl; halófilos moderados cuyo crecimiento óptimo se encuentra en un rango de
3% y 15% (w/v) de sal; así como halófilos extremos, que presentan un crecimiento óptimo al
25% (w/v) de NaCl. (Margesin y Schinner, 2001).
Muchos de estos microorganismos han sido aislados de hábitats que presentan alta salinidad
ubicados en diferentes puntos geográficos del planeta (Ventosa et al. 1998). En la Tabla 1 se
mencionan algunos de los puntos geográficos característicos de los diferentes ambientes salinos,
Las bacterias halófilas al pertenecer al grupo de microorganismos extremófilos capaces de vivir

en ambientes salinos ofrecen una multitud de aplicaciones en varios campos de la biotecnolo-
gía como solutos compatibles, biodegradación de residuos, polímeros, etc.
Lagos Suelos Hábitats Hábitats Alimentos Hábitats

salinos salados salinos y fríos salinos y salados poco
alcalinos comunes
Salinas de
España y Lago Plantas del
Salar de Magadi, desierto:
Atacama, Kenia y
Atriplex
Chile Antártida, 300 Lago Wadi Pescado seco
Mar Rojo halinus,
lagos Natrun, y salsa de
(15 a 30%) Desierto
(25 a hipersalinos Egipto soya
Neguev,
Lago Assal, 30%)
(28%) (pH = 9) (6.5 a 10%) Israel
en Djibouti,
Somalia (10%) (0.5 a 20%)
África
(27.7%)
Vestfold Hills,
Lago salado lago salino frío
de UTAH
Antártica Lago Animales del
E.E. U.U. Alicante Venere, Isla
(0 a 5 °C) desierto:
(22%) Pantelleria, Bacalao Fosas
España
(0.5 a 20%) Italia nasales de
(2.4 a (19%) iguanas
Valles Dry, suelo (pH = 9.7)
Mar muerto 12.7%)
salino (9 a 17%) (12%, 45°C)
(28%)
(12%, –40°C)
Tabla 1. Ecología de los microorganismos halófilos, diferentes hábitats salinos
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Muchos de los ambientes salinos son también extremadamente alcalinos ya que el carbonato
sódico, así como otras sales, pueden liberar iones que producen la alcalinidad.
ACTINOMICETOS HALÓFILOS
El número de actinomicetos halófilos que se conocen actualmente es muy reducido, en los

últimos años se han reportado muy pocos géneros; de modo que el estudio de la biología de
actinomicetos halófilos incluyendo su aislamiento identificación y caracterización empieza a
mostrar la diversidad de estos microorganismos en varias partes del mundo.
En 1975 se dio a conocer por vez primera el reporte de un actinomiceto capaz de crecer en
altas concentraciones de salinidad, Actinopolyspora halophila, (Gochnauer, 1975). Dieciséis años
más tarde, en 1991, se reporta el segundo actinomiceto halófilo, A. mortivallis (Yosida, 1991).
Existen en la actualidad 15 miembros conformando este grupo. A continuación se presenta
de manera breve las principales características de los actinomicetos halófilos reconocidos a la
fecha. Tabla 2.
CRECIMIENTO ÓPTIMO
MICROORGANISMO PROCEDENCIA
% NaCl
Contaminante en medio con 25% de
Actinopolyspora. halophila 10
NaCl. Canadá
Suelo salado. Valle de la muerte,
A. mortivallis 5 - 25
California, E. U. A
A. iraquiensis Suelo salino. Iraq 10 – 15
Suelo salado.
Nocardiopsis lucentensis 10
Alicante, España.
Nocardiopsis halophila Suelo salino. Iraq 20
Nocardiopsis kunsanensis Salinas de Kunsan. Korea 10
Nocardioides aquaticus Lago salado Ekho. Antártida 1-6
Friedmanniella lacustris Lago salado Ekho..Antártida 4
Streptimonospora salina Lago salado.Oeste de China 15
Saccharomonospora halophila Suelo pantanoso. Kuwait 10
Nocardiopsis xinjiangensis Suelo salino. Xinjiang, China 10
Streptomonospora alba Suelo salino. Xinjiang, China 10 - 15
Prauserella halóphila Suelo salino. Xinjiang, China 10
Prauserella alba Suelo salino. Xinjiang, China 10
Saccharomonospora
Suelo salino. Xinjiang, China 10
paurometabolica
Tabla 2. Actinomicetos halófilos aislados en diferentes partes del mundo
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ACTINOMICETOS HALÓFILOS EN MÉXICO
México es un país notable por su diversidad climática por lo que se ha conseguido desarrollar
varios ecosistemas que contienen una gran riqueza de especies (Jaramillo et al., 1996). Esta
diversidad biológica no solo abarca los organismos antes mencionados, sino también una gran
cantidad de especies microbianas habitantes de estos ecosistemas, aun en ambientes de extre-
ma salinidad.
La distribución de ambientes salinos en México es muy amplia. Prácticamente en todos los

estados se encuentran lagos, manantiales o pozos con elevado contenido de sales.
Es en estos ambientes (de agua y suelo) donde predominan los microorganismos halófilos y
halotolerantes, siendo varios de estos ambientes seleccionados como fuente de obtención de
muestras para el aislamiento de actinomicetos halófilos (Alcocer, J. y Williams W. D., 1993).
Dentro de estos ambientes salinos se encuentran los suelos. Un suelo salino es aquel que tiene
una cantidad de sales solubles elevada que alterará desfavorablemente su productividad.; un
ejemplo de ello es el suelo salino del ex Lago de Texcoco, considerado un ecosistema casi único
en el mundo dadas sus características fisicoquímicas y la alta salinidad-sodicidad que se presen-
ta en esta gran extensión. La acumulación del carbonato de calcio en este ambiente es un rasgo
característico de las regiones áridas y semiáridas como resultado de la escasa precipitación.
Este ecosistema representa una fuente poco estudiada respecto a diversidad microbiológica,
principalmente en lo que a microorganismos extremófilos se refiere (Cruickshank, 1995).
Los estudios realizados en México, en los últimos años han demostrado por técnicas taxonó-
micas y moleculares la presencia de los géneros Saccharomonospora y Actinopolyspora en salinas
costeras del país. Además en estudios anteriores en el suelo del ex Lago de Texcoco han identi-
ficado la presencia de 5 géneros predominantes: Salinicoccus, Halomonas, Planococcus, Staphylococcus
y Nocardiopsis.
Actualmente el grupo de actinomicetos halófilos que se conoce es muy reducido; sin embargo
el estudio de sus características fisiológicas y su distribución en el mundo los ubica como un
grupo importante dentro de los microorganismos extremófilos debido al potencial que ofrecen
a nivel ecológico, biotecnológico y médico entre otros.
CARACTERIZACIÓN DE ACTINOMICETOS HALÓFILOS AISLADOS DE SUE-

LOS SALINOS
El estudio de la microflora halófila de suelos salinos comprende el aislamiento de microorganis-

mos a partir de estos ambientes, su identificación, diversidad y predominancia.
El objetivo de esta búsqueda es hallar otros géneros de actinomicetos halófilos (además de los
ya reportados), en ambientes salinos de México.
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CARACTERIZACIÓN FENOTÍPICA DE ACTINOMICETOS HALÓFILOS
Para la caracterización fenotípica se puede echar mano de varias pruebas (Koneman, 1983;
Stainer et al., 1966):
• Pruebas fisiológicas: Temperatura, NaCl y pH óptimos para el crecimiento, etc.

• Pruebas bioquímicas: Catalasa, producción de ácidos, etc.
• Pruebas nutricionales: Utilización de distintos sustratos (azucares, ácidos orgánicos, ami-
noácidos y alcoholes) como única fuentes de carbono y energía.
• Pruebas enzimáticas: utilización de API ZYM que permite estudiar rápida y simultánea-
mente 19 actividades enzimáticas.
• Análisis numérico: Se realiza la selección de algunas pruebas que presenten variación en los
resultados de análisis y se hace uso de coeficientes de asociación simple (SSM) (Sokal y Mi-
chener, 1984), así como el coeficiente de Jaccard (SJ) (Jaccard, 1908) para la construcción de
dendrogramas () mediante la técnica UPGMA “Unweitghted Pair Group Mean Average”
(Sneath y Sokal, 1973). Para el análisis numérico se puede utilizar el programa NTSYS-pc
(Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System) de (Rohlf, 1993).
Figura 1. Ejemplo de dendrograma
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CARACTERIZACIÓN FENOTÍPICA DE ACTINOMICETOS HALÓFILOS:

BIOLOGÍA MOLECULAR Y LA IDENTIFICACIÓN DE ESPECIES DE ACTINO-
MICETOS
La biología molecular contempla técnicas para la identificación de especies basadas en la va-

riación genética. Las herramientas moleculares ofrecen conceptos y metodologías que pueden
usarse en combinación con información demográfica, geográfica y ecológica para la conserva-
ción y manejo de la biodiversidad (Honeycut, 2000).
La biología molecular destaca también su aplicación para identificar poblaciones con el uso
de técnicas basadas en el análisis de ADN mediante el uso de marcadores moleculares, herra-
mientas básicas en la identificación taxonómica, la estructura genética poblacional, evolución
y conservación de los organismos (Welsh y McClelland, 1990).
EXTRACCIÓN DE MATERIAL GENÉTICO (ADN)
Una vez seleccionadas algunas cepas como miembros representantes de cada grupo formado
en las pruebas anteriores se procede a la extracción del material genético (ADN) y sea cual sea
el método resulta bastante simple.
La obtención y purificación del material genético se confirma con la visualización del mismo
en geles de agarosa al 1%.
AMPLIFICACIÓN POR (PCR) Y SECUENCIACIÓN DEL 23S rRNA
En términos simples, la técnica necesita una mezcla de reacción que contiene, entre otros com-
ponentes, una polimerasa termoestable y oligonucleótidos sintéticos, como ,23 INSf, 5’- (AC)
A (AGT) GCG TAG (AGCT) CG A (AT) G G-3’; 23 insR 5’ –GTG (AT) CG GTT T (AGCT)
(GCT) GGT A-3’; que flanquean una región del ADN, se puede amplificar dicha región en
forma específica hasta 100 millones de veces (Mullis et al., 1986).
La amplificación por PCR del 23’s rRNA se realizará utilizando oligonucleótidos de inicio
de tipo universal.
La visualización de los fragmentos amplificados se realiza por electroforesis en geles de agarosa

al 3%. La localización relativa de los fragmentos se determina mediante la tinción con bromu-
ro de etidio, una sonda fluorescente tras iluminación con luz UV, que se intercala entre la doble
hélice de ADN y emite luz (Sambrook et al. 1989). El amplicón obtenido es de +/- 350pb
como se puede observar en la figura 2.
Los fragmentos amplificados son sometidos a secuenciación automatizada (fig. 3 y 4) para

posterior identificación de especies.
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Figura 2. Visualización en gel

de agarosa del amplicón de 23S rRNA de actinomicetos halófilos
Figura 3. Secuenciación automatizada

Fig. 3. secuenciación automatizada
Figura 4. Uso de bioinformática para la identificación de especie
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IDENTIFICACIÓN DE ESPECIES
Finalmente se complementa la información obtenida con el análisis de las secuencias del 23S
rRNA para determinar la presencia de especies y subespecies correspondientes al suelo salino
estudiado.
Se realiza una comparación de las secuencias obtenidas correspondientes a los fragmentos

amplificados con las secuencias depositadas en el Gen-Bank utilizando el programa BLAST
(Altschul et al., 1997). (Fig. 5 y 6)

Fig. 5. Uso de BLAST para comparación de secuencias de DNA
En la etapa final del proceso de identificar una especie la bioinformática es la herramienta

básica que mediante programas específicos como: clustalx, phylo_win, njplot, etc., es posible encon-
trar la semejanza más cercana con otras especies por lo tanto su identificación (Galtier et al., 1996).
La construcción de los correspondientes gráficos de conexión en forma de árbol con lo que se

espera conocer la relación filogenética entre las especies estudiadas; se lleva a cabo utilizando
el método Neighbor-Joining y Kimura 2 (Saitou e Imanishi, 1987) con el programa computa-
cional Phylo_Win (Galtier et al., 1996), determinando así la presencia de especies presentes en
suelo salino estudiado.
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Fig. 6. Uso de BLAST para comparación de secuencias de DNA
El resultado de la secuenciación del ADN o fragmentos específicos tiene múltiples aplicaciones

para la identificación y conservación de especies. Algunas de las aplicaciones son: el estudio
de genes, secuenciación de genomas, estudio de la variación genética, estudios filogenéticos de
especies y búsqueda de nuevos marcadores genéticos en diversas especies animales.
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144
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Muerte celular
La muerte celular es el proceso mediante el cual una célula pierde de manera irreversible
la capacidad para mantener la composición específica de su medio intracelular. Durante el
proceso de muerte, se pueden reconocer dos momentos diferentes: 1) cuando todavía pueden
detectarse y medirse algunas funciones, y 2) después de haber cesado por completo toda
actividad fisiológica, a lo cual se le ha llamado “punto de no retorno” (Pérez-Tamayo 1987).
Una célula puede alcanzar la muerte por varias vías, y aunque el final es el mismo (la desaparición
de la célula), el nombre que se le da al tipo de muerte depende de varias características, entre
las que destacan: el estímulo que la indujo, la señalización o ruta intracelular que sigue la señal,
el organelo blanco que recibirá el estímulo o señal de muerte, las moléculas que intervienen en
la pérdida de la homeostasis celular, etc.
La muerte celular debe ser considerada como un proceso necesario en el mantenimiento del
equilibrio homeostático de los individuos. La pérdida de la capacidad de muerte de las células
que conforman un tejido, puede llevar a la formación de tumores, mientras que la muerte
precipitada o acelerada de algunos grupos celulares es característica de muchas enfermedades
autoinmunes o en casos como VIH. Un tejido se mantiene sano en la medida que guarde un
fino equilibrio entre la proliferación y la muerte de las células que lo conforman.
La muerte celular es un evento de gran importancia, en la diferenciación, el crecimiento y la

morfogénesis que ocurren en el desarrollo normal de vertebrados e invertebrados individuos
(Ellis et al 1991).
Por ser la apoptosis y la necrosis las vías de muerte que ocurren con mayor frecuencia en
los organismos vertebrados, en el desarrollo de este trabajo se describirán las características
celulares y moleculares de estos dos tipos de muerte.
1. Muerte celular por apoptosis
La apoptosis o suicidio celular es un proceso activo, altamente regulado por un programa

genético contenido en cada célula. El término apoptosis es de origen griego y significa la caída
de los pétalos de las flores, en 1972, Kerr y col, le asignaron este nombre a un tipo de muerte
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Muerte celular
celular caracterizado por el encogimiento de la célula y la marginación de la cromatina hacia

la membrana nuclear, provocando figuras curvas con forma de media luna o de pétalos.
En la actualidad se han utilizado como sinónimos los términos de apoptosis y muerte celular
programada (MCP), sin embargo, esto no es adecuado porque aunque en ambos casos las
células contienen un programa genético para la muerte, en la MCP la célula debe reconocer
cuando exactamente debe iniciar el proceso de muerte (generalmente el tiempo es el detonador
de la muerte), mientras que en la apoptosis, la muerte es inducida por factores intrínsecos o
extrínsecos.
La muerte por apoptosis puede ser disparada por una gran variedad de señales, tales como
la interacción ligandos-receptores, problemas en el metabolismo energético y en el potencial
redox, generación de ceramidas, movilización de Ca++ y activación o inactivación de proteínas
de la familia de Bcl-2 (Revisado por Chen et al., 2003). La apoptosis ocurre cuando en el
ambiente celular, se pierde el fino equilibrio entre factores pro y anti-apoptóticos y predominan
los proapoptóticos (Lu et al., 2005).
1.1 Características morfológicas de las células apoptóticas
Las células se liberan de la matriz extracelular y adoptan una forma redonda, el citoplasma
y la cromatina nuclear se condensan, y forman grumos densos que se desplazan hacia la
superficie de la membrana nuclear, el DNA se rompe en los espacios internucleosomales y
produce fragmentos de 180-200 pb o sus múltiplos. La membrana nuclear permanece intacta,
aunque se produce una redistribución de los poros nucleares asociados con alteraciones en las
proteínas nucleares que son degradadas como son: la topoisomerasa y las proteínas de la lámina
o nucleares reguladoras de la mitosis. El núcleo se fragmenta (cariorrexis) y forma múltiples
fragmentos de diferentes tamaños que parecen gotas que tienen DNA y se dispersan por todo
el citoplasma. Si bien en la muerte por apoptosis aparentemente no hay lesiones graves de la
membrana citoplasmática lo cierto es que se deforma y sufre numerosos abombamientos, así
como pérdida de la asimetría fosfolipídica, aparición de sitios de unión a trombospondina y
pérdida de residuos de ácido siálico. En los estadíos finales, la membrana plasmática se fusiona
para empaquetar y envolver los constituyentes del citoplasma así como los fragmentos nucleares
para forma los denominados cuerpos apoptóticos. Los cuerpos apoptóticos son eliminados al
entorno extracelular, donde son endocitados por células fagocíticas o por las células vecinas, lo
que evita la lesión y la consiguiente respuesta inflamatoria. En estudios in vitro donde se inhibe
la endocitosis de las células vecinas y por consiguiente no se eliminan los cuerpos apoptóticos,
se ha podido ver que la célula culminará la muerte con características de necrosis, a lo cual se
conoce como “necrosis secundaria” (Crompton, 1999; Bouchier-Hayes et al, 2005).
La apoptosis es difícil de detectar in vivo debido a que los cambios morfológicos ocurren
rápidamente (entre 2 y 4 h) y los cuerpos apoptóticos son rápidamente fagocitados y removidos
del tejido para evitar una respuesta inflamatoria (Qin et al., 2005)
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1.2 Vías de señalización
En las células de los mamíferos, la cascada de señalización que culminan con la muerte por
apoptosis, puede ser dividida en dos grandes vías: la intrínseca o mediada por la mitocondria
y la extrínseca o mediada por señales extracelulares que disparan los mecanismos de muerte
(Putcha et al., 2002; Zacks et al., 2004). Aunque los mecanismos que disparan una u otra vía
son diferentes, el objetivo en ambos casos es la activación de pro-caspasas y la desestabilización
de la función mitocondrial. La cascada de las caspasas (por sus siglas en inglés: Cytosolic
Aspartate-Specific ProteASAS), es el centro de la progresión de la apoptosis. Estas enzimas, son
una subclase de proteasas que rompen a su sustrato en un residuo de ácido aspártico. Éstas son
sintetizadas como enzimas inactivas (pro-caspasa) y sólo tendrán actividad cuando una célula
recibe el estímulo para la apoptosis. En mamíferos, al menos 13 caspasas han sido identificadas
y se han clasificado en iniciadoras y efectoras (Ho y Hawkins, 2005). Las caspasas iniciadoras
(caspasas 8, 9 y 10), son activadas por autoproteólisis en respuesta a señales de muerte, las
caspasas efectoras (caspasas 3, 6 y 7), son activadas por las caspasas iniciadoras e inician la
digestión proteolítica de la célula para finalizar con la muerte de la misma. Dentro de las
proteínas que son sustrato de las caspasas, se encuentran, proteínas inhibidoras de caspasas de
DNA activas, ADN polimerasa, Bcl-2, lamininas y varias proteínas de unión al citoesqueleto
(Affar et al., 2001). El rompimiento de estas proteínas ocasiona: fragmentación del DNA,
inhibición de la síntesis y reparación del DNA, daño de la membrana nuclear, condensación
de la cromatina y colapso del citoesqueleto (para revisar Crow et al., 2004; Lu et al., 2005).
A continuación se presentan en forma sintética los dos mecanismos de señalización de la

apoptosis (revisar Chen et al., 2003; Crow et al., 2004; Ho y Hawkins, 2005; Lu et al., 2005 y
Yan y Shi, 2005) y se pueden ver en forma esquemática en la figura 1.
1.2.1 Intrínseca
Esta vía de señalización, implica un amplio espectro de estímulos estresantes extra e intra-
celular que se traducen en un estímulo de muerte. Los estímulos extracelulares incluyen,
deficiencia en factores tróficos y de supervivencia, deficiencia en nutrientes, radiación, drogas
y estrés físico, mientras que el estímulo intracelular, incluye estrés oxidativo, daño del DNA y
proteínas malformadas (Crow et al., 2004). Estos estímulos de muerte, ocasionan la activación
de proteínas de la familia de Bcl-2 de un solo dominio BH3, lo que causa la liberación de
factores pro-apoptóticos desde el espacio intermembranal de la mitocondria hasta el citoplasma
(Wang, 2002 citado por Yan y Shi, 2005). Entre ellos se encuentran al citocromo c y la proteína
Smac/Diablo, la salida de estas proteínas es mediada por Bax y Bak (miembros también de la
familia de Bcl-2) que forman un poro para permitir la salida de estas moléculas (Putcha et al.,
2002), lo cual es antagonizado por las proteínas anti-apoptóticas Bcl-2 y Bcl-xL (Crow et al.,
2004; Yan y Shi, 2005). La liberación de citocromo c activa directamente Apaf-1 y en presencia
de dATP o ATP, induce la formación de un complejo multimérico denominado apoptososma.
El apoptosoma media la activación de la caspasa iniciadora 9 que subsecuentemente activa a
las caspasas efectoras 3 y 7, las cuales se encargan de desmantelar a las células en apoptosis. La
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Muerte celular

Fig. 4. La apoptosis puede seguir dos vías: la extrínseca, a través de la interacción de receptores de
muerte como Fas con su ligando (Fas-FasL), y la vía intrínseca, en la cual la señal de muerte (ausencia de
factores tróficos, quimioterapia, radiaciones, etc), provoca un daño directo a la mitocondria.
liberación de Smac/Diablo por su parte, activa directamente caspasas efectoras, removiendo a

las proteínas inhibidoras de la apoptosis (IAPs) (Putcha et al., 2002; Lu et al., 2005; Yan y Shi,
2005). Estas IAPs se unen a las caspasas efectoras para mantenerlas inactivas dentro del citosol,
hasta que un estímulo de muerte ocasiona la liberación de Smac/Diablo para dejar activas a
las caspasas y culminar con la apoptosis (Yan y Shi, 2005).
1.2.2 Extrínseca
La interacción de algunos ligandos a receptores solubles o de membrana inicia la vía extrínseca

de la apoptosis. Entre los ligandos mejor caracterizados y sus correspondientes receptores, se
encuentran, FasL/Fas, factor de necrosis tumoral α y su receptor-1 (TNF-α/TNFR-1), AproL/
receptor de muerte 3 (DR3) y Apro2L/receptor de muerte 4 y 5 (DR4 y DR5) (Lu et al., 2005).
El sistema FasL/Fas, es el más estudiado. La interacción de FasL con su receptor, ocasiona
el ensamble de un complejo de señalización inductor de muerte (DISC) en la membrana
plasmática (Peter & Krammer 2003 citado por Yan y Shi, 2005). En las vías de señalización
mediada por FasL además del DISC es necesaria una proteína adaptadora denominada
dominio de muerte asociado a Fas (FADD), el cual lleva a las caspasas iniciadoras 8 y 10 hacia
DISC para activarlas. La caspasa 8 una vez activada, rompe y activa a las procaspasas 3 y 7.
Es en este punto (activación de caspasas 3 y 7), donde las dos vías de señalización convergen
(Yan y Shi, 2005). Un blanco importante de la caspasa 8 es Bid (un miembro pro-apoptótico
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de un solo dominios de Bcl-2). Caspasa 8 rompe el fragmento C-terminal de Bid (formando

un Bid trucado (tBid), el cual se transloca en la membrana mitocondrial externa, para inducir
la liberación factores pro-apoptóticos (Li et al 1998). Este proceso constituye otro punto de
convergencia entre los dos mecanismos de señalización de muerte celular por apoptosis (Yan
y Shi, 2005).
1.3 La mitocondria, blanco en la apoptosis
La liberación de proteínas proapoptóticas desde el espacio intermembranal de la

mitocondria es considerado un paso decisivo en la muerte por apoptosis que también
ha sido llamado de no retorno, porque una vez liberadas dichas proteínas, la muerte es
inevitable. A diferencia de la apoptosis, en la necrosis, la intensidad del estímulo ocasiona
la catástrofe energética de la célula.
Mitchell (1961) sugirió que en la membrana mitocondrial interna los electrones son transferidos
a través de los complejos de la cadena de fosforilación oxidativa hasta el O2 en una serie de
reacciones acopladas de óxido-reducción que producen una translocación de protones hacia el
espacio intermembranal mitocondrial para generan un diferencial de potencial electroquímico
necesario para la síntesis de ATP. Este potencial electroquímico que recibe el nombre de delta
Psi (Dy) está constituido por la distribución asimétrica de los protones que generan un gradiente
de concentración y eléctrico (Chen and Smiley, 1993).
Diversas señales de muerte celular convergen sobre las membranas de la mitocondria para
inducir cambios en la permeabilidad de la membrana mitocondrial (MMP) (Ferri and
Kroemer 2001). La MMP se ha considerado como un mecanismo fundamental en el proceso
de muerte por apoptosis y necrosis (Crompton, 1999). La MMP favorece la caída del Dy, la
liberación de proteínas desde el espacio intermembranal mitocondrial como las procaspasas 2,
3, 8 y 9 (Van Loo et al 2002), así como de Smac/Diablo, Omi/HtrA2, además la MMP puede
desencadenar un descenso en los niveles de ATP acompañado del aumento en la producción
de especies óxido reactivas (Verhagen et al, 2002; Bratton et al, 2001).
La MMP implica la apertura de un megacanal mitocondrial que se conoce como poro de

permeabilidad mitocondrial de alta conductancia (PT), el cual es un complejo de proteínas que
ponen en contacto la membrana externa con la membrana interna (Zanzami and Kroemer,
2001). Los principales componentes de PT son: una proteína de la membrana mitocondrial
interna, la adenina nucleótido traslocador (ANT), una proteína de la membrana externa, porina
o canal aniónico dependiente de voltaje (VDAC), proteínas del citosol como la hexocinasa,
proteínas del espacio intermembranal mitocondrial como la creatincinasa y la ciclofilin D que
es una proteína de la matriz mitocondrial.
El PT puede estar cerrado o abierto, diversos miembros de la familia de Bcl-2, que se describen
en la tabla 3, pueden modular a PT. En condiciones fisiológicas el PT está cerrado, VDAC
regula el movimiento de sustancias a través de la membrana mitocondrial externa mientras
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Muerte celular
que el ANT intercambia ADP del espacio intermembranal por ATP de la matriz mitocondrial.
Al inicio del proceso de muerte se abre el PT y dependiendo de la intensidad del estímulo, la
conductancia de PT puede estar regulada para estímulos moderados o puede estar desregulado
ante estímulos intensos (He and Lemasters, 2002).
2. Muerte celular por necrosis
El término “Necrosis”, proviene del griego nékrosis que significa mortificación, también se ha
llamado muerte celular accidental y puede pensarse como un asesinato de la célula. La necrosis
se observa cuando las células mueren por un traumatismo grave y súbito.
2.1 Características de la necrosis
La célula necrótica presenta un núcleo condensado que es altamente basófilo (se tiñe con
hematoxilina). El sitio de mayor daño está localizado en la membrana plasmática, se observa
principalmente la ruptura y los cambios en la permeabilidad que esto ocasiona, finalmente
edematizan a la célula, por ello, se ha propuesto el término de oncosis “hinchazón” para
designar este tipo de muerte celular. La célula necrótica libera su contenido citoplásmico hacia
el tejido subyacente, donde su presencia desencadena una reacción inflamatoria. La muerte es
pasiva y desencadenada por una perturbación en el medio ambiente más que por un programa
genético de la célula (Kitanaka and Kuchino, 1999).
En la célula en proceso de necrosis, se observa una disminución en la concentración de

ATP citoplasmático ocasionada principalmente por alteraciones en la apertura del poro de
permeabilidad mitocondrial (He and Lemasters, 2002) y por la actividad de la poli-(ADP-
ribosa) polimerasa (PARP), una enzima que consume ATP al reparar el daño al DNA (Gobell
et al, 2001). La disminución de ATP tiene como principales consecuencias:
1) Una pérdida de la permeabilidad selectiva de la membrana plasmática: Principalmente

una entrada de Na+ y una pérdida de K+ por la disminución de la actividad de la ATPasa
de NA-K, como consecuencia hay una entrada masiva de H2O al citoplasma que causa la
hinchazón de la célula. Hay alteración del potencial de membrana que favorece la entrada
de calcio libre hacia el interior de la célula como consecuencia de la apertura de canales de
calcio dependientes de voltaje, así como la apertura de un canal de calcio heterodimérico
formado por el receptor acetilcolina nicotínico 7 (RACN-7) y DES-2, aunado a la inhibición
del rectificador de la concentración de calcio de la membrana plasmática dependiente de ATP
(PMCA) (Ono et al, 2003). El incremento de calcio citosólico libre activa a las fosfolipasas
unidas a la membrana, que degradan sus fosfolípidos y le causan perturbaciones, así mismo se
observa una activación de calpaina que causa daño a la membrana lisosomal, liberación de sus
enzimas y como consecuencia una rápida desintegración de la célula (Yamashima, 2000). Las
desoxirribonucleasas lisosomales digieren el DNA en fragmentos de diferente tamaño.
2) La pérdida de la asimetría de la membrana citoplasmática, se manifiesta por la exposición de

fosfatidilserina en la cara externa y la fosfatidiletanolamina en la cara interna de la membrana.
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En las células normales los fosfolípidos se distribuyen asimétricamente en la membrana

plasmática, la fosfatidiletanolamina se encuentra principalmente en la cara externa, mientras
que la fosfatidilserina se localiza casi completamente en la cara interna de la membrana
plasmática. El mecanismo por el cual se expone la fosfatidilserina involucra la inhibición de
la flipasa traslocasa aminofosfolípido dependiente de ATP y por la activación de Bid por un
mecanismo aún desconocido (Vermes et al, 1995).
2.2 Los lisosomas, blanco en la Necrosis
Los lisosomas son organelos citoplasmáticos delimitados por membrana. En su interior tiene
un pH 4-5 y contienen alrededor de 60 diferente hidrolasas identificadas hasta el momento, con
actividad catalíticas como las fosfatasas, nucleasa, glicosidasas, proteasas, peptidasas, sulfatasas
y lipasas, que son capaces de digerir todas las macromoléculas de la célula (Cuervo and Dice,
2000; de Duve, 1983). Las catepsinas están dentro de las hidrolasas lisosomales que más se han
estudiado. Se han dividido en tres subgrupos de acuerdo a la presencia de un aminoácido en su
sitio activo, las catepsinas cisteína (B, C, H, F, K, L, O, S, V, W y X/Z), las catepsinas aspartato
(D y E) y las catepsinas serina (G) (Rawlings et al, 2004). Todas ellas tienen una buena actividad
a pH de 4-5; pero otras tienen actividad a pH neutros como el contenido en el citoplasma,
aunque puede existir un descenso en su estabilidad o puede estar acompañado de alteraciones
en su especificidad o de ambos.
En el proceso de muerte celular por necrosis hay una ruptura de la membrana lisosomal, lo cual
libera todo el contenido lisosomal hacia el citosol, principalmente las catepsinas y otras enzimas
hidrolíticas que son las principales ejecutoras de la muerte (Syntichaki and Tavernarakis, 2002;
Fukuda et al, 1993).
Permeabilización de la membrana lisosomal (LMP). Por estudios donde se daña la membrana

lisosomal artificialmente con detergentes (como la esfingosina o Leu-Leu-Ome), estrés oxidativo
(usando peróxido de hidrogeno o con daño fotooxidativo) y con antibióticos que se unen a la
membrana lisosomal, se ha podido conocer que la LMP puede desencadenar tanto la apoptosis
como la necrosis (Kroemer and Jäättela, 2005). Según los autores existe una relación entre la
extensión de la ruptura de la membrana lisosomal y el modo de muerte celular. De acuerdo a
este modelo, una limitada liberación del contenido lisosomal puede desencadenar la muerte
por apoptosis, mientras que una ruptura generalizada de la membrana lisosomal desencadena
la necrosis celular (Kágedal et al, 2001).
3. Muerte celular con características de apoptosis y necrosis
Se ha establecido la hipótesis en la que se considera a las caspasas determinantes críticos de

las características morfológicas de la muerte celular por apoptosis, sin embargo la inhibición
artificial de estas enzimas, en células inducidas a la muerte por apoptosis, no les impidió la
muerte, aunque sí la vía, ya que mostraron características de muerte por necrosis (Kitanaka
and Kuchino, 1999).
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Muerte celular
El proceso de muerte celular no siempre se acompaña de características clásicas de apoptosis

o de necrosis, sino que en muchos casos, las células presentan características morfológicas
o bioquímicas de ambos tipos de muerte (Darzynkiewicz et al, 1997). En algunos casos, la
integridad de la membrana plasmática se preserva, pero se observa una degradación del DNA
característico de necrosis. En otras situaciones, la degradación del DNA puede presentar un
patrón típico de apoptosis (escalera), pero la célula muestra otras características de necrosis.
Estas observaciones hacen suponer que la célula posee ambos programas de muerte celular,
pero que en algunas situaciones pueden activarse separadamente y dar como resultado
características típicas de los procesos de muerte, sin embargo también puede activarse los dos
programas parcialmente y con esto se apreciarían características de ambos tipos de muerte
(Darzynkiewicz et al, 1997).
Conclusiones
Paradójicamente, la muerte celular es un proceso indispensable en la homeostasis de los

seres vivos. Las células pueden morir por diferente vía, dependiendo de la intensidad y el
tipo de estímulo que reciban. Cuando el estímulo ocasiona en la célula un proceso activo
y organizado, en el cual se presenta una cascada de proteínas derivadas de un programa
genético, entonces la muerte será por apoptosis. Sin embargo si el programa genético es
desencadenado por el factor tiempo como ocurre en el desarrollo embrionario, ocurrirá
una muerte celular programada. Mientras tanto, la necrosis se presenta cuando las células
reciben un estímulo muy intenso, se altera la permeabilidad de sus membranas por un
desequilibrio hídrico, se edematizan, sufren catástrofe metabólica (no hay síntesis de ATP)
por alteración de la permeabilidad de la membrana mitocondrial, salida de las enzimas
lisosomales y finalmente la lisis o el entallamiento celular.
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154
LIBRO UAM.indd 154 01/12/11 17:11

La participación de la asimetría fosfolipídica
de la membrana plasmática en diferentes
tipos celulares, tomando como modelo al
espermatozoide

Durante la interacción del espermatozoide con el ovocito, ocurre una secuencia de eventos
altamente regulada. En primera instancia los espermatozoides eyaculados son activados en
el tracto reproductor femenino, en un proceso denominado capacitación, durante el cual
experimentan una reorganización dramática de su membrana plasmática (Frits et al., 2000) y
sólo aquellos que son exitosamente capacitados podrán unirse a la zona pelúcida del ovocito
de manera especie específica. La unión del espermatozoide con la zona pelúcida produce
en el espermatozoide una serie de señalizaciones que desencadenan la entrada de Ca2+ y la
fusión de la membrana plasmática con la membrana acrosomal externa en múltiples sitios,
proceso que se conoce como reacción acrosomal. El contenido acrosomal, compuesto por
enzimas hidrolíticas, produce la digestión de la zona pelúcida del ovocito, lo cual ayuda al
espermatozoide a penetrar a través de esta capa glicoproteica que rodea al gameto femenino.
Durante la reacción acrosomal la membrana plasmática apical y la membrana acrosomal
externa se fusionan para formar vesículas que se separan del espermatozoide. Al terminar
la reacción acrosomal, la membrana acrosomal interna queda expuesta y los residuos de la
membrana plasmática de la región anterior del espermatozoide pueden observarse como
estructuras que parecen horquillas en los costados del espermatozoide. La progresión del
espermatozoide a través de la zona pelúcida, aparentemente facilitada por la existencia de
sitios específicos de fijación entre la membrana acrosomal interna expuesta y las proteínas
constituyentes de la zona pelúcida, conduciéndolo hasta el espacio perivitelino del ovocito
(Frits et al., 2000). Aquí el espermatozoide se coloca de manera que su región ecuatorial
(horquillas), queda en contacto y se fusiona con la membrana plasmática del ovocito (oolema)
(Frits et al., 2000) produciendo la penetración de la cabeza del espermatozoide al interior del
citoplasma del gameto femenino.
La composición y organización de la membrana plasmática del espermatozoide regulan de

manera específica los eventos que conducirán el destino de los espermatozoides, entre estos
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eventos están: la afinidad para factores de adhesión, la permeabilidad para solutos hidrofílicos,
señalización celular y eventos de fusión (Dunina-Barkovskaya, l998).
Antecedentes.
Espermatozoide maduro.
La estructura básica de los espermatozoides maduros ha sido dividida en tres regiones

altamente especializadas: a) La cabeza. Representa la parte más voluminosa y anterior de la
célula espermática y está directamente involucrada en todos los mecanismos con la interacción
entre espermatozoide y el ovocito que darán inicio a la formación de un nuevo individuo. La
cabeza del espermatozoide contiene poca cantidad de citoplasma y en ella se encuentran el
núcleo y el acrosoma. El acrosoma es una vesícula compleja que contiene enzimas hidrolíticas,
necesarias para la penetración de la zona pelúcida, (ZP) del ovocito por el espermatozoide
(Yanagimachi, 1994; Frits et al., 2000); b) La pieza media en la cual se ha localizado todas las
mitocondrias, encargadas de la producción de energía; y c) El flagelo, que le da la movilidad
(Frits et al., 2000).
La célula espermática madura carece de un grupo importante de organelos (retículo

endoplásmico y complejo de Golgi) (lisosomas y peroxisomas) para la síntesis y degradación
de componentes celulares (Frits et al., 2000). También es oportuno mencionar que en
el espermatozoide maduro la superficie de la membrana no está en comunicación con las
estructuras membranosas intercelulares porque el transporte membranal mediado por vesículas
está bloqueado.
Membrana Plasmática del Espermatozoide Eyaculado.
Muchas de las características de la membrana plasmática del espermatozoide, que determinan

su capacidad fisiológica basal para realizar la fertilización del gameto femenino, ocurren
durante el transcurso del espermatozoide a través del conducto epididimario. Tales cambios
forman parte del proceso que se conoce como Maduración epididimaria del espermatozoide.
En la mayoría de las especies de mamíferos el espermatozoide ha adquirido su capacidad de
movilidad progresiva y su capacidad fertilizante al llegar al segmento de unión entre la parte
media y la parte caudal del epidídimo.
Los cambios principales que se producen en la superficie del espermatozoide durante la

maduración epididimaria son: a) un incremento en la carga neta superficial, ya que en los
espermatozoides obtenidos de cola de epidídimo la carga negativa es mayor que la de los
obtenidos de cabeza, en diferentes especies, b) modificaciones en la cantidad de sacáridos
y glicoproteínas en la superficie de los espermatozoides, lo cual probablemente son
la causas de los cambios en la carga neta superficial, c) aumento en la cantidad de ácido
siálico (Yanagimachi et al., 1994), d) disminución en el contenido de lípidos, especialmente
del colesterol, lo cual ha sido informado en cerdo, toro, carnero, cobayo, y rata (Aveldaño
et al., 1992), la proporción colesterol/fosfolípidos y las concentraciones de fosfatidilserina,
156
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Dr. Alejandro Ávalos Rodríguez y col.
fosfatidiletanolamina, cardiolipina, etanolamina, plasmalógeno y de ácidos grasos insaturados

disminuyen en espermatozoides de carnero, mientras que en los espermatozoides de humano
ocurren incrementos en la cantidad de esteroides sulfoconjugados.
Nuevos y trascendentes cambios ocurren en la superficie del espermatozoide después de la

eyaculación en el tracto genital femenino. Algunos de estos cambios han sido detectados con el
uso de lectinas, las cuales tienen afinidad específica por algunos glicoconjugados de membrana.
También se ha encontrado que antígenos de grupos sanguíneos (Frits et al., 2000), antígenos de
histocompatibilidad y factores de inmunosupresión, se adhieren al espermatozoide al mezclarse
con las secreciones de las glándulas accesorias del aparato reproductor masculino durante la
eyaculación. Por ejemplo, los espermatozoides de humano adquieren lactoferrina, ferrisplan
(Frits et al., 2000). En el conejo se han encontrado proteínas de 20,000 daltons en el eyaculado
que no son demostrables en espermatozoides de epidídimo. En el toro se han encontrado
proteínas de 25,000 y 14,000 daltons específicas del plasma seminal unidas a espermatozoides
eyaculados (Vierla et al., 1980).
Distribución heterogénea de los componentes estructurales de la membrana

plasmática del espermatozoide.
La membrana plasmática del espermatozoide se caracteriza por estar subdividida en regiones

bien delimitadas a pesar de la reconocida capacidad de la membrana plasmática para la
migración lateral de proteínas y lípidos. Estas regiones denominadas dominios difieren
notablemente en composición y función (esquema1) (Frits et al., 2000).
La membrana plasmática de la cabeza del espermatozoide (esquema1) está dividida en un

dominio acrosomal (región anterior de la cabeza) y en un dominio postacrosomal (región
posterior a la cabeza). El dominio acrosomal puede ser subdividido en 1.- segmento marginal
(segmento apical, banda anterior y/o aro periférico), dominio que se encuentra sobre el área
del acrosoma que sobresale de la región nuclear, 2.-el segmento principal (segmento acrosomal)
dominio localizado por encima de la mayor porción del acrosoma y 3.- el dominio ecuatorial
(acrosomal posterior) ubicado en los límites entre la parte posterior del acrosoma y la llamada
región posacrosomal. El dominio marginal y del segmento principal, a menudo son referidos
como acrosoma anterior o como capa anterior. Estos dos dominios están separados por una
media luna central en el caso de espermatozoides de cobayo y posiblemente de otras especies
(Yanagimachi, 1994; Frits et al., 2000).
La membrana plasmática del espermatozoide está compuesta de colesterol, glicolípidos, altas

cantidades de plasmalógenos, fosfolípidos y otros lípidos de cadena alifática poliinsaturada. Los
fosfolípidos forman las dos terceras partes del total de los componentes lipídicos de la membrana
plasmática del espermatozoide. Los esteroles son los segundos lípidos más abundantes en el
espermatozoide (Frits et al., 2000). Estudios realizados con fractura por congelación muestran
que, en los espermatozoides de cobayo y de toro, la cantidad de esterol en la parte anterior del
acrosoma es 4 veces mayor que la encontrada en la región postacrosomal. Aunque el sulfato
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de colesterol es una pequeña parte del esterol total, constituye un componente de la mayor
importancia en el dominio acrosomal de la membrana plasmática del espermatozoide humano
(Yanagimachi, 1994; Frits et al., 2000).
La relación fosfolípidos / proteína de la membrana plasmática del espermatozoide de cerdo

es de 0.68 en base al peso, sugiriendo que la cantidad de proteínas y lípidos en la membrana
es aproximadamente la misma, aunque es posible que la relación proteína / lípidos en varios
dominios de la membrana plasmática del espermatozoide sea diferente (Yanagimachi, 1994;
Frits et al., 2000).
La composición y organización de los lípidos en la membrana plasmática del espermatozoide

le confieren propiedades características (Frits et al., 2000). Aunque hay variación considerable
entre las diferentes especies de mamíferos, la membrana plasmática contiene en promedio
70% fosfolípidos, 25 % lípidos neutros y 5 % de glicolípidos (en base molar) (Frits et al., 2000).
Los fosfolípidos pueden ser divididos en dos grupos: fosfoglicerolípidos y esfingomielinas. Los
fosfoglicerolípidos varían en estructura molecular porque la cabeza de su grupo polar es diferente,
en la posición sn-3 del esqueleto del glicerol. Cada clase de fosfolípido contiene diferentes cadenas
Esquema 1
PRINCIPALES COMPONENTES Y DOMINIOS DEL ESPERMATOZOIDE MADURO

Los principales componentes del espermatozoide son la cabeza, pieza media y cola, en la cabeza se
encuentra la membrana plasmática, la acrosomal externa, la acrosomal interna, el acrosoma, la cubierta
nuclear y el núcleo. La membrana plasmática del espermatozoide se caracteriza por estar organizada en
dominios y los principales son: la región apical, la preecuatorial, ecuatorial, postecuatorial, anillo posterior,
pieza media, anillo anular y flagelo (Frits et al., 2000).
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alifáticas tales como acil, alquil, alquenil, que pueden estar unidas a la posición sn-1 o sn-2 del
esqueleto del glicerol (Parks and Hammerstedt, 1985). Las concentraciones de fosfolípidos en
la membrana plasmática de las células espermáticas, son generalmente comparables a los de
las membranas plasmáticas de las células somáticas. Por ejemplo el espermatozoide humano
contiene una relación porcentual de 50 de fosfatidilcolina, 30 de fosfatidiletanolamina,
12.5 de esfingomielina, 3 de fosfatidilserina, 2.5 de cardiolipina y casi 2 de fosfatidilinositol.
Por el contrario, la composición estructural de especies moleculares de fosfatidilcolina y
fosfatidiletanolamina, así como de otros fosfolípidos, es considerablemente diferente entre los
espermatozoides y las células somáticas (Frits et al., 2000). La posición sn-2 del esqueleto del
glicerol de los fosfolípidos espermáticos constituye una de las diferencias más notables en cuanto
a la esterificación con ácidos grasos poli insaturados de cadena larga (casi exclusivamente
ácido docosahexaenóico 22:6 y ácido docosapentaenóico, 22:5), además en la posición sn-1
contienen predominantemente cadenas alifáticas saturadas de 16 átomos de carbono de los
cuales casi el 55 % está unido a un vinileter (plasmenilcolina o plasmeniletanolamina) y 25 %
con un grupo alquilo saturado (fosfatidilcolina o fosfatidiletanolamina) (Brouwers, 1998), solo
el 20 % de la fosfatidilcolina y fosfatidiletanolamina contienen en el sn-1 un enlace de tipo éster
con un ácido graso. Durante la capacitación la cantidad de fosfatidilcolina pueden aumentar
debido a la metilación de la fosfatidiletanolamina (Frits et al., 2000).
Existen variaciones entre espermatozoides de diferentes especies, en cuanto a la

concentración de lípidos neutros que componen su membrana plasmática, incluso hay
diferencias entre espermatozoides del mismo individuo. El principal componente que
varía, es el colesterol. El espermatozoide humano contiene una alta concentración de
colesterol (40% del total de lípidos en base molar), sin embargo el cerdo contiene mucho
menor cantidad (22% del total de lípidos base molar). Además de colesterol, el demosterol,
sulfato de colesterol y ésteres de colesterol también están presentes en la membrana (Mann
y Lutwak-Mann, 1981; Frits et al., 2000).
Asimetría de la membrana plasmática.
Las moléculas lipídicas que presentan la asimetría más marcada y constante, en cuanto a
su distribución en la membrana plasmática de las células animales, son los glicolípidos, los
cuales se caracterizan por estar únicamente en la mitad exterior de la bicapa, quedando sus
carbohidratos al descubierto en la superficie de la célula (Frits et al., 2000).
En cuanto a los componentes fosfolipídicos de la membrana plasmática de los espermatozoides,

se encuentran asimétricamente distribuidos, de manera semejante a como acontece en
la membrana plasmática de las células somáticas. Diversos métodos han revelado que los
fosfolípidos como esfingomielina (SM) y en menor grado fosfatidilcolina (PC), se encuentran
principalmente en la cara externa de la membrana (Gadella et al., 1999 y Muller et al., 1996).
Los aminofosfolípidos como fosfatidiletanolamina (PE) y especialmente la fosfatidilserina (PS)
están localizados en la capa lipídica interna (esquema 2) (Rana et al, 1993). Si bien es cierto
que en general la fosfatidilserina no se encuentra en grandes proporciones en la membrana
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plasmática, es importante resaltar que por el hecho de que casi el 100% de este fosfolípido
se encuentre en la cara interna de la membrana, la presencia de éste en la cara externa es
considerada como indicador de la pérdida de la asimetría membranal (Kuypers et al., 1996).
La Anexina V es una proteína que en presencia de concentraciones adecuadas de Ca2+ tiene
una alta especificidad por la fosfatidilserina, por lo cual ha sido usada como una técnica de
elección para detectar pérdida de la asimetría de la membrana (Kuypers et al., 1996). La
citometría de flujo es una técnica que en la actualidad es utilizada, como una prueba estándar
confiable, para observar los cambios en la asimetría de las células espermáticas (Gadella et al.,
1999; Nolan et al., 1995).
La formación y mantenimiento de la asimetría de las membranas biológicas es importante

para sus funciones y por lo tanto para el mantenimiento de la célula (Herrman et al., 1991).
Los componentes estructurales de las bicapas se encuentran en equilibrio. Dicho equilibrio
es un balance de dos mecanismos. Primero todos los fosfolípidos difunden pasivamente a
través de la bicapa, a una velocidad relativamente baja. Segundo los amino fosfolípidos son
transportados activamente de la cara externa de la membrana hacia la cara interna por la
acción de una enzima denominada translocasa de aminofosfolípidos dependiente de (ATP) y
Mg2+ la cual mantiene el equilibrio de la membrana. Estudios reportados en eritrocitos han
podido demostrar que los aminofosfolípidos son transportados desde la cara externa hasta la
cara interna de la membrana por la aminofosfolípido translocasa, y que este movimiento es
responsable de la distribución asimétrica de los fosfolípidos en los eritrocitos, así como en la
membrana de otras células eucariontes. Cuando en la lámina externa de la bicapa aparece
la fosfatidilserina, ésta es rápidamente devuelta hacia la lámina interior por la translocasa de
amino fosfolípidos (Kuypers et al., 1996). La aminofosfolípido translocasa puede ser bloqueada
por vanadato o por algún sistema que inhiba la producción de ATP (Backer et al., 1987).
El movimiento de la cara externa hacia la cara interna de la membrana se denomina “flip” y el

movimiento de los fosfolípidos de la cara interna hacia la externa se denomina “flop” (Kuypers
et al., 1996).
Bajo la mayoría de las condiciones el mecanismo de “flip-flop” es extraordinariamente lento

y su tiempo medio se mide en intervalos de horas o semanas (Homan et al., 1988). Se ha
encontrado que el movimiento de proteínas del exterior al interior de la membrana cataliza
el paso de algunos fosfolípidos de una lámina a la otra por mecanismos de “flip-flop”, tanto
dependientes de ATP como independientes de él, en un tiempo menor a 5 minutos (Devaux
et al., 1990).
Otras enzimas, semejantes a las translocasas, han sido descritas recientemente como
importantes en la regulación de la distribución asimétrica de los fosfolípidos de las membranas.
Estas enzimas, llamadas “flipasas” regulan una rápida translocación de fosfolípidos por el
movimiento de “flip-flop” (Schneider et al., 1986). La actividad de “flip-flop” de fosfolípidos
puede ser incrementada significativamente por la incorporación de antibióticos formadores de
canales iónicos, como la anfotericina B (Schneider et al., 1986).
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Los iones de calcio juegan un importante papel en algunos procesos fisiológicos por su habilidad
para regular la estructura y función de las membranas celulares y por sus acciones en algunas
vías metabólicas, particularmente aquellas involucradas en los procesos de contractibilidad y
metabolismo energético.
Es conocido que el incremento de la concentración del Ca2+ citosólico, inducido por el

ionóforo A-23187, o por incorporación de Ca2+ al medio, estimula la producción de una
distribución al azar de los lípidos de la membrana (Sulpice et al., 1994; Williamson et al.,
1992). El desorden que se produce en la membrana ocasiona pérdida de la asimetría de los
fosfolípidos de la membrana y posteriormente la formación de vesículas. La relación entre
vesiculación y translocación de fosfolípidos fue demostrado por la observación de experimentos
que mostraron espontáneos brotes y vesiculaciones en liposomas después de que se les indujo
redistribución transmembranal de fosfolípidos (Farge y Deveraux, 1992). Desde hace mucho
tiempo se conoce que ciertos ionóforos como el A23187 son capaces de unir y transportar
cationes divalentes como el Ca2+ a través de barreras lipídicas, incluyendo las membranas
celulares, posteriormente se demostró que este ionóforo era capaz de incrementar el contenido
de cAMP en células de la médula ósea. En virtud de la conocida relación del metabolismo
del calcio con el cAMP, algunos autores decidieron utilizar a este ionóforo como inductor de
la capacitación espermática. Actualmente se sabe que el uso de A-23187, induce la reacción
acrosomal (RA) por un mecanismo regulatorio intracelular que produce un rápido y masivo
influjo de Ca2+ al interior del espermatozoide (Frits et al., 2000; Kirkman-Brown et al., 2002).
Esquema 2
ASIMETRÍA FOSFOLIPÍDICA DE LA MEMBRANA PLASMÁTICA.
La membrana plasmática de la mayoría de las células presenta una distribución asimétrica en cuanto a su
distribución fosfolipídica, tal es el caso de fosfatidilserina y fosfatidiletanolamina que de forma normal se
encuentran principalmente en la lámina interna de la bicapa.
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Fluidez y permeabilidad membranal.
La composición de los fosfolípidos y su relación con el colesterol regulan la fluidez y

permeabilidad iónica de las membranas biológicas y ambos cambian durante la capacitación.
En el caso de los espermatozoides humanos existen evidencias de que la capacitación in vitro
involucra la eliminación de colesterol de la membrana plasmática y que la pérdida de lípidos
membranales durante este evento parece ser un fenómeno reversible asociado con la presencia
de proteínas aceptoras de esteroles en el medio de incubación (Yanagimachi, 1994).
Cuando se incuban espermatozoides con un medio capacitante químicamente definido y

después se estudia la concentración de lípidos (colesterol y fosfolípidos) en las células completas
y fraccionadas, se observa que el colesterol y la relación colesterol-fosfolípidos disminuye en un
20 y 30% en la fracción de la cabeza. La adicción de líquido folicular o suero sanguíneo a este
medio, sin embargo produce la eliminación del 40-50% del colesterol membranal, el cual es
atrapado por las lipoproteínas y albúmina presente en estas secreciones.
Las alteraciones físicas y/o químicas de la bicapa de lípidos membranales durante la

capacitación parece tener como resultado adicional la inducción de redistribución en las
proteínas intrínsecas (Yanagimachi, 1994).
La anexina V como marcador de asimetría fosfolipídica
La Anexina-V es un miembro de una familia de proteínas con actividad anticoagulante vascular

que presentan afinidades específicas por el calcio iónico y por algunos fosfolípidos. Esta proteína
se ha llamado de diferentes maneras: Proteína de placenta 4 (PP4), proteína anticoagulante de
placenta I (PAP I), calfobindina I (CPB-I), proteína fijadora de fosfolípidos dependiente de
calcio 33 (CaBP33), proteína vascular anticoagulante alfa (VACa), ancorina CII, lipocortina-V,
endonexina II e inhibidor de la tromboplastina. Esta proteína, como ya dijimos, presenta una
alta especificidad por la fosfatidilserina cuando se encuentra en condiciones fisiológicas de
concentración de Ca2+.
Una propiedad muy útil de la Anexina V unida a un fluorocromo como el isotiocianato de

fluoresceína (Anexina V –FITC) en este tipo de estudios se deriva del hecho de que puede
unirse a un gran número de sitios de fijación en las superficies celulares proporcionando una
señal fluorescente de gran intensidad. El número de sitios de fijación para la anexina V ha sido
señalado como de 6 - 24 x 106 por célula en las células tumorales que presentan alteraciones
en la distribución de sus fosfolípidos membranales y de 8.8 x 106 por célula en las células de
estirpe endotelial. Los eritrocitos humanos normales pueden tener tan pocos como 276 sitios
de fijación, o tantos como 5000. Este número puede aumentarse notablemente cuando la
fosfatidilserina, usualmente presente sobre todo en la capa interna de la membrana plasmática,
es translocada a la parte externa de esta misma membrana.
Algunos estudios practicados con liposomas fabricados con fosfatidilserina han demostrado
que la estequiometría de fijación de la Anexina V a este fosfolípido oscila entre 4 a 8 moléculas
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de Anexina por cada fosfatidilserina. Esto también refleja la tendencia que tiene la Anexina V
para formar trímeros en el momento de su fijación a fosfatidilserina aumentando notablemente
la intensidad de la fluorescencia producida.
La fijación de la Anexina V a la fosfatidilserina es muy rápida y muy dependiente de la presencia

de concentraciones específicas de calcio. Este proceso puede ser reversible por la adición de un
quelante del calcio, como el EDTA. La utilidad de utilizar simultáneamente las propiedades
tintoriales de la Anexina V y del ioduro de propidio ha sido repetidamente señalada sobre todo
en los casos en que se desea mostrar que la fijación de la Anexina V no obedece a alteraciones
en la membrana celular que permitan su paso al interior de la célula estudiada. Por ejemplo
las células que experimentan el proceso de necrosis se tiñen simultáneamente con la Anexina
V y con el PI.
La pérdida de la asimetría fosfolipídica es una importante evidencia de desestabilidad

membranal. Aunque se sabe que esta desestabilización puede terminar con la muerte celular
también en el caso del espermatozoide (Harrison, 1996), se sabe que éste es un paso esencial en
el proceso de fusión de membranas (Gadella y Harrison, 2002). En el caso del espermatozoide
humano, la incubación de estas células en presencia de bicarbonato/CO2 causa un rápido
cambio en la arquitectura de su membrana plasmática, acompañada de una desestabilización
(de Vries et al., 2003).
Finalmente, podemos resumir que en la mayoría de los diferentes tipos celulares, la mayoría
de los componentes estructurales de su membrana plasmática se encuentran distribuidos
asimétricamente, y que una pérdida de su asimetría podría traer como consecuencia la muerte
celular, sin embargo para el espermatozoide esta pérdida de la asimetría fosfolipídica es un
paso necesario rumbo a la fertilización del ovocito.
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Análisis genómico del repertorio inmunológico
“El estudio de las causas de enfermedad en humanos, animales y plantas no deja duda de que uno de los
principales caracteres con valor en la sobrevivencia es la inmunidad a la infección. Desafortunadamente, esta no
es una adquisición permanente, ya que los agentes patógenos también evolucionan, por lo general más rápido que
sus víctimas.”
J.B.S. Haldane. The causes of evolution (1932)
“Nada en biología tiene sentido salvo ante la luz de la evolución”

T. Dobshansky
1) Generalidades del sistema inmune en metazoarios
Los seres vivos, sean uni o multicelulares responden de maneras diversas a estímulos nocivos
derivados de su interacción con el ambiente. Sin embargo, el aumento en la complejidad
anatómica y funcional derivada de la multi-celularidad y diferenciación celular generó nuevos
y diversos nichos ecológicos susceptibles de ser colonizados por otros seres vivos estableciendo
en su mayoría, interacciones mutualistas. No obstante, también se crearon nichos potenciales
para interacciones parasitarias que no existían en formas de vida unicelular.
El aumento en la complejidad derivada de la organización multicelular en el reino animal

incluyó el surgimiento de nuevos mecanismos de identificación de estímulos nocivos asociados
al parasitismo, así como de mecanismos efectores para contrarrestarlo. En su conjunto estos
mecanismos se conocen como sistema inmune y se encuentran conservados en animales bilaterales
(bilateria), cuyos orígenes datan desde antes de la explosión cámbrica aproximadamente hace
unos 600-900 millones de años (Lynch, 2007). El repertorio inmunológico se refiere a la gama
de mecanismos moleculares con que cuentan los metazoarios que se encuentran implicados en
el reconocimiento de lo no propio.
La respuesta inmune se compone de un brazo aferente que inicia con el reconocimiento del
patógeno (estimulo) a nivel molecular, usualmente a través de receptores trans-membranales
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(repertorio). El reconocimiento del patógeno se encuentra ligado a una serie de cambios

bioquímicos complejos en la célula que genéricamente se describen como vías de transducción
de señales que involucran desde interacciones proteína-proteína, re-localización de complejos
proteicos, fosforilación de proteínas, hidrólisis de nucleótidos trifosfatados y fosfolípidos
membranales, movilización de calcio, lo cual eventualmente culmina en la activación
de diversos programas efectores o eferentes cuya finalidad biológica es la erradicación del
patógeno y mantener al organismo dentro de límites homeostáticos.
La mayoría de las respuestas efectoras implican un acoplamiento entre las vías de transducción
de señales con la inducción o represión de la expresión de genes. Eso usualmente se logra
mediante la activación de factores de trascripción, usualmente citosólicos, su translocación
al núcleo donde interactúan con elementos de respuesta en regiones reguladoras de los genes
blanco, promoviendo así el inicio de la transcripción de los mismos. Los factores de trascripción
más importantes en la respuesta inmune y otras formas de estrés celular (luz UV, estrés
oxidativo, necrosis de células vecinas) en la mayoría de los metazoarios estudiados pertenecen
a la familia de factor de trascripción REL-NFkB (Beutler, 2004; Hoffman y Baltimore, 2006).
Clasificación del sistema inmune de acuerdo al mecanismo de reconocimiento

de patógenos: Según el mecanismo de reconocimiento y relaciones filogenéticas, el
sistema inmune se divide en dos tipos: El sistema inmune innato o no anticipatorio (SINA)
y el sistema inmune adquirido o anticipatorio (SIA) (Klein, 1999). El primero está presente
en todos los animales bilaterales y se basa en el reconocimiento de patógenos mediante un
número limitado (aunque no necesariamente pequeño) de receptores que reconocen firmas
moleculares conservadas y específicas de los patógenos que se denominan PAMP’s (del inglés
Pathogen Associated Molecular Patterns). Los receptores de PAMP’s (PRR’s del inglés Pattern
Recognition Receptor) están sujetos a presión de selección en el curso de millones de años y
sus genes se encuentran codificados en la línea germinal. Por esta razón, la respuesta inmune
innata es esteriotipada al no cambiar su dinámica ante subsecuentes retos inmunes y por lo
mismo carece de memoria inmunológica (Janeway, 1989; Beutler, 2004).
Por otro lado, el sistema inmune adquirido o anticipatorio (SIA) surgió hace unos 550-450
millones de años y está presente a partir de los peces mandibulados (Gnatostomados). Este
sistema de reconocimiento se basa en la construcción de novo de receptores de antígeno, ya
sea inmunoglobulinas (Ig) o receptores de linfocitos T (RLT), esto es, que los individuos
heredan una colección de segmentos génicos en la línea germinal, así como la maquinaria
para ensamblar Ig y RLT. En el individuo, estos segmentos se recombinan clonalmente en
células especializadas denominadas linfocitos B (para las Ig’s) y linfocitos T (para los RLT)
mediante un proceso denominado recombinación somática. El resultado final de este proceso
es que cada linfocito B o T contiene un receptor único que en potencia puede reconocer a un
determinante antigénico del patógeno (Cooper y Alder, 2006).
Reconocimiento de patógenos mediante mecanismos innatos: La secuenciación de genomas

de diversos animales vertebrados e invertebrados ha permitido la identificación de familias
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de genes que codifican para receptores de reconocimiento de PAMPs. La mayoría de esas

familias se encuentran presentes en animales deuterostomados, así como en protostomados,
lo cual sugiere la existencia de genes ancestrales comunes. Otros solo se encuentran en un
phylum pero no en otro. Las principales familias de genes involucradas en el reconocimiento
de patógenos en mamíferos son la familia de receptores tipo Toll, los receptores NOD-LRR,
los receptores scavenger, las proteínas con grupo tioéster, los proteínas de reconocimiento de
peptidoglicano, lectinas tipo C, entre otras.
Receptores tipo Toll: El receptor Toll fue originalmente descrito como un receptor
involucrado en la determinación del patrón dorso-ventral durante la embriogénesis temprana
en Drosophila melanogaster. La activación de este receptor por el ligando Spatzle activa una vía de
transducción de señales que conlleva a la activación del factor de transcripción de la familia
REL-NFkB llamado dorsal. Dorsal regula la expresión de dos organizadores embrionarios Twist
y snail en la región ventral del embrión, los cuales promueven la diferenciación del endodermo.
La falta de actividad de Twist y snail en la región dorsal favorece la diferenciación del ectodermo
y eventualmente del sistema nervioso central (Stathopoulos and Levine, 2002).
Además de su importante papel en la embriogénesis, la vía de Toll es esencial en la respuesta

inmune de Drosophila al regular la expresión de péptidos antimicrobianos. Los patógenos
Gram positivos y hongos conllevan a la activación de diversas proteasas de serina que activan
proteolíticamente a Spatzle, activando la vía de Toll, lo cual conlleva a la activación de otro factor
de transcripción de la familia Rel-NFkB llamado dif, el cual a su vez promueve la activación
transcripcional de los genes que codifican para péptidos antimicrobianos (Hoffmann, 2002).
Los mecanismos involucrados en la respuesta inmune de la mosca de la fruta son similares a
los encontrados en mosquitos vectores de enfermedades humanas como lo son Anopheles gambiae
(malaria) y Aedes aegypti (dengue) (Waterhouse, 2007).
Un descubrimiento clave en el estudio de la respuesta inmune en los últimos 10 años fue

el descubrimiento de que el humano tiene receptores similares a Toll, los cuales han sido
denominados receptores tipo Toll o TLR, los cuales son importantes mediadores de la respuesta
inmune en mamíferos, pero parecen no estar involucrados en el desarrollo embrionario
(Medzhitov, 1997). Los receptores tipo Toll comparten una estructura común. Se trata de
proteínas transmembranales cuyo ectodominio cuenta con varios repetidos ricos en leucina
(leucine rich repeat o LRR); una región transmembranal y un dominio intracelular denominado
TIR (Toll/IL-1R). Mientras que los dominios LRR son frecuentemente encontrados en
diversos receptores que no participan en la respuesta inmune, el dominio TIR está presente
únicamente en los TLR’s, el receptor de IL-1 y las proteínas R que median resistencia contra
patógenos en plantas. El dominio TIR es indispensable para la vía de activación mediada por
factores de trascripción de la familia REL/NFkB (Akira et al. 2006).
En el ser humano se han descrito 11 TLR’s los cuales se encuentran conservados estructuralmente
y funcionalmente en el ratón. Cada TLR tiene propiedades diferentes de reconocimiento.
Así mismo, cada receptor tiene particularidades en cuanto a su capacidad de translucir
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señales intracelulares. TLR4 forma un complejo con CD14 y esencial para el reconocimiento
del lipopolisacárido (LPS). Por su parte TLR1, 2 y 6, ya sea como homodímeros o como
heterodímeros, pueden reconocer diversos componentes de bacterias Gram positivas como
peptidoglicano y ácido lipoteicoico, así como componentes de la pared de hongos, como el
zymosan. TLR5 reconoce flagelina. La activación de este tipo de TLR usualmente conlleva a
la activación de factores transcripcionales de la familia REL-NFkB, lo cual a su vez activa un
programa de expresión genética caracterizado por la expresión de citocinas pro-inflamatorias
(Beutler, 2004; Akira, 2006).
TLR3, 7,8 y 9 merecen mención especial ya que no se expresan en la membrana plasmática,

sino que se encuentran anclados en vesículas endocíticas y son esenciales en el reconocimiento
de ácidos nucleicos de origen viral. Estos, además de activar un programa de secreción de
citocinas pro-inflamatorias mediada por factores de la familia Rel/NFkB también activan la
secreción de interferones de tipo I, mediante la activación de los IRF (Interferon response
factor) 3, 7 y 9 (Beutler, 2004; Akira et al, 2006).
Receptores NOD LRR: Existen otro tipo de receptores de PAMP’s que no pertenecen a la
familia de los TLR. Una familia muy interesante es la familia NOD-LRR que comprende
un grupo diverso de proteínas citosólicas y están constituidos por dominios LLR, un dominio
central llamado NOD (Nucleotide Oligometization Domain), y un dominio CARD (Caspase
Recruitment Domain). Estas proteínas están implicadas en el reconocimiento de componentes
de paredes bacterianas Gram positivas de aquellas bacterias que escapan de la vía endocítica y
residen en el citosol. Así mismo, variantes alélicas de una de estas proteínas han sido implicadas
en el desarrollo de la enfermedad de Crohn (Enfermedad inflamatoria crónica del colon)
(Strober, 2006; Akira et al 2006).
El reconocimiento de muramil-dipéptido y ácido diamino-pimélico por parte de las proteínas

LRR-NOD conlleva a la activación de la producción de citocinas pro-inflamatorias vía REL/
NFkB, así como la activación de caspasa 1, la cual efectúa el corte proteolítico de pro-IL-1
a IL-1 activa, jugando un papel fundamental en la inflamación y la respuesta de fase aguda
(Strober, 2006).
El sistema del complemento: El sistema del complemento está compuesto de una serie de
proteínas séricas que en condiciones normales se encuentran en forma inactiva. La activación
del complemento por diversos estímulos inmunológicos conlleva a la activación proteolítica
de una proteína con grupo tioéster llamada C3 a la forma activa C3b. La activación de C3b
permite la formación de un enlace covalente entre el tioéster de C3b y la superficie del patógeno.
Eso permite la formación de una cascada de eventos bioquímicos que promueven infamación
local, opsonización del patógeno, así como la formación de un complejo multimérico con
otras proteínas del complemento (C5, C6, C7, C9, C9) denominado complejo de ataque de
membrana, el cual se inserta en la pared bacteriana formando un poro que altera la integridad
bacteriana.
El sistema del complemento lo podemos encontrar principalmente en vertebrados, aunque los

ancestros de las proteínas con grupo tioéster datan desde la divergencia entre protostomados y
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deuterostomados, ya que diversas proteínas como los TEPs han sido descritas en la respuesta
inmune en dípteros. En particular, la proteína TEP1 de Anopheles gambiae parece tener un papel
importante en la destrucción de Plasmodium, el parásito causante de la malaria (Blandin et al, 2008)
Reconocimiento de patógenos mediante mecanismos anticipatorios: En el sistema

inmune adquirido, la clona de linfocito que reconoce al patógeno es seleccionada mediante la
activación de un programa de diferenciación a célula efectora como resultado de la interacción
entre el receptor de antígeno y demás señales co-estimuladoras (usualmente derivadas de
activación del sistema inmune innato). En el SIA, la presión de selección ocurre en el orden de
días o semanas. Asumiendo que el individuo sobrevive la infección, las clonas seleccionadas por
el patógeno permanecen en el organismo y se encuentran sensibilizadas de tal forma que retos
subsecuentes con el mismo patógeno son resueltos con mayor eficacia, es decir, se desarrolla
memoria inmunológica. La memoria inmunológica es la base biológica de las estrategias de
vacunación. Al no estar codificada en la línea germinal, la memoria no se hereda, por lo cual
cada individuo susceptible tiene que ser vacunado.
La función del sistema inmune adquirido está íntimamente relacionada con la función del
sistema inmune innato. La producción de anticuerpos así como la inmunidad celular mediada
por células T requieren de estímulos resultantes de la activación del sistema inmune innato. De
hecho, el reconocimiento antigénico per se mediado por los receptores de antígeno (Ig o RLT)
induce un estado refractario a la activación llamado anergia clonal, el cual está implicado
en los mecanismos de tolerancia inmunológica. La activación y diferenciación de linfocitos
requiere, además de la señal antigénica, estímulos co-estimuladores para montar una respuesta
inmune. Estos son muy diversos e incluyen citocinas como IL-1, IL-6, IFN-g, TNF-a; productos
derivados de la activación del complemento (C3b), interacciones celulares mediadas por pares
ligando-receptor (CD40-CD154; CD80-CD28).
Una consecuencia de la aparición del sistema inmune adquirido es la capacidad de

discriminación de lo propio y lo no propio, aún entre individuos de la misma especie
(Klein, 1999). Los linfocitos T reconocen los fragmentos antigénicos derivados de patógenos
que ingresan al interior celular solo en asociación con proteínas del complejo principal de
histocompatibilidad (en humanos también llamado HLA por Human leukocyte antigen). Solo
su asociación con péptidos derivados de patógenos (lo propio modificado por el patógeno), en
conjunto con señales derivadas de la activación del sistema inmune innato desencadena una
respuesta inmune mediada por células T. El surgimiento de este sistema de reconocimiento
confirió al sistema inmune la capacidad de identificar patógenos cuya replicación ocurre en el
interior de la célula (virus y bacterias intracelulares) y la consecuente eliminación de las células
infectadas (en el caso de infecciones virales) o proporcionando señales de activación (ayuda) a
macrófagos infectados por bacterias intracelulares.
El complejo principal de histocompatibilidad es un conjunto de proteínas muy polimórficas

que se encuentran en la superficie de todas las células de organismos vertebrados y actúan
como un “código de barras” de identidad molecular ya que difícilmente dos individuos
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tienen la misma combinación de alelos (a menos de que sean gemelos monocigóticos). Este sello
de identidad molecular individual confiere a los individuos capacidades diferentes de responder a
diferentes patógenos debido a que las diferencias estructurales en el MHC confieren capacidades
diferenciales para asociarse a péptidos antigénicos. Si bien es conocida la asociación de ciertos alelos
de HLA con la resistencia o susceptibilidad a infecciones como malaria, tuberculosis, progresión de
VIH, lepra, la evidencia apunta que los determinantes genéticos de la resistencia o susceptibilidad
a infecciones no se restringen al HLA, sino que son poligénicos (Frodsham y Hill, 2004). De la
misma manera, otras enfermedades crónicas de etiología no infecciosa cuya patogenia obedece a
mecanismos inmunológicos también están asociadas a ciertos alelos de HLA.
El sistema de reconocimiento antigénico mediado por la interacción entre célula T–HLA es

único en su capacidad de identificar perturbaciones mínimas en el universo antigénico del
individuo. Una consecuencia inevitable de este sofisticado mecanismo es la respuesta alogénica,
es decir, el rechazo a un injerto proveniente de un individuo genéticamente distinto de la
misma especie por mecanismos inmunológicos.
2) Genómica comparativa y filogenia del sistema inmune
La genómica comparativa representa un campo muy atractivo e informativo en términos

de análisis de la función y evolución del sistema inmune. Conforme más genomas de
metazoarios se secuencian, ha sido posible evidenciar que elementos aferentes y eferentes de
la respuesta inmune están conservados en todos los metazoarios y por otro lado evidenciar
la gran diversidad de estrategias que diferentes organismos han desarrollado para contender
con el reto permanente a la integridad e individualidad que representa el parasitismo. Así
mismo, el análisis genómico está permitiendo el análisis detallado del repertorio de receptores
involucrados en el reconocimiento de patógenos.
Entre los receptores involucrados en el reconocimiento de patógenos que están claramente

conservados en la mayoría de los metazoarios son las proteínas con dominios pertenecientes a la
superfamilia de inmunoglobulinas (SF-Ig). Estos dominios son quizá unos de los más abundantes
en metazoarios y se encuentra en proteínas cuya función tiene que ver con reconocimiento
célula-célula (como en el guiado de los axones durante la embriogénesis en Drosophila, así
como en otras interacciones célula-célula y desde luego en el reconocimiento antigénico. En
resumen, la función de las proteínas con dominios de Ig no está restringida al sistema inmune.
Sin embargo, algunas de ellas desempeñan funciones claramente inmunológicas tanto en
deuterostomados como en protostomados, aunque en estos últimos no generan diversidad por
recombinación.
Uno de los componentes de la respuesta inmune que se encuentran relativamente bien

conservados en muchos metazoarios son los elementos de las vías de señalización de la vía
Toll-NFkB. En D. melanogaster se han descrito dos vías principales de activación, la vía Toll y
la IMD, que convergen en la activación de factores de trascripción de la familia REL-NFkB.
Estos factores regulan el 70 % de genes que son regulados a nivel transcripcional en respuesta
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a retos inmunológicos experimentales. La vía de Toll es homóloga a la vía de varios TLR’s de

vertebrados, mientras que la vía IMD es homóloga a la vía de señalización mediada por el
receptor de TNFa en vertebrados (Hoffmann, 2002).
Así mismo, las comparaciones a escala genómica entre D. melanogaster, Aedes aegypti y An.
gambiae revelan una gran diversidad en los mecanismos de reconocimiento y mecanismos
efectores, principalmente debida a duplicación genética y de dominios; mientras que las vías
de señalización principales están bastante bien conservadas (Waterhouse, 2007).
La visión clásica del sistema inmune innato como un sistema cuyos mecanismos de
reconocimiento se basan en una diversidad pobre de receptores de PAPM’s ha ido cambiando
paulatinamente conforme se analizan los genomas de mas protostomados y deuterostomados
no vertebrados, o bien al apoyo de técnicas derivadas de la genómica que no implican la
secuenciación total de un genoma. A continuación, se resumen algunos ejemplos que nos
permiten re-plantear esta visión ya que apoyan la noción de que aquellos animales que no
cuentan con sistemas de recombinación somática de segmentos de Ig y TCR pueden generar
una gran diversidad por diferentes mecanismos moleculares:
Generación de variabilidad mediante empalme (splicing) alternativo: Diversas

proteínas con varios dominios de Ig han sido descritos en insectos, en cuyos casos están
involucradas en diversos procesos biológicos como adhesión celular, interacción célula-célula y
respuesta inmune. En Drosophila se describió un gen llamado DSCAM (Down Syndrome Cell
adhesión Molecule) el cual está implicado en la generación de un gran número de isoformas
mediante empalme alternativo, las cuales están implicadas en guiar los axones durante la
embriogénesis. El homólogo de ese gen en An. gambiae, AgDSCAM contiene cerca de 100
exones (cada exón codifica para un dominio de Ig) y en potencia puede generar por empalme
alternativo, más de 30,000 polipéptidos con especificidades diferentes de reconocimiento y
adhesión (Dong, 2006). Es importante hacer notar que esto no indica que sea un mecanismo
homólogo al de la selección clonal observado en el SIA, sin embargo revela una capacidad
para generar diversidad en el lapso ontogénico (un mosquito no vive más de un mes). Aún está
por definirse si la isoforma relevante ante un tipo de infección es seleccionada de cierta forma
y si una vez seleccionada, permanecen en el sistema o son inducidas en forma específica ante
el mismo reto.
Generación de diversidad mediante expansión de familias génicas: La duplicación

de genes involucrados en el reconocimiento de patógenos es un mecanismo para generar un
repertorio amplio de receptores con diferentes capacidades de reconocimiento. La duplicación
genética es un evento fundamental en la especiación y la generación de nuevas funciones, ya
que la función original del gen queda garantizada por el original, y la o las copias tienen menor
presión de selección y pueden variar “más libremente” (Kondrashov, 2002).
Aunque en muchos metazoarios se han descrito expansión de familias génicas involucradas

en el reconocimiento de patógenos, el caso del erizo de mar (equinodermo) es uno de los más
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dramáticos. El genoma del erizo contiene alrededor de 220 TLR (recordemos que el humano,
el ratón y Drosophila tienen una decena de TLR’s). Más aún, el genoma del erizo cuenta
con aproximadamente 200 receptores tipo NOD-LRR y un número similar de receptores
Scavenger, mientras que el genoma humano cuenta con 20 y 80, respectivamente (Rast, 2006).
Generación de diversidad mediante hipermutación somática: El caracol Biomphalaria

glabrata (molusco) contiene una familia de genes denominada FREP (Fibrinogen Related
Proteins) que contienen dos dominios de Ig y un dominio C-terminal tipo fibrinógeno. Los
genes que codifican a estas proteínas sufren mutación somática a una frecuencia mayor que
la de otros genes somáticos después de retos inmunológicos, lo cual ha sido propuesto como
un mecanismo para generar diversidad (Zhang, 2004). Los mecanismos moleculares mediante
los cuales se logra la hipermutación de FREP’s no se conocen, sin embargo no implica que
estén conservados a los mecanismos que median la hipermutación somática de receptores de
antígeno (maduración de afinidad) en vertebrados.
Recombinación somática en Agnatha: Las lampreas emplean un mecanismo de

recombinación somática análogo al empleado por los gnatostomados para generar un repertorio
variable de receptores de antígeno. Este sistema implica una familia de genes llamada VLR
(variable lymphocyte receptor) que codifica para receptores variables de membrana anclados
por GPI. La variabilidad se obtiene mediante recombinación somática de segmentos que
codifican para LRR en forma clonal. A diferencia de los re-arreglos génicos que generan
diversidad en Ig y RLT en vertebrados, los re-arreglos en lampreas no están mediados por las
recombinasas Rag (Pancer, 2004).
Especulaciones sobre el origen del SIA: El origen del SIA plantea un enigma desde la
perspectiva evolutiva porque pareciera que en los gnatostomados aparecieron de la nada los
siguientes elementos: 1) Un sistema de recombinación mediado por las recombinasas Rag 1 y
Rag 2. 2) Ancestros inmediatos del MHC, el RLT y el RLB. 3) Células similares a linfocitos, así
como un programa de regulación transcripcional y diferenciación al linaje linfoide. El aparente
surgimiento de estos elementos novedosos asociados al SIA ha llevado a la postulación de un
supuesto “Big Bang” inmunológico, el cual ocurrió hace aproximadamente 450 millones de
años (Marchalonis, 1998).
En la actualidad, gracias al estudio comparativo a nivel genómico de varias especies

representativas del reino animal han podido identificarse al ancestro de las recombinasas
Rag como algún miembro de la familia de los transposones transib, que están dispersos en
diversos protostomados (Kapitonov y Jurka, 2005). También se han identificado algunos genes
candidatos para precursores del MHC, RLB y RLT en protocordados (DuPasquier, 2004).
Una hipótesis interesante establece que previo al surgimiento de los vertebrados ocurrió una
duplicación genómica, que aumentó la complejidad de los organismos en términos de número
de genes y permitió la duplicación del MHC ancestral (Kasahara, 2004). Por último, el análisis
comparativo de los factores de trascripción involucrados en la diferenciación del linaje linfoide
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sugiere que todos los elementos requeridos para el desarrollo de linfocitos estaban presentes en
agnatos (Rothenberg y Pant, 2004). En síntesis, el surgimiento del SIA ocurrió gradualmente
mediante la apropiación de genes con funciones preexistentes, así como la generación de
nuevas funciones resultantes de la duplicación génica y combinación de dominios (Klein y
Nikolaidis, 2005).
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174
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Participación de la ceramida en la implantación
embrionaria
Dr. Román Espinosa Cervantes

Dr. Adolfo Rosado García
La implantación del embrión en el útero es un proceso complejo y su fracaso es considerado

un impedimento para que se lleve a cabo el embarazo (Skaznik-Wikiel et al., 2006). Las fallas
en el desarrollo embrionario han sido atribuidas a una gran variedad de factores, que incluyen;
la calidad del embrión, sin embargo, otros autores sugieren que es la insuficiencia lútea o
la disrupción endocrina, las causantes de las fallas en el desarrollo embrionario (Dey et al.,
2004). Debido a esto, en los últimos años, se han incrementado los estudios epidemiológicos
en humanos y los estudios genéticos en los roedores. La falla en el desarrollo embrionario,
también ocurre debido a la defectuosa función uterina o a la mala comunicación entre el
embrión y madre poco antes de la placentación. En las especies que presentan implantación
invasiva como en los humanos y los roedores, el compartimento estromal del endometrio
sufre un dramático cambio durante el inicio de la gestación, que involucra la proliferación,
crecimiento y diferenciación de las células estromales residentes en las células poliploides de la
decidua (Kaneko-Tarui et al., 2007).
Recientemente se ha estudiado el papel de los factores de crecimiento, citocinas, genes

homeóticos, factores de transcripción y lípidos mediadores en las interacción embrión-útero
durante la implantación (Dey et al., 2004). Además, se ha reportado una correlación de eventos
en el útero durante el inicio de la implantación por metabolitos de esfingolípidos en otros
sistemas y órganos, por lo que se ha sugerido que el metabolismo de los esfingolípidos provoca
en el útero, el desarrollo de la decidualización. Los esfingolípidos juegan un papel importante
en la angiogénesis, migración celular, apoptosis, regulación de la secreción de materiales
extracelular, señales de transducción, inmunomodulación y diferenciación celular (Kaneko-
Tarui et al., 2007).
Estudios recientes ha demostrado el papel de los esfingolípidos en la regulación de la

sobrevivencia de las células germinales de la ratona. Particularmente la esfingosina-1-fosfato
previene la muerte inducida por la doxorubicina en los ovocitos cultivados de la ratona, en la
quimioterapia y la apoptosis inducida por la radiación en ovocitos in vivo (Suomalainen et al.,
2003; Savtchouk et al., 2007).
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Participación de la ceramida en la implantación embrionaria
En el presente estudio, describimos la expresión uterina y la regulación de enzimas importantes

que coordinan la ínterconversión de los metabolitos de los esfingolípidos (es decir, ceramida,
esfingosina, esfingomielinasa ácida y esfingosina-1-fosfato [S1P]) durante la fase de
implantación y al inicio de la gestación.
Esfingolípidos
En las células de los mamíferos, la esfingosina es el esfingolípido más común, mientras que
en las levaduras y células de las plantas, la fitoesfingosina es la más común. La biosíntesis de
los esfingolípidos (Figura 1) inicia con la condensación de serina y palmitoil CoA que forman
3-cetoesfingosina qué a su vez sufre la reducción a dihidroesfingosina. Un grupo acil graso es
agregado por una unión amida para formar dihidroceramida que se convierte directamente
a ceramida el precursor de todos los esfingolípidos, por la introducción de una doble ligadura
trans entre los carbonos 4 y 5 de la base esfingoide (Merrill y Jones, 1990).
Inhibidor
Fumonisina
Serina +
B1 Palmitoil-CoA Esfingomielina Complejo
Serina Esfingolípidos
Palmitoiltransferasa EMasa Fosfatidilcolina
Dihidroesfingosina Glucosilceramida
Ceramida Sintasa
Dihidroceramida Glucosilceramida
Sintasa
Esfingosina 1 Fosfato Esfingolípidos Ceramida Diacilglicerol PA

Diacilglicero
Esfingosin Ceramidas Esfingomielin
l
a a a
Cinasa
Receptores Cinasa Proteína PF1/PF2a/ SintasaProteína cinasa PF1/
Edg Cinasas Catepsina D Chimaerins Raf1
Angiogénesis Apoptosis Promoción Mitogénesis

Anti-apoptosis Senescencia Tumoral
Hannun y Obeid,
Figura 1. Biosíntesis de esfingolípidos. La síntesis de novo de ceramida se lleva a cabo en el retículo

endoplásmico. La síntesis de esfingomielina, glucosilceramida y glicoesfingolípidos de ceramida
Hannun y O beid, ocurre
en el aparato de Golgi, aunque la degradación de los glicoesfingolípidos y esfingomielina
2002 a ceramida y
esfingosina ocurre en los lisosomas.
Diferentes grupos radicales se agregan a la ceramida para formar esfingolípidos más complejos,
sin embargo uno de los más simples es la ceramida-1-fosfato formada por la ceramida cinasa. Los
grupos radicales más complejos incluyen a cerebrósidos β-glicosídicamente unidos a la glucosa
176
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Dr. Román Espinosa Cervantes y col.
- o a la galactosa, la adición de un grupo sulfato a la galactosilceramida produce sulfatides y

di-, tri- y tetra-glicosilceramidas ahora conocidos como glicoesfingolípidos. Los gangliósidos
son una subclase de glicoesfingolípidos identificados por la presencia del ácido siálico en el
grupo radical del hidrato de carbono (Huwiler et al., 2000). La adición de fosforilcolina a la
ceramida, transferida de la PC por la esfingomielina sintasa, forma la esfingomielina. Los liso-
esfingolípidos, N-deacilado como el 1-galactosilesfingosina, glucosilesfingosina, esfingosina-1-
fosfato y lisoesfingomielina. Estos esfingolípidos están presentes en muy bajas concentraciones
pero pueden tener efectos importantes en la señalización como segundos mensajeros, e.g. la
esfingosina-1-fosfato, o a través de su efecto lítico desestabilizando la membrana (Ohanian y
Ohanian, 2001).
Muy recientemente se han reportado una correlación de eventos en el útero durante el inicio
de la implantación por metabolitos de esfingolípidos en otros sistemas y órganos, por lo que
se ha sugerido que el metabolismo de los esfingolípidos provoca en el útero desarrollo de la
decidualización. Además, los esfingolípidos juegan un papel importante en la angiogénesis,
migración celular, apoptosis, regulación de la secreción de materiales extracelular, señales de
transducción, inmunomodulación y la diferenciación celular (Kaneko-Tarui, 2007).
Decidualización del útero
La implantación embrionaria es una serie compleja de procesos que establecen la conexión

entre los tejidos maternos y embrionarios, que requieren de un programa intrincado de
preparación uterina. Muy poco después de la implantación que ocurre en la ratona en el
día 4.5 postcoito (pc) (día 0.5 - tapón vaginal), la células estromales del endometrio rodean la
implantación del blastocisto y sufren una dramática transformación (decidualización) durante
la cual proliferan y se diferencian en células de la decidua. La decidualización inicia en la
región estromal que rodea inmediatamente al embrión (sitio antimesometrial). Después de la
implantación del blastocisto, se forma una capa delgada y densa de células avasculares, llamada
zona decidual primaria. Adyacente a la zona decidual primaria, la zona decidual secundaria
está totalmente desarrollada el día 6.5 pc, y es caracterizada por una decidua poliploide
terminalmente diferenciadas, con adquisición de células grandes mono y del binucleadas (Tan
et al., 2002). La decidua provee una red vascular para la nutrición e intercambio de gas para el
desarrollo embrionario antes de que se establezca el funcionamiento de la placenta. Además,
actúa como una barrera a la descontrolada proliferación del trofoblasto. La decidualización
uterina es un proceso que ocurre en respuesta a la implantación embrionaria, es crítica para
la sobrevivencia del embrión y es esencial para que se lleve a cabo la gestación (Mizugishi
et al., 2007). La decidualización forma la decidua que por definición es un tejido secretorio
que produce una amplia variedad de moléculas señalizadoras endocrinas y paracrinas, como
prolactina, interleucinas, citocinas, y prostanoides. Además, algunas de las funciones conocidas
de la decidua son acciones inmunosupresivas, control del crecimiento trofoblástico y migración
celular, muerte celular programada para la expansión del trofectodermo y también provee una
red vascular para el intercambio de nutrientes para el embrión poco antes de que se forme la
placenta (Skaznik-Wikiel et al., 2006).
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Recientemente se ha reportado que la ruta metabólica de los esfingolípidos es muy activa en

la decidua durante la gestación normal. La perturbación en la activación de la vía por la
ruptura de los genes esfingosina cinasa (Sphk), provoca defectos en la decidualización y severos
daños en los vasos sanguíneos uterinos, conduciendo a la pérdida de la gestación. Ratonas
deficientes en (Sphk1–/– Sphk2+/–) muestran enorme acumulación de dihidroesfingosina y
esfingosina, así como también, una reducción de los niveles de fosfatidiletanolamina (PE)
en el útero gestante. Las hembras también mostraron incremento de células muertas en
las células de la decidua, disminución en la proliferación celular en las células estromales
indiferenciadas y ruptura de los vasos sanguíneos de la decidua, que provocaron hemorragia
uterina y muerte en los embriones. Por lo que se puede proponer que el metabolismo de
los esfingolípidos regula de forma correcta la decidualización uterina y la estabilidad de los
vasos sanguíneos. Esto sugeriría que una ruptura en el metabolismo de los esfingolípidos
puede ser considerado como una causa de pérdida de la gestación en los humanos (Tilly y
Kolesnick, 2003; Mizugishi et al., 2007).
Ceramida
Las ceramidas son lípidos biológicamente importantes, derivados de la formación de la unión

entre un péptido, una esfingosina y un ácido graso. Las ceramidas están implicadas en la
apoptosis de dos maneras. Primero, ellas trasmiten la señal apoptótica hacia los receptores
de señalización apoptótica, como el receptor 1 del factor de necrosis tumoral (TNFR1),
las caspasas, cinasas dependientes de ciclinas, telomerasas en la membrana mitocondrial
(Ogretmen y Hannun, 2004). Segundo, ellas pueden participar directamente en la apoptosis
formando grandes canales (proteína-permeables) que habilitan la liberación del citocromo c de
la mitocondria el cual dispara las caspasas (Siskind et al., 2005). Además, las ceramidas pueden
formar las balsas de lípidos en la membrana plasmática que lleva a los Fas y el TRAIL (ligando
relacionado al TNF que induce apoptosis) receptor que se agrupa y refuerza la señalización
apoptótica (Cremesti et al., 2001). Un gran número de enzimas están involucradas en el
metabolismo de las ceramidas. Sin embargo, las esfingomielinasa neutra y ácida (nSMases
y aSMases que convierten esfingomielina a ceramida), la ceramidasa ácida (qué convierte la
ceramida a esfingosina) y enzimas como la dihidroceramida desaturasa (DHCD), las cuales
median la síntesis de novo de las ceramidas de dihidroceramida, han sido específicamente
implicadas en el bloqueo de la apoptosis dependiente de ceramida (Figura 2). Es conocido
desde hace mucho tiempo que los ovocitos sin fertilizar están programados para sufrir apoptosis
después de varias horas y que la concentración de ceramida en los ovocitos es superior, al
que se ha reportado en células circundantes. Además se han reportado incrementos en los
niveles de ceramida en los ovocitos viejos y que después sufren apoptosis (Eliyahu et al. 2007;
Savtchouk et al., 2007).
Pérez y colaboradores (1995), determinaron la sensibilidad a ceramida, micro inyectando

(C16) ceramida en ovocitos de ratonas jóvenes y viejas para inducir apoptosis y que está se
incrementaba con la edad. Estos mismos autores plantearon que posiblemente las diferencias
en la respuesta a ovocitos de ratonas jóvenes y viejas a una ceramida citosólica es que los
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TNFR 1 Cer
Cer EM
nSMase NSD
FAN Ceramidasa
Ácida
Bax aEMasa
nEMasa EM
Caspasa-3
Cer
Mitocondria
Poro de
ceramida Catepsin D Esfingosina
Lisosoma
Cer itocondría
DH-Cer
DHCD
r
Síntesis de novo Bid

Bid (Truncado) Mit
oco
ndr
ía
Fas aEMasa Agrupamiento
Trail
EM Cer
Casquete Fas TRAIL
Figura 2. Algunas vías apoptóticas que involucran a la ceramida (Cer). La señal de muerte se activa
externamente vía los receptores como TNFR1, Fas, y TRAIL, o internamente (radiación ionizante, falta
de nutrientes, etc.). Las enzimas que controlan la concentración de ceramida representan blancos
terapéuticos. Éstas incluyen enzimas involucradas la producción de ceramida [nEMasa/aEMasa
(esfingomielinasa neutra/ácida) y DHCD (dihidroceramida desaturasa)] y en su desglose (ceramidasa
ácida). DH, dihidroceramida; FAN, factor asociado con la nEMasa; NSD, dominio que interactúan con
EMase neutra; EM, esfingomielina.
ovocitos de las ratonas viejas desarrollan una elevada respuesta a la ceramida exógena debida
a una prolongada deficiencia en la ceramida endógena (Figura 3.) (Pérez et al., 2005).
Ceramidasa ácida
La ceramida es un lípido de señalización que se produce en respuesta a varios estímulos.

Normalmente está presente en bajas concentraciones, por lo que en respuesta a estos estímulos
la ceramida es producida rápidamente en la superficie celular, provocando la reorganización
de la membrana y señalizando la para producir la apoptosis. Después de la estimulación, la
ceramidasa ácida (CA) y/o otras ceramidasas pueden hidrolizar la ceramida en ácidos grasos
individuales y componentes de esfingosina. Debido a que la degradación de ceramida es la
única fuente de esfingosina intracelular, estas enzimas también pueden limitar la proporción
y determinar el nivel intracelular de este compuesto. Pretenciosamente, un derivado de la
esfingosina, la esfingosina-1-fosfato (S1P), puede neutralizar los efectos apoptóticos de la
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Ratonas jóvenes Ratonas viejas
Ovocito Ovocito
Niveles de Niveles de
- ceramida altos - ceramida altos

- mRNA bax bajos - mRNA bax altos
- proteína bax bajos - proteína bax altos
Células del cumulus Células del cumulus
- niveles de - niveles de
ceramida muy ceramida muy alto
bajos
- Envejecimiento por estrés
Ratonas viejas
Ovocito
Incremento en los Niveles

Figura 3. Los niveles de
ceramida, mRNA bax y proteína
bax cambian con el
- ceramida
envejecimiento. El - mRNA bax
envejecimiento por estrés - proteína bax
dispara aceleradamente la
apoptosis, la cual puede ser Células del cumulus
bloqueada por S1P.
- niveles de
ceramida bajos
S1P
Apoptosis acelerada
(Pérez et al., 2005)
180
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ceramida, esto ha sugerido que las ceramidasas pueden ser un “reostato” que mantenga un
equilibrio apropiado entre el crecimiento y la muerte celular. Los ovocitos ovulados sufren
cambios moleculares característicos de la apoptosis a menos que ocurra una fertilización
exitosa. Mientras que múltiples factores, incluso la ceramida, se han caracterizado como
elementos proapoptóticos involucrados en este proceso, poco es conocido sobre los factores
que mantienen a los ovocitos o a la supervivencia del embrión. Por lo que se ha propuesto
evidencias que demuestran que la CA es uno de los factores que participan de forma
importante en la supervivencia del embrión temprano. Desde hace algunos años se usó el gen
designado para inactivar al gen de la CA (Asah1) en la ratona. La caracterización inicial de
estos animales reveló que las ratonas heterozigotas (Asah1±) tenían una enfermedad fenotípica
que almacenaba lípidos progresivamente y que completamente perdían la CA llevando esto
a la ausencia en individuos mutantes. En este mismo estudio se observó que los niveles de
ceramida se encontraban aumentados en ovocitos viejos y que después llegaban a la apoptosis,
es razonable suponer que la CA, una enzima responsable para la hidrólisis de la ceramida y
producción de esfingosina (el precursor de S1P), podría ser un factor esencial requerido para
la supervivencia del embrión. Estos mismos autores suponen que la ausencia de la actividad
de CA, el nivel de ceramida en embriones de 2-células Asah1, se incremente, provocando la
apoptosis. Esta hipótesis es fuertemente apoyada por datos que muestran que S1P, antagoniza
a la ceramida y que rescata embriones Asah1 -/- y permite su supervivencia a estados de 4–8
células. El mecanismo propuesto de cómo actúa la CA es removiendo el exceso de ceramida
del embrión y esto previene la inducción de la apoptosis por la ceramida. Por el contrario,
embriones “knockout” que carecen del gen CA no transcriben CA a los estados de dos células,
y por lo tanto estos embriones sufren apoptosis (Eliyahu et al., 2007; Savtchouk et al., 2007).
Esfingosina-1-fosfato
La ceramida también puede producirse de novo por la ceramida sintasa. Dependiendo del
tipo de célula, la ceramida sintetizada a través de cualquier vía puede ser utilizada como una
respuesta a estrés para inducir muerte celular. Alternativamente, la ceramida también puede
ser metabolizada por las ceramidasas a esfingosina la cual es fosforilada por la esfingosina
cinasa para generar esfingosina-1-fosfato (S1P) que inhibe la apoptosis (Figura 4.) La S1P actúa
como un ligando extracelular para una familia de receptores acoplados a proteína-G (receptor
del gen de diferenciación endotelial), así como también, a un segundo mensajero intracelular
que induce proliferación celular y sobrevivencia. La S1P inhibe los eventos citoplásmicos y
nucleares que conducen a la apoptosis, proporcionando así protección de la activación de
muerte celular en múltiples puntos de la red reguladora de la apoptosis. Por consiguiente, ha
sido propuesto que un equilibrio metabólico intracelular entre la ceramida y la producción de
S1P contribuyen a la decisión de si una célula vivirá o morirá (Morita et al. (2000).
Estos mismos autores demostraron que la administración in vivo de S1P protegió los ovocitos
de los folículos primordiales de los efectos deletéreos de la radiación, la causa de la falla
ovárica prematura y la infertilidad en los pacientes de cáncer. En ratonas que recibieron
S1P conservaron una distribución normal de folículos con ovocitos dos semanas después de
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Esfingosina cinasa
esfingomielinasa ceramidasa P
Hidrólisis Metabolismo Fosforilación
Esfingomielina Ceramida Esfingosina S1P
Bax
Apoptosis
Radiación
Quimioterapia
Desarrollo
Casper y Jurisicova (2000)
Figura 4. Vía de la esfingosina a la muerte celular en ovocitos. La hidrólisis de la esfingomielina por la

esfingomielinasa genera ceramida. En los ovocitos, la ceramida induce muerte celular, probablemente
a través del factor proapoptótico BAX. La ceramida también puede metabolizarse esfingosina por la
ceramidasa. La fosforilación de esfingosina genera S1P que tiene efectos anti-apoptóticos. Se cree que
la S1P inhibe la apoptosis previniendo la expresión de BAX. La radiación, quimioterapia y programas de
desarrollo pueden inducir apoptosis en los ovocitos y la S1P inhibe la muerte celular en todos casos.
la radiación. Estos mismos autores también encontraron que los ovocitos rescatados por el
tratamiento de S1P pueden desarrollarse morfológicamente en embriones normales. Sin
embargo, no se sabe si estos embriones se desarrollan y llegan a término normalmente. Es
probable que los embriones que presentan más daño en el ADN producto de la radiación no
lleguen a la fase de implantación y desarrollo. Sin embargo los embriones normales producirán
recién nacidos saludables (Morita et al., 2000; Casper y Jurisicova, 2000).
En otro estudio se demostró que la S1P juega un papel importante en protección de ovocitos
de bovino del choque calórico. En particular, los ovocitos cultivados con S1P bajo condiciones
de choque calórico no experimentaron reducción en la tasa de degradación y posteriormente
se desarrollaron a estado de blastocisto, como ovocitos cultivado sin S1P. Además, la inhibición
de la síntesis de S1P provocada por adición de N1N-dimetilesfingosina (DMS) reduce o tiende a
reducir la proporción de ovocitos que sufre degradación y posteriormente se desarrollan incluso
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en ausencia de choque calórico, esto sugeriría que la S1P está directamente o indirectamente
involucrada con procesos que llevan a la maduración de los ovocitos. Es probable que los efectos
termoprotectores de la S1P sean el resultado de una acción antiapoptótica de la S1P. La apoptosis
mediada por caspasas es una vía importante para la ruptura y la capacidad de desarrollo de
ovocitos bovinos causada por el choque calórico y la S1P bloquea la apoptosis de los ovocitos en
la ratona inducida por la doxorubicina y la radiación (Tabla 1.) (Roth y Hansen, 2004).
Tabla 1. Número total de células y porcentaje de blastómeros que fueron positivos a TUNEL en blastocistos
desarrollados de ovocitos madurados durante 12 horas a 38.5 a 41.0 °C en presencia o ausencia de
esfingosina-fosfato (S1P)
Temperatura (°C) Numero total de Porcentaje de

Medio N células blastómeros
Positivos a
TUNEL
38.5 Vehiculo 14 129 ± 145 6.6 ± 2.8
38.5 S1P 23 131 ± 14 8.5 ± 2.8
41.0 Vehiculo 11 122 ± 14 4.4 ± 2.8
41.0 S1P 25 109 ± 14 4.1 ± 2.8
Datos representan el SEM.
Durante el desarrollo normal de los ovocitos precede la apoptosis a menos que la fertilización
ocurra. Entre el complejo de vías reguladoras que se necesitan para controlar este delicado
balance entre la muerte y supervivencia, la señalización de los esfingolípidos es un componente
importante. De hecho, la acumulación de ceramida en ovocitos viejos ha mostrado conducir
a la apoptosis y los lípidos antiapoptóticos, como la S1P, que pueden neutralizar los efectos de
la ceramida y pueden promover la supervivencia de los ovocitos. Otros cambios fisiológicos
en los ovocitos sin fertilizar y en los embriones, son la oscilaciones de Ca2+, también son
componentes importantes de esta decisión reguladora. En la fertilización, los ovocitos jóvenes,
saludables deben proporcionar proteínas antiapoptóticas y mRNA suficiente a los embriones
recientemente formados para superar la vía apoptótica predefinida. Posteriormente el embrión
recientemente formado debe proporcionar estos factores a través de la expresión de su propio
genoma, activación del genoma embrionario (EGA). En la ratona, la activación del EGA es
durante la fase de 2-células mientras que en los humanos el evento de activación mayor ocurre
entre las 4-8-células. Aunque los factores antiapoptóticos deben estar entre la relación genes /
proteínas expresados en la EGA, sorprendentemente, muy pocos factores se han identificado
hasta la fecha. Consistente con las evidencias anteriormente mostradas, de que el aumento de
los niveles de ceramida en los ovocitos viejos conduce a la apoptosis, es razonable suponer que
la CA, es una enzima responsable de la hidrólisis de ceramida y la producción de esfingosina (el
precursor de S1P) y podría ser un factor esencial requerido para la supervivencia del embrión
(Spiegel y Kolesnick, 2002; Eliyahu et al., 2007).
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Otra explicación que podría responder la presencia de los esfingolípidos en la decidua al inicio
de la gestación, es que los derivados de los esfingolípidos en el útero pueden servir como una
fuente de nutrientes para el embrión en ausencia de una placenta funcional.
Es necesario realizar estudios a futuro para medir el contenido de cada una de estas moléculas
de esfingolípidos, así como también, la actividad de cada una de las enzimas involucradas en
el proceso. Los experimentos como éstos, serán de gran utilidad para delinear cuales de las
moléculas de señalización de los esfingolípidos son críticas para el desarrollo de la gestación. Para
establecer el uso potencial de la ceramidasa ácida, para prolongar la sobrevivencia del ovocito/
embrión durante los procedimientos de fertilización in Vitro (FIV), facilitando la identificación
y selección de embriones sanos para reimplantación, especialmente en mujeres de avanzada
edad reproductiva. En conclusión, estos hallazgos establecen el papel tan importante que tiene
la ceramidasa ácida, en los estados tempranos de la embriogénesis de los mamíferos y sugiere
que la enzima y/o los genes pueden ser utilizados para facilitar la sobrevivencia del ovocito/
embrión tanto in vitro como in vivo.
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Desacoplamiento mitocondrial en diabetes tipo 2

Introducción
Los procesos patológicos en los cuales la disfunción mitocondrial tiene gran relevancia,
incluyen la recuperación del tejido isquémico (corazón, cerebro y riñón), enfermedades
neurodegenerativas (Parkinson, Alzheimer, esclerosis lateral amiotrófica), padecimientos
relacionados con el envejecimiento y diabetes (Cooper and Schapira, 1997).
La producción de especies reactivas del oxígeno (ERO) por la cadena transportadora de

electrones, se considera un proceso central en la fisiopatología celular. Se estima que más del
1 % del flujo de electrones mitocondriales conduce en condiciones normales a la formación
de anión superóxido (O2.-), el principal radical libre que se genera en la mitocondria, por
lo que cualquier alteración en el transporte de electrones aumenta de forma importante su
producción (Olivares-Corichi et al., 2007)
Las ERO tienen una función muy importante en diversos procesos biológicos, por ejemplo,
en la acción antimicrobiana de células fagocíticas (neutrófilos, monocitos, macrófagos,
eosinófilos), vía NADPH oxidasa; como segundos mensajeros de ligandos específicos (factores
de crecimiento) y como reguladores de algunos factores transcripcionales como NF-kb (Hoidal,
2001). Sin embargo un exceso de ERO es capaz de oxidar diversas biomoléculas (lípidos,
carbohidratos, proteínas y ácidos nucleicos) y promover de esta manera daño tisular. Por esta
razón, las células poseen sistemas que controlan fisiológicamente su producción y/o limitan
su capacidad de daño; de no ser así, alteraciones entre la producción de ERO y las defensas
celulares, generan un estado conocido como estrés oxidante, el cual resulta en disfunción y
muerte celular (Ortega-Camarillo et al., 2001; Ortega-Camarillo et al., 2006).
En condiciones de hiperglucemia se incrementa el flujo de electrones de la cadena respiratoria

mitocondrial, lo cual provoca la hiperpolarización de la membrana y la formación de ERO.
La energía celular y la función de la membrana mitocondrial en respuesta a glucosa, están
reguladas en parte por un grupo de proteínas, localizadas en la membrana externa mitocondrial
denominadas “proteínas desacoplantes” (UCPs). Las UCPs son transportadoras de la
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membrana interna mitocondrial que controlan el estado de acoplamiento de la respiración

para la síntesis de ATP, también coadyuvan en la defensa antioxidante mitocondrial a través
del desacoplamiento fisiológico que acelera el metabolismo y disminuyen la producción de
ERO con la subsiguiente disminución del estrés oxidante (Nedergaard and Cannon, 2003).
La disfunción de las células b pancreáticas en DT2, se cree es consecuencia de una mayor

exposición a glucosa (glucotoxicidad) y/o a lípidos (lipotoxicidad), eventos frecuentemente
asociados con obesidad y resistencia a la insulina (Schrauwen and Hesselink, 2004). Se han
propuesto diversas hipótesis para tratar de explicar porqué estas condiciones modifican las
funciones de las células b. Una de estas hipótesis se discutirá en este trabajo, la cual se enfoca
a los cambios en la expresión, regulación y función de UCPs. Para una mejor comprensión de
la función de estas proteínas, es necesario revisar algunos aspectos relevantes del metabolismo
oxidante mitocondrial y de la producción de especies reactivas de oxígeno.
1. Mitocondria
La mitocondria es un organelo citoplasmático de características muy especiales, quizá debido

a su origen endosimbiótico, que la convierten en un componente importante en la vida de
la célula. Estructuralmente la mitocondria presenta dos compartimentos bien definidos,
matriz y espacio intermembranal, delimitados por dos membranas, interna y externa, con
características morfológicas y funcionales bien definidas (Gottlieb, 2000; Gray et al., 1999).
Uno de los eventos fisiológicos más importantes en la mitocondria es la generación de un
potencial de membrana a través de su membrana interna, como consecuencia directa de
reacciones bioquímicas que constituyen la cadena respiratoria, en la que participan como
substratos el piruvato, algunos aminoácidos, y los productos de la β-oxidación de ácidos grasos
que entran al ciclo de Krebs y mantienen el estado reducido de las coenzimas dinucleótido
de nicotinamida y adenina reducido (NADH) y dinucleótido de adenina-flavina reducido
(FADH2). La cadena respiratoria aporta los electrones que eventualmente son transferidos al
oxígeno, también se transfieren protones que cruzan la membrana interna mitocondrial, los
cuales generan un gradiente que se expresa como potencial de membrana mitocondrial, con
un valor entre 150 - 180 mV, con carga negativa con respecto al citosol (Hicks et al., 2007).
El flujo de electrones a través de la cadena respiratoria mitocondrial se lleva a cabo por 4

complejos enzimáticos anclados a la membrana, junto con el citocromo c y la coenzima Q
(CoQ). El NADH proveniente del ciclo de Krebs dona electrones al complejo I, éste a su vez
los transfiere a la CoQ , la cual se encuentra en estado reducido por los electrones donados
por varias deshidrogenasas que contienen FADH2, como la succinato-ubiquinona reductasa
(complejo II). Los electrones de la CoQ son transferidos al complejo III. Posteriormente pasan
a través del citocromo c, al complejo IV y finalmente al oxígeno molecular. La transferencia
de electrones a través de los complejos I, III y IV genera un gradiente de protones/voltaje.
Gran parte de la energía de este gradiente, es utilizada para producir ATP a través de la ATP
sintasa (complejo V). Así mismo esta energía puede ser disipada en forma de calor a través de
las proteínas desacoplantes (UCPs). Cuando hay una sobrecarga de protones, el transporte de
188
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Dra. Clara Ortega Camarillo y col.
electrones en el complejo III se inhibe parcialmente y promueve el retorno de electrones a la

CoQ y su donación al oxígeno molecular, facilitando así la producción de anión superóxido
(Duchen, 2004) (Figura 1).
Fig. 1. Flujo de electrones y protones en la cadena respiratoria mitocondrial. La coenzima Q (CoQ) cap-
tura electrones vía complejo I y II, y los trasfiere al complejo III, posteriormente pasan al citocromo c. El
complejo IV pasa los electrones del citocromo c reducido al oxigeno. La activación de las UCPs evita el
paso de electrones por la ATP sintasa y disminuye la producción de ATP y favorece la liberación de calor.
De forma adicional a la provisión de ATP, la mitocondria participa en eventos importantes

de la fisiología celular. Estos incluyen vías de transducción como la secreción de insulina en
respuesta a glucosa por las células b y como sensor de tensión de oxígeno en la carótida y la
vasculatura pulmonar. Hace un par de décadas se destacó su importancia para la inducción de
la muerte celular programada, por lo que actualmente se sitúa a la mitocondria como el punto
donde convergen diferentes vías de señalización apoptótica. En este organelo los cambios
en la permeabilidad de sus membranas, controlan la liberación de proteínas (citocromo c
y el factor inductor de apoptosis, entre otras), que activan diferentes rutas de señalización
necesarias para la inducción de la muerte programada de la célula (Ortega-Camarillo et al.,
2001). La mitocondria también alberga enzimas limitantes de la biosíntesis de esteroides, del
grupo hemo y la anhidrasa carbónica, además de las enzimas necesarias para el metabolismo
intermediario. Así mismo el desacoplamiento fisiológico de la mitocondria vía UCPs, tiene
una función crucial como mecanismo generador de calor en la termogénesis de los mamíferos
pequeños (Tornero and Jordán, 2004).
2. Especies reactivas del oxígeno y estrés oxidante
El término radical libre se aplica a especies químicas que contienen uno o más electrones no
apareados, ya sea por pérdida o ganancia de ellos. La presencia de electrones no apareados
modifica la reactividad química de un átomo o de una molécula y la hace generalmente más
reactiva que su correspondiente “no radical”. Sin embargo, la reactividad química de los
189
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diferentes tipos de radicales libres es muy variable (Halliwell and Gutteridge, 1992; Olivares-
Corichi et al., 2007)
La mitocondria ha sido propuesta como la fuente principal de ERO. Como se mencionó antes,
de forma paralela a la reducción del O2 hasta H2O por la citocromo c oxidasa en la cadena
transportadora de electrones, tiene lugar la reducción, no enzimática y monoelectrónica del
O2 molecular, dando lugar a la formación de anión superóxido (O2.-). De forma adicional, el
anión superóxido puede dar origen a otras especies reactivas como el peróxido de hidrógeno
(H2O2), el radical hidroxilo (HO.) y el peroxinitrito (ONOO-) (Olivares-Corichi et al., 2007).
Existen otras fuentes de ERO en el organismo, por ejemplo el O2.- se produce durante la
fagocitosis para la destrucción de microorganismos extraños (Zentella and Saldaña, 1996). El
radical HO.. se origina como consecuencia de la interacción de radiaciones electromagnéticas
de baja longitud de onda con el agua o por el rompimiento del ONOOH y por la reacción de
Fenton. Este radical tiene la propiedad de interactuar prácticamente con cualquier molécula.
Las especies reactivas de oxígeno generadas por el metabolismo normal existen en

concentraciones muy bajas, de 1x104 a 1x109 M; no viajan muy lejos de los sitios en los que
se forman, debido a que su vida media no sobrepasa los microsegundos. Cuando las ERO
reaccionan con una molécula, pueden dar origen a otras especies reactivas y desencadenar
una reacción en cadena autocatalítica, por ejemplo durante la peroxidación de ácidos
grasos poliinsaturados, de tal manera que la especie reactiva secundaria y los productos de
la degradación oxidativa tienen efectos amplificados a distancia del sitio de origen (Hoidal,
2001). Por lo que la existencia de un control interno que mantenga en un rango fisiológico las
concentraciones de estos radicales es de vital importancia. El desbalance entre los factores pro-
y antioxidantes está asociado con el desarrollo de diversas patologías como diabetes, cáncer y
aterosclerosis, entre otras (Figura 2) (Halliwell, 1994).
Fig. 2. Especies reactivas del oxigeno y sistemas antioxidantes.
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3. Sistemas antioxidantes.
Los antioxidantes se pueden clasificar con base en su estructura y función biológica en: 1)
enzimáticos, como la glutatión peroxidasa, la catalasa y la superóxido dismutasa y; 2) no
enzimáticos, como las vitaminas C y E, el b-caroteno, el ácido úrico y la bilirrubina, entre otros.
Enzimáticos: El más importante es la superóxido dismutasa (SOD), enzima encargada de

catalizar la dismutación del anión superóxido, con la subsecuente formación de peróxido
de hidrógeno, aunque el H2O2 puede constituir un problema aún más grave para la célula,
ya que en presencia de metales (reacción de Fenton), propicia la formación del radical HO.;
para evitarlo entran en acción otras enzimas como la catalasa presente en los peroxisomas,
que transforma dos moléculas de H2O2 en dos moléculas de agua y oxígeno molecular. Otro
grupo de enzimas antioxidantes lo constituyen las peroxidasas, de éstas la más importante en
el mamífero es la glutatión peroxidasa que cataliza la formación de agua y glutatión oxidado
a partir de peróxidos.
No enzimáticos: En este grupo destaca la vitamina E, la cual en el ser humano protege

contra la lipoperoxidación, al actuar de manera directa con varios radicales entre los que se
incluyen el HO., el O2.- ; la vitamina C interactúa con los mismos oxirradicales, pero además es
capaz de regenerar el a-tocoferol a su estado activo (Olivares-Corichi et al., 2007).
Estrés oxidante en las células b pancreáticas
El origen del estrés oxidante en las células b por hiperglucemia, se atribuye principalmente
al aumento de las vías glucolíticas y por lo tanto de NADH+. Estos eventos favorecen la
interacción del oxígeno molecular con electrones no pareados producidos vía respiración
mitocondrial, lo que resulta en la formación de ERO (Duchen, 2004). Sumado a esto, el
aumento de Ca2+ intracelular necesario para la exocitosis de la insulina, también contribuye
a la formación de ERO; estas moléculas se proponen como responsables de la disfunción de
las células b y de alteraciones en la síntesis y secreción de insulina (Robertson et al., 2003), así
como de la acumulación de metabolitos altamente reactivos capaces de unirse a proteínas y
generar estrés oxidante (Díaz-Flores et al., 2004; Fridlyand and Philipson, 2004).
Alterno a la producción de ERO vía respiración mitocondrial, se ha observado que la secreción

de insulina dependiente de glucosa causa estrés oxidante en las células b pancreáticas. En
presencia de glucosa, la relación entre las concentraciones intracelulares de ATP/ADP
aumenta e induce el cierre de los canales de K+ sensibles a ATP (KATP), lo que provoca la
despolarización de la membrana plasmática, la entrada de Ca2+ extracelular y la activación de
la exocitosis. También se ha observado que el incremento en las concentraciones de glucosa
disminuye la concentración de ADP libre, está disminución en un rango fisiológico puede
ser suficiente para cerrar los canales de KATP aún a concentraciones constantes de ATP, el
decremento de ADP también puede disminuir la producción de ATP, lo que en su momento
incrementa el potencial de membrana mitocondrial y la producción de ERO. Aparentemente
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esta respuesta es una propiedad exclusiva del acoplamiento estímulo-secreción de las células
b. De acuerdo con esta hipótesis, la activación de la secreción de insulina inducida por glucosa
tiene una función dual: primero, aumenta la secreción de insulina y segundo, incrementa el
estrés oxidante (Fridlyand and Philipson, 2004). Esto se traduce en que la tasa de secreción de
insulina podría eventualmente tener efectos negativos sobre la propia producción de insulina.
De lo anterior se puede concluir que al menos 3 estados durante la secreción de insulina
(aumento del flujo glucolítico, disminución de ADP y aumento de Ca2+ intracelular) pueden
exacerbar la formación de ERO, lo cual puede explicar por qué las células b son quizás las
únicas que tienen un mayor riesgo de daño por estrés oxidante y apoptosis (Grankvist et al.,
1981). La secreción de insulina inducida por glucosa contribuye al incremento en la producción
de ERO en las células b, lo que sugiere que las ERO son parte del mecanismo de señalización
para la secreción de insulina, sin embargo el incremento en la síntesis de estas moléculas puede
también ejercer efectos deletéreos en las células b (Pi et al., 2007).
4. Proteínas desacoplantes (UCP)
La identificación del tejido adiposo pardo (BAT, por sus siglas en inglés) y su gran actividad
termogénica en los animales que hibernan y en los niños recién nacidos, sugirió que la grasa
parda contenía uno o más compuestos que desacoplaban la cadena respiratoria. A finales de
la década de los 70s, se demostró que una proteína de 32 kDa localizada en la membrana
interna de la mitocondria participaba en este proceso. Su nombre original fue “termogenina”,
sustituyéndose años después por el de proteína desacoplante tipo 1 (UCP-1). Las proteínas
desacoplantes están bien caracterizadas, en los mamíferos se conocen 5 tipos (UCP-1 a UCP-
5) localizadas en diferentes tejidos y con una función específica en el metabolismo celular
(Sokolova and Sokolov, 2005).
Estructura
Las UCPs pertenecen a una familia de proteínas acarreadoras de aniones mitocondriales,
divididas en tres regiones homólogas internas, de aproximadamente 100 aminoácidos cada
una. En cada región existen 2 dominios transmembranales en forma de a-hélice, los extremos
amino y carboxilo se localizan en el espacio intermembranal. Las proteínas homólogas
conservan los seis dominios transmembranales, salvo en el caso de UCP-3S. El gen de UCP-3
en el humano codifica para 2 proteínas: una larga de 311 aminoácidos (UCP-3L) y una corta
de 275 aminoácidos (UCP-3S) que se origina cuando la ruptura y una señal de poliadenilación
(AATAAA) localizada en el último intrón, irrumpe el mensaje de elongación, hasta ahora se
desconoce la razón de la existencia de estas isoformas (Argyropoulos and Harper, 2002).
Expresión
El gen que codifica a UCP-1 está localizado en el cromosoma 4q28-q31 y se expresa
exclusivamente en tejido adiposo pardo, por lo que tiene una función poco significativa en la
homeostasis energética del humano adulto. UCP-2 y UCP-3 se expresan en músculo y tejido
adiposo blanco, tejidos que tienen mayor relevancia para la termogénesis adaptativa en el
humano. El gen de UCP-2 se encuentra en el cromosoma 11p15.1 del humano y presenta una
homología del 59% con UCP-1. La UCP-3 se expresa exclusivamente en tejido muscular y
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grasa parda; en respuesta a estímulos que aumentan la termogénesis (alteraciones a nivel de

tiroides, el frío, la leptina y el ejercicio) (Silvestri et al., 2005)
Regulación
Las proteínas desacoplantes son susceptibles a una regulación de carácter agudo y crónico. La
primera estimula la actividad de UCPs existentes, y la segunda aumenta los niveles de ARNm
y la síntesis de novo de estas proteínas. El frío regula la expresión de UCP-1 en grasa parda, un
tejido termogénico que únicamente tiene sentido fisiológico en animales que hibernan y en
roedores; aunque también puede estimular la expresión de UCP-2 y de UCP-3 en grasa parda,
pero no en músculo (Nagase et al., 1996).
El sistema nervioso simpático es el regulador inmediato (agudo) más importante de estas

proteínas, una estimulación simpática prolongada de la grasa parda, incrementa la actividad
de las UCPs existentes y promueve su trascripción, mediante la activación de los receptores y
a-adrenérgicos de la norepinefrina (Nagase et al., 1996). Otro mecanismo que interviene en
la regulación de estas proteínas a corto plazo es la oxidación de ácidos grasos, durante este
proceso se presenta un aumento en la producción de O.-2 lo que incrementa la actividad de
UCP-2 para disminuir el potencial de membrana mitocondrial (Moreno et al., 2003).
En la regulación crónica, intervienen diversas hormonas como la triyodotironina y la leptina.

La triyodotironina, produce un aumento órgano-específico del ARNm de UCP-2 en corazón
de rata. Un efecto similar pero moderado se observó en músculo esquelético, no así en
riñón o hígado. La administración crónica de triyodotironina aumenta los niveles de ARNm
de UCP-3 en BAT y músculo esquelético (Kerner et al., 2001). La leptina, una hormona
producida por el adipocito que a través del hipotálamo controla el centro de saciedad en
mamíferos, también incrementa la expresión de UCP-2 en islotes pancreáticos y tejido
adiposo blanco (6 y 10 veces, respectivamente); al mismo tiempo que incrementa el ARNm
de UCP-3 en BAT (Silvestri et al., 2005).
5. Fisiología de las UCPs
Se pueden predecir 4 funciones básicas de las UCPs; cuando su actividad es moderada ocurre
un desacoplamiento parcial de la mitocondria (situación en que la síntesis de ATP no esta
afectada). Tal desacoplamiento aumenta la tasa de respiración y la tasa metabólica (función
básica 1). Esto es benéfico para numerosos procesos fisiológicos, al evitar la formación de
especies reactivas de oxígeno (función básica 2) y es inevitablemente paralela a la termogénesis
media (función básica 3). Por otra parte, mantienen el potencial de membrana mitocondrial
bajo cierto límite y controlan la producción de ATP (función básica 4), de otro modo, el
aumento en la síntesis de ATP podría inhibir la cadena respiratoria (Jezek, 2002).
Mecanismo de Acción
La UCP-1 es una proteína transportadora de protones y aniones, constituye una ruta

alternativa para la entrada de protones, evitando su paso por la ATP sintasa por lo que la
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energía del gradiente electroquímico es disipada en forma de calor. Se han propuesto dos
mecanismos para explicar la actividad desacoplante de UCP-1 y el papel que desempeñan los
ácidos grasos. En el primer modelo, la UCP-1 actúa como un canal de protones y en presencia
de ácidos grasos, éstos proporcionan los grupos carboxilo que favorecen su transporte. En el
segundo modelo, los ácidos grasos aniónicos siguen un circuito en el que recogen los protones
del espacio intermembranal, fluyen hasta la matriz donde liberan los protones y la UCP-1
se encarga de regresar el ácido graso aniónico a la zona intermembranal, donde puede ser
protonado nuevamente (Garlid et al., 1996). Este proceso se repite hasta que los ácidos grasos
no esterificados son eliminados (Figura 3). Este mecanismo puede extenderse a todas las UCPs
lo que permite predecir que estás proteínas (al menos UCP-2 y UCP-3) son capaces de mediar
el transporte unidireccional de los ácidos grasos aniónicos (Nagase et al., 1996).
Fig. 3. La exportación de ácidos grasos aniónicos y/o peróxidos por UCPs, evita el daño mitocondrial, al
disminuir el gradiente de protones y la formación de ERO por B-oxidación.
6. UCPs en Diabetes y Obesidad
UCP-2
La localización del gen de UCP-2 en el loci asociado con obesidad e hiperinsulinemia,
despertó gran interés por entender su función en DT2, en la regulación del peso y en el balance
energético (Krauss et al., 2003). Estudios clínicos (sujetos con DT2) y experimentales (ratas
Zucker delgadas y fa/fa obesas), realizados en islotes pancreáticos, mostraron un incremento
en la transcripción de UCP-2, ligada a alteraciones en el metabolismo de la glucosa y en la
secreción de insulina debido al incremento en el desacoplamiento de la cadena respiratoria
mitocondrial y la disminución de ATP; recordemos que la secreción de insulina en respuesta a
glucosa, es dependiente de las concentraciones de ATP y se estima que el 98% de su producción
en la célula β depende del proceso oxidante. Por esta razón, UCP-2 se considera un regulador
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negativo de la liberación de insulina (Jezek, 2002; Krauss et al., 2003). Esto se confirmó en
células β de ratones knockout para UCP-2, donde se observó un aumento en los niveles de
ATP y en la secreción de insulina en respuesta a glucosa. La disminución de ATP en las
células que sobre expresan UCP-2, está asociada a una disminución en la hiperpolarización
de la membrana interna mitocondrial inducida por glucosa (Sesti et al., 2003), por lo que el
incremento en la expresión y/o activación de UCP-2 puede contribuir a alteraciones en la
secreción de insulina al reducir la relación ATP/ADP, necesaria para el cierre de los canales
KATP y la subsiguiente despolarización de la membrana, la entrada de Ca2+ y la exocitosis de
los gránulos de insulina.
Por otro lado, aunque UCP-2 reduce la magnitud en la secreción de insulina en respuesta a
glucosa y por lo tanto la eficiencia de las células β (Brownlee, 2001), también pueden proveer
un sistema de protección contra ERO (Fridlyand and Philipson, 2004). En DT2 prevalece
un estado de estrés oxidante dado principalmente por el aumento en la producción de anión
superóxido (Ortega-Camarillo et al., 2006) (Figura 4).
Fig. 4. En condiciones de hiperglucemia hay un aumento de anión superóxido y de UCP-2 que disminuye
la producción de ATP y la secreción de insulina.
La UCP-2 exporta el anión superóxido desde la matriz hacia el espacio intermembranal, donde
puede experimentar una dismutación más rápida o bien ser capturado por otras defensas
antioxidantes, contribuyendo así a la disminución del potencial de membrana mitocondrial y
de la producción de ERO (Echtay et al., 2002).
Esto permite sugerir que el desacoplamiento parcial ejercido por UCPs, puede ser benéfico
tanto para células como para tejidos. La protección de las células b contra el estrés oxidante
por activación de UCP-2, se confirmó en un estudio en el que se cultivaron células INS-1
(células productoras de insulina) en presencia de H2O2, en estas condiciones se incrementó la
expresión de UCP-2, disminuyó la producción de ERO y la activación de caspasas, mejorando
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notablemente la tasa de supervivencia celular, por lo que se propuso que UCP-2 evita el daño y
probablemente la apoptosis debida a estrés oxidante (Echtay et al., 2002; Vincent et al., 2004).
Otra fuente de ERO la constituye el aumento en la tasa metabólica de los ácidos grasos
libres, al incrementar el flujo de energía a través de la cadena transportadora de electrones
y la producción de ERO en las células b. La UCP-2 también limita la producción de ERO
provenientes de esta vía, al disipar el exceso de energía. Dado que los ácidos grasos regulan
la trascripción de UCP-2 en las células b, se ha propuesto la hipótesis de que la obesidad,
considerada como uno de los principales factores de riesgo para DT2, está relacionada con la
activación de UCP-2 (Joseph et al., 2004). Esta propuesta se apoya en experimentos con células
INS1 expuestas a oleato, en donde se observó una disminución de la secreción de insulina
en respuesta a glucosa, aumento de la expresión de UCP-2 y desacoplamiento mitocondrial
(Chan et al., 2004). Lo que indica que la oxidación de ácidos grasos libres (AGL), está limitada
por un aumento en el desacoplamiento debido a la activación de UCP-2 y de la exportación de
ácidos grasos aniónicos fuera de la mitocondria, haciéndolos inalcanzables para el metabolismo
oxidante (Joseph et al., 2004).
Por otro lado, se sabe que los ácidos grasos inducen la expresión de genes implicados en diversas
rutas lipolíticas, como los que codifican para carnitil palmitoil transferasa I (CPT-I), acil-CoA
oxidasa peroxisomal (ACO) y UCP-2 (Jezek, 2002). Al mismo tiempo, disminuyen la expresión
de acetil-CoA carboxilasa (ACC), enzima clave en la ruta lipogénica y que sintetiza malonil-
CoA, un inhibidor fisiológico de CPT-I, contribuyendo de esta manera a la regulación de la
lipólisis (Joseph et al., 2004). Esta compleja remodelación metabólica podría tener un papel
clave en el proceso de desintoxicación a través de rutas lipolíticas celulares. En este sentido,
UCP-2 podría formar junto a CPT-I y ACO una primera línea lipodesintoxicante, donde
CPT-I y ACO se encargarían de degradar el exceso de lípidos para evitar su esterificación
así como la formación de depósitos tóxicos de triacilgliceroles, UCP-2 disiparía los protones
para disminuir la producción de ATP y adaptar la respuesta secretora a los niveles de glucosa
circulantes, manteniendo en la medida de lo posible, la sensibilidad de la célula b a la glucosa.
UCP-3
La UCP-3 estimula la translocación de GLUT 4 y por lo tanto, el transporte de glucosa en
músculo esquelético y cardíaco por un aumento en la actividad de la fosfatidilinositol-3-cinasa.
Los animales que sobre-expresan UCP-3 (más de 66 veces) pierden peso a pesar de tener
hiperfagia y muestran mayor sensibilidad a la insulina en músculo. La mayoría de los autores
proponen que UCP-3 regula la cantidad de ATP disponible en el interior de las células al
controlar el flujo de protones, como por ejemplo, en el músculo la demanda de energía puede
modificarse de forma brusca durante el ejercicio, en esta situación, la expresión de UCP-2 y 3
disminuye y por lo tanto se favorece la producción de ATP (Nedergaard and Cannon, 2003).
Se ha propuesto que UCP-3 está involucrada en el manejo de lípidos como fuente energética,
más que en la mediación de la termogénesis; así por ejemplo, UCP-3 podría funcionar en
concierto con la tioesterasa mitocondrial 1 (MTE 1), para remover ácidos grasos aniónicos
libres, generados por esta enzima y liberar CoA, necesaria para la b-oxidación y para el ciclo
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de Krebs, en situaciones en que la oxidación de ácidos grasos libres es mayor en la célula

(Lanni et al., 2002). Por lo que UCP-3 puede favorecer la salida de ácidos grasos aniónicos
que cruzan la membrana interna, y permitir su retorno al citosol, al disminuir el gradiente de
protones y la formación de ERO. Las evidencias experimentales permiten proponer que el
gen de UCP-3 puede ser importante en situaciones en las que la b-oxidación es la principal vía
metabólica y puede concluirse que UCP-3 y MTE 1, se encuentran dentro de la misma ruta
para la utilización adecuada de ácidos grasos libres y, que las funciones atribuidas a UCP-3 en
el manejo de lípidos y desacoplamiento mitocondrial, no son excluyentes (Lanni et al., 2002;
Yamashita et al., 2004).
La alta correlación entre la expresión de UCP-3 y la oxidación de ácidos grasos, apoya la idea
de que está proteína interviene en su metabolismo. Los pacientes obesos y diabéticos, muestran
niveles elevados de ácidos grasos libres (AGL), y a largo plazo, este aumento junto con la
disminución en la capacidad de oxidarlos conduce a la acumulación tanto de AGL como de
triacilgliceroles en células b, corazón, hígado y músculo esquelético. Esto aunado a episodios
de hiperglucemia postprandial, pueden conducir a disfunción mitocondrial y a un estado de
resistencia a la insulina. La expresión de UCP-3, se encuentra disminuida en pacientes con
resistencia a la insulina, DT2 y ancianos; lo que sugiere, que en estas condiciones, los niveles
de UCP-3 son insuficientes, tanto para reducir la producción de ERO como para exportar los
ácidos grasos aniónicos y/o peróxidos, por lo que el daño mitocondrial por lipoperoxidación
no puede evitarse (Garvey, 2003)
7. Variaciones genéticas de UCPs en la regulación del peso corporal y Diabetes

tipo 2
En los últimos 20 años se han realizado estudios para identificar las variantes genéticas que
predisponen a las enfermedades complejas como DT2 y obesidad. Aunque el incremento en la
prevalencia de estas patologías se debe principalmente a los cambios en el estilo de vida actual,
se cree que la susceptibilidad a estos padecimientos, posee ciertos determinantes genéticos que
aún se encuentran en estudio.
Recientemente se ha propuesto a los genes de las proteínas desacoplantes como “genes

diabetogénicos” potenciales (Gable et al., 2006; Rousset et al., 2004). Estudios con animales,
mostraron que la región del genoma en que se encuentran UCP-2 y UCP-3 se asocia con
resistencia a insulina, intolerancia a la glucosa y aumento de adipocidad, sin embargo, la
región genómica identificada es demasiado grande y múltiples genes pueden estar incluidos en
ella. En poblaciones de indios Pima, Franco-Canadienses y Finlandeses se han descrito débiles
asociaciones de esta región, con la tasa metabólica y/o la insulina en ayuno. Los polimorfismos
de UCP-2 que se han observado con mayor frecuencia son: la substitución de Alanina por
Valina en el codón 55, la inserción de 45 pares de bases en una región no transcrita en el
extremo 3´ y recientemente la substitución de Guanina por Adenina en la región promotora
(Walder et al., 1998)
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Actualmente se desconoce si el incremento en la expresión de UCP-2 tiene un papel causal en la

disfunción de la célula b durante la DT2, sin embargo, se ha observado que su expresión aumenta
en condiciones de hiperglucemia e hiperlipidemia en líneas celulares pancreáticas y en sujetos con
DT2 así como su deficiencia mejora la función de la célula b en roedores obesos diabéticos (Winzell
et al., 2003) lo que permite sugerir que está proteína tiene una importante función en la patogenia
de está enfermedad (Brown et al., 2002). En el humano el polimorfismo –866 Guanina/Adenina en
el promotor de UCP-2 está asociado con una disminución en la secreción de insulina, un aumento
en la frecuencia y/o en el inicio temprano de DT2 (Fur et al., 2004) y con un mayor riesgo de
obesidad en Caucásicos (Lowell and Shulman, 2005). En el paciente con DT2 homocigoto para
el polimorfismo en el alelo –866 Adenina, la secreción de insulina en respuesta a glucosa y el estrés
oxidante son significativamente más (DAdamo et al., 2004); lo que sugiere que las diferencias que se
observan a nivel de secreción de insulina entre los individuos con DT2, pueden atribuirse en parte
a este polimorfismo –866 G/A (Gable et al., 2006).
A pesar de la poca evidencia funcional que liga a las UCPs con obesidad, diversos grupos han
buscado asociación entre variaciones genéticas de estas proteínas y el acumulo de grasa corporal.
Varios polimorfismos de nucleótidos únicos (SNPs) han sido descritos en el gen de UCP-1, sin
embargo ninguno presenta asociación con obesidad. Algunas mutaciones raras de UCP-3 se han
descrito en pacientes de origen Africano con obesidad mórbida; pese a ello su relación causal se
ha puesto en duda, ya que la mutación Arg282Cis, que elimina la función de UCP-3, no causa
obesidad (Yanovski et al., 1999). En indios Pima el alelo t en la posición –55 aumenta la expresión
de UCP-3 en tejido muscular, en Franceses esta variable se ha relacionado con un aumento en
la frecuencia de dislipidemias y del perímetro de cintura (Walder et al., 1998). Estudios recientes
demuestran que la expresión de UCP-3 en músculo no es distinta entre obesos y delgados, pero
los sujetos delgados con obesidad previa presentan baja expresión de UCP-3, hecho que puede
estar relacionado con una disminución de la tasa metabólica basal descrita en estos sujetos. Dado
que un bajo metabolismo en reposo es un factor que predispone al desarrollo de obesidad, estos
resultados sugieren que la disminución de UCP-3 en músculo esquelético puede favorecer el
incremento de peso corporal (Gable et al., 2006)
Recientemente, la sustitución de adenina por guanina en la posición –3826 en el promotor

del gen de UCP-1 mostró una asociación aparente aunque indirecta, al interactuar con otros
cambios en el receptor b–3-adrenérgico (como el polimorfismo Trp64Arg) con un mayor
riesgo de obesidad, que se explica por una disminución en la tasa metabólica basal. En un
estudio realizado por Ishigaki y col. (2007), se demuestra que la expresión de UCP-1 en hígado
reduce el contenido de grasa, más que inhibir su acumulación, tanto en hígado como en tejido
adiposo, lo que indica que UCP-1 promueve la hidrólisis de triacilgliceroles almacenados en
el tejido adiposo.
Conclusión
Las UCPs pertenecen a la familia de proteínas transportadoras de aniones que facilitan el

intercambio de substratos que cruzan la membrana interna mitocondrial. Los miembros de
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está familia juegan un papel esencial en el tráfico de metabolitos intermediarios dentro y fuera
de la matriz mitocondrial. La UCP-1 además de regular la termogénesis y en el transporte
unidireccional de ácidos grasos; inhibe la acumulación de grasa en tejido adiposo, por lo que
su expresión en hígado podría ser un blanco terapéutico en síndrome metabólico, DT2 y
obesidad. En este trabajo se proveen evidencias del doble papel de UCP-2 y UCP-3: por
un lado el aumento patológico en la transcripción de UCP-2 en islotes pancreáticos puede
conducir a alteraciones en la secreción de insulina en respuesta a glucosa y de está manera
contribuir a la patogénesis de la diabetes tipo 2; y por el otro las UCPs intervienen en la defensa
y probablemente evitan la apoptosis de las células b, en condiciones de estrés oxidante, de tal
manera que el tratamiento con antioxidantes, posiblemente disminuya la expresión de UCPs,
aumente la síntesis de ATP y aminore los síntomas de DT2. Además, estas proteínas ejercen
un papel clave en el metabolismo energético y actualmente constituyen un campo de intensa
investigación como blancos potenciales para el tratamiento farmacológico de DT2 y obesidad.
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Alteraciones en la vía de la señalización de la
insulina y su relación con obesidad y diabetes.
Dra. Rebeca García Macedo.
Diabetes tipo 2 y obesidad
La diabetes tipo 2 (DT2) se puede definir como una enfermedad metabólica caracterizada por
un estado de hiperglucemia crónico que se presenta junto con alteraciones en el metabolismo
de carbohidratos, lípidos y proteínas, debido a la ausencia o disminución en la secreción y/o
acción de la insulina y en la mayoría de los casos está asociado con obesidad. La prevalencia
global de la DT2 alcanzará la cifra de 300 millones de casos en el 2025 (Zimmet et al., 2001)
y se está incrementado entre los niños y jóvenes debido a factores ambientales (sedentarismo)
y factores genéticos (por ejemplo: polimorfismos o cambio de una base nitrogenada en los
genes). La DM2 presenta síntomas característicos tales como: sed intensa (polidipsia), orina
abundante (poliuria), pérdida de peso, algunas veces con gran apetito (polifagia), visión
borrosa, náuseas, vómito, debilidad o cansancio excesivo, altos niveles de glucosa en sangre
y orina, incremento en la susceptibilidad a enfermedades e infecciones. Los efectos a largo
plazo de la DT2 incluyen el desarrollo progresivo de complicaciones específicas; por ejemplo,
anormalidades macrovasculares (macroangiopatía) y microvasculares (microangiopatía). Las
anormalidades macrovasculares resultan en aterosclerosis con incremento en enfermedades
cerebrovasculares e infarto del miocardio. Las afecciones neuropatológicas afectan al sistema
autónomo y a los nervios periféricos. Las anormalidades microvasculares comprenden
cicatrización proliferativa de la retina (retinopatía diabética) y enfermedad renal (nefropatía
diabética) (Expert Committee, 2003 a y b).
La obesidad es una enfermedad compleja, se puede definir de diversas maneras: como un

trastorno metabólico caracterizado por un exceso de grasa corporal o como una enfermedad
crónica, de etiología multifactorial en la cual se involucran aspectos genéticos, ambientales y
de estilo de vida que conducen a un trastorno metabólico, clínicamente se caracteriza por un
índice de masa corporal (IMC) mayor a 30 Kg/cm2. La obesidad es un problema de salud
pública en proceso de expansión en todo el mundo. En México el aumento de su prevalencia
ha sido más rápido que en otros países en vías de desarrollo, y para su tratamiento se requiere
tomar en cuenta los factores biológicos socioculturales y psicológicos que la determinan
(Arellano et al., 2004).
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Alteraciones en la vía de la señalización de la insulina
La mayoría de los modelos de DT2 señalan a la obesidad como una causa importante de la
enfermedad, debido a su asociación con la resistencia a la insulina y a la falla en las células
beta del páncreas. La falta de regulación en los tejidos periféricos y la señalización central,
provocadas por diversos factores, puede iniciar y sostener la cascada de eventos que llevan al
incremento en el peso corporal, a la obesidad y diabetes. Se revisarán aspectos relacionados
con la etiología de estos padecimientos, enfocados principalmente a las funciones de la insulina
y al mecanismo por el cual se incorpora la glucosa en las células.
Vía de señalización de la insulina
La insulina, es una hormona proteica, sintetizada y excretada por el páncreas, es la encargada

de regular el metabolismo y síntesis de novo de la glucosa. Cuando la insulina no se secreta
en cantidades adecuadas o cuando sus funciones están disminuidas o totalmente inhibidas, se
presenta lo que se conoce como resistencia a la insulina. Los órganos más susceptibles a
estas alteraciones, son el hígado, el músculo, el cerebro y el tejido adiposo.
De manera general, una vez que la insulina es liberada, se transporta por el torrente sanguíneo
hasta llegar a los órganos blanco, ahí se une a su receptor (IR). El IR está formado por cuatro
subunidades: dos de tipo alfa y dos beta. La interacción de la insulina con su receptor, provoca
la activación del dominio de tirosina cinasa del receptor y su autofosforilación en determinados
residuos de tirosina de las subunidades ß. Lo anterior va seguido de la fosforilación de otros
sustratos endógenos. Entre estas proteínas, se encuentran los sustratos del receptor a insulina
(IRS), de los cuales se conocen 4 isoformas; IRS-1 es la más común.
El IRS-1 contiene dominios con homología Src 2 (SH2), y después de que se une el fosfato
a residuos de tirosina (Tyr), interacciona con la enzima fosfatidil inositol 3 cinasa (PI3K), esta
interviene en la mayoría o en todas las acciones metabólicas de la insulina. La PI-3K está
constituida por las subunidades catalítica y reguladora. Se han identificado tres clases de esta
enzima, las de clase Ia es más estudiada, presenta la combinación de subunidad catalítica p110
y reguladora p85. La unión de p85 con IRS-1 fosforilado estimula la activación de PI3K, lo
cual lleva a la formación de fosfatidil-inositol-3, 4 bifosfato (PIP2) y fosfatidil inositol-3, 4. 5
trifosfato (PIP3). La activación de esta enzima es un paso necesario para la movilización de los
transportadores de glucosa, ya que en presencia de inhibidores específicos de la PI3-cinasa, se
disminuye la translocación del transportador de glucosa tipo 4 (GLUT4) y por consiguiente,
la entrada de glucosa a las células. La PI3K, a su vez, activa otras serina (Ser)/treonina (Thr)
cinasas, entre las que se encuentran la proteína cinasa tipo B (PKB), también conocida como
Akt, la cinasa p70S6 y las isoformas de las proteínas cinasas C atípicas (PKC): λ y ξ. La p70S6
interviene solamente en la síntesis de proteínas estimulada por insulina, mientras que Akt/PKB
y las PKC atípicas regulan la translocación de GLUT4. Los productos lipídicos de PI3-K (PIP2
y PIP3) son necesarios para la localización de PKB en las membranas y para su activación,
para ello se unen a la cinasa dependiente de fosfoinosítidos (PDK1). Por lo tanto estos dos
fosfolípidos pueden atraer a la PDK1 y a la PDK2 hacia la membrana plasmática, esta última
enzima no se ha identificado. Los sustratos conocidos de estas últimas cinasas son Akt/PKB y
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las PKCs atípicas. Las PDK 1 y 2 fosforilan Akt/PKB en dos residuos: treonina 308 y serina 473,
respectivamente. Akt/PKB actúa sobre más de 35 sustratos que están involucrados en diversos
procesos metabólicos como el transporte de glucosa, síntesis de glucogéno, síntesis de proteínas,
lipogénesis y supresión de la gluconeogénesis hepática, y también interviene en procesos
mitogénicos. Cuando las células no se someten a ningún estímulo, Akt/PKB se localiza en el
citoplasma y bajo el estímulo de insulina, la enzima se transloca hacia la membrana plasmática
(MP), donde se une a PIP2 y PIP3 (Kohn et al., 1996; LeRoith and Zick, 2001; Vanhaesebroeck
et al., 2000). Uno de los sustratos de Akt/PKB es la proteína Rab-GTPasa (GAP) de 160–kDa
(AS160), que participa en la translocación de GLUT4 en los adipocitos y en células de músculo
esquelético (Sano et al., 2003). Parte de Akt/PKB activa también se moviliza hacia el núcleo, por
medio de un mecanismo desconocido, y modula la expresión de genes (Andjelkovick et al., 1997;
Vanhaesebroeck et al., 2000). Los sustratos que son fosforilados directamente por AKT/PKB
incluyen a la glucógeno sintasa cinasa 3 (GSK-3) y a algunos miembros de la familia de factores
de transcripción Foxo, que son parte importante de la homeostasis de la glucosa dependiente de
insulina. En la Fig. 1 se muestran esquemáticamente las reacciones de la vía de señalización de
insulina (Tirosh et al., 2000).
Además de la vía de señalización ya descrita, existe una segunda vía independiente de PI3K, en
la cual participan las proteínas c-Cbl (producto de un proto-oncogene), CAP (proteína que une
c-Cbl) y la GTPasa TC10 que forman un complejo para regular la movilización de GLUT4,
con incremento en la incorporación de glucosa (Saltiel and Pessin, 2002), aparentemente esta
vía es específica de los adipocitos.
Fig. 1. Representación esquemática de la vía de señalización de insulina como se detalla en el texto. La

unión de insulina al IR activa PI3K a través de IRS-1. PDK media la activación de Akt/PKB, que regula
la incorporación de glucosa al interior de la célula por medio de la translocación de GLUT4 hacia la MP.
En la última etapa interviene un complejo de proteínas, compuesto por v-SNARE, Rab4 y sintaxina 4,
entre otras, que se unen a las vesículas que contienen GLUT4. Las flechas indican los sitios que pueden
alterarse en estados de obesidad y diabetes. (Figura modificada de Tirosh at al., 2000)
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Tabla 1. Localización y función de transportadores de glucosa
Transportador Tejido Función

Todos los tejidos, especialmente Captación basal de glucosa;
GLUT 1 eritrocitos y encéfalo. transporte a través de la barrera
hematoencefálica.
Células b del páncreas, hígado Regulación de la liberación de
GLUT 2 riñón e intestino. insulina y otros aspectos de la
homeostasis de la glucosa.
Encéfalo, riñón, placenta y otros Captación en neuronas y en
GLUT 3
Tejidos. otros tejidos.
Músculo y tejido adiposo. Captación de glucosa mediata
GLUT 4
por insulina.
GLUT 5 Intestino y riñón. Absorción intestinal de fructosa.
(Katzung, 1999)
La insulina mantiene la homeostasis de la glucosa, principalmente por estimulación de la

incorporación de glucosa en músculo esquelético y en tejido adiposo, mediante un proceso en
el que participa GLUT4. Se sabe que el transportador se moviliza o recicla, hacia, y desde,
la membrana plasmática (MP), por medio de un mecanismo parecido a la exocitosis de las
vesículas sinápticas, las cuales se reforman después de la liberación del neurotransmisor. La
resistencia a la insulina, particularmente en músculo esquelético, se asocia con una insuficiente
movilización de GLUT4 hacia la MP, a pesar de que la expresión de GLUT4 es normal
(Björnholm and Zierat, 2005).
Regulación de la translocación de GLUT-4
La entrada de glucosa a las células se lleva a cabo por un transporte pasivo, mediante proteínas
transportadoras que se encuentran en la membrana celular, la glucosa se une al transportador
en la parte orientada hacia el exterior de la célula, se modifica la conformación de la proteína,
lo cual permite que la glucosa se libere hacia el interior de la célula. Se conocen varios tipos
de transportadores de glucosa (GLUT). Estos transportadores son el producto de distintos
genes, su localización en diversos tejidos y su función se muestran en la Tabla 1. La isoforma
predominante en el músculo esquelético y en el tejido adiposo es GLUT4 (Tirosh et al., 2000).
Después de la estimulación con insulina, los trasportadores GLUT-1, pero más eficientemente
GLUT-4, se translocan desde vesículas que almacenan GLUT4 (GSV) hasta las pozas que se
localizan en la membrana celular interna, incrementando así el transporte de glucosa. Los
dos trasportadores pasan a diferentes pozas de la membrana. Su cinética de reciclamiento
y de regulación, es diferente, mientras que GLUT1 se recicla predominantemente, en los
endosomas, GLUT4 se puede distribuir, en por lo menos dos sitios distintos, el principal
es GVS. En el proceso participan varias proteínas, cuya función es facilitar la movilización
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del trasportador hacia la membrana celular, entre ellas se encuentran: VAMP2 (proteína de
fusión 2, sensible a N-etilmaleimida y asociada a vesículas), SNAP (proteínas de unión NFS
soluble), VAMP2 se une a receptores SNAP o SNAREs. Algunas proteínas de la familia de
sinaptobrevina se encuentran asociadas con las vesículas que contienen GLUT4 y actúan como
v-SNARES (SNARES vesiculares). La insulina favorece la formación de un complejo entre
GLUT4, v-SNARES, NSF, SNAP y sintaxina-4. La v-SNARE se requiere exclusivamente
para la fusión de GLUT4 con la membrana durante la estimulación con insulina, pero no
en condiciones basales (sin estímulo de insulina). El proceso es más complejo e involucra a
proteínas de la familia Rab, de bajo peso molecular, que unen GTP, y también requiere de la
remoción de una proteína de fusión denominada Munc18c, la cual, en condiciones basales
bloquea la participación de sintaxina-4 (Dugani and Klip, 2005).
Alteraciones en la señalización de la insulina
Varios de los sustratos que participan en la vía de señalización de la insulina pueden

presentar alteraciones en la DT2 y en la obesidad, por los resultados con células en cultivo y
con ratones transgénicos, se sabe que los más susceptibles son los IRS, ya que las respuestas
a la insulina se modifican por la presencia de hormonas contra-reguladoras y de citocinas
pro-inflamatorias, que modulan la fosforilación en residuos de Tyr y de Ser de IRS-1 y 2.
El aumento en la fosforilación de IRS-1 se presenta después de que las células se tratan con
activadores de PKC, con inhibidores de la Ser/Thr fosfatasa como el okadato, con el factor
de crecimiento derivado de plaquetas, y con TNF-α y otras citocinas que activan las vías de
estrés ( LeRoith and Zick, 2001).
En la obesidad y en diabetes se han observado alteraciones en la actividad de las cinasas que

participan en la vía de señalización de la insulina. En la resistencia a la acción de la insulina
se modifican los mecanismos de activación de PKC atípicas, principalmente en músculo. En
el hígado, la activación de PKCs, depende de IRS-2/PI3K más que de IRS1/PI3K, en este
caso la activación de IRS-2/PI3K y de PKC se mantienen normales en estados de obesidad,
diabetes y bajo dietas ricas en grasa. Lo anterior explica el aumento de síntesis de lípidos
dependiente de PKC, mientras que el metabolismo de glucosa dependiente de PKB está
disminuido (LeRoith and Zick, 2001).
La terminación de la señalización de la insulina está compuesta por una red de múltiples cambios y
es crítica para mantener el control metabólico. La endocitosis del IR y la disociación del complejo
ligando-receptor, así como su posterior degradación, permiten regular la cascada de reacciones
en etapas muy tempranas. En los mecanismos de terminación de la señal, pueden participar
serina/treonina cinasas y tirosina fosfatasas. Estas últimas se pueden activar desde el inicio de
la vía, por medio de su interacción con IRS-1-Tyr-fosforilado, una de las más importantes es
la proteína-tirosina-fosfatasa 1B (PTP1B). En los ratones a los que les falta el gen de PTP1B se
incrementa su sensibilidad a la insulina y no desarrollan RI cuando se someten a una dieta alta
en grasas. Además, en los ratones diabéticos, cuando se inhibe la actividad de PTP1B por medio
de la aplicación de oligonucleótidos antisentido, que son específicos para PTP1B, se mejora
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la sensibilidad a insulina y el control de la glicemia. En ensayos de fosforilación in vitro, se ha

demostrado que el IRS-1 es sustrato de Serina/Treonina cinasas, que incluyen a PKC, glucógeno
sintasa cinasa 3 (GSK3) y cinasa dependiente de señales externas (ERK), lo cual sugiere que estas
enzimas son importantes para las señales de terminación. Si estas señales se sobreactivan pueden
alterar las funciones de la insulina (Zinker et al., 2005).
Como se mencionó anteriormente, la resistencia a la insulina consiste en el bloqueo de las

acciones de la hormona en sus tejidos blanco. El concepto de resistencia a la Insulina debe
aplicarse a cualquiera de las acciones biológicas de la insulina, que incluyen su efecto sobre el
metabolismo de los lípidos y de las proteínas, la función del endotelio vascular y la expresión
genética.
La resistencia a la insulina se puede presentar a través de los siguientes mecanismos:
 Defecto de captación y utilización de glucosa, por bloqueo del transporte y/o

fosforilación intracelular de glucosa
 Reducción de la movilización de GLUT-4
 Disminución en la sensibilidad a la insulina por la presencia del factor de necrosis
tumoral tipo alfa (TNF-α)
 Aumento en la resistencia a la insulina debido a la hiperglicemia crónica y/o presencia
de ácidos grasos libres
 Participación de componentes genéticos
En los humanos, las mutaciones en IRS-1 son poco frecuentes y están asociadas con RI
(Whitehead et al., 1998)) y en los ratones la modificación del gene de IRS-1 provoca RI
principalmente en músculo y en tejido adiposo (Yamauchi et al., 1996). Los ratones knockout
presentan además de RI en músculo, hígado y tejido graso, desarrollan diabetes como resultado
de la alteración en las células beta del páncreas (Previs et al., 2000). Existen resultados que
asocian la disfunción de IRS-1 en músculo esquelético, con las proteínas expresadas y liberadas
por los adipocitos, y la lipotoxicidad. Por ejemplo, los ácidos grasos libres (AGL) y la adipocina
TNF-α pueden incrementar la fosforilación de las proteínas IRS en residuos, provocando así
la alteración en la transducción de la señalización de insulina (White et al., 2002). Además.
El estímulo prolongado con insulina, como la que presentan los pacientes diabéticos con
hiperinsulinemia, puede provocar la degradación de IRS (Rui et al., 2001).
El tejido adiposo y sus efectos sobre la señalización de la insulina
El papel del tejido adiposo (TA), tanto en la obesidad como en la lipodistrofia se presenta
resistencia a la insulina en músculo. Actualmente se acepta que tanto la diabetes como la
obesidad cursan con inflamación crónica. La grasa puede influir sobre la homeostasis de la
glucosa, ya que la RI se puede revertir por medio del transplante de tejido adiposo. Cuando se
elimina el gen de GLUT4 en el tejido adiposo de ratón, se provoca resistencia a insulina en el
músculo y en el hígado.
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En la DT2 aumenta la concentración de glucosa sanguínea o hiperglucemia, que genera un

estado de glucotoxicidad, el cual produce procesos inflamatorios, acelerando las complicaciones
de la DT2, que afectan ojos, riñones, nervios y vasos sanguíneos, por mecanismos que aún no
son claros. Como ya se mencionó, el estado inflamatorio se manifiesta por presentar altos
niveles de citocinas pro-inflamatorias y menor cantidad de citocinas anti-inflamatorias.
El tejido adiposo también contribuye a exacerbar la RI, ya que ahora se sabe que no solamente
aporta ácidos grasos libres, sino también contribuye el estado inflamatorio por el aporte
de citocinas, denominadas específicamente “adipocinas”, las principales adipocinas pro-
inflamatorias son: el factor de necrosis tumoral alfa (TNFα), la interleucina (IL) 6 y resistina,
cuyas concentraciones plasmáticas se elevan en la RI, obesidad y diabetes. En condiciones
normales, la adiponectina, adipocina anti-inflamatoria y anti-aterogénica, está incrementada.
Otra de las adipocinas, la leptina, tiene una función importante en la regulación de la ingesta
de alimento, el peso corporal, el gasto energético y las funciones neuroendócrinas. Resulta
paradójico que la leptina está sobre expresada en el tejido adiposo de la mayoría de los
pacientes obesos, lo que ha llevado al desarrollo del concepto de la resistencia a la leptina,
misma que se considera causa de las complicaciones cardiovasculares en la obesidad. Por otra
parte, la leptina sensibiliza la acción de la insulina, promoviendo la oxidación de ácidos grasos
libres y la reducción de grasa ectópica en tejidos no adiposos (Fig. 2) (Sánchez-Muñoz et al.,
2005; Bugianesi, 2005)
Por otro lado, la acumulación de ácidos grasos libres (AGL) altera el metabolismo de la glucosa
y la sensibilidad a insulina en el hígado y en el músculo. Los tratamientos con metformina y
TZD pueden reducir la RI en hígado y tejidos periféricos, respectivamente.
Fig. 2. Efecto de las adipocinas sobre la sensibilidad a la insulina, la ingesta de alimento, la inflamación,
y el sistema vascular. Los signos indican el tipo de regulación (positiva o negativa) que ejercen las
adipocinas. Inhibidor 1 del activador del plasminógeno (PAI-1); proteína estimuladora de acilación
(ASP); factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α); interleucina 6 (IL-6). (Figura tomada de Sánchez-Muñoz
et al., 2005).
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La producción de especies reactivas de oxígeno (ERO), tales como: peróxido de hidrógeno

y radicales superóxido e hidroxilo se encuentran en concentraciones elevadas en la DT2,
provocando disminución de la actividad del sistema de defensa antioxidante y por la generación
de radicales libres, se deterioran estructuras celulares y se alteran funciones fisiológicas. Estas
anomalías determinan que el paciente diabético experimente daño endotelial vascular, pierda
el control del tono vascular y presente hipertensión, entre otros efectos, bajo estas condiciones
se acelera su daño orgánico (Kumar y Elbein, 2006; Wrigth et al., 2006).
Tanto el aumento de los AGL, como de ERO conducen a la activación, del factor de necrosis
tumoral κB (NF-κB) que es un factor de transcripción que regula la expresión de citocinas
pro-inflamatorias, y por otra parte los AGL y ERO activan algunas isoformas de PKC, que
promueven la fosforilación del IRS-1 en residuos de Ser y disminuyen la fosforilación en Tyr,
afectando por este mecanismo la vía de señalización de insulina, lo que lleva a disminuir el
trasporte de glucosa y su acumulación en la sangre, este último efecto también se favorece
debido a que los AGL afectan la actividad de la hexocinasa, en estas circunstancias se presenta
resistencia a insulina (Wellen et al., 2003) (Fig.3).
Como podemos observar existen diversos factores que intervienen en el buen funcionamiento
de la vía de señalización de la insulina. Las alteraciones en la ingesta de alimentos, la falta
de ejercicio físico, pueden conducir a presentar sobrepeso u obesidad, si además existen
alteraciones genéticas, en su conjunto pueden favorecer estados de resistencia a la insulina
y finalmente la diabetes. El reto en los próximos años es incidir en las modificaciones en los
estilos de vida y por nuestra parte en un mayor conocimiento de los mecanismos que participan
Fig. 3. Efecto del incremento en la concentración de triglicéridos, y de las especies reactivas de oxígeno
sobre la señalización de la insulina. El diacilglerol (DAG) se incrementa debido a la presencia de altas
concentraciones de ácidos grasos libres. El DAG estimula la vía pro-inflamatoria regulada por el factor
de transcripción NF-κB y también favorece la activación de isoformas de la PKC. También disminuye la
utilización de glucosa, y bajo estas condiciones se presenta la resistencia a la insulina.
210
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en estos padecimientos, así como crear fármacos más efectivos para prevenir la enfermedad,
y sus complicaciones.
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212
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Carcinomas cerebrales, principios y
mecanismos bioquímicos
Introducción
Las neoplasias son secundarias a más de 200 variedades diferentes de alteraciones que
producen un crecimiento anormal de las células, que se convierten en masas de tejidos
llamados tumores. Se puede definir como una alteración que se caracteriza por una división y
crecimiento celular descontrolado.
Básicamente, hay dos tipos de tumores:

•Benignos o no cancerosos
•Malignos o cancerosos
Los tumores benignos tienen seis características principales:

• Sólo crecen hasta un determinado tamaño.
• Normalmente no crecen muy rápido.
• No destruyen células normales.
• No se propagan al tejido que les rodea.
• Normalmente no producen efectos secundarios graves.
• Por lo general crecen de una manera ordenada.
Los tumores benignos desde el punto de vista histológico pueden tener un comportamiento
biológico maligno dependiendo del sitio donde estén localizados por ejemplo los tumores
cerebrales al crecer comprimen tejido circundantes causando la muerte del tejido e incluso de
la persona.
Los tumores malignos se conocen por su capacidad para invadir y destruir tejidos y órganos,
tanto los que están cerca como los que están lejos del tumor original. La muerte se produce
cuando la propagación del cáncer daña de tal manera los tejidos y los órganos vitales, que no
pueden funcionar.
Las células del cáncer atacan el tejido sano y nunca dejan de multiplicarse. El cáncer tiene un
comportamiento distinto en cada persona, según su tipo. Puede darse a cualquier edad, pero
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Carcinomas cerebrales
es más probable que afecte a personas de edad avanzada; por lo general a partir de los 55 años.
El cáncer también puede presentarse en niños, y de hecho, es la segunda causa principal de
muerte en niños de edades comprendidas entre 1 y 15 años. (Becker, 1975)
Clasificación Tumores Malignos
El cáncer, que puede originarse a partir de cualquier tipo de célula y en cualquier tejido
corporal. Se clasifica como:
Carcinomas. Estos se originan de las células del epitelio de recubrimiento de un órgano.

Los carcinomas constituyen el tipo más común de cáncer. Lugares comunes de carcinomas son
la piel, la boca, el pulmón, las glándulas mamarias, próstata, estómago, intestino delgado,
colon y útero.
Sarcomas. Los sarcomas son cánceres del tejido conectivo y de sostén (tejidos blandos) de
todos los tipos. Los sarcomas se encuentran en cualquier parte del cuerpo y se diseminan a
través de vasos por lo cual son frecuentes las metástasis en hígado, pulmones, etc.
Teratoma. Tumor constituido por diferentes clases de tejidos, ninguno de los cuales se
presentan normalmente juntos o en el sitio del tumor. Estos pueden ser de elementos bien
diferenciados, inmaduros, o tener focos de transformación maligna.
La propagación del cáncer a otros sitios u órganos en el cuerpo mediante el flujo sanguíneo o
el sistema linfático se llama metástasis
Tratamiento del cáncer
• Se fundamenta en tres pilares básicos: cirugía, quimioterapia y radioterapia.

• Existe un cuarto pilar llamado terapia biológica que incluiría la hormonoterapia,
inmunoterapia, y nuevas terapias no citotóxicas.
• El tratamiento del cáncer es multidisciplinario
 Si el cáncer está confinado a un sólo lugar, el objetivo del tratamiento generalmente

es la extirpación quirúrgica del tumor y la curación. Si el tumor se ha diseminado
únicamente a ganglios linfáticos locales, estos pueden también algunas veces
extirparse.
 Si el cáncer no se puede extirpar en su totalidad quirúrgicamente, entonces las
opciones de tratamiento son la radiación, la quimioterapia o ambas.
 En algunos pacientes es necesario realizar una combinación de cirugía, radiación y
quimioterapia.
 En contraste, el linfoma con frecuencia se trata con quimioterapia y radioterapia, y
rara vez con cirugía.
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Cáncer en Cerebro
Comúnmente, el cáncer de cerebro es una consecuencia de la propagación (metástasis) de otro

cáncer que surge en alguna otra parte del cuerpo, en especial el pulmón, glándulas mamarias,
riñón y próstata. Solo un 20 por ciento de todos los cánceres son primarios del sistema nervioso
central. Los tumores cerebrales crecen dentro del cráneo, presionando el tejido y las estructuras
del cerebro. Este corte muestra el efecto de un tumor en el cerebro.
El tratamiento de cáncer cerebral depende de:

• Tamaño
• Localización
• Tipo
•
El tratamiento se fundamenta en:
• Cirugía
• Quimioterapia
• Radioterapia
Quimioterapia del cáncer
• El término quimioterapia suele reservarse para los fármacos empleados en el tratamiento

de las enfermedades neoplásicas que tienen como función el impedir la reproducción de
las células cancerosas.
• La terapia antineoplásica tiene una gran limitación, que es su escasa especificidad. El
mecanismo de acción es provocar una alteración celular ya sea en la síntesis de ácidos
nucleicos, división celular o síntesis de proteínas. La acción de los diferentes citostáticos
varía según la dosis a la que se administre.
• Debido a su no- especificidad afecta a otras células y tejidos normales del organismo, sobre
todo si se encuentran en división activa.
• La quimioterapia es la utilización de diversos fármacos que tiene la propiedad de interferir
con el ciclo celular, ocasionando la destrucción de células.
Existen más de 200 fármacos antineoplásicos que se suelen usar en combinación:
• Agentes alquilantes: su mecanismo de acción general, es el daño inducido al ADN

celular (tanto neoplásico como sano) al incorporar grupos alquilo, y de esta manera alterar
o evitar la duplicación celular. Ejemplos: clorambucil, melfalan, cisplatino, carboplatino.
Son eficaces en el tratamiento de leucemias crónicas, linfomas no Hodgkin, así como
para quienes padecen la enfermedad de Hodgkin, mieloma múltiple y ciertos tumores de
pulmón, mama y ovario. Nitrosureas (carmustina o lomustina, por ejemplo): este segundo
grupo de fármacos actúa de forma similar a los agentes alquilantes, entorpeciendo la
actividad de las enzimas encargadas de reparar el ADN. Se emplean generalmente en el
tratamiento de tumores cerebrales o de melanomas malignos
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• Antimetabolitos: se trata de agentes que se combinan con el ADN celular para modificar
la estuctura de las células, de manera que estas mueren al no poder seguir reproduciéndose
normalmente. Este tipo de fármacos, entre los que se incluyen, por ejemplo el metroxato,
se administra a enfermos que padecen tumores de mama, ovario o bien en el tracto
gastrointestinal y también a pacientes que padecen leucemia crónica.
• Antibióticos antitumorales doxorubicina, mitoxantrona, etc): no funcionan
igual que los antibióticos empleados en el caso de infecciones, sino que por su mecanismo
de acción alteran la membrana que rodea a las células y bloquean el proceso por el que las
células se multiplican
• Inhibidores mitóticos: desde el paclitaxel hasta el docetaxel (Thomson, 2006), estas
sustancias derivan de productos naturales y son capaces de frenar el proceso de reproducción
celular así como la acción de las enzimas responsables de la reproducción celular.
• Inmunoterapia: en este grupo se incluyen todos aquellos medicamentos capaces de
estimular el sistema inmune del propio paciente para que éste sea capaz de reconocer y
combatir las células enfermas. Algunos expertos los consideran una forma diferente de
tratamiento al margen de la quimioterapia. La primera evidencia de ‘inmunoterapia’ data
de principios del siglo XXI, cuando William Cloey, un cirujano neoyorquino apreció una
regresión espontánea del sarcoma entre aquellos de sus pacientes que habían padecido
previamente una infección bacteriana.
Efectos secundarios de la quimioterapia
Deterioro físico severo de los pacientes
El tratamiento quimioterápico puede deteriorar físicamente a los pacientes con cáncer. Los
agentes quimioterápicos destruyen también las células normales sobre todo las que se dividen
más rápidamente, por lo que los efectos secundarios están relacionados con estas células que
se destruyen (Chu et al, 2002). Los efectos secundarios dependen del agente quimioterápico y
los más importantes son:
• Alopecia o caída del cabello: Es el efecto secundario más visible debido al cambio de imagen
corporal y que más afecta psicológicamente a los enfermos, sobre todo a las mujeres. Sin
embargo este depende de la cantidad e intensidad de la dosis y no ocurre en todos los casos.
Pero de 4 a 6 semanas el cabello vuelve a crecer.
• Náuseas y vómitos: Pueden aliviarse con antieméticos como la metoclopramida o mejor
con antagonistas de los receptores tipo 3 de la serotonina como dolasetron, granisetron
y ondansetron. Algunos estudios y grupos de pacientes manifiestan que el uso de
cannabinoides derivados de la marihuana durante la quimioterapia reduce de forma
importante las náuseas y los vómitos ya que aumenta el apetito.
• Diarrea o estreñimiento.
• Anemia: Debido a la destrucción de la médula ósea, que disminuye el número de glóbulos
rojos al igual que la inmunodepresión y hemorragia. A veces hay que recurrir a la transfusión
de sangre o a la administración de eritropoyetina para mitigar la anemia.
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• Inmunodepresión: Prácticamente todos los regímenes de quimioterapia pueden provocar

una disminución de la efectividad del sistema inmune, como la neutropenia que puede
conducir a la infección, a la sepsis y a la muerte si no se detecta y trata a tiempo. La
neutropenia se puede solucionar con la administración de [factor de crecimiento de
colonias de granulocitos] (G-CSF del inglés granulocyte-colony stimulating factor) como el
filgastrim.
• Hemorragia: Debido a la disminución de plaquetas por destrucción de la médula ósea.
• Tumores secundarios
• Cardiotoxicidad: La quimioterapia aumenta el riesgo de enfermedades cardiovasculares
(ejemplo: adriamicina).
• Hepatotoxicidad
• Nefrotoxicidad
• Síndrome de lisis tumoral: Ocurre con la destrucción por la quimioterapia de las células
malignas de grandes tumores como los linfomas. Este grave y mortal efecto secundario se
previene al inicio del tratamiento con diversas medidas terapéuticas.
En resumen el mecanismo de acción de la mayoría de los fármacos utilizados en el tratamiento

del cáncer es provocar una alteración en el ciclo celular ya sea en la síntesis de ácidos nucleicos,
división celular o síntesis de proteínas; por lo tanto el conocimiento y estudio del ciclo celular
es básico para el desarrollo de nuevos fármacos anticancerígenos.
El Ciclo Celular Eucariota engloba las siguientes secuencias

• Crecimiento
• Replicación del ADN
• Mitosis
• Nuevo proceso de crecimiento
Comenzando a partir de la citocinesis la célula hija resulta pequeña y posee un bajo contenido
de ATP resultante del gasto experimentado en el ciclo anterior. La acumulación del ATP
necesario y el incremento de tamaño acontecen durante el intervalo (en inglés: gap) G1 de la
interfase, la parte más larga del ciclo celular. Cuando adquiere el tamaño suficiente y el ATP
necesario comienza la fase S, la célula sintetiza ADN (replicación del ADN) proceso que da
como resultado final “un original y una copia” del ADN, destinadas a las dos células que se
originan del proceso. Dado que el proceso de síntesis consume una gran cantidad de energía
la célula entra nuevamente en un proceso de crecimiento y adquisición de ATP la fase G2. La
energía adquirida durante la fase G2 se utiliza para el proceso de mitosis.
La regulación del ciclo ocurre de diferentes formas en las distintas células. Algunas se dividen
rápidamente, otras como la mayor parte de las células nerviosas pierden la capacidad de
dividirse una vez que llegan a la madurez. Algunas, como las células hepáticas, conservan,
aunque no la utilizan, su capacidad de división. Las células del hígado se dividen si se remueve
parte del hígado y su división continúa hasta que el hígado retorna a su tamaño normal (Alberts
et al, 2004).
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Factores ambientales tales como cambios en la temperatura y el pH, disminución de los niveles
de nutrientes llevan a la disminución de la velocidad de división celular. Cuando las células
detienen su división generalmente lo hacen en una fase tardía de la G1 denominado el punto
R (por restricción).
Las células normales se reproducen en respuesta a una “ cascada” de señales que les envían los
factores de crecimiento externo y detienen su división en respuesta a factores inhibidores que,
obviamente, actúan también por medio de una cascada de señales.
Para programar estos sucesos el “ reloj del ciclo celular” se vale de diversas moléculas proteicas.
Los dos “ engranajes “ moleculares de este reloj son
• Las ciclinas
• Las quinasas (las CDK)
Estos “engranajes” se asocian entre sí e inician los “movimientos” que llevan a iniciar los
diferentes estadios del ciclo celular. Por ejemplo en la G1 temprana las ciclinas del tipo D se
unen a la CDK4 o CDK6 y el complejo resultante “libera” el freno que impedía la progresión
hacia la G1 tardía y, por lo tanto, el pase a la fase S (el complejo ciclina D- CDK4/6 desarma
un potente inhibidor de la progresión del ciclo: el formado por la proteína pRB y los factores
de transcripción inactivos).
La progresión del ciclo depende en gran medida de que se alcancen niveles elevados de ciclinas,
a saber en la siguiente secuencia (Lodish et al, 2005):
• Ciclina D
• Ciclina E
• Ciclina A
• Ciclina B
Un instante crucial del ciclo es el que ocurre en el punto R (por restrictivo) de la fase G1
momento en el cual la célula decide si debe o no avanzar en la prosecución del ciclo. La “llave”
de este paso es un conmutador molecular que pasa de “apagado” a “encendido”.
Las ciclinas D y E aumentan su nivel
A medida que sube el nivel de las ciclinas, las mismas se combinan con quinasas dependientes
de ciclinas (es decir enzimas fosforilantes cuya actividad depende de los niveles de ciclinas).
Las quinasas activas transfieren fosfatos del ATP a la proteína pRB (el “freno” del ciclo celular)
Si la pRB no está fosforilada “secuestra” (es decir permanece unida) a otras proteínas claves
para la prosecución del ciclo: los factores de transcripción, en otras palabras, mantiene la llave
en “apagado”.
Cuando el complejo ciclina-quinasa añade suficientes fosfatos a la pRB, la misma libera los
factores de transcripción que actúan sobre los genes
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Los genes estimulados producen proteínas necesarias para que avance el ciclo celular
El esquema muestra las múltiples interacciones moleculares en el curso del ciclo celular.
Más allá del punto R se observa los cambios que ocurren para mantener el conmutador en
“encendido”.
Por otra parte, diversas proteínas reprimen el ciclo al actuar como inhibidores.
Las proteínas p15 y p16 bloquean la actividad del complejo CDK-ciclina D (recuerde que esta
quinasa en su forma activa activa la pRB) impiden que el ciclo progrese de G1 a S.
Otro inhibidor de CDK, la proteína p21 actúa a lo largo de todo el ciclo celular
La p21 está bajo el control de la denominada:
proteína supresora de tumores denominada p53, que entre sus múltiples efectos pueden
mencionarse:
Control de la integridad del ADN

Terminación correcta de las diferentes fase del ciclo
Detención del “crecimiento celular” (duplicación celular) o senescencia
Puesta en marcha del suicidio celular o apoptosis, cuando existe daño en el ADN o los sistemas
de control se desregulan.
Figura 1. Ciclo celular
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Genes supresores de tumores
Los genes supresores de tumores regulan negativamente el ciclo. Se encargan de que la mitosis
no continúe si se ha producido una alteración del proceso normal.
Entre estos genes, también llamados ‘de verificación’, se encuentran los que codifican:
productos que evitan mutaciones de genes reguladores del ciclo
proteínas que inactivan las CDK por fosforilación/desfosforilación (ej. quinasa WEE1,
fosfatasa CDC25)
proteínas CKI inhibidoras del ciclo (ej. p53, p21, p16)
proteína Rb (retinoblastoma), cuya alteración génica recesiva causa el cáncer de retina con ese
nombre.
proteínas que inducen la salida del ciclo hacia un estado celular diferenciado o hacia apoptosis
(ej. Bad, Bax, Bak, receptor de ligando de Fas)
La verificación se lleva a cabo en los puntos de control y asegura la fidelidad de la replicación

y segregación del genoma. Algunos componentes, además de detectar fallos, pueden poner en
marcha la reparación.
Algunos oncógenos y agentes supresores de tumor pueden alentar o prever apoptosis (Bruce
et al, 2000).
Puntos de control
Existen puntos de control en el ciclo que aseguran la progresión sin fallos de éste:
Punto de control de DNA no replicado, en la entrada de fase M. Actúa inhibiendo a Cdc25, el

cual es un activador de la Ciclina A/B Cdk1.
Punto de control de ensamblaje del huso, antes de la telofase. Se activa una proteína Mad2
que impide la degradación de la segurina, lo que impide la segregación de las cromátidas
hermanas.
Punto de control de la separación de cromosomas, al final de la mitosis. En el caso de que fuera

incorrecto, se impediría la degradación de la ciclina B por APC.
Punto de control del daño del DNA, en G1, S o G2. El daño celular activa a p53, proteína
que favorece la reparación del DNA, detiene el ciclo promoviendo la transcripción de p21,
inhibidor de Cdk, y, en el caso de que todo falle, estimula la apoptosis (Nelson et al, 2000).
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Para que la célula se transforme en neoplásica se requieren, al menos, 2 mutaciones: una en

un gen supresor de tumores y otra en un protooncogén, que dé lugar, entonces, a un oncogén
(Eastman, 2003).
Nanomedicina aplicada a Tumores
La nanotecnología es un campo de las ciencias aplicadas dedicada al control y manipulación de

la materia a una escala menor que un micrómetro, es decir, a nivel de átomos y moléculas. La
aplicación de la nanotecnología en medicina (nanomedicina) es un campo multidisciplinario
que implica el diseño de materiales con propiedades específicas que interaccionan en el cuerpo
a nivel celular con una alta especificidad (Sahoo et al, 2007 y Liu et al, 2007). De particular
interés es en el área de investigación en cáncer (Kim, 2007). En la actualidad como se ha
indicado los quimioterapéuticos son tóxicos tanto para el tumor como para las células normales,
por lo tanto en muchos casos la eficacia de los quimioterapéuticos está limitada a los efectos
secundarios del fármaco (Brigger et al, 2002). El desarrollo de estructuras prediseñadas para la
liberación controlada a nivel nanométrico como pueden ser dendrímeros (polímeros esféricos
ramificados), micelas de sílica recubiertas, nanopartículas de cerámicos (López et al, 2007),
liposomas, etc. (Radozs, 2007 y Oh, 2006) que pueden ser funcionalizadas para ser específicas
hacia células cancerígenas y por lo tanto tengan un incremento de selectividad, esto es que los
fármacos actúen en las células cancerígenas lo cual implicaría una reducción en la toxicidad
hacia tejido normal (Couzin, 2002 y LaVan et al, 2003). En esta área la nanotecnología
cambiará radicalmente la manera de hacer el diagnóstico, tratamiento y prevención. El glioma
es el tumor primario más frecuente de cerebro, los gliomas malignos están asociados con un
mal pronóstico, el promedio de sobrevida de pacientes con glioblastoma múltiple (GMB) es de
1 año (Arrieta et al, 2005). Estos tumores inoculados en animales de laboratorio es un modelo
común para el estudio experimental en oncología (Peterson et al, 1994). Se han sintetizado
nanopartíulas de óxido de titanio que contienen complejos de platino por medio del método
sol-gel; las especies de platino están químicamente unidas a las nanopartículas de óxido de
titanio, el tratamiento con estas nanopartículas de óxido de titanio-platino en ratas a las cuales
se les inoculó glioglastoma múltiple es muy alentador ya que se obtuvo una reducción en el
crecimiento de los tumores de un 56%, además muestran un efecto sinérgico entre el óxido de
titanio y el complejo de platino (López, et al 2008).
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http://www.efn.uncor.edu/dep/biologia/intrbiol/ciclo.htm
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Enfermedades neurodegenerativas.

Introducción
Los avances en genética molecular han abierto grandes esperanzan en el estudio de enfermedades
neurodegenerativas (EN), entre los 35000 genes del genoma humano, muchos de ellos van a
codificar proteínas expresadas solamente en el sistema nervioso, también muchos genes van a
codificar proteínas que se expresan, con diferentes grados, en distintos tipos de neuronas, de
esta manera, ciertas poblaciones neuronales van a ser especialmente vulnerables a los cambios
originados por variaciones genéticas por factores ambientales o por la combinación de ambos.
Actualmente está claro que son consecuencias de anormalidades en el proceso de ciertas

proteínas, de aquí el nombre de proteopatías, que al acumularse en el tejido nervioso dentro y
fuera de las neuronas, produce manifestaciones clínicas.
En todas las enfermedades neurodegenerativas, se presenta por lo menos algún tipo de proceso
anormal de las proteínas neuronales, que pueden ser (Praag et al., 1999, Sohal RS 1996):
• Plegamiento anormal de proteínas
• Alteraciones en las modificaciones post-traduccionales de proteínas nuevamente
sintetizadas.
• Anormalidades en el proceso proteolítico.
• Anomalías en los genes que intervienen en el acoplamiento de corte y empalme (splicing
alternativo).
• Expresión impropia
• Reducción de aclaración de las proteínas degradas.
Por lo se infiere que deduce que las proteínas procesadas defectuosamente, fácilmente se
acumulan cuando se convierten en ineficaces los mecanismos para su eliminación, y por ende,
cuando se procesan mal, alteran su funcionamiento de las diferentes neuronas y por lo tanto
se manifiesta su enfermedad. Son procesos crónicos y progresivos que se caracterizan por la
pérdida selectiva y simétrica de neuronas en los sistemas motor sensorial y cognitivo.
De acuerdo a la característica de la delimitación de los marcadores celulares específicos de la

enfermedad, ha permitido la clasificación nosológica de estas enfermedades de la siguiente
manera:
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Enfermedades neurodegenerativas
En cuanto a la predisposición genética existen algunas como la enfermedad de Huntington,

donde es marcada la tendencia familiar, mientras que el Alzheimer, Parkinson y la esclerosis,
solo del 1 al 10% de los casos son hereditarios. En los últimos años se han incrementado
los estudios relacionados con el envejecimiento tisular, principalmente en las enfermedades
neurodegenerativas. Dichas patogenias están basadas por reacciones que están mediadas por
los llamados radicales libres o especies reactivas de oxígeno.
Enfermedad de Parkinson (EP)
Clínicamente se caracteriza por la presencia de bradicinesia, rigidez, temblor y a nivel

neuronal por la pérdida de las neuronas monoaminoérgicas del tronco cerebral, de manera
significativa en la sustancia negra y el locus coeruleus, que están relacionadas por una
disminución significativa de los niveles de dopamina (DA) y de sus metabolitos tales como los
ácidos 3,4-dihidroxifenilacético (DOPAC) y el homovanílico (AHV), cuando se presentan los
síntomas, ya se ha establecido una pérdida neuronal mínima del 80% en la sustancia negra
compacta. Presencia de cuerpos de inclusión eosinófilos citoplasmática, denominados cueros
de Lewy (Shors et al., 2001, Wickelgren et al., 1996).
La etiolgía de la EP es desconocida, aunque se ha sugerido que ésta podría ser multifactorial,

interviniendo en la misma diversos factores genéticos, ambientales y de envejecimiento, sin
embargo, no existen datos que apoyen alguno de estos factores como único responsable, e
incluso se ha sugerido la posibilidad de que en el término EP se designen varias enfermedades
diferentes. Los posibles mecanismos patogénicos también son desconocidos, aunque las
hipótesis más aceptada en la actualidad incluye la contribución de los siguientes factores: 1.
Estrés oxidativo, 2. neuromelanina, 3. alteraciones de la función mitocondrial, 4. excitotoxicidad
5. déficit de proteínas ligadoras de calcio, 6. óxido nítrico, 7. déficit de factores tróficos, 8.
Citoquinas (Shors et al., 2001).
El descubrimiento de que el derivado piridínico MPTP era capaz de inducir un cuadro

parkinsoniano parecido a la EP, tanto en humanos como en animales, ha ayudado a
comprender algunos de los posibles mecanismos eiopatogénicos de dicha enfermedad. El
MPTP es transformado por la monoaminoxidasa B (MAO B) glial en ion MPDP+, compuesto
inestable que se transforma rápidamente en el ion l-metil-4 fenilpiridinio (MPP+), metabolito
responsable de la acción neurotóxica. El MPP+ es captado por las neuronas por el mismo
sistema de recaptación que la dopamina e inhibe el complejo K (NADH-CoQ1 reductasa) de
la cadena respiratoria mitocondrial y el complejo ala-cetoglutarato-deshidrogenasa del ciclo
de Krebs. Como consecuencia se produce una marcada disminución de la síntesis de ATP y
de glutatión, una alteración energética y reducción del atrapamiento de electrones libres y de
sustancias oxidantes, que conducen a la muerte neuronal. Estas acciones inhibidoras sobre
complejos enzimáticos mitocondriales son también ejercidas por análogos endógenos de las
tetrahidroisoquinolinas, que se han implicado en la etiopatogenia de la EP (Luquin et al., 1991,
Maeto et al., 1990, Mizumo et al., 1987).
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Enfermedad de Alzheimer (EA)
Se describió por primera vez en 1907 por Alois Alzheimer, en donde establece los cambios
anatomopatológicos que consiste en ovillos neurofibrilares y placas seniles o neurotróficas.
Los ovillos neurofribrilares son agregaciones de proteína microtubular TAU, que se encuentra
hiperfosforilada. Si se observa al microscopio electrónico, las neurofibrillas de los ovillos
aparecen como filamentos helicoides pareados. Las placas seniles resultan de acumulo de varias
proteínas en una reacción inflamatoria alrededor de los depósitos de la sustancia denominada
β-amiloide. En algunas placas neuríticas degeneradas se encuentran segmentos de proteína
TAU. A medida que las lesiones progresan se pierden neuronas en el hipocampo, en el córtex
enthorrinal y en las áreas asociadas del neocortex. Aun todavía se discuten si los primeros
cambios corresponden a los ovillos neurofibrilares o a las placas seniles, aunque la mayoría se
inclina por las últimas (Shors et al., 2001; Annunziato et al., 2003).
Estudios efectuados en pacientes mayores de síndrome de Down revelaron la presencia de

ovillos neurofibrilares y placas seniles como en el Alzheimer, lo que sugirió que copias extras
de genes en el cromosoma 21, eran capaces de inducir el espectro patogénico de esta última
enfermedad neurodegenerativa. El estudio de los depósitos de amiloide en las placas seniles
y en pequeños vasos de la corteza cerebral demostró que contenían un fragmento proteico,
la β-amiloide, cuya secuencia en aminoácidos suministro las bases para la clonación del
gen β-amiloide. Este gen codifica a una proteína de larga cadena polipeptídica de 695-770
aminoácidos, denominada proteína precursora amiloide, de la que se origina la β-amiloide,
fragmento compuesto de 40-42 aminoácidos.
Desde el punto de vista neuropatológico se caracteriza por la pérdida progresiva de poblaciones

neuronales, especialmente a nivel de la corteza cerebral e hipocampo, y la presencia de
placas seniles y ovillos neurofibrilares en las regiones afectadas, la atracción neuroquímica
más importante es la disminución de inervación colinérgica cortical, con disminución de
inervación colinérgica cortical, con disminución de la actividad de colinacetiltransferasa
(Benzi et al., 1995).
La etiología de la EA es desconocida, aunque podría relacionarse con la interacción entre

envejecimiento y factores genéticos y ambientales. Se ha sugerido que algunos defectos en el
metabolismo energético y el estrés oxidativo, podrían estar implicados en la patogenia de la
muerte neuronal en la EA (Benzi et al., 1995)
Mediante tomografía por emisión de positrones se ha demostrado disminución de flujo

sanguíneo cerebral y de metabolismo de glucosa en la corteza cerebral y de metabolismo
de glucosa en la corteza cerebral de pacientes con EA, que se relaciona con la gravedad de
la demencia. Se ha descrito también disminución de actividad de los complejos enzimáticos
piruvato-deshidrogenasa en cerebro y de alfacetoglutarato-deshidrogenasa en cerebro y en
fibroblastos de pacientes con EA (Benzi et al., 1995, McNaught et al., l995).
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Enfermedad de Huntington (EH)
Es la causa más frecuente de corea (manifestaciones nerviosas) hereditaria. Su herencia es

autonómica dominante, con penetrancia completa, y el defecto genético es conocido. Desde
el punto de vista clínico, la forma clásica de EH se caracteriza por la presencia de trastornos
del movimiento –de los cuales el más frecuente es la corea-, alteraciones psiquiátricas –muchas
veces son la primera manifestación e incluyen cambios de personalidad, depresión-manías,
ilusiones y alucinaciones, paranoia y cuadros esquizofreniformes, etc.-, y demencia, siendo la
edad de comienzo habitual la cuarta década (Jiménez-Jiménez et al., 1997).
El hallazgo anatomopatológico más característico es la atrofia de neoestriado (sobre todo de

la cabeza del caudado), el cual presenta pérdida neuronal (fundamentalmente de neuronas
pequeñas espinosas) y gliósis. Las alteraciones neuroquímicas más importantes son la depleción
de GABA, glutamato-descarboxilasa y acetilcolina en estriado, aunque también se han
descrito cambios en las concentraciones de algunos neuropéptidos como encefalinas, sustancia
P y enzima convertidora de angiotensina, así como disminución de receptores de GABA,
benzodiacepinas y acetil colina en caudado y putamen (Jiménez-Jiménez et al., 1997,1998).
La patogenia de la muerte neuronal (tabla l) en la EH es desconocida. La hipótesis más

aceptada es la neurotóxica, según la cual el daño neuronal sería mediado por aminoácidos
excitadores como glutamato y aspartato o por metabolitos endógenos del triptófano como
el ácido quinolínico. También se ha sugerido el posible papel de estrés oxidativo y de las
alteraciones de la función mitocondrial. Un hallazgo potencialmente interesante es la reciente
descripción de que el ácido –nitropropiónico, inhibidor del complejo II de la cadena respiratoria
mitocondrial, es capaz de reproducir las características clínicas y neuropatológicas de la EH en
modelos animales (Jiménez-Jiménez et al., 1998, Palfi et al., l998).
Otras enfermedades
No existen muchos datos con respecto a la función mitocondrial en pacientes con esclerosis
lateral amiotrófica (ELA). Se ha encontrado disminución de la actividad del complejo I en
médula, especialmente en sus regiones ventrales. Algunos autores han señalado disminución de
actividades del complejo I en pacientes con distonía, tanto focal como generalizada, mientras
que otros sólo han encontrado dicha alteración en distonías focales (Jiménez-Jiménez et al.,
1998, Palfi, et al., l996).
Papel de los neurotransmisores
La unidad fundamental del sistema nervioso es la neurona, células altamente especializadas

caracterizada por la excitabilidad y conductividad, para estas funciones las neuronas liberan
compuestos químicos llamados neurotransmisores, los cuales se clasifican en: aminas biogénicas
determinados aminoácidos y determinados péptidos.
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Tabla l.- Características de algunas enfermedades neurodegenerativas
Se caracteriza por Sintomatología Neurotransmisor Alteraciones

clásica afectado
Alzheimer Depleción de Alteración en los Disminución de Placas seniles,
neuronas procesos de memoria acetilcolina ovillos
colinérgicas y lenguaje neurfibrilares,
principalmente el pérdida de
hipocampo y la neuronas
amígdala.
Parkinson Depleción de Modificación en el Disminución de Cuerpos de
neuronas control y la Dopamina Lewy y
dopaminérgicas de coordinación del depleción de
la sustancia negra y movimiento dopamina
ganglios basales
Esclerosis Reducción de Debilidad progresiva. Incremento en la Inclusiones
lateral motoneuronas concentración de celulares y
amiotrófica glutamato axones
motores
inflamadas
Los neurotransmisores se liberan en la superficie presináptica y se ligan a sus correspondientes

receptores de la superficie posináptica, y produce un cambio en el potencial de acción
posináptico, por lo que la terapéutica está dirigida para modular los procesos que regulan la
concentración de neurotransmisores a través de: la síntesis, almacenamiento, catabolismo y
recaptación durante la sinopsis.
Acetilcolina.
Es el neurotransmisor específico de las sinopsis neuromusculares del sistema nervioso somático,

así como de las sinapsis ganglionares del sistema nervioso autónomo y los órganos diana de la
división parasimpático.
Participa en la regulación de los niveles de vigilancia y áreas de asociación. Cambios en los

niveles producen alteraciones en la conducta y síndromes característicos como: pérdida de la
memoria y atención, habla confusa, ataxia o desorientación. La alteración en la neurotransmisión
colinérgica está implicada en el Alzheimer (por defecto) y en menor medida en el Parkinson
(por exceso). La acetilcolina aumenta su acción cuando desciende el nivel de la dopamina,
por lo que el bloque de la acción de la acetilcolina resulta eficaz en el control del temblor
y la rigidez en el Parkinson. Por tal motivo, las investigaciones farmacológicas han dirigido
sus investigaciones a los siguientes objetivos (De Jesús, 2003, Cummings 2003). 1.- Fármacos
que potencian la síntesis de colina como lecitina, alfoscerato y la CDP-colina., 2.- Fármacos
agonistas de los receptores nicotínicos como el betanecol, la oxotremonina, la nanomelina y la
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nicotina entre otros. 3.- Fármacos inhibidores del catabolismo de la acetilcolina, inhibidores de
acetilcolinesterasa como la tacrina, el donepezilo, la rivastigmina y la galantamina (Westaway
D 2002, Karatsky et al., 2003, Anande et al., 2003).
Dopamina
Debido a que existe una localización encefálica más elevada que la noradrenalina, la
dopamina es el neurotransmisor catecolaminérgico más importante, y por lo tanto, con
mayor repercusión. Estudios realizados en cerebros post mortem de pacientes con Parkinson
se han encontrado niveles bajos de dopamina. La farmacología mantiene las investigaciones
sobre fármacos que recuperan los niveles de dopamina: l. Precursores de la síntesis de
dopamina, como la levodopa, 2. Potenciadores de su liberación en los botones sinápticos
como la amantadina, 3. Agonistas de receptores dopaminérgicos, como la bromocriptina, la
apomorfina, lalisurida, el ropiniro, el pramipeso, la cabegolina y la pegolida. 4.- Inhibidores
de las enzimas encargadas de su catabolismo, como la monoamino oxidasa B (MAO B);
destacan la selegilina, o la enzima catecol-O-metiltrnasferasa (COMT); entacapona y
tolcapona (Muller et al., 2003; Crosby et al., 2003).
Debido a que la dopamina no atraviesa la barrera hematoencefálica, no se utiliza como fármaco

en neurología. Sin embargo, son varias las aproximaciones que se han realizado con el fin de
aumentar sus niveles, fundamentalmente los transplantes en las áreas afectadas, de células
capaces de secretar dopamina, como son neuronas dopoaminérgicas, células cromoafines de
la glándula suprarrenal y células del cuerpo carotideo. Estudios más recientes, en modelos
animales, se realizan transplante de células indiferenciadas y se logra un crecimiento y
diferenciación completa hasta neuronas dopaminérgicas (Bjorklund et al., 2002).
El uso de precursores de dopamina se utiliza ampliamente y de ellos destaca principalmente la

levodopa, que es capaz de atravesar la barrera hematoencefálica (BHE) y es un eficiente fármaco
para el tratamiento de Parkinson, este fármaco, se absorbe bien en el intestino delgado, pero
se inactiva en una gran porción (aprox. el 95%) por la MOA (monoamino oxidasa) periférica
y da lugar a la aparición de conocidos efectos secundarios, por lo que se coadministra junto
a fármacos inhibidores de la descarboxilasa, como la carbidopa o la benseracida, incapaces
de atravesar la BHE y de esta manera, no solo se evitan los efectos secundarios, si no que se
reduce, unas diez veces, la dosis de levodopa necesaria (Bjorklund et al., 2002).
Glutamato
El glutamato es el neurotransmisor excitatorio por excelencia. Media su efecto al activar

distintos receptores: ionotrópicos, que forman canales iónicos de localización, principalmente,
posináptica como el receptor de NMDA (N-metil-D-aspartato), vinculado con el flujo de cationes
Na+, K+, Ca+2, el receptor de AMPA (Alfa-amino-3-hidroxi-5-metil-isoxazol propiónico) y el
receptor para kainato, asociado a los iones Na+ y K+ y otros presinápticos, conocidos como
metabotrópicos, al mediar su efecto mediante la activación de proteínas G (Conti et al., l998)
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El glutamato participa en 70% de las sinapsis excitatorias, sin embargo, la activación excesiva
de sus receptores, bajo ciertas condiciones, es neurotóxica, y se ha relacionado con procesos
neurodegenerativos, tanto agudos como crónicos. En la neurotoxicidad aguda (p. ej., la isquemia
cerebral), el déficit energético celular conlleva una disminución en la recaptación de glutamado
del espacio sináptico, con el consecuente aumento en su concentración y un incremento de la
sensibilidad de las neuronas al glutamato. La sobre activación de los receptores en esta situación
tiene como resultado una alteración de los iones de Na+ y Cl- que genera la entrada masiva de
agua, e induce la lísis osmótica de la neurona. Hasta la fecha, el glutamato permanece como
marcador bioquímico más potente de deterioro neurológico precoz tras el ictus. Por otro lado,
la neurotoxicidad crónica se media por mecanismos dependientes de la entrada de Ca+2 y se
implica en enfermedades como la ELA, la demencia asociada al SIDA, Parkinson, Huntington
y Alzheimer (Urbani et al., 2000, Kilpatrick et al., 2002)
La farmacología del glutamato, ha centrado sus estudios en fármacos que o bien disminuyen
los niveles sinápticos del neurotransmisor (riluzol, lubeluzol), o antagonizan los receptores
ionotrópicos (selfotel, eliprodil, aptiganel, licostinel, remacemide, dizocilpina y gavestine entre
otros) (Catillo et al., 1997; Muir et al 1995; Urbani et al., 2000)
Muerte celular
Los procesos de muerte celular se engloban dentro de dos grandes bloques, la necrosis y
apoptosis. La necrosis se ha relacionado con estados agudos donde la célula pierde, de una
forma brusca, la integridad de sus organelos, y disipa la capacidad de síntesis de energía y el
control de la homeostasis celular, Estos procesos se han relacionado con patologías como el
traumatismo o la isquemia. Sin embargo durante los procesos apoptóticos la célula mantiene
la integridad de sus organelos hasta estadios bien tardíos, lo que le permite conservar el estado
energético, la homeostasis celular, y en algunos casos, mantener la maquinaria necesaria
para sintetizar proteínas implicadas en estas rutas, por lo que se le ha llamado muerte celular
programada. Células con características apoptóticas se han observado en áreas afectadas en
neuropatías como EA, ELA, EP, EH entre otras (Diener et al., l997).
En los procesos apoptóticos se pueden estableces tres fases: la de activación, propagación y

ejecución que en algunos casos se precede de latencia de extensión variable.
Fase de activación: se media por señales extracelulares, como la unión de ligando a su receptor;
como el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a) o los neurotramisores excitatorios como
los antes mencionados. En esta etapa, el ión Ca+2 juega un papel importante en el Sistema
Nervioso Central (SNC), donde se incluye la producción del potencial de acción, la liberación
de neurotransmisores, la plasticidad neuronal y probablemente en la formación de la memoria.
Sin embargo, la entrada masiva de Ca+2 o el fallo de los mecanismos que regulan su contracción
desencadenan una serie de acontecimientos que llevan a la muerte neuronal mediada directa
o indirectamente con el Ca+2. El aumento de la concentración intraneuronal de calcio puede
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conducir a la activación de rutas moleculares entre las que se incluyen las proteincinasas, las
fosfolipasas A2, la óxido nítrico sintetasa y las proteasas, estas rutas inducen a la generación
de radicales libres, con el daño en organelos como las mitocondria y el retículo endoplásmico
(Zipfer et al., 2000; Annunziato et al., 2003).
Las neuronas, en su citoplasma, contienen proteínas con capacidad de amortiguar Ca+2, como
la calbindina o la parvoalbúmina. En determinadas patologías como la EA o la ELA, los grupos
neuronales que carecen o expresan cantidades muy pequeñas de esas proteínas, se vuelven más
sensibles, mientas aquellos que expresan grandes cantidades parecen respetarse relativamente.
(Prehn et al., 1997).
Especies reactivas de oxígeno
Se sabe que aunque el estrés oxidativo no es el causante directo o el factor etiológico responsable
de las neuropatologías, existen evidencias de que la presencia de radicales libres produce el daño
tisular y degenerativo secundario que acompaña a estas enfermedades (tabla 2). Se sabe que
el SNC específicamente el cerebro, tiene un alto requerimiento metabólico de oxígeno y una
alta concertación de ácidos grasos poliinsaurados, por lo que lo convierte en un lugar propenso
a la peroxidación lipídica. La sobreproducción de radicales libres que pueden atacar y dañar
irremediablemente el tejido neuronal, contribuye de manera directa o sinérgica al proceso
neurodegenerativo. Para prevenir los aumentos descontrolados de EROS, las células tienen
sistemas antioxidantes. Estos sistemas pueden clasificarse en sistemas enzimáticos (superóxido
dismutasa, la catalasa y la glutatión peroxidasa), antioxidantes endógenos (transferían, la
lactoferrina, la ceruloplasmina, la albúmina, la bilirrubina el ácido úrico) o contenidos en
la dieta (vitaminas C y E, el β-caroteno, los flavonoides, el selenio y el zinc) y por último
Tabla 2. Mecanismos de muerte celular en enfermedades neurodegenerativas
Enfermedad Apoptosis Excitotoxicidad Estrés Factores Proteínas Inflamación

oxidativo vasculares tóxicas
Alzheimer + + + + + +
Parkinson + + + + +
Huntington + + + +
Esclerosis lateral + + +
amiotrófica
Demencia + + + +
vascular
Traumatismo + + + +
Isquemia + + + + +
cerebral
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antioxidantes farmacológicos (tirilazad, ebselen, la N-acetil cisterna, las porfirinas) entre otros
(Imam et al., 2001, Butterfield et al., 2002, Butherfield et al., 2002).
El mantenimiento y la optimización de los mecanismos de defensa antioxidante en el

cerebro constituyen una estrategia importante para prevenir o reducir la progresión de la
neurodegeneración. El potencial de los antioxidantes en la dieta –incluidos del beta caroteno,
vitaminas C y E- para proteger contra la pérdida cognitiva y los trastornos neurodegenerativos,
se ha explorado en varios estudios epidemiológicos y clínicos, y muestra una correlación
significativa entre los niveles de vitamina E en el suero y la memoria en una población adulta
(Pong et al., 2001).
Factores de transcripción
Se ha observado que durante algunos procesos de muerte celular se produce la activación de

rutas metabólicas que necesitan de la síntesis de novo de determinadas proteínas. Una de las
formas más importantes de control de la expresión génica es la regulación transcripcional,
y dentro de ésta, los factores de transcripción (FT), se encargan de llevarla a cabo de forma
preferente. Los FT son proteínas que se unen a secuencias específicas de ADN y que modulan
la expresión de los genes. Los FT se localizan en el citoplasma de forma inactiva y tras un
estímulo determinado, que pueden ser Ca+2, EROS o factores tróficos, se activan y se trasloan
al núcleo. Entre los factores de trascripción destacan el factor nuclear kB (NG-kB), la familia
de proteínas activadora-1 (AP-1), que engloba miembros como c-fos y c-jun, y el p53, entre
otros. Uno de los más importantes es el NF–kB, que permanece en el citoplasma celular
unido a proteínas inhibidoras conocidas como IkB. Cuando una señal externa, como factores
neutróficos o EROS, afecta a la célula, el complejo IkB cinasa (IKK) se activa y fosforila a las
proteínas iKB. Entonces, iKB fosforilada se degrada rápidamente y libera y activa así al NF-
kB. Entre los fármacos inhibidores de la familia NK-kB se encuentran algunos de los fármacos
antiinflamatorios más comúnmente usados, como el salicilato aspirina y algunos esteroides
(Uberti et al., 2002).
Otra diana farmacológica es la proteína p53, ésta controla la integridad del ADN y la
terminación correcta de las diferentes fases del ciclo, y detienen el crecimiento celular cuando
existe daño en el ADN o los sistemas de control de regulación. Se ha encontrado activada en
pacientes de la EP, EA 97, y tras la exposición a radiaciones gamma. Fármacos inhibidores de
p53, como la pifithrin-a y el Z-1-117 han sido efectivos en modelos experimentales frente a
diversos estímulos neurotóxicos (Duan et al., 2002).
Fase de propagación: se efectúa intracelular, se media por la participación de segundos

mensajeros como el Ca+2, las especies reactivas de oxígeno (ERO) y factores de transcripción
como p53, y AP-1 entre otros.
La mitocondria ocupa hoy un lugar privilegiado en los procesos de muerte cedular, alteraciones
mitocondriales y alteraciones en los complejos de la cadena transportadora de electrones, se
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han descrito en células de individuos que padecen EH o EA. El campo de la farmacología

mitocondrial se ha enfocado en los últimos años en el estudio de los procesos que se relacionan a
la formación y apertura del pro de permeabilidad transitoria mitocondrial (PPTM). El bloqueo
de la formación de PPTM resulta en la protección de cultivos celulares frente a estímulos
apoptóticos que pueden mediare a través del Ca+2 y las EROS. Fármacos bloqueadores
de la apertura de PPTM, como la ciclosporina A y el ácido clavulanico, presentan efectos
neuroprotectores en modelos neurotóxidos de la corea de Huntington (Leventhal et al., 2000).
Etapa de ejecución: Se activan en las células procesos de degradación en los que participan
proteasas y DNasas. Durante esta fase, se lleva cabo la degradación de proteínas, que se medía
fundamentalmente por la acción de proteasas, como los miembros de la familias de cisterna
(caspasas y calpainas) y serina proteasas. Estas enzimas hidrolizan sustratos selectivos como
elementos del citoesqueleto (actina, fodrina, proteína tay y catenina, enzimas encargadas de
reparar (PARP) o degradar (ADNasa) el ADN celular, factores de transcripción (retinoblastoma,
MDM2), proteínas reguladoras cinasas y fosfatasas (proteína cinasa C, fosfatasas 2, cinasas de
adhesión focal, Akt, raf1) (Jordan et al., 2000).
En modelos experimentales, la activación de las caspasas parece implicarse en algunas END

como la EA, ELA y la EP y la corea de Huntington. Hoy en día, se dispone de fármacos
inhibidores de caspasas, tanto de origen vital (crmA, p35 y el péptido inhibidor de apoptosis),
como de origen sintético (Z-VAD-FMK específico para las caspasa 1,3,4,7, Z-DEVD-FMK,
inhibidor de caspasa-3). La utilización de estos fármacos protege a los cultivos celulares de la
disminución de la viabilidad inducida por neurotoxinas, y se comienza a utilizar, con cierto
éxito, en modelos experimentales de EP. Así, el péptido inhibidor Ac-YVAD-CMK favorece
la viabilidad de los implantes de neuronas dopaminérgicas y mejora sustancialmente la
recuperación funcional de ratas parkinsonianas (Schiele et al., 1999).
Otras dianas.
Estrategia antiinflamatoria
La progresión de END se acompaña de procesos de inflamación en astrocitos y microglia. De

hecho, en estudios experimentales, determinados agentes anticitocinas capaces de modular IL-
1, TNF-α han mostrado capacidad neurorotectora, así como de las citocinas proinflamatorias
en el deterioro neurológico precoz tras el ictus isquémico. En la EA existen procesos de
inflamación asociados a las placas neurítica y a la degeneración neurofibrilar, estudios
epidemiológicos asocian a los fármacos antiinflamatorios no esteroideos con retrasos en la
aparición, o con una progresión más lenta de esta enfermedad. Este efecto neuroprotector
puede explicarse por la inhibición de la ciclooxigenasa (COX), y en concreto la COX-2, cuya
expresión se eleva en áreas relacionadas con la memoria y que se correlaciona con el depósito
de la proteína β-amiloide. Se ha demostrado la acción de trifusal, un antiagregante plaquetario,
en los mecanismos inflamatorios involucrados en la demencia. Su efecto parece mediarse por
la inhibición tanto de la activación del factor de transcripción N-kB, como de la expresión de
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COX-2, también el ibuprofeno confiere citoprotección a cultivos neuronales dopaminérgicos

frente a estímulos excitotóxicos (Avisen et al., 2002).
Factores de crecimiento y hormonas.
La falta o escasez de determinados factores de crecimiento (FC) puede ser la causa de procesos
neurodegenerativos, el factor de crecimiento nervioso (NGF), la neurotrofina 3 (NT-3) o el
factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), son miembros de la familia genética de
las neurotrofinas que inducen supervivencia, diferenciación, mantenimiento y reparación
de poblaciones neuronales específicas. Posiblemente la falta de modulación de los complejos
ciclinas-cdk, por parte de determinados FC, sea uno de los motivos que conducen a la apoptosis.
Además la ausencia de inducción de los genes responsables de la síntesis de determinadas
enzimas antioxidantes o redeterminadas proteínas amortiguadoras de Ca+2, probablemente
también influya en el desarrollo de la muerte neuronal. Así, los niveles de BDNF se reducen
significativamente en el Hipocampo y la corteza parietal del paciente con EA. En este sentido,
el suministro de determinados FC como el NGF, la NT-3, el GDNF o el BDNF, podrían
constituir una terapia protectora en muchas END (Lars O. 2000).
Inmunomodulación
En algunos procesos degenerativos se ha observado la existencia de una desregulación del

sistema inmune. La farmacología centra sus investigaciones en sustancias capaces de modular
estos procesos. El ejemplo más investigado conocido que sirve como modelo de estudio de la
inmunomodulación en neurología es la EM. En ella se ha observado la presencia de linfocito
T autorreactivos frente a proteínas específica de la mielina, que orquestarían una respuesta
defensiva aberrante frente a antígenos del SNC. En la actualidad, dos son los frentes abiertos en
el tratamiento farmacológico inmunomodulador en la EM. El primero utiliza los interferones
(INF), como el IFN β1a, cuya acción terapéutica parece medirse por su capacidad para inducir
un desplazamiento de la respuesta inmune, al facilitar la diferenciación de las células T hacia
poblaciones Th2, que ejercerían un efecto antiinflamatorio y aumentar los niveles de algunas
interleucinas como las IL-4, IL-10 y el factor de crecimiento transformante beta con una
disminución de los niveles de IL-2, IFN γ y el TNF-α entre otros (García-Merino et al., 2003).
Otras alternativas
El esclarecimiento de las rutas de síntesis del péptido β-amiloideo, componente mayoritario

de las placa y depósitos neurofibrilares, ha permitido grandes avances en la terapéutica de
la EA. El bloqueo del paso de proteína precursora del β-amiloide (APP) mediante el uso de
fármacos inhibidores de la secretasa, proteasa encargadas de metabolizar APP, constituye una
de las grandes apuestas. Por ultimo, se han realizado aproximaciones para la construcción
revacunas contra las END. Así en la EA se ha desarrollado una vacuna experimental, la AN-
1792, con la utilización de placas amiloides como agente invasor del cerebro. Aunque en un
principio presentó resultados muy esperanzadores, ya que su administración a un grupo de
233
LIBRO UAM.indd 233 01/12/11 17:11

pacientes indujo la formación y acumulación de anticuerpos dirigidos contra las placas de

b-amiloide, el ensayo clínico ha tenido que detenerse debido a la respuesta inflamatoria del
SNC (Westaway D. 2000).
Conclusiones
Existen dos líneas para el tratamiento de la enfermedades neurodegenerativas, la primera

etiopatogénica, cuyo objetivo es detener la muerte celular y fomentar la recuperación de
poblaciones afectadas mediante fármacos que modulen las rutas bioquímicas relacionadas con
estos procesos, la segunda tendencia es la fisiopatológica que busca prevenir, retardar o paliar la
aparición de la sintomatología de los cambios relacionados con los niveles de neurotransmisores
y procurar su mantenimiento.
El enorme progreso en la comprensión de los mecanismos de transcripción ofrece la posibilidad

del desarrollo de una nueva generación de fármacos, que deberán ser capaces de modular
la síntesis de factores de transcripción, regular su activad y las interacciones con proteínas
activadoras e inhibidores o su unión al ADN. Debido a la alta especificidad de esta nueva
vía terapéutica, parece claro que estos agentes proporcionarán buenas herramientas para la
prevención y el tratamiento de alguna variedad de enfermedades en un futuro no muy lejano.
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236
LIBRO UAM.indd 236 01/12/11 17:11

Bioquímica de los esteroides y su acción a nivel
del Sistema Nervioso Central
Esteroides
Las fracciones de lípidos que se obtienen de plantas y animales contienen un grupo importante
de compuestos que se conocen como esteroides. Estos compuestos son reguladores biológicos
importantes y casi siempre presentan efectos fisiológicos severos cuando se administran a
organismos vivos. Dentro de estos compuestos se encuentran las hormonas sexuales masculinas
y femeninas, las hormonas adrenocoticoides, la vitamina D, los ácidos biliares y algunos
venenos cardiacos (Montenegro, 2002).
Los esteroides son derivados del sistema de anillos perhidrociclopentano fenantreno que se
muestra en la figura 1, Los átomos de carbono de este sistema de anillos se enumeran como se
muestra en la figura. Los cuatro anillos se designan con letras, A, B, C y D.
En la mayoría de los esteroides, las uniones entre los anillos B,C y C,D son trans. Sin embargo,
la unión entre los anillos A,B pueden ser cis o pueden ser trans, y esta posibilidad da lugar a
18
CH3
12
17
11 13
19
CH3 CH D 16
1 9 14
2 10 8 15
A H H
3 5 B 7
4 6
Figura 1. Anillo perhidrociclopentanofenantreno
237
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Bioquímica de los esteroides
dos grupos generales de esteroides que poseen las estructuras tridimensionales que se muestran
en la figura 2.
18
A) B) 19 18
11 13 17
19 12 13
10 9
10 9
8 16 8 14 16
2 1
6 5
7
5
4
3
Figura 2. Serie de esteroides A) Serie de esteroides 5a (Todas las inserciones son trans. B) Serie de
esteroides 5b (La inserción del anillo Ay B es cis).
Los grupos metilo están integrados en los puntos de unión de los anillos (es decir, los numerados
como 18 y 19), se llaman grupos metilos angulares y sirven como puntos importantes de
referencia para las designaciones estereoquímicas. Los grupos metilo angulares sobresalen del
plano general del sistema de anillos cuando este se escribe de la manera que se presenta en
la figura 2. Por convención, los otros grupos que se encuentran en el mismo lado general
de la molécula que los grupos metilo angulares (es decir, en la parte superior), se designan
como sustituyentes β (y se escriben con una cuña sólida). Los grupos que se encuentran en la
parte inferior (o en la posición trans respecto a los grupos metilo angulares) se designan como
sustituyentes α (y se escriben con una cuña punteada). Cuando las designaciones α y β se
aplican al átomo de hidrogeno en la posición 5 el sistema de anillos en el cual la unión de los
anillos A y B es trans, se convierte en la serie 5α, en el sistema de anillos en el cual la unión de
A y B es cis se transforma en la serie 5 .
En la nomenclatura sistemática, la naturaleza del grupo R en la posición 17 determina (en

forma primaria) el nombre base de un esteroide individual. Estos nombres se derivan de los
que corresponden a los hidrocarburos esteroides que se dan en la tabla 1 (Solomons, 1999).
Colesterol
El colesterol (figura 3) es el principal esteroide del organismo humano. Por un lado es un

componente estructural de las membranas celulares y lipoproteínas plasmáticas y por otro
es el compuesto a partir del cual da comienzo la síntesis de los ácidos biliares y hormonas
esteroides. El colesterol es escasamente soluble en medios acuosos aunque son muy solubles en
los disolventes orgánicos, particularmente en los alcoholes.
El desarrollo de la arteriosclerosis, enfermedad que consiste en un endurecimiento de las

arterias, está relacionada con una anomalía en el metabolismo del colesterol, y en su transporte
238
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Tabla 1. Nomenclatura de los esteroides.
R NOMBRE
-H Adrostano
-H (con –H también como sustituyente del –19CH3) Estrano
-20CH221CH3 Pregnano
-20CH222CH223CH224CH3
| Colano
21
CH3
-20CH222CH223CH224CH225CH26CH3
| | Colestano
21 27
CH3 CH3
a través del plasma. La arteriosclerosis puede conducir al infarto de miocardio, a la apoplejía,

a la neurisma, o a la gangrena. Además, se presentan con mayor frecuencia entre la población
de países occidentales está compuesta predominantemente por colesterol. Por último, muchos
medicamentos de uso habitual, por ejemplo derivados de la cortisona y contraceptivos orales,
son esteroides.
Figura 3. Estructura del colesterol (5-colesten-3b-ol)
239
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Además de ser captado en la dieta, el colesterol puede ser sintetizado por los tejidos humanos.
El colesterol se sintetiza a partir de acetil-CoA, que puede derivar de los carbohidratos,
aminoácidos o ácidos grasos. La principal localización de la síntesis del colesterol es el hígado,
aunque el intestino constituye así mismo un importante lugar de síntesis en el hombre. Además
el colesterol es sintetizado en las glándulas productoras de hormonas esteroides, por ejemplo las
glándulas suprarrenales, los testículos y los ovarios. Todas las reacciones de síntesis se producen
en el compartimiento citoplásmico de la célula y la mayor parte de enzimas necesarias se
encuentran en el retículo endoplasmático.
La vía metabólica de síntesis del colesterol es muy compleja pero se puede dividir en tres etapas
como se muestra en la figura 4. En resumen en la primera etapa la Acetil-CoA es transformada
en un intermediario tioéster de 6 átomos de carbono: la 3-hidroxi-3-metil-glutaril-CoA (HMG-
CoA). La segunda etapa implica la conversión de la HMG-CoA escualeno, un hidrocarburo no
cíclico que consta de 30 átomos de carbono. En esta etapa actúa de intermediario la unidad
de isopreno, con 5 átomos de carbón, que está presente en dos formas fosforiladas isoméricas.
Δ3-isopentenilpirofosfato y 3-3-dimetilalilpirofosfato. En la tercera etapa, el escualeno es
ciclado y convertido en un esterol de 27 átomos de carbono, el colesterol, los intermediarios
están unidos físicamente a una proteína citoplasmática, la proteína transportadora de esteroles
(Montenegro, 2002).

Figura 4. Etapas durante la biosíntesis del colesterol en el organismo humano.
240
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Formación de hormonas esteroides a partir del colesterol
Además de los ácidos biliares el colesterol puede convertirse en hormonas esteroides. Estas
hormonas esteroides comprenden los corticoides suprarrenales, de 21 átomos de carbón, el
cortisol, la aldosterona y la corticosterona.
Cortisol. En las células de la corteza suprarrenal se sintetiza el cortisol: el colesterol se convierte

en 17-a-hidroxiprogesterona como se muestra en la figura 5. la 17-a-hidroxiprogesteron que se
ha formado se hidroxila entonces en las posiciones C21 y C11, formando cortisol.

Figura 5. Síntesis del cortisol a partir de colesterol.
La comprensión de las funciones y acciones del cortisol frente a determinados estímulos

como el estrés fisiológico (entrenamiento y las estrategias alimentarias) ó el estrés psíquico
emocional es de suma importancia a la hora de comprender por qué haciendo supuestamente
lo correcto podemos fracasar con nuestra planificación con la actividad física y la alimentación
(Monteleone, 1990).
Cuando hay estrés y ansiedad, el cerebro envía una señal a las glándulas adrenales para que
liberen la hormona cortisol (Williams, 2002). Si el estrés y la ansiedad permanecen por tiempo
prolongado, los niveles de cortisol se mantendrán elevados, produciendo muchos problemas
metabólicos, entre ellos:
241
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1. El estrés produce la liberación de la hormona cortisol de las glándulas adrenales. Esta

hormona hace que el cuerpo libere glucosa a la sangre y como el cuerpo no está utilizando la
fuerza muscular para responder a la situación, la glucosa se deposita como grasa en el tejido
adiposo (Fry, 1998)
2. La habilidad del cerebro para la utilización de la glucosa está disminuida y puede producir
problemas en los centros de control del apetito y “HAMBRE” (Venkatraman, 2001).
3. Químicos cerebrales como la serotonina, dopamina y endorfinas, se repletan o están en

desbalance, lo que puede producir “antojos” por comer carbohidratos, dulces u otros alimentos
“que nos hacen sentirnos bien”, como el chocolate (Patra, 1988, Rowbottom, 1996)
4. Hay constricción de los vasos sanguíneos y la sangre es dirigida a otros órganos, que
necesitan mayor volumen sanguíneo en el organismo con estrés. El sistema digestivo no es la
prioridad del cuerpo en este momento, por lo que pueden presentarse trastornos a este nivel
(Norton, K, 1988)
5. Nutrientes como las vitaminas C y B y el mineral hierro son repletadas, afectando la habilidad
del cuerpo para la conversión de carbohidratos y grasa en energía (Peterse, 2001)
6. Los “antojos” que produce el estrés, pueden producir aumento del deseo de consumir
azúcares y grasas (Rizza, 1982)
Mecanismos de “feedback” del cortisol
El cuerpo posee un elaborado sistema de retroalimentación (feedback) que controla la secreción

de cortisol y regula la cantidad de cortisol en el torrente sanguíneo (Tsigos,20029). La glándula
pituitaria, en la base del cerebro, produce y secreta una hormona llamada adrenocorticotrofina
o ACTH. Su secreción indica a las glándulas adrenales que incrementen la producción y
secreción de cortisol. La pituitaria, a su vez, recibe señales desde el hipotálamo en la forma
de hormona CRH u hormona liberadora de corticotrofina, que le señala a la pituitaria la
liberación de ACTH. Cuando el cortisol está en cantidades adecuadas o en exceso, en la
pituitaria y en el hipotálamo, opera un sistema de feedback negativo, que alerta a estas áreas
a reducir la producción de ACTH y CRH, respectivamente, con el propósito de reducir la
secreción de cortisol (figura 6).
Los niveles corporales de cortisol en la sangre muestran lo que se denomina una variación diurna,
lo cual significa que las concentraciones normales de cortisol varían a lo largo de las 24 horas
de día, siendo más elevados en la mañana temprano, cerca de las 6-8 hs, y más bajos cerca de
la medianoche (Brillon, 1995).
El cortisol es liberado a la circulación sanguínea, con el fin de ejercer sus efectos en el tejido
periférico donde se une a la globulina específica unidora de glucocorticoides α2, llamada
242
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Figura 6. Mecanismos de feedback del cortisol
transcortina. Cerca del 75% del cortisol se une a esta proteína, 15 al 20% se une menos
fuertemente a la albúmina, y el 5% restante es cortisol libre (Amri, 1997). Este es un factor
importante a tener en cuenta, a la hora de realizar mediciones de cortisol. La excreción de
cortisol sin metabolizar en orina de 24 horas, es una de las mejores formas de medir el cortisol
con precisión. Uno de los mejores momentos para monitorear los niveles de cortisol, es en la
mañana con el estómago vacío (Simmons, 1984). Este valor de referencia o rango apropiado
debe estar entre 4 mcg/dl and 19 mcg/dl, en una muestra sanguínea. El rango normal de
cortisol libre medido en orina debe encontrarse entre 10 pg/ml and 110 pg/ml. Existe otra
forma de medir cortisol a través de la saliva (Jacks, 2002). El rango normal con este método,
tomado en la mañana, se encuentra entre 100nmol/L y 300nmol/L. Al respecto, un estudio
ha demostrado que existe una fuerte correlación entre las mediciones de saliva, suero y orina,
por lo tanto cualquiera de los tres métodos puede ser usado para monitorear el nivel de cortisol
durante el período de recuperación del ejercicio (Neary, 2002).
Anomalías de la secreción Adrenocortical
Enfermedad de Addison. A veces se destruye la corteza suprarrenal a causa de enfermedad

y otras veces simplemente se atrofia. La sobre estimulación excesiva de la glándula suprarrenal
por el estrés hace que primero aumente mucho de tamaño, enseguida experimenta hemorragia
y por último queda restituida por tejido fibroso. Lo que conduce a una alteración que se llama
Enfermedad de Addison (Ashton, 2005). La imagen clásica de esta alteración fue descrita
por Thomas Addison, un médico inglés del siglo XIX. La persona con enfermedad de Addison
esta anémica y muy débil, tiene la piel bronceada y es altamente susceptible a las enfermedades
e infecciones. Para que en estas condiciones se logre un completo funcionamiento suficiente de
243
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su organismo , será necesario tratarlo con cortisol (aproximadamente 30 mg al día) además de

mineralcorticoide .
Hiperadrenalismo. La hiperfunción de la corteza suprarrenal origina la Enfermedad

de Cushing y generalmente es causada por crecimiento de ambas suprarrenales, más
frecuentemente por un tumor (Sapse, 1997). El enfermo que padece la enfermedad de Cushing
muestra los efectos de la secreción aumentada de glucocorticoides, mineralocorticoides
y hormonas sexuales. Ocurre más frecuentemente en la mujer adulta. El trastorno del
metabolismo proteico lleva a la consumación de los tejidos corporales y debilitamiento de los
huesos. La secreción aumentada de glucocorticoides causa un aumento de la glucosa sanguínea
que lleva a la diabetes suprarrenal, que puede convertirse en diabetes permanente si continúa
cierto tiempo.
Estabilización de cortisol en materiales mesoporosos de sílice
En el laboratorio de nanotecnología del Instituto Nacional de Neurología y Neurocirugía, se

ha logrado estabilizar cortisol en materiales de sílice que tienen diferentes morfologías y se ha
hecho un estudio “in vitro” de la liberación de éste. Los resultados indican que estos materiales
son adecuados para aplicarse en pruebas “in vivo” en modelos animales (López, 2008). Y se
propone lo siguiente:
Se propone el uso de nanoimplantes de Sílice-cortisol en las lesiones provocadas por la

osteoartritis ya que existe la necesidad de que la administración del glucocorticoide sea de
mínima invasividad para disminuir el riesgo de daño por manipulación tisular y obtener un
efecto localizado sin repercusión sistémica con menos intervenciones.
Así, la liberación de cortisol de manera continua y localizada, representa una opción de

manejo con múltiples ventajas sobre la forma de administración convencional; con la finalidad
de mejorar la calidad de vida del sujeto con OA.
Con este trabajo se pretende evaluar la efectividad del nanoimplante liberador de cortisol en
la reducción del dolor articular en modelos experimentales de OA en ratas Wistar. Para esto,
se reproducirá un modelo animal de osteoartritis (OA) de rodilla en ratas Wistar que permita
evaluar los cambios tardíos potencialmente asociados a los componentes del nanoimplante
colocado en la articulación dañada sin fármaco. Además, determinaremos la existencia o no
de reacción inflamatoria local a los componentes del nanoimplante sin fármaco, instalado
en articulación de la rodilla de ratas Wistar macho, sanas. Por ultimo, determinaremos la
efectividad del nanoimplante liberador de cortisol, instalado en la articulación dañada de
modelos experimentales de OA en ratas, para la reducción del dolor articular mediante las
modificaciones conductuales en la prueba de disfunción inducida por dolor en ratas (PIFIR).
Quiero hacer mención que colaborarán en esta investigación la Dra. Paola Arteaga López del
CINVESTAV-SUR y su grupo de trabajo.
244
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Podemos concluir que nuestro objetivo a mediano plazo es la aplicación de este nanoimplante
de SiO2-cortisol en enfermos con OA.
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Posibles acciones tóxicas de heptacloro y
epóxido de heptacloro vinculadas al estrés
oxidativo
Introducción
El heptacloro (H) es un plaguicida organoclorado diénico que ha sido aplicado con el objeto de
abatir plagas en cultivos agrícolas. Su principal metabolito es el epóxido de heptacloro (EH),
el cual manifiesta efectos químicos y biológicos más acentuados que su progenitor. Una de sus
mutuas características es su alta estabilidad molecular y por esa razón persiste en el ambiente,
de modo que se le ha registrado en diversos eslabones de la cadena trófica. Paralelamente
a la contaminación producida, se ha generado evidencia de los daños a la salud que se han
provocado por su manejo excesivo (Albert 1996; Cassidy et al. 2005; Barlow 2005).
El heptacloro se introdujo en 1952 en aplicaciones tanto foliares como al suelo y para proteger
la madera. De 1975 a 1976 se estimó la producción de 4.5 x 106 kg en EE. UU., usándose como
insecticida sobre 22 cultivos. Debido a sus características fisicoquímicas y a la difusión por las
cadenas tróficas, se le encuentra en el suelo, el aire y el agua; en organismos tanto vegetales y
animales, terrestres y acuáticos; en órganos como hígado, riñón y hueso y en alimentos con alto
contenido de grasa como la leche y la carne.
El H tiene por nombre químico 1,4,5,6,7,8,8-heptacloro-3a,4,7,7a-tetrahidro-4,7-endo-

metilenindeno, y se le conoce en el medio comercial bajo los términos de Termide, Drinox,
Heptagran o Velsicol. Su principal metabolito es el epóxido de heptacloro, 1,4,5,6,7,8,8-heptacloro-
2,3-epoxi-3a,4,7,7a, tetrahidro-4,7-endo-metilenindeno, el cual tiene una estabilidad mayor que
el compuesto original. También se forman el 1-cloro-3-hidroxiclordano, el 1-hidroxiclordano,
1-hidroxi-2,3-epoxiclordano y su derivado deshidrogenado. El coeficiente de partición octanol-
agua (Kow) del H es 5.40, lo que explica su lipoficidad; es estable a la humedad, al aire y al calor
y no se degrada por luz ultravioleta (Tomlin 2000).
Efectos sobre la salud

La presencia de H y EH en la leche es un motivo de estudio porque en la fracción grasa de ésta,
se concentran los contenidos de los plaguicidas organoclorados y porque durante la lactancia
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Posibles acciones tóxicas de heptacloro y epóxido de heptacloro
los organismos se destoxifican excretando dichos compuestos en la leche. De esta manera, es

plausible que poblaciones de recién nacidos se vean afectadas por su presencia en la leche
humana y los consumidores de leche vacuna o de otros orígenes también tengan el riesgo
de presentar problemas de salud asociados a sus residuos. En el caso mexicano y durante los
últimos veinte años, el registro de H y EH en diversas categorías lácteas ha disminuido; sin
embargo, entre los datos más recientes se señala presencia objetable de los dos compuestos
(Prado et al. 2004) en relación a los límites establecidos por los Organismos internacionales de
salud, FAO/OMS.
Las investigaciones en este campo han venido dando informes tanto de daños metabólicos
como genéticos que se han asociado a la presencia de H y EH. Entre los primeros, se reconoce
que alteran respuestas de los sistemas nervioso, inmunológico y endocrino y aparatos como
el reproductivo. Los efectos citotóxicos se manifiestan con alteraciones en el ciclo celular,
proporción anormal de mitosis y disfunción en la regulación del mismo. Como daños sobre
el DNA se reconocen la clastogenicidad, las aberraciones cromosomales y efectos tanto
mutagénicos como carcinogénicos (Gentile et al. 1982; Smialowicz et al. 2001; Pastor et al.
2003; Caudle et al. 2005; Laville et al. 2006; Prado et al. 2008).
Las investigaciones de Suwalsky et al. (2005) han dado evidencias que el clordano, el cual es
un metabolito del H, afecta la forma discoidal de los eritrocitos humanos modificándolos a
esferocitos. Este cambio conduce a una mayor fluidez en la membrana con la consiguiente
alteración de la permeabilidad y el transporte anormal de sustratos al citoplasma. La entrada
excesiva de agua puede estallar la célula y al verterse sus contenidos sobre las células adyacentes,
se produce una respuesta infamatoria en la que se hacen presentes radicales libres asociados a
un estrés oxidativo.
Entre las respuestas que afectan al sistema nervioso se ha registrado que el H induce
modificaciones en la actividad de neurotransmisores como GABA y dopamina (Miller et al.
1999, Kirby et al. 2001; Caudle et al. 2005). Hay estudios que expresan daños inmunológicos
entre los que se citan aumento de gamma globulinas, disminución de citocromo oxidasa y
peroxidasa en leucocitos de sangre periférica, alergias e irritabilidad (Smialowicz et al. 2001).
Los trabajos de Lawson y Luderer (2004) no encontraron alteraciones en el aparato reproductor
de ratas; sin embargo, diversas investigaciones lo señalan como un disruptor endocrino con
alteración en isoformas del citocromo P450 (Laville et al. 2006) como la aromatasa, y efectos
sobre la esteroidogénesis. Se ha considerado que exposiciones de H in utero afectan la fertilidad
de varias generaciones de ratas y que las exposiciones a clordano en el ovario retrasan la
pubertad y modifican los ciclos menstruales.
Hay evidencia creciente que el H in vitro interfiere en la señalización celular modificando factores
de transcripción, reguladores de señales en la división celular, comunicación y apoptosis. Por
ejemplo, puede interferir con la vía Ras/MAP quinasas, decreciendo la expresión de Ras y
desregulando a la proteína supresora de tumor de retinoblastoma en linfocitos humanos, con
la producción de especies reactivas de oxígeno (ERO) (Rough et al. 1999; Okoumassoun et
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al. 2003). Una alteración semejante sucede con la p53, proteína protectora frente a cáncer
(Chuang and Chuang 1998). Estimula la protein quinasa C en cerebro de rata y se ha postulado
que dicha enzima juega un papel en el efecto promotor de tumor por H.
Se ha observado que algunos plaguicidas tienen una acción citotóxica directa sobre el
crecimiento celular, al modificar el índice de proliferación de linfocitos humanos tanto in vivo
como in vitro (Pastor et al. 2003). El heptacloro mostró este efecto al responder a concentraciones
de 10 M en cultivos primarios de hepatocitos de rata in vitro y junto con otras manifestaciones, se
le consideró un agente mutagénico (Okoumassoun et al. 2003). Se le ha calificado como factor
de riesgo en diversos procesos oncogénicos. Tessier y Matsurama (2001) le dan este carácter
en cáncer de próstata; Cassidy et al. (2005) lo responsabilizan en el cáncer mamario y Hansen
y Matsumura (2001a) en el hepatoblastoma en ratón, con la demostración que aumenta la
incidencia del carcinoma hepatocelular y del colangiocelular. Sin embargo, los efectos de largo
alcance permanecen desconocidos y no hay claridad total si las respuestas carcinogénicas
son por razones genéticas o por mecanismos epigenéticos o de otro orden (Okoumassoun
et al. 2003). Por lo mismo, la International Agency of Research on Cancer (IARC) lo evaluó como
carcinogénico en ratón (Bartch and Malaveille 1989) y actualmente está clasificado en el grupo
2B como posible carcinógeno en humanos.
El EH comparte algunas respuestas de su progenitor, el H, y adicionalmente, su grupo epóxido

interviene en reacciones específicas que le confieren mayor toxicidad (Glatt et al. 1983; Seik et al.
2004). También manifiesta actividad disruptora al inducir las isoformas CYP1A/2B del sistema
del citocromo P450 (Dehn et al. 2004), así como la depresión de respuestas inmunes (Smialowicz
et al. 2001). Expresa una respuesta neurotóxica conectada con las vías dopaminérgicas (Kirby
et al. 2001), alterando el transporte de dopamina (Miller et al. 1999) y los receptores de GABA
(Caudle et al. 2005). También induce daños reproductivos como alteración en el descenso
testicular (Barlow 2005). Inhibe la comunicación intercelular (Nomata et al. 1996) e incide
en la cascada de las tirosin quinasas, las cuales intervienen en la regulación del ciclo celular
(Hansen y Matsumura 2001b). Hansen et al. (2006) lo han asociado con efectos promotores
de la proliferación celular, al perturbar la homeostasis de iones de calcio en la membrana del
retículo endoplásmico en hepatocito de rata.
Se ha informado que los plaguicidas organoclorados tienen efectos genotóxicos, los cuales se
manifiestan en aberraciones cromosomales (CA) tanto numéricas como estructurales así como
intercambio de las cromátidas hermanas (SCE). Igualmente se han dado evidencias sobre la
presencia de micronúcleos (MN) en eritocitos de sangre periférica in vitro cuando son expuestos
a los contaminantes de referencia. Las inducciones de MN se han considerado indicadores de
genotoxicidad cuando las células, tejidos u organismos son expuestos in vitro a las sustancias
descritas. Recientemente, la UE lo ha incluido entre sus pruebas para dar cuenta de riesgo en
procesos carcinogénicos (Kiekerland et al. 2005).
Hay datos experimentales tanto en linfocitos humanos de sangre periférica como líneas
celulares, tejidos, hepatocitos in vitro o in vivo que ratifican la formación de MN cuando son
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expuestos a concentraciones elevadas de xenobióticos. Numerosos estudios refieren que una

variedad de mutágenos de acción directa o indirecta tienen efectos genotóxicos manifiestos en
rompimientos de una sola hebra del DNA y alteraciones en la apoptosis.
Cada vez con mayores recursos y complejos diseños experimentales las técnicas de biología
molecular se han orientado en estudiar las respuestas de diferentes compuestos en procesos
mutagénicos y carcinogénicos y el espectro de datos que se viene obteniendo tiene este valioso
componente.
Los autores Yakes y Van Houten (1997) midieron la respuesta por estrés oxidativo causado
por el H2O2 tanto en DNA nuclear como el mitocondrial que es más sensible. Las especies
reactivas de oxígeno asociadas al estrés oxidativo indujeron radical superóxido, luego, éste
generó agua oxigenada y ésta, radical hidroxilo. Se sabe que dicho oxidante provoca daño en
unos 11 sitios del DNA, lipoperoxidación, disminución del crecimiento y mayor expresión en
la apoptosis. Los daños incluyeron ruptura de una o las dos bandas del DNA, sitios básicos,
daños en la 8-oxoguanina y en ocasiones indujeron a la p53 y ésta a la p21. Una causa de dicho
daño pudo ser la acción sobre las histonas que protegen al DNA, ya que el DNA mitocondrial
contiene menor cantidad de histonas y probablemente esa sea una de las causas de su mayor
vulnerabilidad. Otro motivo puede ser la depresión de la respuesta inmune, ya que se sabe que
los macrófagos y los neutrófilos inducen estrés oxidativo.
Los estudios de Wang et al. (2000) han contribuido a evidenciar que las condiciones de hipoxia,
como de exposiciones a cloruro de cobalto en concentraciones 100 y 200 mM generan especies
reactivas de oxígeno, inducción de p53, p21 y el factor inducible por hipoxia, HIF-1a. Cuando
miden los daños al DNA nuclear y mitocondrial por Q-PCR encuentran una disminución de
la amplificación de los transcritos y concluyen que esta disminución está en relación directa
tanto con la ruptura de una sola banda del DNA como con la disfunción en los mecanismos
de reparación del DNA a nivel de MYH, una glicosilasa implicada en tal proceso. Además,
ratifican la mayor sensibilidad de los sistemas de mitocondria para enfrentar los daños
oxidativos al calcular que el mtDNA fue tres veces más sensible que el nDNA.
Las investigaciones que hicieron Moufarij et al. (2003) para medir aductos en el DNA de
unas líneas celulares de cáncer ovárico tratadas experimentalmente con dos medicamentos
anticancerosos, han sido un protocolo metodológico que ha ofrecido información valiosa. Ellos
detectaron la presencia de aductos intrabanda, aductos interbandas y entrecruzamientos DNA-
proteínas potenciados por los tóxicos de estudio. Por sus acuciosas investigaciones identificaron:
1. Los daños en el DNA por efecto de la droga

2. Detección de aductos intrabanda droga-gen específico
3. Detección del entrecruzamiento interbanda droga-gen específico
4. Detección de la reparación de entrecruzamientos inter e intrabanda con el gen específico.
5. Efectos de la droga sobre la acumulación de aductos intrabanda del DNA, inducidos en
el gen específico de la dihidrofolato reductasa (DHFR).
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Una consideración que ha de tomarse en cuenta es que la acción observada expresa diferencias
en los variados tipos de tejidos, dosis de la exposición y frecuencia de las mismas. Las
particularidades de estas condiciones y la amplísima gama de diferencias en los microambientes
celulares abren una serie de preguntas y respuestas que pese a la dificultad, va abriéndose paso
a una comprensión más completa y diversa. Igualmente, los mecanismos de acción genotóxica
pueden expresarse simultáneamente en el tiempo, pueden ser funcionalmente dependientes
uno de otro o no serlo; o bien sus respuestas pueden estar conectadas en cascada.
Mecanismos de acción
La propuesta que el estrés oxidativo es uno de los mecanismos, por el cual la acción tóxica
de los plaguicidas heptacloro y epóxido de heptacloro tiene lugar, se fundamenta en los
aspectos teóricos y en múltiples respuestas relacionadas robustamente con sus consecuencias,
las cuales ya han sido referidas. Los efectos observados se inician por la interacción entre
dichos agentes y las múltiples macromoléculas. Unas, de naturaleza proteica, que expresan
funciones como catálisis, defensa o implicación en la señalización de procesos. Otras, como
los lípidos de membrana, responsables de transducciones, transporte y reconocimiento, y los
ácidos nucleicos, donde está codificada la información global de la célula. Es decir, operan
sobre las estructuras fundamentales y en consecuencia, afectan las funciones básicas de los
organismos. Ciertas enzimas son capaces de convertir a los xenobióticos en intermediarios
altamente reactivos, o de generar metabolitos secundarios como los radicales superóxido e
hidroxilo y el peróxido de hidrógeno: O2-•, •OH y H2O2, (ERO) y otras especies reactivas de
naturaleza nitrogenada. La acción de estos radicales es un motivo creciente de estudio y se
tiene hasta el momento un panorama amplio de evidencias de su acción (Boveris et al. 2008).
Acción sobre proteínas
Se sabe que el radical hidroxilo (•OH) es el iniciador de la oxidación de proteínas; sin embargo,
la continuidad del proceso oxidante se da con la disponibilidad del oxígeno singulete (1O2) y el
superóxido (O2-•), los cuales actúan sobre las cadenas laterales de los aminoácidos o sobre el
esqueleto carbonado de las mismas proteínas. Adicional a la reactividad entre el oxidante y su
sustrato hay muchos factores que intervienen en el daño a la infinidad de proteínas presentes
en el medio celular, siendo algunos simplemente moduladores y otros altamente selectivos.
Cuando se oxida el esqueleto carbonado de la proteína por el radical hidroxilo, se produce
una cadena de derivados tóxicos entre los que están el radical intermediario alquilperoxil,
que se transforma en alquilperóxido, seguido de un alcohoxirradical que finalmente termina
en una hidroxilproteína. Las proteínas oxidadas también son sensibles a descarboxilaciones,
desaminaciones, pérdida de conformación tridimensional, fragmentación y entrecruzamientos.
Los sistemas biológicos tienen mecanismos de reparación que ofrecen a las células las
condiciones de contender el daño. Sin embargo, si esos umbrales son rebasados, la proteína
puede llegar a ser degradada o se conjuga con lípidos o carbohidratos que a su vez pueden ser
agregados o precipitados. Conviene decir que los mecanismos de reparación se limitan por la
edad y la desnutrición (Zentella and Piña 2008).
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Acción sobre lípidos
Una de las acciones de las especies reactivas de oxígeno sobre los lípidos es la lipoperoxidación,
que consiste en el deterioro oxidativo de los lípidos poliinsaturados. La causa de producción
de especies reactivas de oxígeno en proporción lesiva, puede ser iniciada por metabolitos de
plaguicidas, entre otras causas, y las consecuencias de este deterioro son la modificación de la
fluidez y permeabilidad de las membranas que constituyen un sistema celular con funciones de
reconocimiento, transducción de señales y de energía, transporte de sustratos, comunicación
intracelular y extracelular como los más evidentes.
La reactividad entre los agentes oxidantes y las cadenas de dobles enlaces conjugados de los
ácidos grasos que conforman la bicapa lipídica es responsable que el proceso de lipoperoxidación
sea autocatalítico y se propague. Su realización se hace en las etapas de iniciación, propagación
y terminación y puede tener un comportamiento catalizado por enzimas o ser independiente
de ellas. Por ejemplo, el metabolismo del ácido araquidónico es una fuente de ERO, que
puede inducir estrés oxidativo por la vía del citocromo P450, el cual interviene en procesos de
destoxificación por xenobióticos y que además conduce a la formación de epóxidos derivados
del ácido.
En la iniciación de la lipoperoxidación participa un ERO que puede ser el hidroxilo (•OH),

capaz de abstraer un átomo de hidrógeno en el esqueleto carbonado del ácido. Este carbono
afectado se estabiliza mediante un arreglo molecular que genera un dieno conjugado, el cual
reacciona con el oxígeno molecular y forma el radical peroxilo RCOO˙ o el LOO˙. Con la
acción oxidante de esta molécula el radical formado atrae un hidrógeno metilénico del ácido
graso contiguo y queda como hidroperóxido ROOH. La respuesta se propaga y termina por
la acción de un antioxidante como uno de los tocoferoles o carotenos. Estos antioxidantes
recuperan su acción por medio de sustratos tioles reducidos como el glutatión, con la
ubiquinona o con el ácido ascórbico.
Los efectos de la lipoperoxidación significan que pueden formarse dímeros o entrecruzarse

los radicales de los ácidos grasos y forman conglomerados con los cuales se pierde la fluidez
de la membrana. Los hidroperóxidos acumulados se descomponen en diversos compuestos
y los principales son el malondialdehido, el hexanal y el 4-hidroxinonenal. Éstos pueden
reaccionar con otras moléculas con efectos dañinos. Los radicales ROO˙ formados en este
proceso lipoperoxidativo tienen la capacidad de inhibir tanto la transcripción del DNA como
el gradiente de Ca2+ a través de la membrana, y éste causa daño a la Ca-ATPasa en sus
grupos tioles, pudiendo ser en caso extremo, un evento desencadenador de muerte (Zenteno
and Saldaña 2008).
Acción sobre el DNA
Las especies reactivas de oxígeno y nitrógeno que actúan sobre el DNA son de variada índole
pero todas con consecuencias determinantes a la salud porque afectan señales de transducción,
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proliferación celular y comunicación intracelular. Los daños pueden mostrarse como

mutaciones, transformaciones carcinogénicas y en término final ocasionar la muerte.
Los investigadores se han dado cuenta que las especies en cuestión abarcan a los radicales
de oxígeno superóxido, oxígeno singulete, peróxido de hidrógeno, hidroxilo, hidroperoxilo,
hidroperóxidos orgánicos, alcoxilo y peroxirradicales (O2-•, 1O2, H2O2, •OH, HO2•×, ROOH,
RO•, RO2˙ respectivamente) y a los nitrogenados óxido nítrico y peroxinitrito (NO• y ONOO-
). Los radicales superóxido sufren un proceso de dismutación capaces de generar H2O2. En
presencia de metales como el Cu+ o el Fe2+, el agua oxigenada es convertida por la reacción de
Fenton en radical hidroxilo (•OH) que tiene un gran poder oxidante. Dicho radical es capaz
de abstraer átomos de hidrógeno del DNA y de formar aductos que son lesivos a la lectura de
la información génica.
También se ha mostrado que el radical peroxinitrito que proviene de la acción entre el óxido
nítrico (•NO) y el radical superóxido (O2-•), se forma en macrófagos y neutrófilos en los
procesos de inflamación y se le reconoce como actividad mutagénica.
En resumen, puede decirse que entre los efectos de las especies reactivas de oxígeno y nitrógeno
sobre el DNA, están los daños a las bases, a sus azúcares, entrecruzamiento de proteínas con
el DNA, rupturas de una sola cadena y de doble cadena así como formación de sitios abásicos.
La guanina que tiene un bajo potencial de ionización es susceptible de ser oxidada por
los radicales hidroxilo, oxígeno singulete y peroxinitrito. La adición del •OH al C8 de
2’-desoxiguanosina produce un radical de aducto-C8-OH que puede llevar a la formación
de 8-oxo-7,8-dihidro-2’-desoxiguanosina (8-oxo-Guo). Las lesiones oxidativas sobre la adenina
son semejantes en su formación pero el daño permanece por menor tiempo. La timina y la
citosina también son sensibles a desaminaciones por los radicales nitrogenados y responden
finalmente con mutaciones o rupturas de cadena.
Las reacciones con el radical hidroxilo son muy rápidas y poco específicas; en cambio, con
el radical de oxígeno singulete son muy específicas y se tienen datos de la formación de
8-oxodGuo como producto final. Es importante completar que la formación de aductos
también se ve aumentada por la lipoperoxidación, cuyos productos pueden ser el 4-hidroxi-
2-nonenal, el malonaldehído, la acroleína y el crotonaldehído. Estos electrófilos reactivos
pueden alquilar las bases del DNA con la generación de las respuestas mutagénicas, antes
mencionadas (Medeiros 2008).
La apoptosis
La apoptosis se ha considerado relacionada con el estrés oxidativo. En la actualidad, la

comprensión del fenómeno se ha definido con mucha mayor precisión, lo que ha permitido
hacer distinciones de orden molecular en isoformas, pesos moleculares, estados fosforilados
o desfosforilados, concentraciones críticas de las reacciones que se llevan a cabo, donde
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cada condición por sí sola es capaz de generar transformaciones. De manera consecuente,

la conjunción de dichos detalles micromoleculares establece una red de comportamientos
dinámicos. En este momento se tiene un esquema muy complejo de las interacciones en cascada
que se dan en el fenómeno y las maneras en que éste es regulado. En una etapa temprana, la
apoptosis se vincula con sistemas que generan óxido nítrico (•NO) y con la NADH oxidasa
que produce superóxido (O2-•) y peróxido de hidrógeno (H2O2). La primera correlación entre
el estrés oxidativo y la apoptosis tomó evidencia por el conocimiento de los miembros de una
familia de proteínas, las Bcl-2, y otras que no sólo interfieren con la apoptosis sino que inducen
mecanismos que neutralizan el daño del estrés oxidativo. En la actualidad, los investigadores
de este fascinante campo de comportamiento celular enfatizan que en algunos procesos el
estrés oxidativo es una causa para llevarse a cabo la apoptosis y en otras, el estrés oxidativo es
una consecuencia de este tipo de muerte celular (Gómez et al. 2008).
Discusión
A la luz de la información de los daños que las especies reactivas de oxígeno generan en las
moléculas fundamentales de los sistemas biológicos, parece plausible relacionar la información
teórica con muchos datos de la toxicidad por contaminantes ambientales y en el caso concreto
con H y EH referida en los estudios realizados en sistemas in vitro como en resultados en
organismos vivos, los cuales son escasos.
En este sentido los estudios de cánceres citados por Tessier y Matsurama (2001), Cassidy et
al. (2006) y Valavanidis et al. (2006) son concluyentes, puesto que los mismos investigadores
hacen señalamientos de estrés oxidativo responsable de peroxidación de lípidos de membrana,
de daño a proteínas y de entrecruzamientos internos de DNA así como entrecruzamientos del
DNA con proteínas.
La información que se tiene sobre la muy alta reactividad de las ERO, su presencia en diversos
fenómenos, desde la actividad respiratoria en mitocondria, la iniciación del proceso apoptótico
y muchas más, conduce a darse cuenta que la célula tiene estrategias para vivir en los ambientes
aeróbicos y ha evolucionado hasta tener activos mecanismos reguladores para contender de sus
potenciales daños. La actividad reguladora más estudiada es el paquete reductor que las células
generan por medio de vías metabólicas como el ciclo de las pentosas y la producción de NADH.
Adicionalmente, actúan los sustratos reducidos como el glutatión y las enzimas antioxidantes
como las superóxido dismutasas, las glutatión transferasas, la glutatión peroxidasa y la catalasa.
La presencia de carotenos, ácido ascórbico, tocoferoles y el selenio reafirman la actividad
antioxidante con las cuales los organismos neutralizan el daño por el estrés oxidativo. Esta
serie de acoplamientos modula el estado redox de los compartimentos celulares protegiendo
las estructuras y con ello, las funciones que la célula realiza.
De tal modo que la disminución de sustratos y enzimas antioxidantes señalada en las

investigaciones de Dehn et al. (2004) se relaciona claramente con la actividad de las ERO.
Estos valores encontrados dan cuenta que los sistemas de estudio están siendo sujetos del
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efecto oxidante. Los autores hallaron disminuidas las concentraciones de glutatión y vieron
modificadas las concentraciones de enzimas antioxidantes glutatión-S-tranferasas, catalasa y
superóxido dismutasa.
Es muy conocido que existe una diversidad de isoformas del sistema de monooxigenasas,
la familia del P450, las cuales están implicadas en reacciones de hidroxilación, oxigenación,
peroxidación y epoxidación en casi la generalidad de los organismos de la escala filogenética.
Por la clara proximidad entre la implicación de estas proteínas y las respuestas de disruptores
endocrinos que el heptacloro y su epóxido expresan (Dehn et al. 2004 y Laville et al. 2006),
se puede inferir que los radicales libres generados tienen consecuencias en el estrés oxidativo
manifiesto. Se ha estimado que en la mitocondria de células de mamíferos, la concentración de
intermediarios en estado estacionario para la especie hidroxilo •OH es del orden de 1 x 10-16
M, con una vida media de 1 x 10-9 s, y que el DNA mitocondrial es más susceptible a daños que
el DNA nuclear (Yakes and Van Houten 1997).
De acuerdo a lo expuesto, entre los efectos de las ERO sobre el DNA están la formación
de aductos que Laouedj et al. (1995) evidenciaron con la formación de desoxi-8-guanosina,
adiciones covalentes que no permitieron la lectura correcta de la información génica y ésta se
manifestó con mutagénesis. Cuando la respuesta fue de proliferación celular, la cual se expresó
como oncogénica para el EH, se encontraron aumentadas las concentraciones de quinasas
(Hansen y Matsurama 2001a), reguladores del ciclo celular y la proteína p53 dejó de funcionar
como un factor protector ante la tumorigénesis, según los datos ofrecidos por Chuang y
Chuang en 1998. Es posible también que el efecto sobre mecanismos de reparación del DNA
por escisión de bases señalada por Surallés et al. (1995) sea una consecuencia del daño que las
ERO generan en las purinas y pirimidinas que constituyen la estructura del DNA.
Una de las investigaciones que analizó la respuesta del heptacloro como un promotor de
mutagénesis fue la de Okoumassoun et al. (2003). En el trabajo realizado, los autores dieron
evidencias del comportamiento de la familia de Bcl-2, sus isoformas y su vinculación con la
apoptosis que se bloqueó con la incorporación de heptacloro en concentraciones 10 mM. La
orientación que convendría obtener a la luz de las ERO sería verificar si el superóxido (O2-•)
o algún otro radical interviniese, en qué momento y organelo se generase y de esa manera,
ratificar con su identificación, su implicación en la actividad mutagénica.
También es factible conectar el daño inmunológico analizado por los estudios de Rough et
al. (1999) y los datos presentados por Smialowicz et al. (2001) con la información que en los
macrófagos y neutrófilos se generan respuestas conectadas con los radicales de óxido nítrico
(•×NO) y superóxido (O2-•) en los procesos inflamatorios.
Llama la atención la interrelación que hacen algunos estudiosos si la alteración en la

incorporación de calcio iónico (Jangi et al. 2008) por la presencia de epóxido de heptacloro
(Hansen et al. 2006) lo hace responsable de ser un agente promotor de proliferación celular
y si tal influencia está dictada por los radicales oxidativos que el tóxico provoca, entre ellos el
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ROO˙ que a su vez, modifica la síntesis o la conformación de la Ca.-ATPasa. En la calidad del

calcio iónico de ser un segundo mensajero, sería conveniente valorar otras funciones en las que
está involucrado el propio ión calcio.
La afirmación que en los estados de hipoxia o con cloruro de cobalto se producen radicales
oxidantes y la relación de ellos con los daños en el DNA, mitocondrial sugiere verificar la
equivalencia de este fenómeno a la exposición con H y/o EH. Está ratificada la información
de la ruptura de una sola banda del DNA total que se encuentra con el Ensayo Cometa
(Prado et al. 2008) y parece que hay clara similitud. Por tanto, resulta conveniente comprobar
si en el origen de la respuesta tóxica al plaguicida, están involucrados los mismos radicales
generadores de la respuesta hipóxica, ya que por hoy, se reconoce al H2O2 como el principal
responsable. El peróxido de hidrógeno actúa como segundo mensajero en la estabilización del
factor inducible por hipoxia, el HIF-1a. Conviene comentar que las investigaciones en esta
área del conocimiento señalan que en los descensos de oxígeno, el complejo III de la cadena
respiratoria mitocondrial aumenta la producción del radical superóxido y que a través de los
canales iónicos, éste pasa al citosol para ser transformado en H2O2 por la superóxido dismutasa
(SOD), y entonces actúa en la estabilización del HIF-1a (Lluis and Morales 2008). Esta
comprobación daría explicación, por lo menos parcialmente, a la disminución del crecimiento
y a las débiles respuestas energéticas en los organismos expuestos al tóxico.
Si en los análisis de las ERO en las exposiciones a H o al EH se identificara al H2O2 en

concentraciones semejantes, en los organelos y en las mismas condiciones a las manejadas en
los estudios de Yakes y Van Houten (1997), podría reforzarse que la producción de ERO es
un mecanismo de toxicidad de los plaguicidas de estudio, siendo el origen de algunas de las
respuestas que han sido señaladas. La identificación del radical superóxido (O2-•) también sería
una vía de explicación, ya que este radical sufre la dismutación ya referida, que lo convierte
en el H2O2.
Los entrecruzamientos de DNA con proteínas y la formación de aductos que han sido
registrados como efectos tóxicos de H y de EH, guardan similitud con las respuestas señaladas
por las ERO. Como antes ha sido mencionado, también en este caso es conveniente conocer
la naturaleza y proporción de esas especies de alto poder oxidante que fuesen generadas en
las exposiciones a H y a EH y que tienen efectos sobre los fenómenos de la replicación y de la
transcripción del DNA.
Los resultados que se han obtenido acerca de las exposiciones al H y al EH referentes a la

alteración en la comunicación celular, ruptura de una banda del DNA y transformaciones
en los mecanismos reparadores del DNA pueden verse de una manera independiente, o
pueden analizarse desde la perspectiva que son las ERO las responsables originales de estas
manifestaciones sobre la información codificada en el DNA.
La relación que se da entre el H y el EH y la toxicidad mediante las posibles vinculaciones

con la producción de ERO, conduce a una argumentación que se sostiene en el aspecto
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teórico. Es necesaria la confirmación de estas presunciones sobre las especies generadas en

órganos y organelos diana; ellas darán mayor claridad a los efectos enunciados y seguramente
aumentarán la información si dichos radicales, cuándo y cómo son responsables de daños tan
diversos.
Seguramente no hay un solo mecanismo de la acción citotóxica y genotóxica del H y del EH.
Junto con el mecanismo del estrés oxidativo, existe el argumento de participación de otras
formas de manifestar su toxicidad. Desde la influencia de las propiedades de quiralidad como
ha sido propuesto por Hegeman y Laane (2002), los genéticos y los epigenéticos (Okoumassoun
et al. 2003), que junto con los primeros, serán motivo del avance de la ciencia en el campo de
la contaminación ambiental de evidente importancia para la salud.
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La dinámica compleja en electroencefalogramas.
Modelo animal de epilepsia
Electroencefalografía básica
Las ondulaciones de los potenciales eléctricos del cerebro se denominan ondas cerebrales
y su registro es el electroencefalograma (EEG). La electroencefalografía es una rama de la
electrofisiología, encargada de estudiar la actividad eléctrica espontánea que genera el SNC
como resultado de la actividad metabólica celular a nivel de la corteza cerebral, los núcleos
subcorticales y el tallo cerebral (Martínez Villar, 1998). Las señales cerebrales se caracterizan
por su frecuencia y amplitud particulares.
En 1928 Hans Berger (1873-1941), psiquiatra y neurólogo alemán, desarrolló un método para
registrar la señal eléctrica en seres humanos, descubriendo el ritmo de Berger, ahora conocido
como ritmo alfa. Berger es considerado el padre de la electroencefalografía (Teplan, 2002).
La electroencefalografía se utiliza en el estudio, detección, diagnóstico y tratamiento de
anormalidades cerebrales en trastornos neurológicos y psiquiátricos. El EEG convencional
registra gráficamente la actividad eléctrica espontánea que se genera en la corteza cerebral.
La actividad rítmica de la corteza cerebral depende de los impulsos que recibe del tálamo,
cuyas células originan una inhibición periódica de las proyecciones talamocorticales con
frecuencia de 10 veces por segundo. La proyección de estos impulsos hacia la corteza
cerebral produce potenciales postsinápticos que se registran en el EEG en forma de ondas
con frecuencia de 10 Hz. Las neuronas de la corteza cerebral se encuentran dispuestas
en columnas perpendiculares a la superficie del cerebro, los cambios que se registran son
producidos por la suma de las corrientes que producen estos potenciales, captados por los
electrodos y transformados en una señal electrónica amplificada en el electroencefalógrafo
(Martínez Villar, 2004; Waxman, 2004).
La intensidad de las ondas cerebrales depende del número de neuronas y fibras descargadas
de manera sincronizada. La forma de las ondas depende de la actividad cerebral y estado
fisiológico del individuo. La mayor parte se clasifica en: alfa (entre 8 y 13 Hz); beta (mayor a 13
Hz); delta (entre 0.5 y 4 Hz) y theta (entre 4 y 8 Hz) (Teplan, 2002).
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La dinámica compleja en electroencefalogramas
Un equipo de EEG capta las diferencias de potencial de la corriente eléctrica que se producen
entre un electrodo de registro y otro. En el EEG la descarga siempre es contra lateral al sitio
de la manifestación clínica. El cerebro en su hemisferio izquierdo controla la parte derecha
del cuerpo y viceversa (Martínez Villar, 1998). Un EEG se obtiene mediante la colocación
de electrodos en una posición específica de la corteza cerebral, definida por un sistema de
medición y terminología común, utilizados internacionalmente desde 1958, llamado sistema
10-20. Se realiza mediante la medición de ciertas áreas del cráneo, de tal manera que los
puntos correspondientes se encuentran a igual distancia uno del otro (a 10 o a 20%). Cada
electrodo tiene su simétrico en cada lado y se representa con una abreviatura que identifica la
zona del cerebro sobre la que está colocado, creando una nomenclatura formada por una letra
y un número (par para el hemisferio derecho e impar para el izquierdo). La línea de referencia
se identifica por las letra C y Z (correspondiente a Zero). Las letras correspondientes a las
zonas del cerebro son: F (frontal), C (la cisura central o de Rolando), P (parietal), O (occipital),
T (temporal), A (auricular). Sobre la línea de referencia se colocan los electrodos Fz (frontal
cero o frontal medio), Cz (central medio o vértex) y Pz (parietal cero o parietal medio) (Franco
Salazar, 2006).
Epilepsia
La epilepsia es un padecimiento crónico caracterizado por crisis recurrentes, debidas a una

descarga excesiva de las neuronas cerebrales. Su definición formal se formuló en 1973, por
la OMS y la ILAE (Liga Internacional contra la Epilepsia) y actualmente se define como la
“presentación crónica y recurrente o repetitiva de fenómenos paroxísticos que se originan por descargas neuronales
desordenadas y excesivas, que tiene causas diversas y manifestaciones clínicas variables”. Alrededor del 5%
de la población mundial la padece y la ubicada en el lóbulo temporal (TLE) es el tipo más
frecuente (60%). La etiología conocida abarca desde problemas perinatales, trauma obstétrico,
trastornos por malformaciones, infecciones, trauma craneoencefálico, parasitosis, herencia,
entre otras. En gran parte de los casos, es desconocida. Los signos y síntomas pueden ser de
tipo clínico (aportados por la historia clínica y la exploración física; los tipos, modalidad y
repetición de las crisis; la existencia de trastornos neurológicos, psiquiátricos o psicológicos,
entre otros) o paraclínicos (alteraciones en EEG, IRM o TAG) (Sesión sobre epilepsia, 2006).
El tratamiento de la epilepsia abarca de manera conjunta la administración de fármacos

antiepilépticos (AED) (alrededor de 65% de los casos), el registro de las crisis y evitar factores
precipitantes. El 40% de los casos no obtiene beneficio con fármacos (epilepsia refractaria), de
este porcentaje, sólo el 10% es candidato a cirugía para extirpar el foco epiléptico. Los criterios
de clasificación de las crisis epilépticas son la manifestación clínica y electroencefalográfica.
Los periodos en los que se dividen las crisis epilépticas, abarcan desde el momento en que
inicia una crisis, hasta el inicio de la siguiente, considerando los intervalos entre una y otra.
Los términos utilizados para cada etapa son (Esteller et al., 1999) el periodo interictal, el
tiempo entre una crisis y la siguiente; el periodo ictal, el tiempo cuando la crisis se manifiesta
y desarrolla; el periodo preictal, el tiempo que precede a un periodo ictal, el periodo
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postictal, el que sigue a un periodo ictal; el inicio clínico, el momento en que una crisis
clínica es percibida por un observador externo que está observando al paciente cuyo EEG
está siendo registrado y el inicio electroencefalográfico, el momento en el que una crisis
comienza, marcado visualmente por un experto al analizar el EEG.
La complejidad cerebral
Sistemas complejos y caos. No existe una definición exacta para sistema complejo, sin
embargo, la complejidad implica ciertas propiedades; un sistema complejo posee un gran
número de grados de libertad o variables independientes, está compuesto por elementos
simples que modifican su estructura de acuerdo al intercambio que reciben del entorno y de sus
propias interacciones; presentan las leyes de potencia (de “colas pesadas”) en las distribuciones
de frecuencia de sus eventos; son inestables en su mayoría y dado que cualquier variación de
alguno de sus elementos puede ocasionar un cambio global en todo el sistema, se consideran
impredecibles. Estas variaciones provocan que se encuentre continuamente entre un estado de
orden y desorden o caos. Se considera que el caos es el comportamiento aperiódico a largo
plazo de un sistema determinístico limitado que presenta dependencia sensible a las condiciones
iniciales (Clinton J., 2003). Cuando un sistema dinámico no lineal tiene un comportamiento
impredecible, se le llama sistema caótico. Los métodos no lineales para el estudio de sistemas
dinámicos, basados en la teoría del caos, han logrado resultados satisfactorios para identificar
parámetros patológicos en medicina. Actualmente aún se estudia el comportamiento caótico
del cerebro, tratando de determinar el comportamiento de la compleja red neuronal, el papel
de los neurotransmisores y el efecto de los fármacos (Bahrami B., 2005 y otros).
La complejidad del cerebro. El cerebro posee características de un sistema complejo,

dinámico, lo que indica que es recomendable el uso de herramientas de análisis no lineal
para su estudio (Litt et al., 2002). En la literatura se han reportado numerosos estudios de
EEG en diferentes estados fisiológicos en personas sanas y con distintos trastornos neuronales:
durante el sueño, en vigilia, en estado de meditación o estimulación, con trastorno bipolar,
depresión y Alzheimer (Kannathal et al., 2004; Lutz et al., 2004; Susmakova, 2004; Jeongn,
2002; Bahrami et al., 2005). La epilepsia ha sido el padecimiento más ampliamente estudiado
(Martinerie et al., 1998; Chavez et al., 2003; D’Alessandro et al., 2003; Le Van et al., 2003,
2005; Winterhalder et al., 2003, 2006; Maiwald et al., 2004; Lutz et al., 2004; Harrison 2005;
Mormann et al., 2005, 2006).
En el caso de la epilepsia, el primer propósito de caracterizar matemáticamente lo que sucede

en el cerebro en una crisis y bajo la acción de un antiepiléptico analizando EEG antes, durante
y después, es definir comportamientos que permitan detectar la aparición de ésta, i.e. qué
cambios ocurren en el EEG cuando comienza y usar estos parámetros para identificarla antes
de que inicie.
Actualmente, en el software de equipos electroencefalográficos digitales, se ofrecen herramientas

de análisis, que incluyen detectores de inicio de crisis en rangos de frecuencia difíciles de
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detectar por observación clínica (Stellate, Harmonie Signal File Browser Software, 2007). Sin
embargo, no son suficientes para el especialista. Al no ser óptima la tasa de falsas detecciones,
no se resuelve el problema de la revisión manual de todo el registro. Aún se encuentran en fase
de investigación métodos que permitan una detección correcta en registros de largo plazo y en
línea. Por otro lado, un método de predicción debería ser capaz de anticipar una crisis inminente,
disparando una alarma, en un lapso de tiempo antes del inicio, que permitiera la intervención
de un mecanismo para evitarla. Es más probable la identificación, caracterización y predicción
cuando se presenta una transición entre un periodo interictal y preictal, esto ocurre en las crisis
de tipo focal.
Mormann (2007) realizó una compilación de los estudios sobre predicción de crisis epilépticas
realizadas en las últimas décadas, desde los años 70 cuando se realizaron los primeros intentos
por determinar precursores de crisis. Las mediciones utilizadas han sido de diversa índole,
entre ellas: energía acumulada, sincronía/complejidad, densidad de correlación, dimensión
de correlación, disimilaridad, entrenamiento dinámico, entropía de Kolmogorov, densidad de
Lerner, predictabilidad marginal, clustering de fase, sincronización de fase, periodograma de
signo, índice de similaridad, red neuronal simulada y sincronización/correlación. Maiwald
(2004) define lo que idealmente sería una correcta predicción: después de la señal de alarma,
durante el tiempo mínimo de intervención, no ocurre ninguna crisis, sino hasta que inicia el horizonte
de predicción. Las crisis que suceden fuera del horizonte de predicción no son anticipadas por el
sistema y se clasifican como falsos negativos. Las señales de alarma que no son seguidas de una
crisis durante el horizonte de predicción, son predicciones falsas, mientras que cuando la crisis
sí ocurre, se trata de una predicción verdadera.
El estado del arte en el tema tanto de detección como de predicción de crisis epilépticas está en
continuo desarrollo, beneficiándose de los avances tecnológicos respecto a almacenamiento
y velocidad de procesamiento de los algoritmos. Periódicamente se han realizado eventos
como el International Workshop on Seizure Prediction (Lehnertza et al., 2005), cuya cuarta
emisión se llevará a cabo en Kansas, EUA, en Junio de 2009 (http://www.iwsp4.org). El
tercer evento realizó en octubre de 2007, en Freiburg, Alemania, en donde se presentaron
investigaciones que actualmente se llevan a cabo alrededor de mundo. Los enfoques de dichas
investigaciones se presentan en distintos vértices: aproximaciones teóricas de predicción de
crisis; modelización de células y redes neuronales y aproximaciones experimentales en cortes
in vivo; estado del arte en detección de crisis y formas de onda y su aplicabilidad en sistemas
de intervención y alarma; transiciones interictal-ictal en modelo animal y EEG humano;
modelación dinámica y análisis estadístico; control de crisis: implementación técnica de
sistemas de ciclo cerrado y desarrollos recientes en predicción de crisis. Se presentaron
también los enfoques de la industria para la comercialización de dispositivos de alarma/
prevención, analizando restricciones tecnológicas y requerimientos de aplicación clínica.
Entre los métodos utilizados para la detección de crisis sobresalen: el análisis de frecuencias,
el reconocimiento de patrones, la sincronización de fase, el análisis de microcrisis y otras
oscilaciones. En predicción se utilizan entre otros, redes neuronales no lineales, análisis con
métodos estocásticos, sistemas neurodifusos, análisis espectral, teoría de la matriz aleatoria,
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aproximaciones de sincronización multivariada y modelo de pequeño mundo. Hasta la fecha,

no existe algoritmo alguno cuyo rendimiento sea suficientemente superior al de un sistema
aleatorio de predicción de crisis, por lo cual, los esfuerzos continúan. Florian Mormann,
físico y médico experto en el tema, enfatiza que la tendencia en predicción de crisis debe
enfocarse sistémicamente, sobreponiéndose al estudio único de células o redes de células. Los
temas a enfocarse: la transición interictal-ictal, beneficiándose del estudio de la neurofisiología
animal, la dinámica de redes y la modelación de señales electrofisiológicas (3rd Workshop on
Epileptic Seizure Prediction, 2007).
EEG como serie de tiempo. Para el análisis estadístico de un registro de EEG, éste puede
considerarse como una serie de tiempo: una secuencia de datos de una variable, registrados
en intervalos de tiempo sucesivos e iguales. Una serie de tiempo permite modelar y comprender
el mecanismo que describe aquello que produjo los datos, así como monitorear, predecir y
controlar el fenómeno. El análisis de series de tiempo considera que los datos registrados poseen
una estructura interna, como la auto-correlación, la variación estacional y la tendencia. Las
series de tiempo se utilizan entre otras aplicaciones, en predicción, en términos de comparar
su rendimiento predictivo bajo distintas condiciones (Clinton Sprott, 2003).
El uso de la dimensión fractal para la detección y predicción de crisis epilépticas

La geometría fractal es una teoría matemática derivada de la teoría del caos, que fue
desarrollada por el matemático polaco Benoît Mandelbrot, en 1977. También llamada teoría
de fractales, es un lenguaje matemático utilizado para caracterizar fenómenos que presentan
invarianza de escala, su propiedad principal; el mismo modelo es válido para todas las escalas.
Mandelbrot definió como fractal aquello que “tiene una forma, bien sea sumamente irregular, bien
sumamente interrumpida o fragmentada y sigue siendo así a cualquier escala que se produzca el examen”. Los
fragmentos de un objeto fractal son copias exactas o estadísticas del todo y pueden hacerse
coincidir con el objeto en su totalidad creciendo o decreciendo su escala (Mandelbrot, 1997;
Balankin A.S., 2003). La dimensión fractal es un cuantificador de la complejidad que describe
el comportamiento de un fenómeno. Se refiere al número mínimo de variables independientes
necesarias para representar el fenómeno. Otra característica primordial de los fractales es la
autosimilitud (self-similarity). A un fractal que no varía bajo ciertas transformaciones de escala,
se le llama autosimilar, es decir, cada segmento del objeto tiene las mismas características del
objeto en su totalidad. Estadísticamente, en cada área del fractal se conservan las propiedades
globales (Mandelbrot, 1997). Los fractales pueden ser determinísticos, cuando son exactamente
(o geométricamente) autosimilares, al menos en el límite de una escala pequeña; o aleatorios,
cuando únicamente son autosimilares estadísticamente.
El EEG posee autosimilitud estadística. Se ha desarrollado el espectro fractal de EEG humano

(Kulish et al., 2006) y se han utilizado parámetros fractales para identificación de diferencias
en periodos preictales e ictales (Esteller et al., 2000 entre otros). Existe una gran variedad
de métodos para calcular la dimensión fractal de fractales autosimilares, cada uno de ellos
utilizado para distintos tipos de datos. También puede describirse su comportamiento fractal a
265
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través de la estimación de parámetros como el exponente de Hurst (H), el cual determina la

persistencia de una serie de tiempo, estableciendo la dependencia a largo plazo.
H está definido como:

H = log(R/S)/log (T) (1)
donde T es la duración de la muestra de datos y R/S el valor correspondiente del rango reescalado.
Está relacionado con la dimensión fractal como:
D = 2 – H (2)
Si H = 0.5 el fenómeno se considera aleatorio o ruido blanco; si 0.5 < H se le considera

persistente (existe invarianza de escala asociada a correlaciones positivas a largo plazo); si 0 <
H < 0.5, es considerado antipersistente (existe invarianza en la escala asociada a correlaciones
negativas a largo plazo)
Kannathal et al., (2004) afirmó que la no estacionalidad local está presente usualmente
en datos fisiológicos y puede comprometer la habilidad de algunos métodos para estimar
la autosimilitud. En el caso de las series de tiempo de EEG, el exponente de Hurst puede
caracterizar el comportamiento no estacionario. Existen varios métodos para calcular H.
Método del Rango Reescalado (R/S)
Propuesto por Mandelbrot y Wallis, se utiliza para calcular el exponente de Hurst como
parámetro de autosimilitud y para estimar la dependencia a largo plazo de una serie de tiempo.
Para una serie de tiempo de longitud n, X = {X, :t = 1,2,..., n}, R/s se define como el cociente
del rango máximo normalizado de la señal integrada R(n) entre la desviación estándar S(n):
R(n) max {0,r, :t = 1,2,...,n}- min{0,rt : = 1,2,..., n}

= (3)
S(n) S2 (n)
donde: k n k
(4)
∑t =1 X t rk = ∑ Xt −
n

t =1
1/2
⎡ n ⎛
1 1 n ⎞ 2 ⎤
y S(n) = ⎢ ∑⎜ X t − ∑ X t ⎟ ⎥
(5)
€ ⎢⎣n t=1 ⎝ n t=1 ⎠ ⎥⎦
La exactitud en el cálculo de H en todos los intervalos de tiempo, depende del número de

datos que sean utilizados.
€ Si es razonablemente grande (es decir, cuando el intervalo del
tiempo máximo es trazado varias veces), se espera que la curva R/s proporcione información
sobre la auto-similitud de todos los intervalos de tiempo. Si el tiempo registrado posee sólo
correlaciones a corto plazo, entonces la gráfica en escala logarítmica es también una línea recta
con pendiente de 0.5 (Benoit Software).
266
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Método de rugosidad-longitud
Se utiliza la desviación estándar o rugosidad de la raíz cuadrada de la media de los datos, en

las escalas de tiempo t . Para un trazado auto-afín, la rugosidad SD, medida en una escala de
tiempo t , está relacionada con H como:
SD ∝ ?H
(6)
donde SD es la desviación estándar.
Método del Variograma

€
La distribución del tiempo de Xi puede ser caracterizada por una función de semivarianza,
llamada variograma, la cual se define como:

1
N/2
V(n) =
2N
∑ (X − X )
i i+n
2
(7)
i= 0
donde N es el número de parejas de puntos separados por un intervalo n (el desfasamiento del
€
intervalo). Cuando la semivarianza estimada es graficada contra n, ésta puede aproximarse
asintóticamente a un valor constante (umbral) o puede incrementarse sin límites conforme
aumente n. Los variogramas sin límites sugieren que la variación está dándose en un rango
continuo de escalas de tiempo. Tanto el variograma transitivo, con un umbral finito, y los
variogramas sin límites pueden ser analizados en una gráfica a escala logarítmica. Si el
logaritmo de una semivarianza es graficado contra el logaritmo de n, entonces la pendiente es
2H. Por consiguiente:
(8)
(Benoit Software).
Teoría de rugosidad cinética. El comportamiento de los sistemas dinámicos complejos

presenta una invarianza a diferentes escalas en sus variables, ya sea temporales o de espacio.
Esta característica permite su estudio a través del escalamiento dinámico derivado de la teoría de
rugosidad cinética, que en términos generales, estudia el crecimiento de superficies en medios
no homogéneos (condiciones de no-equilibrio). Una de sus aplicaciones es la caracterización y
modelación de fluctuaciones de series de tiempo del mundo real (Balankin A.S., 2007) y se ha
utilizado, junto con la teoría de fractales, para estudiar modelos de crecimiento de superficies
rugosas (Barabási A.L., Stanley H.E., 1995; Ramasco et al., 2000). Existen procesos que no
tienen una superficie como tal, pero eligiendo las variables adecuadas, puede mapearse a una
función matemática cuya rugosidad es susceptible a un análisis con los mismos métodos que las
interfaces reales (Barabási A.L., Stanley H.E., 1995).
La función estructura por permite analizar la memoria a largo plazo en las fluctuaciones de las
series de tiempo:
(9)

267
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la barra denota un promedio de toda t en una serie de longitud T-t; T es la longitud de la serie
original z(t). Los corchetes angulares denotan un promedio entre diferentes muestreos de la
ventana de tiempo de tamaño dt (Balankin A.S., 2007).
El espectro de potencia como la función estructura presentan un comportamiento de ley

de potencia: s a (dt)z y S a q-q con q = 2z+1. El exponente de escalamiento z (o de
Hurst) caracteriza la fuerza de las correlaciones de largo plazo en el comportamiento
de las fluctuaciones (Balankin A.S., 2007). Sin embargo este parámetro no determina el
comportamiento de escalamiento universal, que clasifica una gran variedad de modelos en
términos de su comportamiento colectivo (Ódor G., 2003). La dinámica de las fluctuaciones
de series de tiempo puede comprenderse bajo el estudio de la correlación de variables locales
en diferentes intervalos de muestreo. La autoafinidad de las fluctuaciones de series de tiempo
se caracteriza por el comportamiento de escalamiento. Cuando la función de estructura
presenta un comportamiento de z constante en intervalos de dt, el exponente dinámico z
está dado por:
1
δt c ∝τ z
(10)
El espectro de potencia y la función de estructura a su vez escalan con el intervalo de muestreo

t como:
σ ∝τ β y (11)
€
donde β es el exponente de crecimiento. Estos exponentes de escalamiento satisfacen la
relación de escalamiento z = z/β.
€
Los procesos de crecimiento pueden dividirse en clases de universalidad de acuerdo a los
valores de los exponentes característicos como el de escalamiento (Hurst), el de crecimiento
y el de rugosidad local o global. Particularmente para determinar la clase de universalidad de
la dinámica de fluctuación asociada a los dos exponentes de escalamiento independientes: z
y z. El conocer una clase de universalidad permite comprender los procesos que gobiernan
la dinámica del sistema y así caracterizar, modelar y hacer predicción de series de tiempo de
diferente naturaleza (Balankin et al., 2007).
Análisis de EEG de modelo animal de epilepsia. Un modelo animal se refiere a un

animal que puede presentar una enfermedad igual o similar que en los seres humanos. Se usa
para estudiar el desarrollo y evolución de las enfermedades y para probar nuevos tratamientos
antes de ser administrados en seres humanos. Existen varios tipos de modelos animales experimentales
de epilepsia, con los que se logra inducir una condición persistente del tipo epiléptico, provocando
sensibilidad a la generación de crisis y permite el análisis de la generación de las crisis, así como
de las transiciones de periodos interictal a ictal, e ictal a postictal y del efecto de medicamentos.
Algunos modelos usados en roedores son: mutaciones espontáneas, modelo químico, estatus
epilepticus, radiación, Kindling, modelo crónico límbico, genético (3rd Workshop on Seizure
Prediction, 2007).
268
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En los siguientes párrafos se describe una investigación realizada por un grupo interdisciplinario
del Instituto Politécnico Nacional, la Universidad Autónoma Metropolitana y el Instituto
Nacional de Neurología y Neurocirugía “Manuel Velasco Suárez”.
1) Identificación del problema: Se han publicado diversos estudios en los últimos años, relacionados
con la caracterización de EEG, con el propósito de predecir la ocurrencia de las crisis
epilépticas. Un tema abierto a la investigación en este campo es la caracterización estadística
de EEG epiléptico bajo distintas condiciones, por ejemplo, el mecanismo de acción de
fármacos antiepilépticos in situ (Duncan J., 2002; Mormann et al., 2006). El objetivo de esta
investigación está centrado en la caracterización del comportamiento cerebral en el inicio y
desarrollo de una crisis, particularmente originada en el lóbulo temporal de ratas, mediante
el análisis estadístico y fractal de EEG bajo el efecto de un fármaco epiléptico ocluido en un
reservorio nanoestructurado de liberación controlada.
2) Hipótesis: El comportamiento de las áreas cerebrales involucradas en la crisis epiléptica

no permanece con la misma tendencia en el periodo interictal, por lo que es identificable la
transición ictal. En reacción al efecto del fármaco liberado, se recobra un comportamiento
cercano al periodo de control. La determinación de los parámetros que gobiernan la dinámica
del fenómeno posibilitará su modelación en términos de la teoría de rugosidad cinética y
permitirá hacer predicción de las series de tiempo de estas variables dinámicas.
3) Obtención de datos: Los EEG digitales se obtuvieron en el Instituto Nacional de Neurología

y Neurocirugía “Manuel Velasco Suárez”. Provienen de dos grupos de ratas Wistar (180
a 250 grs.), cada uno formado por 5 ratas estimuladas mediante Kindling químico: con la
administración de PTZ (pentilenetetrazol) (35mg/kg) en periodos de tiempo continuos, se
generaron crisis epilépticas en cinco fases definidas por Racine (Racine R.J., 1972), desde
movimientos oculares, hasta una crisis generalizada. Los EEG fueron tomados en las distintas
etapas del método, en las tres fases de las crisis (interictal, ictal y postictal). El número de
estimulaciones de PTZ administradas es 8 en dosis promedio de 25 ui. Al segundo grupo
de ratas se les insertó en la amígdala basolateral (ABL), mediante cirugía estereotáxica,
un reservorio de estructura nanométrica de titania sol-gel, en el que se ocluyó un fármaco
antiepiléptico: ácido valproico (VPA) (López et al., 2006). En la figura 1 se muestra el lugar de
colocación del reservorio en una imagen del Atlas Estereotáxico del cerebro de la rata.
Para el grupo de ratas sin reservorio, se colocaron dos electrodos formando tres canales (conector
de 5 terminales: tierra, corteza izquierda y corteza derecha en montaje referencial y amígdala
en montaje bipolar) mientras que para el grupo de ratas con reservorio, se colocaron un par
de electrodos formando un solo canal (conector de 3 terminales: tierra y corteza izquierda y
derecha en montaje bipolar).
Se realizaron los registros de los electroencefalogramas en un equipo de video EEG de 18

canales, con un muestreo de 200 MHz. Los registros se realizaron cada tercer día, comenzando
con un periodo de control y posterior a la administración del PTZ, durante un lapso de tiempo
de 20 minutos.
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Figura 1. Lugar de colocación del reservorio. Fuente: Adaptado de Bregma 2.30 mm en Paxinos y
Watson (1998)
4) Análisis experimental: Los EEG fueron segmentados para su procesamiento por etapas de las
crisis: periodo de control, preictal, ictal y postical y divididos en ventanas de 5 y 10 segundos.
En la figura 2 se observa el periodo de control y una crisis en fase IV de la escala de Racine.

a)

b)
Figura 2. EEG en periodos de a) control, b) ictal en fase IV de una rata con reservorio de Ti2O con Ácido
Valproico
Se obtuvo z mediante métodos de trazado auto afín, con el software Benoit (análisis de rango
reescalado, longitud de rugosidad y variograma).
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Resultados
En los resultados preliminares de la investigación, el primer grupo de ratas con Kindling se

presenta una tendencia a la persistencia, incrementando z conforme la crisis se desarrolla.
En el comportamiento de los resultados esperados con EEG de ratas con el reservorio
nanoestructurado insertado ocluido con ácido valproico, el valor se estabiliza hacia lo
presentado en periodo de control, proporcionalmente a las fases de crisis.

Figura 3. Variación del exponente de escalamiento z para los periodos preictal, ictal y postictal
Los exponentes de escalamiento β y z permitirán la modelación de estas series de datos,

correspondiente a alguna clase de universalidad, lo que permitirá realizar predicciones de su
comportamiento.
Conclusión
El comportamiento complejo y fractal del cerebro puede estudiarse mediante el análisis con
métodos no lineales de las señales eléctricas. Actualmente el área de investigación en detección
y predicción de crisis epilépticas se encuentra en desarrollo, beneficiándose de aportaciones
provenientes de estudios con modelos animales, para el mejoramiento de tratamientos
farmacológicos, con el propósito de desarrollar dispositivos de liberación controlada.
El presente trabajo aún se encuentra en etapa de desarrollo, en la obtención de y es parte de

una investigación conjunta de las instituciones mencionadas.
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Farmacocinética y farmacodinamia
Introducción
La farmacología es la ciencia que estudia las drogas: lo que son, como trabajan y que es lo que
hacen. Esta ciencia se divide en farmacocinética y farmacodinamia.
La farmacocinética es la parte de la farmacología que estudia las concentraciones de un

fármaco en el organismo, en función del tiempo y de la dosis (Mycek et al., 1997). Estudia,
desde el punto de vista dinámico y cuantitativo, los fenómenos que determinan la disposición
de un fármaco en su lugar de acción (adsorción, distribución, biotransformación y
eliminación de fármacos) (figura 1) a partir de la forma de dosificación bajo la que se
administra. Tales factores, determinarán la concentración del fármaco en el lugar de acción y
de la cual dependerá en gran parte, la acción terapéutica de la droga. De manera más simple,
podemos definir a la farmacocinética como las modificaciones que impone el organismo al
fármaco (Malgor et al., 2000).

Figura 1. Fenómenos que determinan la disposición de un fármaco
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La farmacocinética también incluye el conocimiento de los siguientes parámetros (Tozer et al.,

2006; Smith et al., 1993):
• Volumen aparente de distribución

• Aclaramiento de la droga (clearance)
• Vida media plasmática
• Biodisponibilidad
Para que se pueda llevar a cabo una terapéutica científica y segura para el paciente, el médico
debe conocer claramente los mecanismos por los cuales una determinada droga se absorbe,
circula en la sangre y se distribuye.
La absorción de una droga es necesaria para que esta cumpla su acción farmacológica en
el sitio de acción (Katzung el al., 1991). Esto implica que la droga debe pasar a través de las
membranas biológicas semipermeables, para posteriormente alcanzar la sangre, en donde se
distribuye, circula y se metaboliza para finalmente ser excretada por el organismo.
Factores físicos que determinarán el proceso de absorción son (Domínguez.Gil et al., 2001):
a) Flujo sanguíneo en el sitio de adsorción

b) Área total disponible para la absorción
c) Tiempo de contacto en la superficie de absorción
Es muy importante conocer los mecanismos mediante los cuales las drogas atraviesan las
membranas celulares, porque de ellos dependerá la concentración final en los sitios de acción.
En los procesos de absorción, se presentan los siguientes mecanismos:
• Transporte pasivo
• Absorción convectiva
• Transporte activo
• Difusión facilitada
• Pinocitosis
• Absorción por asociación de pares de iones
Para todos estos mecanismos, es importante también considerar los factores que modifican la
absorción, como la solubilidad de la droga (se absorbe más rápido cuando se encuentra en forma
acuosa), la cinética de disolución de la forma farmacéutica del medicamento, concentración,
circulación en el centro de acción, superficie de absorción y vía de administración.
Una vez que el fármaco sufrió los procesos de la absorción, ingresa a la sangre y en el plasma
sanguíneo se liga a proteínas en parte y el resto circula en forma de moléculas libres. La unión a
las proteínas es usualmente lábil y reversible, generalmente a través de enlaces iónicos, puentes
o en laces de hidrógeno, fuerzas de Van der Walls y raramente enlaces covalentes. La fracción
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ligada a las proteínas guarda siempre un equilibrio con la fracción libre. Debe considerarse que
solo esta fracción de moléculas libres puede atravesar las membranas que separan los distintos
compartimentos, por lo que de ella dependen los efectos terapéuticos. Cuando moléculas de
la fracción libre salen del plasma y se distribuyen en el organismo, una fracción equivalente de
moléculas se desliga de las proteínas y pasa a reemplazar a las moléculas de la fracción libre.
De esa manera la proporción fracción ligada/fracción libre se mantiene constante aunque la
concentración total vaya disminuyendo progresivamente en el plasma (Curtis et al., 1992).
El transporte plasmático es también un punto importante en el fenómeno de las interacciones

entre drogas. Cuando se administran dos o más drogas es relativamente frecuente que las mismas
interaccionen a nivel del transporte (Cluter et al., 1994). Esto puede ocurrir cuando dos drogas
que utilizan el mismo transportador plasmático compiten por el mismo luego de los procesos
de la absorción. En tal sentido aquella droga que posea mayor afinidad y/o se encuentre en
mayor concentración desplazará a la segunda del sitio de unión y consecuentemente la fracción
libre de esta última droga se incrementará en el plasma. Los fármacos en su distribución y
circulación encuentran algunos tejidos por los que resulta muy difícil su pasaje. Dentro de las
estas barreras, las más importantes son (Gladtke et al., 1979; Gibaldi et al., 1982):
a) Barrera hematoencefálica: Está localizada entre el plasma sanguíneo de los vasos

cerebrales y el espacio extracelular del encéfalo. El paso de las drogas en el cerebro
aunque está sujeto a las mismas leyes que rigen el pasaje de drogas a través de otras
membranas biológicas, presenta claras diferencias, ya que muchas drogas atraviesan
con mucha dificultad o directamente no atraviesan esta barrera, alcanzando niveles de
concentración muy diferentes a otros órganos o tejidos.
b) Barrera sangre líquido cefalorraquídeo Esta localizada a nivel de los plexos
coroideos e impide el paso de ciertas drogas al LCR. Los capilares de los plexos
coroideos son similares a los capilares extracraneales, pero se encuentran recubiertos
por células epiteliales que posiblemente sean responsables de las diferencias en la
absorción. En general los antibióticos solo alcanzan un porcentaje de la concentración
plasmática cuando se administran por otra vía que no sea la intratecal. En tal sentido la
inflamación de las meninges puede modificar el pasaje de drogas a través de la misma.
c) Barrera placentaria El conocimiento de este punto es de gran importancia desde el
momento que muchas drogas administradas a la madre pueden ejercer efectos en el feto.
Es especialmente importante la administración de cualquier droga en el período de la
organogénesis que comprende en forma práctica el primer trimestre del embarazo, ya
que los fármacos liposolubles, no ionizados pasan con facilidad y por difusión pasiva la
barrera placentaria, por ej. la morfina, anestésicos gaseosos, líquidos volátiles, salicilatos
sulfamidas, benzodiacepinas, neurolépticos, el alcohol, etc. La glucosa y otras hexosas
atraviesan la placenta por difusión facilitada, los iones y aminoácidos por transporte
activo, las inmunoglobulinas y proteínas por pinocitosis.
d) Barrera hemato-ocular En el ojo el epitelio de los procesos ciliares es una barrera
difícil de atravesar, por ello la mayoría de los fármacos, no alcanzan niveles terapéuticos
en humor acuoso ó vítreo, cuando se administran por vía parenteral.
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Los fármacos para ser eliminados del organismo deben ser biotransformados o metabolizados
en compuestos polares (Levine et al., 2000). Los mecanismos de biotransformación de drogas
pueden dividirse en dos grupos, que dependen de distintos procesos bioquímicos En general los
compuestos xenobióticos (Fármacos y tóxicos) sobre todo aquellos con actividad farmacológica,
tienden a ser muy lipofílicos y se encuentran no ionizados al pH fisiológico es por ello que su
excreción por vía renal es muy dificultosa porque aunque por el tamaño molecular pueden
atravesar las membranas por filtración glomerular, sufren un intenso proceso de reabsorción
tubular.
Los mecanismos de biotransformación (figura 2) o metabolización originan modificaciones

de las drogas llamados metabolitos, que son usualmente sustancias más hidrosolubles, menos
liposolubles, más polares y se encuentran más ionizadas que el fármaco original. Por ello
generalmente total o parcialmente (carecen) de actividad biológica, no se ligan eficientemente
a las proteínas plasmáticas, son menos difusibles y se eliminan con mayor facilidad por riñón.

Figura 2. Mecanismos de biotransformación de drogas1
Las reacciones de metabolización se pueden dividir en dos grupos fundamentales:
a) Reacciones de Fase I: Catalizadas por los sistemas de citocromos P450 (Cit P450) y afines,
llevan a la formación de metabolitos intermedios mediante reacciones metabólicas reductivas
y oxidativas. Estas permiten posteriormente la conjugación de los metabolitos intermedios
formados, aumentando así su polaridad, en la llamada Fase II. Las reacciones adversas a
drogas se relacionan con la presencia de metabolitos intermedios en Fase I.
1
http://www2.uah.es/tejedor_bio/bioquimica_ambiental/imagenes/biotransformacion-complu.gif
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Las enzimas de Cit P450 son una familia compleja de enzimas bajo control genético de la
que aún desconocemos la mayor parte. Básicamente corresponden a hemoproteínas capaces
de transferir electrones y son de gran importancia en las reacciones de Fase I y generación
de metabolitos tóxicos reactivos. Los metabolitos generados por estas hemoproteínas son
principalmente de dos tipos: electrófilos y radicales libres.
Los electrófilos son producidos por la oxidación de drogas y generan metabolitos reactivos que
actúan como arilantes o alquilantes, uniéndose covalentemente a sitios nucleofílicos, ejerciendo
su toxicidad a través de la formación de enlaces covalentes.
Los radicales libres que se producen por reacciones de oxidación o reducción de los sistemas
de Cit P450, pueden unirse de manera covalente a proteínas o ácidos grasos no saturados y
extraen electrones de estos ácidos grasos desde fosfolípidos de membrana. Los radicales libres
pueden combinarse con oxígeno y formar radicales peroxidados de ácidos grasos, que a su vez
extraen un electrón del ácido graso no saturado inmediatamente adyacente. Esto trae consigo
una reacción en cadena que es capaz de autopropagarse, alterando gravemente la composición
de las membranas.
b) Reacciones de Fase II: En estas reacciones no interviene la formación de metabolitos

intermediarios e involucra a una gran variedad de reacciones de conjugación, donde se
agregan moléculas polares tales como ácido glucurónico, sulfatos, aminoácidos y muy
especialmente glutation (GSH). El GSH juega un papel extremadamente importante por
cuánto el principal sitio nucleofílico es el grupo tiol de la cisteína y en las células, el GSH es
la mayor reserva de tioles. De esta forma, éste sirve como substancia protectora ya que las
GSH transferasas (una familia de enzimas en el hepatocito), catalizan la detoxificación vía
conjugación de metabolitos reactivos con GSH. Así, los metabolitos electrofílicos interactúan
preferentemente con el grupo tiol de GSH en vez de hacerlo con las proteínas constitutivas
de membrana o enzimas, y sólo cuando éste se agota los metabolitos electrofílicos producen
el daño (Lüllman et al., 2004).
Biodisponibilidad y Bioequivalencia
La biodisponibilidad, bioequivalencia y selección de drogas han emergido como temas críticos
en farmacia y medicina en las pasadas cuatro décadas. Con respecto a la disminución de
gastos que en cuestiones de salud, normalmente suele hacer la gente, el uso de medicamentos
genéricos ha incrementado de manera considerable. Tan solo en la década de los 90’s el 50%
de las prescripciones podían ser sustituidas con un producto genérico2 y cerca del 80% de las
drogas podían obtenerse de al menos más de una fuente. Con la creciente disponibilidad y
uso de productos genéricos, los profesionales de la salud se enfrentan a una enorme lista de
productos, de los cuales deben seleccionar aquellos que son terapéuticamente equivalentes.
2
Miller S.W., Strom J.G., Drug Product Selection: Implications for the Geriatric Patient, The Consultant
Pharmacist, 5(1):30-37, 1990.
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La biodisponibilidad de una droga es la fracción de droga administrada, que logra alcanzar la

circulación sistémica (figura 3). Se expresa como la fracción de droga que consigue acceso a la
circulación sistémica en su forma químicamente inalterada. Es una estimación de la cantidad
de fármaco que puede alcanzar el lugar de acción. La biodisponibilidad suele ser diferente
según la vía de administración. Se expresa en porcentaje. Nos da la idea de su velocidad de
absorción y de la cantidad que llega a la biofase de los receptores tisulares en los que debe
ejercer su acción. Un valor de biodisponibilidad oral cercano a uno, significa que el fármaco
se absorbe bien y sufre escaso metabolismo.

Figura 3. Curva de concentración máxima de un fármaco en plasma.
Tabla I. Factores que afectan la biodisponibilidad del fármaco
Metabolismo hepático de primer paso Si la droga es rápidamente metabolizada por el

hígado, disminuye la cantidad de droga que llega
intacta a la circulación sistémica
Solubilidad de la droga Para que una droga sea rápidamente absorbida
debe ser en gran parte hidrofóbica pero tener
una ligera solubilidad en soluciones acuosas.
Inestabilidad química
Naturaleza de la formulación Tamaño de partícula, forma de la sal,
cristalinidad, presencia de excipientes.
El término bioequivalencia, se refiere a la velocidad y proporción en que el mismo principio

activo de dos medicamentos “iguales” alcanza la circulación sistémica. Dos drogas son
bioequivalentes si muestran comparable biodisponibilidad y tiempos iguales para logra el pico
de concentración sanguínea (Rosenfeld et al., 2007).
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Figura 4. Niveles del fármaco vs. tiempo. Aquí se representa la evolución temporal de las concentraciones
sanguíneas del fármaco administrado por vía intravenosa (curva punteada) o por vía oral (curva continua).
Modelos farmacocinéticos
Una ecuación farmacocinética describe las relaciones entre los regímenes de dosificación y el
perfil de concentración de la droga en la sangre en función del tiempo.
Para que la interpretación de las relaciones entre concentraciones y efecto sea correcta es
necesario proponer un modelo farmacocinético que simplifique el complejo sistema biológico
que es el organismo y los procesos que el fármaco experimenta en él. Los modelos se conciben
mediante términos matemáticos que son una forma concisa de expresar relaciones cuantitativas.
El número de parámetros necesarios para describir un modelo dependerá de la complejidad

de los procesos implicados y de la vía de administración y puesto que los parámetros no se
determinan experimentalmente sino a partir de pares de datos concentración (variable
dependiente)-tiempo (variable independiente), la limitación en el número de datos disponibles
es una de las más importantes a la hora de estimar parámetros farmacocinéticos. Los modelos
empleados en farmacocinética son (Goodman et al., 1996):
1. Análisis compartimental (tradicional)

2. Análisis anticompartimental
3. Farmacocinética fisiológica.
4. Farmacocinética de población
Los modelos farmacocinéticos son útiles para:
• Predecir concentraciones plasmáticas, tisulares y urinarias con cualquier régimen de

dosificación.
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• Calcular el régimen de dosificación óptimo para cada paciente.

• Estimar la posible acumulación del fármaco o sus metabolitos.
• Correlacionar concentraciones de fármaco con efecto farmacológico o toxicológico.
• Evaluar diferencias en la biodisponibilidad y bioequivalencia de las formulaciones
• Describir el efecto de los cambios fisiológicos o patológicos en la absorción, distribución
y eliminación de los fármacos.
• Explicar interacciones entre fármacos.
La Farmacodinamia se define como el estudio de los efectos bioquímicos y fisiológicos de los

fármacos y sus mecanismos de acción. Estudia el efecto y mecanismo de acción de los fármacos
sobre el organismo. Efecto es toda modificación bioquímica o fisiológica que produce una
droga sobre el organismo. La Farmacodinamia también estudia la relación entre la estructura
química de la droga y su actividad farmacológica. Desde un punto de vista práctico se puede
definir a la Farmacodinamia como los cambios que el fármaco ejerce en el organismo.
Por lo general los medicamentos no crean nuevas funciones sino que modifican funciones
existentes. El mecanismo de acción, se refiere a las modificaciones que ocurren a nivel
molecular.
En función de sus propiedades o de la vía de administración, un fármaco puede actuar

solamente en un área específica del cuerpo. La interacción con su diana (órgano o tejido),
produce generalmente el efecto terapéutico deseado, mientras que la interacción con otros
tejidos u órganos puede causar efectos secundarios.
En farmacodinamia, es fundamental el concepto de receptor farmacológico, que es una
estructura que ha sido plenamente identificada para numerosas drogas. La gran mayoría de
los fármacos cumplen su mecanismo de acción a través de la interacción con los receptores de
fármacos.
Receptores
Muchos fármacos se adhieren a las células mediante receptores que se encuentran
en la superficie de éstas. Las células en su mayoría tienen muchos receptores de superficie que
permiten que la actividad celular se vea influenciada por las sustancia químicas (fármacos u
hormonas), que están localizadas fuera de la célula (figura 5). La mayor parte de los receptores
son proteínas. Este grupo incluye, aparte de moléculas que son propiamente receptoras de
sustancias endógenas (que median la transmisión de mensajes en el organismo), enzimas
importantes de vías metabólicas, proteínas transportadoras, proteínas estructurales, etc.
Un receptor de la superficie de la célula presenta una configuración que permite que una
sustancia química determinada, como un fármaco, una hormona o un neurotransmisor,
pueda unirse a él, dado que dicha sustancia química presenta una configuración que se ajusta
perfectamente al receptor.
Existen dos parámetros fundamentales en la acción del fármaco con el receptor: la afinidad
(mutua atracción entre el fármaco y su objetivo) y la eficacia o actividad intrínseca (medida
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Figura 5. Esquema de los receptores celulares
de la capacidad del fármaco para producir un efecto farmacológico). Un ejemplo de acción

sería la acción sobre el centro termoregulador que puede producir un fármaco antipirético.
Mientras que el efecto de un fármaco podría decirse que es la manifestación externa de la
acción farmacológica, en este sentido la disminución de la temperatura sería el efecto del
antipirético (Koppanyi et al., 1963).
Hay que tener en cuenta que para que exista efecto farmacológico es necesaria previamente
la acción farmacológica y hay que tener en cuenta también, que puede haber acción y no
haber efecto.
La acción que un fármaco puede realizar sobre el organismo puede ser acción estimulante,
depresora, sustitutiva, anti infecciosa.
Curva dosis-respuesta
La correspondencia entre la cantidad de tóxico y la magnitud del efecto es lo que se conoce

como la relación dosis-efecto o dosis-respuesta.
Una curva de dosis-respuesta es una representación gráfica de la correlación entre una serie
de dosis, consideradas como la variable independiente y por lo tanto representadas en el eje x
de coordenadas, y el efecto observado, considerado como la variable dependiente y graficado
en el eje y.
Las curvas de dosis-respuesta pueden tomar diferentes formas de acuerdo a los mecanismos que
representan (Velásquez-Lorenzo et al., 1993). En algunos casos es posible obtener una mejor
representación usando una escala aritmética para la dosis, como en el caso del estudio de la
inhibición de la actividad de colinesterasas de acuerdo a una serie de dosis de organofosforados
en la dieta.
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Características de una curva dosis-respuesta. La potencia se refiere a la localización

de la curva a lo largo del eje X, representativo de la concentración del fármaco o de la dosis del
mismo. En otras palabras, se refiere a la dosis necesaria de un fármaco para alcanzar un efecto
determinado. En la figura 7, los fármacos B y C tienen la misma potencia para su respectivo
efecto máximo (alcanzan dicho efecto a la misma dosis). Este parámetro indicaría, pues, la
afinidad de un fármaco por su receptor (Kluter et al., 1994).
Si comparamos la potencia de dos fármacos, se utiliza la potencia relativa, la cual no es más

que el cociente entre la potencia de un fármaco respecto a la de otro tomado como patrón.
En la figura 6, los fármacos B y D tienen la misma eficacia, puesto que alcanzan igual efecto
máximo.
La pendiente, es una característica de importancia menos clínica que de investigación, puesto

que informa sobre la forma de interacción de una droga con su receptor. Sin embargo es de
utilidad en la determinación del rango de dosis en el que un fármaco puede ser administrado.

Figura 6. Curva dosis-respuesta
Por otro lado, la variabilidad biológica, se refiere al hecho de que no todos los individuos
reaccionan del mismo modo ante la misma droga, de tal manera que una curva dosis-respuesta
de un individuo sólo puede aplicarse al mismo.
Respecto a este parámetro, se deben destacar los siguientes términos:
• Hipo e Hiperrreactividad: dificultad o facilidad (mayores o menores dosis

requeridas) para el logro del efecto deseado.
• Tolerancia: requerimiento ulterior de mayores dosis para lograr un efecto que antes se
lograba con dosis menores.
• Idiosincrasia: efectos inusuales de la droga, dados en un pequeño porcentaje de la
población.
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Antagonismo farmacológico
Un antagonista se puede definir como una molécula que se une al receptor sin inducir
en él la producción de la función a la que está destinado, por lo que su acción sería la de
impedir la del agonista endógeno. En general, por el tipo de unión al receptor, existen dos
tipos de antagonista: si se unen al sitio en que el agonista normalmente lo hace se trata de
antagonistas competitivos; si lo hacen en otro sitio del receptor, se trata de antagonistas
no competitivos (Hughes et al., 1989).
En el primero de los casos, es posible que el agonista en altas concentraciones (y en función de

la Ley de Acción de Masas) desplace al antagonista, permitiendo que la función se presente;
sin embargo se logra de manera más difícil. Puede deducirse entonces que estas drogas actúan
sobre la potencia de un receptor (reduciéndola), sin alterar la eficacia, puesto que el efecto
máximo aún puede ser alcanzado (aún cuando sólo es a dosis mucho mayores del agonista que
las requeridas habitualmente). Esta posibilidad de que se pueda alcanzar aún el efecto máximo
hace que este antagonismo también se conozca como antagonismo superable.
Los antagonistas no competitivos, al situarse en otro sitio del receptor, no pueden ser
desplazados por el agonista, por lo que su efecto persistiría aún en presencia de dosis altas de
aquél. Por esta razón, este antagonismo también se conoce como no superable.
Hasta hace poco tiempo el concepto de agonista y antagonista se entendía solamente como
un mecanismo relativamente simple en el cual el agonista se unía al receptor modificándolo
y activando procesos en la membrana y el antagonista solo actuaba interfiriendo con la
unión del agonista al receptor, compitiendo por afinidad al receptor y evitando su activación
(antagonismo competitivo).
Por ejemplo, en el escenario de los receptores de histamina, el poder de un agonista o de un

antagonista dependía solamente de la afinidad (fuerza de unión) que se tuviera con el receptor.
Sin embargo, Church y colaboradores (2002) encontraron que por lo menos los receptores
acoplados a proteínas G (GPCRs) no funcionan en esta forma tan simple de “apagado” y
“encendido”. Ahora se ha demostrado que la unión del agonista con el receptor estabiliza
al GPCR en su forma activa y en cambio la unión del ahora llamado agonista inverso
(antihistamínico) con el mismo receptor lo estabiliza en su forma inactiva evitando así el efecto
biológico. Se ha encontrado también que los receptores tienden a permanecer parcialmente
en su forma activa (actividad constitutiva) y el agonista los estabiliza para mantener este efecto
en forma más intensa y prolongada. En este nuevo escenario ahora el agonista inverso, el
antihistamínico, puede tener un efecto aún sin la presencia del agonista, de la histamina, y
no depender solo del bloqueo competitivo que se creía antes. Así el antihistamínico puede
ejercer una acción negativa sobre el receptor al estabilizarlo en la fase inactiva. Hasta ahora
se ha demostrado que por lo menos los receptores H1, H2 y H3 funcionan de esta forma.
Alternativamente se han encontrado antihistamínicos anti H2 que se unen igual al receptor
en su conformación activa o inactiva sin alterar la función del receptor, por lo que se les ha
llamado antagonistas neutrales y estos sí compiten solamente con la unión de los agonistas.
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Se puede cuantificar la capacidad de un antagonista competitivo. Esto se hace por medio de

un índice conocido como potencia antagónica (pAx), que es el logaritmo negativo de la
concentración del antagonista que se precisa para hace que se requiera una dosis de agonista x
veces mayor que la requerida para lograr el efecto deseado en ausencia del antagonista.
Es posible el uso de drogas que generen un efecto opuesto por medio de un mecanismo no
asociado al receptor que media la función que se desea modificar. En este caso, la interacción
se conoce como antagonismo funcional o fisiológico.
Sinergismo farmacológico
Las interacciones entre dos fármacos no siempre son en sentido negativo, es decir que no
siempre se manifiestan como la disminución del efecto de uno por la presencia de otro. Hay
combinaciones farmacológicas en las cuales la respuesta puede acrecentarse en lugar de
inhibirse. Este fenómeno se llama sinergismo, y comprende dos posibilidades:
• De suma: se refiere al hecho de que los dos fármacos implicados en la respuesta tienen
actividad por sí solos, la cual se suma al estar presentes ambos para producir un efecto
que es la SUMA de los efectos individuales. Generalmente se da cuando los mecanismos
de producción del efecto de cada fármaco son diferentes. Ejemplo: uso concomitante
de agonistas adrenérgicos y antagonistas muscarínicos: Ambos son capaces de producir
taquicardia, la cual se manifiesta en presencia de los dos en forma más intensa (suma de
los efectos).
• De potenciación: uno de los fármacos presenta actividad intrínseca, es decir es capaz
de producir el efecto; el otro fármaco es capaz de “ayudar” a que ese efecto se realice
más fácilmente, pero de por sí, no posee actividad. Ejemplo: Uso de penicilinas en
conjunto con inhibidores de las betalactamasas.
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Farmacogenómica: medicina personalizada
Dra. Marisol López López
Introducción
Uno de los principales objetivos de la medicina del siglo XXI es el desarrollo de nuevos
medicamentos, mejor dirigidos a sus sitios blanco y mejor tolerados por la mayoría de los
pacientes. Esta meta ha estado favorecida por el rápido aumento en el conocimiento del
genoma humano, basado principalmente en los datos obtenidos del Proyecto del Genoma
Humano (International Human Genome Sequencing Consortium, 2001; Little, 2005). A
partir de esta investigación han surgido nuevas ideas sobre la susceptibilidad y la patogénesis
de las enfermedades, así como de la interacción entre los humanos y las sustancias exógenas,
como las drogas o fármacos.
En la terapéutica farmacológica frente a una enfermedad, la primera observación del médico

es la gran variabilidad interindividual de la respuesta. Dicha variabilidad es resultado de las
características genéticas del sujeto moduladas por factores fisiológicos, patológicos y ambientales
como estilo de vida, dieta, edad, funcionamiento hepático y renal, estado nutricional y la
severidad de la enfermedad a tratar, entre otros (López et al, 2004). De esta manera, una
particular dotación genética del sujeto influye tanto en los factores farmacocinéticos (absorción,
distribución, metabolismo y excreción) determinantes de la concentración del fármaco en su
sitio de acción, como en los factores farmacodinámicos (acción específica del fármaco) ligados
a la manifestación propia de la enfermedad y a la reacción adversa.
Es importante señalar que la variabilidad en la respuesta de los individuos a los medicamentos

constituye la regla, y no la excepción, para la mayoría de los mismos. En ciertas personas se
presentan efectos terapéuticos (eficacia), en otras efectos adversos (toxicidad), y en algunas
el efecto es menor al esperado (ineficacia). Además, en general, la eficacia de una terapia
farmacológica dista mucho de ser óptima; de hecho se ha calculado que la respuesta favorable
a los fármacos de la práctica clínica actual sólo ocurre en 30 a 70% de los pacientes (Sadée
and Dai, 2005). Aunado a lo anterior, el amplio uso de los medicamentos en todo el mundo ha
revelado también importantes diferencias interétnicas en la respuesta a los mismos.
Actualmente existe una gran expectación de que el avance científico repercuta en mejorar
las técnicas diagnósticas y en el desarrollo de medicamentos personalizados, es decir, cuya
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prescripción se realice acorde al paciente individual para maximizar el efecto terapéutico y

minimizar el riesgo de una reacción adversa.
Antecedentes y reacciones adversas a los fármacos
En la década de los cincuenta se documentó que ciertas anomalías enzimáticas predisponían

a presentar reacciones adversas no esperadas. Una de ellas fue la deficiencia de glucosa-6-
fosfato deshidrogenasa que ocasionó anemia hemolítica en soldados afroamericanos después
de la administración del agente antipalúdico primaquina (Weber, 1997). En 1957, Arno
Motulsky propuso que estas reacciones adversas estaban causadas por variaciones genéticas
individuales que resultan en deficiente o nula actividad enzimática (Motulsky, 1957). La
palabra farmacogenética fue acuñada en 1959 por Friedrich Vogel para designar la ciencia
que estudia las variaciones hereditarias que afectan la respuesta individual a los fármacos
(Vogel, 1959). A finales de los años sesenta, se demostró que en los gemelos monozigóticos,
que comparten el 100% de sus genes, existía una gran similitud en la disposición de varios
fármacos; en comparación con los gemelos dizigóticos que sólo comparten el 50% de sus genes
(Vesell and Page, 1968).
En la década de los noventa y como resultado de la fusión entre la farmacogenética y la genómica

(rama de la biología que se encarga del estudio de los genomas) surge la farmacogenómica, la
cual introduce una gran dimensión para la medicina predictiva e individualizada debido a los
adelantos tecnológicos para el análisis del genoma (Goldstein et al, 2003).
Para propósitos prácticos los términos farmacogenética y farmacogenómica son sinónimos y

aunque las definiciones difieren, farmacogenética se refiere al estudio de las interacciones de los
fármacos con un número relativamente restringido de genes, mientras que la farmacogenómica
implica el estudio de las interacciones de los fármacos con el complemento completo de genes,
es decir, del genoma (Court, 2007).
Las reacciones adversas a los fármacos (RAF) constituyen un serio problema de salud. Un
estudio realizado en Estados Unidos calculó que 6.7% de los pacientes hospitalizados
presentaron RAF severas y 0.32% tuvieron RAF fatales, lo que correspondería a 2 millones 216
mil y 106 mil casos respectivamente, situando a estas reacciones entre la cuarta y sexta causa
de muerte en ese país (Lazarou et al, 1998). Aun cuando estas cifras se han criticado, existen
otras evidencias similares de que las RAF constituyen de 5-7% del total de hospitalizaciones
(Einarson 1993; Green et al, 2000), además de que se ha estimado que incrementan dos días la
estancia en el hospital (Bates et al, 1997).
Por otro lado, las RAF son una de las causas más comunes para retirar un medicamento del
mercado (Jefferys et al, 1998), lo que representa una importante repercusión financiera para
la industria farmacéutica, siendo fundamental el conocimiento de los factores genéticos que
afectan la respuesta farmacológica individual tanto para la terapia como para el desarrollo de
los fármacos.
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Variabilidad genética y metabolismo de fármacos
El concepto subyacente de la farmacogenómica es que la respuesta a la terapia farmacológica es

variable en gran medida por la variación genética. Aproximadamente el 99.9% de la secuencia
de ADN es idéntica entre los diferentes individuos. El restante 0.1% que es variable, aún
cuando representa una pequeña proporción del genoma total, es responsable de una variación
significativa en el fenotipo (Ziv and Burchard, 2003). Las diferencias de las secuencias de ADN
en los genes de los individuos que ocurren en la población con una frecuencia >1% se denominan
polimorfismos. Las variaciones más comunes del genoma humano son los polimorfismos de
nucleótido sencillo o SNP (por sus siglas en inglés, single nucleotide polymorphism) que representan
aproximadamente el 90% (Syvanen, 2005). El cambio en la secuencia nucleotídica de un gen
puede conducir al cambio de la secuencia de aminoácidos de una proteína y alterar su acción
enzimática, su estabilidad o su capacidad de unión a otras moléculas. Por lo tanto, la variación
genética puede afectar la eficacia y seguridad de una droga cuando las mutaciones ocurren en
proteínas receptoras, transportadoras o en enzimas metabolizadoras de drogas o fármacos.
A diferencia de otros factores, las variantes hereditarias generalmente permanecen estables
durante la vida de las personas.
La importancia del metabolismo en las reacciones adversas ha sido señalada en un estudio

que encontró que el 59% de los 27 fármacos más frecuentemente implicados en las RAF
eran metabolizados al menos por una enzima con una variante alélica reportada que causa
alteración del metabolismo, mientras que sólo 7-22% de fármacos seleccionados al azar
cumplen con este criterio (Phillips et al, 2001).
Las enzimas metabolizadoras de fármacos (EMF) desempeñan un papel muy importante en

la biotransformación de fármacos o xenobióticos (compuestos químicos extraños) que son
introducidos al cuerpo humano para poder excretarlos. De manera general, las EMF protegen
o defienden el cuerpo contra agentes potencialmente dañinos del medio ambiente, además
de metabolizar una diversidad de sustancias que normalmente están en el cuerpo humano
como hormonas y ácidos biliares, entre otras. El hígado es el sitio principal del metabolismo
de drogas, pero estas enzimas también se localizan en pulmón, placenta, riñón, mucosa nasal
y tracto gastrointestinal; de hecho, algunas EMF forman parte de la barrera hematoencefálica
(El-Bachan, 1999).
El metabolismo de la mayoría de las drogas o fármacos se realiza en dos pasos denominados

fase I y fase II. Las reacciones de fase I son de ataque directo al fármaco e involucran reacciones
de oxidación, hidrólisis y reducción, mientras que las de fase II comprenden reacciones de
glucuronización, acetilación, metilación, sulfación, conjugación con glutatión y conjugación
con amino ácidos (Wilkinson, 2001). Ambos tipos de reacciones (fase I y II) pueden ser reducidas
o inactivadas por polimorfismos genéticos que modifican o alteran la eficiencia de cualquiera
de los sistemas enzimáticos que catalizan estas reacciones generales de destoxificación.
Las principales EMF de fase I son los citocromos P450 (CYP), que reciben este nombre porque
se encuentran unidos a las membranas celulares (cito) y contienen un pigmento heme (cromo y
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P) que absorbe luz a una longitud de onda de 450 nm cuando se expone a dióxido de carbono.
En el humano, los citocromos P450 son una súper familia de más de 50 enzimas implicada en
más del 90% del metabolismo de los fármacos. Se han descrito polimorfismos genéticos de
varios citocromos P450; sin embargo, CYP2C9, CYP2C19, y CYP2D6 son las enzimas más
polimórficas y metabolizan cerca del 40% de los medicamentos actualmente en el mercado,
por lo que han sido las más relevantes para la farmacogenética.
Como ejemplo describiremos a la enzima CYP2D6 (producto proteico codificado por el gen
CYP2D6) que es responsable del metabolismo del 25-33% de los fármacos de la práctica clínica
actual, entre los que se encuentran antidepresivos (ej: imipramina, amitriptilina y paroxetina),
antipsicóticos (ej. haloperidol y risperidona) y beta bloqueadores (ej: carvedilol y metoprolol),
entre otros (Ingelman-Sundberg, 2005).
El gen CYP2D6 se localiza en el cromosoma 22q13.1 y a la fecha se han descrito más de 75

polimorfismos (http://www.ki.se/CYPalleles/), por lo que dependiendo de las variantes que
presente cada individuo, se pueden clasificar en cuatro fenotipos basados en la capacidad para
metabolizar los fármacos:
• metabolizador ultra rápido (MU)

• rápido (MR)
• intermedio (MI)
• lento (ML)
Los pacientes ML presentan una baja o nula actividad de la enzima CYP2D6 lo que resulta
en una alteración del metabolismo y excreción de muchos fármacos, por lo que tienen más
probabilidad de mostrar RAF a estos medicamentos. En contraste, los sujetos MU tienen
riesgo de presentar ineficacia al tratamiento farmacológico por lo que requerirán dosis más
altas que las que se prescriben normalmente para conseguir concentraciones terapéuticas
(Oscarson, 2003).
También se han observado diferencias en las frecuencias de individuos ML, MR y MU

dependiendo del origen étnico de la población. La frecuencia de individuos ML es de 1-2% en
asiáticos, 5% en afroamericanos, y de 6-10% en poblaciones caucásicas. Los etíopes presentan
29% de individuos MU, los árabes sauditas 20%, los caucásicos de 1-2%, a excepción de los
españoles (7-10%) (López et al, 2004).
En fechas recientes realizamos una investigación de CYP2D6 en la población mestiza

mexicana. Los resultados mostraron que la frecuencia de individuos ML fue de 10% y la de
MU de 6.5%. El estudio también mostró una distribución única para las frecuencias de las
variantes genéticas de CYP2D6 (López et al, 2005). Estos datos pueden tener implicaciones
importantes para el uso de fármacos que sean sustratos de CYP2D6 y posean una estrecha
ventana terapéutica.
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Aplicaciones clínicas
La farmacogenómica es una de las primeras aplicaciones clínicas de la era posgenómica,

aunque su implementación en la práctica clínica presenta retos significativos por lo que su
beneficio es todavía limitado. Entre los principales actores de estos retos están la industria
farmacéutica, las instituciones de investigación, las agencias regulatorias, los médicos y los
pacientes (Swen et al, 2007). Sin embargo, se han identificado varios polimorfismos genéticos
en EMF que son relevantes para prevenir o reducir el riesgo de RAF en la quimioterapia
del cáncer, entre ellos destacan el de la tiopurina S-metiltransferasa (TPMT) y el de la
uridina difosfato glucoroniltransferasa 1A1 (UGT1A1). La TPMT es una enzima que metila
la 6-mercaptopurina, una droga utilizada en el tratamiento de la leucemia linfoblástica
aguda. Se han identificado variantes del gen TPMT con menor actividad causantes de una
mielotoxicidad excesiva del fármaco, por lo que los pacientes portadores de estas variantes
alélicas deben ser tratados a dosis menores a las convencionales (Weinshilboum, 2006). La
enzima UGT1A1 constituye la vía más importante del metabolismo del agente antineoplásico
irinotecán a través de la glucuronización de su forma activa, SN38. Se han descrito diferentes
polimorfismos de la UGT1A1 con disminución de su actividad, causantes de concentraciones
elevadas de SN38 que conducen a toxicidad grave (diarrea y neutropenia) al irinotecán (Kim
e Innocenti, 2007). En importante señalar que en respuesta a estos hallazgos la Agencia
para la Administración de los Alimentos y Drogas de Estados Unidos (FDA, US Food Drug
Administration) ha aprobado la inclusión de información farmacogenética en los marbetes de la
6-mercaptopurina y del irinotecán (Haga et al, 2006). También han sido aprobadas dos pruebas
farmacogenéticas disponibles comercialmente que apoyan la personalización del tratamiento
farmacológico. Estas pruebas detectan variaciones en los genes que codifican para tres enzimas
metabolizadoras de drogas: CYP2D6 y CYP2C19 (Roche AmpliChip, http://www.roche.
com/) y UGT1A1 (Molecular Assay; Third Wave Technologies, http://www.twt.com/).
Descubrimiento y desarrollo de nuevos fármacos
La farmacogenómica también está cambiando la forma en que se diseñan, desarrollan y

emplean los fármacos. Primero, identifica los genes de susceptibilidad a enfermedades que
representen blancos terapéuticos potenciales. A partir del blanco terapéutico se diseñan
ensayos clínicos para tamizar los compuestos químicos posibles y determinar su valor. Las
moléculas que demuestren efecto sobre el blanco son evaluadas para determinar su potencia
y seguridad. En esta etapa se pueden modificar los compuestos seleccionados para aumentar
su eficacia, disminuir su toxicidad y facilitar su absorción y excreción. En los últimos años, las
pruebas farmacogenéticas han sido incorporadas a los ensayos clínicos de los fármacos para
ayudar en la interpretación de los datos en la investigación farmacéutica. De esta manera, la
farmacogenómica representa un gran potencial en la línea de producción de los medicamentos
moleculares en la industria farmacéutica, desde su diseño hasta su comercialización.
La oncología es el área que mejor ha aprovechado del uso de una estrategia farmacogenómica.
Un mayor entendimiento de la biología de muchos cánceres ha identificado blancos o dianas
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moleculares precisas para el diseño de nuevos fármacos proporcionando la oportunidad de

seleccionar una terapia óptima. El trastuzumab (Herceptin; F.Hoffman- La Roche Ltd) es un
anticuerpo monoclonal dirigido a la proteína HER-2 (por sus siglas en inglés, human epidemal
growth factor receptor 2) y se prescribe para una variante genética del cáncer de mama que sobre
expresa esta proteína (Baselga et al, 2007). Otro ejemplo es el mesilato de imatinib (Gleevec;
Novartis) que inhibe la actividad de la proteína cinasa Bcr-Abl sintetizada como consecuencia
de la translocación entre los cromosomas 9 y 22 que ocurre en la leucemia mieloide crónica
(Deininger et al, 2005).
Un avance significativo en el desarrollo de nuevos fármacos es la aplicación de la ciencia

de la toxigenómica. El concepto de toxigenómica fue introducido por primera vez en 1999
(Nuwaysir et al, 1999) y puede ser definido como el estudio de la relación entre la estructura
y actividad del genoma y los efectos biológicos adversos de agentes exógenos (Aardema y
McGregor, 2002). La aplicación de la toxigenómica provee una oportunidad excepcional para
identificar los procesos biológicos afectados por la exposición a compuestos farmacéuticos y/o
xenobióticos. Los métodos convencionales para evaluar la toxicidad de una droga son, en
general, costosos y tardados. Una de las principales metas de la toxigenómica es predecir los
efectos a largo plazo de los compuestos utilizando ensayos rápidos. En este sentido, los perfiles
genéticos de expresión global poseen el poder de predecir respuestas tóxicas. Se asume que
los compuestos que inducen toxicidad mediante mecanismos similares, mostrarán perfiles de
expresión genética característicos. Al agrupar los perfiles genéticos de compuestos modelo bien
caracterizados y comparar estos cambios fenotípicos con índices de toxicidad convencionales,
se puede obtener una firma o huella de la expresión genética relacionada con la toxicidad a un
órgano específico y usarse para predecir la toxicidad de un fármaco candidato. La capacidad
predictiva de los perfiles de expresión genética ya ha sido probada en estudios recientes de
compuestos hepatotóxicos (McMillian et al, 2005) y nefrotóxicos (Thukral et al, 2005).
Además de la clasificación de drogas con base en sus perfiles de expresión genética, la

toxigenómica podría proveer datos valiosos de los mecanismos de toxicidad implicados.
Esta estrategia toxicológica mecanística es muy importante, especialmente en la evaluación
del riesgo de compuestos candidatos durante el desarrollo de nuevos fármacos. Muchos
compuestos farmacéuticos o xenobióticos pueden inducir eventos específicos o no específicos
de transducción de señales celulares que activen varias respuestas fisiológicas y farmacológicas
incluyendo homeostasis, proliferación, diferenciación, apoptosis o necrosis, todas las que pueden
ser detectadas a nivel transcripcional. Al examinar alteraciones en la expresión genética de la
respuesta farmacológica, es posible generar hipótesis de los mecanismos subyacentes de la
toxicidad, que podrían ser cruciales para la identificación de riesgos potenciales de seguridad
durante el proceso temprano de desarrollo del fármaco. La aplicación de la toxigenómica
para propósitos mecanísticos podría jugar un papel relevante cuando la toxicidad de los
fármacos candidatos no está asociada con biomarcadores bien establecidos o con cambios
morfológicos significativos. Por ejemplo, varias publicaciones han demostrado la habilidad
de los perfiles de expresión genética en la elucidación de las bases moleculares de la toxicidad
testicular (Khor et al, 2006).
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Perspectivas futuras
El conocimiento de las bases moleculares de la acción farmacológica o tóxica de los

medicamentos, así como los polimorfismos genéticos que influyen en la variabilidad de
la respuesta farmacológica, optimizará el uso de los mismos en lo que ya se conoce como
medicina personalizada o a la carta. Esto se traducirá en la prescripción a cada individuo del
medicamento adecuado a la enfermedad que presenta y a la dosis apropiada para salvaguardar
la eficacia y seguridad del mismo. Uno de los principales problemas para que la medicina
personalizada sea una realidad es el de poder disponer de una metodología analítica que nos
permita identificar la existencia de un determinado polimorfismo genético en la persona a la
que se pretende medicar y que pueda, en algún sentido, condicionar dicha medicación. Sin
embargo, en los últimos años se ha avanzado mucho en el desarrollo de técnicas analíticas
muy poderosas como los microarreglos de cDNA (DNA complementario al RNA mensajero)
que permiten estudiar la expresión genómica o transcriptoma. Más aun, en un futuro cercano
la combinación del estudio de todas las proteínas codificadas por el genoma (proteoma) y del
perfil metabólico (metabonómica) podrían complementar a la genómica para lograr la terapia
farmacológica personalizada (Nebert and Vesell, 2007).
La farmacogenómica también permitirá alcanzar una mayor habilidad para predecir las
reacciones adversas en etapas tempranas del desarrollo de fármacos. Al disminuir los eventos
adversos e incrementar la eficacia terapéutica se podrían tener costos menores en los servicios
de salud. La detección de variaciones en genes implicados en el metabolismo de fármacos o
en la destoxificación de compuestos, permite establecer el perfil genético individual que tendrá
un profundo impacto en la predicción de la respuesta farmacológica y hará posible la terapia
personalizada.
Es importante señalar que el uso y la utilidad de las pruebas farmacogenéticas para reducir las
RAF y mejorar la eficacia de los fármacos debe ser probada por estudios clínicos prospectivos
y estudios farmacoeconómicos relacionados que demuestren el beneficio de la genotipificación
para estos propósitos (Manolopoulos, 2007).
Una de las barreras más importantes para la implementación de la farmacogenética en la

práctica clínica es la educación de esta disciplina, no sólo en los profesionistas de la salud si
no también en el público general. Los médicos clínicos tienden a ignorar la gran cantidad de
información farmacogenética nueva y la ven como una carga adicional y una complicación
para el complejo proceso de decisión terapéutica. Esto parece ser resultado de la falta de
educación de esta ciencia y del potencial que la genómica ofrece en la aplicación médica
de esta tecnología (Frueh and Gurwitz, 2004). La educación genética a nivel de pregrado,
posgrado y educación continua ha ido rezagada del enorme avance científico y técnico del
área, por lo que es imperativo que el diseño de nuevos programas educativos de licenciatura y
posgrado en el área de la salud incluyan los principios y aplicaciones de la farmacogenómica
para permitir a estos profesionistas entender las bases moleculares de la variabilidad individual
en la respuesta farmacológica y los mecanismos moleculares de la acción de los mismos. Esta
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acción es vital para asegurar la implementación rápida y segura de la medicina personalizada

en la práctica médica, acorde con el surgimiento de herramientas genómicas de diagnóstico
para el beneficio de toda la sociedad.
Por último, cabe subrayar que la implementación de la farmacogenómica en los servicios de

salud deberá estar acompañada de un marco legal sólido que asegure una aplicación ética y
socialmente correcta.
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Alteraciones a nivel celular e inmunofenotipo en
niños desnutridos
Dra. Oralia Nájera Medina

Dra. María Cristina González Torres
Introducción
La desnutrición calórico-proteica es un problema de Salud Pública que afecta principalmente

a niños preescolares haciéndolos más susceptibles a las infecciones por eso a estos niños se les
considera como inmunodeprimidos (Chandra, 1991).
Con el interés de dilucidar algunos de los factores que intervienen en la inmuno-supresión

de los niños desnutridos, se han desarrollado diversos trabajos de investigación para explorar
diferentes aspectos a nivel celular que puedan explicar sus efectos en estos niños. Para el
desarrollo de estos trabajos se han utilizando varias técnicas de laboratorio como son:
A. Citometría de flujo, para la caracterización del inmunofenotipo y detección de células

CD4 con funciones de memoria (células que han entrado en contacto con los antígenos) y
linfocitos con funciones efectoras (células encargadas de la defensa del organismo ante un
agente infeccioso).
B. Ensayo del cometa, técnica que permite indagar sobre los posibles daños que puede
presentar el material genético.
C. Técnicas de biología molecular para estudiar algunos aspectos moleculares, como son la
expresión de genes en estos niños.
A. Inmunofenotipo en niños desnutridos
Desde hace varios años se ha venido trabajando sobre el tema de la inmunidad mediada por
células en niños desnutridos. La investigación se ha centrado principalmente en el estudio de
las subpoblaciones de linfocitos en niños desnutridos infectados; lo que ha permitido estudiar
también estas subpoblaciones en niños bien nutridos con infecciones y en niños bien nutridos
sin infección; estos grupos de estudio permiten, por un lado analizar los cambios que propicia
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Alteraciones a nivel celular e inmunofenotipo en niños desnutridos
la presencia de la infección en las subpoblaciones de linfocitos, y por otro, las diferencias que
se pueden encontrar por la presencia de la desnutrición. Además ha sido necesario para la
realización de este trabajo, definir los parámetros de referencia de estas subpoblaciones en
niños sanos.
Este trabajo se ha realizado con la ayuda de técnicas de laboratorio como la citometría de

flujo (CF), la que gracias al empleo de anticuerpos monoclonales de diferente especificidad
conjugados con fluorocromos, permite identificar varias características a nivel celular: tamaño,
forma y complejidad interna, así como características funcionales. Su eficacia y precisión ha
incrementado el uso de esta técnica tanto en los laboratorios de investigación básica como en
los laboratorios clínicos (Barrera et al., 2004).
La citometría constituye un complemento valioso de las técnicas clásicas utilizadas para el

estudio de la morfología, biología y bioquímica celular. Además, en comparación con los
métodos bioquímicos de análisis celular, en los que se obtiene un resultado promedio para
toda la muestra, la CF es capaz de proporcionar información cuantitativa sobre cada célula en
particular y permite identificar en una muestra subpoblaciones de células diferentes, incluso
cuando están escasamente representadas. Además la citometría ha demostrado tener muy
diversas aplicaciones en el área de la genética (Ortiz et al., 2006a).
Para que el citómetro pueda medir las diferentes características de la célula requiere de los
siguientes sistemas:
1. Fluidos: para introducir y alinear las células para ser medidas.
2. Ópticos: una fuente de excitación (láser de 488 nm) y colección óptica para generar y colectar
las señales de luz.
3. Electrónicos: para convertir las señales ópticas a señales electrónicas proporcionales y
digitalizadas para análisis en la computadora.
Para la interpretación de los datos se obtienen gráficas de puntos, a través de las cuales
primero se regionaliza, para que a partir de la región se adquieran los datos de las diferentes
subpoblaciones. Las regiones pueden ser del total de los linfocitos o de una subpoblación en
específico (Figura 1).
A partir de la regionalización se pueden analizar las subpoblaciones de linfocitos con las

gráficas de puntos que se muestran en la Figura 2.
Los principales hallazgos derivados del estudio en los grupos de trabajo se señalarán
considerando primero los encontrados en el grupo testigo, posteriormente a los niños con
infecciones para terminar con los hallazgos en los niños desnutridos infectados.
1. Grupo testigo (niños bien nutridos)
a) Se encontró a nivel de leucocitos (linfocitos, granulocitos y monocitos) que los niños entre
recién nacidos y hasta la edad de 4 años presentan variaciones en su porcentaje, de tal manera,
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Dra. Oralia Nájera Medina y col.
a) b)

b)
CD3 PerCP

Figura 1. a) Gráfica de puntos (FSC contra SSC) para definir la región R1 (total de linfocitos); b) gráfica de
puntos (FL-3 contra SSC) para definir subpoblaciones específicas (linfocitos CD3+, CD4+ etc.).
a) b)

b)
CD45RA-CD45RO+

CD45RA+CD45RO+
CD45RO

CD45RA+CD45RO-

CD45RA
Figura 2. a) Gráficas de puntos con las diferentes subpoblaciones linfocitarias, por medio de cuadrantes y b) gráficas
de puntos con las células vírgenes (CD45RA) y de memoria (CD45RO).
que a los 4 años se podría considerar que alcanzan su madurez, dado que sus valores se acercan
al de los adultos. En los niños estudiados se observaron diferencias relacionadas con el sexo sólo
en los granulocitos (Nájera et al., 2003).
b) En las subpoblaciones de linfocitos sólo se observaron diferencias de acuerdo a la edad

en los porcentajes de los linfocitos T (CD3+) y en los B (CD19+ y CD20+). Estas variaciones
pueden estar relacionadas con la raza, dado que no han sido señaladas en caucásicos,
asiáticos ni en otros grupos raciales (Huenecke et al., 2008; Ilkinciogullari et al., 2004;
Llovera y Solano, 2004). Asimismo, se consideró que el grupo control alcanzó la madurez
y la expansión de sus subpoblaciones de linfocitos a la edad de dos años, en este momento
sus porcentajes promedio se acercan a los porcentajes de los adultos obtenidos en nuestro
laboratorio (Nájera et al., 2003).
301
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c) En las células vírgenes y de memoria a nivel del total de linfocitos y dentro de las
células CD4+ se encontraron diferencias de acuerdo a la edad, conforme los niños son de
mayor edad, las células vírgenes disminuyen y las células de memoria aumentan. Además
se encontraron diferencias vinculadas a la edad en las células CD4+CD45RA+/CD45RO+
(dobles positivas) (Nájera et al., 2003), considerando este dato como otra probable relación
con la raza, dado que tampoco ha sido señalado para asiáticos y caucásicos (Osugi et al.,
1995; Huenecke et al., 2008).
d) En la activación in vitro de las subpoblaciones de linfocitos T CD3+ se observaron claras

diferencias en la capacidad de respuesta ante la presencia del mitógeno, entre niños menores
y mayores de tres años. Los niños menores de tres años presentaron una menor proporción de
células activas (Nájera et al., 2003). En la figura 4 se muestran los anticuerpos utilizados para
el estudio de estas células.
Los hallazgos antes mencionados en subpoblaciones de linfocitos y en el ámbito de leucocitos

confirman que los niños menores de tres años presentan rasgos de inmadurez de su sistema
inmunológico tanto a nivel celular como funcional. Los rasgos más evidentes de inmadurez
funcional fueron la baja proporción de células activadas aunada a la baja proporción de células
de memoria con relación a los niños mayores de tres años (Nájera et al., 2003).
ESTUDIO DEL INMUNOFENOTIPO EN

LINFOCITOS

B (CD20++) T (CD3++) NK (CD56++CD16++)
CD4++ CD8++
ANÁLISIS DE SUB - POBLACIONES

VÍRGENES, DE MEMORIA Y DOBLES POSITIVAS
CD3 ++CD4 ++
CD4++CD45RA
CD45
++
CD4++CD45RA
CD45
++
CD45RO
CD45
++
CD4++CD45RO
CD45
++
(VÍ RGENES) (DOBLES POSITIVAS) (MEMORIA)
ANÁLISIS DE SUB - POBLACIONES

EFECTORAS
CD3+
Figura 3. Principales fenotipos de linfocitosCD4+CD62L-
determinados CD8+CD28-
en los grupos de estudio en sangre periférica.
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2. Grupo de niños bien nutridos infectados
a) En los niños bien nutridos infectados (BNI), se observó que ante la presencia de infección,
en sangre periférica tienden a disminuir los linfocitos CD3+, CD4+, CD8+ y aumentar las
células CD19+ y/o CD20+ (linfocitos B) con relación a niños sanos. La disminución de los
linfocitos T y el incremento de los linfocitos B son hallazgos importantes que muestran los
cambios a nivel periférico de las subpoblaciones de linfocitos como respuesta ante la infección
(Nájera et al., 2004). En pacientes pediátricos con infecciones respiratorias recurrentes también
se ha encontrado porcentaje alto de linfocitos B (CD5+/CD20+) y disminución de monocitos
(CD11c+/CD18+) (Wasik et al., 2005).
ESTUDIO DEL INMUNOFENOTIPO Y LA ACTIVACIÓN

CELULAR
T (CD3 ++) B (CD19 ++) NK (CD56 ++)
CD4++ CD8++ CD19++CD69++ CD56++CD69++
CD4++CD69 ++ CD8++CD69++
++
(CD69 Células Activadas)
Activadas)

Figura 4. Inmunofenotipo de linfocitos activados
b) Los niños bien nutridos infectados presentaron en las células CD4+CD45RO+ (memoria)
un aumento y una disminución de las células CD4+CD45RA+ (vírgenes) con relación a niños
sanos, que orientan sobre un buen funcionamiento de la capacidad de los linfocitos T CD4+
para diferenciarse de células vírgenes a células de memoria, como un mecanismo de defensa del
organismo ante la infección (Nájera et al., 2001b). Así mismo, al analizar células con funciones
efectoras de tipo ayudadoras (CD4+CD62L-) y citotóxicas (CD8+CD28-) se encontró que
estas células se encuentran aumentadas con relación a niños sanos, evidenciando en estos
niños que ante la presencia de una infección la presencia de estas células son necesarias para
la defensa del organismo ante agentes patógenos (Nájera et al., 2007). Las células efectoras
son capaces de producir citocinas y de generar mecanismos inmunológicos necesarios para la
defensa del organismo (Williams and Bevan, 2007).
c) En el caso de la activación in vitro, se observó un aumento significativo de respuesta a los

mitógenos en el total de los linfocitos T (CD3+) y en los CD8+ con relación a niños sanos. Este
dato puede orientar al aumento de respuesta celular ante la infección (Nájera et al., 2001a).
De acuerdo a la información antes mencionada, la presencia de infecciones desarrolla cambios

en las subpoblaciones de linfocitos que permiten al sistema inmunológico reaccionar ante
el daño. Una subpoblación importante fue la presencia de altos porcentajes de células de
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memoria (CD4+CD45RO+), células que son capaces de producir citocinas y ejercer funciones
efectoras (Lanzavecchia and Sallusto, 2005). Al indagar la presencia de células con funciones
efectoras (CD4+CD62L- y CD8+CD28-) se encontró que se encuentran aumentadas en
niños infectados en comparación a niños sanos, evidenciando lo que podríamos considerar
como un buen funcionamiento del sistema inmunológico. Además, estas células se encuentran
“sensibilizadas”, dado que pueden reaccionar rápidamente ante cualquier estímulo, en este
caso se utilizó un mitógeno, observando que un mayor porcentaje de células se activaron en
los niños infectados en comparación a los niños sanos. Estos datos orientan a la movilización y
acción que desarrolla el sistema inmunológico ante una infección. Es importante señalar que
estos datos (sobre células de memoria, efectoras y la capacidad de activación) no habían sido
reportados en la literatura internacional.
3. Grupo de niños desnutridos infectados
a) En los niños desnutridos ante la presencia de infecciones sus subpoblaciones de linfocitos T

CD3+, presentan las mismas tendencias que los niños bien nutridos con infección. Sólo en los
linfocitos B (CD19+ y/o CD20+) muestran una marcada disminución en comparación a los
niños bien nutridos infectados; este es un hallazgo no descrito previamente con relación a la
desnutrición (Nájera et al., 2004).
b) Los niños desnutridos infectados mostraron una disminución significativa en las células
de memoria (CD4+CD45RO+), con aumento de la fracción de células dobles positivas
(CD4+CD45RA+/CD45RO+) con relación a los niños bien nutridos infectados, lo que fue
interpretado como una alteración o retardo en la funcionalidad (diferenciación) de estas células
(Nájera et al., 2001b). Además al estudiar la presencia de células con funciones efectoras
(CD4+CD62L- y CD8+CD28-) éstas se encontraron disminuidas con relación a niños bien
nutridos infectados (Nàjera et al., 2007).
c) Además, se encontró una importante disminución en la activación/ funcionalidad de las

subpoblaciones de linfocitos T (CD3+, CD4+ y CD8+), en los niños con desnutrición ante
la presencia de un mitógeno in vitro, ya que no son capaces de responder ante el estímulo,
comparada con la respuesta de los niños bien nutridos con infección, se comportan como los
niños sanos (Nájera et al., 2001a).
Los cambios encontrados en los linfocitos B (CD19+ y/o CD20+), en las células de memoria, las
dobles positivas, en células con funciones efectoras y en la activación, son hallazgos importantes que
pueden contribuir a entender la causa de la inmunodepresión observada en los niños desnutridos.
Además se pudo constatar estas mismas alteraciones tanto en niños con desnutrición de tercer
grado como de segundo grado; esto último no se había señalado en la literatura internacional,
dado que se señalan alteraciones solo en niños desnutridos de tercer grado.
Así mismo, se encontraron diferencias de acuerdo al grado y tipo de desnutrición: En los niños
con desnutrición tipo kwashiorkor, las células que mostraron más dificultad en la activación
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fueron en los linfocitos totales (CD3+) y los CD8+; en cambio, los niños con segundo grado de
desnutrición presentaron mayor dificultad en el cambio de células CD4+ de vírgenes a células
de memoria al presentar el porcentaje más alto de células dobles positivas (CD4+ CD45RA+
/CD45RO+). Se requiere realizar estudios adicionales con un mayor número de pacientes
desnutridos para corroborar estas tendencias.
Se considera que las pruebas de activación temprana (CD69) de linfocitos, el análisis de

los isotipos CD45RO (memoria) y CD45RA/CD45RO (dobles positivas) en los linfocitos
CD4+, y el de células efectoras (CD4+CD62L- y CD8+CD28-) podrían ser las causas de la
inmunosupresión en los desnutridos.
B. Daños en el material genético de niños desnutridos
Otros estudios que se han realizado tratando de entender la inmunodeficiencia que presentan
los niños desnutridos, fue evaluar si la desnutrición podría estar relacionada con un incremento
en la cantidad de rompimientos de cadena doble y de cadena sencilla de las moléculas de
ADN, dado que ya había antecedentes de que la desnutrición induce daño al ADN, lo que
se determinó por la presencia en linfocitos de estos niños de aberraciones cromosómicas y de
intercambio de cromátidas hermanas (Betancourt et al., 1979; Ortiz et al., 2004). Para poder
trabajar en esta parte de la investigación se utilizó el ensayo cometa.
El ensayo cometa o electroforesis unicelular detecta fundamentalmente rompimientos de

cadena sencilla inducidos en la molécula de ADN y ha mostrado ser sensible para evaluar
el daño al ADN causado por diversos agentes (Tice, 1995). Con esta técnica también se
detectan rompimientos de cadena doble, así como daños en regiones sensibles al álcali, y
sitios incompletamente reparados por escisión de bases o de nucleótidos, en estos dos últimos
casos un nivel alto de rompimientos puede indicar, tanto daño como reparación eficiente.
Esta metodología tiene diversas ventajas: se requiere una cantidad pequeña de muestra para
realizarse, es factible evaluar el daño al ADN en células no proliferantes, el análisis se efectúa
en células individuales, se puede realizar en diferentes tipos celulares, en diversas especies y es
además relativamente simple y rápida (Ortiz et al., 2006b).
En esta técnica las células se colocan dentro de un gel de agarosa sobre un portaobjetos,
posteriormente son sometidas a un campo eléctrico, en una cámara de electroforesis horizontal,
por poco tiempo bajo condiciones alcalinas. Los núcleos son teñidos con bromuro de etidio
para medir la longitud de migración del ADN en el microscopio de fluorescencia utilizando el
analizador de imágenes. En la Figura 5 se muestran las imágenes que se pueden observar en el
microscopio de fluorescencia.
Dentro de la línea de investigación de “Efectos de la desnutrición a nivel celular” los principales

hallazgos que se detectaron fueron:
a). En leucocitos de niños desnutridos se observó un incremento en los niveles de daño y además
por primera vez se señaló que las infecciones graves y los medicamentos podrían influir en el
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a) b)
Figura 5. Cometa donde la longitud de la cauda evidencia daño al ADN.
incremento de los niveles de daño al ADN en niños sanos y desnutridos ambos con infección
(Betancourt et al., 1995; González et al., 2002a).
b) Con el mismo método se determinó que los linfocitos de niños desnutridos después de la
inducción de daño al ADN con peróxido de hidrógeno, tienen una menor capacidad para
repararlo comparados con los niños bien nutridos con infección (González et al., 2002b).
La mayor cantidad de daño en la molécula de ADN y la incapacidad para reparar este daño, en
los linfocitos de niños desnutridos podría relacionarse con la deficiente respuesta inmunológica
observada en ellos, ya que los linfocitos son células que tienen una función primordial en la
respuesta inmunológica de tipo específica. El alto nivel de daño en el ADN podría interferir
con la correcta expresión de los genes de los niños desnutridos.
C. Estudios a nivel molecular en niños desnutridos
El siguiente nivel de estudio se derivó de los resultados del incremento de daño al ADN, ya que
se consideró importante evaluar si la expresión génica se encontraba alterada en los niños con
desnutrición.
Para estudiar la expresión de genes en linfocitos de niños desnutridos se han utilizado dos
estrategias experimentales:
a) Análisis diferenciales.
b) Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real.
a) Para los análisis diferenciales se trabajó con la siguiente metodología: 1) Se aislaron

linfocitos de sangre periférica usando Linfograd (Microlab, México); 2) Los linfocitos fueron
lisados mediante la técnica de congelación-descongelación, la que se aplicó dos veces; 3) El
RNA mensajero fue retrotranscrito (RT), para producir cDNA; 4) Posteriormente los cDNA’s
fueron digeridos con la enzima de restricción EcoRI y fueron ligados al vector Lambda Zap
III (Stratagene, La Jolla, CA); 5) El primer análisis de expresión diferencial fue realizado con
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autoradiografía y la confirmación de la identidad de los clones fue obtenida por Southern blot.
4) Las clonas de cDNA fueron secuenciadas usando el secuenciados Perkin Elmer (Wellesley),
la base de datos usada fue la de la National Center for Biotechnology Information, usando el
servidor BLAST algorithm [Gltschul et al., 1990].
Los resultados fueron: Después de analizar 12,000 clonas, se encontraron 16 genes en los
linfocitos de los niños desnutridos con expresión claramente diferencial, de los cuales 15 estaban
sub-expresados y uno sobre-expresado con relación a niños bien nutridos infectados. Los genes
fueron secuenciados e identificados, observando que nueve de los 16 genes sub-expresados,
correspondían a una proteína relacionada con el metabolismo mitocondrial (metaxina) y uno
más a la proteína 451 con estructura de dedos de zinc que al parecer está relacionada con el
control de la trascripción (González et al., 2006).
Estos datos fueron interpretados como que la desnutrición calórico-proteica está relacionada
con la sub-expresión o sobre-expresión de los genes relacionados con la función mitocondrial,
y con el desarrollo y diferenciación celular.
b) La PCR en tiempo real se ha realizado utilizando sondas TaqMan en un termociclador de

tiempo real (marca Light Cycler). Para hacer el ensayo se obtuvieron muestras de cDNA con
la misma metodología descrita previamente. Se diseñaron los oligonucleótidos para evaluar la
expresión de los genes de Interleucina-2 (IL-2), IL-4, IL-6, IL-10, Factor de Necrosis Tumoral
(TNF) e Interferón gama (IFNγ).
Los resultados mostraron que hay disminución en los linfocitos de los niños desnutridos
infectados de la expresión de los genes de IL-2, IL-6, e IFN y un aumento en la expresión de IL-
4, IL-10 y TNF con relación a niños bien nutridos infectados (González-Martínez et al., 2008).
Estos resultados claramente están relacionados con alteraciones en la respuesta inmunológica
de los niños desnutridos. La disminución de la expresión de dos genes relacionados con la
respuesta T1 (IL-2 e IFNγ), evidencia una alteración en la respuesta T1/T2 y puede explicar
las alteraciones observadas en la respuesta celular de los niños desnutridos y su dificultad para
erradicar infecciones.
Cabría señalar que nuestros estudios sobre la expresión de genes en niños desnutridos con
infección, son los primeros de este tipo que se publican a nivel internacional.
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Células troncales embrionarias
M. en C. Teresa Florencia López-Murillo

Introducción
Gracias a los avances tecnológicos y al interés cada vez mayor de muchos investigadores en
el campo de la biología molecular y celular, en medicina regenerativa y en terapia génica,
se ha avanzado en el conocimiento de las células troncales embrionarias en aspectos como:
marcadores celulares, proteínas constitutivas; tanto membranales como citoplásmicas, sobre
los mecanismos de metilación y acetilación del ADN, las vías de señalización celular, los
medios de cultivo y la aplicación y el uso potencial de las células troncales embrionarias.
Sin embargo, muchos de estos procesos no están del todo claros o completos, debido a la
dificultad de trabajar con células embrionarias humana, dadas las implicaciones bioéticas. Los
proyectos de investigación son evaluados por las leyes y organismos que regulan el uso de las
células troncales embrionarias humanas, como el “Partners Embryonic Stem Cell Research
Oversight comité” (Pruszak et al., 2007) y autorizados por “Human Embryo and Fertilisation
Authority (HFEA)” (http://www.iscr.ed.ac.uk). La mayor información generada al respecto
proviene de embriones de primates no humanos, ratones y pollos, principalmente.
Características de las células troncales embrionarias
El estudio de las células troncales embrionarias (ES, del inglés “Stem Cells”), está documentado
desde 1981 con las investigaciones de Martín y Evans y Kaufman, que trabajaron con las
células ES de la masa interna del blastocisto de ratón, desarrollando los primeros cultivos in
vitro (Anzaldúa et al., 2007; http://stemcells. nih.gov/info/scireport/chapter3).
Las célula ES tienen su origen en la mórula disociada (Anzaldúa et al., 2007) y en la masa
interna de células del blastocisto (Belkind-Gerson et al., 2003; Merchant, 2007; Nakatsuji,
2001; Nagano et al., 2002a; http://www.amyshah. com.2007/04/). Son células con gran
capacidad de proliferación ( Anzaldúa et al., 2007; Merchant, 2007). In vitro las células ES
pueden producir hasta 10 mil millones de células sin diferenciarse (http://stemcells.nih.gob/
info/scireport/ appendixb). Se auto renuevan (Li y Leder, 2007; Young, 2004, http://www.
amyshah.com.2007/04/), mediante división celular mitótica simétrica; formando células hijas
indiferenciadas (Burdon et al., 2002), con capacidad de diferenciarse en diversos tipos celulares
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(Merchant, 2007) in vivo e in vitro (Merchant, 2007), por largos periodos de tiempo. (http://
stemcells.nih. gov/info/scireport/2001report; Prelle et al., 2002). Son células pluripotentes,
con potencialidad para formar células de las tres capas germinales: del endodermo, el
mesodermo y el ectodermo (Anzaldúa 2004; Henson et al., 2005; Konno et al., 2006; Nagano
et al., 2002a; Nikatsuji, 2001; Niwa, 2001; Prelle, et al., 2002; Ulloa et al., 2005).
Las células ES de ratón presentan un núcleo grande (Young et al., 2004) con escasa cantidad
de citoplasma (Tada y Tada, 2001). Su genotipo muestra un cariotipo normal estable (Prelle et
al., 2002; Henson et al., 2005), diploide, característico de cada especie. Young y colaboradores
(2004), observaron gran actividad de la telomerasa en estás células indiferenciadas.
Marcadores celulares
Los marcadores celulares de superficie son antígenos formados por azúcares y/o proteínas
de membrana celular (http://www.antibody.com/index2.html). Las células ES expresan un
grupo de marcadores superficiales que caracterizan a las células embrionarias indiferenciadas
(Young et al., 2004), pluripotentes y en proliferación, que distinguen entre las células ES del
ratón, del mono y las humanas (Ito et al., 2007). Los marcadores que identifican a las células
ES humanas (hES, del inglés “human Stem cells”) son: SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60 y TRA-
1-81 (Pruszak et al., 2007; http://www.antibody.com/index2.html), Oct-4, telomerasa y la
fosfatasa alcalina. En ratón: SSEA-1, fosfatasa alcalina, Oct-4 y la telomerasa y en el mono:
SSEA-1, SSEA-4. TRA-1-60. TRA-1-81, la fosfatasa alcalina y Oct-4 (http://stemcells.nih.
gov/info/scireport/appendixb).
Entre las técnicas utilizadas para poder evidenciar y seleccionar (sorting) a las células que
portan el marcador de superficie de interés, están: a) la técnicas de tinción fluorescentes (Fig.
1), como la proteína verde fluorescente (GPF), que consiste en insertar en la célula un “gene
reportero”, b) la inmunofluorescencia (Humprey et al., 2004), c) el método de etiquetado
y selección con anticuerpos fluorocromo-conjugados (FAC´s (Pruszak et al., 2007; http://
stgemcells.nih.gov/info/ scireport/appendixe) y d) la separación celular inmunomagnética
(MACS) (Pruszak et al., 2007).
Li y Leder (2007), utilizaron la técnica del vector gen trampa retroviral (Virus murino de la
leucemia MMVL) y los genes Neo reporteros, acoplados a los análisis de la GFP y los FAC´s,
teniendo como blanco los genes expresados en células troncales embrionarias indiferenciadas,
clonadas. Con está técnica observaron, in vivo, que la actividad transcripcional se reduce y que
hay genes endógenos se apagan cuando están diferenciadas las células.
Proteínas
Nagano y colaboradores (2002b) y Kunomura y colaboradores (2002), diseñaron metodologías

para obtener el perfil proteómico de la superficie membranal en células troncales embrionarias,
mediante etiquetado o marcaje celular, acompañado por cromatografía líquida ligada a la
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M. en C. Teresa Florencia López-Murillo y col.
Figura 1: Marcadores de superficie celular usando etiquetas fluorescentes (Terese Winslow, http://
stemcells.nih.gov/info/ scireport/appendixe)
espectrometría de masas. Encontraron que el 80% de péptidos identificados eran derivados

transmembranales o proteínas asociadas a membrana. Éstas incluyen la fosfatasa alcalina,
caderina 1, CD9, CD98, antígeno CDw92, receptor A2 Eph, integrina a y b, laminita a1
y proteína 2 transmembranal. Identificaron en células ES la presencia de entre 987-1233
proteína, en células en crecimiento, como enzimas citolíticas, proteínas de citoesqueleto,
transmembranales, receptores y moléculas de adhesión. Consideran que la expresión de estás
proteínas está regulada por la vía se señalización LIF (factor de inhibición de leucemia).
Mediante análisis de DNA y Northern- and Western-blot se ha confirmado la presencia de

Zfp57 (zinc finger protein), proteína presente en células en estado indiferenciado, regulada la
expresión de su gen por el factor de trascripción STAT3 (Agagi et al., 2002). La proteína
Zfp-57 fue localizada en el núcleo celular (Li y Leder, 2007)
Genes
Es difícil, in vivo, identificar los genes y factores que participan en el la bioquímica de las célula
hES, por lo antes mencionado, así que gran parte de la información genética y molecular
provienen de estudios en células ES de ratón in vitro (http://stemcells.nih.gob/info/scireport/
appendixa).
Los microarreglos son comúnmente reconocidos como una herramienta para evaluar la
expresión de genes vía análisis del cDNA o RNA (Yamazoe e Itawa, 2005). La expresión de
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genes puede ser monitoreada mediante el uso de GFP (gen reportero) (Li y Leder, 2007) en
células hES (Kuroda et al., 2004) y en mono (Shigehiko et al., 2006). Los FAC´s, son usados
para evidenciar con mayor “facilidad” la expresión de genes (Kuroda et al., 2004). La Actividad
o inactividad de estos genes se ha podido identificar mediante técnicas como la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) o la transcriptasa inversa RT–PCR (Ko et al., 2006). Mediante
manipulación genética se han elaborar plásmidos para la introducción del gen de interés (Boer
et al., 2007; Ito et al., 2007). Y la técnica de Knockout para identificar la función de un gen en
particular (Humprey et al., 2004).
En células clonadas ES de ratón se encontró cuatro genes diferentes, tres localizados en un

intrón; una nueva isoforma embrionaria para CSL/RBP-Jkappa, el cual codifica el factor de
trascripción para la vía LIN-12/Notch pathway. Otro fue interno y puede codificar para la
transcripción de RNA no codificante. Esta isoforma es específica para células indiferenciadas y
es posible que juegue un papel importante en la generación y mantenimiento de ciertas células
troncales durante el desarrollo embrionario. (Li y Leder, 2007).
Metilación y acetilación del DNA
La metilación del DNA es un proceso en el que se añade grupos metilos a residuos específicos de
citosina en las regiones promotoras del DNA. Cuando el grupo metilo está unido a una región
en el DNA, los factores de transcripción no pueden unirse al DNA y los genes de transcripción
se apagan. Es un mecanismo de regulación de la expresión de genes (Gilbert, 2000 en http://
stemcells. nih.gov/info/scireport/appendixa).
Después de la fecundación los niveles de metilación son bajos y se mantienen hasta la

preimplantación, los genes no expresados de las células no diferenciadas permanecen
desmetilados. Pero antes de la gastrulación, el DNA de la células somáticas embrionarias
empiezan a remetilarse y los genes son selectivamente encendidos o apagados (Tucker et
al., 1996 en http://stemcells.nih.gov/info/scireport/appendixa). Cuatro genes han sido
identificados en ratón y en humano que llevan el dominio metil C-pG (MBD), MBD1, MBD2,
MBD3 y MBD4. La regulación de la metilación y de la demetilación es desconocida (Tada y
Tada, 2001).
La acetilación se realiza a través de la acción de la histona acetilasa (HATs), que se correlaciona

con la activación de genes. La desacetilación de histonas es vía histona desacetilasa (HDACs)
y se le atribuye la inactivación de genes. Ésta consiste en conservar residuos de Lys en aminos
terminales de histonas H3, H4, H2A y H2B que directamente contribuyen con la regulación
transcripcional. Su mecanismo es desconocido. En células troncales embrionarias de ratón están
hipometiladas en comparación con las células somáticas diferenciadas (Tada y Tada, 2001).
Factores transcripcionales
Un factor de transcripción, es una proteína que se unen al sitio promotor del DNA e intensifican
el proceso de transcripción, activando o inactivando genes que regulan la expresión de las
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características específicas de las células. Los factores de transcripción reconocidos para células
ES son Oct4, Nanog (Herg et al., en Ulloa-Montoya et al., 2005), Sox2 (Boer et al., 2007), y
posiblemente Zfp57 (Agari et al., 2002).
Factor de transcripción oct-4 o oct3/4. Se considera a oct-4, uno de los marcadores

importantes presentes en las células no diferenciadas, en división y pluripotentes (Ko et al.,
2006; Kurosawa et al., 2006). Conocido como Oct-3 u Oct-3/4 (http://stemcells.nih.gob/
info/ scireport/appendixb). Es un octámero rico en adeninas y timinas, miembro de la clase 5
POU, codificado por el gene Pou5f1 (Niwa, 2001). El factor de transcripción Oct-4 puede activar
o reprimir la expresión de varios genes y dependiendo del gen blanco, Oct-4 puede requerir
de la presencia del coactivador E1A o del cofactor transcripcional Sox2 (http://stemcells.nih.
gob/info/scireport/ appendixa). Oct-4 es considerado como el regulador “maestro” de la
pluripotencia en células ES (niwa et al., 2000).
Desde 1989, Schöler y colaboradores identificaron a Oct-4 y Oct-5, como factores de

trascripción presentes en células troncales embrionarias, concluyendo que los niveles de estos
factores decrecen durante la diferenciación.
Cofactores para oct-4.
a) E1A (adenovirus), sirve como un puente de unión entre Oct-4 y la maquinaria transcripcional
(Niwa, 2001).
b) Sox2 (Cofactor transcripcional), es un factor proteico, que activa a los genes Fgf-4, Utf-1, e
inhibe al gen Opn, formando un homodímero con Oct-4. Sox y el octámero son esenciales
para la activación de genes específicos para la pluripotencialidad. Se ha observado que las
secuencias de DNA en Oct-4 y Sox son idénticas entre humanos, ratones y monos (Kuroda
et al., 2004)
c) Zfp57, proteína expresada específicamente células en estado indiferenciado. Su expresión
está regulada por STAT3. Es posible que actúe como cofactor de Oct-4 (Agagi et al., 2002).
La cooperación entre Oct-4 y sus cofactores (Boer et al., 2007) se ha analizado con el
procedimiento de “squelching”. Mediante la activación de promotores artificiales, se observó
la importancia del balance cuantitativo entre estos factores, que forman un complejo ternario
que consiste en Oct-4, E1A y la maquinaria transcripcional. Los excesos de Oct-4 o de E1A
previenen la formación del complejo activo por saturación de sitos de unión. El exceso de Oct-
4 conlleva a la no activación de genes blanco, pero la represión o sobre expresión de Oct-4
activa algunos genes como Zfp42/Rex-1 y Upp/383 (Niwa, 2001). El complejo formado con
Sox2 ha mostrado que pequeños cambios en los niveles de Sox2:Oct-4, alteran en destino
de la células ES (Boer et al., 2007). Es importante, el equilibrio entre la expresión de Oct-4
y sus cofactores, ya que expresiones por arriba del 50% de lo requerido puede promover la
diferenciación de células del endodermo primitivo y el mesodermo, y niveles bajos de Oct-4
puede llevar a las células de la masa interna del blastocisto a la diferenciación en células del
trofoectodermo (Niwa et al., 2000; Niwa, 2001). Boer y colaboradores (2007), encontraron
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que la elevación mínima de los niveles de Sox2, se inhibe la acción sobre los genes y la sobre
expresión de Oct-4 o Nanog no inhibe la relación Sox2:Oct-4.
Genes blanco para oct-4.
Se ha observado que los genes que regula Oct-4 en coordinación con los cofactores son: Utf-
1(cofactor transcripcional), Zfp42/Rex-1 (Proteína Zinc-finger), PDGFαr (receptor del factor
de crecimiento) Fgf-4 (factor de crecimiento de fibroblastos), UPP/383 (Uridin fosforilasa) y
Tera/226. Estos genes se expresan en células ES pero los patrones de expresión son diferentes
dependiendo de la etapa embrionaria de pre o postimplantación (Niwa, 2001)
Factor de transcripción Nanog. La acción sinérgica entre Oct4 y Sox2 posiblemente

regulen al gen Nanog, Este gen es específico de célula pluripotentes. El factor transcripcional
es requerido para el mantenimiento del estado indiferenciado de las células troncales. Sin
embargo, los mecanismos de regulación de este gen son desconocidos (Kuroda et al., 2004)
Señales del transducción para el mantenimiento de la auto renovación en células

troncales embrionarias
El proceso de transducción es un mecanismo de respuestas a estímulos externos, donde la

unión de estos estímulos (moléculas químicas), a sus receptores membranales activan una serie
de respuestas intracelulares que pueden activar o inactivar un gen. El análisis de las señales de
transducción es difícil debido a las bajas concentraciones las moléculas participantes (http://
www.ims.u-tokyo.ac.jp/ stem/annual02.pdf).
El factor de inhibición de la leucemia (LIF), la glicoproteína (gp130), la transducción de señales

y el activador de la vía de trascripción 3 (STAT3) son esenciales en el mantenimiento de la
pluripotencia en ES de ratón (Sumi et al., 2004) y para la auto renovación de células ES en
primates, incluyendo al humano y al chango, es necesaria la relación LIF/gp130/SATAT3
(Sumi et al., 2004)
Humphrey y colaboradores 2004), observaron que STAT3 no se fosforila en células

indiferenciadas hES , concluyendo que esta vía no es suficiente para prevenir su diferenciación.
La auto renovación es mantenida por el factor inhibidor de la leucemia, participando dos
factores de transcripción, STAT3 y Oct-4 (Agagi et al., 2002). La vía de activación de STAT3
ha podido ser estudiadas mediante la técnica de RT-PCR (Konno et al., 2006).
Elementos participantes en los caminos de señalización.
a) Factor inhibidor de la leucemia (LIF). Su gen y el mRNA para su receptor (LIFRβ) son expresados
en el blastocisto. Es una citosina (Gearing et al., 1991), del grupo de las interleucinas-6 (IL-
6). Liberado por la capa alimentadora de fibroblasto de ratón o por proteínas recombinantes
(Burdon et al., 2002). Inhibe la diferenciación de células ES en ratones(Dahéron 2004; Konno
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et al., 2006; Nagano et al., 2002a; Ko et al., 2006), sin embargo, esto no sucede en humanos
ya que es considerado un factor que induce la diferenciación en célula de la leucemia tipo M1
(Niwa, 2001). En cultivos de ratón es requerido para la sobrevivencia, el estado indiferenciado
y la proliferación de células de la masa interna del blastocisto. Mediante la técnica de
inmovilización de LIF, se ha podido determinar la influencia de LIF en la activación de
STAT3 y Oct-4 (Makino et al., 2004). Sin embargo, Dahéron (2004), encontró que el receptor
LIFβ y la subunidad gp130 se expresan en células troncales embrionarias humanas y que
LIF puede inducir la fosforilación de STAT3 y la translocación nuclear y LIF es incapaz de
mantener la pluripotencia. También, observó que los cultivos con capas alimentadoras que
mantienen el estado indiferenciado no muestran activación de STAT3, lo que sugiere que el
camino de señalización que dirige la auto renovación en células humanas es distinto. Nagano
y colaboradores (2002a), encontraron que la vía de señalización de LIF es importante para
mantener la pluripotencia de las células ES.
Gearing y colaboradores (1991) aislaron, en humanos y ratones, el receptor LIF mediante

hibridación e identificaron una región transmembranal y una citoplásmica (soluble) relaciona-
da con la gp130. La acción de LIF es mediante su receptor específico que estimula la
diferenciación-inducción, diferenciación-supresión, proliferación o activación dependiendo
del tipo de célula (Gearing et al., 1991)
b) Factor de transcripción STAT3. Es un factor proteico. Juega un papel importante el la vía de

señalización LIF, en el mantenimiento de la proliferación y el estado no diferenciado (Dahéron,
2004) en las células pluripotentes de la masa interna del blastocisto (Burdon et al., 2002)
La activación de STAT3 es suficiente para la auto renovación de células ES (Agagi et al., 2002)
c) Factor de crecimiento de fibroblastos (FGF-4). Es un factor proteico que se expresa junto con
Oct-4 en la masa de células interna y el epiblasto. FGF-4 actúa como una señal parácrina,
(liberada en la masa interna y actúa alrededor del trofodermo) o como una señal autócrina
(que puede actúan en la misma masa de células internas que la liberan). Codificado por el Gen
Fgf4 (http://stemcells.nih. gov/info/scireport/appendixa)
Dos posibles vías de transducción de señales mantienen el estado de auto renovación de célula
ES, son la vía JAK/STAT3 y la SHP2.
Vía de señalización jak-stat3. (fig. 2). La vía de señalización de LIF es importante para
mantener la pluripotencia LIF se une a un complejo de receptores de membrana, el receptor
LIF y la proteína gp130; mediante señalizaciones moleculares se activa la vía JAK-STAT3 o
la ERK, o SH2 (http://ims.u-tokyo.ac.jp/stem/annual02.pdf). Se ha observado en ratones
que LIF se une a su receptor membranal, LIFRβ que forma un heterodímero con la proteína
gp130. Se asocia con la tirosina cinasa (JAK) y este complejo se fosforila, lo cual activa la vía
JAK-STAT3 (Humphrey et al., 2004). La fosforilación de de STAT3 induce la expresión de
Oct-4 (Konno et al., 2006), que promueve la auto renovación (Burdon et al., 2002) y el estado
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indiferenciado de las células ES en ratón. Estudios en humanos de la vía de señalización LIF/

STAT3, concluye que la activación de STAT3 vía gp130 no contribuye a la pluripotencia en
células ES humanas (Dahéron et al., 2004; Humphrey et al., 2004) y primates no humanos
(Sumi et al., 2004).
Vía de señalización SHP. La auto renovación de las células del ES del ratón parece ser
influenciada por la actividad de SHP-2 y de ERK. SHP-2 es una fosfatasa de tirosina (una
enzima que elimina grupos fosfato a los residuos del Tirosina de varias proteínas). SHP-2 actúa
recíprocamente con el dominio intracelular (del amino terminal) del receptor gp130. ERK es
una de varias clases de enzimas que se activa cuando se estimulan el receptor gp130 y otros
receptores de la superficie celular. ERK y SHP-2 son componentes de una vía de señales de
transducción que actúa en contra de la activación de STAT3 y por lo tanto la proliferación
celular. Por lo tanto, si ERK y SHP-2 están activos, se inhibe la auto renovación de la célula del
ES (http://stemcells.nih.gob/info/scireport/appendixb; Burdon et al., 2002).

Figura 2: Vía de señalización LIF-STAT3 vía que promueve la auto renovación de células troncales
embrionarias (© Terese 2001 Winslow, Lydia Kibiuk en http://stemcells.nih.gob /info/scireport/appendixb)
Cultivo de células troncales embrionarias
Solo tres especies de mamíferos se han mantenido en cultivos a largo plazo de células con
auto renovación; los ratones, los monos y los seres humanos (http://stemcells.nih.gob/info/
scireport/chapter2/.
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Las células troncales embrionarias se obtienen de de embriones en la etapa de mórula, de

blastocistos completos o los obtenidos por inmunocirugía a partir de la masa interna celular del
blastocisto (Anzaldúa et al., 2007), de células de la sangre del cordón umbilical, por embriones
generados por fertilización in vitro por clonación (trasplante nuclear) o partenogénesis
(Belkind-Gerson et al., 2003; www.iscr.ed.ac.uk), de abortos espontáneos (www.iscr.ed.ac.uk) o
congelados (http;//www.revista.unam.mx/vol.5/num2/art7/art7.htm), del fluido amniótico
de roedores y humanos, que expresan marcadores para células embrionaria y adultas (De
Coppi et al., 2007)
El medio de cultivo (MEF) es elaborado con suero fetal de becerro, que proporciona factores
del crecimiento. Se coloca una capa de células de fibroblasto de ratón, llamada capa
alimentadora, que se utilizan como sustrato de adherencia y LIF. Las células del fibroblasto son
tratadas químicamente para evitar su proliferación (http://stemcells.nih.gov/info/scireport/
appendixb). Los fibroblastos embrionarios del ratón mantienen la pluripotencia (Humphrey
et al., 2004), el estado indiferenciado (Li y Leder, 2007) y la proliferación de las células de la
masa interna del blastocisto.
MEF es el medio de cultivo tradicional para proliferar células ES, sin embargo, se han hecho
observaciones del peligro potencial de de trasmitir algún patógeno a células hES, si se utiliza
este medio. El equipo de Yoo ha proliferado exitosamente células hES a partir de células
semejantes a los fibroblastos (DiffMiz-hES6) derivadas de linajes humanos (Yoo et al., 2005).
Las células hES se han cultivado en capas alimentadoras de fibroblastos embrionarios, de piel
y músculo fetal, de fibroblastos de célula adultas, de células de la médula (Ulloa-Montoya et
al., 2005). Se ha podido sustituir las capas alimentadoras con Matrigel, o colágeno purificado
tipo IV, laminina, y fibronectina, medios que minimizan cambios genéticos y optimizan el
mantenimiento del estado indiferenciado (Draper et al., 2004)
Medios de cultivos artificiales. Makino y colaboradores (2004), proponen una técnica de

cultivo de ES de ratones mediante la inmovilización de LIF, logrando la expresión de Oct-4.
Tomohiro Konno y colaboradores (2006), aplicaron la técnica de Polímeros fotoinmovilizados
y observaron liberación de fosfatasa alcalina, la activación del factor de transcripción STAT3
y la expresión del factor de trascripción Oct-4. Demostrando en este estudio que las diferentes
superficies de cultivo afectan la morfología, el crecimiento y la diferenciación de ES.
Variantes a estos cultivos son los cultivos químicos inmovilizados de fibroblastos embrionarios
de ratón o epitelio amniótico humano. Estos cultivos pueden usarse repetidamente sin perder
la habilidad de mantener el crecimiento de células ES indiferenciadas. Los resultados obtenidos
en las muestras de ratón y mono expresan fosfatasa alcalina, Oct-4 y los marcadores SSEA-1,
en ratón y SSEA-4, en monos (Ito et al., 2007)
Un novedoso medio de cultivo que incrementa la conexión entre células ES de ratón,

fue elaborado con mercaptoetanol, glutamina, aminoácidos no esenciales, penicilina,
estreptomicina y LIF (Amano et al., 2006)
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Cultivo con biorreactores para la proliferación y diferenciación de ES. Existen gran

variedad de biorreactores para cultivo de células y es posible que sean adaptadas al cultivo de
células ES, manipulando las condiciones para generar líneas celulares de ES con la finalidad
de aplicarse en terapia celular (Ulloa-Montoya et al., 2005; Yin et al., 2007).
Anzaldúa y colaboradores, (2007), hacen una revisión en relación a las pruebas que se realizan
a las líneas celulares ES obtenidas in vitro, conocidas como de caracterización, en las que
se encuentran: a) las de crecimiento y subcultivo, b) el uso de marcadores moleculares de
superficie y para factores de trascripción, c) la aplicación de enzimas citoplásmicas, d) el
estudio del cariotipo y e) la diferenciación y formación de cuerpos embroides. Mientras que
las pruebas para línea obtenidas in vivo son: a) la formación de animales quiméricos y b) el
desarrollo de teratomas (Nakatsuji 2001).
La pluripotencia es otra prueba requerida para las línea celulares obtenidas (http://stemcells.
nih.gob/info/scireport/chapter2). In vitro los laboratorios han podido probar la pluripotencia
de células ES humanas. In vivo, solo se ha probado la pluripotencia de célula humanas
inyectadas en ratones inmunodeficientes que forman los teratomas (http://stemcells.nih.gov/
info/scireport/chapter3).
Efecto del O2 in vitro en células troncales embrionarias de ratones. Se considera

que el oxígeno juega un papel importante en los medios de cultivo ya que es necesario para
metabolizar los nutrientes, su restricción cesa la proliferación y por lo tanto hay diferenciación.
En cultivos sometidos a una tensión de entre el 5% y el 20% de O2, decrece la actividad de la
fosfatasa alcalina y la expresión del gen Oct-4 y hay diferenciación espontánea. Con 40% de
O2, se retarda la diferenciación, se observa actividad de la fosfatasa alcalina (hasta el tercer día)
y se registra la mayor expresión del gen para Oct-4. Esos resultados sugieren que el oxigeno
regula la expresión de genes en ES (Kurosawa et al., 2006)
Uso y aplicación potencial de las célula troncales embrionarias
Se han abierto campos de investigación en diferenciación celular dirigida, en la clonación

terapéutica, en la reprogramación celular y en la medicina regenerativa, entre otros.
Diferenciación celular dirigida. Para dirigir la diferenciación es necesario cambiar las

condiciones del crecimiento de manera específicas, agregando factores del crecimiento al
medio de cultivo o cambiando la composición química de la superficie en la cual las células
ES están creciendo (http://stemcells.nih.gob/info/scireport/chapter2). Esto es posible por la
plasticidad celular (capacidad de diferenciarse) presentada por las células ES embrionarias
(Belkind-Gerson et al., 2003).
Se han diferenciado neuronas motoras a partir de células ES de ratón añadiendo al medio

del cultivo el ganglio dorsal de un polluelo, se obtuvieron principalmente neurona motoras,
GABAérgicas, serotonérgicas y colinérgicas (Ayako y Shimizu, 2007). Takahisa y colaboradores
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(2007), generaron a partir de ES de ratón, células positivas a la insulina, y Yin y colaboradores

(2007), generaron a partir de cuerpos embroides de ratón un linaje de células hepáticas. Pruszak
y colaboradores (2007), obtuvieron células neurales a partir de células troncales embrionarias
humanas.
En la actualidad hay líneas de investigación encaminadas a generar vasos sanguíneos primitivos,

neuronas que liberen dopamina y serotonina y producción de células del islote pancreático
(http://stemcells.nih.gov/info/scireport/appendixb).
Clonación terapéutica. La clonación terapéutica, consiste en obtener células de un adulto

enfermo, posteriormente se extrae el núcleo de una de ellas y el núcleo se inyecta a un óvulo
(sin núcleo). El óvulo se desarrolla hasta formar un embrión, de este embrión se extraen y se
cultivan células madre. Las células se desarrollan en laboratorio hasta la formación de tejidos,
óseo, digestivo, muscular, neurona. Finalmente pueden ser injertados en el paciente sin peligro
de rechazo inmunológico. (http://ww.jornada.unam.mx/2001/08/06/cien-patricia.html)
Reprogramación celular. Después de la maduración algunas células somáticas, retienen

ciertas propiedades semejantes a las de las células troncales. La reprogramación de células
somáticas puede ser inducida por factores derivados de células ES mediante hibridación con
células somáticas (Nakatsuji, 2001). Por ejemplo, linfocitos de timo llevan consigo el transgen
Oct4-GFP, que es un marcador para identificar célula troncales toti-/pluripotenciales. El gen
Oct4 es reactivado en 48 horas, se cree que es el tiempo en el que el DNA se replica y la célula
se divide y esto puede ser un requerimiento para inducir la reactivación Se ha demostrado que
los ovocitos de mamíferos no fertilizados contienen factores que son capaces de reprogramar
el núcleo somático desde un estado totalmente diferenciado a uno toti-/pluripotencial (Tada
y Tada, 2001)
Mediante la fusión de células troncales adultas con células troncales embrionarias se han
logrado que las primeras presenten características de células troncales embrionarias (Nakatsuji,
2001; Kevin y Hughes en htt://bioeducation.net/news/ pdf/melton6-esp.pdf)
Al respecto se consideran dos posibles procesos celulares, la desdiferenciación y la transdiferen-

ciación celular. La desdiferenciación se refiere a la capacidad de las células troncales maduras
a adquirir estados inmaduros y posteriormente diferenciarse a un linaje específico. Mientras
que la transdiferenciación es cuando una célula madura de un linaje específico se fusiona con
otra célula de otro linaje y adquiere las características de esta última célula (Berlkind-Gerson
et al., 2003)
Medicina regenerativa. El estudio de células troncales se enfoca en el uso potencial para la

cura de enfermedades como el Parkinson, Alzheimer (Anzaldúa et al., 2007) daños en espina
dorsal, la diabetes tipo II (Li y Leder, 2007, stemcells.nih.gov/info/basics/) y malformaciones
congénitas cardiacas (Salamanca-Gómez, 2005), la degeneración de la célula de Purkinje,
la distrofia muscular de Duchenne, enfermedades cardíacas, y pérdida de la visión y de
321
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oído (http:77stemcells.nih.gov/info/ scireport/chapter3), infarto cerebral y daño nerviosos

(Berkind-Gerson, 2003) y reemplazo de órganos (http://www.amyshah.com. 2007/04/) y
tejidos (www.revista.unam.mx/vol.5/num2/art7/art7.html), que son necesarios sustituir
debido a patologías o traumatismos (Merchant, 2007). Con este objetivo, en California, se ha
fundado el “Institute of Regenerative Medicine” (http://www.antibody.com/index2.html).
A casi 30 años de investigaciones en diversos países de todo el mundo se ha avanzado en

el conocimiento de las células troncales embrionarias, sin embargo, aún quedan muchas
interrogantes por resolver. Es importante duplicar esfuerzos dada la importancia que
representan para la cura de diversas enfermedades.
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Diferenciación sexual cerebral

El proceso de diferenciación sexual cerebral en los mamíferos y en las ratas es consecuencia de una
expresión diferencial del genoma neuronal de machos y hembras y depende fundamentalmente
del ambiente hormonal circundante en el que se encuentre el SN. Este ambiente hormonal es
necesario ya que gracias a él se lleva a cabo la organización del sustrato anátomo - funcional y
de las vías neuroendócrinas preexistentes determinantes de las diferencias sexuales.
La mayoría de los circuitos dimórficos del cerebro relacionados con el proceso de diferenciación
sexual están relacionados con el hipotálamo. Este, regula la secreción hormonal y funciona
como interfase entre el sistema endocrino y nervioso, presenta gran cantidad de receptores
a hormonas sexuales como andrógenos y estrógenos (Pfaff and Schwartz-Giblin, 1998). Este
órgano es también el centro regulador funcional del cuerpo, controlando vías relacionadas
con funciones autónomas, endocrinas, emocionales, somáticas y de comportamiento sexual.
El hipotálamo es un órgano complejo a nivel neuroquímico y neuroanatómico; se divide en
4 regiones y 25 núcleos organizados de acuerdo a su estructura anatómica y funcional. Así
mismo presenta diferentes núcleos dimórficos que se relacionan directamente con la fisiología
y la conducta sexual; estos núcleos son el núcleo ventromedial, supraquiasmático y preóptico
(Goy and McEwen, 1980; Robinson et al, 1986; Doler et al, 1986). Durante el periodo
perinatal la presencia de andrógenos determinarán el desarrollo del dimorfismo sexual en
núcleos específicos del hipotálamo en aspectos como conducta sexual, patrones de secreción
de gonadotropinas, teniendo como resultado la masculinización o feminización durante el
periodo crítico de diferenciación.
Las diferencias morfológicas, fisiológicas, bioquímicas y del comportamiento de machos

y hembras se denominan, en su conjunto, dimorfismo sexual. Actualmente es claro que el
estradiol es el principal inductor de la diferenciación sexual y que esta hormona actúa en
etapas tempranas del desarrollo neuronal, a lo cual se le conoce como “periodo crítico”.
También se sabe que el estradiol ocasiona cambios permanentes en estructuras del cerebro los
cuales impactan los procesos reproductivos. Esta hormona puede regular la transcripción de
varias familias de genes que protegen a las neuronas de la apoptosis (neuroprotección) y otros
involucrados en el ciclo celular (neurogénesis) a través de la unión diferencial a los receptores
α o β (Herrera et al., 2006).
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MECANISMOS DE ACCIÓN DEL ESTRADIOL DURANTE LA DIFERENCIACIÓN

SEXUAL
La diferenciación sexual del cerebro de la rata, particularmente de algunas regiones intra y

extrahipotalámicas, es de gran importancia en el desarrollo del patrón fisiológico indispensable
para que el animal adulto presente la secreción endócrina y el patrón de comportamiento
característicos de cada sexo. La diferenciación sexual en la rata ocurre durante el periodo
conocido como “periodo crítico” que se extiende de algunas horas o días antes del nacimiento
hasta algunas horas o días después del nacimiento. Durante este proceso los estrógenos
desempeñan un papel muy importante (Babichev et al., 1990).
Recientemente se ha encontrado, a nivel genómico, que la actividad del estradiol se ejerce

originando diferencias sexuales en los niveles de expresión de algunos genes en ciertas
áreas hipotalámicas (Simerly 2002; Tobet, 2002; Herrera et al., 2006), que pueden alterar
el desarrollo, crecimiento o interacción sináptica entre diversos núcleos hipotalámicos, Se
ha propuesto que el establecimiento de las conexiones neuronales de áreas dimórficas debe
continuar después de la terminación del periodo crítico, para completar la organización
funcional definitiva de las áreas dimórficas. Esto es compatible con el hecho de que los
esteroides actúan únicamente durante el periodo crítico, promoviendo el desarrollo de un
mayor número de neuronas, ya que este aumento en la cantidad de células es necesario
para el establecimiento de las conexiones neuronales que se utilizarán posteriormente para
el adecuado funcionamiento neuronal. Los esteroides pueden influir en la determinación
del número de neuronas que componen los núcleos dimórficos a través de diferentes
mecanismos: (I) estimulan la neurogénesis o prolongan el periodo en el que ésta ocurre,
(II) promueven la supervivencia neuronal, por medio de una neuroprotección, durante el
periodo crítico de diferenciación, (III) influyen sobre la localización neuronal, en términos
de funcionalidad e identificación neuroquímica, (IV) controlan la muerte celular, (V)
regulan el ciclo celular
I.- La neurogénesis ocurre paulatinamente durante la etapa prenatal y es posible que

de manera simultánea se presente la migración neuronal, la diferenciación neural y la
sinaptogénesis. Además, las distintas fases de desarrollo neural presentan un carácter temporal
y regional, o sea, que dependen de la región cerebral en desarrollo y pueden extenderse
hacia el desarrollo postnatal tardío y la madurez. Durante el desarrollo prenatal o postanatal
temprano, los factores hormonales y genéticos controlan la neurogénesis, el proceso de
supervivencia o desencadenamiento de la muerte por apoptosis, así como el desarrollo y la
formación de conexiones entre las neuronas. Después del nacimiento, ocurre un proceso de
plasticidad sináptica, en el cual los factores ambientales y experiencias provocan cambios en el
sistema nervioso, influenciando el desarrollo de los circuitos neuronales. En la edad adulta, la
experiencia altera las sinapsis nerviosas mediante el aprendizaje y la memoria. Así, los procesos
que se llevan a cabo durante el desarrollo del sistema nervioso central son extremadamente
complejos y en ellos intervienen numerosos factores genéticos y ambientales que pueden
modificar este desarrollo en cualquiera de sus fases (Herrera et al., 2006).
328
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Dra. Marcela Vergara Onofre y col.
II.- La neurogénesis implica proliferación y diferenciación, que en el ámbito del ciclo celular, se
traduce en la re-entrada y salida de neuroblastos en el ciclo celular, la cual regulará y determinará
el número de neuronas del cerebro. En este sentido, el número de neuroblastos que salen del
ciclo celular y se diferencian incrementa con el transcurso del desarrollo. La diferenciación
neuronal es un proceso clave en el desarrollo y se encuentra estrechamente vinculada con el ciclo
celular, ya que las células que salen del ciclo celular en fases tempranas exhiben determinadas
características, mientras que las que salen en las fases tardías exhiben otras. Por ello, debe existir
una coordinación precisa entre el ciclo celular y la diferenciación neural, la cual estará regulada
por los factores que regulan ambos procesos (Herrera et al., 2006).
Durante la diferenciación sexual las células neuronales sufren un proceso apoptótico. El

estradiol puede regular la muerte celular de las neuronas por apoptosis. Se han realizado
estudios donde se observan células apoptóticas en el desarrollo del dimorfismo sexual del SNC,
así como en procesos naturales y patológicos (Nielsen et al., 2000; Adrienne et al., 2000).
A través de varios estudios se ha encontrado que algunas hormonas esteroides (como la

testosterona y estradiol) desempeñan un papel importante en la diferenciación sexual cerebral.
Por su función neuroprotectora, los estrógenos pueden tener diferente efecto en hembras y en
machos, debido a la distinta sensibilidad que presenta el tejido hacia estas hormonas, al tipo
de receptor, la localización de éste y a la cantidad de hormona presente (Green et al., 2000,
García Segura et al., 2001).
Trabajos realizados “in vitro” con células hipotalámicas de rata, demostraron que para que
los estrógenos ejerzan su acción neuroprotectora las células deben presentar receptores a y
β, ya que las que sólo presentaron el receptor b tuvieron un mayor índice de muerte neuronal
(Nielsen et al., 2000; Temple et al., 2001), debido muy probablemente al efecto antagónico
que tiene la activación del receptor β sobre el efecto neuroprotector del estradiol. El efecto
neuroprotector de los estrógenos en células hipotalámicas, se debe a que este esteroide actúa
sobre el receptor a para inducir la sobreexpresión de genes antiapoptóticos de la familia de
bcl-2, mientras que en el caso de las células que sólo expresan el receptor b, el estradiol activa
el sistema primario de inducción de apoptosis Fas-Fas ligando (FasL) (Mor et al., 2000). Una
vez que los estrógenos regulan la expresión del FasL, el sistema activa a la caspasa 10, que
a su vez activa a la caspasa 3, y ésta a las endonucleasas, encargadas de fragmentar el ADN
durante el proceso de apoptosis. En el desarrollo del sistema nervioso central (SNC), alrededor
de la mitad de las células mueren, (Oppenheim et al., 1991; Mooney et al., 2000). Las neuronas
que mueren durante el desarrollo del SNC presentan signos de muerte por apoptosis y este tipo
de muerte es un importante mecanismo que determinará el tamaño y forma del SNC (Chia
et al., 2000).
III.- Las hormonas gonadales activan la conducta sexual mediante un efecto local en las
estructuras del sistema nervioso. Esta acción se realiza como parte del funcionamiento normal
de las neuronas y modula la interacción entre ellas. Ello, de hecho, supone la interacción entre
las hormonas gonadales y los neurotransmisores que actúan como mediadores químicos en la
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comunicación interneuronal. Existen evidencias que sugieren que los neurotransmisores podrían
participar en el desarrollo de las diferencias sexuales del SNC, ya que la administración prenatal
de drogas que afectan sistemas adrenérgicos, colinérgicos, serotoninérgicos, dopaminérgicos
(Döhler et al., 1991) y gabaérgicos (Segovia et al., 1991). Son capaces de modificar el desarrollo
de las diferencias sexuales en el cerebro y de las conductas reproductivas. Se han encontrado
diferencias entre los sexos en cuanto al contenido de neurotransmisores y de la actividad
enzimática en los sistemas serotoninérgico, dopaminérgico, colinérgico (De Vries et al., 1984),
así como en el número de sus receptores (Segovia et al., 1991, Avissar et al., 1981; Orensanz et
al., 1983) y de algunos sistemas enzimàticos relacionados con estrés oxidativo (Herrera et al.,
2006). Este dimorfismo encontrado en animales adultos no sólo indica un dimorfismo sexual
funcional, sino también un posible dimorfismo estructural en los núcleos que sintetizan estos
neurotransmisores y en los patrones de distribución de las fibras que los liberan.
IV.- Durante el desarrollo del SNC, se genera un número excesivo de neuronas, siendo
selectivamente eliminadas las que no establecen correctamente sus conexiones (Oppenheim,
1991). Durante la diferenciación sexual del hipotálamo, la muerte celular reduce a la mitad
el número de neuronas que se generaron durante las etapas tempranas de la neurogénesis.
Se piensa que esta pérdida sirve para afinar la función neuronal y parece estar asociada
con un incremento en la especialización de las funciones cerebrales en diferentes regiones
del cerebro. La apoptosis es esencial para el desarrollo y mantenimiento de los organismos
multicelulares, y ocurre de manera natural durante el desarrollo del SNC. De acuerdo con la
teoría trófica, los factores tróficos producidos en las células diana protegen las proyecciones
neuronales de la muerte celular programada (Oppenheim, 1991). En este sentido, las neuronas
necesitan de una serie de factores de crecimiento para sobrevivir. Se han descrito muchos
posibles factores de crecimiento, siendo los más conocidos el factor de crecimiento nervioso
(NGF), el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), neurotrofina (NT-3) y el factor
de crecimiento insulínico del tipo 1 (IGI-1) (Díaz-Horta et al., 2002), los cuales promueven la
proliferación y diferenciación celular. Estos factores de crecimiento se encuentran en el SNC
en concentraciones muy bajas, con estos niveles las neuronas tienen que competir entre sí por
ellos y al no conseguirlos mueren por apoptosis. La muerte de las neuronas presinápticas puede
servir para una variedad de funciones biológicas entre las cuáles se puede incluir la regulación
poblacional de células neurales precursoras que son necesarias para la propia morfogénesis
cerebral, seleccionando las poblaciones regionales apropiadas y/o los fenotipos neuronales
específicos, y eliminando las células con anormalidades genéticas (Herrera et al., 2006).
Morfológica y bioquímicamente, la apoptosis se caracteriza por una serie de alteraciones

esencialmente nucleares pero también citoplasmáticas, tales como la condensación de la
cromatina, la fragmentación del DNA, la desorganización del citoesqueleto, la formación de
cuerpos apoptóticos, la activación de caspasas, la presencia de marcadores fagocíticos en la
superficie celular, etc.
V.- La expresión del homólogo celular de la mielocitomatósis (c-myc) es necesaria para la

progresión del ciclo celular, tanto a nivel del paso de G0 a G1 como de G1 a S. Recientemente,
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se ha involucrado la regulación de c-myc con las cinasas de la familia Src, a través de la

activación de las GTPasas Rho, para la progresión de G0 a G1 del ciclo celular (Brewer G,
1999). En los últimos años, se ha relacionado también a la vía de Raf/ERK y PI-3K/Akt con la
estabilidad de la proteína Myc, mediante la fosforilación de la Ser-62. La expresión de c-myc, es
estrictamente requerida para la transmisión de señales mitogénicas inducidas por los factores
de crecimiento como el M-CSF o PDGF y es suprimida por inhibidores de la proliferación o
señales de diferenciación como por ejemplo por adenosin monofosfato cíclico (AMPc), el factor
de crecimiento transformante (TGF-a), IFN-a (interferón alfa), el inhibidor del ciclo celular,
p21Waf1, u otros inhibidores de la proliferación celular (Chang et al., 2000). Varios estudios
han demostrado que la regulación de los niveles de c-Myc son estrictamente esenciales para
el correcto funcionamiento de la célula, puesto que la eliminación por deleción homocigótica
de los genes de c-myc resulta letal a nivel embrionario (Brewer G, 1999), mientras que la
sobreexpresión de estas proteínas, ya sea en cultivos celulares como en animales transgénicos,
bloquea la diferenciación, e induce la transformación neoplásica y sensibiliza a las células a
morir por fenómenos de apoptosis (Diaz Horta et al., 2002).
APOPTOSIS Y ESTRÉS OXIDATIVO.
La apoptosis constituye un mecanismo fisiológico esencial para la eliminación selectiva de

las células y participa de manera integral en diversos eventos biológicos. La proliferación y
muerte celular son procesos muy complejos e involucran la participación de muchos genes. En
la muerte por apoptosis, la mitocondria tiene un papel central en la fase de ejecución, debido
a que almacena en su espacio intermembranal, activadores y efectores de muerte, como el
citocromo c, entre otros. La permeabilización de la membrana externa, está asociada con
disfunción mitocondrial, alteración del potencial membranal (Dym), colapso del organelo y
liberación de factores pro apoptoticos. En el proceso de apoptosis se observa, la translocación
de proteínas de señalización y moléculas efectoras entre el núcleo, el citoplasma y las
mitocondrias. De particular interés resulta la movilización de proteínas pro apoptoticas hasta
la mitocondria donde inducen disfunción de este organelo, en este grupo se encuentran las
proteínas relacionadas con el estrés oxidativo. (Moll et al., 2001).
El estrés oxidativo se ha implicado en el envejecimiento cerebral y en los trastornos

neurodegenerativos asociados con la edad. Puesto que recientemente se ha demostrado que
la N-acetilcisteína (NAC) previene el daño oxidativo en el cerebro senescente, se ha explorado
los efectos de este antioxidante tiólico sobre los parámetros relacionados con el estrés oxidativo
asociado al envejecimiento cerebral y diferenciación en determinadas regiones cerebrales de
la rata (Shing et al., 2007).
La glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD) es la primera enzima de la vía pentosa fosfato y la

principal fuente intracelular de nicotidamina adenina dinucleótido fosfato reducido (NADPH),
compuesto comprometido en diversos procesos fisiológicos, por ejemplo defensa antioxidante
modulación del crecimiento endotelial, eritropoyesis, vascularización y fagocitosis.
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El proceso de apopptosis sigue a la eliminación de ciertas células selectivas durante el

crecimiento, desarrollo o procesos homeostáticos. La disponibilidad de GSH (glutation
reducido) inter y extracelular podría ser la diferencia entre la vida y la muerte, y en su caso
contrario su agotamiento podría resultar en un compromiso de la célula a su capacidad para
eliminar intermediarios metabólicos altamente reactivos formados durante condiciones de
estrés oxidativo (Bassin et al., l997)
La especialización de las propiedades intracelulares del GSH puede estar involucrada en la

apoptosis o término que se ha referido generalmente como “muerte celular programada”. La
apoptosis se puede caracterizar por cambios celulares que incluyen fragmentación nuclear,
formación de cuerpos apoptoticos, y su ingestión por fagocitosis. El proceso de apopptosis
sigue a la eliminación de ciertas células selectivas durante el crecimiento, desarrollo o procesos
homeostáticos. La disponibilidad de GSH al inter y extracelular podría ser la diferencia entre
la vida y la muerte, y en su caso contrario su agotamiento podría resultar en un compromiso
de la célula a su capacidad para eliminar intermediarios metabólicos altamente reactivos
formados durante condiciones de estrés oxidativo (Ortega-Camarillo et al., 2009).

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Sistema de liberación controlada de
medicamentos
Introducción
El diseño y aplicación de sistemas de dosificación controlada de medicamentos y los sistemas

de dirección localizada de la actividad de un determinado fármaco es actualmente uno de los
aspectos de mayor relevancia en el desarrollo de nuevas formas de medicación. La utilización
de materiales poliméricos como soportes de fármacos para regular y dosificar su liberación en
aplicaciones específicas es una perspectiva que ha adquirido gran interés (Fig. 1) (Virginia, 2002).

Figura 1. Disciplinas científicas relacionadas con liberación de fármacos.
El objetivo principal de la liberación controlada es simple: conseguir la cantidad correcta del

agente activo, en el momento adecuado y en el lugar preciso. Este método de liberación se usa
habitualmente para prolongar el tiempo que la dosis terapéutica está presente de forma efectiva
utilizando una única dosis, y para eliminar o minimizar las concentraciones que exceden los
requerimientos terapéuticos.
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Sistema de liberación controlada de medicamentos
En la actualidad se definen como formas dosificadas de liberación modificada aquellos

preparados que han modificado la velocidad y/o el tiempo y/o el sitio de cesión del ingrediente
activo, para obtener una respuesta terapéutica específica que no se lograba con las formas de
dosificación convencional administradas similarmente, puesto que éstas permiten una rápida
liberación del principio activo. Este término lo emplea la Real Farmacopea Española para
denominar a los sistemas “controlled release” en la literatura anglosajona.
Actualmente existen dos métodos para mejorar la acción de los fármacos (Virginia, 2003):
Liberación controlada, que trata de eliminar o reducir los efectos secundarios produciendo una
concentración terapéutica del fármaco que sea estable en el organismo. Se trata de alcanzar
una cinética de liberación de orden cero y no suelen existir cambios en la concentración del
fármaco en el organismo (comparándolo con los cambios intermitentes de concentración en
las dosificaciones convencionales).
Liberación dirigida hacia lugares específicos, que trata de asegurar que el fármaco es liberado
en el lugar requerido y al mismo tiempo mantiene el fármaco inactivo en cualquier otro lugar
del organismo.
La aplicación más frecuente en la actualidad de estos sistemas está dada por el recubrimiento
eficaz del medicamento con un material adecuado, con lo que se consigue no solo una sección
gradual y sostenida sino una liberación que se produzca a modo de pulso a determinados pH.
También se puede conseguir la reducción del efecto directo irritante causado por algunos
medicamentos en la mucosa gástrica, mediante el recubrimiento del principio activo con un
material no soluble al pH gástrico.
Desde una óptica biofarmacéutico y terapéutico, los beneficios de la microencapsulación en la

formulación de medicamentos podría resumirse en lo siguiente (Benitas, 1996):
Reducción del efecto gástrico irritante, causado por algunos medicamentos en la mucosa
gástrica: El ejemplo más ilustrativo lo representa, de modo general, los medicamentos
de carácter ácido, de los cuales un caso singular es la aspirina. El recubrimiento de estos
medicamentos con un material no soluble al pH gástrico ha permitido reducir sensiblemente
la irritación gástrica causada por los mismos.
Enmascaramiento del olor y del sabor del medicamento: Es importante para mejorar la
aceptación por parte del paciente y se utiliza en medicamentos con características organolépticas
indeseables. Este recubrimiento se puede llevar a cabo para formas farmacéuticas sólidas como
son los comprimidos, sin embargo, en el caso de formulaciones pediátricas, es más deseable
disponer de formas líquidas constituidas por una suspensión de microparticulas, para lo cual se
ha de recurrir a la microencapsulación.
Conseguir una liberación sostenida o controlada del principio activo a partir de la forma
farmacéutica: Con esto se logra un suministro gradual y sostenido del principio activo durante
el tiempo de duración del tratamiento, lográndose mejor efectividad y asimilación del mismo.
336
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Los materiales poliméricos permiten liberar de forma controlada fármacos de bajo peso
molecular y permiten una gran variedad de rutas de administración (oral, parenteral,
transdermal, nasal, ocular, etc.). En casos en los que la actividad de los fármacos convencionales
se pierde o se ve disminuida en el medio corporal, la combinación con macromoléculas puede
mejorar la eficacia de estos fármacos, aliviando la respuesta inmunológica del paciente y
reduciendo la inactivación biológica del agente terapéutico (Nakamura, 2004).
Se puede entonces resumir las categorías de los sistemas de suministro mediante liberación no
inmediata de la siguiente forma:
1. LIBERACIÓN RETARDADA: Utilizan emisiones intermitentes y repetidas de la droga
a partir de una o más unidades de liberación inmediata incorporadas en una sola forma
posológica.
2. LIBERACIÓN SOSTENIDA: Comprende todo sistema de suministro de drogas que
produzca su liberación lenta por un período prolongado.
a) Liberación controlada: Se mantiene un nivel constante de la droga en la sangre o en los
tejidos de destino.
b) liberación prolongada: Prolonga la duración de la acción en comparación con el
suministro convencional.
3. LIBERACIÓN ESPECÍFICA EN UN SITIO
4. LIBERACIÓN EN EL RECEPTOR
Ventajas de los sistemas de liberación no inmediata (Kumaresh, 2001):

Se evitan problemas por incumplimientos de los pacientes.
Se utiliza menos cantidad total de principio activo.
Reducción o eliminación de los efectos colaterales sistémicos.
Se obtiene menos potenciación o reducción de la actividad del principio activo durante el
uso prolongado.
Se reduce a un mínimo la acumulación del principio activo en los tratamientos prolongados.
Se mejora la eficiencia del tratamiento, al evitarse la fluctuación de los niveles sanguíneos
del principio activo y su biodisponibilidad.
Economía.
Desventajas de los sistemas de liberación no inmediata:
Si se presentan reacciones adversas éstas duran más tiempo que si se compara con los
medicamentos convencionales.
Requieren de un mayor costo de elaboración, incluyendo, en ocasiones, equipos y procesos

costosos.
No todos los p.a pueden ser empleados en estos sistemas (t1/2 elevados, dosis muy elevadas).
Diseño con parámetros farmacocinéticos medios poblacionales.
Peligro de liberación brusca de todo el contenido.
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Requerimientos para garantizar la obtención de formulaciones de liberación modificada

(Majeti, 2000):
Los medicamentos cuyas dosis terapéuticas sean muy altas traerían dificultades técnicas a la
hora de la elaboración.
Los fármacos que presenten tiempos de vida media muy prolongados (>12 horas) o muy
pequeños (<1 hora), no son apropiados para su inclusión en este tipo de preparado.
Es un riesgo la administración de fármacos de bajo índice terapéutico a partir de esta forma

farmacéutica, por ejemplo, anticoagulantes, ya que al liberarse más rápido de lo esperado
puede ser peligroso para el paciente.
Los fármacos pueden administrarse por varias vías. Se pueden ingerir (vía oral) o inyectar en una
vena (vía intravenosa), en un músculo (vía intramuscular) o debajo de la piel (vía subcutánea).
Se pueden colocar debajo de la lengua (vía sublingual), introducir en el recto (vía rectal), instilar
en el ojo (vía ocular), vaporizar en las fosas nasales (vía nasal) o en la boca (inhalación), o
bien aplicar sobre la piel con efecto local (tópico) o sistémico (transdérmico). Estas vías de
administración tienen objetivos específicos, así como ventajas y desventajas (Deasey, 1996).
Administración
Los fármacos administrados por vía oral se absorben en el tracto gastrointestinal. La absorción
comienza en la boca y el estómago pero se efectúa principalmente en el intestino delgado
(Bakan,1973). Para llegar a la circulación general, el fármaco debe primero atravesar la pared
intestinal y luego el hígado. La pared intestinal y el hígado alteran químicamente (metabolizan)
muchos fármacos, disminuyendo la cantidad absorbida.
Algunos fármacos administrados por vía oral irritan el tracto gastrointestinal y pueden dañar
el revestimiento del estómago y del intestino delgado, favoreciendo así el desarrollo de úlceras,
como, por ejemplo, la aspirina y muchos otros antinflamatorios no esteroideos. La absorción de
ciertos fármacos en el tracto gastrointestinal puede ser limitada o irregular, o pueden destruirse
en el estómago por el medio ácido y las enzimas digestivas. A pesar de estas limitaciones, la vía
oral se usa más que las otras vías de administración de fármacos. Las demás vías se reservan
generalmente para los casos en que un individuo no pueda ingerir nada por vía oral o cuando
un fármaco tiene que ser administrado con rapidez, a dosis muy precisa, o cuando se trata de
un fármaco cuya absorción es limitada e irregular.
Absorción
La biodisponibilidad de un fármaco está relacionada con la proporción y el grado de absorción

de este en la sangre. La biodisponibilidad depende de varios factores que incluyen el modo
en que se diseña y produce un fármaco, sus propiedades físicas y químicas y la fisiología de la
persona que toma el fármaco (Reynoso, 1997)
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ABSORCION DE UN FARMACO
1. Paso al tubo digestivo por el esófago.
2. Disolución del medicamento en pequeñas partículas.
3. Absorción, que puede tener lugar a nivel del estómago, pero que se lleva a cabo
principalmente en el intestino.

Figura 2. Pasos de Absorción del Figura 3. Principales Tejidos que inter-
fármaco. viene en la Absorción del fármaco.
Una vez absorbido a nivel de la circulación sanguínea el fármaco circula a través del cuerpo, y
penetra en los diferentes tejidos. El metabolismo de los fármacos se lleva a cabo principalmente
en el hígado.
Si un comprimido se disuelve y libera el principio activo demasiado rápido se obtendrán unos

valores en sangre que provocarán una respuesta excesiva. Por otra parte, si el comprimido no
se disuelve y no libera el principio activo con suficiente rapidez, gran parte del mismo pasará
a las heces sin ser absorbido. Por lo tanto, los alimentos, otros fármacos y las enfermedades
gastrointestinales pueden influir en la biodisponibilidad de un fármaco.
Es conveniente que la biodisponibilidad sea una propiedad constante entre productos

farmacéuticos. Los que son químicamente equivalentes contienen el mismo fármaco activo
pero pueden tener componentes inactivos diferentes que afecten a la proporción y al grado de
absorción.
A pesar de ser administrado a una misma dosis, los efectos del fármaco podrían variar de
un producto farmacéutico a otro. Los productos farmacéuticos son bioequivalentes cuando
contienen el mismo principio activo y cuando se obtienen los mismos valores del fármaco en
la sangre.
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La bioequivalencia asegura así la equivalencia terapéutica y los productos bioequivalentes son

intercambiables (Madan, 1981).
Algunos productos farmacéuticos están especialmente formulados para liberar sus principios
activos lentamente, en general al cabo de 12 horas o más. Estas formas de liberación controlada
retrasan la proporción en que se disuelve un fármaco. Por ejemplo, pueden revestirse las
partículas del fármaco contenidas en una cápsula con un polímero (una sustancia química) de
grosor variable. El diseño de este polímero permite su disolución en el tracto gastrointestinal
en distintos momentos.
El material de protección (entérico) que reviste algunos comprimidos y cápsulas está destinado
a prevenir los daños que puedan causar las sustancias irritantes (como la aspirina) en el
revestimiento del estómago; también evita que las sustancias se descompongan en el medio
ácido del estómago. La disolución de este material empieza cuando entra en contacto con
un medio menos ácido o con las enzimas digestivas del intestino delgado. Dado que este
revestimiento protector no siempre se disuelve, son muchas las personas (especialmente las de
edad avanzada) que eliminan en las heces los productos farmacéuticos todavía intactos.
Distribución
El fármaco circula rápidamente por todo el organismo una vez absorbido en la sangre, debido
a que el tiempo promedio de la circulación de la sangre es de un minuto. Sin embargo, es
posible que el fármaco se mueva con lentitud desde la sangre hasta los tejidos del organismo
(Kibbe, 2000).
La distribución de los fármacos después de su absorción no es uniforme en todo el organismo.

Algunos tienden a permanecer dentro de los tejidos acuosos de la sangre y de los músculos,
mientras que otros se concentran en tejidos específicos como la glándula tiroides, el hígado
y los riñones. Otros se adhieren estrechamente a las proteínas de la sangre, abandonando la
circulación sanguínea de forma lenta, en contraste con los que la abandonan rápidamente
dirigiéndose a otros tejidos. Algunos tejidos acumulan tan elevadas cantidades de un fármaco
que sirven como reserva de éste, prolongando así su distribución. Por otros lados algunos
fármacos como los que se acumulan en los tejidos grasos, abandonan éstos con lentitud y,
en consecuencia, siguen circulando en la sangre varios días después de que el paciente haya
dejado de tomarlos.
Eliminación
Los fármacos son metabolizados o bien eliminados intactos. El metabolismo es el proceso químico
por medio del cual el organismo altera un fármaco. El hígado es el principal, pero no el único
lugar del organismo donde se metabolizan los fármacos. Los productos del metabolismo, los
metabolitos, pueden ser inactivos o bien, por el contrario, pueden tener una acción terapéutica
o una toxicidad similar o distinta a la del fármaco original. Los denominados profármacos son
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los fármacos que se administran en forma inactiva. Los metabolitos de estos profár-macos son
activos y cumplen con el efecto deseado. Luego se eliminan (principalmente en la orina o las
heces) o bien son convertidos en otros metabolitos que finalmente son excretados.
Los fármacos se excretan principalmente por la orina. El hígado también excreta algunos
fármacos a través de la bilis, conducida por el conducto colédoco hacia el intestino, para ser
eliminada finalmente con las materias fecales.

Figura 5. Eliminación del Fár- Figura 4. Eliminación del fár-
maco como materias fecales. marco por la orina.
Los riñones filtran los fármacos de la sangre y los excretan en la orina, pero existen muchos
factores que afectan a la capacidad de excreción de los riñones. Un fármaco o un metabolito
debe ser soluble en agua y no estar demasiado unido a las proteínas del plasma. La acidez
de la orina afecta la proporción en que se excretan algunos fármacos ácidos o alcalinos. La
capacidad de los riñones para excretar fármacos depende también del flujo de orina, del flujo
de sangre a través de los riñones y del estado de éstos.
A través de la bilis, el hígado excreta algunos fármacos que a su vez penetran en el tracto
gastrointestinal y terminan en las heces, en caso de no ser reabsorbidos en la sangre ni
descompuestos. Pequeñas cantidades de algunos fármacos también se eliminan en la saliva, el
sudor, la leche materna y el aire espirado.
Principales métodos empleados en la obtención de medicamentos de liberación

controlada.
1-Sistema de reservorio.
Fundamento: En este tipo de sistema el fármaco se encuentra depositado dentro de un
reservorio formado por un polímero insoluble de membrana (poroso o no), el cual controla la
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porción liberada debido a su permeabilidad específica. El principio activo puede existir dentro
del reservorio en forma sólida, suspensión o solución (Aso,1994).
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2-Sistema Osmótico
Fundamento: Estos son sistemas fabricados por encapsulación de un fármaco activo

osmóticamente (o la combinación de un fármaco inactivo con una sal activa) dentro de una
membrana semipermeable hecha de un polímero biocompatible como por ejemplo acetato de
celulosa.
La liberación controlada del soluto se produce a través de un orificio de entrega, de diámetro

específico (0.2-0.4mm), realizado sobre la membrana de cubierta mediante rayo láser (Vila, 1997).
3-Sistemas matriciales
En estos sistemas el reservorio del fármaco está preparado por una dispersión homogénea de
partículas de la droga en una matriz polimérica que controla la porción liberada, la cual está
elaborada con polímeros lipofílicos, hidrofílicos o plásticos (Singh, 1998).
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Matrices lipídicas
Fundamento: Estos sistemas se preparan incorporando el principio activo en el material

lipídico no absorbible, pero capaz de disolverse lentamente o ceder el fármaco por lixiviación
en este sitio.
Ejemplos de polímeros lipídicos: cera de carnauba, cera de castor, alcohol estearílico, ácido esteárico,
alcohol cetílico, monoestearato de polietilenglicol y triglicéridos entre otros (Chiang, 2003).
Matrices Hidrofílicas
Fundamento: Este método, se basa en la utilización de un polímero hinchable capaz de formar

un hidrogel (Aulton, 2002).
Matrices Hidrófilas
• Con elevada proporción de sustancias hidrófilas gelificables: ejemplo, carbopol, éteres
de celulosa
• Secuencia
Fármaco superficial se cede con rapidez
Formación de una capa de gel alrededor del comprimido
Difusión del fármaco en la capa del gel
Disolución progresiva del gel y gelificación de nuevas capas
• Sustancias solubles: incrementan velocidad de cesión (por formar canalículos (lactosa,
manitol)
• Sustancias insolubles: disminuyen la velocidad de cesión por dar mayor consistencia al
comprimido (fosfato cálcico, silicatos)
• Variantes :
A. Flotantes: de densidad inferior a ( < jugo gástrico .004-1.014)

• Para ajustar la densidad: adición de sustancias hidrófobas de densidad inferior, ejemplo:
alcohol cetílico mirístico, esteárico, mono y diestearato de glicerilo, aceites hidrogenados.
La flotabilidad es el resultado del aumento del volumen por hidratación del polímero y
por la porosidad del comprimido no hidratado (que depende en parte de la fuerza de
compresión)
B. Multicapa
Capas de carboximetilcelulosa con el fármaco + capas de carboximetilcelulosa reticulada
(es insoluble). En el tracto gastrointestinal las capas reticuladas gelifican y se hinchan
formando una membrana coloidal que regula la cesión del principio activo
C. Bioadhesivos:
Polímeros bioadhesivos
• Molécula flexible
• Con numerosos grupos hidrofílicos
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• Se esponjan en medio líquido

• Las cadenas de polímero difunden a través de las moléculas de mucina y forman puentes
de hidrógeno: biomucoadhesión
• Ejemplos: carboximetilcelulosa, carbono, alginato sódico, hidroxipropilmetilcelulosa
Resumen del comportamiento de matrices hidrofílicas.

(Shozo, 1999)
Matrices inertes
Fundamento: Este tipo de sistema está constituido por algún tipo de polímero inerte que es
mezclado íntimamente con el principio activo, no interactuando con los fluidos biológicos.
Las formas farmacéuticas más empleadas son las sólidas y específicamente las tabletas. En el
comprimido, además del polímero plástico y los principios activos, se utilizan coadyuvantes
especiales denominados acanalantes o canalizadores, que son sustancias muy solubles en agua
que al disolverse, aumentan la porosidad de la matriz permitiendo que el líquido penetre y
promueva la salida del fármaco desde el interior de la misma (Katstra, 2000).
Algunos de los productos utilizados para la fabricación de matrices inertes son: polietileno,
etilcelulosa, cloruro de polivinilo, siliconas, copolímeros acrílicos, poliamida, copolímeros de
acetato y de cloruro de vinilo, entre otros. (Ngo, 1997)
Sistemas o Dispositivos Terapéuticos.
Son dispositivos que ceden el principio activo de modo continuo en una cantidad fija
predeterminada (orden cero) durante un periodo de tiempo fijo.
• Reservorio de fármaco + coadyuvantes

• Elemento de control
• Fuente de energía
• Superficie o abertura de salida
Se estudiarán atendiendo a la vía de administración y al tipo de acción (local o sistémica).
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Acción Sistémica Oral

Transdérmica
Subcutánea
Acción Local Ocular
Uterina
Sistemas Transdérmicos
• Propiedades fisicoquímicas del fármaco: Peso molecular, Coeficiente difusión, Lipofilia.

• No ser irritantes ni alergizantes.
Fármacos activos a bajas concentraciones
Clasificación: según el sistema de control de la liberación
Los dispositivos transdérmicos son semejantes a un apósito que se adhiere sobre la

piel y proporcionan (a partir de un reservorio por diversos mecanismos de control),
cantidades determinadas de fármaco por unidad de tiempo, que penetran por difusión a través
de la piel y pasan a la circulación general.
Uso Ocular
Ocusert: sistema de liberación controlada por membrana (copolímero de etileno y acetato de

polivinilo)
Uso Uterino
Dispositivos intrauterinos que llevan el fármaco incorporado en un reservorio y recubiertos por

una membrana de control (EVAc). Ejemplo: ProgestasertR (65 microgramos/día progesterona)
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347
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Fronteras de la Ciencia y Universidad Moderna

La universidad debe impartir el conocimiento al nivel más avanzado posible: R.P. Atcon
La ciencia en sus límites extremos representa un logro del pensamiento humano; la

Universidad por otra parte es el medio donde se llevan a cabo, entre otros sitios, los programas
de investigación, algunos de los cuales están en el borde o en la intersección entre el quehacer
científico y el académico-docente propio de la función sustantiva de la universidad.
Un nuevo elemento hace esta relación ciencia –universidad más compleja: los sistemas de
información actuales que junto con los avances de los instrumentos va dirigiendo la investigación
científica y tecnológica por derroteros de competencia sin parangón, ni referente histórico
comparable como se puede ver en el cuadro, el crecimiento de la información en cualquier
rubro de la ciencia es astronómico
y mantenerse en la línea de competencia es buena parte de
la labor de los científicos; hay además historia, la ciencia se desarrolla desde caminos variados
y distintos unos de otros; esto significa que el grado de avance de la ciencia por sí misma y en
los centros educativos depende en alto grado de las condiciones sociales en que el complejo
ciencia-universidad se desarrolle; condición de subdesarrollo es necesariamente subdesarrollo
de la ciencia; en estos casos la actividad científica llega a tener
tintes de heroísmo. Genoma 1,030,000
Es importante ubicar la actividad científica en el contexto real social Genoma 16,700,000

o se corre el riesgo de tener un grupo seleccionado que produce una
ciencia válida pero carente de significado en el contexto propio. Ecología 10,600,000
Ecology 38,500,000
Cuando se quiere impulsar la ciencia, se encuentra que no hay
políticas públicas o bien éstas no son las adecuadas para renovar Bioquímica 1,220,000
e impulsar proyectos científicos; entonces, la actividad científica
carece de base social y no tiene peso ni reconocimiento. Biochemistry 19,900,000
Las carreras científicas son desconocidas por la inmensa mayoría Taxonomía 361,000
de los estudiantes; sólo después de la enseñanza media superior se
orientan algunas vocaciones hacia la ciencia y ocurre en el sistema Taxonomy 13,900,000
educativo estatal y con menos frecuencia en los sistemas privados.
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El auge de la Biotecnología, de los avances en los sistemas de diagnóstico médicos, de los

sistemas de comunicación está reorientando hacia las ciencias básicas y sus derivados a un
buen número de alumnos que ven en la ciencia una posibilidad real de realización, al no ser
más una labor ajena al discurso social; la ciencia es ahora atractiva sin que ello no implique una
entrega y lucha por recursos y comprensión de sus significados.
Es clara la relación entre ciencia, tecnología y progreso, los ejemplos son variados pero por
brevedad y sentido de este trabajo se limitarán a tres que llaman la atención: E.U.A., Kenia y
Japón. En el primer caso, en el año de 1996 se definieron por la Academia de Ciencias de los
E.U.A. los estándares de la educación para la ciencia, fijando los estándares para los diferentes
niveles de educación de los contenidos mínimos para los profesores y para los alumnos, lo
que significó al mismo tiempo de un impulso a programas que privilegiaron en la ciencia una
homogeneidad de contenidos y prácticas; se especificaron no sólo lo ya mencionado sino se
dio preferencia a las actitudes y se impulsó de manera determinante la carrera docente de las
ciencias, con lo cual los profesores lograron especializarse en enseñanza de la ciencia y en la
investigación docente sobre la efectividad de los programas que pasan a ser nacionales. Los
estándares son parte de una política pública nacional y los efectos se notan a corto y mediano
plazo; es evidente la influencia que el sistema social tiene a través de sus representantes y como
se refleja esto en presupuestos y empleos públicos y privados relacionados con la actividad
científica y tecnológica; los estándares no sólo comprenden la actividad científica en sí, sino la
historia y sociología de la ciencia: por ello la generación de personas dedicadas a la ciencia no es
un hecho fuera del contexto académico sino que impacta en otras áreas del conocimiento, con
lo cual se logra una cohesión que no descuida el entorno escolar ni el social; este movimiento
va relacionado con la producción de manuales y textos especializados en los variados aspectos
de estos programas. El resultado pleno se verá en unos años en el aumento de las personas
dedicadas a la actividad científica y se podrá medir en el aumento de la productividad científica
y tecnológica.
En otra escala pero siguiendo la línea de países más avanzados está el caso de Kenia. Las
políticas gubernamentales han privilegiado la ciencia en dos sentidos: uno como formador
de personal de alto nivel y competitividad y el otro dirigido hacia una apropiación de teorías
universales en el contexto de su realidad; desde la enseñanza pre-primaria se inician conceptos
generales y más bien difusos sobre algunas nociones científicas, en este nivel el papel del
maestro es determinante y claro, si no formalmente, al menos en las prácticas escolares se
impulsan actividades de interrogación que conducen a ideas precientíficas.
En la escuela primaria, los conceptos del nivel anterior se exploran de manera menos informal,
son al menos 12 unidades por año en los tres primeros años de la primaria, en los siguientes
tres años son 7 unidades por año, en este nivel, son menos pero son más profundas tanto en
énfasis como en profundidad.
En la educación secundaria, es intensiva y se cursan cuatro años de Biología, Química y Física,

lo que representa casi dos tercios de la educación secundaria.
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Siguiendo esa línea en la universidad, la ciencia se divide en disciplinas de la manera siguiente: 4

años de Bioquímica, Química, Geología, Física y Zoología, cada disciplina puede ser estudiada
sola o en combinación con otras, para obtener un diploma de bachiller en cualquiera de las
ciencias mencionadas.
En los niveles de maestría y doctorado cada una de las ciencias se subdivide en especialidades
como, biología molecular, genética, endocrinología, etc. Hay que hacer notar, revisando
cuidadosamente sus planes y programas de estudio, que no se quedan solamente en descripciones
de materias sino que se dirigen a los fundamentos experimentales más que a los descriptivos.
En el caso de Japón es evidente la relación entre ciencia y sistema educativo. El avance indiscutible
se proyecta en ciencia y tecnología de primer nivel: un ejemplo de ello es la Universidad de
Tsukuba, donde en sus institutos se investigan desde problemas educativos hasta problemas
de plasmas, pasando por nanotecnología, cultivo de tejidos vegetales y animales, ecosistemas
marítimos y terrestres, etc. No es la única institución que lleva a cabo esto, pero es notorio
por la gran concentración de científicos y tecnólogos concentrados ahí. El nivel científico y
tecnológico japonés se debe entre otras cosas a un sistema social que respeta, promueve y
privilegia la actividad científica. Esta Universidad es única en muchos aspectos: a diferencia
de otras, la educación general no graduada está organizada de acuerdo a grupos de colegios
que proveen un apoyo muy variado de actividades extracurriculares para estudiantes dentro y
fuera del campus universitario; esto incluye actividades científicas como parte fundamental del
conglomerado de actividades formativas ligadas a la investigación científica; ésta tiene entonces
una gran prioridad y una difusión que rompe con las líneas tradicionales tanto de divulgación
como de iniciación en las ciencias cubriendo un amplio espectro de campos académicos, en
los cuales se realiza investigación y docencia de alta calidad; la actividad docente está ligada
de manera determinante con las instituciones de investigación localizadas en la Ciudad de la
Investigación de Tsukuba. En cada estamento de la Universidad de Tsukuba se encuentran los
planes y programas de estudio con laboratorios dentro y fuera de la universidad con el personal
y el equipamiento técnico idóneo para la docencia e investigación de alto desempeño; de esta
forma recluta a los alumnos con vocación, excelencia y talento y sobre todo interés en un campo
de la ciencia y la tecnología. Por ejemplo, el Colegio de Ciencias de la Ingeniería, con énfasis en
la Ingeniería Molecular y de Materiales donde cubren temas como los polímeros dieléctricos,
nuevos materiales como los orgánicos magnéticos, el desarrollo de catalizadores para convertir
bióxido de carbono en metanol, desarrollo de nuevas cerámicas para la superconductividad de
alta temperatura, etc.
Para esto, cuenta con el apoyo de al menos trece laboratorios de alto nivel que apoyan la labor
de los docentes y proveen de técnicas y materiales de punta a los alumnos teniendo como
consecuencia un nivel de competitividad muy alto.
¿Por qué hacer estas descripciones y como se asocian a nuestra situación? En primer lugar
porque el curso nos ha orientado y demostrado el nivel que tenemos en este momento y también
la forma de superar el nivel y arribar a un estrato verdaderamente universitario; en segundo
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lugar para hacer una historia que refleje el camino seguido por la ciencia en la UAM-X y lo que
se espera ocurra en los próximos años; por ello se hará a continuación una reseña del camino
seguido al menos en E.U.A., donde nuestra dependencia de todos tipos es mayor, incluyendo
por supuesto la científica. Editado por P. Handler, se publicó en 1970 una obra denominada
BIOLOGY AN THE FUTURE OF MAN en ella la Academia de Ciencias de los Estados Unidos
de América fijaba con precisión las líneas de acción y los campos prioritarios de la ciencia para
ese momento; en esa época tenía importancia primordial la Biología Molecular, sobre todo en
los aspectos de función de ADN/ARN, información genética, naturaleza de ella, duplicación,
etc. Al mismo tiempo se fijaron las metas a corto y largo plazo, entre las primeras estaban las
de comprender a fondo los mecanismos y procesos de función de los genes, como operan con
precisión cuando se habla de enzimas y como es la programación de las funciones celulares
desde el ADN.
En las líneas de acción de largo plazo estaban entre otras las de la comprensión del papel del
ADN y la síntesis de proteínas en el desarrollo de organismos multicelulares. Bajo esta premisa de
análisis se establece primero el campo de la ciencia sobre el cual se va a dar un mayor desarrollo
y enseguida se establecen las metas a lograrse en un plazo determinado; de esta manera se
expusieron los temas siguientes: materiales de la vida y sus transformaciones (proteínas, grasas,
carbohidratos), la célula como estructura fundamental de la vida comprendiendo todos los
aspectos de una biología celular incluyendo problemas de acción de los virus y la relación con
el cáncer.
Los orígenes de la vida, la biología del desarrollo, las funciones de tejidos y órganos, el sistema
nervioso, la biología del comportamiento, la ecología, la herencia y la evolución, la diversidad
de la vida, la computadoras digitales y las ciencias de la vida, la alimentación humana, la
ciencia y la práctica médica, los recursos naturales, la biología y el desarrollo tecnológico, la
salud ambiental y por último la biología y el futuro del hombre, nótese que en este tiempo no
se mencionan de manera directa la nanotecnología, las células troncales, o genoma.
En el año de 1989, se publicó la obra Opportunities in Biology por el National Research Council,
Comisión sobre las Ciencias de la Vida, en cuyo prefacio se aclara la diferencia con la obra
anterior, debida al enorme avance que mediaba entre las dos publicaciones y al problema toral
de la cantidad de información generada en esos años; la diferencia esencial es el énfasis. En
este caso se destaca de manera clara el valor de las nuevas tecnologías e instrumentaciones; sin
embargo, se vuelve a tocar el punto de la estructura y función molecular, en especial las nuevas
técnicas e instrumentaciones, en particular, la relación entre la estructura y función molecular
y la computación, que en la actualidad permite dilucidar una buena parte de los genomas de
los seres vivos incluyendo por supuesto el genoma humano. Al igual que en la obra anterior no
aparecen como prioritarios algunos de los temas de gran relevancia en la actualidad.
La Ciencia en la Frontera (Greenwood 1992,) producto de la Academia Nacional de Ciencias,

amplía el campo de acción de las ciencias a campos no tratados en los otros reportes o tratados
en obras distintas, como son los sistemas dinámicos, la geología, la astrofísica, las imágenes
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por resonancia magnética, la regulación genética, y las redes neuronales entre otras. De 10
capítulos, sólo 4 están dedicados específicamente a biología o a medicina, para este tiempo, se
han dedicado ya volúmenes especiales para cada capítulo de las ciencias actuales.
Esta revisión conduce a una pregunta: ¿Qué debemos enseñar? Aunque también ¿Qué
podemos enseñar? La información crece por horas y no es posible tener un panorama completo
excepto de algunas áreas reducidas y muy especializadas; además, hay que considerar el nivel
de desinformación de los alumnos: en ellos la idea de ciencia es algo deformado por los cursos
de enseñanza media, los cuales no reflejan desde ningún punto de vista el avance y nivel de las
ciencias actuales; por ello, el esfuerzo de llevar los temas avanzados de este curso representan
un reto a enfrentar. Al no ser posible cubrir la totalidad de los contenidos revisados, se puede
hacer una serie de propuestas sobre los temas y las carreras donde pueden tener mayor
trascendencia; esto constituye la segunda parte del ensayo, revisando de forma parcial a que
corresponderían del conocimiento actual en el mundo, como es comprensible, pueden variar
los criterios por lo que están sujetos a discusión todo el tiempo.
Para Marshall (2000), el campo y la velocidad a la que se expande la investigación biotecnológica,

hace difícil definir las áreas de acción, ya que están cambiando a la misma velocidad de la
investigación, ligado a la alta plusvalía de la información para aplicaciones industriales, hace
de la biotecnología una de las inversiones más rentables y susceptibles de ser incorporadas a
los curricula de las carreras.
Las células troncales, (Bajaj,2002), como resultado de una conferencia internacional sobre líneas
emergentes en biotecnología, considera a las células troncales como una de las investigaciones
más prometedoras y apasionantes, como los elementos potenciales de tratamiento de
enfermedades como Parkinson, Alzheimer, diabetes, desórdenes cardiacos entre otras. En este
caso, la incorporación a las carreras de la Salud daría una visión diferente y más avanzada.
Es importante destacar como una gran posibilidad y avance, el trabajo con el ADN,
desde el desciframiento del genoma humano hasta la estructura y funciones de las
histonas y nucleosomas, relacionadas con la regulación epigenética de la expresión
génica. (Recillas, 2007).
En donde hay un gran campo de expansión en este momento, es en la nanotecnología, es

también recomendable incorporarlo en los programas de estudio considerando que hay
personal académico de la UAM-X, experto en el tema; el por qué es obvio pero es importante
destacar algunos aspectos centrales; para Foladori e Invernizzi (2006), representa la revolución
tecnológica a imponerse en uno o en cuatro decenios, los autores examinan las posibles
consecuencias en varios niveles, desde lo que puede significar no desarrollarla o hacerlo
tardíamente hasta sus efectos en la salud o en la economía; la forma en que la nanotecnología
influirá en la vida futura no es previsible en su totalidad; según estos autores, la novedad se da al
menos en cuatro aspectos: En primer lugar es construir de lo más pequeño(átomos y moléculas)
a lo más grande.
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En segundo lugar, en ese nivel no hay diferencia entre el nivel biótico y abiótico, de tal manera
que es posible, aplicar procedimientos biológicos a los procesos materiales, o interferir con
materiales en los cuerpos vivos.
En tercer lugar, cualquiera de los elementos químicos manipulados a nivel nano, despliega
propiedades físicas diferentes a las de una escala mayor.
En cuarto lugar, la nanotecnología combina varias tecnologías y ciencias, como la informática,

biotecnología y tecnología de materiales.
Para Moghimi y colaboradores (2005), la nanotecnología presenta la gran oportunidad, a través

de la nanomedicina, de contribuir a comprender algunas de las enfermedades de etiología
más compleja, así como, a resolver algunas de ellas. Estos autores consideran también que la
investigación en la dirección hacia blancos precisos, con agentes de diagnóstico, farmacéuticos
y terapéuticos son los temas que marchan a la vanguardia de la investigación en nanomedicina.
Estas cuestiones involucran la identificación de blancos precisos, como células, y seleccionar los
nanomedios precisos para tener reacciones colaterales menos dañinas; los blancos pueden ser,
fagocitos mononucleares, dendritas, tumores cancerosos, etc.
En este tiempo, la nanotecnología particularmente en sus aplicaciones médicas, representa un

nicho muy promisorio para el desarrollo médico industrial.
Minakshi (2005), afirma que en los últimos años ha ocurrido una revolución científica
en la Biología; considera que las técnicas se han desarrollado para producir moléculas
medicinalmente valiosas, que podrían cambiar los rasgos hereditarios de plantas y animales,
diagnosticar enfermedades y curarlas a través de proteínas y polipéptidos formando un nuevo
grupo de drogas potentes o bien de vacunas inmunodiagnosticadas; de esas y otras maneras la
Biotecnología está teniendo un gran impacto en la salud, alimentación, agricultura e incluso
en la protección ambiental.
Finalmente, el número de Scientific American edición especial de Nanotecnología (2007), dedica

dos artículos a la nanotecnología, el primero de N.C. Seeman se dirige hacia el uso del ADN no
sólo en sus características bioquímicas, sino como los bloques para hacer otras combinaciones;
menciona que otros investigadores demostraron como el ADN puede ser utilizado como
dispositivo computacional. En su artículo, el autor expone otros usos no biológicos del ADN, la
construcción de dispositivos y estructuras cuyos mecanismos y elementos esenciales van de 1 a
100 nanómetros, esto es en una palabra nanotecnología.
Agrega el uso potencial de estos arreglos, como enrejados de ADN que podrían contener
copias de grandes moléculas biológicas en arreglo ordenado para cristalografía de rayos-X y
con ello determinar su estructura, para a su vez hacer un diseño más racional de fármacos.
En el mismo número de la revista, Shapiro y Benenson, desarrollan la idea de una máquina

de Turing (en 1936, pensó en una máquina computadora programable) con una maquinaria
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biológica, en este caso el ribosoma, considerando la forma en que el ribosoma junto con ARN
mensajero, traduce con precisión las ordenes del ADN, así, las máquinas moleculares naturales,
procesarían la información en el sentido en que Turing pensó la máquina programable, quien
guarda la información (ADN) y quien la interpreta y traduce (ARN) en forma de proteínas
(enzimas), pueden ser programables para proteínas más específicas con lo que se lograrían
fármacos de gran precisión y tal vez individualizados por enfermedad y persona.
Durante el curso hemos constatado al menos dos cosas: la primera es que en México, a pesar
del personal científico y académico con el que se cuenta, los presupuestos y las facilidades son
escasos, por lo que tratar de incorporar la información al campo de estudios profesionales o
de posgrado resulta casi imposible; la segunda tiene que ver con algunos elementos que se
dan hacia el interior de la institución: la dificultad de cambiar los planes y programas y la
velocidad a la que sería necesario hacerlo, para al menos saber de manera razonable cual es
la ubicación de los planes y programas; en el fondo debatimos otros aspectos de la educación.
La ciencia carece de un valor social, no hay políticas públicas claras de apoyo y desarrollo, se
piensa que las prioridades son otras y se relega a un plano inferior la actividad científica; al no
haber un reconocimiento y validación social, no hay tampoco una historia académica en los
estratos anteriores que apoyen la ciencia. Por esta razón las carreras de disciplinas científicas se
encuentran en una crisis de alumnado.
Para terminar es necesario hacer propuestas, además de expresar las ideas. Para esto y con
base en el curso y la literatura, comparándolas con los planes actuales en la D.C.B.S. de la
U.A.M.-X., se sugieren los temas que deberían formar parte de los diversos curricula y en los que
actualmente, aun teniendo a los profesores-investigadores, no están incorporados de manera
expresa; en el cuadro siguiente se plantean los contenidos que podrían ser incorporados y en
las carreras en las que al menos en una primera etapa actualizarían los planes y programas de
estudio. Los criterios de inicio serían entre otros, el estado actual de las carreras y los indicadores
los planes y programas, las facilidades, tanto para información como de laboratorios; con
base en el curso y la separación que se hizo en el programa, habría un énfasis variable según
la carrera, habría que agregar el tiempo en el que se llevaría a cabo y como se crearía y
conservaría un sistema de información permanente y de actualización docente para mantener
un nivel aceptable de comunicación.
A B C D E
Temas Microbiología Procesos Genética y Biomedicina Nutrición
Carreras y Ecología Celulares Genómica
Fundamentales
Biología xxx xxx xxxx xx xx
Medicina xxx xxx xxxxx xxxx xxx
M.V.Z.
xxxx xxxx xxxxx xx xxx
Q.F.B. xxxx xxxxx xxxxx xxxx xxxx

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Las X, representan el énfasis de cada una de las divisiones y el impacto que tendrían en las
carreras de una, el menor a cinco el mayor.
La propuesta es, finalmente, incorporar primero en los profesores y luego en los planes y
programas de estudio, en cursos y seminarios permanentes, los contenidos actualizados, según
carrera y eventualmente posgrados de los avances de las ciencias en especial de las físicas y
naturales.
Referencias
Bajaj BS. (2002) Emerging trends in biotechnology-stem cells. Current Science, 83: 202-203.
Commission on Life Sciences (1989). Opportunities in Biology. Commision on Life Science,
National Academy Press. Washington, D. C.
Foladori G, Invernizzi N. (2006). La nanotecnología: una solución en busca de problemas.
Comercio Exterior 56 No.4: 326-334.
Greenwood A. (1992) Science at the Frontier. National Academy Press. Washington, D. C.
Handler P. (1970). Biology and the Future of Man Edited by Philip Handler. New York. Oxford
University Press.
Marshall A. (2000). Keeping track of the trends. Nature Biotechnology, 18, IT1.
Minaksi D. (2005). Recent trends in biotechnology. Current Science 88: 1030-1031.
Moghimi SM, Hunter AC, Murray C. Nanomedicine: current status and future prospects. The
FASEB Journal 19:311-330.
Recillas F. (2007). Epigenética y Epigenómica. (Conferencia) Curso: Impacto de las Nuevas
tecnologías de la Biología Molecular. UAM-X. D.C.B.S. Septiembre.
Shapiro E, Benenson Y. (2007) Bringing DNA computers to life. Scientific American 17: 41-47
Seeman NC. (2007). Nanotechnology and the double helix. Scientific American 17: 31-39
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Francisco Fierro Fierro y Marcela Guevara Onofre
INSTITUCIONES PARTICIPANTES
PROCEDENCIA
Centro de Investigación Sobre Enfermedades Infecciosas
Instituto Mexicano del Seguro Social

• Centro Médico Nacional Siglo XXI. Unidad de Investigación Médica en Bioquímica
Instituto Nacional de Neurología y Neurocirugía “MVS”
Instituto Nacional de Neurología y Neurocirugía “MVS”
Instituto Nacional de Salud Pública
Instituto Politécnico Nacional

• Estudios de Posgrado e Investigación
Universidad Autónoma del Estado de México

• Facultad de Medicina
Universidad Autónoma Metropolitana Unidad Iztapalapa

• Departamento de Biotecnología
• Departamento de Reproducción Animal.
Universidad Autónoma Metropolitana Unidad Xochimilco

• Depto. de Atención a la Salud
• Depto. de Producción Agrícola y Animal
• Depto. de Sistemas Biológicos.
Universidad de Habana
• Centro de Ingeniería e Investigaciones Químicas C, Habana, Cuba
Universidad Nacional Autónoma de México

• Facultad de Ciencias. Depto. de Ecología y Recursos naturales
• Facultad de Química. Departamento de Alimentos y Biotecnología
• Instituto de Ecología
• Instituto de Ingeniería
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Impacto de la Biología Molecular
IMPACTO DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR Y LAS NUEVAS

TECNOLOGÍAS EN EL CONOCIMIENTO DE LA FUNCIÓN
CELULAR Y SUS APLICACIONES
PARTICIPANTE PROCEDENCIA
Adolfo Rosado García Prof. Titular C

Depto. de Reproducción Animal.
Universidad Autónoma Metropolitana
Miembro del Sistema Nacional de Investigadores.
Alejandro Ávalos Rodríguez Prof. Titular C

Depto. de Producción Agrícola y Animal
Universidad Autónoma Metropolitana Unidad
Xochimilco.
Alma Piñeyro Nelson Instituto de Ecología

Universidad Autónoma Meropolitana.
Ana Ma. Rosales Torres Prof. Titular C

Depto. Producción Agrícola y Animal
Xochimilco.
Araceli Tomasini Campocosio Profesor titular C

Departamento de Biotecnología
Universidad Autónoma Metropolitana-Unidad
Iztapalapa
Araly A Salgado Parra Facultad de Medicina,

Universidad Autonóma del Estado de Mexico
Armando Mejía Álvarez Profesor Titular C

Iztapalapa
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Avedis Aznavurian Apajian Prof. Titular C.

Depto. Atención a la Salud
Xochimilco
Carmen Wacher Rodarte Dra. Ma. del Carmen Wacher Rodarte

Profesor de Carrera
Departamento de Alimentos y Biotecnología
Facultad de Química, UNAM
SNI Investigador Nacional Nivel II
Clara Ortega Camarillo Investigador Asociado D

Unidad de Investigación Médica en Bioquímica,
Hospital Especialidades,
IMSS Centro Medico Nacional sXXI.
Claudia Lizbeth Martínez Estudios de Posgrado e Investigación

González Instituto Politécnico Nacional
Emma Elisa Ortiz Islas Investigador en Ciencias Médicas

Instituto Nacional de Neurología y Neurocirugía
“MVS”
Francisco Fierro Fierro Profesor Titular C

Departamento de Producción Agrícola y Animal
Universidad Autónoma Metropolitana- Unidad
Xochimilco
Francisco J. Fernández Profesor Titular C

Iztapalapa
Gloria Díaz-Ruiz Técnico Académico, Departamento de Alimentos

y Biotecnología
Facultad de Química, UNAM
359
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Impacto de la Biología Molecular
Guadalupe Prado Flores Profesora Titular

Departamento de Producción Agrícola y Animal
Universidad Autónoma Metropolitana- Unidad
Xochimilco
Jaime A. Bustos Martínez. Profesor Titular C

Departamento de Atención a la Salud
Xochimilco
Javier Barrios González Profesor-Investigador Titular C

Iztapalapa
Jesús Martínez Barnetche Jefe del Departamento de Inmunología

Centro de Investigación Sobre Enfermedades
Infecciosas
Instituto Nacional de Salud Pública
Marcela Vergara Onofre Prof. Titular C

Depto. de Producción Agrícola y Animal.
Xochimilco
Marcelo Rojas-Oropeza Profesor de Asignatura A

Depto. de Ecología y Recursos naturales
Facultad de Ciencias UNAM.
María Cristina González Torres Prof. Titular C.

Departamento de Ciencias de la Salud
Iztapalapa
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Marisol López López. Prof. Titular C
Depto. de Sistemas Biológicos.
Xochimilco
Mayra A. Alvarez Lemus Investigadora en Ciencias Médicas b
Instituto Nacional de Neurología y Neurocirugía
“MVS”
Mayra González Hurtado Investigadora Auxiliar
Centro de Ingeniería e Investigaciones
Químicas C, Habana, Cuba
Profesora Adjunta, Facultad de Química
Universidad de Habana
Nathalie Cabirol Profesor de Asignatura A
Departamento de Biología Celular
Facultad de Ciencias, UNAM
Instituto de Ingeniería, UNAM
Miembro del Sistema Nacional de Investigadores
Oralia Nájera Medina Profesor Titular C
Departamento de Atención a la Salud
Xochimilco
Rebeca García Macedo. Investigador Asociado D
Unidad de Investigación Médica en Bioquímica,
Hospital Especialidades,
IMSS Centro Medico Nacional sXXI.
Román Espinosa Cervantes Prof. Titular C
Depto. Producción Agrícola y Animal
Xochimilco
Sonia Recillas Gispert Instituto de Química de la UNAM
Teresa Florencia López-Murillo Prof. Titular A
Xochimilco
361
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Impacto de la biología molecular y las nuevas
tecnologías en el conocimiento de la función
celular y sus aplicaciones. Editado por la
División de Ciencias Biológicas y de la Salud
de la Universidad Autónoma Metropolitana,
se termino de imprimir en diciembre de 2011
en los talleres de Impresión Comunicación
Gráfica, S.A. de C.V.
La edición consta de 500 ejemplares.
362
LIBRO View
UAM.indd 362
publication stats 01/12/11 17:11

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Biología molecular: herramienta para estudios de ecología microbiana

Chapter · January 2011

Nathalie Cabirol Marcelo Rojas-Oropeza

SEE PROFILE SEE PROFILE

Organotins with industrial and biological activities View project

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Francisco Fierro Fierro

LIBRO UAM.indd 1 01/12/11 17:10

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANA-XOCHIMILCO

DIVISIÓN DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y DE LA SALUD

Impacto de la biología molecular y las nuevas tecnologías en el conocimiento de la función

D.R. © UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANA

D.R. © Coordinadores: Francisco Fierro Fierro, Marcela Vergara Onofre

Impreso y hecho en México

LIBRO UAM.indd 2 01/12/11 17:10

Metabolitos secundarios de actinomicetos................................................................ 27

Avances en la producción de antibióticos y otros metabolitos secundarios.............. 39

Métodos actuales para el estudio de microorganismos en alimentos....................... 45

Identificación y tipificación molecular de Staphylococcus aureus en alimentos........ 55

Rutas de transducción de señales y regulación de la morfogénesis en hongos....... 67

B.- AVANCES RECIENTES EN ECOLOGÍA Y AGRONOMÍA

Biorremediación de suelos contaminados por compuestos organoclorados............ 99

Fertilizantes de liberación lenta y su aplicación en campo......................................111

Generación, uso e implementación de organismos genéticamente

Aplicación de técnicas de biología molecular para estudios de ecología

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Muerte Celular......................................................................................................... 145

La participación de la asimetría fosfolipídica de la membrana plasmática

Análisis genómico del repertorio inmunológico....................................................... 165

Participación de la ceramida en la implantación embrionaria................................. 175

Desacoplamiento mitocondrial en diabetes tipo 2................................................... 187

Alteraciones en la vía de la señalización de la insulina y su relación con

Carcinomas cerebrales, principios y mecanismos bioquímicos.............................. 213

Enfermedades neurodegenerativas........................................................................ 223

Posibles acciones tóxicas de heptacloro y epóxido de heptacloro vinculadas

La dinámica compleja en electroencefalogramas.

LIBRO UAM.indd 4 01/12/11 17:10

Farmacogenómica: medicina personalizada........................................................... 289

Alteraciones a nivel celular e inmunofenotipo en niños desnutridos....................... 299

Células troncales embrionarias............................................................................... 311

Diferenciación sexual cerebral................................................................................ 327

Sistema de liberación controlada de medicamentos............................................... 335

Fronteras de la ciencia y universidad moderna....................................................... 349

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En la segunda sección, “Avances Recientes en Ecología y Agronomía”, se incluyen

La tercera sección, “Procesos Celulares Fundamentales”, está dedicada al análisis de

LIBRO UAM.indd 8 01/12/11 17:10

Dr. Salvador Vega y León.

LIBRO UAM.indd 9 01/12/11 17:10

LIBRO UAM.indd 11 01/12/11 17:10

avances desarrollados en el campo de la biología molecular, la genómica y la proteómica, a

LIBRO UAM.indd 12 01/12/11 17:10

Dr. Francisco Fierro Fierro

Definición de metabolito secundario

Los metabolitos secundarios (MS) son compuestos microbianos y de plantas no esenciales

Los metabolitos secundarios presentan una enorme diversidad química en su composición

Aminoazúcares (aminoglicósidos): contienen unidades de mono-

Quinonas: funcionan frecuentemente