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Biologa molecular: herramienta para

estudios de ecologa microbiana aplicada
a estudios ambientales
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Nathalie Cabirol
Francisco J. Fernndez
Universidad Nacional Autnoma de
Metropolitan Autonomous University
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Impacto de la biologa molecular y las

nuevas tecnologas en el conocimiento de
la funcin celular y sus aplicaciones
Francisco Fierro Fierro

Marcela Vergara Onofre
Editores
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UNIVERSIDAD AUTNOMA METROPOLITANA

Rector General
Dr. Enrique Fernndez Fassnacht
Secretaria General
Mtra. Iris Edith Santacruz Fabila
UNIVERSIDAD AUTNOMA METROPOLITANA-XOCHIMILCO
Rector
Dr. Salvador Vega y Len
Secretaria
Dra. Beatriz Araceli Garca Fernndez
DIVISIN DE CIENCIAS BIOLGICAS Y DE LA SALUD
Director
Dr. Fernando de Len Gonzlez
Secretaria Acadmica
M. en C. Georgina Urbn Carrillo
Asistente Editorial
Lic. Zyanya Patricia Ruiz Chapoy
Comit Editorial
Dra. Mara Guadalupe Prado Flores
Dr. Hugo Ramrez Saad
Dra. Gabriela del Pilar Romero Esquiliano
M. en C. Jess Snchez Robles
Impacto de la biologa molecular y las nuevas tecnologas en el conocimiento de la funcin
celular y sus aplicaciones
Primera edicin: 2011
ISBN: 978-607-477-560-0
D.R. UNIVERSIDAD AUTNOMA METROPOLITANA
Unidad Xochimilco
Calzada del Hueso 1100
Col. Villa Quietud, Del. Coyoacn
C.P. 04960, Mxico, D.F.
Tel.: 54 83 70 00 ext. 3783
D.R. Coordinadores: Francisco Fierro Fierro, Marcela Vergara Onofre
D.R. Diseo de portada Mtra. Martha Flores
Impreso y hecho en Mxico
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NDICE
A.- AVANCES RECIENTES EN MICROBIOLOGA Y BIOTECNOLOGA
Sistemas biosintticos, gentica y regulacin del metabolismo secundario; nuevas
metodologas para su estudio................................................................................... 13
Dr. Francisco Fierro Fierro
Metabolitos secundarios de actinomicetos................................................................ 27
Dr. Armando Meja lvarez
Avances en la produccin de antibiticos y otros metabolitos secundarios.............. 39
Dr. Javier Barrios Gonzlez
Mtodos actuales para el estudio de microorganismos en alimentos....................... 45
Dra. Gloria Daz-Ruiz
Dra. Carmen Wacher
Identificacin y tipificacin molecular de Staphylococcus aureus en alimentos........ 55
Dr. Jaime A. Bustos Martnez.
Rutas de transduccin de seales y regulacin de la morfognesis en hongos....... 67
B.- AVANCES RECIENTES EN ECOLOGA Y AGRONOMA
Biologa molecular: herramienta para estudios de ecologa microbiana
aplicada a estudios ambientales............................................................................... 77
Dr. Nathalie Cabirol
Dr. Marcelo Rojas-Oropeza
Dr. Francisco J. Fernndez
Biorremediacin de suelos contaminados por compuestos organoclorados............ 99
Dra. Araceli Tomasini Campocosio
Fertilizantes de liberacin lenta y su aplicacin en campo......................................111
Dr. Mayra Gonzlez Hurtado
Generacin, uso e implementacin de organismos genticamente
modificados para fines agrcolas: el caso del maz en Mxico............................... 123
Dra. Alma Pieyro Nelson
Aplicacin de tcnicas de biologa molecular para estudios de ecologa
de actinomicetos halfilos en Mxico...................................................................... 135
Dra. Araly A. Salgado Parra
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C.- PROCESOS CELULARES FUNDAMENTALES

Muerte Celular......................................................................................................... 145
Dra. Ana Ma. Rosales Torres
La participacin de la asimetra fosfolipdica de la membrana plasmtica
en diferentes tipos celulares, tomando como modelo al espermatozoide............... 155
Dr. Alejandro valos Rodrguez
Dra. Clara Ortega Camarillo
Anlisis genmico del repertorio inmunolgico....................................................... 165
Dr. Jess Martnez Barnetche
Participacin de la ceramida en la implantacin embrionaria................................. 175
Dr. Romn Espinosa Cervantes
Dr. Adolfo Rosado Garca
D.- BIOMEDICINA
Desacoplamiento mitocondrial en diabetes tipo 2................................................... 187
Alejandro valos Rodrguez
Alteraciones en la va de la sealizacin de la insulina y su relacin con
obesidad y diabetes................................................................................................ 203
Dra. Rebeca Garca Macedo
Carcinomas cerebrales, principios y mecanismos bioqumicos.............................. 213
Dra. Sonia Recillas Gispert
Enfermedades neurodegenerativas........................................................................ 223
Dra. Marcela Vergara Onofre
Bioqumica de los esteroides y su accin a nivel del sistema nervioso central...... 237
Dr. Emma Elisa Ortiz Islas
Posibles acciones txicas de heptacloro y epxido de heptacloro vinculadas
al estrs oxidativo.................................................................................................... 247
Dra. Guadalupe Prado Flores
La dinmica compleja en electroencefalogramas.
Modelo animal de epilepsia..................................................................................... 261
Dra. Claudia Lizbeth Martnez Gonzlez
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Farmacocintica y farmacodinamia......................................................................... 275

Dra. Mayra A. lvarez Lemus
Farmacogenmica: medicina personalizada........................................................... 289
Dra. Marisol Lpez Lpez.
Alteraciones a nivel celular e inmunofenotipo en nios desnutridos....................... 299
Dra. Oralia Njera Medina
Dra. Mara Cristina Gonzlez Torres
Clulas troncales embrionarias............................................................................... 311
Dra. Teresa Florencia Lpez-Murillo
Diferenciacin sexual cerebral................................................................................ 327
Sistema de liberacin controlada de medicamentos............................................... 335
Dra. Mayra Gonzlez Hurtado
EPLOGO
Fronteras de la ciencia y universidad moderna....................................................... 349
Dr. Avedis Aznavurian
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PRLOGO
La biologa molecular es una de las disciplinas que ha tenido un desarrollo ms espectacular
durante los ltimos aos. La revista Science publica anualmente una lista de los que, en opinin de
sus editores y cientficos colaboradores, han sido los avances cientficos ms relevantes del ao.
En la lista de 2010, seis los diez descubrimientos pertenecan al mbito de la biologa molecular,
en reas como la genmica, la ingeniera gentica o la biologa sinttica. Dos trabajos de fsica,
uno de medicina y otro de biofsica completaban la lista. El nmero de publicaciones cientficas
dentro del campo de la biologa molecular no ha dejado de aumentar desde hace aos, y las
ms prestigiosas revistas cientficas multidisciplinarias, como Science o Proceedings of the National
Academy of Sciences of the USA, publican en la actualidad de forma mayoritaria artculos donde
la biologa molecular es protagonista. Resulta por tanto muy importante facilitar y apoyar
en nuestra Universidad el desarrollo de esta disciplina, tanto desde un punto de vista bsico
como de la aplicacin de las metodologas de la biologa molecular a diferentes campos de
conocimiento de las ciencias biolgicas en su sentido ms amplio.
La realizacin de este libro permite contar con una serie de especialistas en diversos mbitos,
que van desde la biomedicina a la ecologa y la biotecnologa, y en cuyos captulos se tratan
temas, siguiendo un hilo conductor centrado en la biologa molecular y los avances que las
metodologas de la biologa molecular han supuesto para estos temas. Aprovechando la
experiencia de los autores de los captulos de ste libro, en gran mayora miembros del Sistema
Nacional de Investigadores, se cuenta con la oportunidad de publicar un libro que recoge en su
capitulado temas de actualidad en las diferentes disciplinas del rea biolgica.
Adems de tratar temas relacionados con la biologa molecular, se ha querido dar cabida
tambin a otras metodologas de creciente importancia para los temas tratados. Tal es el caso
de la nanotecnologa, cuyo desarrollo emergente est adquiriendo cada vez mayor notoriedad
y que se prev tenga un gran impacto en un futuro prximo en campos como la biomedicina.
As, dos de los captulos del libro tratan sobre la aplicacin de la nanotecnologa en agronoma
y en farmacologa respectivamente.
El libro se estructura en cuatro secciones que agrupan los diferentes captulos por su temtica.
La primera de estas secciones lleva por ttulo Avances Recientes en Microbiologa
y Biotecnologa, y en la misma se tratan aspectos sobre la produccin de metabolitos
secundarios microbianos por un lado, y sobre microbiologa de alimentos por otro. Los hongos
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Prlogo
y las bacterias del grupo de los Actinomicetos son los principales microorganismos productores
de metabolitos secundarios, muchos de los cuales encuentran una aplicacin en medicina
humana o veterinaria como antibiticos o frmacos para tratar diferentes dolencias. En el
primero de los captulos, Sistemas biosintticos, gentica y regulacin del metabolismo secundario; nuevas
metodologas para su estudio, se introduce el tema de los metabolitos secundarios, analizando su
diversidad estructural, sus sistemas biosintticos y la regulacin de su biosntesis. En otro de
los captulos de esta seccin se analiza la regulacin del desarrollo morfolgico en los hongos
filamentosos y la estrecha relacin que este proceso tiene con el metabolismo secundario. Otro
de los captulos, Metabolitos secundarios de actinomicetos, se centra en la biosntesis de metabolitos
secundarios por parte de este importante grupo bacteriano, revisando aspectos como su
regulacin y su conexin con el desarrollo morfolgico. Y en el captulo que lleva por ttulo
Avances en la produccin de antibiticos y otros metabolitos secundarios se analiza la tecnologa de la
fermentacin en medio slido, de inters creciente y que est empezando a ser utilizada en
la produccin de metabolitos secundarios como la lovastatina. En cuanto a la microbiologa
de alimentos, el captulo Mtodos actuales para el estudio de microorganismos en alimentos hace una
revisin de las metodologas que en la actualidad se utilizan en esta disciplina, muchas de las
cuales son tcnicas de biologa molecular, y al final del trabajo Identificacin y tipificacin molecular
de Staphylococcus aureus en Alimentos describe la aplicacin de algunas de estas metodologas en la
identificacin y tipificacin de esta bacteria patgena.
En la segunda seccin, Avances Recientes en Ecologa y Agronoma, se incluyen
captulos que abordan problemas que se plantean actualmente en estas disciplinas y sus
posibles soluciones, desde la ptica de la biologa molecular fundamentalmente. La seccin se
abre con un amplio trabajo sobre la utilizacin de tcnicas de biologa molecular en el estudio
de la ecologa microbiana. Otro de los captulos aborda la utilizacin de estas metodologas
en el estudio de actinomicetos halfilos en Mxico. El captulo Biorremediacin de suelos
contaminados por compuestos organoclorados se centra en los mecanismos moleculares que poseen
diferentes grupos de microorganismos para la degradacin de este tipo de compuestos, y en la
utilizacin de la ingeniera gentica para la mejora de las caractersticas de cepas que pueden
tener una aplicacin en biorremediacin de estos compuestos. Los otros dos captulos de esta
seccin abordan temas de agronoma, desde la ptica de las nuevas metodologas que se estn
utilizando para el mejoramiento de las variedades de cultivo y de su rendimiento productivo.
En el captulo Generacin, uso e implementacin de organismos genticamente modificados para fines
agrcolas: el caso del maz en Mxico se analiza el tema de los transgnicos, centrndose en el caso
del maz transgnico en Mxico, y en el captulo Fertilizantes de liberacin lenta y su aplicacin en
campo se describe como diferentes tecnologas basadas en nanotecnologa pueden utilizarse en
una mejor aplicacin de los fertilizantes en campo.
La tercera seccin, Procesos Celulares Fundamentales, est dedicada al anlisis de
algunos procesos fisiolgicos primordiales como la apoptosis o la respuesta inmune, el primero
de estos como ciclo celular y la relacin con la muerte celular fisiolgica siendo un proceso
natural programado, controlado por mecanismos moleculares complejos, cuyo conocimiento
es un objetivo primordial de la biologa y la medicina contempornea y el segundo, explicando
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Dr. Salvador Vega y Len
las interacciones desde el punto de vista molecular del individuo sano y su interrelacin con
agentes antignicos.
La cuarta y ltima seccin, que lleva por ttulo Biomedicina, est dedicada por completo
a esta disciplina, y se abordan diferentes problemas mdicos desde un punto de vista de la
biologa molecular, completndose la seccin con algunos captulos dedicados a aspectos
farmacolgicos. Los dos captulos que abren la seccin se centran en una de las dolencias de
mayor incidencia y progresin en Mxico, la diabetes, analizando aspectos moleculares de la
misma. Varios captulos abordan temas de neurologa, como los carcinomas cerebrales o las
enfermedades neurodegenerativas, centrndose en sus aspectos bioqumicos y moleculares. En
la misma lnea se desarrolla el trabajo Bioqumica de los esteroides y su accin a nivel del sistema nervioso
central. Otros temas tratados en esta seccin son las alteraciones celulares e inmunolgicas en
nios desnutridos, las clulas troncales embrionarias y su importancia de cara al futuro en
el tratamiento de diferentes dolencias, y la epilepsia y su descripcin mediante la dinmica
en electroencefalogramas. Finalmente, tres captulos ms abordan aspectos de farmacologa,
como la farmacocintica y la farmacogenmica. Esta ltima disciplina, que se trata en el
captulo Farmacogenmica: medicina personalizada, est adquiriendo un gran protagonismo en
el paulatino desarrollo de tratamientos personalizados; desde hace mucho tiempo se sabe
que diferentes individuos responden de manera dispar al mismo tratamiento para la misma
enfermedad, y hoy en da las bases genticas y moleculares de estas diferencias comienzan a
dilucidarse y comprenderse.
Como eplogo, el captulo Fronteras de la ciencia y universidad moderna discute los retos que en la
sociedad actual enfrenta la enseanza universitaria, que debe reacomodarse permanentemente
a un desarrollo cientfico y tecnolgico cada vez ms dinmico y veloz.
En sntesis, el capitulado que compone este libro suponen un aporte al conocimiento sobre la
importancia e impacto que las nuevas tecnologas, principalmente la biologa molecular, estn
teniendo en diversos mbitos de las ciencias biolgicas, y esperamos que resulte de utilidad
para muchos profesores e investigadores de nuestra universidad y de otras casas de estudio.
Dr. Salvador Vega y Len.
Rector de la Universidad Autnoma
Metropolitana-Xochimilco
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INTRODUCCIN
Los ltimos avances obtenidos a partir de los anlisis de datos, que se producen a travs de
herramientas incluidas en los campos de la genmica, transcriptmica y protemica, nos
permiten contar con una amplia coleccin de datos, que sin embargo, a veces no permiten
comprender de manera integral los mecanismos e interacciones subyacentes, que regulan las
funciones celulares y los sistemas biolgicos.
Sabemos que las funciones celulares no pueden atribuirse a una sola molcula biolgica, existe
una gran interaccin de los diferentes elementos que se localizan en una clula, como son el
DNA, RNA y protenas, as como molculas qumicas que actan como segundos mensajeros,
de naturaleza muy diferente a los anteriores como es el caso del calcio. La meta ltima de esta
era post-genmica, es llegar a comprender como los componentes estructurales y su dinmica
funcional, pueden intervenir para llegar a hacer funcionar a una clula.
La finalidad de este libro es analizar como una o algunas molculas puede llegar a provocar una
gran variedad de cambios fisiolgicos, que incluyen cambios en las vas metablicas, regulacin
de la expresin de diversas protenas, y establecer los posibles mecanismos que pueden llegar
a provocar estos efectos, incluyendo vas de transduccin de seales y efectos epigenticos,
que podran deberse a nuevas formas de modificaciones en la expresin de genes. Tambin
se intentar al mismo tiempo, vislumbrar el fundamento y alcances de algunas herramientas
tecnolgicas, como la nanotecnologa, que permitan correlacionar los avances tecnolgicos con
los descubrimientos cientficos, y estudiar algunas de sus aplicaciones en campos tan diversos
como la medicina y la agronoma.
La biologa es sin lugar a dudas una de las disciplinas cientficas que en la actualidad y a
lo largo de las ltimas dcadas, ha logrado avances ms significativos, uno de cuyos hitos
ms importantes ha sido la secuenciacin del genoma humano, metindonos de lleno en la
era de la genmica. Estos avances, adems de haber contribuido enormemente a nuestra
comprensin del funcionamiento de los sistemas biolgicos, han tenido adems consecuencias
importantes en nuestras vidas, tanto en temas relacionados con la salud y la medicina como
en la agricultura, ciencias veterinarias, nutricin, etc. La enseanza en el Tronco Comn
Divisional C.B.S., proporciona a los alumnos la base de los mecanismos que subyacen en
todos los sistemas biolgicos que sern objeto de estudio en sus diferentes carreras. Resulta por
ello de gran importancia, que dicha enseanza sea efectuada teniendo en cuenta los ltimos
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Introduccin
avances desarrollados en el campo de la biologa molecular, la genmica y la protemica, a

la luz tambin de otros avances tecnolgicos de gran incidencia en diferentes campos de las
ciencias de la vida, todo ello enfocado hacia una comprensin ms global del funcionamiento
celular y todas las interacciones subyacentes en los procesos biolgicos. Resulta por tanto de
gran importancia, la actualizacin en el conocimiento de las nuevas tcnicas moleculares y lo
que han supuesto para el avance multidisciplinario.
Los Editores
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Sistemas biosintticos, gentica y

regulacin del metabolismo secundario;
nuevas metodologas para su estudio
Definicin de metabolito secundario
Los metabolitos secundarios (MS) son compuestos microbianos y de plantas no esenciales
para el crecimiento y reproduccin de los organismos productores. Cada metabolito secundario es producido por un nmero relativamente limitado de especies y sus genes biosintticos se
encuentran agrupados en el genoma y son dispensables. Los MS tienen a menudo estructuras
qumicas complejas e infrecuentes en la naturaleza, y pueden ser sintetizados como una familia de compuestos muy similares entre s. En microorganismos son habitualmente producidos
al final de la fase exponencial de crecimiento y durante la fase estacionaria.
Estructuras qumicas
Los metabolitos secundarios presentan una enorme diversidad qumica en su composicin
(Martn et al. 2000), dentro de esta diversidad encontramos con frecuencia estructuras qumicas como las que se mencionan a continuacin:
Aminoazcares (aminoglicsidos): contienen unidades de monosacridos y ciclitoles, y son producidos mayoritariamente por Actinomicetos. Ejemplo: la estreptomicina. Frecuentemente poseen actividad antibitica.
Quinonas: funcionan frecuentemente

como molculas seal entre organismos en
la rizosfera (plantas y microorganismos),
especialmente entre races de plantas (alelopata)

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Sistemas biosintticos
Isoprenoides: como por ejemplo la micotoxina tricoteceno, un

sesquiterpeno.
Phenazinas: frecuentes en bacterias como Pseudomonas, Streptomyces, y Pantoea agglomerans. Se relacionan con la virulencia y
competitividad de los microorganismos productores.
Cumarinas: poseen un ncleo de benzo-2-pirona (anillo B). Las aminocumarinas tienen tres
anillos: A (4-hidroxibenzoato), B (benzo-2-pirona), y C (desoxiazcar). El aminocido tirosina es
el precursor de los anillos A y B, mientras que el
anillo C (desoxiazcar) deriva de la Glc-1-P. La
Novobiocina (en la figura) es un inhibidor de la
girasa bacteriana y por tanto un antibitico.
Pptidos no ribosomales: son pptidos lineares o circulares que se sintetizan por complejos enzimticos de
una forma diferente a la sntesis habitual en ribosomas.
Suelen tener tamaos inferiores a los 3000 Da, y en su
estructura es frecuente la presencia de aminocidos inusuales, como -aminocidos, iminocidos, derivados
N-metilo, hidroxiaminocidos y aminocidos en configuracin D. Presentan gran resistencia a la digestin
por proteasas y frecuentemente poseen actividades de
tipo antibitico, como el que se muestra en la figura: la
tirocidina.
Poliktidos: son un grupo de compuestos muy diverso con estructuras

complejas formadas por la adicin
de unidades de acetato o propionato.
Son producidos principalmente por
bacterias del grupo de los Actinomicetos y por hongos. Dentro de los po14
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liktidos encontramos macrlidos (como la anfotericina B en la figura), polienos, tetraciclinas,

aflatoxinas y otros muchos tipos de compuestos con actividades diversas.

Nuclesidos: como las Nikkomicinas (peptidil-nuclesidos): son competidores especficos de la quitina
sintasa debido a su similitud estructural con la UDPN-acetilglucosamina, que es el sustrato natural de la
enzima, por lo cual poseen actividades antifngicas,
insecticidas y acaricidas.
Implicaciones de las estructuras qumicas de los metabolitos secundarios

Esta enorme diversidad en las estructuras de los MS tiene importantes implicaciones en cuanto a su modo de biosntesis y la utilidad que presentan para el ser humano, podemos resumirlas de la siguiente forma:
Complejidad. La complejidad de las estructuras qumicas de los MS requiere sistemas enzimticos complejos, cuyos genes se agrupan en forma de clusters. Dichos clusters biosintticos
para un determinado metabolito secundario estn presentes slo en un grupo reducido de
especies, por lo general relacionadas, que sintetizan diferentes variantes qumicas del metabolito.
Familias de compuestos. Los MS suelen producirse como familias de compuestos similares
por un mismo microorganismo, esto es debido principalmente a la baja especificidad enzimtica (broad substrate specificity) de las enzimas que participan en sus rutas biosintticas. Como
ejemplo podemos mencionar cepas de Streptomyces sp. que producen hasta 32 antibiticos del
tipo antraciclina (un poliktido) muy similares.
Multitud de actividades biolgicas. La complejidad y enorme variabilidad de sus estructuras
qumicas hacen que los metabolitos secundarios posean una gran cantidad de actividades
biolgicas diferentes. Muchas de ellas son de utilidad para el hombre, y muchos MS se utilizan en la prctica clnica como antibiticos (penicilina, tetraciclinas, novobiocina) antitumorales (taxol), anticolesterolmicos (lovastatina), etc. En otras ocasiones son txicos para
las clulas humanas, como ocurre con las micotoxinas (ocratoxina, aflatoxinas), que pueden
aparecer sobre alimentos debido al desarrollo de hongos sobre los mismos.
Funcin de los metabolitos secundarios en la naturaleza
La funcin que los MS tienen para el organismo productor ha sido un punto de controversia
frecuente. Los principales puntos de vista que se han dado sobre su funcin en la naturaleza
se resumen en los siguientes:
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1- Posesin de una actividad biolgica, predominantemente de tipo antibitico, que confiere

a los productores una ventaja competitiva sobre otras especies.
2- Mecanismo para convertir intermediarios del metabolismo primario, que se acumulan al
llegar la fase estacionaria de crecimiento y pueden resultar txicos, en compuestos inocuos
(MS), permitiendo a su vez que parte del metabolismo primario permanezca operativo en
periodos de stress metablico.
3- Sistema que tiene un microorganismo para sustraer nutrientes del medio en periodos de
escasez y de esta forma evitar que sean utilizados por competidores, a la vez que sintetiza
compuestos (MS) no utilizables como nutrientes por los competidores y que en muchos casos
son txicos para ellos. Esta hiptesis est en parte relacionada con la 1.
4- Los MS seran seales de comunicacin intercelular del tipo quorum sensing.
La hiptesis 4 ha sido demostrada para algunos metabolitos secundarios, aunque no para la
mayora. Hoy en da la hiptesis 1 es la ms ampliamente aceptada, sin descartar la 3, que
es complementaria de la anterior. Evidencias en favor de la hiptesis 1 son las siguientes: 1)
Slo organismos que carecen de sistema inmune producen MS (plantas y microorganismos),
que actuaran como un sistema de defensa. 2) A menudo los genes de resistencia para un
determinado antibitico se encuentran agrupados en un cluster con los genes biosintticos,
lo que demuestra la actividad de estos compuestos en condiciones naturales. 3) La extrema
complejidad y gasto energtico de la biosntesis de MS sugiere que stos tienen funciones que
otorgan ventajas competitivas a los productores.
Sin embargo, a pesar de todas estas evidencias, se observa que la mayora de los MS no parecen tener ninguna actividad biolgica en el momento de testarlos frente a diferentes microorganismos. Firn y Jones (2000) propusieron un modelo para explicar esta aparente paradoja,
razonando que aunque es difcil que una nica molcula posea en un momento determinado
de la evolucin actividad biolgica frente a organismos competidores, resulta conveniente
para el productor la posesin de la maquinaria biosinttica de los MS, ya que una simple mutacin, o la adquisicin de un gen pueden generar, gracias a la baja especificidad de sustrato
de las enzimas implicadas en su biosntesis, una nueva serie de compuestos, multiplicndose
de esta forma la posibilidad de que alguno de ellos resulte eficiente frente a otros organismos.
La ventaja selectiva estara en la posesin de una maquinaria biosinttica capaz de generar
un elevado y cambiante nmero de estructuras, y no en la capacidad de sintetizar una determinada y nica estructura.
Biosntesis de los metabolitos secundarios
Los metabolitos secundarios se sintetizan a partir de intermediarios del metabolismo primario. En microorganismos se producen durante la idiofase, esto es, despus de que el cultivo
ha finalizado su fase exponencial de crecimiento y se encuentra en la fase estacionaria, en
contraste con la trofofase o fase de crecimiento.
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Pueden subdividirse las reacciones enzimticas que dan origen a los metabolitos secundarios
en 4 grupos (Martn et al. 2000):
I- Reacciones de conversin de metabolitos primarios en precursores especficos del metabolismo secundario
II- Reacciones que comprometen los precursores hacia rutas especficas del metabolismo secundario (p.ej. mediante activacin o modificacin)
III- Reacciones de polimerizacin y condensacin, que dan lugar a poliktidos, pptidos,
isoprenoides, etc
IV- Reacciones tardas (a posteriori) de modificacin
El orden de los dos primeros grupos de reacciones (I. conversin en precursores y II. reacciones de compromiso) puede variar, a veces la primera reaccin de conversin es una modificacin que introduce al intermediario en una va de metabolismo secundario.
Como cabra esperar, existe una gran diversidad en las rutas biosintticas de los MS. Dos de
los ms representativos sistemas enzimticos, exclusivos del metabolismo secundario, son los
que se describen a continuacin: pptido sintetasas y poliktido sintetasas
Pptido Sintetasas: son complejos multienzimticos estructurados en mdulos y dominios
(Fig. 1). Cada uno de los mdulos selecciona y activa un aminocido que formar parte de
la estructura del pptido. Cada mdulo est a su vez constituido por una serie de dominios
con diferentes funciones: dominio de adenilacin (activacin del aminocido mediante la formacin de un derivado adenilado), peptidyl carrier (en el cual est presente como cofactor una
molcula de fosfopantetena, que transporta el aminocido activado al siguiente dominio),
dominio de condensacin (forma el enlace peptdico entre dos aminocidos). Estos 3 dominios
constituyen un mdulo mnimo, junto a ellos pueden aparecer otros en algunos mdulos,
responsables de modificaciones qumicas en los aminocidos incorporados: p. ej. dominio
epimerasa, dominio metil-transferasa, dominio de ciclacin, etc.
Figura 1. Estructura en mdulos y dominios de las pptido sintetasas (modificado de Gutirrez et al.
2002; y Konz et al. 1997). -(L--aminoadipil)-L-cisteinil-D-valina sintetasa (ACVS), gramicidina sintetasa (GS), tirocidina sintetasa (TY), bacitracina sintetasa (BS)
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Poliktido sintetasas: Las poliktido sintetasas (PKS) tienen un funcionamiento semejante al de las cido graso sintetasas, con la salvedad de que en estas ltimas los intermediarios son totalmente reducidos, mientras en los poliktidos algunas reacciones reductoras
no se dan en los diferentes intermediarios, pudindose originar entonces una gran variedad
de compuestos.
Todos los poliktidos estn formados por unidades bsicas de 2, 3 o 4 carbonos: acetato (derivado del malonil-CoA), propionato (del metilmalonil-CoA) o ms raramente butirato (del
etilmalonil-CoA). Estn unidades se van agregando en sucesivos ciclos (condensacin descarboxilativa), en cada uno de los cuales se llevan a cabo una, varias o ninguna de las siguientes
actividades: cetorreduccin, deshidratacin y enoilrreduccin.
Las PKS se organizan tambin en forma de mdulos y dominios. Cada uno de los mdulos
incorpora y modifica una unidad de acetato, propionato o butirato. Los dominios que constituyen un mdulo bsico de una poliktido sintetasa son: Cetosintasa (KS), Aciltransferasa
(AT) y Acyl-carrier, con un cofactor de fosfopantetena (ACP). Junto a stos pueden aparecer
dominios para reducir el O de cada unidad incorporada: cetorreductasa (KR), deshidratasa
(DH), enoil reductasa (ER), y otros dominios con diferentes funciones: metiltransferasa (MT),
ciclasa (CYC), y tioesterasa (TE).
Las poliktido sintetasas pueden dividirse en dos tipos:
PKS modulares o de tipo I: consisten en una enzima modular multifuncional (Fig. 2), en cada
dominio cataltico se lleva a cabo una funcin una sola vez durante la sntesis, hasta que se
completa la estructura definitiva. Son ms verstiles que las de tipo II en cuanto a los sustratos
que utilizan, y dan lugar a estructuras moleculares complejas, a menudo cclicas (macrlidos).
PKS iterativas o de tipo II: consisten en un complejo multiproteico donde cada polipptido
lleva a cabo una nica actividad enzimtica y es utilizado varias veces en sucesivas rondas,
incorporando una nueva unidad cada vez, hasta completar la molcula final. Forman metabolitos secundarios con estructuras de anillos aromticos, como las tetraciclinas. Usan casi
exclusivamente acetato y malonil-CoA.
Por lo tanto, existen muchas fuentes de variabilidad para generar las muy diversas estructuras
de los poliktidos:
- El nmero de unidades (acetato, propionato) incorporadas, que determinar el tamao de
la molcula
- El tipo de unidad iniciadora (suele ser acetato) y extensoras
- Las actividades de cetorreduccin, deshidratacin y/o enoilrreduccin que se llevan a cabo
en cada unidad incorporada, lo que da lugar a diferentes estados de oxidacin (grupos hidroxilo, cetona) y dobles enlaces
- La presencia de residuos aminoacdicos en algunos poliktidos (rapamicina, virginiamicina); hay una interaccin entre la poliktido sintasa y una pptido sintetasa no ribosomal
- Las modificaciones a posteriori: oxidaciones, glicosilaciones, metilaciones
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Figura 2. Esquema general del mecanismo de biosntesis de una poliktido sintetasa (modificado de
Aparicio et al. 2002). Las lneas discontinuas representan cortocircuitos de la ruta que pueden ocurrir
en un determinado ciclo para dar lugar a (a) ceto, (b) hidroxi, (c) enoil, (d) metileno, diferentes estados
de reduccin en la estructura final del poliktido. Dominios: AT, aciltransferasa; ACP, acyl carrier protein;
KS, cetosintasa; KR, cetorreductasa; DH, deshidratasa; ER, enoilrreductasa; TE, tioesterasa.
Gentica de la biosntesis de metabolitos secundarios

En los procariotas es frecuente que los genes pertenecientes a una determinada va, anablica
o catablica, se encuentren agrupados, habitualmente disponindose en forma de un opern.
En eucariotas esto es mucho ms infrecuente, sin embargo los genes de determinadas vas metablicas fngicas s se encuentran agrupados (Keller y Hohn, 1997). Estas vas metablicas
son por lo general dispensables, aunque pueden ser importantes en la supervivencia del hongo
ya que funcionan normalmente en condiciones subptimas o limitantes de crecimiento. La
mayora de estas vas encajan en dos grandes grupos:
1- Vas catablicas para la utilizacin de fuentes de nutrientes poco usuales (etanol, prolina,
nitrato).
2- Vas biosintticas de metabolitos secundarios
Las razones por las cuales los genes de las rutas del metabolismo secundario se encuentran
agrupados se relacionan probablemente con la regulacin simultnea de los mismos, como
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ocurre en el caso de los genes de aflatoxina regulados por LaeA en A. nidulans (Bok y Keller,
2004), regulacin que se ha propuesto es de tipo epigentico, por modificacin de la estructura de la cromatina (Bok et al. 2006a).
Los antibiticos -lactmicos son producidos tanto por organismos procariotas (Streptomyces)
como por hongos (Penicillium chrysogenum, Aspergillus nidulans, Acremonium chrysogenum). El origen
de los genes biosintticos de -lactamas es procariota, y existen importantes evidencias de
que algunos de estos genes fueron transferidos horizontalmente a los hongos (Brakhage et al.
2005). Diferentes especies de hongos han desarrollado sus propias vas metablicas combinando la accin de las enzimas codificadas por los genes de origen procariota con otras de
origen eucariota, para producir antibiticos -lactmicos diferentes a los sintetizados por las
bacterias, como la penicilina (P. chrysogenum, A. nidulans) y la cefalosporina (A. chrysogenum).
Resulta interesante observar como los genes de origen eucariota, como el gen penDE en P.
chrysogenum y los genes cefD1, cefD2 y cefG en A. chrysogenum, han llegado a agruparse con los de
origen procariota para formar los clusters biosintticos de penicilina y cefalosporina respectivamente (Fig. 3), es decir, evolutivamente se ha favorecido la agrupacin de estos genes de origen diferente, lo que evidencia que existe una presin selectiva en favor de este agrupamiento
y que la formacin de clusters de los genes -lactmicos fngicos tiene un sentido funcional, y
no es nicamente una herencia de la transferencia horizontal desde bacterias.
Los clusters de genes del metabolismo secundario suelen incluir, junto a los genes responsables
de la biosntesis del compuesto, genes de transporte, reguladores, y en procariotas frecuentemente genes de resistencia si el compuesto tiene actividad antibitica (Liras, 1999)
Figura 3. Estructura de los clusters de genes biosintticos de -lactamas en procariotas y eucariotas.

pcbAB y pcbC son genes de origen procariota transferidos horizontalmente desde procariotas a los hongos. Los genes de origen eucariota se indican en color gris, y los de origen procariota en negro.
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Existen no obstante algunas excepciones a la regla general de la agrupacin de los genes de

las rutas del metabolismo secundario. Por ejemplo en el caso de los genes biosintticos de
melanina se observa que en la mayora de los hongos donde se han estudiado slo unos pocos
de los ellos estn agrupados, siendo posiblemente Aspergillus fumigatus el ms prximo a un
ancestro comn al observarse una agrupacin con la mayora de los genes (Tsai et al. 1999).
Regulacin de la biosntesis de metabolitos secundarios
En procariotas se han encontrado claras evidencias de la relacin entre la biosntesis de
metabolitos secundarios y otros procesos morfolgicos asociados, como el desarrollo de micelio areo y la esporulacin. Se han identificado molculas denominadas autorreguladores,
como el factor A de Streptomyces griseus, una butirolactona, que acta como una seal de comunicacin intercelular que regula simultneamente el desarrollo morfolgico y la produccin de estreptomicina (Horinouchi y Beppu, 1994). Las butirolactonas son reconocidas por
protenas receptoras de butirolactonas (GBRP) que regulan negativamente la expresin de
genes que participan en estos procesos; la unin de la molcula de butirolactona al receptor
permite la expresin de estos genes, que dirigen entonces la respuesta celular de produccin
de metabolitos secundarios y esporulacin.
Otras molculas autorreguladoras que controlan la produccin de metabolitos secundarios
y no pertenecen al grupo de las butirolactonas se han encontrado en varias especies bacterianas, por ejemplo en Streptomyces natalensis, donde el factor PI, de naturaleza hidroflica,
sealiza la produccin de pimaricina (Recio et al. 2004).
Los genes del metabolismo secundario en procariotas son frecuentemente regulados por factores de transcripcin del tipo denominado SARP (Streptomyces Antibiotic Regulatory Proteins), como por ejemplo AfsR, un regulador general del metabolismo secundario de S. coelicolor (Lee et al. 2002), o CcaR, que regula la biosntesis de cefalosporina y cido clavulnico
en S. clavuligerus (Santamarta et al. 2005).
En eucariotas los genes del metabolismo secundario se regulan por dos tipos de factores
transcripcionales: 1) narrow domain regulators, que son especficos de cada ruta, como por ejemplo AflR que regula la biosntesis de esterigmatocistina en A. nidulans, o Cmr1, que regula la
biosntesis de melanina en Colletotrichum, y 2) broad domain regulators, que son reguladores generales del metabolismo, como por ejemplo PacC, que regula genes expresados en condiciones
de pH alcalino y adems los genes de la ruta de penicilina en Aspergillus nidulans y Penicillium
chrysogenum (Brakhage, 1998).
Recientemente se ha caracterizado la protena LaeA en Aspergillus nidulans y Aspergillus fumigatus. LaeA es un regulador general de todo el metabolismo secundario en hongos, y se ha
propuesto que su funcin puede ser la remodelacin de la cromatina mediante su actividad
metiltransferasa (Keller et al. 2005). Este tipo de regulacin epigentica puede ser uno de los
motivos de que los genes del metabolismo secundario se agrupen en clusters en los hongos.
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Tambin en eucariotas se ha encontrado que existe una coordinacin entre la produccin de

metabolitos secundarios y el desarrollo morfolgico que conduce al proceso de esporulacin
asexual o conidiacin (Calvo et al. 2002). Las subunidades de protenas G heterotrimricas
fngicas participan en una ruta de transduccin de seales que controla la conidiacin y la
produccin de metabolitos secundarios como la esterigmatocistina en A. nidulans (Hicks et
al. 1997). Sin embargo, estas subunidades regulan de forma diferente distintos metabolitos
secundarios, ya que por ejemplo en A. nidulans, la subunidad FadA regula negativamente la
esterigmatocistina pero positivamente otros metabolitos secundarios como la penicilina (Tag
et al. 2000). En Penicillium chrysogenum se ha observado que la subunidad Pga1, homloga a
FadA, regula negativamente la conidiacin (Garca-Rico et al. 2007; Garca-Rico et al. 2008)
y a la vez estimula la produccin de penicilina, demostrando que la funcin de estas subunidades est bastante conservada en los hongos.
Nuevas metodologas en el anlisis del metabolismo secundario
Las nuevas tecnologas de la era de la genmica han permitido avances considerables en el
estudio de la gentica del metabolismo secundario, facilitando el descubrimiento de nuevos
clusters de genes biosintticos, su organizacin y ubicacin cromosmica, as como el anlisis de la regulacin y expresin coordinada de los genes. A continuacin se mencionan tres
ejemplos en los que la genmica y la tecnologa de microarrays han sido aplicadas al estudio del
metabolismo secundario en procariotas y en eucariotas.
Proyectos genoma y localizacin de clusters de genes biosintticos. La secuenciacin
de genomas completos de bacterias y hongos ha permitido la identificacin de nuevos clusters
del metabolismo secundario, responsables de la biosntesis de MS cuya produccin por parte de la especie analizada era en ocasiones desconocida, revertiendo as el orden clsico de
analizar en primer lugar la produccin de compuestos y sus intermediarios y a continuacin
clonar los genes biosintticos.
La secuenciacin del genoma de Streptomyces avermitilis ha permitido tener un panorama completo de todos los clusters de genes involucrados en su metabolismo secundario (Omura et al.
2001). Se encontraron un total de 25 clusters en un genoma de 8.7 Mb, lo que representaba
un 6.4% del total del genoma. Entre ellos se observaron 4 clusters para pigmentos tipo melanina, 11 para la biosntesis de poliktidos (8 de tipo I y 2 de tipo II) y 10 clusters para pptido
sintetasas. La secuencia de estos genes permiti deducir la funcin de muchos de los mdulos
y dominios de las PKS y las NRPS, y en este ltimo caso pudo identificarse en los mdulos
correspondientes el aminocido que se activara.
En ocasiones el descubrimiento de clusters del metabolismo secundario se ha producido mediante genmica comparativa, como en el caso del cluster de los genes biosintticos de gliotoxina en Aspergillus fumigatus, identificados por homologa con los genes de biosntesis de
sirodesmina de Leptosphaeria maculans (Gardiner y Howlett, 2005).
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Uso de microarrays para analizar la expresin y delimitar clusters del metabolismo secundario. Cuando se ha caracterizado el gen regulador de una ruta del metabolismo
secundario y se dispone de mutantes inactivados de dicho gen, pueden llevarse a cabo anlisis
comparativos mediante microarrays utilizando cDNA de la cepa silvestre y de la cepa mutante
como sondas, los cuales nos darn mucha informacin sobre cmo se lleva a cabo la regulacin de la expresin de los genes del MS, adems de servirnos para 1) delimitar los extremos
de un cluster, y 2) localizar genes involucrados en la biosntesis aunque no estn agrupados con
el resto del cluster. Esta metodologa se utiliz exitosamente en Streptomyces coelicolor para analizar los genes biosintticos de actinorrodina, undecilprodigiosina y el antibitico dependiente
de Ca (Huang et al. 2001), y en Aspergillus parasiticus para localizar tres genes relacionados con
la biosntesis de aflatoxina que no se encontraban agrupados con el resto del cluster, utilizando
un mutante delecionado en el gen aflR, el cual codifica un factor transcripcional que regula
la expresin de los genes de aflatoxina (Price et al. 2006).
Genome mining. Este trmino se refiere en general al hallazgo de nuevos genes involucrados en determinadas rutas o procesos mediante anlisis genmico. Bok et al. (2006b) desarrollaron un interesante mtodo de genome mining consistente en la utilizacin de mutantes laeA
en el hongo Aspergillus nidulans. El gen laeA, como se mencion con anterioridad, es un regulador de todo el metabolismo secundario de Aspergillus, por lo que su ausencia mantiene reprimidos los genes involucrados en el metabolismo secundario. De esta forma se identific un
nuevo cluster para un MS no descrito previamente en Aspergillus, el antitumoral terrequinona.
Conclusiones
Los metabolitos secundarios son una de las principales fuentes de frmacos en la actualidad.
Los conocimientos sobre los mecanismos enzimticos y los genes responsables de su biosntesis han permitido la aplicacin de tcnicas biotecnolgicas para la mejora de su produccin a
nivel industrial. En la actualidad, la investigacin sobre el metabolismo secundario ha experimentado un empuje de gran relevancia gracias a las nuevas tcnicas derivadas de la genmica, que han permitido la identificacin de un gran nmero de clusters biosintticos nuevos,
as como su delimitacin y el estudio de su regulacin.
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Metabolitos secundarios de actinomicetos

I. Metabolitos secundarios
Los metabolitos secundarios son molculas sintetizadas por determinados organismos,
principalmente plantas y microorganismos, en este ltimo caso normalmente se producen en
una fase tarda de su ciclo de crecimiento. Las caractersticas generales de los metabolitos
secundarios son (Demain y Fang, 2000; Shapiro, 1989):
No son necesarios para el crecimiento del microorganismo que los produce. En estado
natural, sus funciones se hallan ligadas a la supervivencia de la especie.
Cada uno de estos compuestos es producido por un grupo muy reducido de organismos.
Generalmente se producen como mezclas de productos muy relacionados qumicamente
entre s. Por ejemplo, una nica cepa de una especie del gnero Streptomyces produce 32
antraciclinas diferentes.
La produccin puede perderse fcilmente por mutacin espontnea, particularmente
cuando son sacados de su hbitat natural, por esta razn son muy importantes las tcnicas
de conservacin de estos microorganismos.
Dentro de los metabolitos secundarios ms importantes se encuentran los antibiticos, toxinas
(micotoxinas), feromonas, inhibidores enzimticos, agentes inmunomoduladores, antagonistas
y agonistas de receptores, alcaloides (cido lisrgico), pesticidas, agentes antitumorales,
promotores del crecimiento en animales y plantas (giberelinas) y pigmentos. Esta gran
variedad de compuestos producidos en la naturaleza se ve reflejada en cerca de los ms de
23,000 metabolitos microbianos conocidos, de los cuales el 42% los producen hongos, 32%
actinomicetos y el resto producidos por otros grupos de bacterias (Lazzarini et al., 2000).
Los metabolitos secundarios mejor conocidos son los antibiticos, de los que se han descubierto
ms de 5000, cifra que aumenta a razn de una media aproximada de 300 por ao, aunque
la mayora carecen de utilidad pues son txicos para blancos no deseados. Aproximadamente
el 75% de los antibiticos conocidos son producidos por actinomicetos (Challis y Hopwood,
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Metabolitos secundarios
2003; Demain y Fang, 2000). Algunas especies son excepcionales productores de antibiticos,
por ejemplo Streptomyces griseus produce al menos 40 antibiticos diferentes.
II. Un poco de historia
Desde la aparicin de las civilizaciones urbanas comenz a desarrollarse un amplio nmero
de remedios teraputicos, se intent racionalizar su utilizacin y comprender sus efectos
teraputicos, dentro todava de una concepcin poco racionalizada de la accin medicamentosa
(Lozoya y Lozoya, 1982).
Los mdicos egipcios utilizaron una amplia variedad de frmacos con fines antiparasitarios
y antispticos y las investigaciones realizadas acerca de algunas sustancias o preparaciones
descritas en los papiros han permitido descubrir un cierto conocimiento emprico del fenmeno
de la antibiosis. As lo demuestra la utilizacin en preparados de aplicacin tpica de levadura
de cerveza, la cual contiene principios activos contra el estafilococo dorado, microorganismo
involucrado en la forunculosis, el imptigo y otras infecciones dermatolgicas; tambin da
prueba de ello el uso de pan fermentado prescrito en algunas frmulas para el tratamiento
de heridas purulentas, afecciones intestinales y urinarias, cuyo efecto beneficioso se deba a
la presencia de mohos con capacidad antibitica (Demain y Fang, 2000; Garca-Rodrguez
et al., 1998).
Por su parte, los aztecas tuvieron vastos conocimientos en la herbolaria, y su legado es tan
importante, que la herbolaria mexica ha sido considerada como una de las ms importantes
del mundo. A pesar de que empricamente utilizaron algunas medicinas, fueron muy eficientes
en el tratamiento de enfermedades, por ejemplo, para dolores de estmago y diarreas muy
severas, utilizaban agua con cal; para el tratamiento de algunas infecciones, utilizaron maz
agrio; en la actualidad los cientficos han estudiado las propiedades de este, y han demostrado
que contiene penicilina (Lozoya y Lozoya, 1982).
Pero no fue sino hasta 1895, que Tiberio observ la accin antibitica de diferentes extractos
de hongos (Aspergillus, Mucor, Penicillium) frente a diversos microbios in vitro (bacteridia, bacilo
tfico, colibacilo, vibrin colrico, estafilococos) e in vivo (ensayos con conejos inoculados con
bacilos tficos colricos), y en 1896, E.A. Duchesne atribuy esta accin a la produccin de
determinadas sustancias txicas. Ese mismo ao, B. Gossio utiliz, por primera vez, el hongo
Penicillium glaucum en un intento fallido de producir una sustancia antibacteriana y el propio
Duchesne hizo notar que algunos grmenes patgenos, como el bacilo de Eberth, podan ser
inhibidos incluso in vivo por Penicillium.
La irrupcin de la penicilina en la teraputica antiinfecciosa supuso un punto de inflexin
histrico al cambiar los modos teraputicos al uso, resolver espectacularmente situaciones
mortales y evitar complicaciones graves a partir de accidentes banales, que antes de los aos 40
conferan a la vida una mayor incertidumbre. La penicilina se convirti en algo providencial,
milagroso en aquella poca, y simboliza el comienzo de la era antibitica. Fue adems un
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modelo de planificacin de tcnicas, de ensayos y de errores del que se aprendi para el

desarrollo de las molculas que le siguieron en una vertiginosa carrera que fue acelerndose
hasta llegar a nuestros das (Garca-Rodrguez et al., 1998).
El descubrimiento de la penicilina est asumido como un hecho casual, fortuito, al que se ha
rodeado de una romntica y atractiva leyenda. Nada ms lejos de la realidad. Sera incluso
una injusticia cientfica y una agresin a los personajes que han hecho historia, incluidos los
cientficos ligados a la penicilina. No hay un solo descubrimiento en la historia de la ciencia que
no estuviera precedido de la slida formacin cientfica del investigador o los investigadores, de
duros trabajos previos, errores corregidos, obstculos superados y xitos parciales no siempre
reconocidos.
La descripcin del descubrimiento de la penicilina como la observacin casual por Fleming de
un moho contaminante requiere las siguientes aclaraciones:
No era la primera vez que se observaba y se describa este fenmeno.
Fleming describe el fenmeno tras estudiar todos los cultivos que haba reservado para su
observacin durante unas vacaciones, como haca habitualmente.
La contaminacin es una realidad habitual en cualquier laboratorio.
Pero muy pocas personas como Fleming tenan los conocimientos necesarios para interpretar
la actividad biolgica del hongo y la curiosidad cientfica e inters prctico en sus trabajos para
profundizar en el tema.
Del aire lleg Penicillium y de la tierra los actinomicetos. Los microbilogos ms interesados por
los microorganismos que habitan la tierra saben las dificultades que tienen los microorganismos
patgenos para convivir con aqullos. sta fue la razn por la que S. Waksman y R. Dubos
pensaron que deba existir algn antagonismo entre ambos, lo que favorecera una rpida
destruccin del patgeno. El estudio de los microorganismos del suelo fue una lnea de
investigacin permanente y principal en la vida de Waksman. ste haba nacido en Ucrania en
1888, emigrando a EE.UU. en 1910. All comenz su carrera como microbilogo agrcola y sus
primeros trabajos se dirigieron al conocimiento de los hongos y las bacterias que intervienen
en la fertilizacin de la tierra. Waksman identific muchos de estos microorganismos como
actinomicetos, aislando y estudiando un gran nmero de ellos, entre los que destaca el
hallazgo en 1915 del Streptomyces griseus, del que en 1943 se obtendra la estreptomicina. Este
microorganismo tambin haba sido descrito en 1914 por A. Krainsky. El descubrimiento del
antibitico lo realizaron A. Schatz y S. Waksman, a partir de una cepa aislada de la garganta
de un pollo, y se public en 1945. El cultivo original no produca estreptomicina y fue su
irradiacin y mutacin lo que condujo a la elaboracin de dicho antibitico. La actividad de
este antibitico sobre Mycobacterium tuberculosis abri una etapa extraordinaria en el control de
esta enfermedad y por ello Waksman recibi en 1952 el Premio Nobel de Medicina.
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En el camino hacia el descubrimiento de la estreptomicina hay un acontecimiento importante.

ste fue la identificacin de la tirotricina, a partir de Bacillus brevis, por Ren Dubos, un discpulo
de Waksman. Aunque este antibitico era txico despert grandes expectativas sobre los
microorganismos del suelo y su aplicacin en la teraputica. Waksman pens en los hongos y
actinomicetos como los ms efectivos. En 1939, una compaa farmacutica ofreci al investigador
un gran patrocinio, con medios qumicos y de equipamiento y animales de experimentacin,
para continuar su estudio sobre antibiticos del suelo en la Rutgers University (Nueva Jersey).
Una de las primeras sustancias identificadas fue la actinomicina A, en 1940. Con ella se relacion
posteriormente la actinomicina D, de aplicacin en la enfermedad de Hodgkin. Con la entrada
de EE.UU. en la II Guerra Mundial, el ejrcito americano plante la necesidad de contar con
una gran cantidad de medicamentos para tratar las infecciones de los soldados heridos. El
grupo de Oxford haba conseguido la penicilina con unos medios econmicos y personales muy
limitados. En contraste, Waksman dispuso de grandes posibilidades para su investigacin. Si la
penicilina representaba un buen frmaco para las infecciones por grmenes Gram positivos,
haba que buscar una alternativa eficaz ante aquellos otros microorganismos, generalmente Gram
negativos, que no cubra este antibitico. En 1942, Waksman, en colaboracin con H. Woodruff,
aisl la estreptotricina del Streptomyces levendulae. Era el primer compuesto de la familia, aunque
su toxicidad impidi la aplicacin en humanos. El trabajo les llev a probar miles de cultivos; de
ellos, seleccionaron cien sustancias, ms tarde tan slo diez y, de ellas, nicamente una prob ser
un excelente agente. Haba sido descubierta la estreptomicina. Rpidamente se potenciaron los
estudios a gran escala bajo la vigilancia del National Research Council. La estreptomicina fue el
primer antibitico en el mundo financiado con fondos privados. Con l se iniciaba la familia de
los aminoglucsidos (Demain y Fang, 2000).
La investigacin de los microorganismos del suelo continuaba. Pronto una gran variedad de
antibiticos iba a surgir a partir de los habitantes de la tierra. El mundo de la terapia antiinfecciosa
se enriquecera con substancias como el cloranfenicol, la gentamicina, las tetraciclinas, los
macrlidos, la fosfomicina, la rifampicina, la novobiocina, etc. (Demain y Fang, 2000).
III. Actinomicetos
Los Actinomicetos son un grupo de bacterias filamentosas, generalmente Gram positivas, que
forman filamentos ramificados. Como resultado de un adecuado crecimiento y ramificacin,
se forma una estructura ramificada de filamentos, denominada pseudomicelio, mismo que an
siendo de dimensiones bacterianas es anlogo al micelio que forman los hongos filamentosos.
Muchos actinomicetos forman esporas. Responden al oxgeno en diferentes formas, pues las
hay aerobias y anaerobias, dependiendo de la especie. Los actinomicetos son microorganismos
quimiorganotrficos (Shapiro, 1989).
Algunas caractersticas relevantes de los Actinomicetos son:
Predominan en forma libre en suelos secos y clidos en cantidades de millones por cada
gramo de suelo.
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Son capaces de degradar muchas sustancias complejas y consecuentemente juegan un

papel muy importante en la qumica del suelo.
La composicin de bases del DNA de todos los miembros de los Actinomicetos caen dentro
de un lmite relativamente estrecho de 63 a 78% G + C y tienen el porcentaje de G + C
ms alto de cualquier bacteria.
Los gneros predominantes de este grupo son Nocardia, Streptomyces y Micromonospora.
Son los causantes del olor caracterstico a tierra mojada, originado por la produccin de
una serie de metabolitos de estreptomiceto denominados geosminos. Estas sustancias son
compuestos de sesquiterpenoides, anillos de carbono insaturados, oxgeno e hidrgeno.
La primera geosmina descubierta tiene el nombre qumico de trans-1,10-dimetil-trans9-decanol. Las tierras alcalinas y neutras son las ms favorables para el desarrollo de
Streptomyces que los suelos cidos.
La propiedad ms notable, es el grado en que producen antibiticos. Est comprobado
que ms de 500 sustancias antibiticas distintas son producidas por ellos, las cuales
tienen mltiples aplicaciones en medicina, veterinaria y agricultura. Muchos antibiticos
producidos son eficaces en el control de bacterias patgenas o infecciosas (Challis y
Hopwood, 2003).
IV. Estimuladores del metabolismo secundario de actinomicetos
Se cree que el agotamiento de los nutrientes y/o descenso de la velocidad de crecimiento genera
seales que producen una cascada de eventos regulatorios que conducen a la diferenciacin
qumica (metabolismo secundario). La seal es a menudo una molcula inductora de bajo peso
molecular (factor auto-regulador) que se une a una protena reguladora (protena represora/
protena receptora) que impide el metabolismo secundario durante el crecimiento exponencial
y en presencia de exceso de nutrientes. Estas seales activan probablemente un gen maestro
que acta a nivel de traduccin, el cual codifica para un tRNA raro y para un factor de
transcripcin positivo (Demain, 1989; Grfe, 1989).
Durante las pasadas tres dcadas, diversas categoras de compuestos orgnicos biolgicamente
activos han sido estudiados por su posible efecto sobre la biosntesis de metabolitos
secundarios. Estos grupos incluyen vitaminas, intermediarios metablicos, inhibidores
enzimticos, antibiticos y otras clases de agentes medicinales. Para el caso particular de la
rifamicina se ha aislado un compuesto inductor denominado factor-B (Azuma et al., 1990).
Este compuesto se reporta como un elemento regulatorio esencial para la induccin de la
biosntesis de rifamicina B, lo cual fue demostrado mediante el uso de mutantes deficientes
en la sntesis del antibitico. Esta deficiencia fue revertida en un medio que contena extracto
de levadura, de donde posteriormente fue purificado el factor-B. Finalmente se identific
mediante anlisis estructural y sntesis qumica como 3-(1-butilfosforil) adenosina. Se
determin tambin que la concentracin de factor-B requerida para inducir la biosntesis
del antibitico es extremadamente baja, alrededor de 10 ng/mL. Kawaguchi et al. (1988)
encontraron tambin el factor-B en la cepa progenitora. Por su parte, Azuma et al. (1990)
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reportaron que una ribonucleasa cataliza la biosntesis del factor-B a partir de RNA en
presencia de butanol y 2, 3-cAMP.
Otro compuesto que da una marcada respuesta estimulatoria, pero de origen exgeno, es el
5, 5-dietilbarbiturato (barbital o veronal), el cual fue primeramente reportado por Ferguson
et al. (1957), quienes observaron que a una concentracin ptima de 13.5 mM, en un
medio sinttico y adicionado al momento de la inoculacin, se obtiene consistentemente un
incremento de cuatro veces en la produccin de estreptomicina por S. griseus. Otros barbituratos
hipnticos, como los derivados 5-etil-5-fenil y 5, 5-dietil-1-metil, no fueron activos, sin
embargo, en aquellos anlogos del barbital que conservaron la substitucin dialquil en el C-5
de la molcula, si mostraron actividad inductora. En estudios posteriores sobre la biosntesis
de estreptomicina (Heding y Gurtu, 1977), el barbital no increment la produccin de una
cepa industrial altamente productora de S. griseus, tanto en medio definido como en medio
complejo. El resultado fue similar con una cepa semi-industrial, sin embargo con una cepa
posterior en medio complejo, a una concentracin de barbital de 8.14 mM, la produccin de
estreptomicina se increment en un 29% (Heding y Gurtu, 1977). Otro aspecto interesante
es el hecho de que el barbital de alguna manera evit o antagoniz el efecto inhibitorio de la
quinacrina y del 2, 4-dinitrofenol sobre la biosntesis de estreptomicina por S. griseus.
En un sistema diferente, con Streptomyces galilaeus, el barbital estimul la biosntesis de galirubinas
(antraciclina) a una concentracin de 22 mM, y un tiempo ptimo de adicin de 12 h despus
de la inoculacin. El incremento vari desde 1.5 veces hasta 2.85, dependiendo de la cepa
(Krlovcov et al., 1977).
En la biosntesis de rifamicina por Amycolatopsis mediterranei el barbital ejerce un efecto
extremadamente importante ya que los metabolitos secundarios generalmente son producidos
como familias de compuestos como resultado de la baja especificidad de las enzimas del
metabolismo secundario, sin embargo la abundancia relativa de uno de los miembros de
la familia puede incrementarse por la adicin de ciertas sustancias (Demain, 1989). Tal es
el caso de la produccin de rifamicina B (El-Tayeb et al., 2004), pues A. mediterranei bajo
condiciones normales (sin la adicin de ningn modulador), produce una amplia gama de
rifamicinas, por lo que Margalith y Pagani desde la publicacin de su trabajo clsico en 1961,
estudiaron el efecto de diferentes barbituratos y compuestos relacionados. Ellos monitorearon
la formacin de 6 distintas rifamicinas durante el curso de la fermentacin y encontraron
que el 5-etil-5-metilbarbiturato, el 5-fenil-5-etilbarbiturato, el 5-etil-5-isopropil-barbiturato y
el 5, 5-dietilbarbiturato (barbital) dirigen el metabolismo hacia la biosntesis casi exclusiva de
rifamicina B, y dejan el resto de las rifamicinas en niveles prcticamente despreciables. La
explicacin de este efecto es a nivel de cadena respiratoria, ya que se ha demostrado que el
barbital inhibe el consumo de oxgeno en el metabolismo central, lo cual genera una mayor
disponibilidad de oxgeno en la biosntesis de rifamicina, particularmente en los pasos limitantes
catalizados por monooxigenasas del tipo de los citocromos P450 (Meja et al., 2003).
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V. Un problema en comn
Un problema recurrente en la produccin de antibiticos a nivel industrial ha sido que las
cepas de alta produccin tienden a producir caldos extremadamente viscosos, lo que ocasiona
una gran dificultad para proporcionar un adecuado mezclado y aporte de oxgeno en el
biorreactor; esta viscosidad es consecuencia de la forma filamentosa y ramificada en que crecen
los actinomicetos. La menor transferencia de oxgeno en edades avanzadas del cultivo provoca
el cese de la produccin, ya que al tratarse de un metabolito secundario, es en esta etapa
cuando se inicia la produccin y por lo tanto una mayor demanda de oxgeno. Para resolver
este problema en la produccin de antibiticos como la cefalosporina, se ha demostrado que
la expresin intracelular del gen de la hemoglobina bacteriana (vhb, aislado de Vitreoscilla
stercoraria) en Acremonium chrysogenum incrementa la captacin de oxgeno, tambin considerado
uno de los principales factores limitantes de la produccin de este antibitico (DeModena,
1993). El gen de hemoglobina bacteriana ha sido expresado exitosamente tambin en E. coli
y en Saccharopolyspora erythraea para la produccin de eritromicina, al igual que en Amycolatopsis
mediterranei para la produccin de rifamicina (Guerra et al., 2008).
VI. Represin catablica
Los mecanismos moleculares de la regulacin catablica se esclarecieron en la dcada de los
70. Hoy sabemos que la regulacin catablica est mediada por el nivel intracelular de un
nucletido especial, el adenosin monofosfato cclico (AMPc), cuyo nivel intracelular es inverso a
la concentracin de glucosa en el medio de cultivo. Mientras existe glucosa en el medio de cultivo
el nivel intracelular de AMPc es sumamente reducido, debido a que la glucosa inhibe la actividad
adenilciclasa, enzima que interviene en la sntesis de AMPc. Cuando la glucosa del medio se
agota, la concentracin intracelular de AMPc aumenta rpidamente. El AMPc sintetizado forma
un complejo con una protena existente en la clula, denominada protena receptora de AMPc.
Este complejo de protena receptora y AMPc acta sobre el gen promotor al objeto de inducir
la sntesis de los enzimas necesarios para la utilizacin de otras fuentes de carbono distintas a la
glucosa. La glucosa inhibe gran cantidad de metabolitos secundarios (Shapiro, 1989).
La represin catablica tambin juega un papel importante en la determinacin de la
concentracin relativa de cada uno de los antibiticos de una misma familia qumica que se
producen en una fermentacin. Este es el caso de la produccin de estreptomicina por Streptomyces
griseus. El manano es el inductor de la manosidasa que convierte la mansido estreptomicina en
estreptomicina; sin embargo, esta enzima no se sintetiza si hay glucosa (>0,5%) en el medio,
debido a la represin catablica. Slo cuando la glucosa ha desaparecido se produce la enzima
que es inducida por manano. En este caso la represin catablica juega un papel fundamental
en el porcentaje de mansido estreptomicina producido en esta fermentacin (Shapiro, 1989).
VII. Regulacin por fosfato
Otro camino mediante el cual se regula la formacin de metabolitos secundarios implica la
inhibicin y la represin de las fosfatasas por fosfato. Muchas fermentaciones se inhiben por
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ortofosfato (H3PO4) a concentraciones (>10 mM) que no son inhibidoras para el crecimiento.
En algunos casos se explica ya que los intermediarios de la ruta metablica del producto que
nos interesa estn fosforilados, aunque el producto final no lo est. Las fosfatasas actuaran en
estos intermediarios (Bibb, 2005).
Un ejemplo lo tenemos en la biosntesis de estreptomicina donde actan varias fosfatasas en
la formacin de estreptidina y en el ltimo paso, desfosforilacin de la estreptomicina fosfato,
donde la enzima que cataliza esta reaccin tambin est inhibida por el fosfato inorgnico
(Shapiro, 1989).
VIII. Exportacin
Durante la segunda mitad del siglo pasado se incrementaron los estudios para el
mejoramiento gentico de actinomicetos con miras a incrementar los niveles de produccin.
Se identificaron una gran cantidad de genes involucrados en el metabolismo secundario de
los actinomicetos. Dentro de ellos se han encontrado genes involucrados en la resistencia y
exportacin de los antibiticos propios de cada microorganismo productor. Sin embargo,
se ha puesto poca atencin al papel que juegan estos genes en la regulacin de los niveles
de produccin, ya que es importante considerar que puede presentarse un efecto txico
propio de la actividad del antibitico que sintetizan cuando las concentraciones del mismo
son altas lo que marca un lmite en la produccin en cepas industriales de alta produccin
(Demain y Fang, 2000).
En microorganismos eucariontes que producen antibiticos como Penicillium chrysogenum
productor de penicilina, los antibiticos son concentrados en vesculas membranales internas
que posteriormente son liberados al medio por exocitosis. Sin embargo los organismos
procariontes no son capaces de formar tales vesculas, por lo que tienen que exportar el producto
por un sistema de transporte de membrana. Se han identificado en muchos actinomicetos
protenas de membrana que funcionan como una bomba exportadora de antibitico. Tal es
el caso de Streptomyces pristinaespiralis, productor de pristinamicina en quien el gen ptr codifica
una protena responsable de la exportacin de dicho antibitico mediante un sistema antiport,
pristinamicina/protn (Folcher et al., 2001).
Por otro lado, en 1998 August y colaboradores reportaron la secuencia de nucletidos de los
genes involucrados en la biosntesis de rifamicina. Dentro del cluster, encontraron 34 marcos
abiertos de lectura, uno de los cuales, denominado rifP presenta un 66.1% de homologa con
el gen ptr de Streptomyces pristinaespiralis, mientras que a nivel proteico RifP y Ptr tienen una
similitud de 81.2%. La funcin de la protena RifP fue demostrada mediante silenciamiento
del gen rifP, encontrndose que este silenciamiento ocasiona una disminucin de la produccin
de un 80 % (Absaln et al., 2007). Esto sugiere que un incremento en la expresin de este tipo
de genes podra mejorar la capacidad de produccin del antibitico.
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IX. Metabolismo secundario y diferenciacin

Los actinomicetos presentan un ciclo de vida complejo que implica procesos de diferenciacin
morfolgica y fisiolgica. Estas bacterias son capaces de colonizar sustratos formando una
red de hifas tabicadas ramificadas que dan lugar al micelio vegetativo. Estas hifas obtienen
los nutrientes de la degradacin del material orgnico insoluble gracias a numerosas enzimas
hidrolticas (Chater, 1984). En una primera etapa, las zonas ms alejadas de la fuente de
nutrientes empiezan a acumular sustancias de reserva, hasta que en un determinado momento
y debido a la carencia de nutrientes, se reciben una serie de seales; justamente en esta zona,
que disparan la expresin de genes implicados en la formacin del micelio areo. Se produce
as, el desarrollo de hifas que emergen del micelio vegetativo para dar lugar al micelio areo.
Estas hifas se van a nutrir de los productos de degradacin del micelio vegetativo, y en una
segunda etapa van a sufrir un proceso de curvatura, enrollamiento, formacin de septos y
engrosamiento de la pared celular para dar lugar a una cadena de esporas uninucleares, que se
liberarn al medio y que con las condiciones adecuadas, germinarn y desarrollarn un nuevo
micelio vegetativo (Elliot y Talbot 2004).
La iniciacin de la biosntesis de metabolitos secundarios usualmente ocurre cuando la tasa de
crecimiento se detiene y es acompaada por la transicin morfolgica del micelio vegetativo
hacia la formacin de la hifa area. Un aspecto interesante es que se han encontrado una serie
de genes que interconectan o estn involucrados en ambos procesos; la diferenciacin y el
metabolismo secundario (Fernndez et al., 2009).
El factor A (2-isocapryloyl-3Rhydroxymethyl g-butyrolactona) en Streptomyces griseus es uno
de los ms representativos autorreguladores, el cual dispara el metabolismo secundario o la
formacin de micelio areo o ambos (Kato et al., 2007). El factor A producido de manera
dependiente del crecimiento, se acumula hasta una concentracin crtica (10-9 M) o cercana
a la mitad de la fase de crecimiento exponencial y entonces enciende la transcripcin de
adpA. AdpA activa a un nmero de genes con varias funciones requeridas para el desarrollo
morfolgico y el metabolismo secundario (Kato et al., 2007).
Por otro lado, los aminocidos son la principal fuente de carbono y nitrgeno, por lo que su
limitacin juega un papel central en la iniciacin del metabolismo secundarios, desencadenando
un mecanismo conocido como respuesta estricta que consiste en la disminucin de la sntesis
proteica, disminucin de la estabilidad de los mRNA, aumento de la degradacin de protenas
y aumento de la produccin de aminocidos. El efector de esta respuesta es el 3,5 difosfato
de guanosina (ppGpp), sintetizado por una protena asociada a ribosoma. ppGpp se une
a la subunidad cataltica de la RNA polimerasa, alterando el reconocimiento de una serie
de promotores llamados promotores estrictos. Este incremento en la cantidad de ppGpp se
correlaciona con la necesidad de entrar en metabolismo secundario (Hesketh et al., 2007).
Otras evidencias sobre la relacin que guardan la diferenciacin y el metabolismo secundario,
es la descripcin sobre clonacin de un fragmento regulatorio (SCO5749) de S. coelicolor,
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en S. lividans, el cual causa una sobreproduccin de actinorrodina y undecilprodigiosina y

simultneamente el cese de la esporulacin bajo condiciones de estrs osmtico (Bishop et
al., 2004).
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Avances en la produccin de antibiticos y otros

metabolitos secundarios
Los metabolitos secundarios son compuestos producidos principalmente por hongos y
actinomicetos, generalmente tarde en el ciclo de crecimiento (idiofase). Aunque los antibiticos
son los metabolitos secundarios (MS) ms conocidos, hay otros con un enorme rango de
actividades biolgicas diferentes (Barrios-Gonzlez et al 2004b). Las ltimas dos dcadas han
sido una fase de rpido descubrimiento de nuevas actividades y desarrollo de importantes
compuestos de uso en diferentes campos industriales, principalmente: farmacutico y
cosmticos, alimentos, agricultura y ganadera. Algunos ejemplos son: antiinflamatorios,
hipotensivos, antitumorales, anticolesterolmicos; pero tambin hay insecticidas, reguladores
del crecimiento vegetal y herbicidas y pesticidas amigables con el medio ambiente (Demain,
1999; Barrios-Gonzlez et al 2004a).
Estos compuestos son producidos comercialmente por fermentacin lquida sumergida (FL),
pero muchos de estos metabolitos podran ser producidos ventajosamente por fermentacin
slida.
Aunque sistemas de fermentacin slida (FS) han sido usados desde la antigedad en varios
pases orientales, la FS ha sido transformada, en los ltimos 25 aos, para nuevos propsitos,
usando nuevos enfoques de microbiologa, bioqumica e ingeniera bioqumica. Este mayor
grado de control, ha permitido el uso de la FS para producir sofisticadas y valiosas molculas
como los MS (Barrios-Gonzlez y Meja, 1996; Barrios-Gonzlez y Meja, 2007; BarriosGonzlez y Meja, 2009).
Hace 10 o incluso 5 aos, las revisiones (reviews) de este campo sealaban que la FS era una
tecnologa emergente con gran potencial para la produccin de metabolitos secundarios a
escala comercial. Los autores comentaban que la morfologa del micelio, asociada a los
microorganismos productores de MS, es muy apropiada o adaptada para el crecimiento en
soporte slido. Tambin que la FS presenta ventajas como mayor produccin, a menudo en
tiempos ms cortos, mayor estabilidad del producto, menores requerimientos de energa;
aunque tambin comentan desventajas como un ms complicado escalamiento y dificultades
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Avances en la produccin de antibiticos
para monitorear y controlar los parmetros del proceso (Barrios-Gonzlez & Meja, 1996;
Blakrishnan & Pandey, 1996; Robinson & Nigam, 2001).
Hoy la produccin industrial de MS por FS es una realidad. Hace algunos aos, una compaa
de la India comenz la produccin industrial de algunos MS; y se ha convertido desde entonces
en un exitosa empresa y la FDA de EEUU ha aprobado esta tecnologa para la produccin
de frmacos para aplicaciones industriales desarrolladas (Suryanarayan, 2003). En un futuro
prximo, la competencia entre el sistema convencional de FL (fermentacin lquida) y el de FS
promete ser mucho ms reida e interesante.
Actualmente, se pueden distinguir 2 tipos de FS, dependiendo de la naturaleza de la fase slida
utilizada: 1) FS en sustratos naturales, como salvado de trigo, harina de yuca, etc.; y 2) FS en
soportes inertes impregnados con medio lquido. Este ltimo, fue desarrollado por nuestro
grupo (Metabolitos Secundarios e ingeniera gentica, Depto. de Biotecnologa, UAM-I) a final
de los aos 80; y adems de tener buena productividad, es un sistema que ha representado un
modelo conveniente para estudios bsicos sobre la FS (Ooijkaas et al, 2000).
La investigacin sobre produccin de MS por FS de los ltimos 10 aos se ha caracterizado
no slo por un incremento en el nmero de publicaciones, sino tambin por el incremento
en la proporcin de MS con actividades biolgicas diferentes a las de los antibiticos. Otro
interesante aspecto de esta etapa es la sorprendentemente alta productividad de MS obtenida
en los procesos desarrollados en estos estudios. Hace 10 aos, las revisiones mencionaban
slo un reporte en el que el nivel de produccin logrado estaba por arriba de los 7 mg/g,
mientras que procesos con producciones mucho ms altas son relativamente comunes en
publicaciones recientes (Barrios-Gonzlez & Meja, 1996; Barrios-Gonzlez & Meja, 2007;
Bhargav et al, 2008).
Adinarayana et al (2003), reportaron la produccin de 22.3 mg de cefalosporina/g (de
cultivo seco) en una FS sobre rawa de trigo (integral y quebrado), mientras que nuestro
grupo report una produccin del frmaco utilizado para disminuir los niveles de colesterol
en sangre: lovastatina, de 20 mg/g en un sistema novedoso de FS en soporte inerte artificial
(Baos et al, 2008a). Posteriormente, la cepa de produccin, una cepa silvestre de Aspergillus
terreus, fue mutada y sometida a un proceso de seleccin racional, se obtuvo una produccin de
27.9 mg/g (Baos et al, 2009).
Investigaciones realizadas por nosotros y por otros autores han demostrado que la fisiologa
de la idiofase (fase de produccin) en FS comparte varias similitudes con la conocida fisiologa
en medio lquido. De esta manera, similares estrategias deben ser adaptadas para desarrollar
procesos de produccin eficientes; por ejemplo, evitar la regulacin por carbono (catablica),
nitrgeno o fosfato, adems de incluir inductores y precursores en el medo slido. No obstante,
hay importantes parmetros especficos para la FS que deben ser optimizados y que incluyen:
pretratamiento del sustrato o soporte, contenido de humedad inicial, concentracin del medio
y aireacin (Pandey et al, 2007).
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Sin embargo, nuestros estudios de respiracin durante la produccin de MS por FS han

contribuido a mostrar aspectos ms sutiles de la fisiologa de una produccin eficiente en
contraposicin con la de una produccin ineficiente, en este sistema de cultivo (Domnguez et
al, 2000). sta y otras evidencias han indicado que hay ciertas particularidades de la fisiologa
en FS que necesitan ser mejor entendidas; lo cual generara un conocimiento que ser la base
del desarrollo de procesos y estrategias de control ms eficientes. Un impacto igual o incluso
mayor lo tendra la aplicacin de dicho conocimiento al desarrollo de cepas microbianas
sobreproductoras de MS, particularmente efectivas en medio slido.
Muchas de las ventajas de la FS, como que los metabolitos son a menudo producidos en
concentraciones mucho ms altas que en FL, son una consecuencia de la diferente fisiologa
mostrada por los microorganismos en FS, en relacin a la presentada en FL (Barrios-Gonzlez
y Meja, 2009).
Las razones fisiolgicas y moleculares que subyacen el diferente comportamiento de los
microorganismos en FS apenas comienzan a ser entendidas, pero se sabe que grandes grupos
de genes son expresados en forma diferencial cuando los hongos crecen en FS y en FL (Akao
et al, 2002; Te Biesebeke et al, 2005a). En cuanto a la produccin de metabolitos secundarios,
estudios de mi grupo han demostrado que la mayor produccin de lovastatina en FS es debida,
al menos en parte, a la mayor expresin de los genes de biosntesis, en particular el factor
transcripcional del cluster, lovE (Barrios-Gonzlez et al, 2008). Actualmente nuestro trabajo
se dirige a identificar las seales que recibe el hongo del medio ambiente y que le indican que
est en medio slido; as como las vas de transduccin de seales involucradas en inducir los
genes relacionados con la biosntesis del metabolito.
Aunque el conocimiento bsico de la fisiologa del medio slido es an incipiente, ya empiezan
a surgir ejemplos de su aplicacin al mejoramiento gentico (Campos et al, 2008; Te Biesebeke
et al, 2005; Te Biesebeke et al, 2006; Barrios-Gonzlez y Meja, 2009).
En relacin a las cepas utilizadas para procesos de FS, un anlisis de la literatura indica que
aislamientos silvestres tienen un rendimiento sorprendentemente alto en FS (Rao et al, 2005;
Asagbra et al, 2005, Baos et al, 2004; Mahalaxmi et al, 2010; Baos et al, 2009). Es importante
sealar que sera imposible obtener estos rendimientos, con una cepa silvestre, en un proceso
de fermentacin sumergida.
Sin embargo, a pesar de todo esto, el mejoramiento gentico de las cepas es tambin muy
importante o incluso inevitable para el desarrollo de procesos de FS competitivos. En este
sentido es significativo que 8 de los 10 procesos de FS ms productivos para MS fngicos,
reportados en los ltimos aos, utilizaron cepas mejoradas. Tambin interesante es que los 3
procesos de FS ms productivos de MS de actinomicetos, tambin utilizan cepas mejoradas
genticamente (Barrios-Gonzlez & Meja, 2007; Khaliq et al, 2009).
Hoy est claro que es necesario utilizar y generar cepas especiales, particularmente adecuadas
o convenientes para el medio slido; tanto para la produccin de MSs como de enzimas. Lo
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que no est tan claro es qu mtodos o estrategias deberan usarse. Una estrategia que ha sido
usada, es partir de cepas hiperproductoras para FL y aislar mutantes que sean eficientes en
FS. Idealmente, esas mutantes combinarn la capacidad de alta produccin con una buena
adaptacin al medio slido (Barrios-Gonzlez et al, 1993).
Un estrategia alternativa, y que ha sido exitosa, es la de rastrear los mejores aislamientos
silvestres y despus someterlos a un programa de mutacin y seleccin (Murthy et al, 1999).
En relacin a la gentica molecular, si se logran identificar genes especficos, involucrados en la
adaptacin al ambiente slido y/o que tienen un impacto en su productividad en este medio,
un mejoramiento gentico molecular tambin podra realizarse (Barrios-Gonzlez y Meja,
2009).
Recientemente, Te Bisebeke et al (2005b) estudiaron la relacin entre el nmero de puntas de
hifa y la secrecin de enzimas durante el crecimiento de A. oryzae en FS. Los autores razonaron
que el crecimiento del hongo en este medio involucra la modificacin enzimtica y posterior
penetracin en el sustrato. Como la secrecin de enzimas ocurre alrededor de la regin apical y
subapical de la hifa que avanza, un incremento en la frecuencia de ramificacin incrementara
la produccin de la enzima. Para probarlo, construyeron una cepa con mayor frecuencia
de ramificacin debida a la interrupcin de los genes pcla y pf/pi-ip. La cepa transformante
produjo 50% ms amilasa, 100% ms glucoamilasa y 90% ms proteasas que la parental.
En nuestro laboratorio, se construy una biblioteca genmica de P. chrysogenum en un csmido
construido previamente en nuestro laboratorio (Iztapacos) y de ah se clon todo el cluster de
genes de la ruta biosinttica de penicilina. As, fue posible estudiar el efecto de introducir dosis
altas de estos genes en P. chrysogenum y probar su efecto en la produccin del antibitico en FS
y FL.
Los resultados mostraron un incremento en la produccin de penicilina en ambos sistemas,
siendo el incremento superior en FS (Campos et al, 2008). La cepa de alta produccin (P-2),
utilizada en este trabajo, fue desarrollada en la industria de FL por mutacin clsica y se ha
demostrado que ya contiene 14 copias del cluster de biosntesis de penicilina. Transformantes
de esta cepa, mostraron un incremento de 92.9% en FL y 158.4% en FS. Estos resultados
demostraron que la estrategia de incrementar la dosis gnica es efectiva an en cepas de alto
nmero de copias; y que de este modo se pueden obtener mutantes sobreproductoras de
penicilina, y muy probablemente de otros metabolitos secundarios.
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Mtodos actuales para el estudio de

microorganismos en alimentos
Dra. Gloria Daz-Ruiz
Dra. Carmen Wacher
Introduccin
Los microorganismos son probablemente los seres vivos ms antiguos y colonizan cualquier
ambiente en la tierra. Han jugado papeles centrales en su evolucin climtica, geolgica,
geoqumica, biolgica (Xu, 2006). Los alimentos entonces estn tambin colonizados,
generalmente con microbiotas complejas. Dentro de sta pueden encontrarse microorganismos
indeseables: los que causan enfermedades, los que alteran los alimentos, y los deseables: los que
los fermentan, los que los hacen funcionales, como los probiticos, y tambin los comensales
que no causan problemas ni son tiles.
Los microorganismos han actuado en los alimentos siempre, pero debido a su tamao se
conocieron hasta que Antonie van Leeuwenhoek los observ con una lente. Ms tarde
Louis Pasteur descubri la relacin entre los microorganismos, la descomposicin y la
fermentacin de los alimentos. Debido a esto se le considera el padre de la microbiologa de
alimentos (Jay, 2007).
Estudio de los microorganismos en los alimentos.
Los microorganismos son microscpicos, difciles de observar, de contar, entonces se desarroll
un mtodo para aislarlos y cuantificarlos, inoculando rebanadas de papa, en las que se forman
colonias de microorganismos. El principio de este mtodo (cada colonia se forma a partir de
una clula o de un agregado de clulas, o de una espora, etc., que se llama unidad formadora de
colonias o ufc) se sigue usando en la actualidad, con medios de cultivo en vez de rebanadas de
papa. Con esta tcnica fue posible tambin obtener cultivos puros de los microorganismos, lo
que fue esencial para determinar cules microorganismos eran los causantes de enfermedades
(Tortora et al., 2006).
A diferencia de los animales y las plantas, no haba sido posible determinar las relaciones
filogenticas entre los microorganismos, ya que no contaban con caracteres como los de los
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Mtodos actuales para el estudio de microorganismos en alimentos
organismos superiores (presencia de alas, picos, etc.), hasta que se ide comparar las secuencias
del ADN de los microorganismos, que es lo que los hace diferentes. Debido a la dificultad para
comparar las secuencias del ADN total de un aislado, surgi la necesidad de seleccionar un
gen. Este debe cumplir con ciertas caractersticas: que est distribuido universalmente, que sea
funcionalmente homlogo en todos los organismos a comparar, que cuente con regiones de
homologa y regiones de heterogeneidad, que la velocidad de cambio de la secuencia sea
proporcional a la de la distancia evolutiva medida. Algunos genes que cumplen con estos
requisitos son: genes que codifican ATPasas, RecA (relacionado con la recombinacin)
y los genes de rRNA (sobre todo el 16S es el que ms se ha usado) (Tortora et al., 2006;
Ludwig, 2008).
Woese (1987) us este mtodo para determinar las relaciones filogenticas entre los organismos
que tienen clulas. El menciona que: La clula es un documento histrico, y obteniendo la capacidad
de leerlo (secuenciando sus genes) no podemos ms que alterar drsticamente la manera de ver la biologa.
Entonces se agruparon en 3 dominios: Bacteria, Archaea y Eukarya, a diferencia de los 5 reinos
en los que se clasificaban. Debido a que esta nueva clasificacin est basada en la historia de
los microorganismos se considera una clasificacin ms natural.
Por otra parte, si lo que se requiere es comparar las secuencias de los genes ribosomales de
los microorganismos, stas pueden obtenerse directamente del ADN de una muestra, sin la
necesidad de aislar los microorganismos. A partir del ADN extrado, se amplifican mediante la
reaccin de PCR regiones de los genes ribosomales. Estos amplicones pueden ser secuenciados
e identificados mediante la comparacin de su secuencia con la de una base de datos, como el
GenBank.
Al usar esta tcnica, que no requiere del cultivo de los microorganismos, se descubri que la
microbiota presente en los ambientes naturales es ms compleja de lo que se crea, ya que
una proporcin muy baja, alrededor del 1%, se recupera en los medios de cultivo usados
tradicionalmente (Hugenholtz et al., 1998). Esto ocurre por ejemplo en el suelo. La diversidad
microbiana describe la complejidad y variabilidad a diferentes niveles. Variabilidad gentica
entre los taxones (especies), el nmero (riqueza) y abundancia relativa (uniformidad) de
los taxones y grupos funcionales (asociaciones) en las comunidades. El tipo de proceso y
complejidad de interacciones. El estudio de todo lo anterior debe incluir mltiples mtodos
que se dirijan a determinar la estructura y la funcin (Torsvik y Ovres, 2002).
Dentro de las razones por las cuales no todos los microorganismos se recuperan en medios
de cultivo se mencionan: no se sabe cmo cultivarlos y no crecen debido a que les falta o les
sobra algn nutrimento en el medio, la atmsfera no es adecuada, no se pueden desarrollar
en cultivo puro, o entran en un estado conocido como viable pero no cultivable, al cual
entran cuando se encuentran ante una situacin de estrs y no crecen en medios de cultivo,
a pesar de estar vivas (Roszak y Colwell, 1987; Colwell, 2000). Esto ha venido a cambiar los
criterios para determinar si un microorganismo est muerto o vivo, ya que anteriormente
se consideraba que los viables eran aqullos capaces de desarrollarse en medios de cultivo.
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Dr. Gloria Daz-Ruiz y Col.
Figura 1. Mtodos dependientes e independientes del cultivo para el anlisis microbiolgico de alimentos
(Daz-Ruiz y Wacher, 2003).
Surge entonces la necesidad de redefinir la muerte microbiana, ya que el concepto tradicional

ya no es vlido.
Se han ideado entonces una gran variedad de mtodos con base en la biologa molecular y en la
filogentica. Si bien fue muy importante la obtencin de cultivos puros, con el descubrimiento
de que los ambientes son ms complejos de lo que se pensaba, ahora se reconoce que los
microorganismos no funcionan como seres individuales, sino como miembros de comunidades
y stas influyen en su desarrollo (Harwood y Buckley, 2008). Entonces se usa un enfoque
ecolgico para estudiarlos (Ercolini, 2004).
En la Figura 1 se resumen algunos de los mtodos que se usan actualmente en microbiologa
de alimentos (Daz-Ruiz y Wacher, 2003).
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Mtodos dependientes del cultivo

Existen mtodos basados en el cultivo de los microorganismos y mtodos independientes
del cultivo. Dentro de la primera categora se encuentran los que se conocen como de
huella digital, que se basan en la tipificacin, o identificacin ms all de la especie, de los
microorganismos.
Existe una gran variedad de mtodos de huella digital y dentro de stos se pueden mencionar:
RFLP (polimorfismo de longitud de fragmentos de restriccin). Se basa en obtener,
a partir del ADN aislado de cada microorganismo, un patrn de bandas de diferente tamao
despus de digerirlo con una enzima de restriccin. Estas enzimas cortan el ADN nicamente
cuando encuentran una cierta secuencia. De esta manera, dos cepas pertenecern al mismo
grupo si tienen patrones idnticos. De acuerdo con la similitud entre los diferentes patrones de
bandas se construye una matriz de distancias y con sta un dendrograma, en el que se agrupan
los microorganismos de acuerdo con su similitud (Busse et al., 1996).
Ribotipificacin y ARDRA (anlisis de restriccin de ADN ribosomal amplificado).
Debido a que se trabaja con el ADN total del microorganismo, los patrones de RFPL son
complejos y difciles de analizar. Para evitar este problema, puede trabajarse con un gen,
como el del rRNA 16S. Para hacer una ribotipificacin se parte del patrn de RFLP, el cual
se transfiere a una membrana, la cual se hibrida con una sonda del gen ribosomal 16S. De
esta forma se seleccionan solamente las bandas que contengan zonas complementarias a la de
la sonda y el patrn ser ms sencillo. Por otra parte, el ARDRA (anlisis de restriccin de
ADN ribosomal amplificado) ADN consiste en amplificar por la reaccin de PCR, a partir del
ADN total de cada microorganismo, el gen ribosomal 16S y ste se digiere con una enzima
de restriccin, con la que se lograr obtener patrones ms sencillos que los de RFLP (Barret y
Gerner-Smidt, 2007).
PFGE (electroforesis en gel con campos pulsados). En ocasiones, cuando se usan enzimas
de corte raro, se obtienen fragmentos demasiado grandes que no migran adecuadamente en el
gel. Para promover o facilitar el movimiento de los fragmentos a travs del gel, la electroforesis
es en varios sentidos, de manera que se va forzando a la molcula a moverse a travs del gel,
siendo finalmente su movimiento en lnea recta como la electroforesis convencional. Este es un
mtodo muy reproducible y ha sido el seleccionado para usarse en programas epidemiolgicos
nacionales, como el Pulsenet en Estados Unidos (Swaminathan et al., 2001).
Estos mtodos son muy tiles para: a) Agrupar microorganismos antes de identificarlos (de
esta manera se puede seleccionar uno de cada grupo para identificar), b) Para determinar las
fuentes de contaminacin de alimentos por ejemplo con bacterias patgenas, c) Para determinar
a partir de cules alimentos se produjo un brote, al aislar el mismo tipo del microorganismo
del alimento y de muestras clnicas de las personas enfermas. Estos mtodos se usan entonces
para comprender la transmisin de las enfermedades transmitidas por alimentos y la seguridad
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Figura
2. Ribotipos de aislados de L. monocytogenes del procesador D. Las muestras ambientales (E),
de materia prima (R), en proceso (IP) y producto terminal (F), agrupados por visita. * ribotipo aislado ms
frecuentemente de las muestras del procesador D. (Norton et al., 2001)
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microbiolgica de alimentos (Whittam y Bergholz, 2007). Norton et al., (2001) estudiaron la

ecologa microbiana de Listeria monocytogenes en diversos ambientes de procesamiento de pescado
de 3 industrias. Para esto tomaron muestras del producto en diferentes puntos del proceso
(pescado crudo, durante el proceso de ahumado fro, producto final y muestras del ambiente).
Usando un mtodo comercial basado en la PCR, 17.9% de las muestras dieron positivas a la
bacteria, de stas, 17.7% fueron ambientales, 7.8% del pescado crudo, 18.1% de pescado en
diversas etapas durante el procesamiento y 7.3% del producto terminado. Aislaron cepas de
las muestras que dieron positivas y realizaron una ribotipificacin para determinar el origen
de la contaminacin. Encontraron 15 ribotipos diferentes y de acuerdo con la distribucin de
los aislados, fue posible concluir que cada industria tena su microbiota diferente, que algunos
tipos de la bacteria permanecan hasta el final del procesamiento y que el pescado crudo y el
ambiente del proceso eran las fuentes potenciales de contaminacin. Con esta informacin
sera posible emitir recomendaciones para mejorar la calidad microbiolgica del producto. La
cepa DUP-1039C (Fig. 2) permaneci en la planta durante los 6 meses que dur el muestreo
y se encuentra en casi todas las muestras. Esto sugiere que forma parte de la microbiota del
ambiente de procesamiento y que no se elimina con los procedimientos de limpieza usados.
Mtodos independientes del cultivo
Por las razones explicadas anteriormente, es importante usar mtodos que no requieran del
cultivo de los microorganismos. Se extrae entonces el ADN de las muestras y se amplifica por
PCR una regin del gen ribosomal 16S, o de otro gen. La especificidad estar determinada
por los cebadores, que pueden ser tan generales como un dominio o tan especficos como
una especie. Si se usan cebadores universales para Bacteria, el producto de la PCR ser una
mezcla de fragmentos de miembros de este dominio. Son entonces del mismo tamao, pero
con secuencias diferentes. Para separarlos y determinar qu bacterias se encuentran en la
mezcla, se puede hacer una biblioteca de clonas en E. coli, para despus aislar las cepas que
hayan adquirido el fragmento y secuenciarlo. Otra alternativa es separarlos de acuerdo con
su secuencia usando geles de poliacrilamida y correrlos en una electroforesis con gradiente
de temperatura (TTGE) o de urea-formamida (DGGE, electroforesis en gel con gradiente
desnaturalizante). Se obtiene para cada muestra un patrn de bandas en el que idealmente
cada banda representa un microorganismo diferente y la intensidad de las bandas da una idea
de su proporcin relativa en la muestra; sin embargo no es un mtodo cuantitativo (Muyzer
et al., 1993). El SSCP (polimorfismo de conformacin de bandas sencillas) se basa en la
separacin de bandas sencillas de ADN de acuerdo con su conformacin (que a su vez depende
de su secuencia). Para identificar cada banda del patrn se puede determinar la posicin de
la banda que producen cepas aisladas e identificadas o se corta la banda, se extrae el ADN,
se reamplifica por PCR, se secuencia y se compara con una base de datos para identificar el
microorganismo al que corresponde (Schwieger y Tebbe, 1998).
Con el fin de determinar cules microorganismos estn metablicamente activos, se extrae
en vez del ADN el ARN, que es muy inestable y por lo cual no se esperara obtenerlo de un
microorganismo no viable. Se obtiene el cADN mediante el uso de la transcriptasa inversa y
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con ste es posible usar los mtodos mencionados anteriormente. De esta manera es posible
determinar la estructura de las poblaciones microbianas, distinguir los microorganismos activos
metablicamente y se puede determinar su funcin, si se trabaja con genes funcionales.
Estudiaron la diversidad y la dinmica de crecimiento microbiano durante la fermentacin
del queso italiano artesanal Ragussano, (Randazzo et al., 2002). Se usaron los mtodos
convencionales, PCR, PCR transcriptasa inversa y DGGE, basados en las secuencias del gen
ribosomal 16S, usando cebadores especficos para bacteria y para Lactobacillus. Se observaron
cambios dramticos en la estructura bacteriana (Fig. 3); en la leche predominaron Leuconostoc,
Lactococcus lactis y Macrococcus caseolyticus, durante la fermentacin Streptococcus thermophilus.
Los patrones de RT-DGGE demostraron que no todas las cepas se encontraban activas. A
permanece activo en la leche y en la cuajada, mientras que B y C ya no se observan en la
cuajada. Todos los microorganismos detectados en el queso mediante DGGE se encuentran
activos. Este mtodo (DGGE) es entonces ideal para determinar cambios en los patrones
microbianos durante procesos de fermentacin.

Figura 3. Comparacin
entre patrones de PCR-DGGE, y RT-PCR de productos de las regiones V6 a V8
de aislamientos de ADN y rARN de leche, cuajada y queso madurado 15 das, del productor I. Las bandas
pertenecen a: A, Macrococcus caseolyticus; B, Lactococcus lactis; C, Leuconostoc mesenteroides; D,
Streptococcus thermophilus; E: Streptococcus bovis; F, G, H, I, and J, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus;
K, Lactobacillus fermentum; L, Lactobacillus casei; and M, Enterococcus hirae. (Randazzo et al., 2002).
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Cuantificacin de microorganismos
Debido a su naturaleza no lineal, no es posible relacionar directamente la concentracin de los
productos de PCR con la concentracin de ADN en el templado. El mtodo ms usado para
cuantificar microorganismos es la reaccin de PCR en tiempo real (RT-PCR). A diferencia de
la PCR en tiempo final, en la cual es necesario esperar a que concluya el programa establecido,
con el nmero de ciclos establecido, para determinar la presencia o ausencia de amplicones
mediante una electroforesis en gel de agarosa, se detecta el producto de PCR mientras ocurre
la reaccin. Para esto se usan diferentes tipos de reacciones mediante las cuales se detecta el
amplicn marcndolo de diferentes formas. Adems de las ventajas del PCR convencional,
el RT-PCR proporciona rapidez, sensibilidad, reproducibilidad. Estas caractersticas son de
gran valor para la industria de alimentos; la desventaja del mtodo es el costo, tanto del equipo
como de los reactivos (Mustapha y Li, 2006).
Localizacin de los microorganismos
En general, para realizar el anlisis de algn alimento se toma una muestra y se homogeniza.
Para el caso de las muestras slidas, con esto se pierde la informacin sobre la localizacin
de los microorganismos, que puede ser de gran importancia. Se usan entonces mtodos in
situ, como el FISH (Hibridacin fluorescente in situ). Se basa en la hibridacin de sondas
de ADN marcado complementaria a regiones del gen ribosomal. Los microorganismos
marcados podrn ser detectados mediante microscopa de fluorescencia o citometra de flujo.
Es una tcnica muy rpida y sensible, considerada una herramienta poderosa para identificar
microorganismos en comunidades microbianas complejas.
Mediante el mtodo de FISH se detectan secuencias de cidos nucleicos marcadas con
fluorescencia. Estas son lo suficientemente pequeas como para penetrar las membranas
celulares e hibridar especficamente el rRNA intracelular sin alterar la morfologa o la
integridad de la clula. Es posible entonces detectar y cuantificar microorganismos mediante
esta prueba, que no es destructiva; visualizar la distribucin temporal y espacial, acoplada con
la microscopa confocal lser de barrido se pueden observar las comunidades microbianas
en su ambiente. Mejoras recientes a esta tcnica incluyen el FISH mltiple. Se realizan
hibridaciones mltiples, una para cada tipo de microorganismo (Girafa y Carminati, 2008).
El conocimiento de la distribucin de los microorganismos en sus ambientes naturales,
adems de su composicin, es importante en ecologa microbiana y en aspectos de
seguridad microbiolgica de alimentos (Bottari et al., 2006), Recientemente, Tuohy et al.
(2007) demostraron que una cepa probitica de Lactobacillus casei sobrevive bien en el tracto
gastrointestinal de humanos y Moroni et al., (2006) visualizaron la competencia entre una
cepa de Bifidobacterium aislada de un neonato y una de Listeria monocytogenes, bloqueando la
primera la invasin por Listeria.
Mediante el uso de estos mtodos, junto con los tradicionales, ha avanzado la comprensin de
la estructura y la funcin de la compleja microbiota presente en los alimentos, haciendo posible
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planear de manera ms racional su control, en el caso de los indeseables o su desarrollo, en el

caso de los responsables de la fermentacin de los alimentos.
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Identificacin y tipificacin molecular de

Staphylococcus aureus en alimentos.
Dr. Jaime A. Bustos Martnez
Las enfermedades de origen alimentario (EOA), las ha definido la OMS como enfermedades
por infecciones o toxinas naturales causadas por el consumo de agua o alimentos. Se conocen
ms de 250 EOA, sus sntomas varan dependiendo del agente etiolgico. La diarrea y el
vmito son los sntomas ms comunes. El nmero de casos, hospitalizaciones y muertes es
elevado (Le Loir et al., 2003).
Las bacterias son una de las principales causas de las EOA, debido a que su patognesis se
centra en su habilidad para penetrar, sobrevivir y multiplicarse en las clulas husped. La
patognesis en gran medida depende de la capacidad de la bacteria para producir toxinas
despus de la ingestin (en el tracto digestivo) o antes (toxinas preformadas en los alimentos).
Dentro de las bacterias Gram-positivas que causan EOA se encuentra Staphylococcus aureus. (Le
Loir et al., 2003)
Staphylococcus aureus es una de los principales agentes etiolgicos de gastroenteritis causada por
el consumo de alimentos contaminados. La intoxicacin alimentaria por estafilococos (IAE) se
debe a la absorcin de las enterotoxinas estafiloccicas (SEs) preformadas en los alimentos (Le
Loir et al., 2003; Alarcn et al., 2006).
Staphylococcus aureus: caractersticas y enterotoxinas
S. aureus es un coco Gram-positivo anaerobio facultativo, no es mvil, es coagulasa y catalasa
positivo. Las clulas son esfricas, se encuentran solas, en pares o formando agrupaciones
como racimos de uvas (staphylo significa uva en griego). La pared del estafilococo es resistente a
la lisozima y sensible a la lisostafina, la cual rompe especficamente los puentes de pentaglicina
del estafilococo.
Las cepas de S. aureus se pueden clasificar en biotipos de acuerdo a su origen animal o humano.
Se han desarrollado esquemas basados en sus caractersticas bioqumicas que incluyen seis
biotipos diferentes: humano, humano no -hemoltico, aviar, bovino, ovino y no especfico
(Devriese, 1984: 215-220).
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Identificacin y tipificacin molecular
Algunas cepas de S. aureus son capaces de producir enterotoxinas estafiloccicas, estas cepas son
los agentes causales de la intoxicacin alimentaria por estafilococos. S. aureus no forma esporas,
por lo que su contaminacin puede ser rpidamente eliminada al tratar con calor la comida.
Sin embargo, permanece como una causa principal de EOA debido a que puede contaminar
productos alimenticios durante su preparacin y procesamiento.
S. aureus se puede encontrar en las narinas, piel y cabello de los animales de sangre caliente.
Entre el 30 y 50% de la poblacin humana son portadores de S. aureus (Bustos et al., 2006).
S. aureus es capaz de crecer en un rango amplio de temperatura (7 a 48.5C con una temperatura
ptima de 30 a 37C) (Schmitt et al., 1990). Puede crecer a pH de 4.2 a 9.3 con un pH ptimo
de 7 a 7.5 (Le Loir et al., 2003). Crece en altas concentraciones de cloruro de sodio (arriba
del 15% de NaCl). Estas caractersticas lo hacen capaz de crecer en una amplia variedad de
alimentos. Adems su nicho ecolgico, explica fcilmente su incidencia en los alimentos que
requieren manipulacin durante el proceso, incluyendo alimentos fermentados como el queso.
S. aureus es una bacteria patgena importante debido a su virulencia, mediada por la combinacin
de sus toxinas, sus factores de invasividad y su resistencia a los antibiticos. Por lo que el espectro
de infecciones que produce es muy variado, causa desde furnculos hasta el sndrome del shock
txico y sepsis, infecciones nosocomiales e infecciones adquiridas en la comunidad. Varios
de estos padecimientos dependen de numerosos factores de virulencia (Bustos et al., 2006;
Bachert et al., 2002). Sin embargo, por otra parte, la intoxicacin alimentaria por estafilococos
(IAE), depende principalmente de un tipo de factor de virulencia: las SEs. Los sntomas de
IAE son dolor abdominal, nausea, vmito, algunas veces seguido de diarrea (nunca diarrea
solamente). La aparicin de los sntomas es rpida (de 30 min a 8 h) y se observa generalmente
una remisin espontnea despus de 24h (Balaban et al., 2000; Le Loir et al., 2003).
Se encuentran descritos ms de 20 tipos de enterotoxinas estafiloccicas (SEs) y enterotoxinas
estafiloccicas-similares (SE-like, SEl), las primeras se nombran de la A a la E y G, las segundas
de la H a la U (Bohach, 2006:464-485). Las SEs son protenas pequeas (entre 24 y 28kDa),
secretadas en el medio y solubles en agua. Son ricas en lisina, cido asprtico, cido glutmico
y tirosina. Muchas poseen un loop de cistena que se requiere para su reconocimiento y su
actividad emtica. Son protenas muy estables, resisten muchas enzimas proteolticas como
la pepsina, la tripsina, la quimiotripsina, la renina, por lo que pueden mantener su actividad
en el tracto digestivo despus de la ingestin (Le Loir et al., 2003; Bachert et al., 2002). Las
SEs tambin son muy resistentes al calor y al pH bajo (Bennet, 1992). Por lo que ests toxinas
resisten las condiciones que destruyen fcilmente a la bacteria que las produjo.
Los genes que codifican las SEs se localizan en diferentes partes, principalmente en elementos
genticos mviles. Se pueden encontrar en profagos, plsmidos, transposones, islas de
patogenicidad y en el cromosoma (Le Loir et al., 2003; Bustos et al., 2006).
El principal sistema regulador que controla la expresin de los genes de los factores de
virulencia en S. aureus es el regulador de genes accesorios (accessory gene regulator, agr), que
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acta en combinacin del regulador accesorio estafiloccico (staphylococcal accesory regulator,

sar) (Bronner et al., 2004). La produccin de SEs dependientes de agr en alimentos, depende
de la habilidad de S. aureus de alcanzar una alta densidad celular en los alimentos (se estima
de 106 ufc/g). S. aureus se considera una bacteria exigente en trminos de requerimientos
nutricionales, necesita valina para su crecimiento, adems de arginina y cistena tanto
para crecer como para producir las SEs (Onoue et al., 1997). Glucosa y pH bajo tienen un
efecto inhibitorio sobre la expresin de agr. La produccin de SEs es ptima a pH neutro
y disminuye en pH cido, generalmente la produccin se inhibe a pH menor de 5 (Novick,
2006; Bronner et al., 2004).
S. aureus es muy sensible a la competencia microbiana. Este efecto se ha estudiado bien en
productos alimenticios fermentados, se ha demostrado que ha mayor concentracin de
microorganismos competidores en la leche, disminuye la velocidad de crecimiento de S. aureus
y la produccin de SEs (Genigeorgis, 1989:327-360).
La mayora de las SEs presentan dos actividades principales: la actividad emtica y la de
superantgeno. Estas funciones se localizan en dominios separados de la protena (Dinges et al.,
2000). Debido a su actividad de superantgeno producen reacciones cruzadas que dan como
resultado la activacin no especfica y la proliferacin de linfocitos T, dando como resultado
la secrecin masiva de interleucinas que pueden estar involucradas en los mecanismos
de toxicidad de las SEs. Las SEs activan clulas T en rdenes de magnitud superiores a la
activacin antgeno-especfica. Esta dramtica activacin causa el sndrome del shock txico
(McCormick et al., 2001).
El efecto emtico no est bien caracterizado. Adems, poco se conoce de cmo las SEs causan
los sntomas de envenenamiento alimentario, es posible que las SEs presenten un efecto directo
sobre el epitelio intestinal y sobre el nervio vago, causando estimulacin sobre el centro emtico
y el trnsito intestinal (Arbuthnott et al., 1990).
Intoxicacin alimentaria por estafilococos
En todos los casos de IAE, el alimento o uno de sus ingredientes se hallaba contaminado
con cepas de S. aureus productoras de SE y fueron expuestos, al menos por un tiempo, a
temperaturas que permiten el crecimiento de S. aureus. Esto puede deberse a fallas en el proceso
de refrigeracin o porque se requieren temperaturas permisivas de crecimiento durante el
proceso de fabricacin (por ejemplo, la produccin de queso). Muchos y variados alimentos
pueden ser un buen medio de crecimiento de S. aureus y por lo tanto implicar la IAE, se incluyen:
leche, crema, mantequilla, jamn, quesos, salchichas, carne enlatada, ensaladas, sndwich y
platos de comidas (Le Loir et al., 2003).
Es importante eliminar cualquier fuente de contaminacin durante el procesamiento y
refrigeracin de los alimentos y sus ingredientes. Los alimentos deben refrigerarse antes y
despus del tratamiento con calor (pasteurizacin). En el caso de alimentos enlatados estos
deben procesarse correctamente y se deben destruir las bacterias y las SEs.
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Los alimentos que ms involucran IAE difieren de un pas a otro, en el Reino Unido se debe
al jamn (Wieneke et al., 1993), en Francia los quesos y en Estados Unidos las carnes rojas
(Genigeorgis, 1989:327-360). En todos los casos de IAE, la principal fuente de contaminacin
de los alimentos son los humanos, contaminacin va contacto por manos o va aparato
respiratorio por tos o estornudo. La contaminacin ocurre despus del tratamiento con calor
de los alimentos. No obstante los alimentos como carne cruda, salchichas, leche cruda y
quesos de leche cruda, se contaminan de los animales de origen y con mayor frecuencia
cuando el animal es portador o se encuentra con infeccin por S. aureus, por ejemplo, la
mastitis (Akineden et al., 2001).
Los alimentos y sus ingredientes deben estar sujetos regularmente a control microbiolgico. Entre
las cepas de S. aureus aisladas de muestras de alimentos, el porcentaje de cepas enterotoxignicas es
de alrededor del 25% (Le Loir et al., 2003). Sin embargo, esta estimacin vara dependiendo del
tipo de alimento y del lugar del muestreo. Uno de los factores importantes en productos lcteos es la
presencia de vacas con mastitis, por ejemplo en un reporte de Alemania se encontr que el 72.8%
de las cepas aisladas eran enterotoxignicas, productoras de SEA a SEJ (Akineden et al., 2001).
Actualmente en la mayora de los lugares slo se buscan las toxinas clsicas SEA a SEE, sin embargo
utilizando tcnicas de biologa molecular, se ampla el nmero de cepas enterotoxignicas cuando
se buscan las SEs descritas recientemente (Le Loir et al., 2003). Esto demuestra la importancia de
cuantificar adecuadamente la produccin de todas las SE en los alimentos para tener una idea clara
de la relacin entre las SE descritas recientemente y la intoxicacin alimentaria.
Una concentracin de 106 a 108 ufc de S. aureus por gramo de alimento es suficiente para
producir IAE. Una dosis de menos de 1g de enterotoxina, la cual puede ser producida por 105
ufc/gramo, en alimentos contaminados puede producir sntomas despus de 1 a 6 horas de la
ingestin (FDA, 2007). La dosis infectiva requerida para inducir IAE se estima en alrededor de
0.1g y puede variar por la sensibilidad del paciente (Evenson et al., 1988).
En muchos pases las normas oficiales solicitan la ausencia de S. aureus en 1 g o ml de alimento
como en productos basados en huevo o alimentos listos para comer. Tambin pueden solicitar
un bajo nivel de contaminacin 102 o 103 ufc/g, en productos que van a ser cocinados como
la carne molida y las salchichas (Alarcn et al., 2006). De igual manera en productos frescos
como los quesos, ya que en estas concentraciones no se considera un riesgo para la salud, como
en Mxico (Secretaria de Salud, 1994) y Francia (AFNOR, 2004).
Mtodos moleculares de identificacin de S. aureus en alimentos
La identificacin microbiolgica clsica de S. aureus en alimentos, implica la deteccin y
cuantificacin de estafilococos coagulasa positivos en un medio selectivo, generalmente
el medio Baird-Parker. La sensibilidad de estas pruebas es de alrededor de 102 ufc/g para
alimentos slidos y de 10 ufc/g para muestras lquidas (Baird et al., 1995).
Regularmente se realiza una cuenta directa o se recuperan colonias aisladas despus del
enriquecimiento en un caldo selectivo por 24-48h a 37C. A las colonias sospechosas se les
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realiza la prueba de coagulasa y DNasa y se identifican por pruebas bioqumicas, como el

mtodo de identificacin con galeras API de bioMrieux. Esta metodologa convencional
toma de cinco a seis das.
Los mtodos de identificacin microbiolgica han sido considerados como estndar de oro en
la identificacin de bacterias. En muchos laboratorios tambin se incluye el anlisis basado en
caractersticas fenotpicas utilizando pruebas bioqumicas, serolgicas y perfiles enzimticos.
Sin embargo, existen varias desventajas asociadas con los mtodos microbiolgicos. Se pueden
encontrar resultados negativos si el nmero de patgenos en la muestra es muy bajo. Cultivos
negativos tambin pueden obtenerse a partir de muestras obtenidas despus de una terapia
con antibiticos ya que las muestras pueden contener residuos de antibiticos. La presencia
de leucocitos en la leche de casos clnicos con mastitis puede producir resultados negativos
(Gillespie et al., 2005).
Estos mtodos requieren de ms de 48 horas para obtener el resultado. Adems la inadecuada
deteccin del patgeno o la realizacin de pruebas de confirmacin aumentan el tiempo para
intervenir y controlar la contaminacin y su diseminacin (Gillespie et al., 2005).
La utilizacin de ensayos basados en el DNA resuelve varios de los problemas asociados con
los procedimientos microbiolgicos convencionales. La mayor ventaja es que los mtodos
diagnsticos basados en el DNA estn enfocados a la composicin nica de los cidos nucleicos
del genoma bacteriano, ms que a la expresin fenotpica de los productos codificados por los
cidos nucleicos. Por lo tanto, los ensayos basados en el DNA estn sujetos a menos variabilidad
comparados con los mtodos basados en la caracterizacin fenotpica. Los sistemas de
identificacin basados en el DNA estn dirigidos para patgenos especficos, se puede realizar
un escrutinio rpido de un nmero grande de patgenos de manera simultnea y proporcionar
una confirmacin definitiva de los patgenos.
El mtodo ms utilizado actualmente para la deteccin de microorganismos patgenos es la
reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), inventada por Kary Mullis en la dcada de los
ochenta (Mullis et al., 1986). Este mtodo puede identificar bacterias en unas cuantas horas.
El mtodo se basa en amplificar millones de veces una secuencia de DNA a partir de una copia
del gen que se est buscando. Para esto se utiliza una DNA polimerasa que puede realizar este
proceso de manera eficiente, la llamada taq polimerasa, la cual es una enzima termoestable
aislada de una bacteria termorresistente.
La tcnica de PCR se ha utilizado ampliamente para la identificacin de S. aureus, en
especial se han utilizado para su deteccin genes esenciales o housekeeping, como el gen
nuc que codifica para una nucleasa termoestable (Brakstad et al., 1992). Genes del rRNA
como: las regiones espaciadoras del rDNA 16S-23S (Saruta et al., 1997); el gen del rRNA
23S (Straub et al., 1999: Akineden et al., 2001). Genes de resistencia a los antibiticos
como: el gen mecA, que confiere resistencia a la meticilina (Oliveira et al., 2002:); el gen van,
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que da resistencia a la vancomicina (Depardieu et al., 2004). Genes de virulencia como: el gen
coa, que codifica para la coagulasa y el gen spa, que codifica para la protena A (Kalorey et al.,
2007; Akineden et al., 2001). Genes de toxinas como: los genes sea, seb, sec de enterotoxinas
(Nakayama et al., 2006; Akineden et al., 2001); el gen tst de la toxina del sndrome del shock
txico (Jonson et al., 1996; Akineden et al., 2001); los genes eta y etb, que codifican toxinas
exfoliativas (Johnson et al., 1996; Akineden et al., 2001).
En el caso de los alimentos si se quiere detectar por PCR la presencia de la bacteria se utilizan
los genes nuc, coa y spa (Kalorey et al., 2007; Alarcn et al., 2006), si lo importante es determinar
la presencia de las toxinas de S. aureus, se utiliza principalmente la deteccin de los genes de
las SE (Akineden et al., 2001: Nakayama et al., 2006). Esta metodologa se ha empleado en
alimentos como: leche (Cremonesi et al., 2005; Jorgensen et al., 2005); queso (Jorgensen et al.,
2005; Ercolini et al., 2004); salchichas (Holeckov et al., 2002, Alarcn et al., 2006); pollo (Pepe
et al., 2006), pescado (Herrera et al., 2006), carne, ensaladas y una gran variedad de alimentos
(Alarcn et al., 2006).
A fines del siglo pasado Higuchi y colaboradores describen la PCR en tiempo real, la cual
vuelve a revolucionar la metodologa para la deteccin de agentes infecciosos (Higuchi et al.,
1993). La diferencia con la PCR normal o tambin llamada de punto final, es que en la PCR
el producto de la reaccin se puede observar hasta el final mediante electroforesis en un gel de
agarosa teido normalmente con bromuro de etidio, mientras que en la PCR en tiempo real
se va observando la amplificacin del DNA ciclo a ciclo, no se necesita esperar a que finalice la
reaccin para saber si la muestra analizada contiene el gen que se busca, por lo que el resultado
se obtiene inmediatamente sin necesidad de realizar la electroforesis del producto final. Esta
metodologa es ms sensible y puede hacerse una determinacin cuantitativa, de tal manera
que se puede saber el nmero de copias del gen que se est buscando en la muestra analizada.
Tambin se requiere menos tiempo para la deteccin (aproximadamente una hora y media). Es
un mtodo muy reproducible y con alta sensibilidad, al igual que en la PCR se pueden llevar a
cabo reacciones para detectar varios genes al mismo tiempo (reaccin multiplex).
La deteccin del gen de inters se puede realizar por varias tcnicas basadas en: sustancias
intercalantes del DNA como el SYBR green; en iniciadores marcados como los LUX; sondas de
hibridacin como Hybprobes o sondas de hidrlisis como TaqMan.
Utilizando la tecnologa de la PCR en tiempo real se ha determinado y cuantificado la
presencia tanto de S. aureus (Goto et al., 2007), como sus toxinas (Cremonesi et al., 2005). Se
han desarrollado pruebas multiplex para la deteccin simultnea de varios agentes patgenos
incluido S. aureus (Gillespie et al., 2005).
La deteccin de S. aureus utilizando la PCR en tiempo real se ha realizado en mltiples alimentos
como queso (Hein et al., 2001; Poli et al., 2007), leche (Ikeda et al., 2005; Goto et al., 2007;
Gillespie et al., 2005), carne, salchichas, ensaladas, salmn ahumado, pat, huevos preparados
y helados entre otros (Alarcn et al., 2006; Berrada et al., 2006).
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Tipificacin molecular de S. aureus

Las epidemias de enfermedades infecciosas resultan de la exposicin de un agente etiolgico
comn. Generalmente, este agente se deriva de una sola clula cuya progenie es genticamente
idntica o cercanamente relacionada. En trminos epidemiolgicos, los organismos
involucrados en las epidemias estn relacionados clonalmente, es decir, tienen un origen comn.
Los organismos relacionados clonalmente son miembros de la misma especie que comparten
factores de virulencia, rasgos bioqumicos y caractersticas genmicas. Sin embargo, existe
suficiente diversidad a nivel de especie para qu organismos aislados de diferentes fuentes y/o
en diferentes regiones geogrficas pueden ser diferenciados y clasificados en subtipos o cepas.
El proceso de tipificacin es de gran importancia epidemiolgica para reconocer entre otras
cosas: epidemias, deteccin de transmisin cruzada de patgenos nosocomiales, determinacin
de la fuente de infeccin, reconocimiento de cepas particularmente virulentas y monitoreo de
programas de vacunacin (Olive et al., 1999).
Cualquier mtodo de tipificacin debe tener un elevado poder de diferenciacin, debe ser
capaz de diferenciar claramente cepas no relacionadas, como aquellas que provienen de
diferente lugar, pero al mismo tiempo debe demostrar la relacin de todos los organismos
aislados de individuos infectados de la misma fuente.
En un sistema de tipificacin, la velocidad de mutacin puede influenciar directamente la
estabilidad de los patrones durante los ciclos de replicacin de una clona bacteriana. La
velocidad de mutacin, incluye mutaciones puntuales, rearreglos genticos y transferencia
horizontal de elementos genticos mviles, como fagos y transposones, y es diferente de una
especie bacteriana a otra (Olive et al., 1999).
Las cepas de S. aureus pueden variar considerablemente en virulencia y potencial epidemiolgico.
Para controlar la diseminacin de las infecciones estafiloccicas, se debe identificar la fuente
de contaminacin y los mecanismos de transmisin. Los estudios epidemiolgicos y de
patogenicidad, dependen de la habilidad de los sistemas de tipificacin para poder diferenciar
entre cepas que pertenecen a la misma o diferente especie bacteriana.
S. aureus causa brotes epidmicos de intoxicacin alimentaria que involucran un nmero elevado
de personas, con hospitalizaciones y muertes (Le Loi et al., 2003; Do Carmo et al., 2004). En
estos casos es de suma importancia identificar el alimento contaminado y la cepa causante
del brote. Debido a la importancia clnica y epidemiolgica de S. aureus, se han realizado
numerosos estudios de tipificacin molecular de este microorganismo. Dentro de los mtodos
utilizados se encuentran: el anlisis de DNA polimrfico amplificado al azar (RAPD) (Van
Leeuwen et al., 1996); el anlisis del polimorfismo longitudinal de fragmentos de restriccin
(RFLP) (Yugueros et al., 1999); la tipificacin de secuencias multilocus (MLST) (Rabello et al.,
2007). Sin embargo, ha sobresalido la electroforesis en gel de campos pulsados (PFGE) y se
le considera como el estndar de oro en la tipificacin (Olive et al., 1999). La PFGE se ha
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utilizado ampliamente en la tipificacin de cepas de S. aureus tanto en infecciones nosocomiales

(Mulvey et al., 2001) como en intoxicaciones alimentaras (Kluytmans et al., 1995).
La caracterizacin de cepas de S. aureus enterotoxignicas causantes de brotes epidmicos de
intoxicacin alimentaria se ha estudiado ampliamente, tanto por RAPD como por PFGE y
MLST (Krouanton et al., 2007:369-375; Martin et al., 2004; Smith et al., 2005). No slo se
analizan los alimentos, sino tambin a las personas que los preparan, ya que stas pueden ser
las portadoras de las cepas enterotoxignicas (Fueyo et al., 2005; Colombari et al., 2007:).
Conclusiones
Las nuevas tecnologas de anlisis microbiolgico basadas en el estudio del DNA han
revolucionado la manera de identificar y caracterizar a los microorganismos. En el caso
particular de S. aureus, bacteria causante de mltiples enfermedades debido a que presenta
una gran cantidad de factores de virulencia y resistencia a los antibiticos, es en estos genes
que codifican los factores de virulencia en donde se basa principalmente la identificacin y
tipificacin de las cepas enterotoxignicas que se encuentran en los alimentos y que causan la
intoxicacin alimentaria por estafilococos. Por lo que el conocer y manejar la tecnologa del
DNA es de gran importancia en la actualidad.
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Rutas de transduccin de seales y regulacin

de la morfognesis en hongos
Los hongos filamentosos
Los hongos filamentosos, en contraposicin a las levaduras unicelulares, presentan un desarrollo

morfolgico y un ciclo de vida ms complejo, con la formacin frecuentemente de esporas
tanto de origen sexual como asexual. La mayora de los hongos pertenecientes a la Divisin
de los Ascomicetos son filamentosos, caracterizados por tener hifas regularmente septadas
y formar colonias compactas, en contraposicin a los Zigomicetos, con hifas cenocticas y
colonias de morfologa ms laxa. Los Ascomicetos filamentosos se caracterizan adems por la
formacin de estructuras de origen sexual denominadas ascas, que contienen las ascosporas, y
la formacin de conidios (esporas asexuales) exgenos, que aparecen sobre hifas especializadas
denominadas conidiforos.
Los hongos filamentosos tienen una gran importancia para el ser humano, ya que participan
en numerosos procesos relacionados con actividades humanas, por ejemplo:
Ecologa: remineralizacin de materia orgnica, biorremediacin
Biotecnologa: produccin de antibiticos, frmacos, enzimas, etc.
Microbiologa de alimentos: participacin en procesos de maduracin de muchos
alimentos, como el queso (Penicillium roqueforti, P. camemberti), salamis (P. nalgiovense) y otros.
Patgenos: humanos (Aspergillus fumigatus, Penicillium marneffei) y fitopatgenos
(Fusarium spp., Magnaporthe grisea, Botrytis cinerea, etc)
El principal sistema de propagacin de los hongos filamentosos es a travs de esporas asexuales.
En aos recientes se han realizado importantes avances en la comprensin de los mecanismos
que controlan el proceso de formacin de estas esporas, denominado comnmente proceso
de conidiacin, habindose caracterizado un buen nmero de genes que regulan este proceso,
principalmente en el hongo ascomiceto Aspergillus nidulans.
Estmulos ambientales de la conidiacin
El desarrollo vegetativo de los hongos filamentosos comienza con la germinacin de una
espora, la cual produce inicialmente una hifa que crece de forma polar mediante extensin
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Rutas de transduccin de seales y regulacin de la morfognesis en hongos
apical. A medida que crece longitudinalmente la hifa se ramifica, y el resultado final es una
red de clulas interconectadas que se denomina micelio. Este micelio forma una colonia que
crece radialmente a una velocidad constante. En Aspergillus nidulans, unas 16 h despus de la
germinacin surgen en el centro de la colonia hifas especializadas denominadas hifas areas
(Champe y Simn, 1992), muchas de las cuales se diferenciarn posteriormente para formar
conidiforos. Los conidiforos forman una vescula (hinchamiento) en la parte apical (Fig.
1), sobre la que se desarrolla una corona de clulas denominadas mtula, y sobre stas las
filides, clulas especializadas con forma de matraz que sufren mitosis sucesivas en su parte
apical generando los conidios en una sucesin basiptala. En Penicillium el conidiforo no forma
una vescula sino que se ramifica en la parte apical originando las mtula y a continuacin
las filides, que producirn los conidios.
La formacin de conidiforos y conidios est sujeta a unas determinadas condiciones fisiolgicas,
la ms importante de las cuales es la exposicin al aire (Law y Timberlake, 1980). Cuando el
micelio se expone al aire se producen una serie de importantes cambios en las propiedades de
superficie del micelio, como la aparicin de una capa hidrfoba formada principalmente por
protenas denominadas hidrofobinas (Wessels, 1997), las cuales son muy abundantes en los
conidios. Por norma general, los hongos filamentosos no conidian en cultivos sumergidos, si
bien puede inducirse la conidiacin estableciendo condiciones especficas, entre las que cabe
citar la limitacin de determinados nutrientes, una alta osmolaridad y la adicin de iones Ca2+
en especies de Penicillium (Roncal y Ugalde, 2003).
Otro estmulo ambiental que induce la conidiacin en determinadas especies como Neurospora
crassa, Trichoderma viridae y Aspergillus nidulans es la exposicin a la luz. En Neurospora crassa la
protena White Collar-1 (WC-1), que contiene FAD como cofactor, se ha identificado como
el receptor de luz azul que media la induccin por la luz del reloj circadiano (Froehlich et al.
2002; He et al. 2002).
Figura 1. Morfologa del

conidiforo y estructuras formadoras de los conidios en los gneros Penicillium
y Aspergillus.
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Inductores endgenos
Adems de los estmulos ambientales se han identificado inductores endgenos, o autoinductores,
molculas de bajo peso que son producidas por el propio hongo y que inducen la conidiacin,
actuando aparentemente de forma similar a los sistemas de Quorum Sensing descritos en
bacterias (Swift, 1996). En Penicillium notatum se observ que eran necesarias 7 h de crecimiento
vegetativo para inducir conidiacin en cultivo sumergido mediante adicin de iones Ca2+, sin
embargo este periodo de incubacin era innecesario si el micelio se cultivaba en un medio
donde previamente se haba crecido el hongo (Hadley y Harrold, 1958). Posteriormente se
obtuvieron estos mismos resultados en Penicillium cyclopium y se aisl un compuesto diterpeno
que era responsable de la actividad observada, y al cual se denomin conidiogenona (Roncal
et al. 2002). Se comprob que la conidiogenona era suficiente y necesaria para inducir la
conidiacin en cultivo sumergido, y que por tanto el papel de los iones Ca2+ en la induccin era
meramente auxiliar, reduciendo el umbral de concentracin de conidiogenona necesario para
inducir conidiacin entre 5 y 6 veces. La induccin de la conidiacin por la conidiogenona
ofrece una explicacin al requerimiento de la exposicin area para que se produzca la
conidiacin; en cultivo sumergido el autoinductor difunde en el medio y no llega a alcanzar la
concentracin umbral que desencadena el proceso de diferenciacin, sin embargo en cultivo
slido, la conidiogenona no difunde de la misma forma, y alcanza una concentracin en la
zona del micelio areo suficiente para inducir la diferenciacin y posterior conidiacin.
Otros posibles inductores endgenos han sido encontrados en otros hongos, como el esporgenoPF1, de Penicillium funiculosum, cuya sntesis es estimulada por la luz azul, y que es capaz de
inducir conidiacin en condiciones de oscuridad (Katayama, 1989). En Aspergillus nidulans se
postula la existencia de una molcula autoinductora en cuya sntesis estara involucrado el gen
fluG, ya que un mutante en este gen es aconidial, pero sin embargo es capaz de conidiar cuando
crece en presencia de la cepa silvestre, formando un nmero normal de conidios en el borde de
la colonia prximo a la silvestre (Lee y Adams, 1994).
Regulacin gentica de la conidiacin
El proceso de desarrollo morfolgico que conduce a la formacin de conidios en los hongos
filamentosos se ha estudiado principalmente en Aspergillus nidulans. Se trata de un proceso
secuencial, en el cual las diferentes estructuras van apareciendo y desarrollndose bajo el control
de una serie de genes que definen la denominada: va reguladora central de la conidiognesis
(Adams et al. 1998).
Esta va reguladora central de la conidiognesis consiste en 3 genes que fueron identificados
mediante el estudio de mutantes bloqueados en diferentes fases del proceso de la conidiacin:
brlA, su expresin es necesaria y suficiente para desencadenar la conidiognesis. Controla
directamente la expresin de genes implicados en las primeras etapas del proceso y la del
segundo gen de la va reguladora central: abaA. Los mutantes brlA son incapaces de completar
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la diferenciacin de los conidiforos, los cuales crecen hasta una longitud 20 o 30 veces mayor
que los silvestres; estos mutantes son denominados bristle (erizados) por la apariencia de sus
colonias, consecuencia del excesivo desarrollo sin diferenciacin de los conidiforos. brlA
codifica una protena que contiene un motivo de unin a ADN de tipo Zinc-finger, se trata por
tanto de un factor de transcripcin que se une a la secuencia consenso BRE (BrlA Response
Elements) en los promotores de los genes que controla (Chang y Timberlake, 1992)
abaA, implicado en las etapas intermedias del proceso. Regula la expresin de numerosos
genes especficos de la conidiacin y del ltimo de los genes de la va central, el gen wetA.
Los mutantes abaA se denominan abacus, ya que desarrollan conidiforos normales pero las
mtula y filides son anormales y no producen conidios, formando en su lugar estructuras
alargadas compuestas de cadenas de clulas con abultamientos que asemejan la forma de
un baco. abaA codifica un polipptido que contiene un dominio de unin a ADN similar
al de factores de transcripcin como el simian virus 40 enhancer factor TEF-1 (Andrianopoulos
y Timberlake, 1991), y una posible cremallera de leucina para dimerizacin. El factor AbaA
se une especficamente a la secuencia consenso 5-CATTCY-3 (ARE), que est presente en
muchos genes especficos de la conidiacin incluido wetA.
wetA, se expresa con posterioridad a los otros dos y regula las etapas finales del proceso y
la formacin de conidios, controlando entre otros la expresin de genes de biosntesis de
componentes de la pared celular. El fenotipo de los mutantes wetA se describe como wet-white
(hmedo-blanco), caracterizado por la formacin normal de conidiforos pero con conidios
no pigmentados y que se autolisan. wetA codifica un polipptido que no muestra similitudes
importantes con otras protenas en bases de datos, pero se postula que su funcin es la de
controlar la expresin de genes especficos de los conidios (Marshall y Timberlake, 1991).
En A. nidulans se han aislado adems muchos mutantes con fenotipos aconidiales, que se
denominan fluffy, y que definen reguladores tempranos del proceso conidiognico. Martinelli y
Clutterbuck (1971) propusieron que en torno al 83% de los mutantes en esporulacin estaban
alterados en su capacidad para iniciar el proceso antes de la formacin de la vescula del
conidiforo, y presumiblemente antes de la activacin de la expresin de brlA.
Mediante un extensivo anlisis gentico de mutantes fluffy recesivos se lograron identificar 6
genes: fluG, flbA, flbB, flbC, flbD, y flbE (Wieser, 1994). Mutaciones de prdida de funcin en
cualquiera de estos genes causaban fenotipos tipo fluffy y una clara disminucin del primer gen
de la va reguladora central de la conidiognesis. Estos 6 genes han sido aislados y estudiados.
El gen fluG, como se dijo con anterioridad parece estar involucrado en la sntesis de una seal
extracelular que acta como un autoinductor de la conidiacin. fluG codifica una protena
relacionada con la glutamina sintetasa I procariota. Los genes flbB, flbC y flbD codifican
protenas de unin a cidos nucleicos, y probablemente actan activando la transcripcin de
otros genes reguladores del desarrollo, como el propio brlA, en respuesta a seales inductoras
de la conidiacin. Los transcritos de los genes fluG, flbB, flbC, flbD y flbE estn presentes durante
el desarrollo vegetativo y se mantienen en niveles aproximadamente constantes durante las
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distintas etapas de la diferenciacin. Por su parte, flbA codifica un polipptido de 719 aminocidos
que muestra similitud con una familia de protenas que comparten un dominio C-terminal
conservado de 120 aminocidos, el cual ha sido denominado RGS (Regulator of G-protein
Signaling) (Dohlman y Thorner, 1997). El dominio RGS tiene una funcin reguladora de la
seal mediada por protenas G heterotrimricas, al activar la actividad GTPasa endgena de
la subunidad a de estas protenas, lo que lleva a su inactivacin temporal.
La funcin de flbA qued establecida cuando se caracteriz otra mutacin dominante en otro
gen, fadA. Esta mutacin corresponda a un cambio de un residuo glicina por una arginina en
la posicin 42, dando lugar al alelo mutante fadAG42R, el cual causa un fenotipo fluffy y autoltico
similar al de los mutantes flbA (Yu et al. 1996). fadA codifica la subunidad a de una protena G
heterotrimrica. Las protenas G heterotrimricas estn compuestas de 3 subunidades: a, b y g.
En su estado inactivo la protena se encuentra formando un trmero, asociada a la membrana
plasmtica, y la subunidad a tiene unida una molcula de GDP. Cuando un receptor de
membrana denominado G protein-coupled receptor es activado por una seal, la subunidad a de
la protena G heterotrimrica sufre un cambio conformacional que provoca su separacin del
dmero bg y el intercambio de GDP por GTP (Hamm, 2001). La subunidad a y el dmero bg
por separado estn entonces activos para interaccionar con sus efectores correspondientes.
Pero esta activacin es temporal, la subunidad a posee una actividad GTPasa endgena que
hidroliza GTP en GDP, y cuando esto sucede la subunidad vuelve a unirse al dmero bg para
formar el trmero inactivo. La mutacin G42R provoca la inactivacin de la actividad GTPasa
de FadA, y consecuentemente produce una subunidad a constitutivamente activa, la cual
inhibe permanentemente el proceso de conidiacin dando lugar a un mutante fluffy. FadA es
por tanto un regulador negativo del proceso de conidiacin, mientras que el papel de FlbA
es antagonista de FadA, estimulando la actividad GTPasa de esta ltima, lo que provoca su
inactivacin, y consecuentemente la estimulacin de la conidiacin. La inactivacin de flbA
hace que FadA permanezca activa durante mucho ms tiempo, reprimiendo la conidiacin y
generando un mutante fluffy.
En base a estos resultados se postul la existencia de dos rutas antagonistas de control del
proceso de conidiognesis (Adams et al. 1998) (Fig. 2). La protena G heterotrimrica con la
subunidad a FadA bloquea la conidiacin, favoreciendo el desarrollo vegetativo; para que
se produzca la conidiacin FadA debe ser al menos parcialmente inactivada mediante la
actividad de FlbA. Por otro lado, una seal extracelular dependiente de la actividad de FluG
activa otras rutas de transduccin de seales que conducen a la conidiacin, y entre cuyos
componentes estn los productos de los genes flbB, flbD, flbE y flbC. Estos genes se transcriben
constitutivamente pero su actividad es especfica del proceso de esporulacin, por lo que la
sealizacin mediada por FluG posiblemente incluya la modificacin transcripcional de los
productos de estos genes para activarlos.
La subunidad a FadA acta a travs de la protena kinasa dependiente de AMPc, PkaA (Shimizu
y Keller, 2001). Esta kinasa acta promoviendo el crecimiento vegetativo y bloqueando la
esporulacin.
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El gen que en Aspergillus nidulans codifica la subunidad b de la protena G heterotrimrica se

denomina sfaD. Los mutantes DsfaD tienen un fenotipo caracterizado por la sobreproduccin
de conidios, por lo que se deduce que tambin la subunidad b es un regulador negativo de la
esporulacin asexual (Rosn et al. 1999).

Figura
2. Modelo de regulacin de la esporulacin asexual en Aspergillus nidulans a travs de dos rutas
antagnicas. Modificado de Adams et al. (1998), Lengeler et al. (2000), Shimizu y Keller (2001) y Rosn
et al. (1999).
Relacin entre el desarrollo morfolgico y el metabolismo secundario
Adems de su funcin como inhibidor del desarrollo morfolgico y la conidiacin, la
subunidad a FadA de Aspergillus nidulans regula la produccin de metabolitos secundarios
como la esterigmatocistina (Calvo et al. 2002). Mutantes con el alelo fadAG42R, que produce una
subunidad a constitutivamente activa, presentan adems de su fenotipo fluffy la incapacidad
de producir esterigmatocistina (Hicks et al. 1997).
El control de estos dos procesos se lleva a cabo principalmente a nivel transcripcional; en
mutantes fadAG42R se encuentra reprimida la expresin de los genes brlA, primero de la va
reguladora central de la conidiognesis, y aflR, que codifica un factor transcripcional especfico
que activa los genes biosintticos de esterigmatocistina. Este control es mediado por la protena
kinasa PkaA (Shimizu y Keller, 2001), tanto a nivel transcripcional como post-transcripcional.
Sin embargo, FadA tiene un efecto opuesto en la regulacin de la biosntesis de diferentes
metabolitos secundarios, as mientras reprime la sntesis de esterigmatocistina, regula
positivamente la sntesis de penicilina por una va an no caracterizada (Tag et al. 2000).
Este fenmeno no es exclusivo de Aspergillus nidulans, ya que se han descrito otros ejemplos de
regulacin diferencial de la sntesis de metabolitos secundarios por subunidades a homlogas a
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FadA en otros hongos, as por ejemplo, en Trichoderma atroviride, la subunidad a Tga1 tiene una
funcin opuesta en la regulacin de diferentes sustancias antifngicas (Reithner et al., 2005).
Adems del desarrollo morfolgico y la produccin de metabolitos secundarios, las protenas G
heterotrimricas tambin estn implicadas en procesos de virulencia en hongos fitopatgenos,
como ocurre en Magnaporthe grisea o Cryphonectria parasitica (Lengeler et al. 2000).
Caracterizacin de la subunidad a Pga1 de Penicillium chrysogenum
El gen pga1 codifica una subunidad a de una protena G heterotrimrica en Penicillium chrysogenum.
Pga1 pertenece al grupo I dentro de las subunidades a de los hongos (Blker, 1998), y presenta
una alta similitud con la protena FadA de A. nidulans (Garca-Rico et al. 2007).
La caracterizacin de Pga1 se llev a cabo mediante la interrupcin gnica del gen, generando
la cepa Dpga1, y la obtencin de cepas transformantes portadoras del alelo pga1G42R, que
produce una subunidad a constitutivamente activa, y otras portadoras del alelo pga1G203R,
que produce una subunidad a mutada la cual es incapaz de separarse del dmero bg, y por
tanto est permanentemente inactivada (Garca-Rico et al. 2007).
Las cepas pga1G42R presentan un fenotipo de tipo fluffy, con muy pocos conidios, mientras
las cepas Dpga1 y pga1G203R muestran un fenotipo hiperconidiante en medio slido, y adems
tambin conidian en medio lquido, una condicin en la que P. chrysogenum no desarrolla
habitualmente el proceso de conidiacin, lo que indica que Pga1 es un regulador negativo de la
conidiognesis (Garca-Rico et al. 2008). El control sobre la conidiacin se lleva a cabo mediante
la regulacin de la expresin de los genes brlA y wetA, pertenecientes a la va reguladora central
de la conidiognesis. En las cepas pga1G42R la expresin de brlA y wetA se encuentra reprimida,
en cambio en las cepas Dpga1 y pga1G203R la expresin de estos genes es ms alta que en la
parental, lo que provoca el fenotipo hiperconidiante en cultivos en medio slido. Adems, en
medio lquido, mientras en la cepa parental no hay expresin de brlA y wetA, en las cepas Dpga1
y pga1G203R se induce la expresin de ambos genes, dando lugar al desarrollo de las estructuras
conidiognicas y cadenas de conidios que se observan en dichas cepas en esta condicin.
Existen varios trabajos que describen la implicacin del AMP cclico (AMPc) en el proceso de
conidiacin en hongos filamentosos. En Aspergillus nidulans, la regulacin de la esporulacin
asexual por la subunidad a FadA se produce a travs de la protena kinasa dependiente de
AMPc PkaA (Shimizu y Keller, 2001). Tambin en Aspergillus niger (Bencina et al. 1997) y en
Penicillium marneffei (Zuber et al., 2002) se ha reportado un efecto negativo del AMPc en la
conidiacin. Sin embargo, en Penicillium chrysogenum la va sealizadora mediada por AMPc tiene
poca relevancia en el control negativo de Pga1 sobre la conidiacin (Garca-Rico et al. 2008).
Pga1 s modula la concentracin intracelular de AMPc, al igual que ocurre en otros hongos,
pero el incremento inducido de la concentracin de AMPc en la cepa parental, mediante la
utilizacin del anlogo funcional dibutiril-AMPc y el inhibidor de fosfodiesterasas teofilina,
caus una disminucin en el nmero de conidios de slo un 25%, mientras que en las cepas
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portadoras del alelo dominante activador pga1G42R la disminucin fue hasta de un 95%. Este
resultado indica que la represin de la conidiacin por Pga1 se lleva a cabo principalmente
por mecanismos independientes de la va sealizadora del AMPc. En contraste, en Penicillium
marneffei las altas concentraciones de AMPc intracelular producen un fenotipo totalmente
aconidial (Zuber et al., 2002). Por tanto, aunque los mecanismos bsicos de regulacin de la
conidiacin son similares en los hongos filamentosos, existen diferencias en las vas a travs de
las cuales se ejerce esta regulacin, estando el AMPc implicado de manera diferente segn la
especie de que se trate.
Como se mencion con anterioridad, en Aspergillus nidulans el dmero bg regula tambin
negativamente la conidiacin, ya que la delecin del gen sfaD, que codifica la subunidad
b, provoca la conidiacin en cultivo sumergido (Rosn et al. 1999). De forma similar se ha
relacionado la actividad del dmero bg con el control sobre la conidiacin en Cryphonectria
parasitica y Neurospora crassa. En Penicillium chrysogenum, el diferente comportamiento en cuanto
a la conidiacin en medio lquido de las cepas Dpga1, donde el dmero bg se encuentra libre y
es activo, y pga1G203R, en la cual el dmero se encuentra asociado permanentemente a Pga1 y es
inactivo, sugiere tambin que el dmero bg tiene un papel en la regulacin de la conidiognesis.
La cepa pga1G203R muestra un fenotipo ms extremo que la cepa Dpga1, formando un mayor
nmero de conidios en cultivo sumergido y mostrando una mayor expresin de los genes brlA y
wetA, lo que parece indicar que la presencia del dmero bg en su forma activa en la cepa Dpga1
est ejerciendo un efecto represor sobre la conidiacin que no tiene lugar en la cepa pga1G203R.
Adems de su participacin en el control de la conidiacin, Pga1 tambin regula la produccin
de penicilina en Penicillium chrysogenum, al igual que su homlogo FadA en Aspergillus nidulans. La
activacin constitutiva de la subunidad a Pga1 tiene como resultado una mayor produccin de
penicilina y una mayor expresin de los genes biosintticos de este antibitico, mientras que la
delecin de pga1 o la inactivacin constitutiva de la subunidad a provocan una disminucin tanto
en la biosntesis de penicilina como en la expresin de los genes (Garca-Rico et al. en prensa).
El control de Pga1 sobre la produccin de penicilina no se lleva a cabo a travs del AMPc. As
mismo, cuando se transforma una cepa de Penicillium roqueforti con el alelo pga1G42R se produce un
incremento en la produccin de roquefortina; este resultado es similar al observado en Fusarium
sporotrichioides respecto a la produccin de trichoteceno cuando es transformado con el alelo
fadAG42R de A. nidulans (Tag et al. 2000). Estos resultados muestran que la funcin de las protenas
G heterotrimricas est bastante conservada en hongos, y que las subunidades a regulan el
metabolismo secundario, aunque como se indic con anterioridad, esta regulacin es positiva en
algunos casos (penicilina) y negativa en otros (esterigmatocistina en Aspergillus nidulans).
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Biologa molecular: herramienta para estudios

de ecologa microbiana aplicada a estudios
ambientales
Dr. Nathalie Cabirol
Dr. Marcelo Rojas-Oropeza
Dr. Francisco J. Fernndez
Introduccin
Tradicionalmente, el anlisis de las comunidades microbianas en el ambiente se relacionaba
con tcnicas clsicas de cultivo, para lo cual se dispone de una gran variedad de medios. Sin
embargo, slo del 0.001 al 15% de los microorganismos han sido estudiados por estos mtodos
(Hill et al., 2000; Spring et al., 2000; Smith et al., 2001). Con estas tcnicas, adems, se puede
favorecer el crecimiento de grupos microbianos poco representativos del ecosistema estudiado,
sin realmente aislar los ms importantes, lo que influira en la interpretacin del papel ecolgico
de los microorganismos. En otros trminos, los mtodos de cultivo tradicionales no permiten
estudiar objetivamente la estructura y funcin de las comunidades microbianas, ya que en
general se altera el nmero y las actividades de los microorganismos, de manera negativa o
positiva (Atlas y Bartha, 2002; Nocker et al., 2007).
En la actualidad se dispone de mtodos ms sensibles para el anlisis de comunidades
microbianas, en la naturaleza o en ingeniera ambiental. Uno de los mejores procedimientos es
el que se basa en la deteccin de los cidos nucleicos, tcnicas que se denominan moleculares.
La aplicacin de tcnicas moleculares en muestras ambientales ha producido avances muy
importantes en ecologa microbiana en los ltimos aos. El desarrollo de estas tcnicas permite
detectar poblaciones microbianas concretas y sus actividades, sin necesidad de cultivar los
microorganismos (Atlas y Bartha, 2002; Madigan et al., 2004). Estos mtodos moleculares se
basan en sondas o secuencias de cidos nucleicos, que pueden ser un pequeo fragmento de
cido desoxirribonucleico (ADN) o ribonucleico (ARN) (en general de unos 20 nucletidos)
complementario en la secuencia de bases a una parte de un gen, el objeto de estudio. La
utilizacin de ADN o ARN tiene dos alcances diferentes: el seguimiento de las comunidades
microbianas mediante secuencias de tipo ADN permite la deteccin de los microorganismos
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Biologa molecular
implicados, sin obtener indicacin de su estado fisiolgico, mientras que mediante el anlisis
del ARN es posible evaluar la actividad de dichos microorganismos.
Para poder aplicar las tcnicas moleculares es necesario extraer el ADN o ARN de las muestras
ambientales a estudiar. El primer paso es el rompimiento mecnico o qumico de las paredes
y membranas de los microorganismos a estudiar. Las etapas siguientes son de limpieza de la
muestra, seguidas al final por la precipitacin y purificacin del material gentico.
Sondas de cidos nucleicos (Cebadores o Primers)
Las tcnicas de este tipo se basan en la bsqueda de secuencias blanco determinadas
mediante hibridacin con fragmentos especficos de ADN (las denominadas sondas). Entre
los muchos fragmentos de ADN utilizados para estimar la composicin y diversidad de las
comunidades de bacterias y arqueas en
hbitats complejos, el caso ms utilizado es el del gen que codifica para el ARN ribosomal
(ARNr) 16S de los procariotas (Madigan et al., 2004). Esta molcula se ha elegido como reloj
evolutivo debido a que presenta algunas caractersticas que permiten hacer una diferenciacin
adecuada entre los microorganismos a diferentes niveles taxonmicos:
- es universal y abundante en los seres vivos (existen 103-105 ribosomas/bacteria).
- tiene alta conservacin en los diferentes niveles taxonmicos, por lo cual permite
correlacionar directamente los microorganismos cercanos desde el punto de vista
filogentico.
- registra los principales cambios que han sufrido los microorganismos durante su
evolucin, debido a la presencia de regiones de variabilidad. Por esta razn, permite
diferenciar entre ellos incluso al nivel de especie.
- su tamao es adecuado para hacer tratamientos estadsticos (Stahl et al., 1988;
Witzingerode et al., 1997; Jan y Le Borgne, 2001; Sanz y Kchling, 2007).
El anlisis de este gen permite caracterizar ms del 90% de los microorganismos sin cultivarlos,
lo cual refuerza el inters de las tcnicas moleculares (Hill et al., 2000; Madigan et al., 2004).
Adems, la base de datos de secuencias de ARNr disponibles es muy amplia, lo cual facilita la
identificacin de los microorganismos: por ejemplo, el sitio en Internet del National Center for
Biotechnology Information (NCBI) contiene ya ms de 61,132,599 secuencias de ADNr 16S en la
base de datos Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Usando dichas bases ha sido posible la
obtencin de cebadores especficos para cinco gneros de arqueas metangenas, con el objetivo
de seguirlos de manera rpida en muestras ambientales, tales como lodos anaerobios de inters
para su uso industrial en plantas de tratamiento de aguas residuales (Cabirol et al., 2003).
Aparte de este gen, se pueden elegir otros genes o secuencias especficas como base para el diseo
de sondas de cidos nucleicos. ste es el caso de los denominados genes de funcin, como
por ejemplo el gen codificador de la nitrito reductasa (nirS y nirK) en bacterias desnitrificantes
y l de la metil-coenzima M reductasa (mcrA) en bacterias metangenas. Los productos de estos
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Dr. Nathalie Cabirol y cols.
genes intervienen en procesos de tratamiento de aguas residuales por digestin anaerobia.

Otro gen interesante es el que codifica para la amonio mono-oxigenasa (amoA) en bacterias
nitrificantes (Kowalchuk y Stephen, 2001; Luton et al., 2002; Tiquia et al., 2006). En nuestro
laboratorio del Instituto de Ingeniera (UNAM), hemos podido amplificar el gen amoA en
suelos salinos sdicos del Ex-Lago de Texcoco (Edo. de Mxico, Mxico), con el fin de estudiar
la diversidad de las bacterias nitrificantes.
PCR, reaccin en cadena de la polimerasa (Polimerase Chain Reaction)
Esta tcnica, base en casi todos los procesos de identificacin molecular que se vern con
posterioridad, se fundamenta en el mecanismo de replicacin natural del ADN. El resultado
principal es la amplificacin del ADN, al aumentar artificialmente el nmero de veces que ste
se replica. Esto permite obtener una elevada cantidad del fragmento o fragmentos deseados.
La tcnica consiste en la amplificacin enzimtica in vitro de una secuencia de ADN ubicada
entre dos cebadores, compuestos por oligonucletidos, que sirven de inicio de la replicacin,
y por lo tanto constituyen los extremos terminales del fragmento amplificado. El tamao de
los fragmentos amplificados est determinado por la distancia entre las posiciones que ocupan
dichos oligonucletidos (cebadores o primers) sobre la molcula de ADN, siendo la secuencia
de estos cebadores conocida y complementaria al gen o a la regin que se pretende amplificar
(Mullis et al., 1994; Sambrook y Russell, 2001). La PCR permite una deteccin altamente
sensible del gen considerado, incluso en muestras heterogneas de ADN como son el lodo, el
agua o el suelo (Dussurget y Roulland-Dussoix, 1994).
El protocolo de la tcnica se puede describir como sigue: extraccin de ADN total y repeticin
(comnmente, entre 25 y 35 veces) de un ciclo compuesto de:

a) desnaturalizacin de las cadenas de ADN,

b) alineamiento de los cebadores con las cadenas diana (ADN molde) y
c) sntesis de las cadenas complementarias por medio de una ADN polimerasa termoestable
(Taq Polimerasa, por ejemplo) (Figura 1).
Los componentes esenciales de la mezcla de reaccin son la ADN polimerasa, los

cebadores oligonucleotdicos, los desoxirrobonucletidos trifosfato libres (dNTPs), el ADN
molde e iones de magnesio (Mg2+). El producto amplificado se separa mediante electroforesis
horizontal en gel de agarosa y se visualiza con un marcador fluorescente con afinidad para el
ADN (bromuro de etidio, por ejemplo). El tamao de los fragmentos amplificados se determina
mediante el uso de un marcador de peso molecular conocido (Mullis et al., 1994; Sambrook y
Russell, 2001).
Los principales factores que pueden afectar la eficiencia de la reaccin son: el diseo
del cebador (considerando la secuencia y el grado de homologa con el ADN blanco),
concentracin del cebador, concentracin y pureza del ADN molde, temperaturas de
desnaturalizacin y alineamiento, duracin de cada etapa, tiempo para el cambio de
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Biologa molecular
ADN
94C
Alineamiento
de cebadores
C variable
ADN
polimerasa
72C (Taq Pol)

20-35 ciclos
Mltiples copias
Figura 1. Diagrama general de la reaccin de PCR.
la temperatura (debido al termociclador) y la concentracin del in magnesio (Mg2+)

(Sambrook y Russell, 2001).
Mtodos de anlisis de comunidades microbianas con tcnicas de ADN
Con el objetivo de analizar las comunidades microbianas y detectar los microorganismos, desde
los ms hasta los menos representativos, el ADN total obtenido de una muestra ambiental se
amplifica por PCR. A continuacin, los diferentes amplicones o grupos amplificados, deben ser
separados para poder distinguir y secuenciar cada uno (Hill et al., 2000). Existen diferentes
mtodos de anlisis de la diversidad microbiana, que utilizan distintas formas de separar los
productos obtenidos por PCR.
Clonacin y secuenciacin
Esta tcnica es an la ms utilizada en el estudio de las comunidades microbianas. Implica la
extraccin de los cidos nucleicos, amplificacin y clonacin de los genes estudiados (por ejemplo
del ARNr 16S), la secuenciacin de dichos genes y la utilizacin de programas filogenticos
para determinar la filiacin del clon aislado en base a las secuencias obtenidas a partir de
bancos de datos (NCBI, EBI (www.ebi.ac.uk), etc.) (Sanz y Kchling, 2007). Lo extendido del
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uso de esta tcnica hace que, hoy en da, unas dos terceras partes de las 61,132,599 secuencias
depositadas en los bancos de datos citados no pertenezcan a organismos aislados.
La clonacin molecular corresponde al aislamiento e incorporacin de un fragmento de ADN
dentro de un vector en el cual puede replicarse (Madigan et al., 2004). El procedimiento de
clonacin puede usar una gran variedad de vectores para Escherichia coli, y es el mtodo ms
tradicionalmente utilizado para separar fragmentos de ADN amplificados por PCR, sobre
todo aquellos que tienen longitud idntica pero secuencia diferente (Wintzingerode et al.,
1997; Hill et al., 2000). Los vectores de clonacin, en general plsmidos o bacterifagos, estn
generalmente diseados de forma que permiten la recombinacin del ADN forneo en un
sitio de restriccin que corta el vector sin afectar a su replicacin. La etapa de insercin del
fragmento del ADN en el vector se llama ligacin. Luego, dichos vectores estn introducidos
en un organismo hospedero, etapa llamada transformacin.
En el vector de clonacin, el sitio de restriccin utilizado para la ligacin suele encontrarse dentro
de un gen definido, lo que provocar la aparicin de un fenotipo conocido al microorganismo
transformado con el vector. Dicho gen de seleccin puede ser un gen de resistencia a antibitico
(p. ej. el plsmido pBR322, con genes de resistencia a la ampicilina y la tetraciclina), o un gen
catablico (p. ej, el plsmido pGEMT con un gen para la -galactosidasa, lacZ) (Figura 2)
(Madigan et al., 2004).
Figura 2. Vector de clonacin, producto Promega, http://www.promega.com
El fragmento de ADN a secuenciar se inserta por ligacin dentro de gen de seleccin, lo cual
inactiva su expresin fenotpica. En el caso del vector pGEM-T, la bacteria que contiene el
vector con el fragmento de ADN amplificado no presenta el gen lacZ activo, lo cual permite
una seleccin colorimtrica (colonias azules: Lac+ y crema: Lac-). Cada colonia bacteriana
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corresponde a un clon, es decir una poblacin de clulas que descienden todas de una nica
clula. Cada colonia bacteriana contiene as un nico fragmento de ADN a secuenciar
(Madigan et al., 2004).
Una vez obtenidos los clones, el fragmento de inters se amplifica por PCR usando cebadores
universales, que se unen a secuencias del vector y permiten amplificar cualquier fragmento
insertado en l: en el caso del vector pGEM-T, se utilizan los primers T7 y SP6 (Figura 2). Los
diferentes clones sern explorados, por comparacin de los perfiles de los fragmentos generados
tras la digestin del plsmido con una enzima de restriccin definida. A partir de este screening,
slo se secuenciarn los plsmidos de los clones que presenten perfiles de restriccin diferentes,
pues los perfiles idnticos podran corresponder a un mismo microorganismo. En general, la
secuencia de los diferentes plsmidos se determina con un secuenciador automtico, usando el
mtodo de Sanger (mtodo enzimtico o de los didesoxinucletidos), que consiste en hacer una
copia de ADN monocatenario con la enzima ADN polimerasa (Madigan et al., 2004). Cada
secuencia correspondiente a un clon se compara con las secuencias disponibles en bases de
datos en Internet, con el fin de identificar al microorganismo. El anlisis de la microbiota total
se obtiene mediante la construccin de un rbol filogentico por el mtodo de Jukes y Cantor
(1969), en el cual la longitud de las ramas entre las secuencias estudiadas se relaciona con el
nmero de cambios moleculares que han ocurrido entre dos nudos, es decir entre dos unidades
taxonmicas como especie o gnero (Prescott et al., 2000).
Desde su introduccin a principios de los aos 90 del siglo pasado (Ward et al., 1990), esta
estrategia ha sido utilizada masivamente y con xito, ya que permite elaborar rboles
filogenticos y estudiar exhaustivamente las muestras con un elevado nivel de deteccin,
facilitando el diseo de sondas para otro tipo de tcnicas. Su principal desventaja es que supone
un trabajo y consumo de tiempo importante, por lo que resulta poco prctica para mltiples
muestras, por ejemplo para seguir la evolucin de las poblaciones microbianas de un reactor
o comunidad natural a lo largo del tiempo, especialmente si se consideran distintos puntos de
muestreo (Mullis et al., 1994; Godon et al., 1997; Sanz y Kchling, 2007).
A pesar de su amplia utilizacin para el estudio de las comunidades microbianas de ambientes
naturales, su aplicacin en el campo de la ingeniera ambiental es menor. Esta falta de
popularidad reside, probablemente, en la necesidad de conocimientos avanzados y equipos
especficos para biologa y gentica molecular, as como en el tiempo necesario de trabajo, lo
que hace difcil su aplicacin en departamentos de ingeniera, qumica y otros similares. La
tcnica, por esas mismas razones, puede resultar demasiado compleja para ser considerada
como una simple herramienta de apoyo en las tareas diarias de operacin y control de
plantas potabilizadoras, de tratamiento de agua residual, y de uso comn por organismos
gubernamentales controladores de descargas de aguas negras y tratadas en cuerpos de agua
y suelo. A pesar de ello, se pueden citar algunos casos que permiten formarse una idea de
su potencial en este campo, todos ellos ejemplos exitosos obtenidos en centros e institutos de
investigacin cientfica y aplicada. En concreto, ha sido utilizada para definir la diversidad
microbiana en diferentes reactores anaerobios usados en tratamiento de vinazas (Godon et
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al., 1997), o en grnulos de diferentes tratamientos mesoflicos y termoflicos (Sekiguchi et

al., 1998), para determinar que la diversidad en biorreactores metanognicos termoflicos es
menor a la observada en los mesoflicos tratando residuos slidos (Leven et al., 2007), o tambin
para establecer con precisin la posicin filogentica de bacterias filamentosas detectadas
en un lodo granular y previamente adscritas, mediante hibridacin in situ, al grupo de las
bacterias verdes no del azufre (Sekiguchi et al., 2001). Tambin se ha aplicado para determinar
la filogenia de Desulfitobacterium, gnero que incluye especies participantes en la degradacin de
compuestos txicos clorados (Villemur et al., 2006).
El anlisis del metagenoma, o biblioteca genmica completa de toda la comunidad participante
en la digestin anaerobia por ejemplo, podra permitir el estudio funcional del ADN total
extrado de una muestra de lodos anaerobios, sin necesidad de la etapa de cultivo (Figura 3). Esta
herramienta es una buena opcin para una mejor comprensin de los ecosistemas, as como
tambin para el aislamiento de nuevos o mejores biocatalizadores con utilidad biotecnolgica
(Cowan et al., 2005; Schmeisser et al., 2007). Por ejemplo, a partir de un metagenoma de
digestores anaerobios en tratamiento de aguas residuales, Wexler y colaboradores (2005) han
aislado el gen de una nueva enzima de tipo alcohol/aldehdo deshidrogenasa.
En general, se puede afirmar que la clonacin y la creacin de bibliotecas de genes de ARNr
se ha utilizado en el campo de la ingeniera ambiental para confirmar con mayor precisin la
posicin filogentica de microorganismos cuya presencia ha sido detectada previamente por
otras tcnicas (hibridacin in situ [FISH] o incluso electroforesis desnaturalizante [DGGE]), as
como para el diseo de sondas especficas que permitan detectar y cuantificar un determinado
organismo. Un ejemplo de esta ltima aproximacin es el trabajo de Chouari y colaboradores
(2005b), quienes a partir de las secuencias completas de los ARNr 16S obtenidos de la biomasa
extrada de un digestor de lodos de una planta de tratamiento de aguas residuales, estudiaron
(por la tcnica de FISH) la diversidad de la divisin Planctomicetales.
Dichos estudios les permitieron definir dicho grupo como una nueva divisin o subphylum
dentro del dominio Bacteria, as como determinar su funcin en los ciclos biogeoqumicos
dentro del digestor, en relacin directa con su diversidad. Algo semejante haba sido realizado
previamente por Liu y colaboradores (2002a) para evaluar la diversidad microbiana en lodos
granulares de tratamiento de aguas residuales de cervecera. Por ltimo, la clonacin del gen
para el ARNr 16S se ha complementado tambin con la tcnica de reaccin en cadena de la
polimerasa (PCR) en tiempo real, con el fin de cuantificar, adems de definir, la diversidad
microbiana (Yu et al., 2005; Shigematsu et al., 2006).
Tcnicas de huella gentica
Las interrelaciones entre cepas microbianas de varios tipos de hbitat pueden estudiarse
analizando el ADN para obtener su huella gentica (Genetic fingerprint). Estas tcnicas
permiten la obtencin de un patrn de bandas y el patrn obtenido es caracterstico de cada
grupo microbiano, pudiendo llegarse a discernir de este modo, y dependiendo del tipo de
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Figura 3. Esquema de elaboracin del metagenoma de una muestra ambiental para el estudio de una
comunidad microbiana. La secuencia de trabajo comprende: i) extraccin directa de los cidos nucleicos,
sin necesidad del aislamiento previo y cultivo microbiano; ii) ligacin del ADN extrado en un vector
apropiado y clonacin dentro de una bacteria husped; iii) anlisis funcional mediante la expresin del gen
y produccin de una nueva enzima o compuesto dentro de diferentes bacterias husped; iv) anlisis de
la secuencia por bases de datos de ADN, para la comprensin del potencial metablico de la comunidad
estudiada (Adaptada de Schmeisser y colaboradores (2007)
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cebadores usado, hasta el nivel taxonmico de especie. Cada banda diferencial en la huella
puede analizarse mediante anlisis directo de la secuencia de ADN o por clonacin previa.
Por ello, durante el seguimiento de la dinmica microbiana dentro de un digestor, mediante
una tcnica de huella gentica bastara con buscar una banda ya conocida por su tamao y
a continuacin comparar los diferentes patrones en funcin del tiempo (Oude Elferink et al.,
1998; Dabert et al., 2002; Angenent et al., 2005).
Durante la electroforesis, el patrn de bandas genticas se traduce en la separacin de los
fragmentos de ADN amplificados previamente por PCR. Esta separacin puede basarse en
varios aspectos, como por ejemplo en las diferencias conformacionales entre estas molculas,
observables tras la migracin a travs de un gradiente de desnaturalizacin qumico o trmico,
en el polimorfismo de la conformacin de la hebra sencilla de ADN de estas molculas, en
la amplificacin al azar de ADN polimrfico, en el polimorfismo en longitud de fragmentos
de ADN (polimorfismo que se obtiene de manera artificial por digestin enzimtica con
endonucleasas de restriccin), o de manera natural mediante la amplificacin de genes
o espacios intergnicos con tamao variable entre las distintas especies bacterianas y en la
carga elctrica de estas molculas, modificada por medio de una cromatografa lquida
desnaturalizante de alto rendimiento, junto con reactivos qumicos (DHPLC, Denaturing Highperformance Liquid Chromatography). Este mtodo es relativamente nuevo por lo cual an no se
han reportado aplicaciones en ingeniera ambiental (Atlas y Bartha, 2002; Dabert et al., 2002;
Nocker et al., 2007).
Separacin por electroforesis en gradiente de gel desnaturalizante o trmico (DGGE, TGGE: Denaturing/
Thermal gradient gel electroforesis). La electroforesis en gradiente de gel desnaturalizante (DGGE)
y la electroforesis en gradiente de gel trmico (TGGE) fueron introducidas hace unos aos en
microbiologa ambiental y son ahora usadas de manera rutinaria como mtodo molecular para
el estudio de comunidades microbianas y de dinmica de poblaciones en ecologa microbiana
(Muyzer et al., 1993; Giraffa y Neviani, 2001). Las dos tcnicas consisten en la separacin de los
fragmentos de ADN amplificados utilizando los cambios conformacionales de estas molculas
a lo largo de un gradiente de desnaturalizacin. Esta separacin se basa en la disminucin
de movilidad electrofortica de los fragmentos de ADN parcialmente fusionados o de doble
cadena en un gel de electroforesis que contiene un gradiente linear de un desnaturalizante
qumico para el ADN (DGGE) o un gradiente linear de temperatura (TGGE) (Giraffa y
Neviani, 2001). A lo largo del gradiente, las molculas de ADN con diferentes secuencias y
de una misma longitud presentarn comportamientos de fusin de las cadenas bicatenarias
particulares (melting) y, por lo tanto, detendrn su migracin en diferentes posiciones del gel
(Giraffa y Neviani, 2001; Madigan et al., 2004).
Utilizando estas tcnicas, Cytryn et al. (2000) estudiaron la diversidad dentro del dominio Archaea
en muestras de un lago hipersalino a partir de una sonda de ADNr 16S; Duinevel et al. (2001)
evaluaron la presencia y la actividad del ecosistema de una rizsfera de Chrysanthemum por
comparacin de los perfiles obtenidos a partir de ADNr 16S y de ARNr 16S. Como ejemplo
de estudios sobre dinmica poblacional, podran destacarse los seguimientos de las bacterias
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nitrificantes (Bruns et al., 1999; Laverman et al., 2001; Kowalchuk et al., 1998; Kowalchuk et
al., 2000; Nicolaisen y Ramsing, 2002). Roest y colaboradores (2005) demostraron mediante
DGGE acoplada a una serie de diluciones, que las bacterias sintrficas responsables de la
produccin de H2 tienen el mismo papel en reactores anaerobios termoflicos que en los
mesoflicos. Liu y colaboradores (2002a), por su parte, determinaron por medio de la DGGE
la estructura de la comunidad microbiana en un lodo granular de un reactor tipo UASB
(Upflow Anaerobic Sludge Blanket) en tratamiento de efluentes de cervecera. Con base a 18
bandas, cada una equivalente a una unidad operacional taxonmica (OTU), se determin
la composicin cualitativa del inculo a nivel dominio (Bacteria, Archaea), a nivel de grupo
(bacteria Gram + con bajo porcentaje en GC, Proteobacteria [subclase d y g], Cytophaga,
etc.), hasta llegar al nivel de especie (Methanobacterium formicicum y Methanosaeta concilii, por
ejemplo). Liu y colaboradores (2002b) compararon la comunidad microbiana en dos digestores
acidgenos, uno bajo condiciones de mesofilia y otro bajo condiciones de termofilia, durante su
arranque. En este caso, la tcnica de DGGE fue eficaz para detectar el cambio del consorcio
microbiano, as como para identificar filogenticamente las bacterias metangenas dominantes
en el consorcio. Arkasubasi y colaboradores (2005) identificaron cinco unidades taxonmicas
diferentes del dominio Archaea, dos de ellas estrechamente relacionadas con Methanosaeta concilii
y Methanobacterium formicicum, con una distribucin dependiente del tipo de sustratos a degradar
(de destilera a farmacutico) en el digestor de lodos. En reactores anaerobios de doble fase
(acidognico/metanognico) la tcnica de TGGE permiti definir una mayor diversidad del
dominio Bacteria en el reactor cido, detectando la dominancia del gnero Coprothermobacter
(clostridia, dentro del phylum Firmicutes (bajo G+C Gram-positive bacteria)) participando en
la hidrlisis y/o acidognesis, lo cual puede explicar la prdida de diversidad bacteriana en los
reactores metanognicos-mesoflicos (Noyola et al., 2007). Mediante el TGGE, se ha podido
detectar la presencia de Thiobacillus sp. UAM-I (99% similitud) en biofiltros que tratan H2S
(Cabirol, publicacin en curso).
Mtodo de polimorfismo de conformacin de hebra simple (SSCP, Single strand conformation polymorphism).
El anlisis del polimorfismo de conformacin de hebra simple permite estudiar la diversidad
microbiana y la estructura de poblaciones complejas como los biorreactores (Leclerc et
al., 2001). El SSCP detecta variaciones de secuencia entre diferentes fragmentos de ADN,
normalmente amplificados con base en la regin variable del gen ADNr 16S. Esta tcnica
est esencialmente basada en la diferente movilidad de los fragmentos de ADN, debida a su
tamao y su estructura secundaria. La conformacin secundaria depende del fenmeno del
plegado de la hebra simple de la molcula de ADN, que es funcin de la secuencia de esta
cadena. Secuencias especficas se traducen en una velocidad de migracin especfica para
cada molcula. Se puede utilizar un primer fluorescente, lo cual permite obtener la secuencia
de ADN directamente. Sin embargo, el anlisis requiere un electroforesis uniforme, a baja
temperatura y sin gradiente desnaturalizante, con el fin de no alterar la estructura secundaria
(Giraffa y Neviani, 2001; Leclerc et al., 2004).
Zumstein y colaboradores (2000) observaron, durante un seguimiento de 2 aos, el dimorfismo
de la comunidad microbiana, ya que el consorcio de las arquebacterias presenta menos variacin
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en su composicin que las eubacterias. En otro trabajo, se pudo relacionar una acumulacin
de cidos grasos voltiles en el proceso anaerobio, con una dominancia de Methanobacterium
formicicum sobre Methanosaeta concilii, con lo que se concluye que un buen equilibrio entre esas
dos especies provee una mejor capacidad de amortiguamiento en el sistema que se traduce
en una mayor eficacia de la digestin anaerobia (Leclerc et al., 2001; Bouallagui et al., 2004).
Delbs y colaboradores (2001) estudiaron, durante una acumulacin de acetato, el papel de las
bacterias de tipo Synergistes y Spirochetes, organismos difciles de cultivar, mediante el anlisis de
su actividad a travs de la extraccin de ARN.
Mtodo del ADN polimrfico amplificado al azar (RAPD, Random amplified polymorphic DNA). Esta otra
tcnica se usa en muestras ambientales; no obstante es una de las ms exitosas en sistemtica
para la clasificacin de bacterias (Franklin et al., 1999; Wikstrm et al., 2000; Yang et al., 2000;
Giraffa y Neviani, 2001). La amplificacin al azar consiste en amplificar por PCR una regin
de ADN escogida de manera arbitraria mediante un primer pequeo, generalmente de 8-10
nucletidos. En una misma molcula de ADN, el primer se puede fijar en diferentes sitios, ya que
la sonda es corta. Por lo tanto, los fragmentos de ADN amplificados presentan polimorfismo
de longitud. En el caso de un cultivo bacteriano puro, un perfil similar indica un genoma
similar; sin embargo, actualmente este mtodo an se aplica a la evaluacin de comunidades
microbianas (Franklin et al., 1999; Giraffa y Neviani, 2001).
Mtodos basados en el polimorfismo en la longitud de fragmentos de ADN. Todas estas tcnicas permiten
estudiar la diversidad total de comunidades microbianas. Permiten tambin realizar estudios
o seguimientos de poblaciones especficas. (Giraffa y Neviani, 2001; Atlas y Bartha, 2002;
Angenent et al., 2005; Sanz y Kchling, 2007). El polimorfismo en la longitud de fragmentos
de restriccin (RFLP, Restriction fragment length polymorphism) se obtiene, a partir de cualquier gen
amplificado por PCR, tras digestin con endonucleasas de restriccin concretas, de lo cual
resulta un perfil especfico para la muestra. La separacin de los fragmentos de ADN obtenidos
en un gel de electroforesis se puede acoplar a un Southern blot (se presentar ms tarde) con lo
que se podra identificar a los microorganismos. akra et al. (1999) estudiaron de esta manera la
poblacin de bacterias nitrificantes. Rangarajan et al. (2002) observaron el efecto de la salinidad
sobre Pseudomonas spp. en la rizsfera de arroz, utilizando solamente la tcnica de RFLP. Imachi
y colaboradores (2000) estudiaron por RFLP la asociacin sintrfica entre Desulfotomaculum y
Methanobacterium para la degradacin del propionato.
En el caso de la amplificacin del gen del ARNr 16S, el RFLP se puede denominar
especficamente como anlisis de restriccin de ADN ribosmico amplificado (ARDRA,
Amplified ribosomal DNA restriction anlisis) (Giraffa y Neviani, 2001; Atlas y Bartha, 2002). Como
ejemplos de su uso, Cheneby et al. (2000) compararon poblaciones de bacterias desnitrificantes
en tres suelos agrcolas. Heyndrieckx et al. (1996) describieron que la tcnica de ARDRA
permite la deteccin de variabilidad entre especies o entre cepas. Klocke y colaboradores
(2007) estudiaron la diversidad de un consorcio anaerobio que participaba en la degradacin
de ensilaje de betabel en un reactor totalmente mezclado: se aislaron 60 clones y se identificaron
hasta el nivel de clase; cuatro de ellos pertenecieron al dominio Archaea y 56 al dominio Bacteria.
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El alcance de este trabajo fue muy similar al estudio realizado por Godon y colaboradores
(1997), que emplearon la tcnica de amplificacin, clonacin y secuenciacin. Sin embargo, el
anlisis del perfil ARDRA de cada clon permite descartar los clones repetidos, aunque es ms
laborioso (Nocker et al., 2007).
Otro variante de RFLP es el polimorfismo de longitud del fragmento de restriccin terminal
(T-RFLP, Terminal-restriction fragment lenght polymorphism). La particularidad de este mtodo
la da el uso de un primer iniciador (forward primer) fluorescente en su extremo 5 durante la
PCR (Giraffa y Neviani, 2001).Esta tcnica es independiente de la clonacin, es decir que la
determinacin de las bandas de ADN se hace directamente en un secuenciador automtico,
sin una etapa previa de clonacin (Giraffa y Neviani, 2001). Este mtodo es una herramienta
poderosa y rpida en ecologa microbiana, sobre todo para estudios filogenticos relacionados
con bacterias en ecosistemas cerrados; Bruce (1997) y Horz et al. (2000) reportaron el uso de
la T-RFLP para el anlisis de los genes mer y amoA, respectivamente, en estudios de anlisis de
la estructura de poblaciones especficas de varios sitios ambientales. La densidad y actividad
de bacterias sintrficas se determin por T-RFLP, siendo capaz de diferenciar la poblacin
bacteriana marcada por 13C despus de la introduccin de palmitato-13C (Hatamoto et al.,
2007). Briones y colaboradores (2007) demostraron por esa misma tcnica la competencia entre
representantes de las familias Methanobacteriacaea y Methanospirillaceae despus de un aumento de
sulfatos en la carga orgnica. Se han realizado estudios de los genes nirS y nirK en sedimentos
marinos (Tiquia et al., 2006) y suelos (Kandeler et al., 2006). Tambin se han hecho estudios
por T-RFLP del gen mcrA para poblaciones de bacterias metangenas en diferentes ambientes,
por ejemplo en reactores de laboratorio (Shigematsu et al., 2004), en suelo de campo de arroz
(Friedrich, 2005) y en turba (Juottonen et al., 2006).
Anlisis del espacio intergnico de los genes 16S y 23S (RISA, rDNA internal spacer analysis) corresponde
a la amplificacin por PCR de dicho espacio intergnico ITS/IGS (Figura 4).
Figura 4. Opern ribosomal bacteriano

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El espacio intergnico ITS/IGS tiene una velocidad de evolucin diez veces ms elevada
que el gen ADNr 16S, lo cual permite realizar una identificacin ms segura de una cepa.
Puede revelar eventos evolutivamente recientes (akra et al., 1999). Esta regin ITS/IGS es
extremadamente variable en tamao y secuencia, an dentro de un grupo taxonmico (GarcaMartnez et al., 1999). Esta variabilidad de tamao permite separar directamente el producto
de PCR proveniente de Bacteria o Archaea. Esta tcnica ha sido reportada en distintos estudios,
como por ejemplo para evaluar la diversidad microbiana total en microagregados de suelo, o la
biodiversidad de Archaea (Ranjard et al., 2000; Benlloch et al., 2001). Tambin se ha usado para
estudios de poblaciones especficas, como es el caso del estudio de una poblacin bacteriana
reductora del mercurio y de la poblacin nitrificante (akra et al., 1999; Canstein et al., 2001).
La principal caracterstica que se explota en esta tcnica es la variabilidad en la longitud de
la secuencia. De esta forma, RISA se basa en el polimorfismo natural, sin usar enzimas de
restriccin (Garca-Martnez et al., 1999). Dentro de los mtodos basados en el polimorfismo
de tamao, RISA es fcil de realizar, permitiendo un rpido examen de la composicin y
complejidad de la comunidad bacteriana. Tambin es importante que no requiera un equipo
especfico y costoso (Ranjard et al., 2000), disminuyendo el costo y el tiempo de realizacin (el
producto de PCR se separa directamente en gel de electroforesis de agarosa sin tratamiento
previo).
Sin embargo, para la identificacin de cada banda se requiere de la tcnica de clonacin y
secuenciacin, como tambin ocurre en los casos de ARDRA, RFLP clsica, y RAPD. Con
el fin de evitar esta laboriosa etapa, existe una variante automatizada de RISA denominada
ARISA. Como en la T-RFLP, se usa un primer iniciador marcado, lo cual permite analizar
directamente la muestra en un secuenciador automtico (Giraffa y Neviani, 2001). El limitante
actual de esta tcnica es la baja disponibilidad de secuencias registradas en las bases de datos
en Internet, en comparacin con las disponibles para el gen ADN16S.
RISA presenta una ventaja para estudios en ambientes extremos. Los microorganismos han
habitado prcticamente todas las superficies existentes en la tierra y con ello han dado lugar a
una gran diversidad de estrategias metablicas, una enorme biodiversidad de microorganismos
y tambin de microbiotas (Madigan et. al., 2004). Esta gran biodiversidad es el resultado del
xito de adaptacin a factores ambientales muy heterogneos. Y se debe, desde su inicio, a la
supervivencia de microorganismos a condiciones extremas que son desfavorables para la gran
mayora de las especies existentes. Estos microorganismos se ubican principalmente dentro del
grupo Archaea, que a diferencia de Bacteria y Eukarya han evolucionado muy lentamente y son
considerados como los primeros habitantes verdaderos de la tierra. Puesto que la regin del
ADNr 16S tiene una evolucin menor al espacio intergnico 16S-23S, RISA permite detectar
una mayor biodiversidad en ambientes extremos (akra et al., 1999).
Cada una de las tcnicas de huella gentica tiene sus ventajas y desventajas, aunque
la informacin que se obtiene es similar en todos los casos (Nocker et al., 2007). Permiten
estudiar de manera rpida y sencilla la variabilidad espacio-temporal de las poblaciones (Sanz
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y Kchling, 2007). Otra ventaja es su adecuacin para analizar un gran nmero de muestras
(comparado con la clonacin). Sin embargo, el nmero de copias del ADN, dependiente
de la abundancia del microorganismo y de la facilidad para la amplificacin del gen para
el ARNr 16S, puede ser muy diferente, lo que da lugar a bandas en el gel de electroforesis
con intensidades muy distintas (Sanz y Kchling, 2007). Por otra parte, el nmero de bandas
detectadas es normalmente pequeo, por lo que el nmero de especies identificadas tambin
lo es, y corresponden, aunque no necesariamente, a las especies mayoritarias presentes en la
muestra original. La mayor limitacin de estas tcnicas reside en que no permiten cuantificar
cada OTU identificada (Sanz y Kchling, 2007).
Tcnicas de hibridacin
Estas tcnicas consisten en hibridar (o aparear) molculas de ADN-ADN, as como ADNARN; ambas opciones son herramientas poderosas para el estudio de comunidades
microbianas. Son tcnicas de elevada precisin y sensibilidad en la deteccin y cuantificacin
de microorganismos y tienen como fundamento el uso de las secuencias especficas del gen
ADNr 16S. La hibridacin se detecta por fluorescencia o por marcaje con fsforo radiactivo en
el extremo terminal 5 de la sonda (Raskin et al., 1994; Sanz y Kchling, 2007).
Existen dos tipos principales de hibridacin, que ofrecen un acercamiento diferente en el
estudio de la diversidad y de la dinmica de poblaciones microbianas especficas:
hibridacin ex situ: sobre una membrana, se procede a la hibridacin de tipo ADN:ADN
(Southern Blot) o ADN:ARN (Slot Blot, Northern Blot). En el caso de las bacterias metangenas,
la tcnica ms usada es la hibridacin Slot Blot, la cual consiste en la extraccin de ARN
total de la muestra y la elaboracin de manchas (spot) del producto sobre una membrana,
seguida a continuacin por la hibridacin con los cebadores seleccionados. Esta tcnica
permite tanto la identificacin como la cuantificacin (McMahon et al., 2004; Zheng et al.,
2006),
hibridacin in situ o FISH (Fluorescence in situ hybrization): se trata de secuencias de ADN
marcadas con un cromforo fluorescente que reconocen secuencias del ARNr 16S,
hibridando (apareamiento ADN:ARN) in situ en las clulas completas, lo que permite su
identificacin, localizacin y posterior cuantificacin (Nakamura et al., 2006; Miura et al.,
2007).
Mediante la hibridacin ex situ de tipo Slot Blot de las bacterias sintrficas y metangenas,
McMahon y colaboradores (2001) determinaron el efecto inhibidor de la agitacin dentro
del reactor sobre la oxidacin sintrfica de los cidos grasos voltiles. La digestin anaerobia
de desechos de cerdos es posible con niveles de amonio superiores a 3,500 mg.L-1, gracias a
la capacidad de las bacterias metangenas hidrogenfilas del orden Methanomicrobiales de
adaptarse a esas concentraciones de amonio (Angenent et al., 2002). Zheng y colaboradores
(2006) relacionaron la abundancia de Methanosaeta concilii junto con el crecimiento de los
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grnulos. Del mismo modo ha podido detectarse que un aumento en la temperatura de 55 a

65C provoc una disminucin en las poblaciones de las eubacterias y un incremento de las
arquebacterias en un lodo anaerobio (Ahring et al., 2002). Chouari y colaboradores (2005a)
pudieron observar con estas tcnicas un nuevo grupo de Archaea predominante en un digestor
anaerobio de lodos.
La hibridacin in situ ha permitido obtener fotografas de la estructura microbiolgica de
los grnulos anaerobios para grupos especficos o especies, as como la morfologa de los
microorganismos estudiados (Yamada et al., 2005; Daz et al., 2006; Fernndez et al., 2006;
Abreu et al., 2007; Del Nery et al., 2007). En particular, Zheng y colaboradores (2006)
detectaron el papel de ncleo de Methanosaeta concilii en el desarrollo de los grnulos. Syutsubo
y colaboradores (2001) correlacionaron la cuantificacin de familias metangenas especficas
por FISH con la tcnica un digestor tipo UASB, para una mejor comprensin del mecanismo
de granulacin. Se han realizado microautorradiografas (MAR-FISH, FISH combinado con
el uso de sustratos marcados [3H, 14C]) para el estudio de las bacterias oxidantes del propionato,
grupo perteneciente a las bacterias productoras obligadas de hidrgeno (OHPA por sus siglas en
ingls, Obligate Hydrogen-producing Acetogen). En estos estudios se observ una respuesta funcional
y dinmica de dicha poblacin durante cambios de concentracin del sustrato carbonado
(Ariesyady et al., 2007b). Ariesyady y colaboradores (2007a) identificaron, adems, dominancias
de diferentes grupos (Chloroflexi, Smithella, Syntrophomonas y Methanosaeta) en el mismo reactor
anaerbico, capaces de degradar, respectivamente, glucosa, propionato, butirato y acetato,
lo que contribuye a una mejor comprensin de la digestin anaerobia. Jung y colaboradores
(2007) determinaron los factores que afectan la actividad de las bacterias anaerobias oxidantes
del amonio (bacterias ANAMMOX) durante el arranque de un reactor de tipo UASB.
Las tcnicas de hibridacin son muy sencillas y rpidas, si se dispone de las sondas adecuadas
(en muchos casos ya estn descritas), las cuales permiten cuantificar grupos microbianos
especficos, frente a las tcnicas tradicionales que, generalmente, no lo permiten. En el caso de
las hibridaciones ADN:ARN, la tcnica permite la deteccin de nicamente microorganismos
activos. Sin embargo, para hacer un estudio completo de un ecosistema es conveniente tener
una idea de la composicin del mismo o de lo que cabe esperar (puede ser necesaria combinarlas
con otras tcnicas). El lmite mnimo de deteccin con la tcnica FISH es de 104 clulas.mL-1, lo
cual impide detectar poblaciones menos numerosas. Para estudiar la estructura/arquitectura
de un agregado (lodo granular, biopelculas), se necesita un microscopio confocal y, de ser
posible, hacer anlisis de imgenes, lo cual es costoso y requiere de personal calificado (Bottari
et al., 2006).
Conclusin
En conclusin, los tres grupos de tcnicas moleculares descritas no son mutuamente excluyentes,
sino que son y deben ser consideradas como complementarias. Esta es la filosofa del presente
trabajo. Lo ideal sera la utilizacin conjunta de varias de ellas cuando el trabajo lo requiera, de
tal manera que las tcnicas basadas en la PCR y secuenciacin permitan construir una librera
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Biologa molecular
de genes del ARNr (identificacin pero no cuantificacin de los microorganismos presentes en

el sistema) y el diseo de sondas especficas para utilizarlas en dicho sistema y en otros similares
(cuantificacin y arquitectura de la muestra). Lo anterior, en conjunto, se denomina el ciclo
completo del ARNr (full cycle rRNA approach, Wilderer, 2002). Los resultados obtenidos de dichas
investigaciones pueden permitir el desarrollo de microarreglos, que se pueden definir como
placas moleculares que permitiran un mtodo de anlisis de rutina en serie (los equivalentes
moleculares a las placas API o BIOLOG utilizadas en microbiologa clsica). Los microarreglos
pueden ser de varios tipos: filogentico, funcional o ecolgico, segn el diagnstico deseado
(Bae y Park, 2006; Gentry et al., 2006). Recientemente, Scholten y colaboradores (2007) han
desarrollado un microarreglo para dos bacterias sintrficas y dos arquebacterias metangenas,
aplicable al anlisis de la expresin gentica global de una comunidad microbiana anaerobia en
respuesta al estrs oxidativo. Su aplicabilidad inmediata e in situ, en condiciones de operacin
y en reactores a escala real, es indiscutible para la toma de decisiones rpidas en ingeniera
ambiental.
Agradecimientos
Los autores agradecen a la Lic. Guillermina Snchez Nahuacatl y su equipo para el apoyo
bibliogrfico
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Biorremediacin de suelos contaminados por

compuestos organoclorados
Introduccin
Existen gran cantidad de compuestos orgnicos txicos como fungicidas, herbicidas,
plaguicidas, algunos colorantes, plsticos, y aceites industriales, que se acumulan en el agua,
suelo y aire, y causan grandes daos a los ecosistemas biolgicos y al hombre.
Muchos de estos compuestos no existen en la naturaleza, y son producidos por el hombre
para un uso especfico, por ejemplo, para la eliminacin de maleza indeseable y de hongos
fitopatgenos, para el control de insectos y para coloracin de fibras textiles. Otros se obtienen
como producto de la actividad industrial como los compuestos txicos generados durante la
incineracin de aceites empleados en los transformadores elctricos. A estos compuestos no
naturales se les conoce como xenobiticos. Existen otros compuestos que aunque son de origen
natural, como los hidrocarburos del petrleo y sus derivados, pueden acumularse, causando
graves problemas a los ecosistemas al igual que los compuestos xenobiticos. A los compuestos
orgnicos txicos, sintticos y naturales que se acumulan en el medio ambiente, porque no
pueden ser eliminados de una manera rpida, se les conoce como compuestos recalcitrantes.
Estos compuestos son generalmente txicos para la mayora de los diversos sistemas biolgicos,
entre ellos podemos mencionar a los organohalogenados, hidrocarburos policclicos, bifenilos
clorados, aromticos nitrogenados y sulfurados. Los organoclorados, que son el tema de estudio
propuesto, pertenecen al primer grupo mencionado. El objetivo del presente trabajo es dar una
visin actual de los avances que se han hecho para la eliminacin, por procesos biolgicos
empleando hongos, de estos compuestos txicos que se encuentran acumulados en el suelo.
Eliminacin de compuestos organoclorados
El proceso para la eliminacin de compuestos txicos se conoce tambin como remediacin,
y se refiere a las acciones qumicas, fsicas o biolgicas implicadas durante la eliminacin o
movilidad de los txicos, o bien la reduccin de la toxicidad por cambios en las molculas de los
compuestos txicos o en la disminucin de la concentracin de stos en un sitio contaminado
sea este suelo, agua o aire. La eliminacin de los compuestos organoclorados por medios
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Biorremediacin de suelos contaminados
fsicos o qumicos se conoce como procesos abiticos. Mientras los procesos que implican a
los organismos se conocen como procesos biticos, con la intervencin de organismos o una
combinacin de ambos (figura 1). La eliminacin abitica de los compuestos orgnicos txicos
(COT) se realiza mediante mecanismos como la foto-descomposicin, la volatilizacin a la
atmsfera o la percolacin. Por ejemplo, la degradacin troposfrica la cual ocurre en la parte
baja de la atmsfera por la oxidacin a travs de radicales hidroxilo y otros agentes oxidantes
naturales los cuales transforman los compuestos txicos en dixido de carbono, agua y cloro. La
eliminacin bitica se refiere a la transformacin de los COT por plantas y microorganismos,
stos ltimos tienen la capacidad de desarrollarse en medios con oxgeno y/o sin oxgeno.
ABIOTICA
Volatilizacin
Fotodescomposicin
Degradacin
Percolacin
Insecticidas
Herbicidas
Fungicidas
Hidrocarburos y derivados
Compuestos Halogenados
Preservativos de la madera
Industria elctrica (BPCs)
Solventes Industriales
Figura 1. Eliminacin natural de compuestos xenobiticos.
BIOTICA
Transformacin/
movilidad
Vegetal
Transformacin
Microbiana

Acoplamiento
oxidativo al humus
Los microorganismos transforman los COT en molculas ms simples como el dixido de

carbono, o bien, en molculas ms complejas que ayudan a la formacin del humus del suelo.
La transformacin de compuestos txicos por microorganismos es importante debido a que es
mucho ms rpida que la transformacin abitica, ya que sta ltima es extremadamente lenta
a causa de las limitaciones inherentes de las reacciones qumicas, sobre todo, en la degradacin
de sustancias recalcitrantes, tales como los pesticidas organoclorados, esta eliminacin natural
es todava ms lenta y puede llevar muchos aos. La elevada concentracin actual de estos
COT por el uso excesivo de pesticidas, fungicidas, plsticos, explosivos, etc. y por la creciente
actividad industrial, ha rebasado por mucho la capacidad de la flora y microflora natural para
degradarlos. Debido a ello, es muy importante proponer procesos para eliminar de forma ms
rpida y eficiente dichos compuestos del medio ambiente.
Biodegradacin
La biodegradacin de compuestos txicos se lleva a cabo empleando plantas, y microorganismos.
EL proceso con el empleo de plantas se conoce como fitorremediacin. Este proceso puede ser
por movilidad de los compuestos txicos del suelo hacia la raz u hojas de las plantas, como el
caso de los metales pesados, o tambin puede llevarse a cabo una transformacin de los txicos
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en compuestos de menor toxicidad o nula (Jackson et al., 2005; Ucisik et al., 2007; Smith et al.,
2007). Sin embargo, por no ser tema de este trabajo no se mencionar durante este resumen.
Se ver con ms detalle la biodegradacin de compuestos organoclorados por bacterias y
hongos, as como las enzimas que intervienen en estos procesos.
Compuestos Orgnicos Halogenados
Los compuestos orgnicos halogenados se refieren a los compuestos alifticos, aromticos y
poliaromticos que contienen tomos de cloro o de flor en su molcula, como los clorofenoles
y los fluorofenoles, que pertenecen a los aromticos. El principal uso de estos compuestos es
como plaguicidas, herbicidas, fungicidas y bactericidas. Por otro lado, muchos de ellos son
producto de la actividad industrial del hombre, principalmente, de las industrias petroqumica,
textil y del papel. Como ejemplo de clorofenoles se puede mencionar al pentaclorofenol (PCP),
que es un compuesto que se usa ampliamente en la preservacin de la madera. En pases de la
Comunidad Europea y Estados Unidos su uso ya est restringido desde hace varios aos, sin
embargo, en otros como en Mxico, an se usa indiscriminadamente. Adems, es un producto
de desecho de la industria del papel, ya que se produce, al igual que otros clorofenoles y
cloroligninas, durante el blanqueo de la pulpa con cloro, y es liberado en las aguas de desecho.
Es interesante mencionar que en algunos pases ya no se usa el cloro para blanquear la pulpa
y en su lugar se usa enzimas de tipo peroxidasas y fenoloxidasas. As se evita la produccin a
gran escala de compuestos altamente txicos como los mencionados. A estas tecnologas se les
conoce como tecnologas limpias.
Caractersticas fsico-qumicas de los clorofenoles
Los clorofenoles son cidos dbiles y existen en la naturaleza como fenoles neutros o como iones
fenxido disociados. Las propiedades, as como el destino de estos compuestos en el ambiente
difiere marcadamente si se encuentra en forma neutra o ionizada, afectando principalmente la
solubilidad y sorsin, por lo tanto la movilidad de los clorofenoles en el suelo.
Los clorofenoles empleados como herbicidas y el pentaclorofenol (PCF) usado en la preservacin
de la madera contienen impurezas como dioxinas, dibenzofuranos, fenoxifenol policlorados y
bifenilos policlorados. Todos ellos son tambin txicos para los diversos sistemas biolgicos.
Los clorofenoles son molculas recalcitrantes y se encuentran ampliamente distribuidos en el
ambiente, aun despus de que el uso de estos compuestos se ha prohibido. Los clorofenoles se
incorporan al suelo por mecanismos de sorsin y de acoplamiento oxidativo, afectando, de esta
manera, su biodisponibilidad y por lo tanto si biodegradacin.
Biodegradacin de Clorofenoles
Los clorofenoles pueden ser hidroxilados, metoxilados o polimerizados por la accin de los
microorganismos, es decir pueden formar a partir de la o-metilacin los correspondiente
cloroanisoles, o sufrir dimerizacin o polimerizacin entre otras alternativas metablicas. Los
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productos de biotransformacin causan riesgos e impactos ecotoxicolgicos en el suelo. Por

ejemplo, la metilacin de los clorofenoles produce los anisoles clorados que son ms lipoflicos
y por lo tanto son ms susceptibles a la bio-acumulacin (Laine et al., 2003).
Degradacin por bacterias
Varias bacterias son capaces de mineralizar los clorofenoles. La mineralizacin puede llevarse a
cabo aerbicamente o por la va de dehalogenacin reductiva, sta ltima no siempre conduce
a una mineralizacin completa, formando en ste caso productos ms o menos txicos, que
pueden acumularse en el ambiente. Se han aislado, de suelo contaminado, tanto bacterias
Gram-positivas como Gram-negativas y se ha observado que las bacterias Gram-negativas
toleran mayor concentracin de PCF que las positivas. Se ha demostrado que especies de
Shinogobium y Novoshingomonas, bacterias Gram-negativas, toleran y degradan PCF (Takeuchi et
al., 2001; Tiirola et al., 2002). Tambin bacterias del gnero Pseudomonas y Sphingomonas pueden
degradarlo por va aerbica (Tiirola y cols., 2002). Muchas bacterias Gram-negativas tienen
un paso comn para degradar PCP y otros fenoles altamente clorados. El paso involucra una
declorinacin oxigenoltica para formar a parir del PCP el tetracloro-p-hidroxi benzoquinona
a travs de una PCP-monooxigenasa. Las hidroquinonas cloradas formadas, pueden ser
degradas por bacterias Gram-positiva, incluyendo Mycobacterium chlorophenolicum, M. fortutim y
Streptomyces rochei siguiendo diferentes rutas de degradacin que incluyen la oxidacin de mono o
diclorofenoles a los correspondientes clorocatecoles seguida de dehalogenacin y rompimiento
del anillo (Hggblo, et al., 1994, Golovela et al., 1992;Nohynek et al., 1993).
Los herbicidas del grupo n-clorofenoxi-propinico, compuestos halogenados, son degradados
por las enzimas oxigenasas producidas por la bacteria Delftia acidovorans (Benndorf y Babel, 2202).
Otros compuestos organoclorados son los bifenilos policlorados (BPC) que tienen un amplio
uso industrial, principalmente, en la transferencia de calor en los fluidos dielctricos e
hidrulicos. Se presentan con diversos nombres comerciales como Acrolor, Clofen y Delor,
y estn constituidos de una mezcla de compuestos relacionados que difieren en el nmero y
posicin de los tomos de cloro sobre los ncleos bifenilos.
Las bacterias como Pseudomonas, Vibrio, Aeromonas, Micrococcus, Acinetobacter, Bacillus y Streptomyces, son
bacilos Gram negativos y aerobias estrictas, degradan los bifenilos mono-, di-, tri- y tetraclorados
utilizando la enzima denominada 2,3-dioxigenasa, transformando al BPC, a travs de diferentes
pasos de degradacin a compuestos como los clorobenzoatos. A partir de los cuales, en presencia
de un consorcio bacteriano, se transforman finalmente en dixido de carbono.
Degradacin por hongos
Los hongos son capaces de colonizar un amplio rango de organismos vivos y muertos, incluyendo
plantas, animales, madera y papel, por lo que son agentes primarios muy importantes en la
descomposicin de la materia orgnica teniendo as un papel en el ciclo del carbono, del
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nitrgeno y del azufre. Los hongos secretan gran diversidad de enzimas con extraordinaria
accin cataltica. Por esta razn, la degradacin fngica de compuestos organoclorados es de
importancia en la biorremediacin y el papel de los hongos en la remocin de compuestos
txicos del ambiente ha sido ampliamente estudiado en las ltimas dcadas.
Los hongos de pudricin blanca son los agentes degradadores de lignina ms activos. La
lignina es el polmero estructural clave en las plantas y uno de los polmeros ms abundantes
y resistentes que existen en la naturaleza. Estos hongos, capaces de degradar la lignina han
sido usados para degradar un amplio espectro de contaminantes ambientales debido a su
sistema enzimtico no especfico, constituido principalmente por oxidasas. Estas enzimas
son conocidas tambin como enzimas ligninolticas e incluyen a la lignina peroxidasa (LiP),
manganeso peroxidasa (MnP), verstil peroxidasa, glioxal oxidasa, aril-oxidasa y lacasa;
producidas por basidiomicetos, principalmente los de pudricin blanca y caf. Phanerochaete
chrysosporium, un hongo de pudricin blanca, es uno de los ms estudiados para la degradacin
de compuestos xenobiticos incluyendo la degradacin de clorofenoles. Se ha demostrado
que P. chrysosporium degrada y mineraliza el pentaclorofenol (PCP) cuando ste se encuentra
en concentraciones iniciales de 1 a 500 mg l-1 (Lamar et al. 1990; Lamar 1992; Lin et al.
1989; Mileski et al. 1988). A pesar de que P. chrysosporium fue de los primeros basidiomicetos
propuestos para fines de biorremediacin, se han estudiado gran diversidad de basidiomicetos
capaces de degradar PCP como Inonotus dryophilus, Perenniporia medulla-panis, Trametes versicolor,
Phellinus badius, Ganoderma oregonens, Pleurotus ostreatus and Lentinula edodes (Alleman et al. 1992;
Okeke et al. 1996; Fahr et al., 1999). El tiempo de degradacin depende de la concentracin
inicial de PCP, del gnero y especie del hongo, de la biomasa inicial y de la edad del micelio
(Alleman et al. 1992; Lamar et al. 1990).
En 1996, Aitken y Logan, estudiaron la degradacin del PCF por P. chrysosporium, observando
una degradacin del 72 al 75% del compuesto. Los autores propusieron que la deshalogenacin
del PCF era mediada por la actividad extracelular de la enzima lignina peroxidasa (LiP). Por
otro lado, Fahr et al. (1999), estudiaron la degradacin del 2,4-diclorofenol y del PCF por
hongos de pudricin caf (Gloeophyllum striatum y G. trabeum). En estos cultivos no detectaron
actividad lacasa ni otra peroxidasa normalmente involucrada (la manganeso peroxidasa); sin
embargo, la degradacin de ambos clorofenoles se llev a cabo.
Law et al. (2003) reportaron un 89% de degradacin del PCF por una cepa de Pleurotus
pulmonarius, aunque esta cepa presenta el inconveniente de que tarda mucho tiempo en
propagarse para su uso (10 das). Walter et al. (2004) reportaron dos hongos, P. chrysosporium y
Trametes versicolor, aislados a partir de desechos ligninolticos con capacidad de degradar el PCF,
en este trabajo tambin se report la actividad de peroxidasas extracelulares.
Tambin se ha propuesto el uso de otros hongos, diferentes a los basidiomicetes, para la
degradacin del PCF con la ventaja de que son hongos que crecen ms rpido por lo tanto el
proceso de degradacin puede ser ms corto y por ende ms econmico. Seigle-Murandi et
al., (1993) reportaron un gran nmero de cepas pertenecientes a diversos grupos taxonmicos,
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como los zigomycetos, los ascomycetos, y los mucorales capaces de degradar PCF con diferentes
eficiencias cada cepa.
Nagarathnamma y Bajpai (1999) reportaron la decoloracin de aguas residuales de la industria
de la pulpa y el papel por Rhizopus oryzae, en el mismo trabajo demostraron que esta cepa es
capaz de remover entre 50 a 100% de los diversos clorofenoles presentes en esta agua, pero no
reportan actividades enzimticas.
Tomasini et al., (1996) aislaron una cepa de Amylomyces rouxii, a partir de aguas residuales
de la industria de la pulpa y del papel. Esta cepa tiene la caracterstica de ser resistente al
pentaclorofenol (PCF). Los mismos autores demostraron que A. rouxii tolera dos veces ms de
PCF que P. chrysosporium, y que es capaz de degradar este txico en cultivo sumergido aunque
con menor eficiencia que el basidiomiceto. Se observ que A. rouxii degrada 65% del PCF
inicial en 192 h, mientras que P. chrysosporium lo hace en 144 h, bajo las condiciones ensayadas
(Tomasini et al., 2001).
Ms recientemente, Szewczyk et al. (2003) publicaron un estudio realizado con 15 cepas de
hongos, aisladas de reas contaminadas con compuestos xenobiticos provenientes de desechos
de aceite, efluentes de curtiduras y petrleo crudo. Estas cepas se incubaron en medios que
contenan fenantreno, antraceno y PCF, para determinar su capacidad de degradacin. En
este trabajo lograron identificar algunas cepas capaces de degradar PCF, determinando que se
trataba de Mucor ramosissimus, aunque no identificaron ninguna actividad enzimtica.
Rhizopus oryzae ENHE, aislado a partir de suelo contaminado con PCF, tambin es capaz de
degradar PCF. Se demostr que R. oryzae ENHE degrada entre el 85-95 % del PCF en 24
h, con una concentracin inicial de 12.5 mg PCP l-1, adems se determin produccin de
tirosinasa y LiP. (Len-Santiesteban et al., 2008).
Degradacin por levaduras
Tsai y col. (2005) revelan que levaduras del suelo poseen gran capacidad para la degradacin
de compuestos aromticos de bajo peso molecular, pero este tipo de reportes son escasos.
Se han reportado levaduras aisladas de suelo con capacidad de degradacin del fenol a
concentraciones altas para el uso posterior de estos microorganismos en el tratamiento de
aguas residuales y del suelo. Las levaduras que reportan pertenecen a gneros de Candida,
Trichosporon, Pichia, Hansenula, Yarrowia y Rhodotorula. (Kaszycki et al. 2006; Ahuatzi et al. 2004;
Polnisch et al. 1992)
Tsai et al. (2005) demuestran que la cepa de Candida albicans TL3 tiene una mejor eficiencia
para degradar fenol y formaldehdo que cepas de Pseudomonas y Buckholderia cepacia y Candida
tropicallis mutante. Adems mencionan que es de las pocas levaduras reportadas con capacidad
para degradar ambos compuestos.
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Jurez et al. (2001) evaluaron una cepa inmovilizada de C. tropicallis en un reactor de lecho
fluidizado para la degradacin de fenol, en donde ellos obtienen eficiencias de degradacin de
casi 100%, cuando las concentraciones de fenol son de hasta 1560 mg l-1.
Romero et al. (2001), mencionan que fueron seleccionadas cepas de levaduras nativas para
la degradacin de bifenilo (BF), en donde se evalu la capacidad de degradacin de 24 cepas
de los gneros Candida spp., Cryptococcus spp., Pichia spp., Rhodotorula spp., Trichosporon spp., R.
glutinis y Yarrowia spp, provenientes de sedimentos contaminados; adems, R. glutinis haba sido
mencionado como capaz de degradar otros hidrocarburos aromticas y tena alta importancia
en experimentos de biorremediacin.
Cabral et al. (2003) utilizan a Saccharomyces cerevisiae para evaluar la respuesta adaptativa al
herbicida cido 2-metil-4-clorofenoxiacetico (MCPA). En este trabajo se proponen los efectos
txicos del herbicida MCPA y el mecanismo fisiolgico de adaptacin a dicho herbicida. Los
resultados pueden ser tiles para aclarar los mecanismos de adaptacin a este compuesto
xenobitico en eucariontes. Tambin mencionan el uso de las levaduras como sistema
de bioensayo para determinar la toxicidad del herbicida de cido fenolactico y de otros
xenobiticos lipoflicos.
Yan y col. (2006) mencionan la degradacin de fenol y m-cresol usando cultivos puros de
Candida tropicalis, sus resultaron muestra que C. tropicalis puede degradar 2000 mg l-1 de fenol
y 280 mg l-1 de m-cresol en solo 66 y 52 h, respectivamente. Ellos encuentran que cuando se
aumenta la concentracin de m-cresol se inhibe en gran medida la degradacin de fenol, solo
se degradan 1000 mg l-1 de fenol, en presencia de una concentracin mayor a 280 mg l-1 de
m-cresol.
Melndez et al. (2005) reportaron que se seleccionaron 44 levaduras a partir de suelo de un
aserradero contaminado con PCF. Estas levaduras toleran PCF en diferentes concentraciones,
hasta 150 mg l-1 y demostraron que 4 de ellas tienen la capacidad de degradar PCF, en medio
con 15 g glucosa l-1 y 25 mg PCF l-1 inicial.
Enzimas que intervienen en la degradacin de PCF
Como se mencion anteriormente, entre las enzimas ms comunes que intervienen en la
degradacin del PCF estn las peroxidasas, principalmente la manganeso (MnP) y la lignina
peroxidasa (LiP). Estas enzimas realizan, en presencia de H2O2, la oxidacin de la lignina
(Kirk y Farrell, 1987; Gold et al., 1989; Higuchi, 1990).
Las manganeso peroxidasas son protenas con grupo hemo que catalizan la oxidacin
del Mn2+. La MnP (EC 1.11.1.13) es oxidada por 2 electrones del H2O2 para generar un
intermediario conocido como compuesto I. El compuesto I puede oxidar Mn2+ a Mn3+ o
puede oxidar substratos fenlicos a sus correspondientes radicales, siendo la enzima reducida
al intermediario oxidado con un electrn, conocido como compuesto II. El compuesto II
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requiere de Mn2+ como reductor, y por la oxidacin de Mn2+ a Mn3+ la enzima pasa a su estado
reducido (Kuan et al., 1993). El Mn3+, quelado por un cido orgnico, es un oxidante capaz de
oxidar gran variedad de substratos fenlicos (Kishi et al,. 1994).
Por otro lado, la lignina peroxidasa (LiP) (EC 1.11.1.14) es una glicoprotena, inespecfica y
extracelular, dependiente de H2O2. Contiene un mol de protohemo IX por mol de enzima y se
encuentra como una serie de isoenzimas (pI 3.2-4.0) (Wariishi y Gold, 1990). Esta enzima acta
por extraccin de electrones sencillos de anillos aromticos de lignina, llegando a la generacin
de un radical catinico y al subsecuente rompimiento de los anillos (Bonnarme y Jeffries, 1990).
La enzima interviene tambin en reacciones de degradacin de varios compuestos aromticos.
Otro tipo de enzimas, especficamente las fenoloxidasas (lacasas y tirosinasas), tienen la
capacidad de oxidar tambin los compuestos fenlicos.
Las lacasas (EC 1.10.3.2) pertenecen al grupo de las oxidasas azules de cobre. Son enzimas de
tipo fenoloxidasa cprica que contienen cuatro tomos de cobre, los cuales tienen un papel
importante en los mecanismos catalticos de la enzima. Los tomos de cobre se distribuyen
en diferentes sitios de la molcula. Las lacasas se han clasificado en tres tipos: lacasa tipo 1
azul, tipo 2 normal y tipo 3 cobre binuclear. En la reaccin tpica de una lacasa fngica,
el substrato est sujeto a la oxidacin de un electrn para dar un radical oxi-aril: por ejemplo,
el fenol se oxida para formar el radical fenoxilo, acompaado de la reduccin del oxgeno
molecular a agua. Las lacasas catalizan la oxidacin de tanto compuestos fenlicos como
no fenlicos (Bourbonnais y Paice, 1990) y son capaces de mineralizar un amplio rango de
colorantes sintticos (1999; Abadulla et al., 2000).
La enzima tirosinasa o polifenoloxidasa (PPO, monofenol, o-difenol:oxgeno reductasa,
EC.1.14.18.1), tambin presenta cobre en su molcula. Los sitios activos de la tirosinasa
contienen dos tomos de cobre, aunque su estructura espacial completa es an desconocida.
Esta enzima se ha estudiado principalmente en humanos, debido a su gran importancia en
la pigmentacin por melanina. Tambin el oscurecimiento enzimtico de las frutas y los
vegetales es causado por la actividad de la tirosinasa en los tejidos de las plantas, por lo que
esta enzima juega un papel importante en el procesamiento de frutas y verduras y durante el
almacenamiento de alimentos procesados. La enzima cataliza la hidroxilacin de monofenoles
(actividad monofenolasa) y la oxidacin de o-difenoles a o-quinonas (actividad difenolasa). Los
zigomicetos de las especies Rhizopus y Mucor presentan actividad fenoloxidasa (Thompson and
Cannon., 1984).
Mejoramiento gentico de cepas por expresin heterloga de peroxidasas
Gracias al conocimiento de la participacin de las peroxidasas en el proceso de degradacin
de compuestos fenlicos, como el PCF, se han realizado trabajos en los que se han expresado
genes que codifican para dichas enzimas en otros microorganismos que presentan ventajas
en cuanto a su crecimiento y manipulacin. Un ejemplo de estos trabajos es el reportado
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por Ruz-Dueas et al. en 1999, donde se realiza la expresin heterloga de peroxidasas de

Pleurotus eryngii en Aspergillus nidulans, encontrndose que ste ltimo hongo es capaz, despus de
la transformacin, de oxidar Mn2+ y otros substratos aromticos, casi con la misma eficiencia
que las enzimas nativas.
Tambin se han realizado trabajos acerca de la sobreexpresin de genes para la Mn-peroxidasa,
como el reportado por Mayfield et al. en 1994, en el que se estudi la expresin homloga
de la Mn-peroxidasa recombinante en P. chrysosporium. Los autores encontraron que la Mn-P
recombinante no se vea influenciada por el nivel de Mn en el medio, como ocurra en el tipo
silvestre, y que la cantidad de Mn-P expresada y secretada en este sistema es comparable a la
cantidad de enzima expresada por la cepa de tipo silvestre en condiciones ligninolticas.
Yasushi et al. (2000) obtuvieron la expresin heterloga eficiente de una peroxidasa con
capacidad de decoloracin de colorantes de Geotrichum candidum Dec1 en Aspergillus oryzae,
usando el promotor del gen para la a amilasa de A. oryzae. En este caso, la actividad de la
peroxidasa recombinante fue 42 veces mayor a la actividad presentada por la enzima nativa.
Asimismo, Stewart et al. en 1996 reportaron la expresin heterloga de un gen para la
manganeso peroxidasa (mnp1) de P. chrysosporium en Aspergillus oryzae. En este caso, la expresin
se consigui fusionando el ADNc del gen mnp1 con un promotor de la taka-amilasa y una seal
de secrecin, obteniendo la secrecin de la enzima en forma activa con propiedades fsicas y
cinticas similares a las de la protena nativa.
En 2001, Larrondo et al. reportaron la multiplicidad de isoenzimas y la caracterizacin de
una manganeso peroxidasa recombinante de Ceriporiopsis subvermispora y de P. chrysosporium. En
este trabajo expresaron en Aspergillus nidulans los ADNc que codifican para las MnPs de los
basidiomicetos C. subvermispora (MnP1) y P. chrysosporium (H4) bajo el control de un promotor
para la a amilasa de Aspergillus oryzae. Encontraron que las MnPs recombinantes obtenidas
tienen masas moleculares y se expresan de manera similar a las enzimas obtenidas de las cepas
parentales.
Recientemente se report la expresin heterloga de la Li-P de P. chrysosporium en la levadura
Pichia methanolica, obtenindose niveles de expresin de 100 mg Li-P H8/L (Wang et al., 2004).
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Fertilizantes de liberacin lenta y su aplicacin

en campo
Aspectos generales
En la ltima dcada han tomado importancia las llamadas tecnologas de liberacin controlada
o controlled release. Esta tecnologa puede definirse como la transferencia lenta, moderada
o gradual, de un material activo desde un sustrato de reserva a otro medio, con el fin de
conseguir sobre el mismo una accin determinada.
Con la aplicacin de esta tecnologa se busca aumentar la eficiencia de la sustancia aplicada
alargando su accin en el tiempo, evitando prdidas de todo tipo tales como lixiviacin,
volatilizacin, etc.
Por otra parte segn la Asociacin Americana del Control Oficial de Planta y Alimentos
(AAPFCO, 1995), los fertilizantes de accin lenta o controlada, son aquellos fertilizantes que
disponen de los nutrientes para las plantas de las siguientes formas:
A- Retardando y modulando la disponibilidad de stos, al ser captados por las plantas.
B- Permitiendo una disponibilidad adecuada de estos nutrientes para las plantas y se mantenga
por un perodo largo de tiempo, con respecto a los nutrientes del fertilizante tradicional.
No hay una diferencia oficial entre el trmino liberacin lenta y liberacin controlada. La
AAPFCO usa ambos trminos y definiciones. Sin embargo, la descomposicin microbiolgica
de productos nitrogenados como UFs (urea-formaldehdos), normalmente se comercializan
como fertilizantes de liberacin lenta y los productos recubiertos o encapsulados como
fertilizantes de liberacin controlada
Este retardo o prolongacin del tiempo de disponibilidad de los nutrientes puede ocurrir por
varios mecanismos: por recubrimiento semipermeable, oclusin, por polmeros insolubles en
agua, organismos nitrgenos naturales, u otras formas qumicas as como, por la hidrlisis lenta
de compuestos solubles o de poco peso molecular (100-200 unidades estructurales) que actan
por otros mecanismos no conocidos en los cuales influyen la solubilidad del material en agua.
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Fertilizantes de liberacin lenta
Existen diferentes factores que influyen en el aporte de nutrientes por los fertilizantes de
liberacin lenta siendo stos los siguientes (Fujita, 1992):
- Calidad del recubrimiento: El recubrimiento es ms eficaz cuanto ms duro,
homogneo y resistente sea. Todos los mtodos de fabricacin apuntan a estas caractersticas;
sin embargo, las tecnologas ms modernas sealan recubrimientos ms delgados y ms
eficaces, haciendo de esta manera, ms eficiente la aplicacin.
Dentro de los medios de incubacin los ms importantes son el pH y la temperatura.
- Temperatura: Es bien conocida la accin de la temperatura sobre la disolucin de
sustancias. Resumidas estas acciones podemos indicar.
a) El incremento de solubilidad de la sustancia fertilizante en agua
b) Aumento en la velocidad de difusin del fertilizante en la solucin del suelo.
c) Aumento en la velocidad de degradacin del recubrimiento.
- pH: Este factor ejerce su influencia sobre el recubrimiento o sobre el lavado y absorcin
de los iones.
- Mtodo de aplicacin: Este aspecto es an discutido. Existen razones a favor
y en contra respecto a la conveniencia de colocar el producto cerca de la superficie o ms
profundamente. Las prdidas de nitrgeno por volatilizacin de amonaco (NH3) son ms
importantes si la aplicacin es superficial, por otro lado la puesta a disposicin del nitrgeno
a la planta por degradacin de la cubierta es ms rpida cuando los grnulos estn mezclados
con el suelo. Estos fenmenos estn influenciados adems por el grado de humedad.
- Actividad microbiana: El accionar de los microorganismos influye fundamentalmente
en la disolucin del fertilizante, por la accin que tienen stos sobre la cubierta. Existen algunos
recubrimientos, como los plsticos, que no sufren el ataque de los microorganismos, pero otros
s lo sufren y es el caso de los recubrimientos a base de azufre. En los casos donde la accin de
los microorganismos es muy intensa se incorporan a los recubrimientos sustancias microbicidas
que atenan este ataque retardando de esta manera la degradacin de la cubierta.
Los fertilizantes de liberacin lenta y controlada renen estos requisitos de fertilizante
ideal, siendo sus principales ventajas (Hauck, 1993):
Reduccin de la toxicidad (particularmente en los semilleros) que es causada por
las altas concentraciones inicas producidas por la disolucin rpida de los fertilizantes
convencionales solubles por lo que de esta forma se contribuye a una mejor seguridad
agronmica.
Debido a la reduccin de la toxicidad y al volumen de sal de los sustratos se puede realizar
una mayor aplicacin del fertilizante (reducindose la frecuencia de aplicacin) en comparacin
como los fertilizantes convencionales solubles.
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Significacin econmica elevada, pues disminuye las labores en el campo y permite

la utilizacin de fertilizantes ms conveniente. Representando esto la mayor ventaja para el
consumo de los fertilizantes de liberacin lenta y controlada, contribuyendo a un avanzado
programa de sistema de cultivo con una sola aplicacin del fertilizante. Permite adems ser
utilizado en cultivos protegidos al suministrar la cantidad de nutrientes necesarios con una sola
aplicacin del fertilizante.
Reduccin de las posibles prdidas de nutrientes, particularmente las prdidas
de nitrgeno que se producen entre aplicaciones y permite captar los nutrientes por la planta
de manera gradual.
Disminucin substancial del riesgo a la contaminacin medioambiental, permite
reducir las prdidas por evaporacin del amonio, contribuyendo as a reducir las emisiones de
gases (N20) a la atmsfera, ya que como es conocido el nitrgeno fijado en forma de amonaco
y nitratos es absorbido directamente por las plantas e incorporado a sus tejidos en forma de
protenas vegetales. Cuando las plantas y los animales mueren, los compuestos nitrogenados se
descomponen produciendo amonaco y dando lugar a un proceso llamado amonificacin. Parte
de este amonaco es recuperado por las plantas; el resto se disuelve en el agua o permanece en
el suelo, donde los microorganismos lo convierten en nitratos o nitritos en un proceso llamado
nitrificacin. Los nitratos pueden almacenarse en el humus en descomposicin o desaparecer
del suelo por lixiviacin, siendo arrastrado a los arroyos y los lagos.
La lixiviacin del nitrgeno de las tierras de cultivo demasiado fertilizadas, la tala indiscriminada
de bosques, los residuos animales y las aguas residuales han aadido demasiado nitrgeno a
los ecosistemas acuticos, produciendo un descenso en la calidad del agua y estimulando un
crecimiento excesivo de las algas.
La lixiviacin adems es responsable de un problema medioambiental muy grave, ya que
produce la contaminacin de los suelos y de las aguas subterrneas o superficiales cuando el
agua de lluvia arrastra sustancias contaminantes presentes. Se suelen acumular carbonatos,
nitratos y sulfatos de hierro, calcio o aluminio.
Los fertilizantes qumicos arrastrados por el agua desde los campos de cultivo pueden ser los
responsables de estos graves problemas. El proceso de eutrofizacin puede ocasionar problemas
estticos, como mal sabor y olor, y un cmulo de algas o verdn desagradable a la vista, as
como un crecimiento denso de las plantas con races, el agotamiento del oxgeno en las aguas
ms profundas y la acumulacin de sedimentos en el fondo de los lagos, as como otros cambios
qumicos, tales como la precipitacin del carbonato de calcio en las aguas duras (Hauck, 1993).
La agricultura, es la fuente de muchos contaminantes orgnicos e inorgnicos de las aguas
superficiales y subterrneas. Estos contaminantes incluyen tanto sedimentos procedentes
de la erosin de las tierras de cultivo como compuestos de fsforo y nitrgeno que, en parte
proceden de los residuos animales y los fertilizantes comerciales, por lo que el principal peligro
que representan es el de la filtracin y las escorrentas.
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Teniendo en cuenta lo anteriormente expresado se puede plantear que hoy en da el mundo

experimenta un progresivo descenso en la calidad y disponibilidad del agua. Casi el 75% de la
poblacin rural del mundo y el 20% de su poblacin urbana carece de acceso directo a agua
no contaminada, ya que en muchas regiones, las reservas de agua estn contaminadas con
productos qumicos txicos y nitratos, por lo que las enfermedades transmitidas por el agua
afectan a un tercio de la humanidad y matan a 10 millones de personas al ao, por lo que este
aspecto se considera de suma importancia para la salud mundial (Ferry, 1990).
Sin embargo, hoy en da se est trabajando en pases tales como Japn E.U.A, Francia y
Alemania en bsqueda de producir fertilizante ms ecolgicos y que a su vez sean de bajo
costos, pues su principal desventaja son sus altos precios a que se cotizan, debido a la mayor
complicacin para obtener capas perfectas de encapsulado o recubrimiento, al ser comparados
con la produccin de los fertilizantes minerales convencionales (Trenkel, 1993).
El principal proceso de obtencin de los fertilizantes de liberacin lenta y controlada est dado
en proteger por recubrimiento o encapsulacin un fertilizante convencional soluble hacindolo
un material insoluble, semipermeable o impermeable, controlando la penetracin del agua y el
por ciento de dilucin y de liberacin de nutrientes de acuerdo a las necesidades de las plantas
(Amberger, 1996).
Las ms importantes vas de produccin son (Trenkel, 1993):
Materiales que liberan a los nutrientes a travs de su poca solubilidad dada la estructura
qumica del complejo de alto peso molecular.
Materiales que liberan los nutrientes a travs de la superficie recubierta por una pelcula.
Materiales que liberan los nutrientes a travs de la membrana, la cual puede ser o no
soluble (encapsulado).
Materiales que liberan los nutrientes incorporados dentro de una matriz la cual puede
ser recubierta.
Materiales que liberan los nutrientes en forma retardada, debido a la pequea relacin
superficie volumen (pellet, tabletas, clavos, aglomerados)
Otros materiales clasificados como fertilizantes de liberacin lenta y que no estn
ampliamente difundidos son:
Sustancias orgnicas, ejemplo: residuos de cosechas, estircol, mezcla pastosa, composta,
lodo albaal, etc.
Fosfatos metal-amonio, ejemplo: fosfato amnico de magnesio.
Los grupos ms importantes de fertilizantes de liberacin lenta y controlada segn su
proceso de produccin son:
Productos de la condensacin de urea y urea-aldehdo (fertilizantes de liberacin lenta).
Fertilizantes recubierto o encapsulados (fertilizantes de liberacin controlada).
Entre los fertilizantes de liberacin lenta, la urea-formaldehdo ocupa un papel mundialmente
importante. ste es el primer producto en que se investig la liberacin lenta del nitrgeno.
En 1924, Badische Anilin & Soda-Fabrik AG (hoy da BASF) en Alemania recibi la patente
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del mismo (DRP 431 585) en la produccin de fertilizantes por condensacin de la ureaformaldehdo (Abraham, et Col, 1996). En 1947 fue usada por los Estados Unidos esta patente
por primera vez. La produccin comercial empez en 1955 y presentaba distintas formas de
fabricacin (Folleto Aglukon Nutralene, 1993).
La urea-formaldehdo se obtiene por la reaccin de formaldehdo con urea en exceso bajo
condiciones controladas (pH, temperatura, relacin molar, tiempo de la reaccin, etc),
produciendo una mezcla de polmeros de cadenas largas diferentes. El costo de produccin de
esta sntesis es considerado elevado debido a la rigurosidad en las condiciones de la reaccin
que hay que mantener durante todo el proceso de obtencin (Trenkel, 1997).
El problema principal de su obtencin es producir por medio de una condensacin, oligmeros
en una proporcin deseada.
El modelo de liberacin lenta del nitrgeno en el fertilizante Ureaform es un proceso que
incluye dos pasos (disolucin y descomposicin).
En general los fertilizantes de urea-formaldehdo muestran una liberacin lenta de nitrgeno
combinado con una buena compatibilidad con la mayora de las cosechas. Debido a su baja
solubilidad la planta no se quema ni interfiere en la germinacin.
Su eficiencia se hace mayor a temperatura ms alta, por lo que se usa ampliamente en climas
ms calurosos (en la regin mediterrnea en Europa y en la regin del sur y del suroeste de los
Estados Unidos).
Diferentes trabajos fueron desarrollados por los cientficos con el objetivo de obtener la
Ureaform de manera menos laboriosa, as fue el trabajo desarrollado por (Waters y Col, 1966)
sobre las suspensiones de NPK con Ureaform como portador de nitrgeno. En ste se plantea
que una cantidad calculada de monmeros solubles (urea formaldehdo) se hacen reaccionar
in situ, para producir suspensiones estables, siendo necesario trabajar con una agitacin
adecuada para obtener una suspensin con la estabilidad deseada.
Fertilizantes de liberacin controlada encapsulados con polmero-cubiertos
Una serie de fertilizantes de liberacin controlada han surgido y otros se han modificado
mediante diferentes mtodos desarrollados. Los problemas principales en la produccin del
polmero recubierto estn dados por el material de la capa que se usa para recubrir y la tcnica
aplicada para sta (Moore, 1986).
El proceso de liberacin de los nutrientes a travs de la membrana/cpsula que forma el
polmero no se ve afectada por el pH, salinidad de la tierra, actividad microbiana y la fuerza
potencial redox sino que depende de la temperatura y de la permeabilidad a la humedad del
polmero que cubre al fertilizante, siendo posible predecir la liberacin de los nutriente durante
un tiempo dado (Shoji, 1992).
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La permeabilidad a la humedad puede ser controlada cambiando la composicin del polmero

que cubre el material usado.
El tiempo de duracin del producto recubierto con el polmero depende del espesor de la capa
usado en el recubrimiento. Los productos obtenidos deben indicar el tiempo de liberacin y
la temperatura a la que sta se realiza preferentemente. En caso que en la formulacin NPK
a recubrir existan compuestos secundarios no se declara el tiempo de liberacin del producto,
ya que es muy difcil determinar exactamente el mecanismo del descargo para estos elementos
(Gonzlez, 2004).
Al recubrir con materiales polimricos biodegradable los fertilizantes, se producen unos
procesos de descomposicin fotoqumica muy rpidos en la tierra. Sin embargo, cuando se
usan polmeros de poca solubilidad y difcil degradacin estos problemas no se observan con
gran facilidad siendo una caracterstica del material sinttico utilizado en la encapsulacin.
Una amplia recopilacin de los procesos tcnicos para la obtencin de estos productos es la
ofrecida por (Goertz, 1993). Por otro lado los detalles de los procesos industriales empleados
en Japn son mostrados por (Gandeza y Shoji 1992). Las tecnologas ms amplias se muestran
a travs de (Pursell Inc, 1995). as como los modelos de liberacin de estos fertilizantes
desarrollados en Israel son descritos por (Shavit, 1994) y colaboradores, (Lupu, 1996).
A pesar del alto costo de fabricacin de estos polmeros comparados con los fertilizantes
convencionales, su consumo ha aumentado durante los ltimos 15 aos, siendo ste mayor (10
% por ao) comparado con la Ureaform recubierta con azufre (2 % por ao).
El consumo de estos fertilizantes en Japn ha aumentado por encima de 47% durante el perodo
1985 a 1994. Sin embargo, Europa est retrasada con un crecimiento anual de slo 6.5%.
Una de las tcnicas ms usadas en Alemania y Japn est relacionada con la mezcla de
fertilizantes encapsulados con otros no encapsulados, es decir, con fertilizantes convencionales
los cuales ofrecen mayor flexibilidad y mejoras econmicas (Kluge, 1996).
Fertilizantes de liberacin controlada en una matriz
Las partculas de fertilizantes estn incorporadas dentro de una matriz portadora, para lograr
un efecto de liberacin lenta deseada, se necesita gran cantidad del material portador (40%).
Por consiguiente las formulaciones de fertilizante de baja cantidad de nutrientes posibles a
utilizar son: (NPK 10-10-10 o NPK 5-15-10).
En general el material portador es una mezcla de cera fundida, surfactantes, y polietilen glicol.
Otras matrices polimricas, son formuladas con caucho, estireno-butadieno y otros.
Teniendo en cuenta lo anteriormente planteado, nos dimos a la tarea de trabajar con una
suspensin polimrica de peso molecular a base de urea-formaldehdo en condiciones y
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relaciones tales que nos permitiera, recubrir un fertilizante convencional, convirtiendo a ste
en un material poco soluble o semipermeable permitiendo la liberacin de los nutrientes de
acuerdo a las necesidades de las plantas.
Los primeros estudios que se realizan en este tipo de materiales son los estudios in vitro,
los cuales constituyen la clave del conocimiento para poder predecir el posible mecanismo
y comportamiento de estos materiales en el suelo, una vez analizados los mismos en estas
condiciones ideales. A continuacin se comprueba en campo en vivo la efectividad de estos
fertilizantes para lo cual se trabaj con el cultivo de tomate y el gladiolo. Estas evaluaciones
se llevaron a cabo en reas del Instituto de Investigaciones Hortcola Liliana Dimtrova,
ubicado en la Habana, Cuba.
El estudios en vivo efectuado en parcelas en el cultivo de tomate (Lycopersicon esculentura)
fue realizado en un suelo ferraltico rojo con textura arcillosa con un contenido de materia
orgnica de 3.1 % y un pH en agua de 7.4, los fertilizantes se aplicaron a los 15 das despus
del transplante en el cultivo de tomate donde se fertilizaron 200 plantas por tratamiento, con 2
rplicas de 100 plantas cada una ocupando un rea total de 30 m2.
Tratamientos:
Tratamiento I FERLENT (12-5-16) (una sola aplicacin)
Tratamiento II Fertilizante convencional (12-5-16) (dos aplicaciones)
Las evaluaciones realizadas durante el desarrollo de la plantacin fueron:
Altura de planta.
Nmero de racimos.
Rendimiento.
Al evaluar los resultados agronmicos en parcelas en el cultivo de tomate a travs de los
parmetros de altura de la planta y rendimiento (Fig.1), se pudo comprobar la superioridad
del FERLENT el testigo, ya que en el mismo existe una barrera fsica que impide la liberacin

61.4 a
60.89 a
57.4
b
32.36 b
22 a
bbbbbb
bbbb
9b
Figura 1. Comparacin Agronmica del FERLENT y el fertilizante testigo.

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instantnea de los nutrientes, la cual los pone a disposicin de las plantas durante un perodo
ms largo, facilitando su asimilacin ms lenta y evitando las posibles prdidas lo cual se
traduce en mayores beneficios para el desarrollo y productividad de cada cosecha.
Otro estudio realizado con este fertilizante fue, en el cultivo de gladiolo (gladiolus spp. Var.
Rosado), para lo cual se trabaj en un suelo Ferraltico Rojo compactado con fertilidad de
media a alta (Tabla.1). Las variantes quedaron distribuidas en un diseo de bloque al azar con
3 rplicas en parcelas de 8.10 m2. Se utiliz un marco de plantacin de 0.90 x 0.05 m y las
labores agrotcnicas se realizaron segn lo establecido para el cultivo (lvarez, 1976).
Tabla 1. Caractersticas agroqumicas del suelo
Materia Orgnica
(%)
PH (H2O)
K+
(%)
Ca2+
(cmol/kg)
Mg2+
(%)
P
(ppm )
1.36
7.6
0.37
11
1.0
250
Tratamientos:
Tratamiento I FERLENT (14-5-12) (una sola aplicacin) a razn de 40 g/m2 y aporta 7025-60 kg NPK/ha.
Tratamiento II Fertilizante convencional, 70-70-70 kg de NPK/ha segn lo
recomendado (lvarez, 1976) con fertilizacin nitrogenada fraccionada en la plantacin
y a los 45 das posteriores. Todo el fsforo y el potasio se aplicaron en el momento de la
plantacin
Durante el desarrollo de la plantacin, se realizaron las siguientes evaluaciones:
Altura de la planta a los 60 das despus de la plantacin (cm).
Calidad del cormo (cm).
Porcentaje foliar de macroelementos (%).
La evaluacin agronmica realizada al cultivo de Gladiolo son reflejados en la Fig. 2 donde
se grafican la altura de la planta y el nmero de hojas a los 60 das despus de la plantacin,
momento que coincide con el mximo desarrollo vegetativo del cultivo del gladiolo. Para estas
variables de crecimiento se observ que la aplicacin de FERLENT produjo valores de altura
estadsticamente superiores a la variante testigo con incrementos de 15.69 % con relacin a la
fertilizacin recomendada para el cultivo en estos tipos de suelos.
Por otro lado se observ que para el nmero de hojas, a pesar de no encontrarse diferencias
significativas estadstica entre los dos tratamientos en estudio la aplicacin del FERLENT
provoc ligeros incrementos en esta variable de crecimiento (8.75%) con relacin a la
fertilizacin tradicional.
De lo anterior se deduce que desde el punto de vista agronmico la utilizacin del FERLENT
estimula el crecimiento del gladiolo. A los 60 das de la plantacin, momento que coincide con
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el mximo de desarrollo del cultivo, la planta se encuentra con un mayor desarrollo vegetativo
por tanto mejor preparada para enfrentar el proceso de floracin que se inicia justo a los 60
das, y con menor posibilidad de sufrir los estrs que se pueden presentar en las condiciones de
desarrollo y con mayor acumulacin de masa vegetal y sustancias de reservas, sta ltima se
movilizan hacia el cormo durante el proceso de engrosamiento y favorecer la formacin de
materias de alta calidad, aspecto que ser corroborado ms adelante. El proceso de crecimiento
del cormo se inicia aproximadamente a los 93 das de la plantacin coincidiendo con el final
del periodo de floracin
Figura 2. Altura de la planta y nmero de hojas a los 60 (das despus de la plantacin) DDP.
El cormo del gladiolo es un tubrculo de estructura slida, forma redondeada y algo achatada,
en l se localizan las yemas que dan lugar a las futuras plantas, se reversa en cada plantacin y
sus restos permanecen en la base del nuevo formado.
El engrosamiento del nuevo cormo se produce por migracin de los productos de la fotosntesis
contenidos en las hojas y conjuntamente dan lugar a multitud de bulbillos denominados perlitas
o cormelos.
Al analizar los indicadores de calidad del cormo, material que se utilizar en las futuras
plantaciones, se encontr que FERLENT favoreci la produccin de cormos con dimetros
superiores a 5 cm (categora Jumbo), e inversamente, disminuyeron los porcentajes de cormos
ubicados en la categora grande cuyos dimetros se ubican entre 3 y 5 cm lo cual se corresponden
con materiales de plantacin de alta calidad.
En este sentido hay que destacar que la obtencin de cormo con calibres superiores (Fig. 3)
influye en la calidad del cultivo del gladiolo, a nivel internacional se comercializan bulbos
con dimetros mnimos de 8 cm si se pretende obtener flores grandes, por otro lado se ha
comprobado que el ciclo del cultivo suele ser ms corto si los calibres son mayores, por tanto el
grosor del cormo es un factor de precocidad. El rgano comercial del gladiolo est constituido
por una inflorescencia en la espiga si el inters es obtener flores cortadas, pero si por el
contrario el fin de la plantacin es formar semillas las labores estn dirigidas a cosechar cornos
de calidad. De aqu la importancia que esto representa en el estudio realizado.
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Figura 3. Porcentajes de cormos por categoras.
Al evaluar el estado nutricional del cultivo a los 60 das despus de la plantacin (Fig.4), se
obtuvo un mayor porcentaje de acumulacin de potasio, seguido por el nitrgeno y del fsforo,
que segn estudios realizados para las condiciones de Cuba los contenidos de N, P, y K foliares
oscilan entre 0.972.22%, 0.190.85% y 1.453.25% respectivamente coincidiendo con las
determinaciones en esta experiencia. Al comparar ambos tratamientos se obtuvo que con
el FERLENT se favoreci la acumulacin de nitrgeno y potasio en plantas de Gladiolo, al
encontrarse un porcentaje significativamente superior de estos macroelementos en las plantas
(11.61 y 26.34 %) respectivamente en comparacin con la fertilizacin tradicional. Adems
con estos resultados se pudo comprobar el aprovechamiento de los nutrientes por la planta,
lo que impide que stos sean lixiviados o volatilizados contribuyendo a la disminucin de la
contaminacin ambiental.
Figura 4. Porcentaje foliares de macroelementos a los 60 DDP.
Con todos estos anlisis se pudo demostrar que con la utilizacin de FERLENT como
alternativa de nutricin en el gladiolo permite obtener indicadores de calidad de la espiga y de
crecimiento superiores que la fertilizacin tradicional recomendada para este cultivo en suelos
ferralticos rojos, esto favorece adems la produccin de cormos de mayor calibre y plantas con
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un mayor contenido de nitrgeno y potasio foliar lo que influye en la calidad comercial de la

planta obtenida.
Es de destacar, que con la utilizacin de FERLENT se pueden aplicar los nutrientes que la
planta requiere durante todo su ciclo de una sola vez, ya que es un fertilizante que se suministra
de fondo sin necesidad de fraccionamiento y su accin de liberacin progresiva le permite a
la planta tomar los nutrientes contenidos en su formulacin a medida que sta lo necesita, por
lo que este efecto redunda en una disminucin del nmero de aplicaciones y por tanto en
un resultado positivo por el concepto de costo, al reducir los gastos en mano de obra que se
requieren para realizar el segundo fraccionamiento de fertilizantes.
Conclusiones
1- Se encontr una metodologa de sntesis para la obtencin de un material polimrico que
permiti la microencapsulacin de un fertilizante convencional y obtener as un fertilizante
de liberacin lenta y controlada registrado en la Oficina Cubana de la Propiedad Intelectual
como FERLENT.
2- Con la produccin de un fertilizante de liberacin lenta y controlada se logra hacer ms
insoluble el compuesto ms soluble (KCl) presente en el fertilizante convencional y de esta
manera la planta logra asimilar este nutriente con un nivel de aprovechamiento elevado, por
un espacio de tiempo ms prolongado. Todo lo anterior es vlido para el caso de los restantes
nutrientes.
3- Los resultados agronmicos demostraron la superioridad del FERLENT con respecto a
la fertilizacin tradicional para todos los cultivos aqu analizados con lo que se garantiza la
seguridad agronmica en cada produccin, al disminuir el nmero de aplicaciones y por
consiguiente los gastos en mano de obra que se requieren con el fertilizante convencional,
produciendo un ahorro econmico por este concepto.
4-Con estos estudios se comprob que con el fertilizante microencapsulado se logra un marcado
efecto ecolgico al reducir las emisiones de gases de N2O y NxO a la atmsfera, sin lo cual
podra traer consigo que los nitratos puedan almacenarse en el humus en descomposicin o
desaparecer del suelo por lixiviacin, siendo arrastrado a los arroyos y los lagos, contaminndose
los mismos.
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Generacin, uso e implementacin de

organismos genticamente modificados para
fines agrcolas: el caso del maz en Mxico
Introduccin
Los Organismos Genticamente Modificados (OGMs) son producto de la llamada biotecnologa

moderna, concepto que engloba procesos donde se utiliza la ingeniera gentica para aislar,
manipular y reinsertar en nuevos organismos genes que confieren propiedades (expresin de
protenas recombinantes o regulacin diferencial de la transcripcin) de inters para fines de
investigacin o comerciales. Desde 1996 existen diferentes lneas de cultivos genticamente
modificados que han sido liberados al ambiente y sembrados de manera masiva en diferentes
partes del mundo, dentro de los cultivos con mayor extensin, est el maz transgnico, cuya
introduccin en Mxico ha generado un gran debate entre diferentes sectores de la sociedad,
la industria, y los tomadores de decisiones.
En esta aportacin se abordar este tema tomando en cuenta las condiciones agrcolas
y sociales que estn presentes en Mxico, no sin antes hacer un breve punteo sobre los
mtodos de transformacin gentica de plantas, las herramientas moleculares que se
utilizan para caracterizar los transgenes una vez insertados en un nuevo genoma, las
limitaciones del biomonitoreo. Finalmente, los puntos anteriores sern discutidos en el
contexto de nuestro pas.
La ingeniera gentica y los Mtodos de transformacin de plantas
La ingeniera gentica entendida como la manipulacin directa del material de la
herencia y sus productos (protenas), fue posible a partir del descubrimiento de la molcula
fundamental de la herencia, el cido Desoxirribonucleico (ADN), en 1953 y despus de ello,
la caracterizacin y aislamiento de la molcula mensajera de cido Ribonucleico (ARN) as
como las enzimas (protenas) de restriccin capaces de cortar el ADN en sitios con motivos
especficos, as como las ADN Polimerasas (enzimas con capacidad de copiado de ADN)
hicieron posible la obtencin, edicin y transformacin del ADN de diversos organismos.
Los primeros estudios que utilizaron esta tecnologa se llevaron a cabo en bacterias y para
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Generacin, uso e implementacin de organismos genticamente modificados para fines agrcolas
1986 se cre la primera planta genticamente modificada o transgnica (aqu se usar

indistintamente el trmino): una planta de tabaco que expresaba una luciferasa y por lo
tanto, fluoreca en la oscuridad (Ow et al, 1986).
En la actualidad, existen diferentes tcnicas de transformacin vegetal que utilizan mtodos
fsicos, qumicos o biolgicos (vectores) para introducir una secuencia de ADN exgeno o
transgen al genoma de una planta que al incorporarlo se vuelve transgnica. Las secuencias
producto de la tecnologa de ADN recombinante son quimricas ya que contienen secuencias
de distintos organismos que fueron cortadas mediante enzimas de restriccin a partir de
extractos de ADN o cADN1. Estas secuencias quimricas o casettes de transformacin estn
constituidos, como mnimo, por un promotor que dirige la expresin espacio-temporal del
gen de inters, el gen de inters y una secuencia de trmino o terminador de la transcripcin.
Adems, las lneas que han sido transformadas mediante cultivos bacterianos contienen
secuencias flanqueadoras (ADN-T) que permiten la insercin de un fragmento exgeno en un
genoma blando de transformacin.
En la mayora de las plantas transgnicas y en particular en maz, todas las lneas transgnicas
comerciales tienen adems de los elementos mencionados arriba, genes que confieren resistencia a
algn sustrato, comnmente, a antibiticos (llamados marcadores de seleccin). Esta caracterstica
se usa para seleccionar las lneas que hayan incorporado de manera exitosa un transgen.
Hay dos estrategias generales para transformar plantas, en la primera se utilizan cultivos
celulares de tejidos poco diferenciados que pueden ser de origen esporoftico o gametoftico
que despus de habrseles introducido la construccin de inters, son regenerados en plantas
completas mediante diferentes tratamientos hormonales; la segunda se basa en la introduccin
de ADN en el gametofito u otros tejidos que lo conforman (transformacin in planta). Para una
sntesis de los mtodos de transformacin ms utilizados en cereales, as como sus ventajas y
desventajas metodolgicas, ver tabla 1.
En el primer caso, la secuencia quimrica se inserta en el ncleo de una clula totipotencial
ya sea de callos indiferenciados, tejidos en cultivo o meristemos areos por mtodos fsicos o
qumicos, mientras que en el segundo caso el mtodo de transformacin se basa en infeccin
por parte de cultivos de la bacteria Agrobacterium tumefaciens, la que contiene plsmidos propios
que son previamente modificados con construcciones quimricas. Aqu, la construccin es
incorporada al genoma de la planta receptora mediante procesos de recombinacin ilegtima
o no homloga que son mediados por la maquinaria subcelular de reparacin del ADN.
Tcnicas moleculares de deteccin de transgenes y sus productos
Despus de transformar un cultivo celular o planta es necesario averiguar si la transformacin
fue exitosa. Una de las formas de determinarlo es analizar la expresin del marcador de
El ADNc (complementario) es producto de la extraccin de ARN y retrotranscripcin para obtener cadenas de ADN sin intrones, es decir, la parte codificante de un gen
1
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Necesario
Necesario
Clulas
indiferenciadas en
suspensin,
Electroporacin callos, explantes:
embriones
inmaduros,
inflorescencias
Meristemos
apicales,
embriones, callos
Botones florales,
callos, tejido
vegetativo
Biobalstica
Infeccin con
Agrobacterium
tumefaciens
No
Uso
FT
Es independiente del tipo

tejido y especie/genotipo
Requiere poca
preparacin del tejido a
transformar
Mtodo ms exitoso para
transformar cereales
Alta eficiencia de
transformacin estable
Tendencia a presentar
bajo nmero de copias
del transgen
Posibilidad de transferir
Diversidad de tejidos
tiles
Tendencia a presentar
bajo nmero de copias
del transgen
Mtodo simple
Uso de poco equipo
especializado
Alto porcentaje de plantas

transformadas con
expresin estable; til
para probar vectores de
transformacin y
seleccionar en etapa de
cultivo de tejidos
Ventajas
Transferencia de fragmentos
indeseados del plsmido Ti
Necesario pasar de vector primario a
secundario
Cereales solan ser recalcitrantes a
infeccin
El tejido u rgano debe ser separado

de la planta
Tcnicamente ms complicado
Manejo de tejidos post transformacin
es complicado
Restringido a tejidos particulares

Las fibras son dainas para la salud
- Necesario uso de Suspensiones de

clulas embrionarias que:
- Pierden su capacidad embriognica
con el tiempo
- Acumulan anormalidades
- Tendencia a que se inserten muchas
copias del transgen
Desventajas
Se resumen los mtodos de transformacin ms exitosos en gramneas, haciendo especial nfasis en la transformacin con A. tumefaciens y
biobalstica, que son las tcnicas ms utilizadas a la fecha. Claves: MS, marcadores de seleccin; FT, fitohormonas. Informacin sacada de:
Lazzeri, PA y Barcel, P. (2003). Tabla modificada de Pieyro-Nelson (2007).
Necesario
Necesario
Clulas
embriognicas en
suspensin
Vrtex con
fibras de
carbamida de
silicn
Uso de
MS
Necesario
tejido utilizado
Clulas
Transformacin
indiferenciadas en
de protoplastos
suspensin
Mtodo
Tabla 1. Mtodos ms utilizados para la transformacin de gramneas.
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alta
Alta
Baja
Media
Alta
***
**
***
Southern blot
Genosensores
ELISA
Western blot
media
***
PCR
cuantitativo de
tiempo real
**
media
**
PCR cualitativo
PCR
cuantitativo de
punto final
Capacitacin
tcnica
Costo
Mtodo
Alta
Media
Alta
Alta
Alta
Alta
Alta
Especificidad
baja
media
alta
baja
alta
alta
alta
baja
media
baja
baja
alta
media
media
Sensibilidad
M.
M.
Individual Agregada
Buena calidad del ADN necesaria para

resultados reproducibles. Muy sensible
a pequeas cantidades contaminantes
de templado
resultados reproducibles. Sensible a
pequeas cantidades contaminantes de
templado; gen reportero puede ser
problemtico (ms de 1 copia en
diferentes razas de la misma especie).
Buena calidad y cantidad de ADN
necesaria para resultados
reproducibles, digestin y transferencia
a membrana delicados. Sonda debe
tener actividad especfica precisa.
Secuencia-especfico. Sensible a
pequeas cantidades contaminantes de
templado
No til para alimentos procesados
donde la protena se haya degradado.
Puede presentar resultados
artefactuales
Buena calidad de ARN necesaria para
resultados reproducibles; cantidad de
ARNm necesario es alta, transferencia
a membrana delicados. Sonda debe
tener actividad especfica precisa

resultados reproducibles. Muy sensible
a pequeas cantidades contaminantes
de templado
Restricciones analticas
Un mayor nmero de asteriscos implica mayor costo de la tcnica, tanto por los reactivos involucrados, como por la infraestructura implicada. La informacin para esta tabla est basada en los artculos de Anklam et al, 2002; Shehata, M., 2005 y Tripathi, L., 2005. Tabla
modificada de Pieyro-Nelson (2007).
Protena
ADN
Molcula
que
detecta
Tabla 2. Tcnicas de deteccin de transgenes en plantas.
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seleccin. Hay que sealar que este permite saber si el transgen que codifica para el marcador
de seleccin ha sido incorporado adecuadamente y no garantiza la correcta expresin de
otro transgen con el que se haya cotransformado a una planta. En algunos casos, el gen de
resistencia puede haberse insertado pero no se expresa por silenciamiento transcripcional (no
hay ARN) o postranscripcional (el ARN es degradado antes de ser traducido). Para detectar
la presencia del ADN insertado la tcnica ms utilizada es la Reaccin en Cadena de la
Polimerasa o PCR (por sus siglas en ingls), con la que se detecta el gen de inters, ya que si
ste se encuentra presente, habr una amplificacin exitosa al llevar a cabo una reaccin de
PCR utilizando oligonucletidos especficos para la secuencia que se busca. Con variantes de
esta misma tcnica se pueden determinar, adems, las secuencias flanqueantes al transgen, ya
sea por PCR inverso o TAIL-PCR2
Otra tcnica ampliamente utilizada en el anlisis pos-transformacin es la hibridacin DNADNA tipo Southern blot, con la cual se puede determinar el nmero de copias del transgen o
secuencias reguladoras no codificantes (promotores y terminadores) que han sido incorporadas
al genoma de una planta transformada, mientras que por otra tcnica similar llamada Northern
blot que implica una hibridacin ADN-ARN, se puede determinar la cantidad de RNAm
producido por un gen particular y por ende estimar cualitativamente el grado de expresin de
un transgen. Esta ltima tcnica sirve nicamente para observar los productos de secuencias
codificantes; no es til para determinar la presencia de secuencias reguladoras. La tcnica
de PCR s permite amplificar ADN genmico para buscar si estn insertadas secuencias
reguladoras exgenas.
Para determinar el nivel de expresin de las protenas recombinantes se usan mtodos de
inmunoensayo mediante hibridacin protena-protena (anticuerpos especficos), llamada
Western blot, que sirve para determinar si se expresa una protena recombinante particular
y en qu nivel. Otra tcnica usada se basa en una reaccin inmunolgica donde la protena
de origen recombinante es detectada por una reaccin antgeno-anticuerpo especfica. Esta
tcnica, conocida como ELISA (Enzyme Linked Inmunobsorbent Assay) por sus siglas en
ingls, se puede montar para cualquier protena y actualmente existen varios kits comerciales de
deteccin de las protenas recombinantes ms comunes presentes en los cultivares transgnicos
comerciales, como son las diferentes versiones de protenas Cry, EPSPS y PAT (por ejemplo, la
empresa Agdia ofrece kits que son capaces de detectar diferentes combinaciones de protenas
recombinantes: http://www.agdia.com/gmo.html).
En el caso del maz genticamente modificado, varias secuencias han sido ampliamente
utilizadas para transformar las diferentes lneas de maz transgnico presentes en el mercado:
El PCR inverso y el TAIL-PCR se basan en disear oligonucletidos o cebadores que se anclan dentro
de una secuencia conocida (por ejemplo, el promotor, el transgen o el terminador) pero en lugar de que
uno de los oligonucletidos se dirija en direccin 3` a 5` y el otro en direccin 5`a 3`, ambos se dirigen en
direccin 5`a 3`, es decir, hacia fuera de la secuencia conocida, con lo cual empezarn a amplificar una
parte de la secuencia desconocida que se quiere determinar. Cada tcnica tiene sus variaciones, sin embargo, en ambos casos, se pueden aislar y clonar los fragmentos de PCR amplificados y secuenciar con
el fin de determinar las secuencias adyacentes.
1
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la de mayor uso ha sido el promotor 35S del Virus del Mosaico de la Coliflor (CaMV, por sus
siglas en ingls), presente en 86% de los eventos transgnicos reportados y en menor medida
(60%)3, el terminador de la transcripcin de la enzima Nopalina Sintetasa (tNOS), aislada
de Escherichia coli, as como ciertos genes que codifican para la resistencia a antibiticos o
herbicidas aislados de diversos organismos. Por ejemplo, el gen PAT, aislado de Streptomyces
viridochromogenes. Si se realiza pruebas de PCR para amplificar tanto el promotor 35S as como
el tNOS, se abarca el 96% de los eventos comerciales de maz transgnico liberados al medio
ambiente en Estados Unidos4, que es el principal productor de OGMs del mundo.
Estas mismas tcnicas, ms otras que se mencionan en la tabla 2, han sido utilizadas para llevar
a cabo labores de biomonitoreo de OGMs, es decir, detectar la presencia de transgenes en
plantas y semillas de eventos transgnicos liberados al medio ambiente, as como sus derivados
(alimentos procesados, aceites, etc.) tomados de distintas partes de la cadena productiva y
alimenticia (campo, contenedores industriales, harinas, alimentos procesados). El biomonitoreo
de plantas transgnicas tambin se puede hacer mediante mtodos de observacin indirecta
en campo, al caracterizar la respuesta fisiolgica de plantas vivas despus de la aplicacin de
herbicidas u otros marcadores de seleccin. Sin embargo, es ms confiable determinar si estn
presentes las protenas o genes recombinantes mediante las tcnicas moleculares enlistadas
arriba, pues la gran mayora de los organismos transgnicos no se distinguen visualmente de los
no transgnicos y las respuesta fisiolgica a determinada sustancia puede variar dependiendo
de condiciones ambientales. Ahora bien, las tcnicas de deteccin moleculares pueden verse
afectadas y presentar falsos negativos si la secuencia de inters en el caso de anlisis basados
en ARN- se encuentra silenciada, va metilacin de residuos de citosina, o si ha sido blanco de
recombinacin, en el caso del ADN, as como si fue integrada de manera truncada. En el caso
de tcnicas de deteccin basadas en la presencia de protenas recombinantes, stas tambin
pueden presentar modificaciones en el eptope de reconocimiento, degradacin proteica, o
demasiada o muy poca protena, que pueden generar falsos negativos y en ocasiones, falsos
positivos, disminuyendo as la certidumbre de las pruebas de ELISA.
Por ltimo, no se sabe si el cambiar de contexto genmico es decir, pasar de estar en un
hbrido comercial a una raza criolla- afecta la sensibilidad de los ensayos de laboratorio, dada
la presencia de metabolitos secundarios no considerados o por los procesos de silenciamiento
transcripcional o postranscripcional. Los fenmenos bioqumicos mencionados provocan que
el llevar a cabo labores de biomonitoreo sea potencialmente mucho ms complejo e impreciso
de lo previsto, por lo que es aconsejable corroborar la robustez de las diferentes tcnicas a
emplear y en su caso, estandarizarlas para el caso especfico del cultivar bajo monitoreo, as
como sus variantes (en el caso del maz, las razas criollas e hbridos no convencionales). En la
siguiente seccin se presentan los caracteres ms utilizados en plantas agrcolas transgnicas as
como los patrones de adopcin de estos cultivares a nivel mundial.
3
4
Segn informacin consultada en www.agbios.com en Mayo, 28, 2008.

Ibid.
128
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Transgnicos sembrados a nivel mundial

Los principales cultivares transgnicos sembrados desde 1996 han sido, en orden de extensin:
soya, maz, algodn y colza. Las caractersticas de origen transgnico en estos cultivares han
sido primordialmente la tolerancia a herbicidas (glifosato y glufosinato, principalmente) y la
resistencia a insectos (Lepidpteros y Colepteros), seguidas por cultivos con genes apilados
para ambas. As, en 2005, la tolerancia a herbicidas, introducida en maz, colza y algodn,
ocup 71% de la superficie total plantada con OGMs, (63.7 millones de hectreas de las 90.0
millones de hectreas de transgnicos a nivel mundial) mientras que 16.2 millones de hectreas
(18%) se sembraron con cultivos resistentes a insectos, comnmente llamados Bt (con alguna
variante de protenas Cry) y 10.1 millones de hectreas (11%) con cultivos que contienen ambos
genes apilados. Estas ltimas lneas fueron las que tuvieron una representacin proporcional
mayor en 2004 y 2005, con 49% de aumento con respecto a aos anteriores en comparacin
con un 9% de aumento para las lneas tolerantes a herbicidas y 4% para aquellas resistentes a
insectos (p. 4-5 James, 2005).
A decir de los proponentes del uso a gran escala de organismos genticamente modificados
en la agricultura, la intencin es que en los siguientes diez aos los cultivos transgnicos pasen
de estar concentrados en pases desarrollados (Estados Unidos concentra casi el 55% del rea
mundial sembrada con OGMs) a estar preponderantemente en pases en vas de desarrollo, en
particular, pases de frica, Amrica Latina (adems de Argentina y Brasil, cuyo uso de soya
resistente a glifosato es muy alto) y del continente Asitico, en particular China e India (para
ms informacin ver James, 2005). Para ello, las corporaciones productoras y comercializadoras
de OGMs estn llevando a cabo una intensa campaa de propaganda y cabildeo con los
gobiernos de los diferentes pases blanco. Esto tambin implicara el desarrollar transgnicos
de otras especies segn las necesidades de estos pases. El maz es uno de los cultivares blanco,
ya que este cultivo es fundamental en muchos pases del tercer mundo y actualmente las
variedades transgnicas comercializadas slo representan menos del 14% del rea mundial
plantada. Bajo este panorama, Mxico es sin duda, uno de los pases ms importantes para
promover la siembra de maz transgnico, ya que nuestro pas se encuentra en los primeros
lugares de produccin de este grano a nivel mundial y el maz representa las dos terceras partes
de los cereales cultivados en Mxico.
Dado lo anterior, a continuacin se har una breve sntesis de las caractersticas biolgicas,
sociales, econmicas y culturales que hacen que el uso de maz transgnico en Mxico sea
potencialmente nocivo.
Importancia del maz para Mxico
El maz es un cultivo nodal para Mxico, pues es la base de la dieta mexicana. A la vez, nuestro
pas es centro de origen y diversificacin del maz (Vavilov, 1992; Doebley e Iltis, 1984; Wang
et al, 1999; Matsuoka et al. 2002;) y actualmente cuenta con al menos 41 razas catalogadas
(Ortega, 2003) que representan un importante reservorio de diversidad gentica que es
fundamental conservar.
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En cuanto a su biologa, el maz (Zea mays ssp. mays) es una planta monocotilednea anual,
monoica, con un tallo que termina en una inflorescencia masculina llamada pancula o espiga
mientras que la inflorescencia femenina, conocida por su fruto como mazorca se forma a
partir de meristemos laterales presentes en las axilas de las hojas, generalmente a mitad de la
longitud del tallo. La polinizacin se lleva a cabo por viento y es generalmente cruzada. El
polen es viable hasta por 8 horas despus de haber sido dispersado de la pancula y puede
viajar entre 2 a 20Km, dependiendo de las condiciones climatolgicas.
El maz, es una planta que a diferencia de otros cultivos, como el trigo y la cebada, no tiene
variedades silvestres y depende del ser humano para completar su ciclo biolgico (en particular,
en el proceso de eliminacin de brcteas que cubren la mazorca y la dispersin de semillas).
Estudios recientes, tanto en gentica del desarrollo como evolucin molecular y arqueologa,
estn aportando evidencia emprica y experimental que apoya la hiptesis postulada por
George Beadle para explicar el origen biolgico del maz: Beadle propuso que esta planta es
el producto de la seleccin artificial del hombre sobre poblaciones de una especie de teocintle
(Zea mays ssp. parviglumis) presente en el valle del ro Balsas hace 10, 000 aos (Buckler y Stevens,
2006). Algo importante que se desprenda de esta hiptesis es que el cambio drstico en la
ontogenia y morfologa del teocintle al maz, en particular del fruto (la mazorca), se debe
a cambios pequeos en genes maestros (hometicos) que son responsables de establecer
los patrones de desarrollo presentes en diferentes especies. Investigaciones recientes han
comprobado que ste es el caso para el maz (Wang et al, 1999; Matsuoka et al. 2002)
Un grupo de herbceas silvestres que se asemejan en estructura al maz, los teocintles, son
considerados los parientes ms cercanos del maz pues aunque la mazorca de maz y la
infrutescencia de las diferentes especies y subespecies de teocintles presentes en el territorio
nacional son muy distintos entre s, su cercana gentica se ha comprobado (Doebley, 2004).
Actualmente se siguen encontrando hbridos maz-teocintle, prueba de que el flujo gnico
entre ambos, contina y muchos teocintles crecen como herbceas invasoras en sembrados
del pas. (Ellstrand et al, 1999) Lo anterior, abre la puerta a la posibilidad de introgresin de
transgenes en los teocintles presentes en Mxico.
Los registros fsiles ms antiguos de mazorcas de maz modernas (con las caractersticas que
conocemos actualmente) son de hace aproximadamente 10,000 aos (Benz, 2001). A partir de
estas primeras mazorcas ancestrales, el mejoramiento continuo por parte de los agricultores
mesoamericanos prehispnicos (para los cuales el cultivo de esta planta y otras llev al
sedentarismo necesario para la construccin de las diferentes civilizaciones documentadas en
Mesoamrica) as como los actuales, asentados en reas con condiciones edficas, climticas,
altitudinales y agroecolgicas contrastantes, ha generado una enorme variedad de razas y
poblaciones nativas adaptadas a diversas condiciones y requerimientos agronmicos (Ortega,
2003). El mejoramiento de estas poblaciones no es un proceso acabado y se sigue llevando
a cabo en un proceso de mejoramiento autctono continuo, trmino acuado por el Dr.
Antonio Turrent para sintetizar el proceso realizado por los agricultores de comunidades
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rurales tradicionales (Turrent y Serratos, 2004). stos conservan semilla de un ciclo agrcola
a otro, seleccionando en cada generacin aquellas mazorcas con caractersticas deseadas
como tamao de la mazorca, tamao del grano y olote, color, consistencia, precocidad, etc.
Tambin, intercambian semilla con vecinos y parientes y en ocasiones, adquieren semilla de
lugares lejanos si sta les parece atractiva. Este proceso ha dado como resultado al menos 41
razas distintas de maz (Snchez 2000, citado por Ortega, 2003) aunque nuevas razas se siguen
descubriendo y caracterizando (Astier y Barrera, 2006). En nuestro pas, 75% de las tierras
sembradas con maz lo son con variedades criollas. (Turrent y Serratos 2004) Adems, este
cultivo ocupa las dos terceras partes de tierras cultivadas en Mxico (www.sagarpa.gob.mx),
mientras que a nivel mundial, es el segundo cultivo (despus del arroz) ms sembrado.
Discusin: manejo de maz en Mxico y relacin con el potencial flujo de
transgenes a razas criollas.
La dinmica de mejoramiento continuo por parte de agricultores, genera problemas claros
para el aislamiento de un cultivar de maz transgnico de uno no transgnico mientras que las
limitaciones de las tcnicas moleculares utilizadas para realizar biomonitoreo consecuencia
de diferentes fenmenos bioqumicos y fisiolgicos que han sido documentados en plantas
transgnicas (Anklam et al 2002), aunado al hecho de que para implementar este tipo de ensayos
de laboratorio, es necesario tener personal altamente calificado, as como una infraestructura,
equipo, material e insumos relativamente costosos, ocasiona que el biomonitoreo de la
introduccin de lneas de maz transgnico a campo abierto en nuestro pas sea poco eficiente
y por ende, la implementacin de estrategias para restringir el flujo gnico entre variedades
transgnicas y no transgnicas de maz sean tardas o insuficientes. Esto, tanto por el hecho de
que si no se puede detectar la presencia y estimar la frecuencia de un transgen en una poblacin
de manera consistente y expedita, se pierde tiempo para aplicar las medidas de contencin
necesarias que permitan evitar y/o disminuir el flujo gnico, el cual, a su vez, se puede ver
potenciado por las dinmicas de intercambio de semillas comunes a un alto porcentaje de
agricultores mexicanos, quienes de manera involuntaria podran potenciar este flujo ya que
a la fecha, las lneas de maz transgnico son fenotpicamente iguales que sus contrapartes no
transgnicas, por lo que visualmente no se pueden discriminar.
Bajo este panorama, la legalizacin y consecuente liberalizacin de la siembra de lneas de
maz GM puede llevar a una difusin inadvertida de este material va las redes de intercambio
campesino. Ms an, mientras que las lneas de maz GM actuales no han presentado daos
claros a la salud (si bien no se han realizado estudios epidemiolgicos a largo plazo), lo que s
se sabe es que stas y todas las otras lneas comerciales de OGMs para uso agrcola presentan
derechos de patente sobre las secuencias transgnicas y son sujeto de contratos restrictivos
que obligan al agricultor a pagar un sobreprecio por la tecnologa presente en la semilla, as
como el comprometerse legalmente a que acabado el ciclo agrcola, no guarde semilla para
sembrar en un ciclo posterior. Lo anterior, en el escenario de flujo gnico fortuito de variedades
transgnicas patentadas, puede representar una seria amenaza a la conservacin de semillas
tanto por los agricultores (in situ) como en bancos de germoplasma (ex situ) por las implicaciones
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legales de infringir un derecho de patente. Otro aspecto an ms preocupante se refiere al

hecho de que ya existen otras lneas de maz transgnicos que expresan frmacos, solventes,
plsticos, sustancias de uso industrial o teraputico que eliminan la vocacin alimenticia de este
cultivo y que adems, de llegar a la cadena trfica podran tener consecuencias desastrosas. Esta
posibilidad se incrementa dado el hecho de que en Estados Unidos, con quien compartimos
una frontera grande y porosa, ya tiene sembrados miles de acres con este tipo de OGMs1. Esta
posibilidad ha sido advertida en diferentes foros, as como por un panel trinacional de expertos
consultados por parte de la Comisin de Cooperacin Ambiental de Amrica del Norte (2004),
quienes han recomendado la moratoria a la siembra de este tipo de cultivos.
Dado lo anterior, ms el hecho de que Mxico, en su calidad de Centro de origen y diversificacin
cuenta con un reservorio gentico sobresaliente en lo referente a este cultivar, aunado a la
importancia alimenticia, social y econmica que tiene el maz en nuestro pas, la poltica ms
sensata a la fecha es declarar una moratoria indefinida a la siembra a campo abierto de maz
transgnico.
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Aplicacin de tcnicas de biologa molecular

para estudios de ecologa de actinomicetos
halfilos en Mxico
BIOLOGA DE LOS AMBIENTES EXTREMOS: LOS EXTREMFILOS
A lo largo de las ltimas dcadas, hemos descubierto que en la Tierra existen ambientes inimaginables, y lo que era an ms difcil de esperar, se ha descubierto que existen organismos
que viven ah. No es que estos organismos sobrevivan en estas condiciones, sino que estos ambientes extremos son su hbitat natural, es por ello que se les ha denominado extremfilos. Este
trmino fue usado por primera vez por Maceroy hace tres dcadas (MacEroy, 1974).
Cuando las condiciones del medio son tales que el individuo se encuentra en situacin de stress,
estamos hablando de un ambiente extremo (Rossi et al, 2003). Ante esta situacin y para no
morir los organismos pueden generar distintas estrategias, una de ellas es por ejemplo aislarse
del medio; as Cyanidium caldarium y Dunaliella acidophila que se encuentran en un pH de 5 tiene
un citoplasma neutro, aunque eso s sus protenas externas son cido tolerantes.
Existen diferentes tipos de organismos extremfilos:
Psicrfilos: Se desarrollan en ambientes fros, prximos al punto de congelacin del agua
(Madigan et al. ,2003).
Termfilos: Viven y se reproducen en ambientes de elevada temperatura, por arriba de los
80 C (Niehaus et al., 1999).
Acidfilos: Viven en sitios de pH cido, menor a 5
Alcalfilos: Viven en sitios de pH bsico, por encima de 9 (Madigan et al. ,2003).
Barfilos (piezfilos): Crecen en ambientes con alta presin como suelos profundos (Abe y
Hirikoshi, 2001).
Metalfilos: Habitan en medios con altas concentraciones de metales pesados.
Xerfilos: Crecen en ambientes con baja humedad (Madigan y Marrs, 1997).
Halfilos: Viven en ambientes con elevada concentracin salina.
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HALFILOS
El microbilogo britnico Anthony Walsby descubri en un estanque hiper-salino cerca del
Mar Rojo, bacterias que viven en ambientes con altsimas concentraciones de sales, este tipo
de microorganismos fueron llamados halfilos (amantes de la sal).
Los microorganismos capaces de crecer tanto en ausencia como en presencia de sal, son llamados halotolerantes y los que requieren sal para su crecimiento son llamados halfilos. De
acuerdo a la definicin de Kushner (1978), es posible distinguir entre halfilos dbiles, como lo
son la mayora de los organismos marinos, considerando que el agua de mar contiene cerca de
3% (w/v) de NaCl; halfilos moderados cuyo crecimiento ptimo se encuentra en un rango de
3% y 15% (w/v) de sal; as como halfilos extremos, que presentan un crecimiento ptimo al
25% (w/v) de NaCl. (Margesin y Schinner, 2001).
Muchos de estos microorganismos han sido aislados de hbitats que presentan alta salinidad
ubicados en diferentes puntos geogrficos del planeta (Ventosa et al. 1998). En la Tabla 1 se
mencionan algunos de los puntos geogrficos caractersticos de los diferentes ambientes salinos,
Las bacterias halfilas al pertenecer al grupo de microorganismos extremfilos capaces de vivir
en ambientes salinos ofrecen una multitud de aplicaciones en varios campos de la biotecnologa como solutos compatibles, biodegradacin de residuos, polmeros, etc.
Lagos
salinos
Salinas de
Espaa y
Salar de
Atacama,
Chile
(15 a 30%)
Lago Assal,
en Djibouti,
Somalia
frica
(27.7%)
Suelos
salados
Mar Rojo
(25 a
30%)
Alimentos
salados
Antrtida, 300
lagos
hipersalinos
Lago
Magadi,
Kenia y
Lago Wadi
Natrun,
Egipto
Pescado seco
y salsa de
soya
(28%)
(pH = 9)
(6.5 a 10%)
Hbitats
poco
comunes
Plantas del
desierto:
Atriplex
halinus,
Desierto
Neguev,
Israel
(0.5 a 20%)
Vestfold Hills,
lago salino fro
Alicante
(22%)
Espaa
Mar muerto
(2.4 a
12.7%)
(28%)
Hbitats
salinos
y
alcalinos
(10%)
Lago salado
de UTAH
E.E. U.U.
Hbitats
salinos y fros
Antrtica
(0.5 a 20%)
Lago
Venere, Isla
Pantelleria,
Italia
Valles Dry, suelo
(pH = 9.7)
salino
(9 a 17%)
(0 a 5 C)
Bacalao
(19%)
Animales del
desierto:
Fosas
nasales de
iguanas
(12%, 45C)
(12%, 40C)
Tabla 1. Ecologa de los microorganismos halfilos, diferentes hbitats salinos

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Muchos de los ambientes salinos son tambin extremadamente alcalinos ya que el carbonato
sdico, as como otras sales, pueden liberar iones que producen la alcalinidad.
ACTINOMICETOS HALFILOS
El nmero de actinomicetos halfilos que se conocen actualmente es muy reducido, en los
ltimos aos se han reportado muy pocos gneros; de modo que el estudio de la biologa de
actinomicetos halfilos incluyendo su aislamiento identificacin y caracterizacin empieza a
mostrar la diversidad de estos microorganismos en varias partes del mundo.
En 1975 se dio a conocer por vez primera el reporte de un actinomiceto capaz de crecer en
altas concentraciones de salinidad, Actinopolyspora halophila, (Gochnauer, 1975). Diecisis aos
ms tarde, en 1991, se reporta el segundo actinomiceto halfilo, A. mortivallis (Yosida, 1991).
Existen en la actualidad 15 miembros conformando este grupo. A continuacin se presenta
de manera breve las principales caractersticas de los actinomicetos halfilos reconocidos a la
fecha. Tabla 2.
MICROORGANISMO
Actinopolyspora. halophila
A. mortivallis
A. iraquiensis
Nocardiopsis lucentensis
Nocardiopsis halophila
PROCEDENCIA
Contaminante en medio con 25% de
NaCl. Canad
Suelo salado. Valle de la muerte,
California, E. U. A
Suelo salino. Iraq
Suelo salado.
Alicante, Espaa.
Suelo salino. Iraq
CRECIMIENTO PTIMO
% NaCl
10
5 - 25
10 15
10
20
Nocardiopsis kunsanensis
Salinas de Kunsan. Korea
10
Nocardioides aquaticus
Lago salado Ekho. Antrtida
1-6
Friedmanniella lacustris
Lago salado Ekho..Antrtida
Streptimonospora salina
Lago salado.Oeste de China
15
Saccharomonospora halophila
Suelo pantanoso. Kuwait
10
Nocardiopsis xinjiangensis
Suelo salino. Xinjiang, China
10
Streptomonospora alba
10 - 15
Prauserella halphila
10
Prauserella alba
10
10
Saccharomonospora
paurometabolica
Tabla 2. Actinomicetos halfilos aislados en diferentes partes del mundo

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ACTINOMICETOS HALFILOS EN MXICO

Mxico es un pas notable por su diversidad climtica por lo que se ha conseguido desarrollar
varios ecosistemas que contienen una gran riqueza de especies (Jaramillo et al., 1996). Esta
diversidad biolgica no solo abarca los organismos antes mencionados, sino tambin una gran
cantidad de especies microbianas habitantes de estos ecosistemas, aun en ambientes de extrema salinidad.
La distribucin de ambientes salinos en Mxico es muy amplia. Prcticamente en todos los
estados se encuentran lagos, manantiales o pozos con elevado contenido de sales.
Es en estos ambientes (de agua y suelo) donde predominan los microorganismos halfilos y
halotolerantes, siendo varios de estos ambientes seleccionados como fuente de obtencin de
muestras para el aislamiento de actinomicetos halfilos (Alcocer, J. y Williams W. D., 1993).
Dentro de estos ambientes salinos se encuentran los suelos. Un suelo salino es aquel que tiene
una cantidad de sales solubles elevada que alterar desfavorablemente su productividad.; un
ejemplo de ello es el suelo salino del ex Lago de Texcoco, considerado un ecosistema casi nico
en el mundo dadas sus caractersticas fisicoqumicas y la alta salinidad-sodicidad que se presenta en esta gran extensin. La acumulacin del carbonato de calcio en este ambiente es un rasgo
caracterstico de las regiones ridas y semiridas como resultado de la escasa precipitacin.
Este ecosistema representa una fuente poco estudiada respecto a diversidad microbiolgica,
principalmente en lo que a microorganismos extremfilos se refiere (Cruickshank, 1995).
Los estudios realizados en Mxico, en los ltimos aos han demostrado por tcnicas taxonmicas y moleculares la presencia de los gneros Saccharomonospora y Actinopolyspora en salinas
costeras del pas. Adems en estudios anteriores en el suelo del ex Lago de Texcoco han identificado la presencia de 5 gneros predominantes: Salinicoccus, Halomonas, Planococcus, Staphylococcus
y Nocardiopsis.
Actualmente el grupo de actinomicetos halfilos que se conoce es muy reducido; sin embargo
el estudio de sus caractersticas fisiolgicas y su distribucin en el mundo los ubica como un
grupo importante dentro de los microorganismos extremfilos debido al potencial que ofrecen
a nivel ecolgico, biotecnolgico y mdico entre otros.
CARACTERIZACIN DE ACTINOMICETOS HALFILOS AISLADOS DE SUELOS SALINOS
El estudio de la microflora halfila de suelos salinos comprende el aislamiento de microorganismos a partir de estos ambientes, su identificacin, diversidad y predominancia.
El objetivo de esta bsqueda es hallar otros gneros de actinomicetos halfilos (adems de los
ya reportados), en ambientes salinos de Mxico.
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CARACTERIZACIN FENOTPICA DE ACTINOMICETOS HALFILOS

Para la caracterizacin fenotpica se puede echar mano de varias pruebas (Koneman, 1983;
Stainer et al., 1966):
Pruebas fisiolgicas: Temperatura, NaCl y pH ptimos para el crecimiento, etc.
Pruebas bioqumicas: Catalasa, produccin de cidos, etc.
Pruebas nutricionales: Utilizacin de distintos sustratos (azucares, cidos orgnicos, aminocidos y alcoholes) como nica fuentes de carbono y energa.
Pruebas enzimticas: utilizacin de API ZYM que permite estudiar rpida y simultneamente 19 actividades enzimticas.
Anlisis numrico: Se realiza la seleccin de algunas pruebas que presenten variacin en los
resultados de anlisis y se hace uso de coeficientes de asociacin simple (SSM) (Sokal y Michener, 1984), as como el coeficiente de Jaccard (SJ) (Jaccard, 1908) para la construccin de
dendrogramas () mediante la tcnica UPGMA Unweitghted Pair Group Mean Average
(Sneath y Sokal, 1973). Para el anlisis numrico se puede utilizar el programa NTSYS-pc
(Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System) de (Rohlf, 1993).
Figura 1. Ejemplo de dendrograma

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CARACTERIZACIN FENOTPICA DE ACTINOMICETOS HALFILOS:

BIOLOGA MOLECULAR Y LA IDENTIFICACIN DE ESPECIES DE ACTINOMICETOS
La biologa molecular contempla tcnicas para la identificacin de especies basadas en la variacin gentica. Las herramientas moleculares ofrecen conceptos y metodologas que pueden
usarse en combinacin con informacin demogrfica, geogrfica y ecolgica para la conservacin y manejo de la biodiversidad (Honeycut, 2000).
La biologa molecular destaca tambin su aplicacin para identificar poblaciones con el uso
de tcnicas basadas en el anlisis de ADN mediante el uso de marcadores moleculares, herramientas bsicas en la identificacin taxonmica, la estructura gentica poblacional, evolucin
y conservacin de los organismos (Welsh y McClelland, 1990).
EXTRACCIN DE MATERIAL GENTICO (ADN)
Una vez seleccionadas algunas cepas como miembros representantes de cada grupo formado
en las pruebas anteriores se procede a la extraccin del material gentico (ADN) y sea cual sea
el mtodo resulta bastante simple.
La obtencin y purificacin del material gentico se confirma con la visualizacin del mismo
en geles de agarosa al 1%.
AMPLIFICACIN POR (PCR) Y SECUENCIACIN DEL 23S rRNA
En trminos simples, la tcnica necesita una mezcla de reaccin que contiene, entre otros componentes, una polimerasa termoestable y oligonucletidos sintticos, como ,23 INSf, 5- (AC)
A (AGT) GCG TAG (AGCT) CG A (AT) G G-3; 23 insR 5 GTG (AT) CG GTT T (AGCT)
(GCT) GGT A-3; que flanquean una regin del ADN, se puede amplificar dicha regin en
forma especfica hasta 100 millones de veces (Mullis et al., 1986).
La amplificacin por PCR del 23s rRNA se realizar utilizando oligonucletidos de inicio
de tipo universal.
La visualizacin de los fragmentos amplificados se realiza por electroforesis en geles de agarosa
al 3%. La localizacin relativa de los fragmentos se determina mediante la tincin con bromuro de etidio, una sonda fluorescente tras iluminacin con luz UV, que se intercala entre la doble
hlice de ADN y emite luz (Sambrook et al. 1989). El amplicn obtenido es de +/- 350pb
como se puede observar en la figura 2.
Los fragmentos amplificados son sometidos a secuenciacin automatizada (fig. 3 y 4) para
posterior identificacin de especies.
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Figura 2. Visualizacin en gel

de agarosa del amplicn de 23S rRNA de actinomicetos halfilos
Figura 3. Secuenciacin automatizada

Fig. 3. secuenciacin automatizada
Figura 4. Uso de bioinformtica para la identificacin de especie
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IDENTIFICACIN DE ESPECIES
Finalmente se complementa la informacin obtenida con el anlisis de las secuencias del 23S
rRNA para determinar la presencia de especies y subespecies correspondientes al suelo salino
estudiado.
Se realiza una comparacin de las secuencias obtenidas correspondientes a los fragmentos
amplificados con las secuencias depositadas en el Gen-Bank utilizando el programa BLAST
(Altschul et al., 1997). (Fig. 5 y 6)
Fig. 5. Uso de BLAST para comparacin de secuencias de DNA
En la etapa final del proceso de identificar una especie la bioinformtica es la herramienta

bsica que mediante programas especficos como: clustalx, phylo_win, njplot, etc., es posible encontrar la semejanza ms cercana con otras especies por lo tanto su identificacin (Galtier et al., 1996).
La construccin de los correspondientes grficos de conexin en forma de rbol con lo que se
espera conocer la relacin filogentica entre las especies estudiadas; se lleva a cabo utilizando
el mtodo Neighbor-Joining y Kimura 2 (Saitou e Imanishi, 1987) con el programa computacional Phylo_Win (Galtier et al., 1996), determinando as la presencia de especies presentes en
suelo salino estudiado.
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Fig. 6. Uso de BLAST para comparacin de secuencias de DNA
El resultado de la secuenciacin del ADN o fragmentos especficos tiene mltiples aplicaciones

para la identificacin y conservacin de especies. Algunas de las aplicaciones son: el estudio
de genes, secuenciacin de genomas, estudio de la variacin gentica, estudios filogenticos de
especies y bsqueda de nuevos marcadores genticos en diversas especies animales.
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Muerte celular
La muerte celular es el proceso mediante el cual una clula pierde de manera irreversible
la capacidad para mantener la composicin especfica de su medio intracelular. Durante el
proceso de muerte, se pueden reconocer dos momentos diferentes: 1) cuando todava pueden
detectarse y medirse algunas funciones, y 2) despus de haber cesado por completo toda
actividad fisiolgica, a lo cual se le ha llamado punto de no retorno (Prez-Tamayo 1987).
Una clula puede alcanzar la muerte por varias vas, y aunque el final es el mismo (la desaparicin
de la clula), el nombre que se le da al tipo de muerte depende de varias caractersticas, entre
las que destacan: el estmulo que la indujo, la sealizacin o ruta intracelular que sigue la seal,
el organelo blanco que recibir el estmulo o seal de muerte, las molculas que intervienen en
la prdida de la homeostasis celular, etc.
La muerte celular debe ser considerada como un proceso necesario en el mantenimiento del
equilibrio homeosttico de los individuos. La prdida de la capacidad de muerte de las clulas
que conforman un tejido, puede llevar a la formacin de tumores, mientras que la muerte
precipitada o acelerada de algunos grupos celulares es caracterstica de muchas enfermedades
autoinmunes o en casos como VIH. Un tejido se mantiene sano en la medida que guarde un
fino equilibrio entre la proliferacin y la muerte de las clulas que lo conforman.
La muerte celular es un evento de gran importancia, en la diferenciacin, el crecimiento y la
morfognesis que ocurren en el desarrollo normal de vertebrados e invertebrados individuos
(Ellis et al 1991).
Por ser la apoptosis y la necrosis las vas de muerte que ocurren con mayor frecuencia en
los organismos vertebrados, en el desarrollo de este trabajo se describirn las caractersticas
celulares y moleculares de estos dos tipos de muerte.
1. Muerte celular por apoptosis
La apoptosis o suicidio celular es un proceso activo, altamente regulado por un programa
gentico contenido en cada clula. El trmino apoptosis es de origen griego y significa la cada
de los ptalos de las flores, en 1972, Kerr y col, le asignaron este nombre a un tipo de muerte
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celular caracterizado por el encogimiento de la clula y la marginacin de la cromatina hacia

la membrana nuclear, provocando figuras curvas con forma de media luna o de ptalos.
En la actualidad se han utilizado como sinnimos los trminos de apoptosis y muerte celular
programada (MCP), sin embargo, esto no es adecuado porque aunque en ambos casos las
clulas contienen un programa gentico para la muerte, en la MCP la clula debe reconocer
cuando exactamente debe iniciar el proceso de muerte (generalmente el tiempo es el detonador
de la muerte), mientras que en la apoptosis, la muerte es inducida por factores intrnsecos o
extrnsecos.
La muerte por apoptosis puede ser disparada por una gran variedad de seales, tales como
la interaccin ligandos-receptores, problemas en el metabolismo energtico y en el potencial
redox, generacin de ceramidas, movilizacin de Ca++ y activacin o inactivacin de protenas
de la familia de Bcl-2 (Revisado por Chen et al., 2003). La apoptosis ocurre cuando en el
ambiente celular, se pierde el fino equilibrio entre factores pro y anti-apoptticos y predominan
los proapoptticos (Lu et al., 2005).
1.1 Caractersticas morfolgicas de las clulas apoptticas
Las clulas se liberan de la matriz extracelular y adoptan una forma redonda, el citoplasma
y la cromatina nuclear se condensan, y forman grumos densos que se desplazan hacia la
superficie de la membrana nuclear, el DNA se rompe en los espacios internucleosomales y
produce fragmentos de 180-200 pb o sus mltiplos. La membrana nuclear permanece intacta,
aunque se produce una redistribucin de los poros nucleares asociados con alteraciones en las
protenas nucleares que son degradadas como son: la topoisomerasa y las protenas de la lmina
o nucleares reguladoras de la mitosis. El ncleo se fragmenta (cariorrexis) y forma mltiples
fragmentos de diferentes tamaos que parecen gotas que tienen DNA y se dispersan por todo
el citoplasma. Si bien en la muerte por apoptosis aparentemente no hay lesiones graves de la
membrana citoplasmtica lo cierto es que se deforma y sufre numerosos abombamientos, as
como prdida de la asimetra fosfolipdica, aparicin de sitios de unin a trombospondina y
prdida de residuos de cido silico. En los estados finales, la membrana plasmtica se fusiona
para empaquetar y envolver los constituyentes del citoplasma as como los fragmentos nucleares
para forma los denominados cuerpos apoptticos. Los cuerpos apoptticos son eliminados al
entorno extracelular, donde son endocitados por clulas fagocticas o por las clulas vecinas, lo
que evita la lesin y la consiguiente respuesta inflamatoria. En estudios in vitro donde se inhibe
la endocitosis de las clulas vecinas y por consiguiente no se eliminan los cuerpos apoptticos,
se ha podido ver que la clula culminar la muerte con caractersticas de necrosis, a lo cual se
conoce como necrosis secundaria (Crompton, 1999; Bouchier-Hayes et al, 2005).
La apoptosis es difcil de detectar in vivo debido a que los cambios morfolgicos ocurren
rpidamente (entre 2 y 4 h) y los cuerpos apoptticos son rpidamente fagocitados y removidos
del tejido para evitar una respuesta inflamatoria (Qin et al., 2005)
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1.2 Vas de sealizacin

En las clulas de los mamferos, la cascada de sealizacin que culminan con la muerte por
apoptosis, puede ser dividida en dos grandes vas: la intrnseca o mediada por la mitocondria
y la extrnseca o mediada por seales extracelulares que disparan los mecanismos de muerte
(Putcha et al., 2002; Zacks et al., 2004). Aunque los mecanismos que disparan una u otra va
son diferentes, el objetivo en ambos casos es la activacin de pro-caspasas y la desestabilizacin
de la funcin mitocondrial. La cascada de las caspasas (por sus siglas en ingls: Cytosolic
Aspartate-Specific ProteASAS), es el centro de la progresin de la apoptosis. Estas enzimas, son
una subclase de proteasas que rompen a su sustrato en un residuo de cido asprtico. stas son
sintetizadas como enzimas inactivas (pro-caspasa) y slo tendrn actividad cuando una clula
recibe el estmulo para la apoptosis. En mamferos, al menos 13 caspasas han sido identificadas
y se han clasificado en iniciadoras y efectoras (Ho y Hawkins, 2005). Las caspasas iniciadoras
(caspasas 8, 9 y 10), son activadas por autoprotelisis en respuesta a seales de muerte, las
caspasas efectoras (caspasas 3, 6 y 7), son activadas por las caspasas iniciadoras e inician la
digestin proteoltica de la clula para finalizar con la muerte de la misma. Dentro de las
protenas que son sustrato de las caspasas, se encuentran, protenas inhibidoras de caspasas de
DNA activas, ADN polimerasa, Bcl-2, lamininas y varias protenas de unin al citoesqueleto
(Affar et al., 2001). El rompimiento de estas protenas ocasiona: fragmentacin del DNA,
inhibicin de la sntesis y reparacin del DNA, dao de la membrana nuclear, condensacin
de la cromatina y colapso del citoesqueleto (para revisar Crow et al., 2004; Lu et al., 2005).
A continuacin se presentan en forma sinttica los dos mecanismos de sealizacin de la
apoptosis (revisar Chen et al., 2003; Crow et al., 2004; Ho y Hawkins, 2005; Lu et al., 2005 y
Yan y Shi, 2005) y se pueden ver en forma esquemtica en la figura 1.
1.2.1 Intrnseca
Esta va de sealizacin, implica un amplio espectro de estmulos estresantes extra e intracelular que se traducen en un estmulo de muerte. Los estmulos extracelulares incluyen,
deficiencia en factores trficos y de supervivencia, deficiencia en nutrientes, radiacin, drogas
y estrs fsico, mientras que el estmulo intracelular, incluye estrs oxidativo, dao del DNA y
protenas malformadas (Crow et al., 2004). Estos estmulos de muerte, ocasionan la activacin
de protenas de la familia de Bcl-2 de un solo dominio BH3, lo que causa la liberacin de
factores pro-apoptticos desde el espacio intermembranal de la mitocondria hasta el citoplasma
(Wang, 2002 citado por Yan y Shi, 2005). Entre ellos se encuentran al citocromo c y la protena
Smac/Diablo, la salida de estas protenas es mediada por Bax y Bak (miembros tambin de la
familia de Bcl-2) que forman un poro para permitir la salida de estas molculas (Putcha et al.,
2002), lo cual es antagonizado por las protenas anti-apoptticas Bcl-2 y Bcl-xL (Crow et al.,
2004; Yan y Shi, 2005). La liberacin de citocromo c activa directamente Apaf-1 y en presencia
de dATP o ATP, induce la formacin de un complejo multimrico denominado apoptososma.
El apoptosoma media la activacin de la caspasa iniciadora 9 que subsecuentemente activa a
las caspasas efectoras 3 y 7, las cuales se encargan de desmantelar a las clulas en apoptosis. La
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Fig. 4. La apoptosis puede seguir dos vas: la extrnseca, a travs de la interaccin de receptores de
muerte como Fas con su ligando (Fas-FasL), y la va intrnseca, en la cual la seal de muerte (ausencia de
factores trficos, quimioterapia, radiaciones, etc), provoca un dao directo a la mitocondria.
liberacin de Smac/Diablo por su parte, activa directamente caspasas efectoras, removiendo a

las protenas inhibidoras de la apoptosis (IAPs) (Putcha et al., 2002; Lu et al., 2005; Yan y Shi,
2005). Estas IAPs se unen a las caspasas efectoras para mantenerlas inactivas dentro del citosol,
hasta que un estmulo de muerte ocasiona la liberacin de Smac/Diablo para dejar activas a
las caspasas y culminar con la apoptosis (Yan y Shi, 2005).
1.2.2 Extrnseca
La interaccin de algunos ligandos a receptores solubles o de membrana inicia la va extrnseca
de la apoptosis. Entre los ligandos mejor caracterizados y sus correspondientes receptores, se
encuentran, FasL/Fas, factor de necrosis tumoral y su receptor-1 (TNF-/TNFR-1), AproL/
receptor de muerte 3 (DR3) y Apro2L/receptor de muerte 4 y 5 (DR4 y DR5) (Lu et al., 2005).
El sistema FasL/Fas, es el ms estudiado. La interaccin de FasL con su receptor, ocasiona
el ensamble de un complejo de sealizacin inductor de muerte (DISC) en la membrana
plasmtica (Peter & Krammer 2003 citado por Yan y Shi, 2005). En las vas de sealizacin
mediada por FasL adems del DISC es necesaria una protena adaptadora denominada
dominio de muerte asociado a Fas (FADD), el cual lleva a las caspasas iniciadoras 8 y 10 hacia
DISC para activarlas. La caspasa 8 una vez activada, rompe y activa a las procaspasas 3 y 7.
Es en este punto (activacin de caspasas 3 y 7), donde las dos vas de sealizacin convergen
(Yan y Shi, 2005). Un blanco importante de la caspasa 8 es Bid (un miembro pro-apopttico
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de un solo dominios de Bcl-2). Caspasa 8 rompe el fragmento C-terminal de Bid (formando

un Bid trucado (tBid), el cual se transloca en la membrana mitocondrial externa, para inducir
la liberacin factores pro-apoptticos (Li et al 1998). Este proceso constituye otro punto de
convergencia entre los dos mecanismos de sealizacin de muerte celular por apoptosis (Yan
y Shi, 2005).
1.3 La mitocondria, blanco en la apoptosis
La liberacin de protenas proapoptticas desde el espacio intermembranal de la
mitocondria es considerado un paso decisivo en la muerte por apoptosis que tambin
ha sido llamado de no retorno, porque una vez liberadas dichas protenas, la muerte es
inevitable. A diferencia de la apoptosis, en la necrosis, la intensidad del estmulo ocasiona
la catstrofe energtica de la clula.
Mitchell (1961) sugiri que en la membrana mitocondrial interna los electrones son transferidos
a travs de los complejos de la cadena de fosforilacin oxidativa hasta el O2 en una serie de
reacciones acopladas de xido-reduccin que producen una translocacin de protones hacia el
espacio intermembranal mitocondrial para generan un diferencial de potencial electroqumico
necesario para la sntesis de ATP. Este potencial electroqumico que recibe el nombre de delta
Psi (Dy) est constituido por la distribucin asimtrica de los protones que generan un gradiente
de concentracin y elctrico (Chen and Smiley, 1993).
Diversas seales de muerte celular convergen sobre las membranas de la mitocondria para
inducir cambios en la permeabilidad de la membrana mitocondrial (MMP) (Ferri and
Kroemer 2001). La MMP se ha considerado como un mecanismo fundamental en el proceso
de muerte por apoptosis y necrosis (Crompton, 1999). La MMP favorece la cada del Dy, la
liberacin de protenas desde el espacio intermembranal mitocondrial como las procaspasas 2,
3, 8 y 9 (Van Loo et al 2002), as como de Smac/Diablo, Omi/HtrA2, adems la MMP puede
desencadenar un descenso en los niveles de ATP acompaado del aumento en la produccin
de especies xido reactivas (Verhagen et al, 2002; Bratton et al, 2001).
La MMP implica la apertura de un megacanal mitocondrial que se conoce como poro de
permeabilidad mitocondrial de alta conductancia (PT), el cual es un complejo de protenas que
ponen en contacto la membrana externa con la membrana interna (Zanzami and Kroemer,
2001). Los principales componentes de PT son: una protena de la membrana mitocondrial
interna, la adenina nucletido traslocador (ANT), una protena de la membrana externa, porina
o canal aninico dependiente de voltaje (VDAC), protenas del citosol como la hexocinasa,
protenas del espacio intermembranal mitocondrial como la creatincinasa y la ciclofilin D que
es una protena de la matriz mitocondrial.
El PT puede estar cerrado o abierto, diversos miembros de la familia de Bcl-2, que se describen
en la tabla 3, pueden modular a PT. En condiciones fisiolgicas el PT est cerrado, VDAC
regula el movimiento de sustancias a travs de la membrana mitocondrial externa mientras
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que el ANT intercambia ADP del espacio intermembranal por ATP de la matriz mitocondrial.
Al inicio del proceso de muerte se abre el PT y dependiendo de la intensidad del estmulo, la
conductancia de PT puede estar regulada para estmulos moderados o puede estar desregulado
ante estmulos intensos (He and Lemasters, 2002).
2. Muerte celular por necrosis
El trmino Necrosis, proviene del griego nkrosis que significa mortificacin, tambin se ha
llamado muerte celular accidental y puede pensarse como un asesinato de la clula. La necrosis
se observa cuando las clulas mueren por un traumatismo grave y sbito.
2.1 Caractersticas de la necrosis
La clula necrtica presenta un ncleo condensado que es altamente basfilo (se tie con
hematoxilina). El sitio de mayor dao est localizado en la membrana plasmtica, se observa
principalmente la ruptura y los cambios en la permeabilidad que esto ocasiona, finalmente
edematizan a la clula, por ello, se ha propuesto el trmino de oncosis hinchazn para
designar este tipo de muerte celular. La clula necrtica libera su contenido citoplsmico hacia
el tejido subyacente, donde su presencia desencadena una reaccin inflamatoria. La muerte es
pasiva y desencadenada por una perturbacin en el medio ambiente ms que por un programa
gentico de la clula (Kitanaka and Kuchino, 1999).
En la clula en proceso de necrosis, se observa una disminucin en la concentracin de
ATP citoplasmtico ocasionada principalmente por alteraciones en la apertura del poro de
permeabilidad mitocondrial (He and Lemasters, 2002) y por la actividad de la poli-(ADPribosa) polimerasa (PARP), una enzima que consume ATP al reparar el dao al DNA (Gobell
et al, 2001). La disminucin de ATP tiene como principales consecuencias:
1) Una prdida de la permeabilidad selectiva de la membrana plasmtica: Principalmente
una entrada de Na+ y una prdida de K+ por la disminucin de la actividad de la ATPasa
de NA-K, como consecuencia hay una entrada masiva de H2O al citoplasma que causa la
hinchazn de la clula. Hay alteracin del potencial de membrana que favorece la entrada
de calcio libre hacia el interior de la clula como consecuencia de la apertura de canales de
calcio dependientes de voltaje, as como la apertura de un canal de calcio heterodimrico
formado por el receptor acetilcolina nicotnico 7 (RACN-7) y DES-2, aunado a la inhibicin
del rectificador de la concentracin de calcio de la membrana plasmtica dependiente de ATP
(PMCA) (Ono et al, 2003). El incremento de calcio citoslico libre activa a las fosfolipasas
unidas a la membrana, que degradan sus fosfolpidos y le causan perturbaciones, as mismo se
observa una activacin de calpaina que causa dao a la membrana lisosomal, liberacin de sus
enzimas y como consecuencia una rpida desintegracin de la clula (Yamashima, 2000). Las
desoxirribonucleasas lisosomales digieren el DNA en fragmentos de diferente tamao.
2) La prdida de la asimetra de la membrana citoplasmtica, se manifiesta por la exposicin de
fosfatidilserina en la cara externa y la fosfatidiletanolamina en la cara interna de la membrana.
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En las clulas normales los fosfolpidos se distribuyen asimtricamente en la membrana

plasmtica, la fosfatidiletanolamina se encuentra principalmente en la cara externa, mientras
que la fosfatidilserina se localiza casi completamente en la cara interna de la membrana
plasmtica. El mecanismo por el cual se expone la fosfatidilserina involucra la inhibicin de
la flipasa traslocasa aminofosfolpido dependiente de ATP y por la activacin de Bid por un
mecanismo an desconocido (Vermes et al, 1995).
2.2 Los lisosomas, blanco en la Necrosis
Los lisosomas son organelos citoplasmticos delimitados por membrana. En su interior tiene
un pH 4-5 y contienen alrededor de 60 diferente hidrolasas identificadas hasta el momento, con
actividad catalticas como las fosfatasas, nucleasa, glicosidasas, proteasas, peptidasas, sulfatasas
y lipasas, que son capaces de digerir todas las macromolculas de la clula (Cuervo and Dice,
2000; de Duve, 1983). Las catepsinas estn dentro de las hidrolasas lisosomales que ms se han
estudiado. Se han dividido en tres subgrupos de acuerdo a la presencia de un aminocido en su
sitio activo, las catepsinas cistena (B, C, H, F, K, L, O, S, V, W y X/Z), las catepsinas aspartato
(D y E) y las catepsinas serina (G) (Rawlings et al, 2004). Todas ellas tienen una buena actividad
a pH de 4-5; pero otras tienen actividad a pH neutros como el contenido en el citoplasma,
aunque puede existir un descenso en su estabilidad o puede estar acompaado de alteraciones
en su especificidad o de ambos.
En el proceso de muerte celular por necrosis hay una ruptura de la membrana lisosomal, lo cual
libera todo el contenido lisosomal hacia el citosol, principalmente las catepsinas y otras enzimas
hidrolticas que son las principales ejecutoras de la muerte (Syntichaki and Tavernarakis, 2002;
Fukuda et al, 1993).
Permeabilizacin de la membrana lisosomal (LMP). Por estudios donde se daa la membrana
lisosomal artificialmente con detergentes (como la esfingosina o Leu-Leu-Ome), estrs oxidativo
(usando perxido de hidrogeno o con dao fotooxidativo) y con antibiticos que se unen a la
membrana lisosomal, se ha podido conocer que la LMP puede desencadenar tanto la apoptosis
como la necrosis (Kroemer and Jttela, 2005). Segn los autores existe una relacin entre la
extensin de la ruptura de la membrana lisosomal y el modo de muerte celular. De acuerdo a
este modelo, una limitada liberacin del contenido lisosomal puede desencadenar la muerte
por apoptosis, mientras que una ruptura generalizada de la membrana lisosomal desencadena
la necrosis celular (Kgedal et al, 2001).
3. Muerte celular con caractersticas de apoptosis y necrosis
Se ha establecido la hiptesis en la que se considera a las caspasas determinantes crticos de
las caractersticas morfolgicas de la muerte celular por apoptosis, sin embargo la inhibicin
artificial de estas enzimas, en clulas inducidas a la muerte por apoptosis, no les impidi la
muerte, aunque s la va, ya que mostraron caractersticas de muerte por necrosis (Kitanaka
and Kuchino, 1999).
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Muerte celular
El proceso de muerte celular no siempre se acompaa de caractersticas clsicas de apoptosis

o de necrosis, sino que en muchos casos, las clulas presentan caractersticas morfolgicas
o bioqumicas de ambos tipos de muerte (Darzynkiewicz et al, 1997). En algunos casos, la
integridad de la membrana plasmtica se preserva, pero se observa una degradacin del DNA
caracterstico de necrosis. En otras situaciones, la degradacin del DNA puede presentar un
patrn tpico de apoptosis (escalera), pero la clula muestra otras caractersticas de necrosis.
Estas observaciones hacen suponer que la clula posee ambos programas de muerte celular,
pero que en algunas situaciones pueden activarse separadamente y dar como resultado
caractersticas tpicas de los procesos de muerte, sin embargo tambin puede activarse los dos
programas parcialmente y con esto se apreciaran caractersticas de ambos tipos de muerte
(Darzynkiewicz et al, 1997).
Conclusiones
Paradjicamente, la muerte celular es un proceso indispensable en la homeostasis de los
seres vivos. Las clulas pueden morir por diferente va, dependiendo de la intensidad y el
tipo de estmulo que reciban. Cuando el estmulo ocasiona en la clula un proceso activo
y organizado, en el cual se presenta una cascada de protenas derivadas de un programa
gentico, entonces la muerte ser por apoptosis. Sin embargo si el programa gentico es
desencadenado por el factor tiempo como ocurre en el desarrollo embrionario, ocurrir
una muerte celular programada. Mientras tanto, la necrosis se presenta cuando las clulas
reciben un estmulo muy intenso, se altera la permeabilidad de sus membranas por un
desequilibrio hdrico, se edematizan, sufren catstrofe metablica (no hay sntesis de ATP)
por alteracin de la permeabilidad de la membrana mitocondrial, salida de las enzimas
lisosomales y finalmente la lisis o el entallamiento celular.
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La participacin de la asimetra fosfolipdica

de la membrana plasmtica en diferentes
tipos celulares, tomando como modelo al
espermatozoide
Durante la interaccin del espermatozoide con el ovocito, ocurre una secuencia de eventos
altamente regulada. En primera instancia los espermatozoides eyaculados son activados en
el tracto reproductor femenino, en un proceso denominado capacitacin, durante el cual
experimentan una reorganizacin dramtica de su membrana plasmtica (Frits et al., 2000) y
slo aquellos que son exitosamente capacitados podrn unirse a la zona pelcida del ovocito
de manera especie especfica. La unin del espermatozoide con la zona pelcida produce
en el espermatozoide una serie de sealizaciones que desencadenan la entrada de Ca2+ y la
fusin de la membrana plasmtica con la membrana acrosomal externa en mltiples sitios,
proceso que se conoce como reaccin acrosomal. El contenido acrosomal, compuesto por
enzimas hidrolticas, produce la digestin de la zona pelcida del ovocito, lo cual ayuda al
espermatozoide a penetrar a travs de esta capa glicoproteica que rodea al gameto femenino.
Durante la reaccin acrosomal la membrana plasmtica apical y la membrana acrosomal
externa se fusionan para formar vesculas que se separan del espermatozoide. Al terminar
la reaccin acrosomal, la membrana acrosomal interna queda expuesta y los residuos de la
membrana plasmtica de la regin anterior del espermatozoide pueden observarse como
estructuras que parecen horquillas en los costados del espermatozoide. La progresin del
espermatozoide a travs de la zona pelcida, aparentemente facilitada por la existencia de
sitios especficos de fijacin entre la membrana acrosomal interna expuesta y las protenas
constituyentes de la zona pelcida, conducindolo hasta el espacio perivitelino del ovocito
(Frits et al., 2000). Aqu el espermatozoide se coloca de manera que su regin ecuatorial
(horquillas), queda en contacto y se fusiona con la membrana plasmtica del ovocito (oolema)
(Frits et al., 2000) produciendo la penetracin de la cabeza del espermatozoide al interior del
citoplasma del gameto femenino.
La composicin y organizacin de la membrana plasmtica del espermatozoide regulan de
manera especfica los eventos que conducirn el destino de los espermatozoides, entre estos
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eventos estn: la afinidad para factores de adhesin, la permeabilidad para solutos hidroflicos,
sealizacin celular y eventos de fusin (Dunina-Barkovskaya, l998).
Antecedentes.
Espermatozoide maduro.
La estructura bsica de los espermatozoides maduros ha sido dividida en tres regiones
altamente especializadas: a) La cabeza. Representa la parte ms voluminosa y anterior de la
clula espermtica y est directamente involucrada en todos los mecanismos con la interaccin
entre espermatozoide y el ovocito que darn inicio a la formacin de un nuevo individuo. La
cabeza del espermatozoide contiene poca cantidad de citoplasma y en ella se encuentran el
ncleo y el acrosoma. El acrosoma es una vescula compleja que contiene enzimas hidrolticas,
necesarias para la penetracin de la zona pelcida, (ZP) del ovocito por el espermatozoide
(Yanagimachi, 1994; Frits et al., 2000); b) La pieza media en la cual se ha localizado todas las
mitocondrias, encargadas de la produccin de energa; y c) El flagelo, que le da la movilidad
(Frits et al., 2000).
La clula espermtica madura carece de un grupo importante de organelos (retculo
endoplsmico y complejo de Golgi) (lisosomas y peroxisomas) para la sntesis y degradacin
de componentes celulares (Frits et al., 2000). Tambin es oportuno mencionar que en
el espermatozoide maduro la superficie de la membrana no est en comunicacin con las
estructuras membranosas intercelulares porque el transporte membranal mediado por vesculas
est bloqueado.
Membrana Plasmtica del Espermatozoide Eyaculado.
Muchas de las caractersticas de la membrana plasmtica del espermatozoide, que determinan
su capacidad fisiolgica basal para realizar la fertilizacin del gameto femenino, ocurren
durante el transcurso del espermatozoide a travs del conducto epididimario. Tales cambios
forman parte del proceso que se conoce como Maduracin epididimaria del espermatozoide.
En la mayora de las especies de mamferos el espermatozoide ha adquirido su capacidad de
movilidad progresiva y su capacidad fertilizante al llegar al segmento de unin entre la parte
media y la parte caudal del epiddimo.
Los cambios principales que se producen en la superficie del espermatozoide durante la
maduracin epididimaria son: a) un incremento en la carga neta superficial, ya que en los
espermatozoides obtenidos de cola de epiddimo la carga negativa es mayor que la de los
obtenidos de cabeza, en diferentes especies, b) modificaciones en la cantidad de sacridos
y glicoprotenas en la superficie de los espermatozoides, lo cual probablemente son
la causas de los cambios en la carga neta superficial, c) aumento en la cantidad de cido
silico (Yanagimachi et al., 1994), d) disminucin en el contenido de lpidos, especialmente
del colesterol, lo cual ha sido informado en cerdo, toro, carnero, cobayo, y rata (Aveldao
et al., 1992), la proporcin colesterol/fosfolpidos y las concentraciones de fosfatidilserina,
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Dr. Alejandro valos Rodrguez y col.
fosfatidiletanolamina, cardiolipina, etanolamina, plasmalgeno y de cidos grasos insaturados

disminuyen en espermatozoides de carnero, mientras que en los espermatozoides de humano
ocurren incrementos en la cantidad de esteroides sulfoconjugados.
Nuevos y trascendentes cambios ocurren en la superficie del espermatozoide despus de la
eyaculacin en el tracto genital femenino. Algunos de estos cambios han sido detectados con el
uso de lectinas, las cuales tienen afinidad especfica por algunos glicoconjugados de membrana.
Tambin se ha encontrado que antgenos de grupos sanguneos (Frits et al., 2000), antgenos de
histocompatibilidad y factores de inmunosupresin, se adhieren al espermatozoide al mezclarse
con las secreciones de las glndulas accesorias del aparato reproductor masculino durante la
eyaculacin. Por ejemplo, los espermatozoides de humano adquieren lactoferrina, ferrisplan
(Frits et al., 2000). En el conejo se han encontrado protenas de 20,000 daltons en el eyaculado
que no son demostrables en espermatozoides de epiddimo. En el toro se han encontrado
protenas de 25,000 y 14,000 daltons especficas del plasma seminal unidas a espermatozoides
eyaculados (Vierla et al., 1980).
Distribucin heterognea de los componentes estructurales de la membrana
plasmtica del espermatozoide.
La membrana plasmtica del espermatozoide se caracteriza por estar subdividida en regiones
bien delimitadas a pesar de la reconocida capacidad de la membrana plasmtica para la
migracin lateral de protenas y lpidos. Estas regiones denominadas dominios difieren
notablemente en composicin y funcin (esquema1) (Frits et al., 2000).
La membrana plasmtica de la cabeza del espermatozoide (esquema1) est dividida en un
dominio acrosomal (regin anterior de la cabeza) y en un dominio postacrosomal (regin
posterior a la cabeza). El dominio acrosomal puede ser subdividido en 1.- segmento marginal
(segmento apical, banda anterior y/o aro perifrico), dominio que se encuentra sobre el rea
del acrosoma que sobresale de la regin nuclear, 2.-el segmento principal (segmento acrosomal)
dominio localizado por encima de la mayor porcin del acrosoma y 3.- el dominio ecuatorial
(acrosomal posterior) ubicado en los lmites entre la parte posterior del acrosoma y la llamada
regin posacrosomal. El dominio marginal y del segmento principal, a menudo son referidos
como acrosoma anterior o como capa anterior. Estos dos dominios estn separados por una
media luna central en el caso de espermatozoides de cobayo y posiblemente de otras especies
(Yanagimachi, 1994; Frits et al., 2000).
La membrana plasmtica del espermatozoide est compuesta de colesterol, glicolpidos, altas
cantidades de plasmalgenos, fosfolpidos y otros lpidos de cadena aliftica poliinsaturada. Los
fosfolpidos forman las dos terceras partes del total de los componentes lipdicos de la membrana
plasmtica del espermatozoide. Los esteroles son los segundos lpidos ms abundantes en el
espermatozoide (Frits et al., 2000). Estudios realizados con fractura por congelacin muestran
que, en los espermatozoides de cobayo y de toro, la cantidad de esterol en la parte anterior del
acrosoma es 4 veces mayor que la encontrada en la regin postacrosomal. Aunque el sulfato
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de colesterol es una pequea parte del esterol total, constituye un componente de la mayor
importancia en el dominio acrosomal de la membrana plasmtica del espermatozoide humano
(Yanagimachi, 1994; Frits et al., 2000).
La relacin fosfolpidos / protena de la membrana plasmtica del espermatozoide de cerdo
es de 0.68 en base al peso, sugiriendo que la cantidad de protenas y lpidos en la membrana
es aproximadamente la misma, aunque es posible que la relacin protena / lpidos en varios
dominios de la membrana plasmtica del espermatozoide sea diferente (Yanagimachi, 1994;
Frits et al., 2000).
La composicin y organizacin de los lpidos en la membrana plasmtica del espermatozoide
le confieren propiedades caractersticas (Frits et al., 2000). Aunque hay variacin considerable
entre las diferentes especies de mamferos, la membrana plasmtica contiene en promedio
70% fosfolpidos, 25 % lpidos neutros y 5 % de glicolpidos (en base molar) (Frits et al., 2000).
Los fosfolpidos pueden ser divididos en dos grupos: fosfoglicerolpidos y esfingomielinas. Los
fosfoglicerolpidos varan en estructura molecular porque la cabeza de su grupo polar es diferente,
en la posicin sn-3 del esqueleto del glicerol. Cada clase de fosfolpido contiene diferentes cadenas
Esquema 1
PRINCIPALES COMPONENTES Y DOMINIOS DEL ESPERMATOZOIDE MADURO
Los principales componentes del espermatozoide son la cabeza, pieza media y cola, en la cabeza se
encuentra la membrana plasmtica, la acrosomal externa, la acrosomal interna, el acrosoma, la cubierta
nuclear y el ncleo. La membrana plasmtica del espermatozoide se caracteriza por estar organizada en
dominios y los principales son: la regin apical, la preecuatorial, ecuatorial, postecuatorial, anillo posterior,
pieza media, anillo anular y flagelo (Frits et al., 2000).
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alifticas tales como acil, alquil, alquenil, que pueden estar unidas a la posicin sn-1 o sn-2 del
esqueleto del glicerol (Parks and Hammerstedt, 1985). Las concentraciones de fosfolpidos en
la membrana plasmtica de las clulas espermticas, son generalmente comparables a los de
las membranas plasmticas de las clulas somticas. Por ejemplo el espermatozoide humano
contiene una relacin porcentual de 50 de fosfatidilcolina, 30 de fosfatidiletanolamina,
12.5 de esfingomielina, 3 de fosfatidilserina, 2.5 de cardiolipina y casi 2 de fosfatidilinositol.
Por el contrario, la composicin estructural de especies moleculares de fosfatidilcolina y
fosfatidiletanolamina, as como de otros fosfolpidos, es considerablemente diferente entre los
espermatozoides y las clulas somticas (Frits et al., 2000). La posicin sn-2 del esqueleto del
glicerol de los fosfolpidos espermticos constituye una de las diferencias ms notables en cuanto
a la esterificacin con cidos grasos poli insaturados de cadena larga (casi exclusivamente
cido docosahexaenico 22:6 y cido docosapentaenico, 22:5), adems en la posicin sn-1
contienen predominantemente cadenas alifticas saturadas de 16 tomos de carbono de los
cuales casi el 55 % est unido a un vinileter (plasmenilcolina o plasmeniletanolamina) y 25 %
con un grupo alquilo saturado (fosfatidilcolina o fosfatidiletanolamina) (Brouwers, 1998), solo
el 20 % de la fosfatidilcolina y fosfatidiletanolamina contienen en el sn-1 un enlace de tipo ster
con un cido graso. Durante la capacitacin la cantidad de fosfatidilcolina pueden aumentar
debido a la metilacin de la fosfatidiletanolamina (Frits et al., 2000).
Existen variaciones entre espermatozoides de diferentes especies, en cuanto a la
concentracin de lpidos neutros que componen su membrana plasmtica, incluso hay
diferencias entre espermatozoides del mismo individuo. El principal componente que
vara, es el colesterol. El espermatozoide humano contiene una alta concentracin de
colesterol (40% del total de lpidos en base molar), sin embargo el cerdo contiene mucho
menor cantidad (22% del total de lpidos base molar). Adems de colesterol, el demosterol,
sulfato de colesterol y steres de colesterol tambin estn presentes en la membrana (Mann
y Lutwak-Mann, 1981; Frits et al., 2000).
Asimetra de la membrana plasmtica.
Las molculas lipdicas que presentan la asimetra ms marcada y constante, en cuanto a
su distribucin en la membrana plasmtica de las clulas animales, son los glicolpidos, los
cuales se caracterizan por estar nicamente en la mitad exterior de la bicapa, quedando sus
carbohidratos al descubierto en la superficie de la clula (Frits et al., 2000).
En cuanto a los componentes fosfolipdicos de la membrana plasmtica de los espermatozoides,
se encuentran asimtricamente distribuidos, de manera semejante a como acontece en
la membrana plasmtica de las clulas somticas. Diversos mtodos han revelado que los
fosfolpidos como esfingomielina (SM) y en menor grado fosfatidilcolina (PC), se encuentran
principalmente en la cara externa de la membrana (Gadella et al., 1999 y Muller et al., 1996).
Los aminofosfolpidos como fosfatidiletanolamina (PE) y especialmente la fosfatidilserina (PS)
estn localizados en la capa lipdica interna (esquema 2) (Rana et al, 1993). Si bien es cierto
que en general la fosfatidilserina no se encuentra en grandes proporciones en la membrana
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plasmtica, es importante resaltar que por el hecho de que casi el 100% de este fosfolpido
se encuentre en la cara interna de la membrana, la presencia de ste en la cara externa es
considerada como indicador de la prdida de la asimetra membranal (Kuypers et al., 1996).
La Anexina V es una protena que en presencia de concentraciones adecuadas de Ca2+ tiene
una alta especificidad por la fosfatidilserina, por lo cual ha sido usada como una tcnica de
eleccin para detectar prdida de la asimetra de la membrana (Kuypers et al., 1996). La
citometra de flujo es una tcnica que en la actualidad es utilizada, como una prueba estndar
confiable, para observar los cambios en la asimetra de las clulas espermticas (Gadella et al.,
1999; Nolan et al., 1995).
La formacin y mantenimiento de la asimetra de las membranas biolgicas es importante
para sus funciones y por lo tanto para el mantenimiento de la clula (Herrman et al., 1991).
Los componentes estructurales de las bicapas se encuentran en equilibrio. Dicho equilibrio
es un balance de dos mecanismos. Primero todos los fosfolpidos difunden pasivamente a
travs de la bicapa, a una velocidad relativamente baja. Segundo los amino fosfolpidos son
transportados activamente de la cara externa de la membrana hacia la cara interna por la
accin de una enzima denominada translocasa de aminofosfolpidos dependiente de (ATP) y
Mg2+ la cual mantiene el equilibrio de la membrana. Estudios reportados en eritrocitos han
podido demostrar que los aminofosfolpidos son transportados desde la cara externa hasta la
cara interna de la membrana por la aminofosfolpido translocasa, y que este movimiento es
responsable de la distribucin asimtrica de los fosfolpidos en los eritrocitos, as como en la
membrana de otras clulas eucariontes. Cuando en la lmina externa de la bicapa aparece
la fosfatidilserina, sta es rpidamente devuelta hacia la lmina interior por la translocasa de
amino fosfolpidos (Kuypers et al., 1996). La aminofosfolpido translocasa puede ser bloqueada
por vanadato o por algn sistema que inhiba la produccin de ATP (Backer et al., 1987).
El movimiento de la cara externa hacia la cara interna de la membrana se denomina flip y el
movimiento de los fosfolpidos de la cara interna hacia la externa se denomina flop (Kuypers
et al., 1996).
Bajo la mayora de las condiciones el mecanismo de flip-flop es extraordinariamente lento
y su tiempo medio se mide en intervalos de horas o semanas (Homan et al., 1988). Se ha
encontrado que el movimiento de protenas del exterior al interior de la membrana cataliza
el paso de algunos fosfolpidos de una lmina a la otra por mecanismos de flip-flop, tanto
dependientes de ATP como independientes de l, en un tiempo menor a 5 minutos (Devaux
et al., 1990).
Otras enzimas, semejantes a las translocasas, han sido descritas recientemente como
importantes en la regulacin de la distribucin asimtrica de los fosfolpidos de las membranas.
Estas enzimas, llamadas flipasas regulan una rpida translocacin de fosfolpidos por el
movimiento de flip-flop (Schneider et al., 1986). La actividad de flip-flop de fosfolpidos
puede ser incrementada significativamente por la incorporacin de antibiticos formadores de
canales inicos, como la anfotericina B (Schneider et al., 1986).
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Los iones de calcio juegan un importante papel en algunos procesos fisiolgicos por su habilidad
para regular la estructura y funcin de las membranas celulares y por sus acciones en algunas
vas metablicas, particularmente aquellas involucradas en los procesos de contractibilidad y
metabolismo energtico.
Es conocido que el incremento de la concentracin del Ca2+ citoslico, inducido por el
ionforo A-23187, o por incorporacin de Ca2+ al medio, estimula la produccin de una
distribucin al azar de los lpidos de la membrana (Sulpice et al., 1994; Williamson et al.,
1992). El desorden que se produce en la membrana ocasiona prdida de la asimetra de los
fosfolpidos de la membrana y posteriormente la formacin de vesculas. La relacin entre
vesiculacin y translocacin de fosfolpidos fue demostrado por la observacin de experimentos
que mostraron espontneos brotes y vesiculaciones en liposomas despus de que se les indujo
redistribucin transmembranal de fosfolpidos (Farge y Deveraux, 1992). Desde hace mucho
tiempo se conoce que ciertos ionforos como el A23187 son capaces de unir y transportar
cationes divalentes como el Ca2+ a travs de barreras lipdicas, incluyendo las membranas
celulares, posteriormente se demostr que este ionforo era capaz de incrementar el contenido
de cAMP en clulas de la mdula sea. En virtud de la conocida relacin del metabolismo
del calcio con el cAMP, algunos autores decidieron utilizar a este ionforo como inductor de
la capacitacin espermtica. Actualmente se sabe que el uso de A-23187, induce la reaccin
acrosomal (RA) por un mecanismo regulatorio intracelular que produce un rpido y masivo
influjo de Ca2+ al interior del espermatozoide (Frits et al., 2000; Kirkman-Brown et al., 2002).
Esquema 2
ASIMETRA FOSFOLIPDICA DE LA MEMBRANA PLASMTICA.
La membrana plasmtica de la mayora de las clulas presenta una distribucin asimtrica en cuanto a su
distribucin fosfolipdica, tal es el caso de fosfatidilserina y fosfatidiletanolamina que de forma normal se
encuentran principalmente en la lmina interna de la bicapa.
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Fluidez y permeabilidad membranal.

La composicin de los fosfolpidos y su relacin con el colesterol regulan la fluidez y
permeabilidad inica de las membranas biolgicas y ambos cambian durante la capacitacin.
En el caso de los espermatozoides humanos existen evidencias de que la capacitacin in vitro
involucra la eliminacin de colesterol de la membrana plasmtica y que la prdida de lpidos
membranales durante este evento parece ser un fenmeno reversible asociado con la presencia
de protenas aceptoras de esteroles en el medio de incubacin (Yanagimachi, 1994).
Cuando se incuban espermatozoides con un medio capacitante qumicamente definido y
despus se estudia la concentracin de lpidos (colesterol y fosfolpidos) en las clulas completas
y fraccionadas, se observa que el colesterol y la relacin colesterol-fosfolpidos disminuye en un
20 y 30% en la fraccin de la cabeza. La adiccin de lquido folicular o suero sanguneo a este
medio, sin embargo produce la eliminacin del 40-50% del colesterol membranal, el cual es
atrapado por las lipoprotenas y albmina presente en estas secreciones.
Las alteraciones fsicas y/o qumicas de la bicapa de lpidos membranales durante la
capacitacin parece tener como resultado adicional la induccin de redistribucin en las
protenas intrnsecas (Yanagimachi, 1994).
La anexina V como marcador de asimetra fosfolipdica
La Anexina-V es un miembro de una familia de protenas con actividad anticoagulante vascular
que presentan afinidades especficas por el calcio inico y por algunos fosfolpidos. Esta protena
se ha llamado de diferentes maneras: Protena de placenta 4 (PP4), protena anticoagulante de
placenta I (PAP I), calfobindina I (CPB-I), protena fijadora de fosfolpidos dependiente de
calcio 33 (CaBP33), protena vascular anticoagulante alfa (VACa), ancorina CII, lipocortina-V,
endonexina II e inhibidor de la tromboplastina. Esta protena, como ya dijimos, presenta una
alta especificidad por la fosfatidilserina cuando se encuentra en condiciones fisiolgicas de
concentracin de Ca2+.
Una propiedad muy til de la Anexina V unida a un fluorocromo como el isotiocianato de
fluorescena (Anexina V FITC) en este tipo de estudios se deriva del hecho de que puede
unirse a un gran nmero de sitios de fijacin en las superficies celulares proporcionando una
seal fluorescente de gran intensidad. El nmero de sitios de fijacin para la anexina V ha sido
sealado como de 6 - 24 x 106 por clula en las clulas tumorales que presentan alteraciones
en la distribucin de sus fosfolpidos membranales y de 8.8 x 106 por clula en las clulas de
estirpe endotelial. Los eritrocitos humanos normales pueden tener tan pocos como 276 sitios
de fijacin, o tantos como 5000. Este nmero puede aumentarse notablemente cuando la
fosfatidilserina, usualmente presente sobre todo en la capa interna de la membrana plasmtica,
es translocada a la parte externa de esta misma membrana.
Algunos estudios practicados con liposomas fabricados con fosfatidilserina han demostrado
que la estequiometra de fijacin de la Anexina V a este fosfolpido oscila entre 4 a 8 molculas
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de Anexina por cada fosfatidilserina. Esto tambin refleja la tendencia que tiene la Anexina V
para formar trmeros en el momento de su fijacin a fosfatidilserina aumentando notablemente
la intensidad de la fluorescencia producida.
La fijacin de la Anexina V a la fosfatidilserina es muy rpida y muy dependiente de la presencia
de concentraciones especficas de calcio. Este proceso puede ser reversible por la adicin de un
quelante del calcio, como el EDTA. La utilidad de utilizar simultneamente las propiedades
tintoriales de la Anexina V y del ioduro de propidio ha sido repetidamente sealada sobre todo
en los casos en que se desea mostrar que la fijacin de la Anexina V no obedece a alteraciones
en la membrana celular que permitan su paso al interior de la clula estudiada. Por ejemplo
las clulas que experimentan el proceso de necrosis se tien simultneamente con la Anexina
V y con el PI.
La prdida de la asimetra fosfolipdica es una importante evidencia de desestabilidad
membranal. Aunque se sabe que esta desestabilizacin puede terminar con la muerte celular
tambin en el caso del espermatozoide (Harrison, 1996), se sabe que ste es un paso esencial en
el proceso de fusin de membranas (Gadella y Harrison, 2002). En el caso del espermatozoide
humano, la incubacin de estas clulas en presencia de bicarbonato/CO2 causa un rpido
cambio en la arquitectura de su membrana plasmtica, acompaada de una desestabilizacin
(de Vries et al., 2003).
Finalmente, podemos resumir que en la mayora de los diferentes tipos celulares, la mayora
de los componentes estructurales de su membrana plasmtica se encuentran distribuidos
asimtricamente, y que una prdida de su asimetra podra traer como consecuencia la muerte
celular, sin embargo para el espermatozoide esta prdida de la asimetra fosfolipdica es un
paso necesario rumbo a la fertilizacin del ovocito.
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Anlisis genmico del repertorio inmunolgico

El estudio de las causas de enfermedad en humanos, animales y plantas no deja duda de que uno de los
principales caracteres con valor en la sobrevivencia es la inmunidad a la infeccin. Desafortunadamente, esta no
es una adquisicin permanente, ya que los agentes patgenos tambin evolucionan, por lo general ms rpido que
sus vctimas.
J.B.S. Haldane. The causes of evolution (1932)
Nada en biologa tiene sentido salvo ante la luz de la evolucin
T. Dobshansky
1) Generalidades del sistema inmune en metazoarios
Los seres vivos, sean uni o multicelulares responden de maneras diversas a estmulos nocivos
derivados de su interaccin con el ambiente. Sin embargo, el aumento en la complejidad
anatmica y funcional derivada de la multi-celularidad y diferenciacin celular gener nuevos
y diversos nichos ecolgicos susceptibles de ser colonizados por otros seres vivos estableciendo
en su mayora, interacciones mutualistas. No obstante, tambin se crearon nichos potenciales
para interacciones parasitarias que no existan en formas de vida unicelular.
El aumento en la complejidad derivada de la organizacin multicelular en el reino animal
incluy el surgimiento de nuevos mecanismos de identificacin de estmulos nocivos asociados
al parasitismo, as como de mecanismos efectores para contrarrestarlo. En su conjunto estos
mecanismos se conocen como sistema inmune y se encuentran conservados en animales bilaterales
(bilateria), cuyos orgenes datan desde antes de la explosin cmbrica aproximadamente hace
unos 600-900 millones de aos (Lynch, 2007). El repertorio inmunolgico se refiere a la gama
de mecanismos moleculares con que cuentan los metazoarios que se encuentran implicados en
el reconocimiento de lo no propio.
La respuesta inmune se compone de un brazo aferente que inicia con el reconocimiento del
patgeno (estimulo) a nivel molecular, usualmente a travs de receptores trans-membranales
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(repertorio). El reconocimiento del patgeno se encuentra ligado a una serie de cambios

bioqumicos complejos en la clula que genricamente se describen como vas de transduccin
de seales que involucran desde interacciones protena-protena, re-localizacin de complejos
proteicos, fosforilacin de protenas, hidrlisis de nucletidos trifosfatados y fosfolpidos
membranales, movilizacin de calcio, lo cual eventualmente culmina en la activacin
de diversos programas efectores o eferentes cuya finalidad biolgica es la erradicacin del
patgeno y mantener al organismo dentro de lmites homeostticos.
La mayora de las respuestas efectoras implican un acoplamiento entre las vas de transduccin
de seales con la induccin o represin de la expresin de genes. Eso usualmente se logra
mediante la activacin de factores de trascripcin, usualmente citoslicos, su translocacin
al ncleo donde interactan con elementos de respuesta en regiones reguladoras de los genes
blanco, promoviendo as el inicio de la transcripcin de los mismos. Los factores de trascripcin
ms importantes en la respuesta inmune y otras formas de estrs celular (luz UV, estrs
oxidativo, necrosis de clulas vecinas) en la mayora de los metazoarios estudiados pertenecen
a la familia de factor de trascripcin REL-NFkB (Beutler, 2004; Hoffman y Baltimore, 2006).
Clasificacin del sistema inmune de acuerdo al mecanismo de reconocimiento
de patgenos: Segn el mecanismo de reconocimiento y relaciones filogenticas, el
sistema inmune se divide en dos tipos: El sistema inmune innato o no anticipatorio (SINA)
y el sistema inmune adquirido o anticipatorio (SIA) (Klein, 1999). El primero est presente
en todos los animales bilaterales y se basa en el reconocimiento de patgenos mediante un
nmero limitado (aunque no necesariamente pequeo) de receptores que reconocen firmas
moleculares conservadas y especficas de los patgenos que se denominan PAMPs (del ingls
Pathogen Associated Molecular Patterns). Los receptores de PAMPs (PRRs del ingls Pattern
Recognition Receptor) estn sujetos a presin de seleccin en el curso de millones de aos y
sus genes se encuentran codificados en la lnea germinal. Por esta razn, la respuesta inmune
innata es esteriotipada al no cambiar su dinmica ante subsecuentes retos inmunes y por lo
mismo carece de memoria inmunolgica (Janeway, 1989; Beutler, 2004).
Por otro lado, el sistema inmune adquirido o anticipatorio (SIA) surgi hace unos 550-450
millones de aos y est presente a partir de los peces mandibulados (Gnatostomados). Este
sistema de reconocimiento se basa en la construccin de novo de receptores de antgeno, ya
sea inmunoglobulinas (Ig) o receptores de linfocitos T (RLT), esto es, que los individuos
heredan una coleccin de segmentos gnicos en la lnea germinal, as como la maquinaria
para ensamblar Ig y RLT. En el individuo, estos segmentos se recombinan clonalmente en
clulas especializadas denominadas linfocitos B (para las Igs) y linfocitos T (para los RLT)
mediante un proceso denominado recombinacin somtica. El resultado final de este proceso
es que cada linfocito B o T contiene un receptor nico que en potencia puede reconocer a un
determinante antignico del patgeno (Cooper y Alder, 2006).
Reconocimiento de patgenos mediante mecanismos innatos: La secuenciacin de genomas
de diversos animales vertebrados e invertebrados ha permitido la identificacin de familias
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de genes que codifican para receptores de reconocimiento de PAMPs. La mayora de esas

familias se encuentran presentes en animales deuterostomados, as como en protostomados,
lo cual sugiere la existencia de genes ancestrales comunes. Otros solo se encuentran en un
phylum pero no en otro. Las principales familias de genes involucradas en el reconocimiento
de patgenos en mamferos son la familia de receptores tipo Toll, los receptores NOD-LRR,
los receptores scavenger, las protenas con grupo tioster, los protenas de reconocimiento de
peptidoglicano, lectinas tipo C, entre otras.
Receptores tipo Toll: El receptor Toll fue originalmente descrito como un receptor
involucrado en la determinacin del patrn dorso-ventral durante la embriognesis temprana
en Drosophila melanogaster. La activacin de este receptor por el ligando Spatzle activa una va de
transduccin de seales que conlleva a la activacin del factor de transcripcin de la familia
REL-NFkB llamado dorsal. Dorsal regula la expresin de dos organizadores embrionarios Twist
y snail en la regin ventral del embrin, los cuales promueven la diferenciacin del endodermo.
La falta de actividad de Twist y snail en la regin dorsal favorece la diferenciacin del ectodermo
y eventualmente del sistema nervioso central (Stathopoulos and Levine, 2002).
Adems de su importante papel en la embriognesis, la va de Toll es esencial en la respuesta
inmune de Drosophila al regular la expresin de pptidos antimicrobianos. Los patgenos
Gram positivos y hongos conllevan a la activacin de diversas proteasas de serina que activan
proteolticamente a Spatzle, activando la va de Toll, lo cual conlleva a la activacin de otro factor
de transcripcin de la familia Rel-NFkB llamado dif, el cual a su vez promueve la activacin
transcripcional de los genes que codifican para pptidos antimicrobianos (Hoffmann, 2002).
Los mecanismos involucrados en la respuesta inmune de la mosca de la fruta son similares a
los encontrados en mosquitos vectores de enfermedades humanas como lo son Anopheles gambiae
(malaria) y Aedes aegypti (dengue) (Waterhouse, 2007).
Un descubrimiento clave en el estudio de la respuesta inmune en los ltimos 10 aos fue
el descubrimiento de que el humano tiene receptores similares a Toll, los cuales han sido
denominados receptores tipo Toll o TLR, los cuales son importantes mediadores de la respuesta
inmune en mamferos, pero parecen no estar involucrados en el desarrollo embrionario
(Medzhitov, 1997). Los receptores tipo Toll comparten una estructura comn. Se trata de
protenas transmembranales cuyo ectodominio cuenta con varios repetidos ricos en leucina
(leucine rich repeat o LRR); una regin transmembranal y un dominio intracelular denominado
TIR (Toll/IL-1R). Mientras que los dominios LRR son frecuentemente encontrados en
diversos receptores que no participan en la respuesta inmune, el dominio TIR est presente
nicamente en los TLRs, el receptor de IL-1 y las protenas R que median resistencia contra
patgenos en plantas. El dominio TIR es indispensable para la va de activacin mediada por
factores de trascripcin de la familia REL/NFkB (Akira et al. 2006).
En el ser humano se han descrito 11 TLRs los cuales se encuentran conservados estructuralmente
y funcionalmente en el ratn. Cada TLR tiene propiedades diferentes de reconocimiento.
As mismo, cada receptor tiene particularidades en cuanto a su capacidad de translucir
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seales intracelulares. TLR4 forma un complejo con CD14 y esencial para el reconocimiento
del lipopolisacrido (LPS). Por su parte TLR1, 2 y 6, ya sea como homodmeros o como
heterodmeros, pueden reconocer diversos componentes de bacterias Gram positivas como
peptidoglicano y cido lipoteicoico, as como componentes de la pared de hongos, como el
zymosan. TLR5 reconoce flagelina. La activacin de este tipo de TLR usualmente conlleva a
la activacin de factores transcripcionales de la familia REL-NFkB, lo cual a su vez activa un
programa de expresin gentica caracterizado por la expresin de citocinas pro-inflamatorias
(Beutler, 2004; Akira, 2006).
TLR3, 7,8 y 9 merecen mencin especial ya que no se expresan en la membrana plasmtica,
sino que se encuentran anclados en vesculas endocticas y son esenciales en el reconocimiento
de cidos nucleicos de origen viral. Estos, adems de activar un programa de secrecin de
citocinas pro-inflamatorias mediada por factores de la familia Rel/NFkB tambin activan la
secrecin de interferones de tipo I, mediante la activacin de los IRF (Interferon response
factor) 3, 7 y 9 (Beutler, 2004; Akira et al, 2006).
Receptores NOD LRR: Existen otro tipo de receptores de PAMPs que no pertenecen a la
familia de los TLR. Una familia muy interesante es la familia NOD-LRR que comprende
un grupo diverso de protenas citoslicas y estn constituidos por dominios LLR, un dominio
central llamado NOD (Nucleotide Oligometization Domain), y un dominio CARD (Caspase
Recruitment Domain). Estas protenas estn implicadas en el reconocimiento de componentes
de paredes bacterianas Gram positivas de aquellas bacterias que escapan de la va endoctica y
residen en el citosol. As mismo, variantes allicas de una de estas protenas han sido implicadas
en el desarrollo de la enfermedad de Crohn (Enfermedad inflamatoria crnica del colon)
(Strober, 2006; Akira et al 2006).
El reconocimiento de muramil-dipptido y cido diamino-pimlico por parte de las protenas
LRR-NOD conlleva a la activacin de la produccin de citocinas pro-inflamatorias va REL/
NFkB, as como la activacin de caspasa 1, la cual efecta el corte proteoltico de pro-IL-1
a IL-1 activa, jugando un papel fundamental en la inflamacin y la respuesta de fase aguda
(Strober, 2006).
El sistema del complemento: El sistema del complemento est compuesto de una serie de
protenas sricas que en condiciones normales se encuentran en forma inactiva. La activacin
del complemento por diversos estmulos inmunolgicos conlleva a la activacin proteoltica
de una protena con grupo tioster llamada C3 a la forma activa C3b. La activacin de C3b
permite la formacin de un enlace covalente entre el tioster de C3b y la superficie del patgeno.
Eso permite la formacin de una cascada de eventos bioqumicos que promueven infamacin
local, opsonizacin del patgeno, as como la formacin de un complejo multimrico con
otras protenas del complemento (C5, C6, C7, C9, C9) denominado complejo de ataque de
membrana, el cual se inserta en la pared bacteriana formando un poro que altera la integridad
bacteriana.
El sistema del complemento lo podemos encontrar principalmente en vertebrados, aunque los
ancestros de las protenas con grupo tioster datan desde la divergencia entre protostomados y
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deuterostomados, ya que diversas protenas como los TEPs han sido descritas en la respuesta
inmune en dpteros. En particular, la protena TEP1 de Anopheles gambiae parece tener un papel
importante en la destruccin de Plasmodium, el parsito causante de la malaria (Blandin et al, 2008)
Reconocimiento de patgenos mediante mecanismos anticipatorios: En el sistema
inmune adquirido, la clona de linfocito que reconoce al patgeno es seleccionada mediante la
activacin de un programa de diferenciacin a clula efectora como resultado de la interaccin
entre el receptor de antgeno y dems seales co-estimuladoras (usualmente derivadas de
activacin del sistema inmune innato). En el SIA, la presin de seleccin ocurre en el orden de
das o semanas. Asumiendo que el individuo sobrevive la infeccin, las clonas seleccionadas por
el patgeno permanecen en el organismo y se encuentran sensibilizadas de tal forma que retos
subsecuentes con el mismo patgeno son resueltos con mayor eficacia, es decir, se desarrolla
memoria inmunolgica. La memoria inmunolgica es la base biolgica de las estrategias de
vacunacin. Al no estar codificada en la lnea germinal, la memoria no se hereda, por lo cual
cada individuo susceptible tiene que ser vacunado.
La funcin del sistema inmune adquirido est ntimamente relacionada con la funcin del
sistema inmune innato. La produccin de anticuerpos as como la inmunidad celular mediada
por clulas T requieren de estmulos resultantes de la activacin del sistema inmune innato. De
hecho, el reconocimiento antignico per se mediado por los receptores de antgeno (Ig o RLT)
induce un estado refractario a la activacin llamado anergia clonal, el cual est implicado
en los mecanismos de tolerancia inmunolgica. La activacin y diferenciacin de linfocitos
requiere, adems de la seal antignica, estmulos co-estimuladores para montar una respuesta
inmune. Estos son muy diversos e incluyen citocinas como IL-1, IL-6, IFN-g, TNF-a; productos
derivados de la activacin del complemento (C3b), interacciones celulares mediadas por pares
ligando-receptor (CD40-CD154; CD80-CD28).
Una consecuencia de la aparicin del sistema inmune adquirido es la capacidad de
discriminacin de lo propio y lo no propio, an entre individuos de la misma especie
(Klein, 1999). Los linfocitos T reconocen los fragmentos antignicos derivados de patgenos
que ingresan al interior celular solo en asociacin con protenas del complejo principal de
histocompatibilidad (en humanos tambin llamado HLA por Human leukocyte antigen). Solo
su asociacin con pptidos derivados de patgenos (lo propio modificado por el patgeno), en
conjunto con seales derivadas de la activacin del sistema inmune innato desencadena una
respuesta inmune mediada por clulas T. El surgimiento de este sistema de reconocimiento
confiri al sistema inmune la capacidad de identificar patgenos cuya replicacin ocurre en el
interior de la clula (virus y bacterias intracelulares) y la consecuente eliminacin de las clulas
infectadas (en el caso de infecciones virales) o proporcionando seales de activacin (ayuda) a
macrfagos infectados por bacterias intracelulares.
El complejo principal de histocompatibilidad es un conjunto de protenas muy polimrficas
que se encuentran en la superficie de todas las clulas de organismos vertebrados y actan
como un cdigo de barras de identidad molecular ya que difcilmente dos individuos
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tienen la misma combinacin de alelos (a menos de que sean gemelos monocigticos). Este sello
de identidad molecular individual confiere a los individuos capacidades diferentes de responder a
diferentes patgenos debido a que las diferencias estructurales en el MHC confieren capacidades
diferenciales para asociarse a pptidos antignicos. Si bien es conocida la asociacin de ciertos alelos
de HLA con la resistencia o susceptibilidad a infecciones como malaria, tuberculosis, progresin de
VIH, lepra, la evidencia apunta que los determinantes genticos de la resistencia o susceptibilidad
a infecciones no se restringen al HLA, sino que son polignicos (Frodsham y Hill, 2004). De la
misma manera, otras enfermedades crnicas de etiologa no infecciosa cuya patogenia obedece a
mecanismos inmunolgicos tambin estn asociadas a ciertos alelos de HLA.
El sistema de reconocimiento antignico mediado por la interaccin entre clula THLA es
nico en su capacidad de identificar perturbaciones mnimas en el universo antignico del
individuo. Una consecuencia inevitable de este sofisticado mecanismo es la respuesta alognica,
es decir, el rechazo a un injerto proveniente de un individuo genticamente distinto de la
misma especie por mecanismos inmunolgicos.
2) Genmica comparativa y filogenia del sistema inmune
La genmica comparativa representa un campo muy atractivo e informativo en trminos
de anlisis de la funcin y evolucin del sistema inmune. Conforme ms genomas de
metazoarios se secuencian, ha sido posible evidenciar que elementos aferentes y eferentes de
la respuesta inmune estn conservados en todos los metazoarios y por otro lado evidenciar
la gran diversidad de estrategias que diferentes organismos han desarrollado para contender
con el reto permanente a la integridad e individualidad que representa el parasitismo. As
mismo, el anlisis genmico est permitiendo el anlisis detallado del repertorio de receptores
involucrados en el reconocimiento de patgenos.
Entre los receptores involucrados en el reconocimiento de patgenos que estn claramente
conservados en la mayora de los metazoarios son las protenas con dominios pertenecientes a la
superfamilia de inmunoglobulinas (SF-Ig). Estos dominios son quiz unos de los ms abundantes
en metazoarios y se encuentra en protenas cuya funcin tiene que ver con reconocimiento
clula-clula (como en el guiado de los axones durante la embriognesis en Drosophila, as
como en otras interacciones clula-clula y desde luego en el reconocimiento antignico. En
resumen, la funcin de las protenas con dominios de Ig no est restringida al sistema inmune.
Sin embargo, algunas de ellas desempean funciones claramente inmunolgicas tanto en
deuterostomados como en protostomados, aunque en estos ltimos no generan diversidad por
recombinacin.
Uno de los componentes de la respuesta inmune que se encuentran relativamente bien
conservados en muchos metazoarios son los elementos de las vas de sealizacin de la va
Toll-NFkB. En D. melanogaster se han descrito dos vas principales de activacin, la va Toll y
la IMD, que convergen en la activacin de factores de trascripcin de la familia REL-NFkB.
Estos factores regulan el 70 % de genes que son regulados a nivel transcripcional en respuesta
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a retos inmunolgicos experimentales. La va de Toll es homloga a la va de varios TLRs de

vertebrados, mientras que la va IMD es homloga a la va de sealizacin mediada por el
receptor de TNFa en vertebrados (Hoffmann, 2002).
As mismo, las comparaciones a escala genmica entre D. melanogaster, Aedes aegypti y An.
gambiae revelan una gran diversidad en los mecanismos de reconocimiento y mecanismos
efectores, principalmente debida a duplicacin gentica y de dominios; mientras que las vas
de sealizacin principales estn bastante bien conservadas (Waterhouse, 2007).
La visin clsica del sistema inmune innato como un sistema cuyos mecanismos de
reconocimiento se basan en una diversidad pobre de receptores de PAPMs ha ido cambiando
paulatinamente conforme se analizan los genomas de mas protostomados y deuterostomados
no vertebrados, o bien al apoyo de tcnicas derivadas de la genmica que no implican la
secuenciacin total de un genoma. A continuacin, se resumen algunos ejemplos que nos
permiten re-plantear esta visin ya que apoyan la nocin de que aquellos animales que no
cuentan con sistemas de recombinacin somtica de segmentos de Ig y TCR pueden generar
una gran diversidad por diferentes mecanismos moleculares:
Generacin de variabilidad mediante empalme (splicing) alternativo: Diversas
protenas con varios dominios de Ig han sido descritos en insectos, en cuyos casos estn
involucradas en diversos procesos biolgicos como adhesin celular, interaccin clula-clula y
respuesta inmune. En Drosophila se describi un gen llamado DSCAM (Down Syndrome Cell
adhesin Molecule) el cual est implicado en la generacin de un gran nmero de isoformas
mediante empalme alternativo, las cuales estn implicadas en guiar los axones durante la
embriognesis. El homlogo de ese gen en An. gambiae, AgDSCAM contiene cerca de 100
exones (cada exn codifica para un dominio de Ig) y en potencia puede generar por empalme
alternativo, ms de 30,000 polipptidos con especificidades diferentes de reconocimiento y
adhesin (Dong, 2006). Es importante hacer notar que esto no indica que sea un mecanismo
homlogo al de la seleccin clonal observado en el SIA, sin embargo revela una capacidad
para generar diversidad en el lapso ontognico (un mosquito no vive ms de un mes). An est
por definirse si la isoforma relevante ante un tipo de infeccin es seleccionada de cierta forma
y si una vez seleccionada, permanecen en el sistema o son inducidas en forma especfica ante
el mismo reto.
Generacin de diversidad mediante expansin de familias gnicas: La duplicacin
de genes involucrados en el reconocimiento de patgenos es un mecanismo para generar un
repertorio amplio de receptores con diferentes capacidades de reconocimiento. La duplicacin
gentica es un evento fundamental en la especiacin y la generacin de nuevas funciones, ya
que la funcin original del gen queda garantizada por el original, y la o las copias tienen menor
presin de seleccin y pueden variar ms libremente (Kondrashov, 2002).
Aunque en muchos metazoarios se han descrito expansin de familias gnicas involucradas
en el reconocimiento de patgenos, el caso del erizo de mar (equinodermo) es uno de los ms
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dramticos. El genoma del erizo contiene alrededor de 220 TLR (recordemos que el humano,
el ratn y Drosophila tienen una decena de TLRs). Ms an, el genoma del erizo cuenta
con aproximadamente 200 receptores tipo NOD-LRR y un nmero similar de receptores
Scavenger, mientras que el genoma humano cuenta con 20 y 80, respectivamente (Rast, 2006).
Generacin de diversidad mediante hipermutacin somtica: El caracol Biomphalaria
glabrata (molusco) contiene una familia de genes denominada FREP (Fibrinogen Related
Proteins) que contienen dos dominios de Ig y un dominio C-terminal tipo fibringeno. Los
genes que codifican a estas protenas sufren mutacin somtica a una frecuencia mayor que
la de otros genes somticos despus de retos inmunolgicos, lo cual ha sido propuesto como
un mecanismo para generar diversidad (Zhang, 2004). Los mecanismos moleculares mediante
los cuales se logra la hipermutacin de FREPs no se conocen, sin embargo no implica que
estn conservados a los mecanismos que median la hipermutacin somtica de receptores de
antgeno (maduracin de afinidad) en vertebrados.
Recombinacin somtica en Agnatha: Las lampreas emplean un mecanismo de
recombinacin somtica anlogo al empleado por los gnatostomados para generar un repertorio
variable de receptores de antgeno. Este sistema implica una familia de genes llamada VLR
(variable lymphocyte receptor) que codifica para receptores variables de membrana anclados
por GPI. La variabilidad se obtiene mediante recombinacin somtica de segmentos que
codifican para LRR en forma clonal. A diferencia de los re-arreglos gnicos que generan
diversidad en Ig y RLT en vertebrados, los re-arreglos en lampreas no estn mediados por las
recombinasas Rag (Pancer, 2004).
Especulaciones sobre el origen del SIA: El origen del SIA plantea un enigma desde la
perspectiva evolutiva porque pareciera que en los gnatostomados aparecieron de la nada los
siguientes elementos: 1) Un sistema de recombinacin mediado por las recombinasas Rag 1 y
Rag 2. 2) Ancestros inmediatos del MHC, el RLT y el RLB. 3) Clulas similares a linfocitos, as
como un programa de regulacin transcripcional y diferenciacin al linaje linfoide. El aparente
surgimiento de estos elementos novedosos asociados al SIA ha llevado a la postulacin de un
supuesto Big Bang inmunolgico, el cual ocurri hace aproximadamente 450 millones de
aos (Marchalonis, 1998).
En la actualidad, gracias al estudio comparativo a nivel genmico de varias especies
representativas del reino animal han podido identificarse al ancestro de las recombinasas
Rag como algn miembro de la familia de los transposones transib, que estn dispersos en
diversos protostomados (Kapitonov y Jurka, 2005). Tambin se han identificado algunos genes
candidatos para precursores del MHC, RLB y RLT en protocordados (DuPasquier, 2004).
Una hiptesis interesante establece que previo al surgimiento de los vertebrados ocurri una
duplicacin genmica, que aument la complejidad de los organismos en trminos de nmero
de genes y permiti la duplicacin del MHC ancestral (Kasahara, 2004). Por ltimo, el anlisis
comparativo de los factores de trascripcin involucrados en la diferenciacin del linaje linfoide
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sugiere que todos los elementos requeridos para el desarrollo de linfocitos estaban presentes en
agnatos (Rothenberg y Pant, 2004). En sntesis, el surgimiento del SIA ocurri gradualmente
mediante la apropiacin de genes con funciones preexistentes, as como la generacin de
nuevas funciones resultantes de la duplicacin gnica y combinacin de dominios (Klein y
Nikolaidis, 2005).
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Participacin de la ceramida en la implantacin

embrionaria
Dr. Romn Espinosa Cervantes
Dr. Adolfo Rosado Garca
La implantacin del embrin en el tero es un proceso complejo y su fracaso es considerado
un impedimento para que se lleve a cabo el embarazo (Skaznik-Wikiel et al., 2006). Las fallas
en el desarrollo embrionario han sido atribuidas a una gran variedad de factores, que incluyen;
la calidad del embrin, sin embargo, otros autores sugieren que es la insuficiencia ltea o
la disrupcin endocrina, las causantes de las fallas en el desarrollo embrionario (Dey et al.,
2004). Debido a esto, en los ltimos aos, se han incrementado los estudios epidemiolgicos
en humanos y los estudios genticos en los roedores. La falla en el desarrollo embrionario,
tambin ocurre debido a la defectuosa funcin uterina o a la mala comunicacin entre el
embrin y madre poco antes de la placentacin. En las especies que presentan implantacin
invasiva como en los humanos y los roedores, el compartimento estromal del endometrio
sufre un dramtico cambio durante el inicio de la gestacin, que involucra la proliferacin,
crecimiento y diferenciacin de las clulas estromales residentes en las clulas poliploides de la
decidua (Kaneko-Tarui et al., 2007).
Recientemente se ha estudiado el papel de los factores de crecimiento, citocinas, genes
hometicos, factores de transcripcin y lpidos mediadores en las interaccin embrin-tero
durante la implantacin (Dey et al., 2004). Adems, se ha reportado una correlacin de eventos
en el tero durante el inicio de la implantacin por metabolitos de esfingolpidos en otros
sistemas y rganos, por lo que se ha sugerido que el metabolismo de los esfingolpidos provoca
en el tero, el desarrollo de la decidualizacin. Los esfingolpidos juegan un papel importante
en la angiognesis, migracin celular, apoptosis, regulacin de la secrecin de materiales
extracelular, seales de transduccin, inmunomodulacin y diferenciacin celular (KanekoTarui et al., 2007).
Estudios recientes ha demostrado el papel de los esfingolpidos en la regulacin de la
sobrevivencia de las clulas germinales de la ratona. Particularmente la esfingosina-1-fosfato
previene la muerte inducida por la doxorubicina en los ovocitos cultivados de la ratona, en la
quimioterapia y la apoptosis inducida por la radiacin en ovocitos in vivo (Suomalainen et al.,
2003; Savtchouk et al., 2007).
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Participacin de la ceramida en la implantacin embrionaria
En el presente estudio, describimos la expresin uterina y la regulacin de enzimas importantes

que coordinan la nterconversin de los metabolitos de los esfingolpidos (es decir, ceramida,
esfingosina, esfingomielinasa cida y esfingosina-1-fosfato [S1P]) durante la fase de
implantacin y al inicio de la gestacin.
Esfingolpidos
En las clulas de los mamferos, la esfingosina es el esfingolpido ms comn, mientras que
en las levaduras y clulas de las plantas, la fitoesfingosina es la ms comn. La biosntesis de
los esfingolpidos (Figura 1) inicia con la condensacin de serina y palmitoil CoA que forman
3-cetoesfingosina qu a su vez sufre la reduccin a dihidroesfingosina. Un grupo acil graso es
agregado por una unin amida para formar dihidroceramida que se convierte directamente
a ceramida el precursor de todos los esfingolpidos, por la introduccin de una doble ligadura
trans entre los carbonos 4 y 5 de la base esfingoide (Merrill y Jones, 1990).
Inhibidor
Fumonisina
B1
Serina +
Palmitoil-CoA
Serina
Palmitoiltransferasa
Ceramida Sintasa
Esfingosina 1 Fosfato
Receptores
Edg
Angiognesis
Anti-apoptosis
Esfingomielina
EMasa
Fosfatidilcolina
Dihidroesfingosina
Glucosilceramida
Dihidroceramida
Glucosilceramida
Sintasa
Esfingolpidos
Esfingosin
a
Cinasa
Ceramida
Ceramidas
a
Protena
Cinasas
Complejo
Esfingolpidos
Diacilglicerol
Esfingomielin
a
PF1/PF2a/ SintasaProtena cinasa

Catepsina D
Chimaerins
Apoptosis
Senescencia
PA
Diacilglicero
l
Cinasa
Promocin
Tumoral
PF1/
Raf1
Mitognesis
Hannun y Obeid,
Figura 1. Biosntesis de esfingolpidos. La sntesis de novo de ceramida se lleva a cabo en el retculo

endoplsmico. La sntesis de esfingomielina, glucosilceramida y glicoesfingolpidos
de ceramida
Hannun
y O beid, ocurre
en el aparato de Golgi, aunque la degradacin de los glicoesfingolpidos y esfingomielina
a ceramida y
2002
esfingosina ocurre en los lisosomas.
Diferentes grupos radicales se agregan a la ceramida para formar esfingolpidos ms complejos,

sin embargo uno de los ms simples es la ceramida-1-fosfato formada por la ceramida cinasa. Los
grupos radicales ms complejos incluyen a cerebrsidos -glicosdicamente unidos a la glucosa
176
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Dr. Romn Espinosa Cervantes y col.
- o a la galactosa, la adicin de un grupo sulfato a la galactosilceramida produce sulfatides y

di-, tri- y tetra-glicosilceramidas ahora conocidos como glicoesfingolpidos. Los ganglisidos
son una subclase de glicoesfingolpidos identificados por la presencia del cido silico en el
grupo radical del hidrato de carbono (Huwiler et al., 2000). La adicin de fosforilcolina a la
ceramida, transferida de la PC por la esfingomielina sintasa, forma la esfingomielina. Los lisoesfingolpidos, N-deacilado como el 1-galactosilesfingosina, glucosilesfingosina, esfingosina-1fosfato y lisoesfingomielina. Estos esfingolpidos estn presentes en muy bajas concentraciones
pero pueden tener efectos importantes en la sealizacin como segundos mensajeros, e.g. la
esfingosina-1-fosfato, o a travs de su efecto ltico desestabilizando la membrana (Ohanian y
Ohanian, 2001).
Muy recientemente se han reportado una correlacin de eventos en el tero durante el inicio
de la implantacin por metabolitos de esfingolpidos en otros sistemas y rganos, por lo que
se ha sugerido que el metabolismo de los esfingolpidos provoca en el tero desarrollo de la
decidualizacin. Adems, los esfingolpidos juegan un papel importante en la angiognesis,
migracin celular, apoptosis, regulacin de la secrecin de materiales extracelular, seales de
transduccin, inmunomodulacin y la diferenciacin celular (Kaneko-Tarui, 2007).
Decidualizacin del tero
La implantacin embrionaria es una serie compleja de procesos que establecen la conexin
entre los tejidos maternos y embrionarios, que requieren de un programa intrincado de
preparacin uterina. Muy poco despus de la implantacin que ocurre en la ratona en el
da 4.5 postcoito (pc) (da 0.5 - tapn vaginal), la clulas estromales del endometrio rodean la
implantacin del blastocisto y sufren una dramtica transformacin (decidualizacin) durante
la cual proliferan y se diferencian en clulas de la decidua. La decidualizacin inicia en la
regin estromal que rodea inmediatamente al embrin (sitio antimesometrial). Despus de la
implantacin del blastocisto, se forma una capa delgada y densa de clulas avasculares, llamada
zona decidual primaria. Adyacente a la zona decidual primaria, la zona decidual secundaria
est totalmente desarrollada el da 6.5 pc, y es caracterizada por una decidua poliploide
terminalmente diferenciadas, con adquisicin de clulas grandes mono y del binucleadas (Tan
et al., 2002). La decidua provee una red vascular para la nutricin e intercambio de gas para el
desarrollo embrionario antes de que se establezca el funcionamiento de la placenta. Adems,
acta como una barrera a la descontrolada proliferacin del trofoblasto. La decidualizacin
uterina es un proceso que ocurre en respuesta a la implantacin embrionaria, es crtica para
la sobrevivencia del embrin y es esencial para que se lleve a cabo la gestacin (Mizugishi
et al., 2007). La decidualizacin forma la decidua que por definicin es un tejido secretorio
que produce una amplia variedad de molculas sealizadoras endocrinas y paracrinas, como
prolactina, interleucinas, citocinas, y prostanoides. Adems, algunas de las funciones conocidas
de la decidua son acciones inmunosupresivas, control del crecimiento trofoblstico y migracin
celular, muerte celular programada para la expansin del trofectodermo y tambin provee una
red vascular para el intercambio de nutrientes para el embrin poco antes de que se forme la
placenta (Skaznik-Wikiel et al., 2006).
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Recientemente se ha reportado que la ruta metablica de los esfingolpidos es muy activa en

la decidua durante la gestacin normal. La perturbacin en la activacin de la va por la
ruptura de los genes esfingosina cinasa (Sphk), provoca defectos en la decidualizacin y severos
daos en los vasos sanguneos uterinos, conduciendo a la prdida de la gestacin. Ratonas
deficientes en (Sphk1/ Sphk2+/) muestran enorme acumulacin de dihidroesfingosina y
esfingosina, as como tambin, una reduccin de los niveles de fosfatidiletanolamina (PE)
en el tero gestante. Las hembras tambin mostraron incremento de clulas muertas en
las clulas de la decidua, disminucin en la proliferacin celular en las clulas estromales
indiferenciadas y ruptura de los vasos sanguneos de la decidua, que provocaron hemorragia
uterina y muerte en los embriones. Por lo que se puede proponer que el metabolismo de
los esfingolpidos regula de forma correcta la decidualizacin uterina y la estabilidad de los
vasos sanguneos. Esto sugerira que una ruptura en el metabolismo de los esfingolpidos
puede ser considerado como una causa de prdida de la gestacin en los humanos (Tilly y
Kolesnick, 2003; Mizugishi et al., 2007).
Ceramida
Las ceramidas son lpidos biolgicamente importantes, derivados de la formacin de la unin
entre un pptido, una esfingosina y un cido graso. Las ceramidas estn implicadas en la
apoptosis de dos maneras. Primero, ellas trasmiten la seal apopttica hacia los receptores
de sealizacin apopttica, como el receptor 1 del factor de necrosis tumoral (TNFR1),
las caspasas, cinasas dependientes de ciclinas, telomerasas en la membrana mitocondrial
(Ogretmen y Hannun, 2004). Segundo, ellas pueden participar directamente en la apoptosis
formando grandes canales (protena-permeables) que habilitan la liberacin del citocromo c de
la mitocondria el cual dispara las caspasas (Siskind et al., 2005). Adems, las ceramidas pueden
formar las balsas de lpidos en la membrana plasmtica que lleva a los Fas y el TRAIL (ligando
relacionado al TNF que induce apoptosis) receptor que se agrupa y refuerza la sealizacin
apopttica (Cremesti et al., 2001). Un gran nmero de enzimas estn involucradas en el
metabolismo de las ceramidas. Sin embargo, las esfingomielinasa neutra y cida (nSMases
y aSMases que convierten esfingomielina a ceramida), la ceramidasa cida (qu convierte la
ceramida a esfingosina) y enzimas como la dihidroceramida desaturasa (DHCD), las cuales
median la sntesis de novo de las ceramidas de dihidroceramida, han sido especficamente
implicadas en el bloqueo de la apoptosis dependiente de ceramida (Figura 2). Es conocido
desde hace mucho tiempo que los ovocitos sin fertilizar estn programados para sufrir apoptosis
despus de varias horas y que la concentracin de ceramida en los ovocitos es superior, al
que se ha reportado en clulas circundantes. Adems se han reportado incrementos en los
niveles de ceramida en los ovocitos viejos y que despus sufren apoptosis (Eliyahu et al. 2007;
Savtchouk et al., 2007).
Prez y colaboradores (1995), determinaron la sensibilidad a ceramida, micro inyectando
(C16) ceramida en ovocitos de ratonas jvenes y viejas para inducir apoptosis y que est se
incrementaba con la edad. Estos mismos autores plantearon que posiblemente las diferencias
en la respuesta a ovocitos de ratonas jvenes y viejas a una ceramida citoslica es que los
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Cer
TNFR 1
EM
nSMase
Cer
NSD
FAN
Ceramidasa
cida
Bax
aEMasa
nEMasa
Caspasa-3
EM
Cer
Mitocondria
Poro de
ceramida
Catepsin D
Cer
DHCD
r
DH-Cer
Sntesis de novo
Fas
Trail
Bid (Truncado)
aEMasa
EM
Lisosoma
itocondra
Agrupamiento
Cer
Esfingosina
Bid
Mit
oco
ndr
a
Casquete Fas TRAIL
Figura 2. Algunas vas apoptticas que involucran a la ceramida (Cer). La seal de muerte se activa
externamente va los receptores como TNFR1, Fas, y TRAIL, o internamente (radiacin ionizante, falta
de nutrientes, etc.). Las enzimas que controlan la concentracin de ceramida representan blancos
teraputicos. stas incluyen enzimas involucradas la produccin de ceramida [nEMasa/aEMasa
(esfingomielinasa neutra/cida) y DHCD (dihidroceramida desaturasa)] y en su desglose (ceramidasa
cida). DH, dihidroceramida; FAN, factor asociado con la nEMasa; NSD, dominio que interactan con
EMase neutra; EM, esfingomielina.
ovocitos de las ratonas viejas desarrollan una elevada respuesta a la ceramida exgena debida
a una prolongada deficiencia en la ceramida endgena (Figura 3.) (Prez et al., 2005).
Ceramidasa cida
La ceramida es un lpido de sealizacin que se produce en respuesta a varios estmulos.
Normalmente est presente en bajas concentraciones, por lo que en respuesta a estos estmulos
la ceramida es producida rpidamente en la superficie celular, provocando la reorganizacin
de la membrana y sealizando la para producir la apoptosis. Despus de la estimulacin, la
ceramidasa cida (CA) y/o otras ceramidasas pueden hidrolizar la ceramida en cidos grasos
individuales y componentes de esfingosina. Debido a que la degradacin de ceramida es la
nica fuente de esfingosina intracelular, estas enzimas tambin pueden limitar la proporcin
y determinar el nivel intracelular de este compuesto. Pretenciosamente, un derivado de la
esfingosina, la esfingosina-1-fosfato (S1P), puede neutralizar los efectos apoptticos de la
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Ratonas jvenes
Ratonas viejas
Ovocito
Ovocito
Niveles de
Niveles de
- ceramida altos
- mRNA bax bajos
- protena bax bajos
- ceramida altos
- mRNA bax altos
- protena bax altos
Clulas del cumulus
Clulas del cumulus
niveles de
ceramida muy
bajos
niveles de
ceramida muy alto
- Envejecimiento por estrs
Ratonas viejas
Ovocito
Incremento en los Niveles
Figura 3. Los niveles de

ceramida, mRNA bax y protena
bax cambian con el
envejecimiento. El
envejecimiento por estrs
dispara aceleradamente la
apoptosis, la cual puede ser
bloqueada por S1P.
- ceramida
- mRNA bax
- protena bax
Clulas del cumulus
niveles de
ceramida bajos
S1P
Apoptosis acelerada
(Prez et al., 2005)
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ceramida, esto ha sugerido que las ceramidasas pueden ser un reostato que mantenga un
equilibrio apropiado entre el crecimiento y la muerte celular. Los ovocitos ovulados sufren
cambios moleculares caractersticos de la apoptosis a menos que ocurra una fertilizacin
exitosa. Mientras que mltiples factores, incluso la ceramida, se han caracterizado como
elementos proapoptticos involucrados en este proceso, poco es conocido sobre los factores
que mantienen a los ovocitos o a la supervivencia del embrin. Por lo que se ha propuesto
evidencias que demuestran que la CA es uno de los factores que participan de forma
importante en la supervivencia del embrin temprano. Desde hace algunos aos se us el gen
designado para inactivar al gen de la CA (Asah1) en la ratona. La caracterizacin inicial de
estos animales revel que las ratonas heterozigotas (Asah1) tenan una enfermedad fenotpica
que almacenaba lpidos progresivamente y que completamente perdan la CA llevando esto
a la ausencia en individuos mutantes. En este mismo estudio se observ que los niveles de
ceramida se encontraban aumentados en ovocitos viejos y que despus llegaban a la apoptosis,
es razonable suponer que la CA, una enzima responsable para la hidrlisis de la ceramida y
produccin de esfingosina (el precursor de S1P), podra ser un factor esencial requerido para
la supervivencia del embrin. Estos mismos autores suponen que la ausencia de la actividad
de CA, el nivel de ceramida en embriones de 2-clulas Asah1, se incremente, provocando la
apoptosis. Esta hiptesis es fuertemente apoyada por datos que muestran que S1P, antagoniza
a la ceramida y que rescata embriones Asah1 -/- y permite su supervivencia a estados de 48
clulas. El mecanismo propuesto de cmo acta la CA es removiendo el exceso de ceramida
del embrin y esto previene la induccin de la apoptosis por la ceramida. Por el contrario,
embriones knockout que carecen del gen CA no transcriben CA a los estados de dos clulas,
y por lo tanto estos embriones sufren apoptosis (Eliyahu et al., 2007; Savtchouk et al., 2007).
Esfingosina-1-fosfato
La ceramida tambin puede producirse de novo por la ceramida sintasa. Dependiendo del
tipo de clula, la ceramida sintetizada a travs de cualquier va puede ser utilizada como una
respuesta a estrs para inducir muerte celular. Alternativamente, la ceramida tambin puede
ser metabolizada por las ceramidasas a esfingosina la cual es fosforilada por la esfingosina
cinasa para generar esfingosina-1-fosfato (S1P) que inhibe la apoptosis (Figura 4.) La S1P acta
como un ligando extracelular para una familia de receptores acoplados a protena-G (receptor
del gen de diferenciacin endotelial), as como tambin, a un segundo mensajero intracelular
que induce proliferacin celular y sobrevivencia. La S1P inhibe los eventos citoplsmicos y
nucleares que conducen a la apoptosis, proporcionando as proteccin de la activacin de
muerte celular en mltiples puntos de la red reguladora de la apoptosis. Por consiguiente, ha
sido propuesto que un equilibrio metablico intracelular entre la ceramida y la produccin de
S1P contribuyen a la decisin de si una clula vivir o morir (Morita et al. (2000).
Estos mismos autores demostraron que la administracin in vivo de S1P protegi los ovocitos
de los folculos primordiales de los efectos deletreos de la radiacin, la causa de la falla
ovrica prematura y la infertilidad en los pacientes de cncer. En ratonas que recibieron
S1P conservaron una distribucin normal de folculos con ovocitos dos semanas despus de
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Esfingosina cinasa
esfingomielinasa
Hidrlisis
Esfingomielina
ceramidasa
Metabolismo
Ceramida
Fosforilacin
Esfingosina
S1P
Bax

Apoptosis
Radiacin
Quimioterapia
Desarrollo
Casper y Jurisicova (2000)
Figura 4. Va de la esfingosina a la muerte celular en ovocitos. La hidrlisis de la esfingomielina por la

esfingomielinasa genera ceramida. En los ovocitos, la ceramida induce muerte celular, probablemente
a travs del factor proapopttico BAX. La ceramida tambin puede metabolizarse esfingosina por la
ceramidasa. La fosforilacin de esfingosina genera S1P que tiene efectos anti-apoptticos. Se cree que
la S1P inhibe la apoptosis previniendo la expresin de BAX. La radiacin, quimioterapia y programas de
desarrollo pueden inducir apoptosis en los ovocitos y la S1P inhibe la muerte celular en todos casos.
la radiacin. Estos mismos autores tambin encontraron que los ovocitos rescatados por el
tratamiento de S1P pueden desarrollarse morfolgicamente en embriones normales. Sin
embargo, no se sabe si estos embriones se desarrollan y llegan a trmino normalmente. Es
probable que los embriones que presentan ms dao en el ADN producto de la radiacin no
lleguen a la fase de implantacin y desarrollo. Sin embargo los embriones normales producirn
recin nacidos saludables (Morita et al., 2000; Casper y Jurisicova, 2000).
En otro estudio se demostr que la S1P juega un papel importante en proteccin de ovocitos
de bovino del choque calrico. En particular, los ovocitos cultivados con S1P bajo condiciones
de choque calrico no experimentaron reduccin en la tasa de degradacin y posteriormente
se desarrollaron a estado de blastocisto, como ovocitos cultivado sin S1P. Adems, la inhibicin
de la sntesis de S1P provocada por adicin de N1N-dimetilesfingosina (DMS) reduce o tiende a
reducir la proporcin de ovocitos que sufre degradacin y posteriormente se desarrollan incluso
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en ausencia de choque calrico, esto sugerira que la S1P est directamente o indirectamente
involucrada con procesos que llevan a la maduracin de los ovocitos. Es probable que los efectos
termoprotectores de la S1P sean el resultado de una accin antiapopttica de la S1P. La apoptosis
mediada por caspasas es una va importante para la ruptura y la capacidad de desarrollo de
ovocitos bovinos causada por el choque calrico y la S1P bloquea la apoptosis de los ovocitos en
la ratona inducida por la doxorubicina y la radiacin (Tabla 1.) (Roth y Hansen, 2004).
Tabla 1. Nmero total de clulas y porcentaje de blastmeros que fueron positivos a TUNEL en blastocistos
desarrollados de ovocitos madurados durante 12 horas a 38.5 a 41.0 C en presencia o ausencia de
esfingosina-fosfato (S1P)
Temperatura (C)
38.5
38.5
41.0
41.0
Medio
Vehiculo
S1P
Vehiculo
S1P
14
23
11
25
Numero total de
clulas
Porcentaje de
blastmeros
Positivos a
TUNEL
129 145
131 14
122 14
109 14
6.6 2.8
8.5 2.8
4.4 2.8
4.1 2.8
Datos representan el SEM.
Durante el desarrollo normal de los ovocitos precede la apoptosis a menos que la fertilizacin
ocurra. Entre el complejo de vas reguladoras que se necesitan para controlar este delicado
balance entre la muerte y supervivencia, la sealizacin de los esfingolpidos es un componente
importante. De hecho, la acumulacin de ceramida en ovocitos viejos ha mostrado conducir
a la apoptosis y los lpidos antiapoptticos, como la S1P, que pueden neutralizar los efectos de
la ceramida y pueden promover la supervivencia de los ovocitos. Otros cambios fisiolgicos
en los ovocitos sin fertilizar y en los embriones, son la oscilaciones de Ca2+, tambin son
componentes importantes de esta decisin reguladora. En la fertilizacin, los ovocitos jvenes,
saludables deben proporcionar protenas antiapoptticas y mRNA suficiente a los embriones
recientemente formados para superar la va apopttica predefinida. Posteriormente el embrin
recientemente formado debe proporcionar estos factores a travs de la expresin de su propio
genoma, activacin del genoma embrionario (EGA). En la ratona, la activacin del EGA es
durante la fase de 2-clulas mientras que en los humanos el evento de activacin mayor ocurre
entre las 4-8-clulas. Aunque los factores antiapoptticos deben estar entre la relacin genes /
protenas expresados en la EGA, sorprendentemente, muy pocos factores se han identificado
hasta la fecha. Consistente con las evidencias anteriormente mostradas, de que el aumento de
los niveles de ceramida en los ovocitos viejos conduce a la apoptosis, es razonable suponer que
la CA, es una enzima responsable de la hidrlisis de ceramida y la produccin de esfingosina (el
precursor de S1P) y podra ser un factor esencial requerido para la supervivencia del embrin
(Spiegel y Kolesnick, 2002; Eliyahu et al., 2007).
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Otra explicacin que podra responder la presencia de los esfingolpidos en la decidua al inicio
de la gestacin, es que los derivados de los esfingolpidos en el tero pueden servir como una
fuente de nutrientes para el embrin en ausencia de una placenta funcional.
Es necesario realizar estudios a futuro para medir el contenido de cada una de estas molculas
de esfingolpidos, as como tambin, la actividad de cada una de las enzimas involucradas en
el proceso. Los experimentos como stos, sern de gran utilidad para delinear cuales de las
molculas de sealizacin de los esfingolpidos son crticas para el desarrollo de la gestacin. Para
establecer el uso potencial de la ceramidasa cida, para prolongar la sobrevivencia del ovocito/
embrin durante los procedimientos de fertilizacin in Vitro (FIV), facilitando la identificacin
y seleccin de embriones sanos para reimplantacin, especialmente en mujeres de avanzada
edad reproductiva. En conclusin, estos hallazgos establecen el papel tan importante que tiene
la ceramidasa cida, en los estados tempranos de la embriognesis de los mamferos y sugiere
que la enzima y/o los genes pueden ser utilizados para facilitar la sobrevivencia del ovocito/
embrin tanto in vitro como in vivo.
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Desacoplamiento mitocondrial en diabetes tipo 2

Introduccin
Los procesos patolgicos en los cuales la disfuncin mitocondrial tiene gran relevancia,
incluyen la recuperacin del tejido isqumico (corazn, cerebro y rin), enfermedades
neurodegenerativas (Parkinson, Alzheimer, esclerosis lateral amiotrfica), padecimientos
relacionados con el envejecimiento y diabetes (Cooper and Schapira, 1997).
La produccin de especies reactivas del oxgeno (ERO) por la cadena transportadora de
electrones, se considera un proceso central en la fisiopatologa celular. Se estima que ms del
1 % del flujo de electrones mitocondriales conduce en condiciones normales a la formacin
de anin superxido (O2.-), el principal radical libre que se genera en la mitocondria, por
lo que cualquier alteracin en el transporte de electrones aumenta de forma importante su
produccin (Olivares-Corichi et al., 2007)
Las ERO tienen una funcin muy importante en diversos procesos biolgicos, por ejemplo,
en la accin antimicrobiana de clulas fagocticas (neutrfilos, monocitos, macrfagos,
eosinfilos), va NADPH oxidasa; como segundos mensajeros de ligandos especficos (factores
de crecimiento) y como reguladores de algunos factores transcripcionales como NF-kb (Hoidal,
2001). Sin embargo un exceso de ERO es capaz de oxidar diversas biomolculas (lpidos,
carbohidratos, protenas y cidos nucleicos) y promover de esta manera dao tisular. Por esta
razn, las clulas poseen sistemas que controlan fisiolgicamente su produccin y/o limitan
su capacidad de dao; de no ser as, alteraciones entre la produccin de ERO y las defensas
celulares, generan un estado conocido como estrs oxidante, el cual resulta en disfuncin y
muerte celular (Ortega-Camarillo et al., 2001; Ortega-Camarillo et al., 2006).
En condiciones de hiperglucemia se incrementa el flujo de electrones de la cadena respiratoria
mitocondrial, lo cual provoca la hiperpolarizacin de la membrana y la formacin de ERO.
La energa celular y la funcin de la membrana mitocondrial en respuesta a glucosa, estn
reguladas en parte por un grupo de protenas, localizadas en la membrana externa mitocondrial
denominadas protenas desacoplantes (UCPs). Las UCPs son transportadoras de la
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membrana interna mitocondrial que controlan el estado de acoplamiento de la respiracin

para la sntesis de ATP, tambin coadyuvan en la defensa antioxidante mitocondrial a travs
del desacoplamiento fisiolgico que acelera el metabolismo y disminuyen la produccin de
ERO con la subsiguiente disminucin del estrs oxidante (Nedergaard and Cannon, 2003).
La disfuncin de las clulas b pancreticas en DT2, se cree es consecuencia de una mayor
exposicin a glucosa (glucotoxicidad) y/o a lpidos (lipotoxicidad), eventos frecuentemente
asociados con obesidad y resistencia a la insulina (Schrauwen and Hesselink, 2004). Se han
propuesto diversas hiptesis para tratar de explicar porqu estas condiciones modifican las
funciones de las clulas b. Una de estas hiptesis se discutir en este trabajo, la cual se enfoca
a los cambios en la expresin, regulacin y funcin de UCPs. Para una mejor comprensin de
la funcin de estas protenas, es necesario revisar algunos aspectos relevantes del metabolismo
oxidante mitocondrial y de la produccin de especies reactivas de oxgeno.
1. Mitocondria
La mitocondria es un organelo citoplasmtico de caractersticas muy especiales, quiz debido
a su origen endosimbitico, que la convierten en un componente importante en la vida de
la clula. Estructuralmente la mitocondria presenta dos compartimentos bien definidos,
matriz y espacio intermembranal, delimitados por dos membranas, interna y externa, con
caractersticas morfolgicas y funcionales bien definidas (Gottlieb, 2000; Gray et al., 1999).
Uno de los eventos fisiolgicos ms importantes en la mitocondria es la generacin de un
potencial de membrana a travs de su membrana interna, como consecuencia directa de
reacciones bioqumicas que constituyen la cadena respiratoria, en la que participan como
substratos el piruvato, algunos aminocidos, y los productos de la -oxidacin de cidos grasos
que entran al ciclo de Krebs y mantienen el estado reducido de las coenzimas dinucletido
de nicotinamida y adenina reducido (NADH) y dinucletido de adenina-flavina reducido
(FADH2). La cadena respiratoria aporta los electrones que eventualmente son transferidos al
oxgeno, tambin se transfieren protones que cruzan la membrana interna mitocondrial, los
cuales generan un gradiente que se expresa como potencial de membrana mitocondrial, con
un valor entre 150 - 180 mV, con carga negativa con respecto al citosol (Hicks et al., 2007).
El flujo de electrones a travs de la cadena respiratoria mitocondrial se lleva a cabo por 4
complejos enzimticos anclados a la membrana, junto con el citocromo c y la coenzima Q
(CoQ). El NADH proveniente del ciclo de Krebs dona electrones al complejo I, ste a su vez
los transfiere a la CoQ , la cual se encuentra en estado reducido por los electrones donados
por varias deshidrogenasas que contienen FADH2, como la succinato-ubiquinona reductasa
(complejo II). Los electrones de la CoQ son transferidos al complejo III. Posteriormente pasan
a travs del citocromo c, al complejo IV y finalmente al oxgeno molecular. La transferencia
de electrones a travs de los complejos I, III y IV genera un gradiente de protones/voltaje.
Gran parte de la energa de este gradiente, es utilizada para producir ATP a travs de la ATP
sintasa (complejo V). As mismo esta energa puede ser disipada en forma de calor a travs de
las protenas desacoplantes (UCPs). Cuando hay una sobrecarga de protones, el transporte de
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Dra. Clara Ortega Camarillo y col.
electrones en el complejo III se inhibe parcialmente y promueve el retorno de electrones a la

CoQ y su donacin al oxgeno molecular, facilitando as la produccin de anin superxido
(Duchen, 2004) (Figura 1).
Fig. 1. Flujo de electrones y protones en la cadena respiratoria mitocondrial. La coenzima Q (CoQ) captura electrones va complejo I y II, y los trasfiere al complejo III, posteriormente pasan al citocromo c. El
complejo IV pasa los electrones del citocromo c reducido al oxigeno. La activacin de las UCPs evita el
paso de electrones por la ATP sintasa y disminuye la produccin de ATP y favorece la liberacin de calor.
De forma adicional a la provisin de ATP, la mitocondria participa en eventos importantes

de la fisiologa celular. Estos incluyen vas de transduccin como la secrecin de insulina en
respuesta a glucosa por las clulas b y como sensor de tensin de oxgeno en la cartida y la
vasculatura pulmonar. Hace un par de dcadas se destac su importancia para la induccin de
la muerte celular programada, por lo que actualmente se sita a la mitocondria como el punto
donde convergen diferentes vas de sealizacin apopttica. En este organelo los cambios
en la permeabilidad de sus membranas, controlan la liberacin de protenas (citocromo c
y el factor inductor de apoptosis, entre otras), que activan diferentes rutas de sealizacin
necesarias para la induccin de la muerte programada de la clula (Ortega-Camarillo et al.,
2001). La mitocondria tambin alberga enzimas limitantes de la biosntesis de esteroides, del
grupo hemo y la anhidrasa carbnica, adems de las enzimas necesarias para el metabolismo
intermediario. As mismo el desacoplamiento fisiolgico de la mitocondria va UCPs, tiene
una funcin crucial como mecanismo generador de calor en la termognesis de los mamferos
pequeos (Tornero and Jordn, 2004).
2. Especies reactivas del oxgeno y estrs oxidante
El trmino radical libre se aplica a especies qumicas que contienen uno o ms electrones no
apareados, ya sea por prdida o ganancia de ellos. La presencia de electrones no apareados
modifica la reactividad qumica de un tomo o de una molcula y la hace generalmente ms
reactiva que su correspondiente no radical. Sin embargo, la reactividad qumica de los
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diferentes tipos de radicales libres es muy variable (Halliwell and Gutteridge, 1992; OlivaresCorichi et al., 2007)
La mitocondria ha sido propuesta como la fuente principal de ERO. Como se mencion antes,
de forma paralela a la reduccin del O2 hasta H2O por la citocromo c oxidasa en la cadena
transportadora de electrones, tiene lugar la reduccin, no enzimtica y monoelectrnica del
O2 molecular, dando lugar a la formacin de anin superxido (O2.-). De forma adicional, el
anin superxido puede dar origen a otras especies reactivas como el perxido de hidrgeno
(H2O2), el radical hidroxilo (HO.) y el peroxinitrito (ONOO-) (Olivares-Corichi et al., 2007).
Existen otras fuentes de ERO en el organismo, por ejemplo el O2.- se produce durante la
fagocitosis para la destruccin de microorganismos extraos (Zentella and Saldaa, 1996). El
radical HO.. se origina como consecuencia de la interaccin de radiaciones electromagnticas
de baja longitud de onda con el agua o por el rompimiento del ONOOH y por la reaccin de
Fenton. Este radical tiene la propiedad de interactuar prcticamente con cualquier molcula.
Las especies reactivas de oxgeno generadas por el metabolismo normal existen en
concentraciones muy bajas, de 1x104 a 1x109 M; no viajan muy lejos de los sitios en los que
se forman, debido a que su vida media no sobrepasa los microsegundos. Cuando las ERO
reaccionan con una molcula, pueden dar origen a otras especies reactivas y desencadenar
una reaccin en cadena autocataltica, por ejemplo durante la peroxidacin de cidos
grasos poliinsaturados, de tal manera que la especie reactiva secundaria y los productos de
la degradacin oxidativa tienen efectos amplificados a distancia del sitio de origen (Hoidal,
2001). Por lo que la existencia de un control interno que mantenga en un rango fisiolgico las
concentraciones de estos radicales es de vital importancia. El desbalance entre los factores proy antioxidantes est asociado con el desarrollo de diversas patologas como diabetes, cncer y
aterosclerosis, entre otras (Figura 2) (Halliwell, 1994).
Fig. 2. Especies reactivas del oxigeno y sistemas antioxidantes.

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3. Sistemas antioxidantes.
Los antioxidantes se pueden clasificar con base en su estructura y funcin biolgica en: 1)
enzimticos, como la glutatin peroxidasa, la catalasa y la superxido dismutasa y; 2) no
enzimticos, como las vitaminas C y E, el b-caroteno, el cido rico y la bilirrubina, entre otros.
Enzimticos: El ms importante es la superxido dismutasa (SOD), enzima encargada de
catalizar la dismutacin del anin superxido, con la subsecuente formacin de perxido
de hidrgeno, aunque el H2O2 puede constituir un problema an ms grave para la clula,
ya que en presencia de metales (reaccin de Fenton), propicia la formacin del radical HO.;
para evitarlo entran en accin otras enzimas como la catalasa presente en los peroxisomas,
que transforma dos molculas de H2O2 en dos molculas de agua y oxgeno molecular. Otro
grupo de enzimas antioxidantes lo constituyen las peroxidasas, de stas la ms importante en
el mamfero es la glutatin peroxidasa que cataliza la formacin de agua y glutatin oxidado
a partir de perxidos.
No enzimticos: En este grupo destaca la vitamina E, la cual en el ser humano protege
contra la lipoperoxidacin, al actuar de manera directa con varios radicales entre los que se
incluyen el HO., el O2.- ; la vitamina C interacta con los mismos oxirradicales, pero adems es
capaz de regenerar el a-tocoferol a su estado activo (Olivares-Corichi et al., 2007).
Estrs oxidante en las clulas b pancreticas
El origen del estrs oxidante en las clulas b por hiperglucemia, se atribuye principalmente
al aumento de las vas glucolticas y por lo tanto de NADH+. Estos eventos favorecen la
interaccin del oxgeno molecular con electrones no pareados producidos va respiracin
mitocondrial, lo que resulta en la formacin de ERO (Duchen, 2004). Sumado a esto, el
aumento de Ca2+ intracelular necesario para la exocitosis de la insulina, tambin contribuye
a la formacin de ERO; estas molculas se proponen como responsables de la disfuncin de
las clulas b y de alteraciones en la sntesis y secrecin de insulina (Robertson et al., 2003), as
como de la acumulacin de metabolitos altamente reactivos capaces de unirse a protenas y
generar estrs oxidante (Daz-Flores et al., 2004; Fridlyand and Philipson, 2004).
Alterno a la produccin de ERO va respiracin mitocondrial, se ha observado que la secrecin
de insulina dependiente de glucosa causa estrs oxidante en las clulas b pancreticas. En
presencia de glucosa, la relacin entre las concentraciones intracelulares de ATP/ADP
aumenta e induce el cierre de los canales de K+ sensibles a ATP (KATP), lo que provoca la
despolarizacin de la membrana plasmtica, la entrada de Ca2+ extracelular y la activacin de
la exocitosis. Tambin se ha observado que el incremento en las concentraciones de glucosa
disminuye la concentracin de ADP libre, est disminucin en un rango fisiolgico puede
ser suficiente para cerrar los canales de KATP an a concentraciones constantes de ATP, el
decremento de ADP tambin puede disminuir la produccin de ATP, lo que en su momento
incrementa el potencial de membrana mitocondrial y la produccin de ERO. Aparentemente
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esta respuesta es una propiedad exclusiva del acoplamiento estmulo-secrecin de las clulas
b. De acuerdo con esta hiptesis, la activacin de la secrecin de insulina inducida por glucosa
tiene una funcin dual: primero, aumenta la secrecin de insulina y segundo, incrementa el
estrs oxidante (Fridlyand and Philipson, 2004). Esto se traduce en que la tasa de secrecin de
insulina podra eventualmente tener efectos negativos sobre la propia produccin de insulina.
De lo anterior se puede concluir que al menos 3 estados durante la secrecin de insulina
(aumento del flujo glucoltico, disminucin de ADP y aumento de Ca2+ intracelular) pueden
exacerbar la formacin de ERO, lo cual puede explicar por qu las clulas b son quizs las
nicas que tienen un mayor riesgo de dao por estrs oxidante y apoptosis (Grankvist et al.,
1981). La secrecin de insulina inducida por glucosa contribuye al incremento en la produccin
de ERO en las clulas b, lo que sugiere que las ERO son parte del mecanismo de sealizacin
para la secrecin de insulina, sin embargo el incremento en la sntesis de estas molculas puede
tambin ejercer efectos deletreos en las clulas b (Pi et al., 2007).
4. Protenas desacoplantes (UCP)
La identificacin del tejido adiposo pardo (BAT, por sus siglas en ingls) y su gran actividad
termognica en los animales que hibernan y en los nios recin nacidos, sugiri que la grasa
parda contena uno o ms compuestos que desacoplaban la cadena respiratoria. A finales de
la dcada de los 70s, se demostr que una protena de 32 kDa localizada en la membrana
interna de la mitocondria participaba en este proceso. Su nombre original fue termogenina,
sustituyndose aos despus por el de protena desacoplante tipo 1 (UCP-1). Las protenas
desacoplantes estn bien caracterizadas, en los mamferos se conocen 5 tipos (UCP-1 a UCP5) localizadas en diferentes tejidos y con una funcin especfica en el metabolismo celular
(Sokolova and Sokolov, 2005).
Estructura
Las UCPs pertenecen a una familia de protenas acarreadoras de aniones mitocondriales,
divididas en tres regiones homlogas internas, de aproximadamente 100 aminocidos cada
una. En cada regin existen 2 dominios transmembranales en forma de a-hlice, los extremos
amino y carboxilo se localizan en el espacio intermembranal. Las protenas homlogas
conservan los seis dominios transmembranales, salvo en el caso de UCP-3S. El gen de UCP-3
en el humano codifica para 2 protenas: una larga de 311 aminocidos (UCP-3L) y una corta
de 275 aminocidos (UCP-3S) que se origina cuando la ruptura y una seal de poliadenilacin
(AATAAA) localizada en el ltimo intrn, irrumpe el mensaje de elongacin, hasta ahora se
desconoce la razn de la existencia de estas isoformas (Argyropoulos and Harper, 2002).
Expresin
El gen que codifica a UCP-1 est localizado en el cromosoma 4q28-q31 y se expresa
exclusivamente en tejido adiposo pardo, por lo que tiene una funcin poco significativa en la
homeostasis energtica del humano adulto. UCP-2 y UCP-3 se expresan en msculo y tejido
adiposo blanco, tejidos que tienen mayor relevancia para la termognesis adaptativa en el
humano. El gen de UCP-2 se encuentra en el cromosoma 11p15.1 del humano y presenta una
homologa del 59% con UCP-1. La UCP-3 se expresa exclusivamente en tejido muscular y
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grasa parda; en respuesta a estmulos que aumentan la termognesis (alteraciones a nivel de

tiroides, el fro, la leptina y el ejercicio) (Silvestri et al., 2005)
Regulacin
Las protenas desacoplantes son susceptibles a una regulacin de carcter agudo y crnico. La
primera estimula la actividad de UCPs existentes, y la segunda aumenta los niveles de ARNm
y la sntesis de novo de estas protenas. El fro regula la expresin de UCP-1 en grasa parda, un
tejido termognico que nicamente tiene sentido fisiolgico en animales que hibernan y en
roedores; aunque tambin puede estimular la expresin de UCP-2 y de UCP-3 en grasa parda,
pero no en msculo (Nagase et al., 1996).
El sistema nervioso simptico es el regulador inmediato (agudo) ms importante de estas
protenas, una estimulacin simptica prolongada de la grasa parda, incrementa la actividad
de las UCPs existentes y promueve su trascripcin, mediante la activacin de los receptores y
a-adrenrgicos de la norepinefrina (Nagase et al., 1996). Otro mecanismo que interviene en
la regulacin de estas protenas a corto plazo es la oxidacin de cidos grasos, durante este
proceso se presenta un aumento en la produccin de O.-2 lo que incrementa la actividad de
UCP-2 para disminuir el potencial de membrana mitocondrial (Moreno et al., 2003).
En la regulacin crnica, intervienen diversas hormonas como la triyodotironina y la leptina.
La triyodotironina, produce un aumento rgano-especfico del ARNm de UCP-2 en corazn
de rata. Un efecto similar pero moderado se observ en msculo esqueltico, no as en
rin o hgado. La administracin crnica de triyodotironina aumenta los niveles de ARNm
de UCP-3 en BAT y msculo esqueltico (Kerner et al., 2001). La leptina, una hormona
producida por el adipocito que a travs del hipotlamo controla el centro de saciedad en
mamferos, tambin incrementa la expresin de UCP-2 en islotes pancreticos y tejido
adiposo blanco (6 y 10 veces, respectivamente); al mismo tiempo que incrementa el ARNm
de UCP-3 en BAT (Silvestri et al., 2005).
5. Fisiologa de las UCPs
Se pueden predecir 4 funciones bsicas de las UCPs; cuando su actividad es moderada ocurre
un desacoplamiento parcial de la mitocondria (situacin en que la sntesis de ATP no esta
afectada). Tal desacoplamiento aumenta la tasa de respiracin y la tasa metablica (funcin
bsica 1). Esto es benfico para numerosos procesos fisiolgicos, al evitar la formacin de
especies reactivas de oxgeno (funcin bsica 2) y es inevitablemente paralela a la termognesis
media (funcin bsica 3). Por otra parte, mantienen el potencial de membrana mitocondrial
bajo cierto lmite y controlan la produccin de ATP (funcin bsica 4), de otro modo, el
aumento en la sntesis de ATP podra inhibir la cadena respiratoria (Jezek, 2002).
Mecanismo de Accin
La UCP-1 es una protena transportadora de protones y aniones, constituye una ruta
alternativa para la entrada de protones, evitando su paso por la ATP sintasa por lo que la
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energa del gradiente electroqumico es disipada en forma de calor. Se han propuesto dos
mecanismos para explicar la actividad desacoplante de UCP-1 y el papel que desempean los
cidos grasos. En el primer modelo, la UCP-1 acta como un canal de protones y en presencia
de cidos grasos, stos proporcionan los grupos carboxilo que favorecen su transporte. En el
segundo modelo, los cidos grasos aninicos siguen un circuito en el que recogen los protones
del espacio intermembranal, fluyen hasta la matriz donde liberan los protones y la UCP-1
se encarga de regresar el cido graso aninico a la zona intermembranal, donde puede ser
protonado nuevamente (Garlid et al., 1996). Este proceso se repite hasta que los cidos grasos
no esterificados son eliminados (Figura 3). Este mecanismo puede extenderse a todas las UCPs
lo que permite predecir que ests protenas (al menos UCP-2 y UCP-3) son capaces de mediar
el transporte unidireccional de los cidos grasos aninicos (Nagase et al., 1996).
Fig. 3. La exportacin de cidos grasos aninicos y/o perxidos por UCPs, evita el dao mitocondrial, al
disminuir el gradiente de protones y la formacin de ERO por B-oxidacin.
6. UCPs en Diabetes y Obesidad

UCP-2
La localizacin del gen de UCP-2 en el loci asociado con obesidad e hiperinsulinemia,
despert gran inters por entender su funcin en DT2, en la regulacin del peso y en el balance
energtico (Krauss et al., 2003). Estudios clnicos (sujetos con DT2) y experimentales (ratas
Zucker delgadas y fa/fa obesas), realizados en islotes pancreticos, mostraron un incremento
en la transcripcin de UCP-2, ligada a alteraciones en el metabolismo de la glucosa y en la
secrecin de insulina debido al incremento en el desacoplamiento de la cadena respiratoria
mitocondrial y la disminucin de ATP; recordemos que la secrecin de insulina en respuesta a
glucosa, es dependiente de las concentraciones de ATP y se estima que el 98% de su produccin
en la clula depende del proceso oxidante. Por esta razn, UCP-2 se considera un regulador
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negativo de la liberacin de insulina (Jezek, 2002; Krauss et al., 2003). Esto se confirm en
clulas de ratones knockout para UCP-2, donde se observ un aumento en los niveles de
ATP y en la secrecin de insulina en respuesta a glucosa. La disminucin de ATP en las
clulas que sobre expresan UCP-2, est asociada a una disminucin en la hiperpolarizacin
de la membrana interna mitocondrial inducida por glucosa (Sesti et al., 2003), por lo que el
incremento en la expresin y/o activacin de UCP-2 puede contribuir a alteraciones en la
secrecin de insulina al reducir la relacin ATP/ADP, necesaria para el cierre de los canales
KATP y la subsiguiente despolarizacin de la membrana, la entrada de Ca2+ y la exocitosis de
los grnulos de insulina.
Por otro lado, aunque UCP-2 reduce la magnitud en la secrecin de insulina en respuesta a
glucosa y por lo tanto la eficiencia de las clulas (Brownlee, 2001), tambin pueden proveer
un sistema de proteccin contra ERO (Fridlyand and Philipson, 2004). En DT2 prevalece
un estado de estrs oxidante dado principalmente por el aumento en la produccin de anin
superxido (Ortega-Camarillo et al., 2006) (Figura 4).
Fig. 4. En condiciones de hiperglucemia hay un aumento de anin superxido y de UCP-2 que disminuye
la produccin de ATP y la secrecin de insulina.
La UCP-2 exporta el anin superxido desde la matriz hacia el espacio intermembranal, donde
puede experimentar una dismutacin ms rpida o bien ser capturado por otras defensas
antioxidantes, contribuyendo as a la disminucin del potencial de membrana mitocondrial y
de la produccin de ERO (Echtay et al., 2002).
Esto permite sugerir que el desacoplamiento parcial ejercido por UCPs, puede ser benfico
tanto para clulas como para tejidos. La proteccin de las clulas b contra el estrs oxidante
por activacin de UCP-2, se confirm en un estudio en el que se cultivaron clulas INS-1
(clulas productoras de insulina) en presencia de H2O2, en estas condiciones se increment la
expresin de UCP-2, disminuy la produccin de ERO y la activacin de caspasas, mejorando
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notablemente la tasa de supervivencia celular, por lo que se propuso que UCP-2 evita el dao y
probablemente la apoptosis debida a estrs oxidante (Echtay et al., 2002; Vincent et al., 2004).
Otra fuente de ERO la constituye el aumento en la tasa metablica de los cidos grasos
libres, al incrementar el flujo de energa a travs de la cadena transportadora de electrones
y la produccin de ERO en las clulas b. La UCP-2 tambin limita la produccin de ERO
provenientes de esta va, al disipar el exceso de energa. Dado que los cidos grasos regulan
la trascripcin de UCP-2 en las clulas b, se ha propuesto la hiptesis de que la obesidad,
considerada como uno de los principales factores de riesgo para DT2, est relacionada con la
activacin de UCP-2 (Joseph et al., 2004). Esta propuesta se apoya en experimentos con clulas
INS1 expuestas a oleato, en donde se observ una disminucin de la secrecin de insulina
en respuesta a glucosa, aumento de la expresin de UCP-2 y desacoplamiento mitocondrial
(Chan et al., 2004). Lo que indica que la oxidacin de cidos grasos libres (AGL), est limitada
por un aumento en el desacoplamiento debido a la activacin de UCP-2 y de la exportacin de
cidos grasos aninicos fuera de la mitocondria, hacindolos inalcanzables para el metabolismo
oxidante (Joseph et al., 2004).
Por otro lado, se sabe que los cidos grasos inducen la expresin de genes implicados en diversas
rutas lipolticas, como los que codifican para carnitil palmitoil transferasa I (CPT-I), acil-CoA
oxidasa peroxisomal (ACO) y UCP-2 (Jezek, 2002). Al mismo tiempo, disminuyen la expresin
de acetil-CoA carboxilasa (ACC), enzima clave en la ruta lipognica y que sintetiza malonilCoA, un inhibidor fisiolgico de CPT-I, contribuyendo de esta manera a la regulacin de la
liplisis (Joseph et al., 2004). Esta compleja remodelacin metablica podra tener un papel
clave en el proceso de desintoxicacin a travs de rutas lipolticas celulares. En este sentido,
UCP-2 podra formar junto a CPT-I y ACO una primera lnea lipodesintoxicante, donde
CPT-I y ACO se encargaran de degradar el exceso de lpidos para evitar su esterificacin
as como la formacin de depsitos txicos de triacilgliceroles, UCP-2 disipara los protones
para disminuir la produccin de ATP y adaptar la respuesta secretora a los niveles de glucosa
circulantes, manteniendo en la medida de lo posible, la sensibilidad de la clula b a la glucosa.
UCP-3
La UCP-3 estimula la translocacin de GLUT 4 y por lo tanto, el transporte de glucosa en
msculo esqueltico y cardaco por un aumento en la actividad de la fosfatidilinositol-3-cinasa.
Los animales que sobre-expresan UCP-3 (ms de 66 veces) pierden peso a pesar de tener
hiperfagia y muestran mayor sensibilidad a la insulina en msculo. La mayora de los autores
proponen que UCP-3 regula la cantidad de ATP disponible en el interior de las clulas al
controlar el flujo de protones, como por ejemplo, en el msculo la demanda de energa puede
modificarse de forma brusca durante el ejercicio, en esta situacin, la expresin de UCP-2 y 3
disminuye y por lo tanto se favorece la produccin de ATP (Nedergaard and Cannon, 2003).
Se ha propuesto que UCP-3 est involucrada en el manejo de lpidos como fuente energtica,
ms que en la mediacin de la termognesis; as por ejemplo, UCP-3 podra funcionar en
concierto con la tioesterasa mitocondrial 1 (MTE 1), para remover cidos grasos aninicos
libres, generados por esta enzima y liberar CoA, necesaria para la b-oxidacin y para el ciclo
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de Krebs, en situaciones en que la oxidacin de cidos grasos libres es mayor en la clula

(Lanni et al., 2002). Por lo que UCP-3 puede favorecer la salida de cidos grasos aninicos
que cruzan la membrana interna, y permitir su retorno al citosol, al disminuir el gradiente de
protones y la formacin de ERO. Las evidencias experimentales permiten proponer que el
gen de UCP-3 puede ser importante en situaciones en las que la b-oxidacin es la principal va
metablica y puede concluirse que UCP-3 y MTE 1, se encuentran dentro de la misma ruta
para la utilizacin adecuada de cidos grasos libres y, que las funciones atribuidas a UCP-3 en
el manejo de lpidos y desacoplamiento mitocondrial, no son excluyentes (Lanni et al., 2002;
Yamashita et al., 2004).
La alta correlacin entre la expresin de UCP-3 y la oxidacin de cidos grasos, apoya la idea
de que est protena interviene en su metabolismo. Los pacientes obesos y diabticos, muestran
niveles elevados de cidos grasos libres (AGL), y a largo plazo, este aumento junto con la
disminucin en la capacidad de oxidarlos conduce a la acumulacin tanto de AGL como de
triacilgliceroles en clulas b, corazn, hgado y msculo esqueltico. Esto aunado a episodios
de hiperglucemia postprandial, pueden conducir a disfuncin mitocondrial y a un estado de
resistencia a la insulina. La expresin de UCP-3, se encuentra disminuida en pacientes con
resistencia a la insulina, DT2 y ancianos; lo que sugiere, que en estas condiciones, los niveles
de UCP-3 son insuficientes, tanto para reducir la produccin de ERO como para exportar los
cidos grasos aninicos y/o perxidos, por lo que el dao mitocondrial por lipoperoxidacin
no puede evitarse (Garvey, 2003)
7. Variaciones genticas de UCPs en la regulacin del peso corporal y Diabetes
tipo 2
En los ltimos 20 aos se han realizado estudios para identificar las variantes genticas que
predisponen a las enfermedades complejas como DT2 y obesidad. Aunque el incremento en la
prevalencia de estas patologas se debe principalmente a los cambios en el estilo de vida actual,
se cree que la susceptibilidad a estos padecimientos, posee ciertos determinantes genticos que
an se encuentran en estudio.
Recientemente se ha propuesto a los genes de las protenas desacoplantes como genes
diabetognicos potenciales (Gable et al., 2006; Rousset et al., 2004). Estudios con animales,
mostraron que la regin del genoma en que se encuentran UCP-2 y UCP-3 se asocia con
resistencia a insulina, intolerancia a la glucosa y aumento de adipocidad, sin embargo, la
regin genmica identificada es demasiado grande y mltiples genes pueden estar incluidos en
ella. En poblaciones de indios Pima, Franco-Canadienses y Finlandeses se han descrito dbiles
asociaciones de esta regin, con la tasa metablica y/o la insulina en ayuno. Los polimorfismos
de UCP-2 que se han observado con mayor frecuencia son: la substitucin de Alanina por
Valina en el codn 55, la insercin de 45 pares de bases en una regin no transcrita en el
extremo 3 y recientemente la substitucin de Guanina por Adenina en la regin promotora
(Walder et al., 1998)
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Actualmente se desconoce si el incremento en la expresin de UCP-2 tiene un papel causal en la

disfuncin de la clula b durante la DT2, sin embargo, se ha observado que su expresin aumenta
en condiciones de hiperglucemia e hiperlipidemia en lneas celulares pancreticas y en sujetos con
DT2 as como su deficiencia mejora la funcin de la clula b en roedores obesos diabticos (Winzell
et al., 2003) lo que permite sugerir que est protena tiene una importante funcin en la patogenia
de est enfermedad (Brown et al., 2002). En el humano el polimorfismo 866 Guanina/Adenina en
el promotor de UCP-2 est asociado con una disminucin en la secrecin de insulina, un aumento
en la frecuencia y/o en el inicio temprano de DT2 (Fur et al., 2004) y con un mayor riesgo de
obesidad en Caucsicos (Lowell and Shulman, 2005). En el paciente con DT2 homocigoto para
el polimorfismo en el alelo 866 Adenina, la secrecin de insulina en respuesta a glucosa y el estrs
oxidante son significativamente ms (DAdamo et al., 2004); lo que sugiere que las diferencias que se
observan a nivel de secrecin de insulina entre los individuos con DT2, pueden atribuirse en parte
a este polimorfismo 866 G/A (Gable et al., 2006).
A pesar de la poca evidencia funcional que liga a las UCPs con obesidad, diversos grupos han
buscado asociacin entre variaciones genticas de estas protenas y el acumulo de grasa corporal.
Varios polimorfismos de nucletidos nicos (SNPs) han sido descritos en el gen de UCP-1, sin
embargo ninguno presenta asociacin con obesidad. Algunas mutaciones raras de UCP-3 se han
descrito en pacientes de origen Africano con obesidad mrbida; pese a ello su relacin causal se
ha puesto en duda, ya que la mutacin Arg282Cis, que elimina la funcin de UCP-3, no causa
obesidad (Yanovski et al., 1999). En indios Pima el alelo t en la posicin 55 aumenta la expresin
de UCP-3 en tejido muscular, en Franceses esta variable se ha relacionado con un aumento en
la frecuencia de dislipidemias y del permetro de cintura (Walder et al., 1998). Estudios recientes
demuestran que la expresin de UCP-3 en msculo no es distinta entre obesos y delgados, pero
los sujetos delgados con obesidad previa presentan baja expresin de UCP-3, hecho que puede
estar relacionado con una disminucin de la tasa metablica basal descrita en estos sujetos. Dado
que un bajo metabolismo en reposo es un factor que predispone al desarrollo de obesidad, estos
resultados sugieren que la disminucin de UCP-3 en msculo esqueltico puede favorecer el
incremento de peso corporal (Gable et al., 2006)
Recientemente, la sustitucin de adenina por guanina en la posicin 3826 en el promotor
del gen de UCP-1 mostr una asociacin aparente aunque indirecta, al interactuar con otros
cambios en el receptor b3-adrenrgico (como el polimorfismo Trp64Arg) con un mayor
riesgo de obesidad, que se explica por una disminucin en la tasa metablica basal. En un
estudio realizado por Ishigaki y col. (2007), se demuestra que la expresin de UCP-1 en hgado
reduce el contenido de grasa, ms que inhibir su acumulacin, tanto en hgado como en tejido
adiposo, lo que indica que UCP-1 promueve la hidrlisis de triacilgliceroles almacenados en
el tejido adiposo.
Conclusin
Las UCPs pertenecen a la familia de protenas transportadoras de aniones que facilitan el
intercambio de substratos que cruzan la membrana interna mitocondrial. Los miembros de
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est familia juegan un papel esencial en el trfico de metabolitos intermediarios dentro y fuera
de la matriz mitocondrial. La UCP-1 adems de regular la termognesis y en el transporte
unidireccional de cidos grasos; inhibe la acumulacin de grasa en tejido adiposo, por lo que
su expresin en hgado podra ser un blanco teraputico en sndrome metablico, DT2 y
obesidad. En este trabajo se proveen evidencias del doble papel de UCP-2 y UCP-3: por
un lado el aumento patolgico en la transcripcin de UCP-2 en islotes pancreticos puede
conducir a alteraciones en la secrecin de insulina en respuesta a glucosa y de est manera
contribuir a la patognesis de la diabetes tipo 2; y por el otro las UCPs intervienen en la defensa
y probablemente evitan la apoptosis de las clulas b, en condiciones de estrs oxidante, de tal
manera que el tratamiento con antioxidantes, posiblemente disminuya la expresin de UCPs,
aumente la sntesis de ATP y aminore los sntomas de DT2. Adems, estas protenas ejercen
un papel clave en el metabolismo energtico y actualmente constituyen un campo de intensa
investigacin como blancos potenciales para el tratamiento farmacolgico de DT2 y obesidad.
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Alteraciones en la va de la sealizacin de la
insulina y su relacin con obesidad y diabetes.
Dra. Rebeca Garca Macedo.
Diabetes tipo 2 y obesidad
La diabetes tipo 2 (DT2) se puede definir como una enfermedad metablica caracterizada por
un estado de hiperglucemia crnico que se presenta junto con alteraciones en el metabolismo
de carbohidratos, lpidos y protenas, debido a la ausencia o disminucin en la secrecin y/o
accin de la insulina y en la mayora de los casos est asociado con obesidad. La prevalencia
global de la DT2 alcanzar la cifra de 300 millones de casos en el 2025 (Zimmet et al., 2001)
y se est incrementado entre los nios y jvenes debido a factores ambientales (sedentarismo)
y factores genticos (por ejemplo: polimorfismos o cambio de una base nitrogenada en los
genes). La DM2 presenta sntomas caractersticos tales como: sed intensa (polidipsia), orina
abundante (poliuria), prdida de peso, algunas veces con gran apetito (polifagia), visin
borrosa, nuseas, vmito, debilidad o cansancio excesivo, altos niveles de glucosa en sangre
y orina, incremento en la susceptibilidad a enfermedades e infecciones. Los efectos a largo
plazo de la DT2 incluyen el desarrollo progresivo de complicaciones especficas; por ejemplo,
anormalidades macrovasculares (macroangiopata) y microvasculares (microangiopata). Las
anormalidades macrovasculares resultan en aterosclerosis con incremento en enfermedades
cerebrovasculares e infarto del miocardio. Las afecciones neuropatolgicas afectan al sistema
autnomo y a los nervios perifricos. Las anormalidades microvasculares comprenden
cicatrizacin proliferativa de la retina (retinopata diabtica) y enfermedad renal (nefropata
diabtica) (Expert Committee, 2003 a y b).
La obesidad es una enfermedad compleja, se puede definir de diversas maneras: como un
trastorno metablico caracterizado por un exceso de grasa corporal o como una enfermedad
crnica, de etiologa multifactorial en la cual se involucran aspectos genticos, ambientales y
de estilo de vida que conducen a un trastorno metablico, clnicamente se caracteriza por un
ndice de masa corporal (IMC) mayor a 30 Kg/cm2. La obesidad es un problema de salud
pblica en proceso de expansin en todo el mundo. En Mxico el aumento de su prevalencia
ha sido ms rpido que en otros pases en vas de desarrollo, y para su tratamiento se requiere
tomar en cuenta los factores biolgicos socioculturales y psicolgicos que la determinan
(Arellano et al., 2004).
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Alteraciones en la va de la sealizacin de la insulina
La mayora de los modelos de DT2 sealan a la obesidad como una causa importante de la
enfermedad, debido a su asociacin con la resistencia a la insulina y a la falla en las clulas
beta del pncreas. La falta de regulacin en los tejidos perifricos y la sealizacin central,
provocadas por diversos factores, puede iniciar y sostener la cascada de eventos que llevan al
incremento en el peso corporal, a la obesidad y diabetes. Se revisarn aspectos relacionados
con la etiologa de estos padecimientos, enfocados principalmente a las funciones de la insulina
y al mecanismo por el cual se incorpora la glucosa en las clulas.
Va de sealizacin de la insulina
La insulina, es una hormona proteica, sintetizada y excretada por el pncreas, es la encargada
de regular el metabolismo y sntesis de novo de la glucosa. Cuando la insulina no se secreta
en cantidades adecuadas o cuando sus funciones estn disminuidas o totalmente inhibidas, se
presenta lo que se conoce como resistencia a la insulina. Los rganos ms susceptibles a
estas alteraciones, son el hgado, el msculo, el cerebro y el tejido adiposo.
De manera general, una vez que la insulina es liberada, se transporta por el torrente sanguneo
hasta llegar a los rganos blanco, ah se une a su receptor (IR). El IR est formado por cuatro
subunidades: dos de tipo alfa y dos beta. La interaccin de la insulina con su receptor, provoca
la activacin del dominio de tirosina cinasa del receptor y su autofosforilacin en determinados
residuos de tirosina de las subunidades . Lo anterior va seguido de la fosforilacin de otros
sustratos endgenos. Entre estas protenas, se encuentran los sustratos del receptor a insulina
(IRS), de los cuales se conocen 4 isoformas; IRS-1 es la ms comn.
El IRS-1 contiene dominios con homologa Src 2 (SH2), y despus de que se une el fosfato
a residuos de tirosina (Tyr), interacciona con la enzima fosfatidil inositol 3 cinasa (PI3K), esta
interviene en la mayora o en todas las acciones metablicas de la insulina. La PI-3K est
constituida por las subunidades cataltica y reguladora. Se han identificado tres clases de esta
enzima, las de clase Ia es ms estudiada, presenta la combinacin de subunidad cataltica p110
y reguladora p85. La unin de p85 con IRS-1 fosforilado estimula la activacin de PI3K, lo
cual lleva a la formacin de fosfatidil-inositol-3, 4 bifosfato (PIP2) y fosfatidil inositol-3, 4. 5
trifosfato (PIP3). La activacin de esta enzima es un paso necesario para la movilizacin de los
transportadores de glucosa, ya que en presencia de inhibidores especficos de la PI3-cinasa, se
disminuye la translocacin del transportador de glucosa tipo 4 (GLUT4) y por consiguiente,
la entrada de glucosa a las clulas. La PI3K, a su vez, activa otras serina (Ser)/treonina (Thr)
cinasas, entre las que se encuentran la protena cinasa tipo B (PKB), tambin conocida como
Akt, la cinasa p70S6 y las isoformas de las protenas cinasas C atpicas (PKC): y . La p70S6
interviene solamente en la sntesis de protenas estimulada por insulina, mientras que Akt/PKB
y las PKC atpicas regulan la translocacin de GLUT4. Los productos lipdicos de PI3-K (PIP2
y PIP3) son necesarios para la localizacin de PKB en las membranas y para su activacin,
para ello se unen a la cinasa dependiente de fosfoinostidos (PDK1). Por lo tanto estos dos
fosfolpidos pueden atraer a la PDK1 y a la PDK2 hacia la membrana plasmtica, esta ltima
enzima no se ha identificado. Los sustratos conocidos de estas ltimas cinasas son Akt/PKB y
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las PKCs atpicas. Las PDK 1 y 2 fosforilan Akt/PKB en dos residuos: treonina 308 y serina 473,
respectivamente. Akt/PKB acta sobre ms de 35 sustratos que estn involucrados en diversos
procesos metablicos como el transporte de glucosa, sntesis de glucogno, sntesis de protenas,
lipognesis y supresin de la gluconeognesis heptica, y tambin interviene en procesos
mitognicos. Cuando las clulas no se someten a ningn estmulo, Akt/PKB se localiza en el
citoplasma y bajo el estmulo de insulina, la enzima se transloca hacia la membrana plasmtica
(MP), donde se une a PIP2 y PIP3 (Kohn et al., 1996; LeRoith and Zick, 2001; Vanhaesebroeck
et al., 2000). Uno de los sustratos de Akt/PKB es la protena Rab-GTPasa (GAP) de 160kDa
(AS160), que participa en la translocacin de GLUT4 en los adipocitos y en clulas de msculo
esqueltico (Sano et al., 2003). Parte de Akt/PKB activa tambin se moviliza hacia el ncleo, por
medio de un mecanismo desconocido, y modula la expresin de genes (Andjelkovick et al., 1997;
Vanhaesebroeck et al., 2000). Los sustratos que son fosforilados directamente por AKT/PKB
incluyen a la glucgeno sintasa cinasa 3 (GSK-3) y a algunos miembros de la familia de factores
de transcripcin Foxo, que son parte importante de la homeostasis de la glucosa dependiente de
insulina. En la Fig. 1 se muestran esquemticamente las reacciones de la va de sealizacin de
insulina (Tirosh et al., 2000).
Adems de la va de sealizacin ya descrita, existe una segunda va independiente de PI3K, en
la cual participan las protenas c-Cbl (producto de un proto-oncogene), CAP (protena que une
c-Cbl) y la GTPasa TC10 que forman un complejo para regular la movilizacin de GLUT4,
con incremento en la incorporacin de glucosa (Saltiel and Pessin, 2002), aparentemente esta
va es especfica de los adipocitos.
Fig. 1. Representacin esquemtica de la va de sealizacin de insulina como se detalla en el texto. La

unin de insulina al IR activa PI3K a travs de IRS-1. PDK media la activacin de Akt/PKB, que regula
la incorporacin de glucosa al interior de la clula por medio de la translocacin de GLUT4 hacia la MP.
En la ltima etapa interviene un complejo de protenas, compuesto por v-SNARE, Rab4 y sintaxina 4,
entre otras, que se unen a las vesculas que contienen GLUT4. Las flechas indican los sitios que pueden
alterarse en estados de obesidad y diabetes. (Figura modificada de Tirosh at al., 2000)
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Tabla 1. Localizacin y funcin de transportadores de glucosa

Transportador
Tejido
Funcin

Todos los tejidos, especialmente

GLUT 1
eritrocitos y encfalo.

Captacin basal de glucosa;

transporte a travs de la barrera
hematoenceflica.

Clulas b del pncreas, hgado

GLUT 2
rin e intestino.

Regulacin de la liberacin de
insulina y otros aspectos de la
homeostasis de la glucosa.

GLUT 3

Captacin en neuronas y en
otros tejidos.
Encfalo, rin, placenta y otros

Tejidos.

GLUT 4
Msculo y tejido adiposo.

Captacin de glucosa mediata

por insulina.
Absorcin intestinal de fructosa.
GLUT 5
Intestino y rin.
(Katzung, 1999)
La insulina mantiene la homeostasis de la glucosa, principalmente por estimulacin de la

incorporacin de glucosa en msculo esqueltico y en tejido adiposo, mediante un proceso en
el que participa GLUT4. Se sabe que el transportador se moviliza o recicla, hacia, y desde,
la membrana plasmtica (MP), por medio de un mecanismo parecido a la exocitosis de las
vesculas sinpticas, las cuales se reforman despus de la liberacin del neurotransmisor. La
resistencia a la insulina, particularmente en msculo esqueltico, se asocia con una insuficiente
movilizacin de GLUT4 hacia la MP, a pesar de que la expresin de GLUT4 es normal
(Bjrnholm and Zierat, 2005).
Regulacin de la translocacin de GLUT-4
La entrada de glucosa a las clulas se lleva a cabo por un transporte pasivo, mediante protenas
transportadoras que se encuentran en la membrana celular, la glucosa se une al transportador
en la parte orientada hacia el exterior de la clula, se modifica la conformacin de la protena,
lo cual permite que la glucosa se libere hacia el interior de la clula. Se conocen varios tipos
de transportadores de glucosa (GLUT). Estos transportadores son el producto de distintos
genes, su localizacin en diversos tejidos y su funcin se muestran en la Tabla 1. La isoforma
predominante en el msculo esqueltico y en el tejido adiposo es GLUT4 (Tirosh et al., 2000).
Despus de la estimulacin con insulina, los trasportadores GLUT-1, pero ms eficientemente
GLUT-4, se translocan desde vesculas que almacenan GLUT4 (GSV) hasta las pozas que se
localizan en la membrana celular interna, incrementando as el transporte de glucosa. Los
dos trasportadores pasan a diferentes pozas de la membrana. Su cintica de reciclamiento
y de regulacin, es diferente, mientras que GLUT1 se recicla predominantemente, en los
endosomas, GLUT4 se puede distribuir, en por lo menos dos sitios distintos, el principal
es GVS. En el proceso participan varias protenas, cuya funcin es facilitar la movilizacin
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del trasportador hacia la membrana celular, entre ellas se encuentran: VAMP2 (protena de
fusin 2, sensible a N-etilmaleimida y asociada a vesculas), SNAP (protenas de unin NFS
soluble), VAMP2 se une a receptores SNAP o SNAREs. Algunas protenas de la familia de
sinaptobrevina se encuentran asociadas con las vesculas que contienen GLUT4 y actan como
v-SNARES (SNARES vesiculares). La insulina favorece la formacin de un complejo entre
GLUT4, v-SNARES, NSF, SNAP y sintaxina-4. La v-SNARE se requiere exclusivamente
para la fusin de GLUT4 con la membrana durante la estimulacin con insulina, pero no
en condiciones basales (sin estmulo de insulina). El proceso es ms complejo e involucra a
protenas de la familia Rab, de bajo peso molecular, que unen GTP, y tambin requiere de la
remocin de una protena de fusin denominada Munc18c, la cual, en condiciones basales
bloquea la participacin de sintaxina-4 (Dugani and Klip, 2005).
Alteraciones en la sealizacin de la insulina
Varios de los sustratos que participan en la va de sealizacin de la insulina pueden
presentar alteraciones en la DT2 y en la obesidad, por los resultados con clulas en cultivo y
con ratones transgnicos, se sabe que los ms susceptibles son los IRS, ya que las respuestas
a la insulina se modifican por la presencia de hormonas contra-reguladoras y de citocinas
pro-inflamatorias, que modulan la fosforilacin en residuos de Tyr y de Ser de IRS-1 y 2.
El aumento en la fosforilacin de IRS-1 se presenta despus de que las clulas se tratan con
activadores de PKC, con inhibidores de la Ser/Thr fosfatasa como el okadato, con el factor
de crecimiento derivado de plaquetas, y con TNF- y otras citocinas que activan las vas de
estrs ( LeRoith and Zick, 2001).
En la obesidad y en diabetes se han observado alteraciones en la actividad de las cinasas que
participan en la va de sealizacin de la insulina. En la resistencia a la accin de la insulina
se modifican los mecanismos de activacin de PKC atpicas, principalmente en msculo. En
el hgado, la activacin de PKCs, depende de IRS-2/PI3K ms que de IRS1/PI3K, en este
caso la activacin de IRS-2/PI3K y de PKC se mantienen normales en estados de obesidad,
diabetes y bajo dietas ricas en grasa. Lo anterior explica el aumento de sntesis de lpidos
dependiente de PKC, mientras que el metabolismo de glucosa dependiente de PKB est
disminuido (LeRoith and Zick, 2001).
La terminacin de la sealizacin de la insulina est compuesta por una red de mltiples cambios y
es crtica para mantener el control metablico. La endocitosis del IR y la disociacin del complejo
ligando-receptor, as como su posterior degradacin, permiten regular la cascada de reacciones
en etapas muy tempranas. En los mecanismos de terminacin de la seal, pueden participar
serina/treonina cinasas y tirosina fosfatasas. Estas ltimas se pueden activar desde el inicio de
la va, por medio de su interaccin con IRS-1-Tyr-fosforilado, una de las ms importantes es
la protena-tirosina-fosfatasa 1B (PTP1B). En los ratones a los que les falta el gen de PTP1B se
incrementa su sensibilidad a la insulina y no desarrollan RI cuando se someten a una dieta alta
en grasas. Adems, en los ratones diabticos, cuando se inhibe la actividad de PTP1B por medio
de la aplicacin de oligonucletidos antisentido, que son especficos para PTP1B, se mejora
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la sensibilidad a insulina y el control de la glicemia. En ensayos de fosforilacin in vitro, se ha

demostrado que el IRS-1 es sustrato de Serina/Treonina cinasas, que incluyen a PKC, glucgeno
sintasa cinasa 3 (GSK3) y cinasa dependiente de seales externas (ERK), lo cual sugiere que estas
enzimas son importantes para las seales de terminacin. Si estas seales se sobreactivan pueden
alterar las funciones de la insulina (Zinker et al., 2005).
Como se mencion anteriormente, la resistencia a la insulina consiste en el bloqueo de las
acciones de la hormona en sus tejidos blanco. El concepto de resistencia a la Insulina debe
aplicarse a cualquiera de las acciones biolgicas de la insulina, que incluyen su efecto sobre el
metabolismo de los lpidos y de las protenas, la funcin del endotelio vascular y la expresin
gentica.
La resistencia a la insulina se puede presentar a travs de los siguientes mecanismos:
Defecto de captacin y utilizacin de glucosa, por bloqueo del transporte y/o
fosforilacin intracelular de glucosa
Reduccin de la movilizacin de GLUT-4
Disminucin en la sensibilidad a la insulina por la presencia del factor de necrosis
tumoral tipo alfa (TNF-)
Aumento en la resistencia a la insulina debido a la hiperglicemia crnica y/o presencia
de cidos grasos libres
Participacin de componentes genticos
En los humanos, las mutaciones en IRS-1 son poco frecuentes y estn asociadas con RI
(Whitehead et al., 1998)) y en los ratones la modificacin del gene de IRS-1 provoca RI
principalmente en msculo y en tejido adiposo (Yamauchi et al., 1996). Los ratones knockout
presentan adems de RI en msculo, hgado y tejido graso, desarrollan diabetes como resultado
de la alteracin en las clulas beta del pncreas (Previs et al., 2000). Existen resultados que
asocian la disfuncin de IRS-1 en msculo esqueltico, con las protenas expresadas y liberadas
por los adipocitos, y la lipotoxicidad. Por ejemplo, los cidos grasos libres (AGL) y la adipocina
TNF- pueden incrementar la fosforilacin de las protenas IRS en residuos, provocando as
la alteracin en la transduccin de la sealizacin de insulina (White et al., 2002). Adems.
El estmulo prolongado con insulina, como la que presentan los pacientes diabticos con
hiperinsulinemia, puede provocar la degradacin de IRS (Rui et al., 2001).
El tejido adiposo y sus efectos sobre la sealizacin de la insulina
El papel del tejido adiposo (TA), tanto en la obesidad como en la lipodistrofia se presenta
resistencia a la insulina en msculo. Actualmente se acepta que tanto la diabetes como la
obesidad cursan con inflamacin crnica. La grasa puede influir sobre la homeostasis de la
glucosa, ya que la RI se puede revertir por medio del transplante de tejido adiposo. Cuando se
elimina el gen de GLUT4 en el tejido adiposo de ratn, se provoca resistencia a insulina en el
msculo y en el hgado.
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En la DT2 aumenta la concentracin de glucosa sangunea o hiperglucemia, que genera un

estado de glucotoxicidad, el cual produce procesos inflamatorios, acelerando las complicaciones
de la DT2, que afectan ojos, riones, nervios y vasos sanguneos, por mecanismos que an no
son claros. Como ya se mencion, el estado inflamatorio se manifiesta por presentar altos
niveles de citocinas pro-inflamatorias y menor cantidad de citocinas anti-inflamatorias.
El tejido adiposo tambin contribuye a exacerbar la RI, ya que ahora se sabe que no solamente
aporta cidos grasos libres, sino tambin contribuye el estado inflamatorio por el aporte
de citocinas, denominadas especficamente adipocinas, las principales adipocinas proinflamatorias son: el factor de necrosis tumoral alfa (TNF), la interleucina (IL) 6 y resistina,
cuyas concentraciones plasmticas se elevan en la RI, obesidad y diabetes. En condiciones
normales, la adiponectina, adipocina anti-inflamatoria y anti-aterognica, est incrementada.
Otra de las adipocinas, la leptina, tiene una funcin importante en la regulacin de la ingesta
de alimento, el peso corporal, el gasto energtico y las funciones neuroendcrinas. Resulta
paradjico que la leptina est sobre expresada en el tejido adiposo de la mayora de los
pacientes obesos, lo que ha llevado al desarrollo del concepto de la resistencia a la leptina,
misma que se considera causa de las complicaciones cardiovasculares en la obesidad. Por otra
parte, la leptina sensibiliza la accin de la insulina, promoviendo la oxidacin de cidos grasos
libres y la reduccin de grasa ectpica en tejidos no adiposos (Fig. 2) (Snchez-Muoz et al.,
2005; Bugianesi, 2005)
Por otro lado, la acumulacin de cidos grasos libres (AGL) altera el metabolismo de la glucosa
y la sensibilidad a insulina en el hgado y en el msculo. Los tratamientos con metformina y
TZD pueden reducir la RI en hgado y tejidos perifricos, respectivamente.
Fig. 2. Efecto de las adipocinas sobre la sensibilidad a la insulina, la ingesta de alimento, la inflamacin,
y el sistema vascular. Los signos indican el tipo de regulacin (positiva o negativa) que ejercen las
adipocinas. Inhibidor 1 del activador del plasmingeno (PAI-1); protena estimuladora de acilacin
(ASP); factor de necrosis tumoral alfa (TNF-); interleucina 6 (IL-6). (Figura tomada de Snchez-Muoz
et al., 2005).
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La produccin de especies reactivas de oxgeno (ERO), tales como: perxido de hidrgeno

y radicales superxido e hidroxilo se encuentran en concentraciones elevadas en la DT2,
provocando disminucin de la actividad del sistema de defensa antioxidante y por la generacin
de radicales libres, se deterioran estructuras celulares y se alteran funciones fisiolgicas. Estas
anomalas determinan que el paciente diabtico experimente dao endotelial vascular, pierda
el control del tono vascular y presente hipertensin, entre otros efectos, bajo estas condiciones
se acelera su dao orgnico (Kumar y Elbein, 2006; Wrigth et al., 2006).
Tanto el aumento de los AGL, como de ERO conducen a la activacin, del factor de necrosis
tumoral B (NF-B) que es un factor de transcripcin que regula la expresin de citocinas
pro-inflamatorias, y por otra parte los AGL y ERO activan algunas isoformas de PKC, que
promueven la fosforilacin del IRS-1 en residuos de Ser y disminuyen la fosforilacin en Tyr,
afectando por este mecanismo la va de sealizacin de insulina, lo que lleva a disminuir el
trasporte de glucosa y su acumulacin en la sangre, este ltimo efecto tambin se favorece
debido a que los AGL afectan la actividad de la hexocinasa, en estas circunstancias se presenta
resistencia a insulina (Wellen et al., 2003) (Fig.3).
Como podemos observar existen diversos factores que intervienen en el buen funcionamiento
de la va de sealizacin de la insulina. Las alteraciones en la ingesta de alimentos, la falta
de ejercicio fsico, pueden conducir a presentar sobrepeso u obesidad, si adems existen
alteraciones genticas, en su conjunto pueden favorecer estados de resistencia a la insulina
y finalmente la diabetes. El reto en los prximos aos es incidir en las modificaciones en los
estilos de vida y por nuestra parte en un mayor conocimiento de los mecanismos que participan
Fig. 3. Efecto del incremento en la concentracin de triglicridos, y de las especies reactivas de oxgeno
sobre la sealizacin de la insulina. El diacilglerol (DAG) se incrementa debido a la presencia de altas
concentraciones de cidos grasos libres. El DAG estimula la va pro-inflamatoria regulada por el factor
de transcripcin NF-B y tambin favorece la activacin de isoformas de la PKC. Tambin disminuye la
utilizacin de glucosa, y bajo estas condiciones se presenta la resistencia a la insulina.
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en estos padecimientos, as como crear frmacos ms efectivos para prevenir la enfermedad,

y sus complicaciones.
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Carcinomas cerebrales, principios y

mecanismos bioqumicos
Introduccin
Las neoplasias son secundarias a ms de 200 variedades diferentes de alteraciones que
producen un crecimiento anormal de las clulas, que se convierten en masas de tejidos
llamados tumores. Se puede definir como una alteracin que se caracteriza por una divisin y
crecimiento celular descontrolado.
Bsicamente, hay dos tipos de tumores:
Benignos o no cancerosos
Malignos o cancerosos
Los tumores benignos tienen seis caractersticas principales:
Slo crecen hasta un determinado tamao.
Normalmente no crecen muy rpido.
No destruyen clulas normales.
No se propagan al tejido que les rodea.
Normalmente no producen efectos secundarios graves.
Por lo general crecen de una manera ordenada.
Los tumores benignos desde el punto de vista histolgico pueden tener un comportamiento
biolgico maligno dependiendo del sitio donde estn localizados por ejemplo los tumores
cerebrales al crecer comprimen tejido circundantes causando la muerte del tejido e incluso de
la persona.
Los tumores malignos se conocen por su capacidad para invadir y destruir tejidos y rganos,
tanto los que estn cerca como los que estn lejos del tumor original. La muerte se produce
cuando la propagacin del cncer daa de tal manera los tejidos y los rganos vitales, que no
pueden funcionar.
Las clulas del cncer atacan el tejido sano y nunca dejan de multiplicarse. El cncer tiene un
comportamiento distinto en cada persona, segn su tipo. Puede darse a cualquier edad, pero
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Carcinomas cerebrales
es ms probable que afecte a personas de edad avanzada; por lo general a partir de los 55 aos.
El cncer tambin puede presentarse en nios, y de hecho, es la segunda causa principal de
muerte en nios de edades comprendidas entre 1 y 15 aos. (Becker, 1975)
Clasificacin Tumores Malignos
El cncer, que puede originarse a partir de cualquier tipo de clula y en cualquier tejido
corporal. Se clasifica como:
Carcinomas. Estos se originan de las clulas del epitelio de recubrimiento de un rgano.
Los carcinomas constituyen el tipo ms comn de cncer. Lugares comunes de carcinomas son
la piel, la boca, el pulmn, las glndulas mamarias, prstata, estmago, intestino delgado,
colon y tero.
Sarcomas. Los sarcomas son cnceres del tejido conectivo y de sostn (tejidos blandos) de
todos los tipos. Los sarcomas se encuentran en cualquier parte del cuerpo y se diseminan a
travs de vasos por lo cual son frecuentes las metstasis en hgado, pulmones, etc.
Teratoma. Tumor constituido por diferentes clases de tejidos, ninguno de los cuales se
presentan normalmente juntos o en el sitio del tumor. Estos pueden ser de elementos bien
diferenciados, inmaduros, o tener focos de transformacin maligna.
La propagacin del cncer a otros sitios u rganos en el cuerpo mediante el flujo sanguneo o
el sistema linftico se llama metstasis
Tratamiento del cncer
Se fundamenta en tres pilares bsicos: ciruga, quimioterapia y radioterapia.
Existe un cuarto pilar llamado terapia biolgica que incluira la hormonoterapia,
inmunoterapia, y nuevas terapias no citotxicas.
El tratamiento del cncer es multidisciplinario
Si el cncer est confinado a un slo lugar, el objetivo del tratamiento generalmente
es la extirpacin quirrgica del tumor y la curacin. Si el tumor se ha diseminado
nicamente a ganglios linfticos locales, estos pueden tambin algunas veces
extirparse.
Si el cncer no se puede extirpar en su totalidad quirrgicamente, entonces las
opciones de tratamiento son la radiacin, la quimioterapia o ambas.
En algunos pacientes es necesario realizar una combinacin de ciruga, radiacin y
quimioterapia.
En contraste, el linfoma con frecuencia se trata con quimioterapia y radioterapia, y
rara vez con ciruga.
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Cncer en Cerebro
Comnmente, el cncer de cerebro es una consecuencia de la propagacin (metstasis) de otro
cncer que surge en alguna otra parte del cuerpo, en especial el pulmn, glndulas mamarias,
rin y prstata. Solo un 20 por ciento de todos los cnceres son primarios del sistema nervioso
central. Los tumores cerebrales crecen dentro del crneo, presionando el tejido y las estructuras
del cerebro. Este corte muestra el efecto de un tumor en el cerebro.
El tratamiento de cncer cerebral depende de:
Tamao
Localizacin
Tipo

El tratamiento se fundamenta en:
Ciruga
Quimioterapia
Radioterapia
Quimioterapia del cncer
El trmino quimioterapia suele reservarse para los frmacos empleados en el tratamiento
de las enfermedades neoplsicas que tienen como funcin el impedir la reproduccin de
las clulas cancerosas.
La terapia antineoplsica tiene una gran limitacin, que es su escasa especificidad. El
mecanismo de accin es provocar una alteracin celular ya sea en la sntesis de cidos
nucleicos, divisin celular o sntesis de protenas. La accin de los diferentes citostticos
vara segn la dosis a la que se administre.
Debido a su no- especificidad afecta a otras clulas y tejidos normales del organismo, sobre
todo si se encuentran en divisin activa.
La quimioterapia es la utilizacin de diversos frmacos que tiene la propiedad de interferir
con el ciclo celular, ocasionando la destruccin de clulas.
Existen ms de 200 frmacos antineoplsicos que se suelen usar en combinacin:
Agentes alquilantes: su mecanismo de accin general, es el dao inducido al ADN
celular (tanto neoplsico como sano) al incorporar grupos alquilo, y de esta manera alterar
o evitar la duplicacin celular. Ejemplos: clorambucil, melfalan, cisplatino, carboplatino.
Son eficaces en el tratamiento de leucemias crnicas, linfomas no Hodgkin, as como
para quienes padecen la enfermedad de Hodgkin, mieloma mltiple y ciertos tumores de
pulmn, mama y ovario. Nitrosureas (carmustina o lomustina, por ejemplo): este segundo
grupo de frmacos acta de forma similar a los agentes alquilantes, entorpeciendo la
actividad de las enzimas encargadas de reparar el ADN. Se emplean generalmente en el
tratamiento de tumores cerebrales o de melanomas malignos
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Antimetabolitos: se trata de agentes que se combinan con el ADN celular para modificar
la estuctura de las clulas, de manera que estas mueren al no poder seguir reproducindose
normalmente. Este tipo de frmacos, entre los que se incluyen, por ejemplo el metroxato,
se administra a enfermos que padecen tumores de mama, ovario o bien en el tracto
gastrointestinal y tambin a pacientes que padecen leucemia crnica.
Antibiticos antitumorales doxorubicina, mitoxantrona, etc): no funcionan
igual que los antibiticos empleados en el caso de infecciones, sino que por su mecanismo
de accin alteran la membrana que rodea a las clulas y bloquean el proceso por el que las
clulas se multiplican
Inhibidores mitticos: desde el paclitaxel hasta el docetaxel (Thomson, 2006), estas
sustancias derivan de productos naturales y son capaces de frenar el proceso de reproduccin
celular as como la accin de las enzimas responsables de la reproduccin celular.
Inmunoterapia: en este grupo se incluyen todos aquellos medicamentos capaces de
estimular el sistema inmune del propio paciente para que ste sea capaz de reconocer y
combatir las clulas enfermas. Algunos expertos los consideran una forma diferente de
tratamiento al margen de la quimioterapia. La primera evidencia de inmunoterapia data
de principios del siglo XXI, cuando William Cloey, un cirujano neoyorquino apreci una
regresin espontnea del sarcoma entre aquellos de sus pacientes que haban padecido
previamente una infeccin bacteriana.
Efectos secundarios de la quimioterapia
Deterioro fsico severo de los pacientes
El tratamiento quimioterpico puede deteriorar fsicamente a los pacientes con cncer. Los
agentes quimioterpicos destruyen tambin las clulas normales sobre todo las que se dividen
ms rpidamente, por lo que los efectos secundarios estn relacionados con estas clulas que
se destruyen (Chu et al, 2002). Los efectos secundarios dependen del agente quimioterpico y
los ms importantes son:
Alopecia o cada del cabello: Es el efecto secundario ms visible debido al cambio de imagen
corporal y que ms afecta psicolgicamente a los enfermos, sobre todo a las mujeres. Sin
embargo este depende de la cantidad e intensidad de la dosis y no ocurre en todos los casos.
Pero de 4 a 6 semanas el cabello vuelve a crecer.
Nuseas y vmitos: Pueden aliviarse con antiemticos como la metoclopramida o mejor
con antagonistas de los receptores tipo 3 de la serotonina como dolasetron, granisetron
y ondansetron. Algunos estudios y grupos de pacientes manifiestan que el uso de
cannabinoides derivados de la marihuana durante la quimioterapia reduce de forma
importante las nuseas y los vmitos ya que aumenta el apetito.
Diarrea o estreimiento.
Anemia: Debido a la destruccin de la mdula sea, que disminuye el nmero de glbulos
rojos al igual que la inmunodepresin y hemorragia. A veces hay que recurrir a la transfusin
de sangre o a la administracin de eritropoyetina para mitigar la anemia.
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Inmunodepresin: Prcticamente todos los regmenes de quimioterapia pueden provocar

una disminucin de la efectividad del sistema inmune, como la neutropenia que puede
conducir a la infeccin, a la sepsis y a la muerte si no se detecta y trata a tiempo. La
neutropenia se puede solucionar con la administracin de [factor de crecimiento de
colonias de granulocitos] (G-CSF del ingls granulocyte-colony stimulating factor) como el
filgastrim.
Hemorragia: Debido a la disminucin de plaquetas por destruccin de la mdula sea.
Tumores secundarios
Cardiotoxicidad: La quimioterapia aumenta el riesgo de enfermedades cardiovasculares
(ejemplo: adriamicina).
Hepatotoxicidad
Nefrotoxicidad
Sndrome de lisis tumoral: Ocurre con la destruccin por la quimioterapia de las clulas
malignas de grandes tumores como los linfomas. Este grave y mortal efecto secundario se
previene al inicio del tratamiento con diversas medidas teraputicas.
En resumen el mecanismo de accin de la mayora de los frmacos utilizados en el tratamiento
del cncer es provocar una alteracin en el ciclo celular ya sea en la sntesis de cidos nucleicos,
divisin celular o sntesis de protenas; por lo tanto el conocimiento y estudio del ciclo celular
es bsico para el desarrollo de nuevos frmacos anticancergenos.
El Ciclo Celular Eucariota engloba las siguientes secuencias

Crecimiento

Replicacin del ADN

Mitosis

Nuevo proceso de crecimiento
Comenzando a partir de la citocinesis la clula hija resulta pequea y posee un bajo contenido
de ATP resultante del gasto experimentado en el ciclo anterior. La acumulacin del ATP
necesario y el incremento de tamao acontecen durante el intervalo (en ingls: gap) G1 de la
interfase, la parte ms larga del ciclo celular. Cuando adquiere el tamao suficiente y el ATP
necesario comienza la fase S, la clula sintetiza ADN (replicacin del ADN) proceso que da
como resultado final un original y una copia del ADN, destinadas a las dos clulas que se
originan del proceso. Dado que el proceso de sntesis consume una gran cantidad de energa
la clula entra nuevamente en un proceso de crecimiento y adquisicin de ATP la fase G2. La
energa adquirida durante la fase G2 se utiliza para el proceso de mitosis.
La regulacin del ciclo ocurre de diferentes formas en las distintas clulas. Algunas se dividen
rpidamente, otras como la mayor parte de las clulas nerviosas pierden la capacidad de
dividirse una vez que llegan a la madurez. Algunas, como las clulas hepticas, conservan,
aunque no la utilizan, su capacidad de divisin. Las clulas del hgado se dividen si se remueve
parte del hgado y su divisin contina hasta que el hgado retorna a su tamao normal (Alberts
et al, 2004).
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Factores ambientales tales como cambios en la temperatura y el pH, disminucin de los niveles
de nutrientes llevan a la disminucin de la velocidad de divisin celular. Cuando las clulas
detienen su divisin generalmente lo hacen en una fase tarda de la G1 denominado el punto
R (por restriccin).
Las clulas normales se reproducen en respuesta a una cascada de seales que les envan los
factores de crecimiento externo y detienen su divisin en respuesta a factores inhibidores que,
obviamente, actan tambin por medio de una cascada de seales.
Para programar estos sucesos el reloj del ciclo celular se vale de diversas molculas proteicas.
Los dos engranajes moleculares de este reloj son
Las ciclinas
Las quinasas (las CDK)
Estos engranajes se asocian entre s e inician los movimientos que llevan a iniciar los
diferentes estadios del ciclo celular. Por ejemplo en la G1 temprana las ciclinas del tipo D se
unen a la CDK4 o CDK6 y el complejo resultante libera el freno que impeda la progresin
hacia la G1 tarda y, por lo tanto, el pase a la fase S (el complejo ciclina D- CDK4/6 desarma
un potente inhibidor de la progresin del ciclo: el formado por la protena pRB y los factores
de transcripcin inactivos).
La progresin del ciclo depende en gran medida de que se alcancen niveles elevados de ciclinas,
a saber en la siguiente secuencia (Lodish et al, 2005):
Ciclina D
Ciclina E
Ciclina A
Ciclina B
Un instante crucial del ciclo es el que ocurre en el punto R (por restrictivo) de la fase G1
momento en el cual la clula decide si debe o no avanzar en la prosecucin del ciclo. La llave
de este paso es un conmutador molecular que pasa de apagado a encendido.
Las ciclinas D y E aumentan su nivel
A medida que sube el nivel de las ciclinas, las mismas se combinan con quinasas dependientes
de ciclinas (es decir enzimas fosforilantes cuya actividad depende de los niveles de ciclinas).
Las quinasas activas transfieren fosfatos del ATP a la protena pRB (el freno del ciclo celular)
Si la pRB no est fosforilada secuestra (es decir permanece unida) a otras protenas claves
para la prosecucin del ciclo: los factores de transcripcin, en otras palabras, mantiene la llave
en apagado.
Cuando el complejo ciclina-quinasa aade suficientes fosfatos a la pRB, la misma libera los
factores de transcripcin que actan sobre los genes
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Los genes estimulados producen protenas necesarias para que avance el ciclo celular
El esquema muestra las mltiples interacciones moleculares en el curso del ciclo celular.
Ms all del punto R se observa los cambios que ocurren para mantener el conmutador en
encendido.
Por otra parte, diversas protenas reprimen el ciclo al actuar como inhibidores.
Las protenas p15 y p16 bloquean la actividad del complejo CDK-ciclina D (recuerde que esta
quinasa en su forma activa activa la pRB) impiden que el ciclo progrese de G1 a S.
Otro inhibidor de CDK, la protena p21 acta a lo largo de todo el ciclo celular
La p21 est bajo el control de la denominada:
protena supresora de tumores denominada p53, que entre sus mltiples efectos pueden
mencionarse:
Control de la integridad del ADN
Terminacin correcta de las diferentes fase del ciclo
Detencin del crecimiento celular (duplicacin celular) o senescencia
Puesta en marcha del suicidio celular o apoptosis, cuando existe dao en el ADN o los sistemas
de control se desregulan.
Figura 1. Ciclo celular

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Genes supresores de tumores

Los genes supresores de tumores regulan negativamente el ciclo. Se encargan de que la mitosis
no contine si se ha producido una alteracin del proceso normal.
Entre estos genes, tambin llamados de verificacin, se encuentran los que codifican:
productos que evitan mutaciones de genes reguladores del ciclo
protenas que inactivan las CDK por fosforilacin/desfosforilacin (ej. quinasa WEE1,
fosfatasa CDC25)
protenas CKI inhibidoras del ciclo (ej. p53, p21, p16)
protena Rb (retinoblastoma), cuya alteracin gnica recesiva causa el cncer de retina con ese
nombre.
protenas que inducen la salida del ciclo hacia un estado celular diferenciado o hacia apoptosis
(ej. Bad, Bax, Bak, receptor de ligando de Fas)
La verificacin se lleva a cabo en los puntos de control y asegura la fidelidad de la replicacin
y segregacin del genoma. Algunos componentes, adems de detectar fallos, pueden poner en
marcha la reparacin.
Algunos oncgenos y agentes supresores de tumor pueden alentar o prever apoptosis (Bruce
et al, 2000).
Puntos de control
Existen puntos de control en el ciclo que aseguran la progresin sin fallos de ste:
Punto de control de DNA no replicado, en la entrada de fase M. Acta inhibiendo a Cdc25, el
cual es un activador de la Ciclina A/B Cdk1.
Punto de control de ensamblaje del huso, antes de la telofase. Se activa una protena Mad2
que impide la degradacin de la segurina, lo que impide la segregacin de las cromtidas
hermanas.
Punto de control de la separacin de cromosomas, al final de la mitosis. En el caso de que fuera
incorrecto, se impedira la degradacin de la ciclina B por APC.
Punto de control del dao del DNA, en G1, S o G2. El dao celular activa a p53, protena
que favorece la reparacin del DNA, detiene el ciclo promoviendo la transcripcin de p21,
inhibidor de Cdk, y, en el caso de que todo falle, estimula la apoptosis (Nelson et al, 2000).
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Para que la clula se transforme en neoplsica se requieren, al menos, 2 mutaciones: una en

un gen supresor de tumores y otra en un protooncogn, que d lugar, entonces, a un oncogn
(Eastman, 2003).
Nanomedicina aplicada a Tumores
La nanotecnologa es un campo de las ciencias aplicadas dedicada al control y manipulacin de
la materia a una escala menor que un micrmetro, es decir, a nivel de tomos y molculas. La
aplicacin de la nanotecnologa en medicina (nanomedicina) es un campo multidisciplinario
que implica el diseo de materiales con propiedades especficas que interaccionan en el cuerpo
a nivel celular con una alta especificidad (Sahoo et al, 2007 y Liu et al, 2007). De particular
inters es en el rea de investigacin en cncer (Kim, 2007). En la actualidad como se ha
indicado los quimioteraputicos son txicos tanto para el tumor como para las clulas normales,
por lo tanto en muchos casos la eficacia de los quimioteraputicos est limitada a los efectos
secundarios del frmaco (Brigger et al, 2002). El desarrollo de estructuras prediseadas para la
liberacin controlada a nivel nanomtrico como pueden ser dendrmeros (polmeros esfricos
ramificados), micelas de slica recubiertas, nanopartculas de cermicos (Lpez et al, 2007),
liposomas, etc. (Radozs, 2007 y Oh, 2006) que pueden ser funcionalizadas para ser especficas
hacia clulas cancergenas y por lo tanto tengan un incremento de selectividad, esto es que los
frmacos acten en las clulas cancergenas lo cual implicara una reduccin en la toxicidad
hacia tejido normal (Couzin, 2002 y LaVan et al, 2003). En esta rea la nanotecnologa
cambiar radicalmente la manera de hacer el diagnstico, tratamiento y prevencin. El glioma
es el tumor primario ms frecuente de cerebro, los gliomas malignos estn asociados con un
mal pronstico, el promedio de sobrevida de pacientes con glioblastoma mltiple (GMB) es de
1 ao (Arrieta et al, 2005). Estos tumores inoculados en animales de laboratorio es un modelo
comn para el estudio experimental en oncologa (Peterson et al, 1994). Se han sintetizado
nanopartulas de xido de titanio que contienen complejos de platino por medio del mtodo
sol-gel; las especies de platino estn qumicamente unidas a las nanopartculas de xido de
titanio, el tratamiento con estas nanopartculas de xido de titanio-platino en ratas a las cuales
se les inocul glioglastoma mltiple es muy alentador ya que se obtuvo una reduccin en el
crecimiento de los tumores de un 56%, adems muestran un efecto sinrgico entre el xido de
titanio y el complejo de platino (Lpez, et al 2008).
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Enfermedades neurodegenerativas.
Introduccin
Los avances en gentica molecular han abierto grandes esperanzan en el estudio de enfermedades
neurodegenerativas (EN), entre los 35000 genes del genoma humano, muchos de ellos van a
codificar protenas expresadas solamente en el sistema nervioso, tambin muchos genes van a
codificar protenas que se expresan, con diferentes grados, en distintos tipos de neuronas, de
esta manera, ciertas poblaciones neuronales van a ser especialmente vulnerables a los cambios
originados por variaciones genticas por factores ambientales o por la combinacin de ambos.
Actualmente est claro que son consecuencias de anormalidades en el proceso de ciertas
protenas, de aqu el nombre de proteopatas, que al acumularse en el tejido nervioso dentro y
fuera de las neuronas, produce manifestaciones clnicas.
En todas las enfermedades neurodegenerativas, se presenta por lo menos algn tipo de proceso
anormal de las protenas neuronales, que pueden ser (Praag et al., 1999, Sohal RS 1996):
Plegamiento anormal de protenas
Alteraciones en las modificaciones post-traduccionales de protenas nuevamente
sintetizadas.
Anormalidades en el proceso proteoltico.
Anomalas en los genes que intervienen en el acoplamiento de corte y empalme (splicing
alternativo).
Expresin impropia
Reduccin de aclaracin de las protenas degradas.
Por lo se infiere que deduce que las protenas procesadas defectuosamente, fcilmente se
acumulan cuando se convierten en ineficaces los mecanismos para su eliminacin, y por ende,
cuando se procesan mal, alteran su funcionamiento de las diferentes neuronas y por lo tanto
se manifiesta su enfermedad. Son procesos crnicos y progresivos que se caracterizan por la
prdida selectiva y simtrica de neuronas en los sistemas motor sensorial y cognitivo.
De acuerdo a la caracterstica de la delimitacin de los marcadores celulares especficos de la
enfermedad, ha permitido la clasificacin nosolgica de estas enfermedades de la siguiente
manera:
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Enfermedades neurodegenerativas
En cuanto a la predisposicin gentica existen algunas como la enfermedad de Huntington,

donde es marcada la tendencia familiar, mientras que el Alzheimer, Parkinson y la esclerosis,
solo del 1 al 10% de los casos son hereditarios. En los ltimos aos se han incrementado
los estudios relacionados con el envejecimiento tisular, principalmente en las enfermedades
neurodegenerativas. Dichas patogenias estn basadas por reacciones que estn mediadas por
los llamados radicales libres o especies reactivas de oxgeno.
Enfermedad de Parkinson (EP)
Clnicamente se caracteriza por la presencia de bradicinesia, rigidez, temblor y a nivel
neuronal por la prdida de las neuronas monoaminorgicas del tronco cerebral, de manera
significativa en la sustancia negra y el locus coeruleus, que estn relacionadas por una
disminucin significativa de los niveles de dopamina (DA) y de sus metabolitos tales como los
cidos 3,4-dihidroxifenilactico (DOPAC) y el homovanlico (AHV), cuando se presentan los
sntomas, ya se ha establecido una prdida neuronal mnima del 80% en la sustancia negra
compacta. Presencia de cuerpos de inclusin eosinfilos citoplasmtica, denominados cueros
de Lewy (Shors et al., 2001, Wickelgren et al., 1996).
La etiolga de la EP es desconocida, aunque se ha sugerido que sta podra ser multifactorial,
interviniendo en la misma diversos factores genticos, ambientales y de envejecimiento, sin
embargo, no existen datos que apoyen alguno de estos factores como nico responsable, e
incluso se ha sugerido la posibilidad de que en el trmino EP se designen varias enfermedades
diferentes. Los posibles mecanismos patognicos tambin son desconocidos, aunque las
hiptesis ms aceptada en la actualidad incluye la contribucin de los siguientes factores: 1.
Estrs oxidativo, 2. neuromelanina, 3. alteraciones de la funcin mitocondrial, 4. excitotoxicidad
5. dficit de protenas ligadoras de calcio, 6. xido ntrico, 7. dficit de factores trficos, 8.
Citoquinas (Shors et al., 2001).
El descubrimiento de que el derivado piridnico MPTP era capaz de inducir un cuadro
parkinsoniano parecido a la EP, tanto en humanos como en animales, ha ayudado a
comprender algunos de los posibles mecanismos eiopatognicos de dicha enfermedad. El
MPTP es transformado por la monoaminoxidasa B (MAO B) glial en ion MPDP+, compuesto
inestable que se transforma rpidamente en el ion l-metil-4 fenilpiridinio (MPP+), metabolito
responsable de la accin neurotxica. El MPP+ es captado por las neuronas por el mismo
sistema de recaptacin que la dopamina e inhibe el complejo K (NADH-CoQ1 reductasa) de
la cadena respiratoria mitocondrial y el complejo ala-cetoglutarato-deshidrogenasa del ciclo
de Krebs. Como consecuencia se produce una marcada disminucin de la sntesis de ATP y
de glutatin, una alteracin energtica y reduccin del atrapamiento de electrones libres y de
sustancias oxidantes, que conducen a la muerte neuronal. Estas acciones inhibidoras sobre
complejos enzimticos mitocondriales son tambin ejercidas por anlogos endgenos de las
tetrahidroisoquinolinas, que se han implicado en la etiopatogenia de la EP (Luquin et al., 1991,
Maeto et al., 1990, Mizumo et al., 1987).
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Enfermedad de Alzheimer (EA)

Se describi por primera vez en 1907 por Alois Alzheimer, en donde establece los cambios
anatomopatolgicos que consiste en ovillos neurofibrilares y placas seniles o neurotrficas.
Los ovillos neurofribrilares son agregaciones de protena microtubular TAU, que se encuentra
hiperfosforilada. Si se observa al microscopio electrnico, las neurofibrillas de los ovillos
aparecen como filamentos helicoides pareados. Las placas seniles resultan de acumulo de varias
protenas en una reaccin inflamatoria alrededor de los depsitos de la sustancia denominada
-amiloide. En algunas placas neurticas degeneradas se encuentran segmentos de protena
TAU. A medida que las lesiones progresan se pierden neuronas en el hipocampo, en el crtex
enthorrinal y en las reas asociadas del neocortex. Aun todava se discuten si los primeros
cambios corresponden a los ovillos neurofibrilares o a las placas seniles, aunque la mayora se
inclina por las ltimas (Shors et al., 2001; Annunziato et al., 2003).
Estudios efectuados en pacientes mayores de sndrome de Down revelaron la presencia de
ovillos neurofibrilares y placas seniles como en el Alzheimer, lo que sugiri que copias extras
de genes en el cromosoma 21, eran capaces de inducir el espectro patognico de esta ltima
enfermedad neurodegenerativa. El estudio de los depsitos de amiloide en las placas seniles
y en pequeos vasos de la corteza cerebral demostr que contenan un fragmento proteico,
la -amiloide, cuya secuencia en aminocidos suministro las bases para la clonacin del
gen -amiloide. Este gen codifica a una protena de larga cadena polipeptdica de 695-770
aminocidos, denominada protena precursora amiloide, de la que se origina la -amiloide,
fragmento compuesto de 40-42 aminocidos.
Desde el punto de vista neuropatolgico se caracteriza por la prdida progresiva de poblaciones
neuronales, especialmente a nivel de la corteza cerebral e hipocampo, y la presencia de
placas seniles y ovillos neurofibrilares en las regiones afectadas, la atraccin neuroqumica
ms importante es la disminucin de inervacin colinrgica cortical, con disminucin de
inervacin colinrgica cortical, con disminucin de la actividad de colinacetiltransferasa
(Benzi et al., 1995).
La etiologa de la EA es desconocida, aunque podra relacionarse con la interaccin entre
envejecimiento y factores genticos y ambientales. Se ha sugerido que algunos defectos en el
metabolismo energtico y el estrs oxidativo, podran estar implicados en la patogenia de la
muerte neuronal en la EA (Benzi et al., 1995)
Mediante tomografa por emisin de positrones se ha demostrado disminucin de flujo
sanguneo cerebral y de metabolismo de glucosa en la corteza cerebral y de metabolismo
de glucosa en la corteza cerebral de pacientes con EA, que se relaciona con la gravedad de
la demencia. Se ha descrito tambin disminucin de actividad de los complejos enzimticos
piruvato-deshidrogenasa en cerebro y de alfacetoglutarato-deshidrogenasa en cerebro y en
fibroblastos de pacientes con EA (Benzi et al., 1995, McNaught et al., l995).
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Enfermedad de Huntington (EH)

Es la causa ms frecuente de corea (manifestaciones nerviosas) hereditaria. Su herencia es
autonmica dominante, con penetrancia completa, y el defecto gentico es conocido. Desde
el punto de vista clnico, la forma clsica de EH se caracteriza por la presencia de trastornos
del movimiento de los cuales el ms frecuente es la corea-, alteraciones psiquitricas muchas
veces son la primera manifestacin e incluyen cambios de personalidad, depresin-manas,
ilusiones y alucinaciones, paranoia y cuadros esquizofreniformes, etc.-, y demencia, siendo la
edad de comienzo habitual la cuarta dcada (Jimnez-Jimnez et al., 1997).
El hallazgo anatomopatolgico ms caracterstico es la atrofia de neoestriado (sobre todo de
la cabeza del caudado), el cual presenta prdida neuronal (fundamentalmente de neuronas
pequeas espinosas) y glisis. Las alteraciones neuroqumicas ms importantes son la deplecin
de GABA, glutamato-descarboxilasa y acetilcolina en estriado, aunque tambin se han
descrito cambios en las concentraciones de algunos neuropptidos como encefalinas, sustancia
P y enzima convertidora de angiotensina, as como disminucin de receptores de GABA,
benzodiacepinas y acetil colina en caudado y putamen (Jimnez-Jimnez et al., 1997,1998).
La patogenia de la muerte neuronal (tabla l) en la EH es desconocida. La hiptesis ms
aceptada es la neurotxica, segn la cual el dao neuronal sera mediado por aminocidos
excitadores como glutamato y aspartato o por metabolitos endgenos del triptfano como
el cido quinolnico. Tambin se ha sugerido el posible papel de estrs oxidativo y de las
alteraciones de la funcin mitocondrial. Un hallazgo potencialmente interesante es la reciente
descripcin de que el cido nitropropinico, inhibidor del complejo II de la cadena respiratoria
mitocondrial, es capaz de reproducir las caractersticas clnicas y neuropatolgicas de la EH en
modelos animales (Jimnez-Jimnez et al., 1998, Palfi et al., l998).
Otras enfermedades
No existen muchos datos con respecto a la funcin mitocondrial en pacientes con esclerosis
lateral amiotrfica (ELA). Se ha encontrado disminucin de la actividad del complejo I en
mdula, especialmente en sus regiones ventrales. Algunos autores han sealado disminucin de
actividades del complejo I en pacientes con distona, tanto focal como generalizada, mientras
que otros slo han encontrado dicha alteracin en distonas focales (Jimnez-Jimnez et al.,
1998, Palfi, et al., l996).
Papel de los neurotransmisores
La unidad fundamental del sistema nervioso es la neurona, clulas altamente especializadas
caracterizada por la excitabilidad y conductividad, para estas funciones las neuronas liberan
compuestos qumicos llamados neurotransmisores, los cuales se clasifican en: aminas biognicas
determinados aminocidos y determinados pptidos.
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Tabla l.- Caractersticas de algunas enfermedades neurodegenerativas
Alzheimer
Se caracteriza por
Sintomatologa
clsica
Neurotransmisor
afectado
Alteraciones
Deplecin
neuronas
colinrgicas
principalmente
hipocampo y
amgdala.
Alteracin en los
procesos de memoria
y lenguaje
Disminucin
acetilcolina
de
Placas seniles,
ovillos
neurfibrilares,
prdida
de
neuronas
de
Cuerpos
Lewy
deplecin
dopamina
de
el
la
Parkinson
Deplecin
de
neuronas
dopaminrgicas de
la sustancia negra y
ganglios basales
Modificacin en el
control
y
la
coordinacin
del
movimiento
Disminucin
Dopamina
Esclerosis
lateral
amiotrfica
Reduccin
motoneuronas
Debilidad progresiva.
Incremento en la
concentracin de
glutamato
de
de
y
de
Inclusiones
celulares
axones
motores
inflamadas
Los neurotransmisores se liberan en la superficie presinptica y se ligan a sus correspondientes

receptores de la superficie posinptica, y produce un cambio en el potencial de accin
posinptico, por lo que la teraputica est dirigida para modular los procesos que regulan la
concentracin de neurotransmisores a travs de: la sntesis, almacenamiento, catabolismo y
recaptacin durante la sinopsis.
Acetilcolina.
Es el neurotransmisor especfico de las sinopsis neuromusculares del sistema nervioso somtico,
as como de las sinapsis ganglionares del sistema nervioso autnomo y los rganos diana de la
divisin parasimptico.
Participa en la regulacin de los niveles de vigilancia y reas de asociacin. Cambios en los
niveles producen alteraciones en la conducta y sndromes caractersticos como: prdida de la
memoria y atencin, habla confusa, ataxia o desorientacin. La alteracin en la neurotransmisin
colinrgica est implicada en el Alzheimer (por defecto) y en menor medida en el Parkinson
(por exceso). La acetilcolina aumenta su accin cuando desciende el nivel de la dopamina,
por lo que el bloque de la accin de la acetilcolina resulta eficaz en el control del temblor
y la rigidez en el Parkinson. Por tal motivo, las investigaciones farmacolgicas han dirigido
sus investigaciones a los siguientes objetivos (De Jess, 2003, Cummings 2003). 1.- Frmacos
que potencian la sntesis de colina como lecitina, alfoscerato y la CDP-colina., 2.- Frmacos
agonistas de los receptores nicotnicos como el betanecol, la oxotremonina, la nanomelina y la
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nicotina entre otros. 3.- Frmacos inhibidores del catabolismo de la acetilcolina, inhibidores de
acetilcolinesterasa como la tacrina, el donepezilo, la rivastigmina y la galantamina (Westaway
D 2002, Karatsky et al., 2003, Anande et al., 2003).
Dopamina
Debido a que existe una localizacin enceflica ms elevada que la noradrenalina, la
dopamina es el neurotransmisor catecolaminrgico ms importante, y por lo tanto, con
mayor repercusin. Estudios realizados en cerebros post mortem de pacientes con Parkinson
se han encontrado niveles bajos de dopamina. La farmacologa mantiene las investigaciones
sobre frmacos que recuperan los niveles de dopamina: l. Precursores de la sntesis de
dopamina, como la levodopa, 2. Potenciadores de su liberacin en los botones sinpticos
como la amantadina, 3. Agonistas de receptores dopaminrgicos, como la bromocriptina, la
apomorfina, lalisurida, el ropiniro, el pramipeso, la cabegolina y la pegolida. 4.- Inhibidores
de las enzimas encargadas de su catabolismo, como la monoamino oxidasa B (MAO B);
destacan la selegilina, o la enzima catecol-O-metiltrnasferasa (COMT); entacapona y
tolcapona (Muller et al., 2003; Crosby et al., 2003).
Debido a que la dopamina no atraviesa la barrera hematoenceflica, no se utiliza como frmaco
en neurologa. Sin embargo, son varias las aproximaciones que se han realizado con el fin de
aumentar sus niveles, fundamentalmente los transplantes en las reas afectadas, de clulas
capaces de secretar dopamina, como son neuronas dopoaminrgicas, clulas cromoafines de
la glndula suprarrenal y clulas del cuerpo carotideo. Estudios ms recientes, en modelos
animales, se realizan transplante de clulas indiferenciadas y se logra un crecimiento y
diferenciacin completa hasta neuronas dopaminrgicas (Bjorklund et al., 2002).
El uso de precursores de dopamina se utiliza ampliamente y de ellos destaca principalmente la
levodopa, que es capaz de atravesar la barrera hematoenceflica (BHE) y es un eficiente frmaco
para el tratamiento de Parkinson, este frmaco, se absorbe bien en el intestino delgado, pero
se inactiva en una gran porcin (aprox. el 95%) por la MOA (monoamino oxidasa) perifrica
y da lugar a la aparicin de conocidos efectos secundarios, por lo que se coadministra junto
a frmacos inhibidores de la descarboxilasa, como la carbidopa o la benseracida, incapaces
de atravesar la BHE y de esta manera, no solo se evitan los efectos secundarios, si no que se
reduce, unas diez veces, la dosis de levodopa necesaria (Bjorklund et al., 2002).
Glutamato
El glutamato es el neurotransmisor excitatorio por excelencia. Media su efecto al activar
distintos receptores: ionotrpicos, que forman canales inicos de localizacin, principalmente,
posinptica como el receptor de NMDA (N-metil-D-aspartato), vinculado con el flujo de cationes
Na+, K+, Ca+2, el receptor de AMPA (Alfa-amino-3-hidroxi-5-metil-isoxazol propinico) y el
receptor para kainato, asociado a los iones Na+ y K+ y otros presinpticos, conocidos como
metabotrpicos, al mediar su efecto mediante la activacin de protenas G (Conti et al., l998)
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El glutamato participa en 70% de las sinapsis excitatorias, sin embargo, la activacin excesiva
de sus receptores, bajo ciertas condiciones, es neurotxica, y se ha relacionado con procesos
neurodegenerativos, tanto agudos como crnicos. En la neurotoxicidad aguda (p. ej., la isquemia
cerebral), el dficit energtico celular conlleva una disminucin en la recaptacin de glutamado
del espacio sinptico, con el consecuente aumento en su concentracin y un incremento de la
sensibilidad de las neuronas al glutamato. La sobre activacin de los receptores en esta situacin
tiene como resultado una alteracin de los iones de Na+ y Cl- que genera la entrada masiva de
agua, e induce la lsis osmtica de la neurona. Hasta la fecha, el glutamato permanece como
marcador bioqumico ms potente de deterioro neurolgico precoz tras el ictus. Por otro lado,
la neurotoxicidad crnica se media por mecanismos dependientes de la entrada de Ca+2 y se
implica en enfermedades como la ELA, la demencia asociada al SIDA, Parkinson, Huntington
y Alzheimer (Urbani et al., 2000, Kilpatrick et al., 2002)
La farmacologa del glutamato, ha centrado sus estudios en frmacos que o bien disminuyen
los niveles sinpticos del neurotransmisor (riluzol, lubeluzol), o antagonizan los receptores
ionotrpicos (selfotel, eliprodil, aptiganel, licostinel, remacemide, dizocilpina y gavestine entre
otros) (Catillo et al., 1997; Muir et al 1995; Urbani et al., 2000)
Muerte celular
Los procesos de muerte celular se engloban dentro de dos grandes bloques, la necrosis y
apoptosis. La necrosis se ha relacionado con estados agudos donde la clula pierde, de una
forma brusca, la integridad de sus organelos, y disipa la capacidad de sntesis de energa y el
control de la homeostasis celular, Estos procesos se han relacionado con patologas como el
traumatismo o la isquemia. Sin embargo durante los procesos apoptticos la clula mantiene
la integridad de sus organelos hasta estadios bien tardos, lo que le permite conservar el estado
energtico, la homeostasis celular, y en algunos casos, mantener la maquinaria necesaria
para sintetizar protenas implicadas en estas rutas, por lo que se le ha llamado muerte celular
programada. Clulas con caractersticas apoptticas se han observado en reas afectadas en
neuropatas como EA, ELA, EP, EH entre otras (Diener et al., l997).
En los procesos apoptticos se pueden estableces tres fases: la de activacin, propagacin y
ejecucin que en algunos casos se precede de latencia de extensin variable.
Fase de activacin: se media por seales extracelulares, como la unin de ligando a su receptor;
como el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a) o los neurotramisores excitatorios como
los antes mencionados. En esta etapa, el in Ca+2 juega un papel importante en el Sistema
Nervioso Central (SNC), donde se incluye la produccin del potencial de accin, la liberacin
de neurotransmisores, la plasticidad neuronal y probablemente en la formacin de la memoria.
Sin embargo, la entrada masiva de Ca+2 o el fallo de los mecanismos que regulan su contraccin
desencadenan una serie de acontecimientos que llevan a la muerte neuronal mediada directa
o indirectamente con el Ca+2. El aumento de la concentracin intraneuronal de calcio puede
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conducir a la activacin de rutas moleculares entre las que se incluyen las proteincinasas, las
fosfolipasas A2, la xido ntrico sintetasa y las proteasas, estas rutas inducen a la generacin
de radicales libres, con el dao en organelos como las mitocondria y el retculo endoplsmico
(Zipfer et al., 2000; Annunziato et al., 2003).
Las neuronas, en su citoplasma, contienen protenas con capacidad de amortiguar Ca+2, como
la calbindina o la parvoalbmina. En determinadas patologas como la EA o la ELA, los grupos
neuronales que carecen o expresan cantidades muy pequeas de esas protenas, se vuelven ms
sensibles, mientas aquellos que expresan grandes cantidades parecen respetarse relativamente.
(Prehn et al., 1997).
Especies reactivas de oxgeno
Se sabe que aunque el estrs oxidativo no es el causante directo o el factor etiolgico responsable
de las neuropatologas, existen evidencias de que la presencia de radicales libres produce el dao
tisular y degenerativo secundario que acompaa a estas enfermedades (tabla 2). Se sabe que
el SNC especficamente el cerebro, tiene un alto requerimiento metablico de oxgeno y una
alta concertacin de cidos grasos poliinsaurados, por lo que lo convierte en un lugar propenso
a la peroxidacin lipdica. La sobreproduccin de radicales libres que pueden atacar y daar
irremediablemente el tejido neuronal, contribuye de manera directa o sinrgica al proceso
neurodegenerativo. Para prevenir los aumentos descontrolados de EROS, las clulas tienen
sistemas antioxidantes. Estos sistemas pueden clasificarse en sistemas enzimticos (superxido
dismutasa, la catalasa y la glutatin peroxidasa), antioxidantes endgenos (transferan, la
lactoferrina, la ceruloplasmina, la albmina, la bilirrubina el cido rico) o contenidos en
la dieta (vitaminas C y E, el -caroteno, los flavonoides, el selenio y el zinc) y por ltimo
Tabla 2. Mecanismos de muerte celular en enfermedades neurodegenerativas
Enfermedad
Apoptosis
Excitotoxicidad
Estrs
oxidativo
Factores
vasculares
Protenas
txicas
Inflamacin
Alzheimer
Parkinson
Huntington
Esclerosis lateral
amiotrfica
Demencia
vascular
Traumatismo
Isquemia
cerebral
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antioxidantes farmacolgicos (tirilazad, ebselen, la N-acetil cisterna, las porfirinas) entre otros
(Imam et al., 2001, Butterfield et al., 2002, Butherfield et al., 2002).
El mantenimiento y la optimizacin de los mecanismos de defensa antioxidante en el
cerebro constituyen una estrategia importante para prevenir o reducir la progresin de la
neurodegeneracin. El potencial de los antioxidantes en la dieta incluidos del beta caroteno,
vitaminas C y E- para proteger contra la prdida cognitiva y los trastornos neurodegenerativos,
se ha explorado en varios estudios epidemiolgicos y clnicos, y muestra una correlacin
significativa entre los niveles de vitamina E en el suero y la memoria en una poblacin adulta
(Pong et al., 2001).
Factores de transcripcin
Se ha observado que durante algunos procesos de muerte celular se produce la activacin de
rutas metablicas que necesitan de la sntesis de novo de determinadas protenas. Una de las
formas ms importantes de control de la expresin gnica es la regulacin transcripcional,
y dentro de sta, los factores de transcripcin (FT), se encargan de llevarla a cabo de forma
preferente. Los FT son protenas que se unen a secuencias especficas de ADN y que modulan
la expresin de los genes. Los FT se localizan en el citoplasma de forma inactiva y tras un
estmulo determinado, que pueden ser Ca+2, EROS o factores trficos, se activan y se trasloan
al ncleo. Entre los factores de trascripcin destacan el factor nuclear kB (NG-kB), la familia
de protenas activadora-1 (AP-1), que engloba miembros como c-fos y c-jun, y el p53, entre
otros. Uno de los ms importantes es el NFkB, que permanece en el citoplasma celular
unido a protenas inhibidoras conocidas como IkB. Cuando una seal externa, como factores
neutrficos o EROS, afecta a la clula, el complejo IkB cinasa (IKK) se activa y fosforila a las
protenas iKB. Entonces, iKB fosforilada se degrada rpidamente y libera y activa as al NFkB. Entre los frmacos inhibidores de la familia NK-kB se encuentran algunos de los frmacos
antiinflamatorios ms comnmente usados, como el salicilato aspirina y algunos esteroides
(Uberti et al., 2002).
Otra diana farmacolgica es la protena p53, sta controla la integridad del ADN y la
terminacin correcta de las diferentes fases del ciclo, y detienen el crecimiento celular cuando
existe dao en el ADN o los sistemas de control de regulacin. Se ha encontrado activada en
pacientes de la EP, EA 97, y tras la exposicin a radiaciones gamma. Frmacos inhibidores de
p53, como la pifithrin-a y el Z-1-117 han sido efectivos en modelos experimentales frente a
diversos estmulos neurotxicos (Duan et al., 2002).
Fase de propagacin: se efecta intracelular, se media por la participacin de segundos
mensajeros como el Ca+2, las especies reactivas de oxgeno (ERO) y factores de transcripcin
como p53, y AP-1 entre otros.
La mitocondria ocupa hoy un lugar privilegiado en los procesos de muerte cedular, alteraciones
mitocondriales y alteraciones en los complejos de la cadena transportadora de electrones, se
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han descrito en clulas de individuos que padecen EH o EA. El campo de la farmacologa

mitocondrial se ha enfocado en los ltimos aos en el estudio de los procesos que se relacionan a
la formacin y apertura del pro de permeabilidad transitoria mitocondrial (PPTM). El bloqueo
de la formacin de PPTM resulta en la proteccin de cultivos celulares frente a estmulos
apoptticos que pueden mediare a travs del Ca+2 y las EROS. Frmacos bloqueadores
de la apertura de PPTM, como la ciclosporina A y el cido clavulanico, presentan efectos
neuroprotectores en modelos neurotxidos de la corea de Huntington (Leventhal et al., 2000).
Etapa de ejecucin: Se activan en las clulas procesos de degradacin en los que participan
proteasas y DNasas. Durante esta fase, se lleva cabo la degradacin de protenas, que se meda
fundamentalmente por la accin de proteasas, como los miembros de la familias de cisterna
(caspasas y calpainas) y serina proteasas. Estas enzimas hidrolizan sustratos selectivos como
elementos del citoesqueleto (actina, fodrina, protena tay y catenina, enzimas encargadas de
reparar (PARP) o degradar (ADNasa) el ADN celular, factores de transcripcin (retinoblastoma,
MDM2), protenas reguladoras cinasas y fosfatasas (protena cinasa C, fosfatasas 2, cinasas de
adhesin focal, Akt, raf1) (Jordan et al., 2000).
En modelos experimentales, la activacin de las caspasas parece implicarse en algunas END
como la EA, ELA y la EP y la corea de Huntington. Hoy en da, se dispone de frmacos
inhibidores de caspasas, tanto de origen vital (crmA, p35 y el pptido inhibidor de apoptosis),
como de origen sinttico (Z-VAD-FMK especfico para las caspasa 1,3,4,7, Z-DEVD-FMK,
inhibidor de caspasa-3). La utilizacin de estos frmacos protege a los cultivos celulares de la
disminucin de la viabilidad inducida por neurotoxinas, y se comienza a utilizar, con cierto
xito, en modelos experimentales de EP. As, el pptido inhibidor Ac-YVAD-CMK favorece
la viabilidad de los implantes de neuronas dopaminrgicas y mejora sustancialmente la
recuperacin funcional de ratas parkinsonianas (Schiele et al., 1999).
Otras dianas.
Estrategia antiinflamatoria
La progresin de END se acompaa de procesos de inflamacin en astrocitos y microglia. De
hecho, en estudios experimentales, determinados agentes anticitocinas capaces de modular IL1, TNF- han mostrado capacidad neurorotectora, as como de las citocinas proinflamatorias
en el deterioro neurolgico precoz tras el ictus isqumico. En la EA existen procesos de
inflamacin asociados a las placas neurtica y a la degeneracin neurofibrilar, estudios
epidemiolgicos asocian a los frmacos antiinflamatorios no esteroideos con retrasos en la
aparicin, o con una progresin ms lenta de esta enfermedad. Este efecto neuroprotector
puede explicarse por la inhibicin de la ciclooxigenasa (COX), y en concreto la COX-2, cuya
expresin se eleva en reas relacionadas con la memoria y que se correlaciona con el depsito
de la protena -amiloide. Se ha demostrado la accin de trifusal, un antiagregante plaquetario,
en los mecanismos inflamatorios involucrados en la demencia. Su efecto parece mediarse por
la inhibicin tanto de la activacin del factor de transcripcin N-kB, como de la expresin de
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COX-2, tambin el ibuprofeno confiere citoproteccin a cultivos neuronales dopaminrgicos

frente a estmulos excitotxicos (Avisen et al., 2002).
Factores de crecimiento y hormonas.
La falta o escasez de determinados factores de crecimiento (FC) puede ser la causa de procesos
neurodegenerativos, el factor de crecimiento nervioso (NGF), la neurotrofina 3 (NT-3) o el
factor neurotrfico derivado del cerebro (BDNF), son miembros de la familia gentica de
las neurotrofinas que inducen supervivencia, diferenciacin, mantenimiento y reparacin
de poblaciones neuronales especficas. Posiblemente la falta de modulacin de los complejos
ciclinas-cdk, por parte de determinados FC, sea uno de los motivos que conducen a la apoptosis.
Adems la ausencia de induccin de los genes responsables de la sntesis de determinadas
enzimas antioxidantes o redeterminadas protenas amortiguadoras de Ca+2, probablemente
tambin influya en el desarrollo de la muerte neuronal. As, los niveles de BDNF se reducen
significativamente en el Hipocampo y la corteza parietal del paciente con EA. En este sentido,
el suministro de determinados FC como el NGF, la NT-3, el GDNF o el BDNF, podran
constituir una terapia protectora en muchas END (Lars O. 2000).
Inmunomodulacin
En algunos procesos degenerativos se ha observado la existencia de una desregulacin del
sistema inmune. La farmacologa centra sus investigaciones en sustancias capaces de modular
estos procesos. El ejemplo ms investigado conocido que sirve como modelo de estudio de la
inmunomodulacin en neurologa es la EM. En ella se ha observado la presencia de linfocito
T autorreactivos frente a protenas especfica de la mielina, que orquestaran una respuesta
defensiva aberrante frente a antgenos del SNC. En la actualidad, dos son los frentes abiertos en
el tratamiento farmacolgico inmunomodulador en la EM. El primero utiliza los interferones
(INF), como el IFN 1a, cuya accin teraputica parece medirse por su capacidad para inducir
un desplazamiento de la respuesta inmune, al facilitar la diferenciacin de las clulas T hacia
poblaciones Th2, que ejerceran un efecto antiinflamatorio y aumentar los niveles de algunas
interleucinas como las IL-4, IL-10 y el factor de crecimiento transformante beta con una
disminucin de los niveles de IL-2, IFN y el TNF- entre otros (Garca-Merino et al., 2003).
Otras alternativas
El esclarecimiento de las rutas de sntesis del pptido -amiloideo, componente mayoritario
de las placa y depsitos neurofibrilares, ha permitido grandes avances en la teraputica de
la EA. El bloqueo del paso de protena precursora del -amiloide (APP) mediante el uso de
frmacos inhibidores de la secretasa, proteasa encargadas de metabolizar APP, constituye una
de las grandes apuestas. Por ultimo, se han realizado aproximaciones para la construccin
revacunas contra las END. As en la EA se ha desarrollado una vacuna experimental, la AN1792, con la utilizacin de placas amiloides como agente invasor del cerebro. Aunque en un
principio present resultados muy esperanzadores, ya que su administracin a un grupo de
233
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pacientes indujo la formacin y acumulacin de anticuerpos dirigidos contra las placas de

b-amiloide, el ensayo clnico ha tenido que detenerse debido a la respuesta inflamatoria del
SNC (Westaway D. 2000).
Conclusiones
Existen dos lneas para el tratamiento de la enfermedades neurodegenerativas, la primera
etiopatognica, cuyo objetivo es detener la muerte celular y fomentar la recuperacin de
poblaciones afectadas mediante frmacos que modulen las rutas bioqumicas relacionadas con
estos procesos, la segunda tendencia es la fisiopatolgica que busca prevenir, retardar o paliar la
aparicin de la sintomatologa de los cambios relacionados con los niveles de neurotransmisores
y procurar su mantenimiento.
El enorme progreso en la comprensin de los mecanismos de transcripcin ofrece la posibilidad
del desarrollo de una nueva generacin de frmacos, que debern ser capaces de modular
la sntesis de factores de transcripcin, regular su activad y las interacciones con protenas
activadoras e inhibidores o su unin al ADN. Debido a la alta especificidad de esta nueva
va teraputica, parece claro que estos agentes proporcionarn buenas herramientas para la
prevencin y el tratamiento de alguna variedad de enfermedades en un futuro no muy lejano.
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Bioqumica de los esteroides y su accin a nivel

del Sistema Nervioso Central
Esteroides
Las fracciones de lpidos que se obtienen de plantas y animales contienen un grupo importante
de compuestos que se conocen como esteroides. Estos compuestos son reguladores biolgicos
importantes y casi siempre presentan efectos fisiolgicos severos cuando se administran a
organismos vivos. Dentro de estos compuestos se encuentran las hormonas sexuales masculinas
y femeninas, las hormonas adrenocoticoides, la vitamina D, los cidos biliares y algunos
venenos cardiacos (Montenegro, 2002).
Los esteroides son derivados del sistema de anillos perhidrociclopentano fenantreno que se
muestra en la figura 1, Los tomos de carbono de este sistema de anillos se enumeran como se
muestra en la figura. Los cuatro anillos se designan con letras, A, B, C y D.
En la mayora de los esteroides, las uniones entre los anillos B,C y C,D son trans. Sin embargo,
la unin entre los anillos A,B pueden ser cis o pueden ser trans, y esta posibilidad da lugar a
18
12
19
11
CH3
10
A
5
3
4
CH
CH3
14
17
13
16
D
15
Figura 1. Anillo perhidrociclopentanofenantreno

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Bioqumica de los esteroides
dos grupos generales de esteroides que poseen las estructuras tridimensionales que se muestran
en la figura 2.
18
A)
19
1
2
4
10 9
6
5
11
12
8
13
17
B)
18
19
10
16
13
8
14
16
Figura 2. Serie de esteroides A) Serie de esteroides 5a (Todas las inserciones son trans. B) Serie de
esteroides 5b (La insercin del anillo Ay B es cis).
Los grupos metilo estn integrados en los puntos de unin de los anillos (es decir, los numerados
como 18 y 19), se llaman grupos metilos angulares y sirven como puntos importantes de
referencia para las designaciones estereoqumicas. Los grupos metilo angulares sobresalen del
plano general del sistema de anillos cuando este se escribe de la manera que se presenta en
la figura 2. Por convencin, los otros grupos que se encuentran en el mismo lado general
de la molcula que los grupos metilo angulares (es decir, en la parte superior), se designan
como sustituyentes (y se escriben con una cua slida). Los grupos que se encuentran en la
parte inferior (o en la posicin trans respecto a los grupos metilo angulares) se designan como
sustituyentes (y se escriben con una cua punteada). Cuando las designaciones y se
aplican al tomo de hidrogeno en la posicin 5 el sistema de anillos en el cual la unin de los
anillos A y B es trans, se convierte en la serie 5, en el sistema de anillos en el cual la unin de
A y B es cis se transforma en la serie 5 .
En la nomenclatura sistemtica, la naturaleza del grupo R en la posicin 17 determina (en
forma primaria) el nombre base de un esteroide individual. Estos nombres se derivan de los
que corresponden a los hidrocarburos esteroides que se dan en la tabla 1 (Solomons, 1999).
Colesterol
El colesterol (figura 3) es el principal esteroide del organismo humano. Por un lado es un
componente estructural de las membranas celulares y lipoprotenas plasmticas y por otro
es el compuesto a partir del cual da comienzo la sntesis de los cidos biliares y hormonas
esteroides. El colesterol es escasamente soluble en medios acuosos aunque son muy solubles en
los disolventes orgnicos, particularmente en los alcoholes.
El desarrollo de la arteriosclerosis, enfermedad que consiste en un endurecimiento de las
arterias, est relacionada con una anomala en el metabolismo del colesterol, y en su transporte
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Tabla 1. Nomenclatura de los esteroides.
NOMBRE
-H
Adrostano
-H (con H tambin como sustituyente del 19CH3)

-20CH221CH3
Estrano
Pregnano
-20CH222CH223CH224CH3
|
21
Colano
CH3
-20CH222CH223CH224CH225CH26CH3
|
21
CH3
|
27
Colestano
CH3
a travs del plasma. La arteriosclerosis puede conducir al infarto de miocardio, a la apopleja,

a la neurisma, o a la gangrena. Adems, se presentan con mayor frecuencia entre la poblacin
de pases occidentales est compuesta predominantemente por colesterol. Por ltimo, muchos
medicamentos de uso habitual, por ejemplo derivados de la cortisona y contraceptivos orales,
son esteroides.
Figura 3. Estructura del colesterol (5-colesten-3b-ol)

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Adems de ser captado en la dieta, el colesterol puede ser sintetizado por los tejidos humanos.
El colesterol se sintetiza a partir de acetil-CoA, que puede derivar de los carbohidratos,
aminocidos o cidos grasos. La principal localizacin de la sntesis del colesterol es el hgado,
aunque el intestino constituye as mismo un importante lugar de sntesis en el hombre. Adems
el colesterol es sintetizado en las glndulas productoras de hormonas esteroides, por ejemplo las
glndulas suprarrenales, los testculos y los ovarios. Todas las reacciones de sntesis se producen
en el compartimiento citoplsmico de la clula y la mayor parte de enzimas necesarias se
encuentran en el retculo endoplasmtico.
La va metablica de sntesis del colesterol es muy compleja pero se puede dividir en tres etapas
como se muestra en la figura 4. En resumen en la primera etapa la Acetil-CoA es transformada
en un intermediario tioster de 6 tomos de carbono: la 3-hidroxi-3-metil-glutaril-CoA (HMGCoA). La segunda etapa implica la conversin de la HMG-CoA escualeno, un hidrocarburo no
cclico que consta de 30 tomos de carbono. En esta etapa acta de intermediario la unidad
de isopreno, con 5 tomos de carbn, que est presente en dos formas fosforiladas isomricas.
3-isopentenilpirofosfato y 3-3-dimetilalilpirofosfato. En la tercera etapa, el escualeno es
ciclado y convertido en un esterol de 27 tomos de carbono, el colesterol, los intermediarios
estn unidos fsicamente a una protena citoplasmtica, la protena transportadora de esteroles
(Montenegro, 2002).
Figura 4. Etapas durante la biosntesis del colesterol en el organismo humano.
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Formacin de hormonas esteroides a partir del colesterol

Adems de los cidos biliares el colesterol puede convertirse en hormonas esteroides. Estas
hormonas esteroides comprenden los corticoides suprarrenales, de 21 tomos de carbn, el
cortisol, la aldosterona y la corticosterona.
Cortisol. En las clulas de la corteza suprarrenal se sintetiza el cortisol: el colesterol se convierte
en 17-a-hidroxiprogesterona como se muestra en la figura 5. la 17-a-hidroxiprogesteron que se
ha formado se hidroxila entonces en las posiciones C21 y C11, formando cortisol.
Figura 5. Sntesis del cortisol a partir de colesterol.
La comprensin de las funciones y acciones del cortisol frente a determinados estmulos

como el estrs fisiolgico (entrenamiento y las estrategias alimentarias) el estrs psquico
emocional es de suma importancia a la hora de comprender por qu haciendo supuestamente
lo correcto podemos fracasar con nuestra planificacin con la actividad fsica y la alimentacin
(Monteleone, 1990).
Cuando hay estrs y ansiedad, el cerebro enva una seal a las glndulas adrenales para que
liberen la hormona cortisol (Williams, 2002). Si el estrs y la ansiedad permanecen por tiempo
prolongado, los niveles de cortisol se mantendrn elevados, produciendo muchos problemas
metablicos, entre ellos:
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1. El estrs produce la liberacin de la hormona cortisol de las glndulas adrenales. Esta

hormona hace que el cuerpo libere glucosa a la sangre y como el cuerpo no est utilizando la
fuerza muscular para responder a la situacin, la glucosa se deposita como grasa en el tejido
adiposo (Fry, 1998)
2. La habilidad del cerebro para la utilizacin de la glucosa est disminuida y puede producir
problemas en los centros de control del apetito y HAMBRE (Venkatraman, 2001).
3. Qumicos cerebrales como la serotonina, dopamina y endorfinas, se repletan o estn en
desbalance, lo que puede producir antojos por comer carbohidratos, dulces u otros alimentos
que nos hacen sentirnos bien, como el chocolate (Patra, 1988, Rowbottom, 1996)
4. Hay constriccin de los vasos sanguneos y la sangre es dirigida a otros rganos, que
necesitan mayor volumen sanguneo en el organismo con estrs. El sistema digestivo no es la
prioridad del cuerpo en este momento, por lo que pueden presentarse trastornos a este nivel
(Norton, K, 1988)
5. Nutrientes como las vitaminas C y B y el mineral hierro son repletadas, afectando la habilidad
del cuerpo para la conversin de carbohidratos y grasa en energa (Peterse, 2001)
6. Los antojos que produce el estrs, pueden producir aumento del deseo de consumir
azcares y grasas (Rizza, 1982)
Mecanismos de feedback del cortisol
El cuerpo posee un elaborado sistema de retroalimentacin (feedback) que controla la secrecin
de cortisol y regula la cantidad de cortisol en el torrente sanguneo (Tsigos,20029). La glndula
pituitaria, en la base del cerebro, produce y secreta una hormona llamada adrenocorticotrofina
o ACTH. Su secrecin indica a las glndulas adrenales que incrementen la produccin y
secrecin de cortisol. La pituitaria, a su vez, recibe seales desde el hipotlamo en la forma
de hormona CRH u hormona liberadora de corticotrofina, que le seala a la pituitaria la
liberacin de ACTH. Cuando el cortisol est en cantidades adecuadas o en exceso, en la
pituitaria y en el hipotlamo, opera un sistema de feedback negativo, que alerta a estas reas
a reducir la produccin de ACTH y CRH, respectivamente, con el propsito de reducir la
secrecin de cortisol (figura 6).
Los niveles corporales de cortisol en la sangre muestran lo que se denomina una variacin diurna,
lo cual significa que las concentraciones normales de cortisol varan a lo largo de las 24 horas
de da, siendo ms elevados en la maana temprano, cerca de las 6-8 hs, y ms bajos cerca de
la medianoche (Brillon, 1995).
El cortisol es liberado a la circulacin sangunea, con el fin de ejercer sus efectos en el tejido
perifrico donde se une a la globulina especfica unidora de glucocorticoides 2, llamada
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Figura 6.
Mecanismos de feedback del cortisol
transcortina. Cerca del 75% del cortisol se une a esta protena, 15 al 20% se une menos
fuertemente a la albmina, y el 5% restante es cortisol libre (Amri, 1997). Este es un factor
importante a tener en cuenta, a la hora de realizar mediciones de cortisol. La excrecin de
cortisol sin metabolizar en orina de 24 horas, es una de las mejores formas de medir el cortisol
con precisin. Uno de los mejores momentos para monitorear los niveles de cortisol, es en la
maana con el estmago vaco (Simmons, 1984). Este valor de referencia o rango apropiado
debe estar entre 4 mcg/dl and 19 mcg/dl, en una muestra sangunea. El rango normal de
cortisol libre medido en orina debe encontrarse entre 10 pg/ml and 110 pg/ml. Existe otra
forma de medir cortisol a travs de la saliva (Jacks, 2002). El rango normal con este mtodo,
tomado en la maana, se encuentra entre 100nmol/L y 300nmol/L. Al respecto, un estudio
ha demostrado que existe una fuerte correlacin entre las mediciones de saliva, suero y orina,
por lo tanto cualquiera de los tres mtodos puede ser usado para monitorear el nivel de cortisol
durante el perodo de recuperacin del ejercicio (Neary, 2002).
Anomalas de la secrecin Adrenocortical
Enfermedad de Addison. A veces se destruye la corteza suprarrenal a causa de enfermedad
y otras veces simplemente se atrofia. La sobre estimulacin excesiva de la glndula suprarrenal
por el estrs hace que primero aumente mucho de tamao, enseguida experimenta hemorragia
y por ltimo queda restituida por tejido fibroso. Lo que conduce a una alteracin que se llama
Enfermedad de Addison (Ashton, 2005). La imagen clsica de esta alteracin fue descrita
por Thomas Addison, un mdico ingls del siglo XIX. La persona con enfermedad de Addison
esta anmica y muy dbil, tiene la piel bronceada y es altamente susceptible a las enfermedades
e infecciones. Para que en estas condiciones se logre un completo funcionamiento suficiente de
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su organismo , ser necesario tratarlo con cortisol (aproximadamente 30 mg al da) adems de

mineralcorticoide .
Hiperadrenalismo. La hiperfuncin de la corteza suprarrenal origina la Enfermedad
de Cushing y generalmente es causada por crecimiento de ambas suprarrenales, ms
frecuentemente por un tumor (Sapse, 1997). El enfermo que padece la enfermedad de Cushing
muestra los efectos de la secrecin aumentada de glucocorticoides, mineralocorticoides
y hormonas sexuales. Ocurre ms frecuentemente en la mujer adulta. El trastorno del
metabolismo proteico lleva a la consumacin de los tejidos corporales y debilitamiento de los
huesos. La secrecin aumentada de glucocorticoides causa un aumento de la glucosa sangunea
que lleva a la diabetes suprarrenal, que puede convertirse en diabetes permanente si contina
cierto tiempo.
Estabilizacin de cortisol en materiales mesoporosos de slice
En el laboratorio de nanotecnologa del Instituto Nacional de Neurologa y Neurociruga, se
ha logrado estabilizar cortisol en materiales de slice que tienen diferentes morfologas y se ha
hecho un estudio in vitro de la liberacin de ste. Los resultados indican que estos materiales
son adecuados para aplicarse en pruebas in vivo en modelos animales (Lpez, 2008). Y se
propone lo siguiente:
Se propone el uso de nanoimplantes de Slice-cortisol en las lesiones provocadas por la
osteoartritis ya que existe la necesidad de que la administracin del glucocorticoide sea de
mnima invasividad para disminuir el riesgo de dao por manipulacin tisular y obtener un
efecto localizado sin repercusin sistmica con menos intervenciones.
As, la liberacin de cortisol de manera continua y localizada, representa una opcin de
manejo con mltiples ventajas sobre la forma de administracin convencional; con la finalidad
de mejorar la calidad de vida del sujeto con OA.
Con este trabajo se pretende evaluar la efectividad del nanoimplante liberador de cortisol en
la reduccin del dolor articular en modelos experimentales de OA en ratas Wistar. Para esto,
se reproducir un modelo animal de osteoartritis (OA) de rodilla en ratas Wistar que permita
evaluar los cambios tardos potencialmente asociados a los componentes del nanoimplante
colocado en la articulacin daada sin frmaco. Adems, determinaremos la existencia o no
de reaccin inflamatoria local a los componentes del nanoimplante sin frmaco, instalado
en articulacin de la rodilla de ratas Wistar macho, sanas. Por ultimo, determinaremos la
efectividad del nanoimplante liberador de cortisol, instalado en la articulacin daada de
modelos experimentales de OA en ratas, para la reduccin del dolor articular mediante las
modificaciones conductuales en la prueba de disfuncin inducida por dolor en ratas (PIFIR).
Quiero hacer mencin que colaborarn en esta investigacin la Dra. Paola Arteaga Lpez del
CINVESTAV-SUR y su grupo de trabajo.
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Podemos concluir que nuestro objetivo a mediano plazo es la aplicacin de este nanoimplante
de SiO2-cortisol en enfermos con OA.
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Posibles acciones txicas de heptacloro y

epxido de heptacloro vinculadas al estrs
oxidativo
Introduccin
El heptacloro (H) es un plaguicida organoclorado dinico que ha sido aplicado con el objeto de
abatir plagas en cultivos agrcolas. Su principal metabolito es el epxido de heptacloro (EH),
el cual manifiesta efectos qumicos y biolgicos ms acentuados que su progenitor. Una de sus
mutuas caractersticas es su alta estabilidad molecular y por esa razn persiste en el ambiente,
de modo que se le ha registrado en diversos eslabones de la cadena trfica. Paralelamente
a la contaminacin producida, se ha generado evidencia de los daos a la salud que se han
provocado por su manejo excesivo (Albert 1996; Cassidy et al. 2005; Barlow 2005).
El heptacloro se introdujo en 1952 en aplicaciones tanto foliares como al suelo y para proteger
la madera. De 1975 a 1976 se estim la produccin de 4.5 x 106 kg en EE. UU., usndose como
insecticida sobre 22 cultivos. Debido a sus caractersticas fisicoqumicas y a la difusin por las
cadenas trficas, se le encuentra en el suelo, el aire y el agua; en organismos tanto vegetales y
animales, terrestres y acuticos; en rganos como hgado, rin y hueso y en alimentos con alto
contenido de grasa como la leche y la carne.
El H tiene por nombre qumico 1,4,5,6,7,8,8-heptacloro-3a,4,7,7a-tetrahidro-4,7-endometilenindeno, y se le conoce en el medio comercial bajo los trminos de Termide, Drinox,
Heptagran o Velsicol. Su principal metabolito es el epxido de heptacloro, 1,4,5,6,7,8,8-heptacloro2,3-epoxi-3a,4,7,7a, tetrahidro-4,7-endo-metilenindeno, el cual tiene una estabilidad mayor que
el compuesto original. Tambin se forman el 1-cloro-3-hidroxiclordano, el 1-hidroxiclordano,
1-hidroxi-2,3-epoxiclordano y su derivado deshidrogenado. El coeficiente de particin octanolagua (Kow) del H es 5.40, lo que explica su lipoficidad; es estable a la humedad, al aire y al calor
y no se degrada por luz ultravioleta (Tomlin 2000).
Efectos sobre la salud

La presencia de H y EH en la leche es un motivo de estudio porque en la fraccin grasa de sta,
se concentran los contenidos de los plaguicidas organoclorados y porque durante la lactancia
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Posibles acciones txicas de heptacloro y epxido de heptacloro
los organismos se destoxifican excretando dichos compuestos en la leche. De esta manera, es

plausible que poblaciones de recin nacidos se vean afectadas por su presencia en la leche
humana y los consumidores de leche vacuna o de otros orgenes tambin tengan el riesgo
de presentar problemas de salud asociados a sus residuos. En el caso mexicano y durante los
ltimos veinte aos, el registro de H y EH en diversas categoras lcteas ha disminuido; sin
embargo, entre los datos ms recientes se seala presencia objetable de los dos compuestos
(Prado et al. 2004) en relacin a los lmites establecidos por los Organismos internacionales de
salud, FAO/OMS.
Las investigaciones en este campo han venido dando informes tanto de daos metablicos
como genticos que se han asociado a la presencia de H y EH. Entre los primeros, se reconoce
que alteran respuestas de los sistemas nervioso, inmunolgico y endocrino y aparatos como
el reproductivo. Los efectos citotxicos se manifiestan con alteraciones en el ciclo celular,
proporcin anormal de mitosis y disfuncin en la regulacin del mismo. Como daos sobre
el DNA se reconocen la clastogenicidad, las aberraciones cromosomales y efectos tanto
mutagnicos como carcinognicos (Gentile et al. 1982; Smialowicz et al. 2001; Pastor et al.
2003; Caudle et al. 2005; Laville et al. 2006; Prado et al. 2008).
Las investigaciones de Suwalsky et al. (2005) han dado evidencias que el clordano, el cual es
un metabolito del H, afecta la forma discoidal de los eritrocitos humanos modificndolos a
esferocitos. Este cambio conduce a una mayor fluidez en la membrana con la consiguiente
alteracin de la permeabilidad y el transporte anormal de sustratos al citoplasma. La entrada
excesiva de agua puede estallar la clula y al verterse sus contenidos sobre las clulas adyacentes,
se produce una respuesta infamatoria en la que se hacen presentes radicales libres asociados a
un estrs oxidativo.
Entre las respuestas que afectan al sistema nervioso se ha registrado que el H induce
modificaciones en la actividad de neurotransmisores como GABA y dopamina (Miller et al.
1999, Kirby et al. 2001; Caudle et al. 2005). Hay estudios que expresan daos inmunolgicos
entre los que se citan aumento de gamma globulinas, disminucin de citocromo oxidasa y
peroxidasa en leucocitos de sangre perifrica, alergias e irritabilidad (Smialowicz et al. 2001).
Los trabajos de Lawson y Luderer (2004) no encontraron alteraciones en el aparato reproductor
de ratas; sin embargo, diversas investigaciones lo sealan como un disruptor endocrino con
alteracin en isoformas del citocromo P450 (Laville et al. 2006) como la aromatasa, y efectos
sobre la esteroidognesis. Se ha considerado que exposiciones de H in utero afectan la fertilidad
de varias generaciones de ratas y que las exposiciones a clordano en el ovario retrasan la
pubertad y modifican los ciclos menstruales.
Hay evidencia creciente que el H in vitro interfiere en la sealizacin celular modificando factores
de transcripcin, reguladores de seales en la divisin celular, comunicacin y apoptosis. Por
ejemplo, puede interferir con la va Ras/MAP quinasas, decreciendo la expresin de Ras y
desregulando a la protena supresora de tumor de retinoblastoma en linfocitos humanos, con
la produccin de especies reactivas de oxgeno (ERO) (Rough et al. 1999; Okoumassoun et
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al. 2003). Una alteracin semejante sucede con la p53, protena protectora frente a cncer
(Chuang and Chuang 1998). Estimula la protein quinasa C en cerebro de rata y se ha postulado
que dicha enzima juega un papel en el efecto promotor de tumor por H.
Se ha observado que algunos plaguicidas tienen una accin citotxica directa sobre el
crecimiento celular, al modificar el ndice de proliferacin de linfocitos humanos tanto in vivo
como in vitro (Pastor et al. 2003). El heptacloro mostr este efecto al responder a concentraciones
de 10 M en cultivos primarios de hepatocitos de rata in vitro y junto con otras manifestaciones, se
le consider un agente mutagnico (Okoumassoun et al. 2003). Se le ha calificado como factor
de riesgo en diversos procesos oncognicos. Tessier y Matsurama (2001) le dan este carcter
en cncer de prstata; Cassidy et al. (2005) lo responsabilizan en el cncer mamario y Hansen
y Matsumura (2001a) en el hepatoblastoma en ratn, con la demostracin que aumenta la
incidencia del carcinoma hepatocelular y del colangiocelular. Sin embargo, los efectos de largo
alcance permanecen desconocidos y no hay claridad total si las respuestas carcinognicas
son por razones genticas o por mecanismos epigenticos o de otro orden (Okoumassoun
et al. 2003). Por lo mismo, la International Agency of Research on Cancer (IARC) lo evalu como
carcinognico en ratn (Bartch and Malaveille 1989) y actualmente est clasificado en el grupo
2B como posible carcingeno en humanos.
El EH comparte algunas respuestas de su progenitor, el H, y adicionalmente, su grupo epxido
interviene en reacciones especficas que le confieren mayor toxicidad (Glatt et al. 1983; Seik et al.
2004). Tambin manifiesta actividad disruptora al inducir las isoformas CYP1A/2B del sistema
del citocromo P450 (Dehn et al. 2004), as como la depresin de respuestas inmunes (Smialowicz
et al. 2001). Expresa una respuesta neurotxica conectada con las vas dopaminrgicas (Kirby
et al. 2001), alterando el transporte de dopamina (Miller et al. 1999) y los receptores de GABA
(Caudle et al. 2005). Tambin induce daos reproductivos como alteracin en el descenso
testicular (Barlow 2005). Inhibe la comunicacin intercelular (Nomata et al. 1996) e incide
en la cascada de las tirosin quinasas, las cuales intervienen en la regulacin del ciclo celular
(Hansen y Matsumura 2001b). Hansen et al. (2006) lo han asociado con efectos promotores
de la proliferacin celular, al perturbar la homeostasis de iones de calcio en la membrana del
retculo endoplsmico en hepatocito de rata.
Se ha informado que los plaguicidas organoclorados tienen efectos genotxicos, los cuales se
manifiestan en aberraciones cromosomales (CA) tanto numricas como estructurales as como
intercambio de las cromtidas hermanas (SCE). Igualmente se han dado evidencias sobre la
presencia de microncleos (MN) en eritocitos de sangre perifrica in vitro cuando son expuestos
a los contaminantes de referencia. Las inducciones de MN se han considerado indicadores de
genotoxicidad cuando las clulas, tejidos u organismos son expuestos in vitro a las sustancias
descritas. Recientemente, la UE lo ha incluido entre sus pruebas para dar cuenta de riesgo en
procesos carcinognicos (Kiekerland et al. 2005).
Hay datos experimentales tanto en linfocitos humanos de sangre perifrica como lneas
celulares, tejidos, hepatocitos in vitro o in vivo que ratifican la formacin de MN cuando son
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expuestos a concentraciones elevadas de xenobiticos. Numerosos estudios refieren que una

variedad de mutgenos de accin directa o indirecta tienen efectos genotxicos manifiestos en
rompimientos de una sola hebra del DNA y alteraciones en la apoptosis.
Cada vez con mayores recursos y complejos diseos experimentales las tcnicas de biologa
molecular se han orientado en estudiar las respuestas de diferentes compuestos en procesos
mutagnicos y carcinognicos y el espectro de datos que se viene obteniendo tiene este valioso
componente.
Los autores Yakes y Van Houten (1997) midieron la respuesta por estrs oxidativo causado
por el H2O2 tanto en DNA nuclear como el mitocondrial que es ms sensible. Las especies
reactivas de oxgeno asociadas al estrs oxidativo indujeron radical superxido, luego, ste
gener agua oxigenada y sta, radical hidroxilo. Se sabe que dicho oxidante provoca dao en
unos 11 sitios del DNA, lipoperoxidacin, disminucin del crecimiento y mayor expresin en
la apoptosis. Los daos incluyeron ruptura de una o las dos bandas del DNA, sitios bsicos,
daos en la 8-oxoguanina y en ocasiones indujeron a la p53 y sta a la p21. Una causa de dicho
dao pudo ser la accin sobre las histonas que protegen al DNA, ya que el DNA mitocondrial
contiene menor cantidad de histonas y probablemente esa sea una de las causas de su mayor
vulnerabilidad. Otro motivo puede ser la depresin de la respuesta inmune, ya que se sabe que
los macrfagos y los neutrfilos inducen estrs oxidativo.
Los estudios de Wang et al. (2000) han contribuido a evidenciar que las condiciones de hipoxia,
como de exposiciones a cloruro de cobalto en concentraciones 100 y 200 mM generan especies
reactivas de oxgeno, induccin de p53, p21 y el factor inducible por hipoxia, HIF-1a. Cuando
miden los daos al DNA nuclear y mitocondrial por Q-PCR encuentran una disminucin de
la amplificacin de los transcritos y concluyen que esta disminucin est en relacin directa
tanto con la ruptura de una sola banda del DNA como con la disfuncin en los mecanismos
de reparacin del DNA a nivel de MYH, una glicosilasa implicada en tal proceso. Adems,
ratifican la mayor sensibilidad de los sistemas de mitocondria para enfrentar los daos
oxidativos al calcular que el mtDNA fue tres veces ms sensible que el nDNA.
Las investigaciones que hicieron Moufarij et al. (2003) para medir aductos en el DNA de
unas lneas celulares de cncer ovrico tratadas experimentalmente con dos medicamentos
anticancerosos, han sido un protocolo metodolgico que ha ofrecido informacin valiosa. Ellos
detectaron la presencia de aductos intrabanda, aductos interbandas y entrecruzamientos DNAprotenas potenciados por los txicos de estudio. Por sus acuciosas investigaciones identificaron:
1. Los daos en el DNA por efecto de la droga
2. Deteccin de aductos intrabanda droga-gen especfico
3. Deteccin del entrecruzamiento interbanda droga-gen especfico
4. Deteccin de la reparacin de entrecruzamientos inter e intrabanda con el gen especfico.
5. Efectos de la droga sobre la acumulacin de aductos intrabanda del DNA, inducidos en
el gen especfico de la dihidrofolato reductasa (DHFR).
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Una consideracin que ha de tomarse en cuenta es que la accin observada expresa diferencias
en los variados tipos de tejidos, dosis de la exposicin y frecuencia de las mismas. Las
particularidades de estas condiciones y la amplsima gama de diferencias en los microambientes
celulares abren una serie de preguntas y respuestas que pese a la dificultad, va abrindose paso
a una comprensin ms completa y diversa. Igualmente, los mecanismos de accin genotxica
pueden expresarse simultneamente en el tiempo, pueden ser funcionalmente dependientes
uno de otro o no serlo; o bien sus respuestas pueden estar conectadas en cascada.
Mecanismos de accin
La propuesta que el estrs oxidativo es uno de los mecanismos, por el cual la accin txica
de los plaguicidas heptacloro y epxido de heptacloro tiene lugar, se fundamenta en los
aspectos tericos y en mltiples respuestas relacionadas robustamente con sus consecuencias,
las cuales ya han sido referidas. Los efectos observados se inician por la interaccin entre
dichos agentes y las mltiples macromolculas. Unas, de naturaleza proteica, que expresan
funciones como catlisis, defensa o implicacin en la sealizacin de procesos. Otras, como
los lpidos de membrana, responsables de transducciones, transporte y reconocimiento, y los
cidos nucleicos, donde est codificada la informacin global de la clula. Es decir, operan
sobre las estructuras fundamentales y en consecuencia, afectan las funciones bsicas de los
organismos. Ciertas enzimas son capaces de convertir a los xenobiticos en intermediarios
altamente reactivos, o de generar metabolitos secundarios como los radicales superxido e
hidroxilo y el perxido de hidrgeno: O2-, OH y H2O2, (ERO) y otras especies reactivas de
naturaleza nitrogenada. La accin de estos radicales es un motivo creciente de estudio y se
tiene hasta el momento un panorama amplio de evidencias de su accin (Boveris et al. 2008).
Accin sobre protenas
Se sabe que el radical hidroxilo (OH) es el iniciador de la oxidacin de protenas; sin embargo,
la continuidad del proceso oxidante se da con la disponibilidad del oxgeno singulete (1O2) y el
superxido (O2-), los cuales actan sobre las cadenas laterales de los aminocidos o sobre el
esqueleto carbonado de las mismas protenas. Adicional a la reactividad entre el oxidante y su
sustrato hay muchos factores que intervienen en el dao a la infinidad de protenas presentes
en el medio celular, siendo algunos simplemente moduladores y otros altamente selectivos.
Cuando se oxida el esqueleto carbonado de la protena por el radical hidroxilo, se produce
una cadena de derivados txicos entre los que estn el radical intermediario alquilperoxil,
que se transforma en alquilperxido, seguido de un alcohoxirradical que finalmente termina
en una hidroxilprotena. Las protenas oxidadas tambin son sensibles a descarboxilaciones,
desaminaciones, prdida de conformacin tridimensional, fragmentacin y entrecruzamientos.
Los sistemas biolgicos tienen mecanismos de reparacin que ofrecen a las clulas las
condiciones de contender el dao. Sin embargo, si esos umbrales son rebasados, la protena
puede llegar a ser degradada o se conjuga con lpidos o carbohidratos que a su vez pueden ser
agregados o precipitados. Conviene decir que los mecanismos de reparacin se limitan por la
edad y la desnutricin (Zentella and Pia 2008).
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Accin sobre lpidos

Una de las acciones de las especies reactivas de oxgeno sobre los lpidos es la lipoperoxidacin,
que consiste en el deterioro oxidativo de los lpidos poliinsaturados. La causa de produccin
de especies reactivas de oxgeno en proporcin lesiva, puede ser iniciada por metabolitos de
plaguicidas, entre otras causas, y las consecuencias de este deterioro son la modificacin de la
fluidez y permeabilidad de las membranas que constituyen un sistema celular con funciones de
reconocimiento, transduccin de seales y de energa, transporte de sustratos, comunicacin
intracelular y extracelular como los ms evidentes.
La reactividad entre los agentes oxidantes y las cadenas de dobles enlaces conjugados de los
cidos grasos que conforman la bicapa lipdica es responsable que el proceso de lipoperoxidacin
sea autocataltico y se propague. Su realizacin se hace en las etapas de iniciacin, propagacin
y terminacin y puede tener un comportamiento catalizado por enzimas o ser independiente
de ellas. Por ejemplo, el metabolismo del cido araquidnico es una fuente de ERO, que
puede inducir estrs oxidativo por la va del citocromo P450, el cual interviene en procesos de
destoxificacin por xenobiticos y que adems conduce a la formacin de epxidos derivados
del cido.
En la iniciacin de la lipoperoxidacin participa un ERO que puede ser el hidroxilo (OH),
capaz de abstraer un tomo de hidrgeno en el esqueleto carbonado del cido. Este carbono
afectado se estabiliza mediante un arreglo molecular que genera un dieno conjugado, el cual
reacciona con el oxgeno molecular y forma el radical peroxilo RCOO o el LOO. Con la
accin oxidante de esta molcula el radical formado atrae un hidrgeno metilnico del cido
graso contiguo y queda como hidroperxido ROOH. La respuesta se propaga y termina por
la accin de un antioxidante como uno de los tocoferoles o carotenos. Estos antioxidantes
recuperan su accin por medio de sustratos tioles reducidos como el glutatin, con la
ubiquinona o con el cido ascrbico.
Los efectos de la lipoperoxidacin significan que pueden formarse dmeros o entrecruzarse
los radicales de los cidos grasos y forman conglomerados con los cuales se pierde la fluidez
de la membrana. Los hidroperxidos acumulados se descomponen en diversos compuestos
y los principales son el malondialdehido, el hexanal y el 4-hidroxinonenal. stos pueden
reaccionar con otras molculas con efectos dainos. Los radicales ROO formados en este
proceso lipoperoxidativo tienen la capacidad de inhibir tanto la transcripcin del DNA como
el gradiente de Ca2+ a travs de la membrana, y ste causa dao a la Ca-ATPasa en sus
grupos tioles, pudiendo ser en caso extremo, un evento desencadenador de muerte (Zenteno
and Saldaa 2008).
Accin sobre el DNA
Las especies reactivas de oxgeno y nitrgeno que actan sobre el DNA son de variada ndole
pero todas con consecuencias determinantes a la salud porque afectan seales de transduccin,
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proliferacin celular y comunicacin intracelular. Los daos pueden mostrarse como

mutaciones, transformaciones carcinognicas y en trmino final ocasionar la muerte.
Los investigadores se han dado cuenta que las especies en cuestin abarcan a los radicales
de oxgeno superxido, oxgeno singulete, perxido de hidrgeno, hidroxilo, hidroperoxilo,
hidroperxidos orgnicos, alcoxilo y peroxirradicales (O2-, 1O2, H2O2, OH, HO2, ROOH,
RO, RO2 respectivamente) y a los nitrogenados xido ntrico y peroxinitrito (NO y ONOO). Los radicales superxido sufren un proceso de dismutacin capaces de generar H2O2. En
presencia de metales como el Cu+ o el Fe2+, el agua oxigenada es convertida por la reaccin de
Fenton en radical hidroxilo (OH) que tiene un gran poder oxidante. Dicho radical es capaz
de abstraer tomos de hidrgeno del DNA y de formar aductos que son lesivos a la lectura de
la informacin gnica.
Tambin se ha mostrado que el radical peroxinitrito que proviene de la accin entre el xido
ntrico (NO) y el radical superxido (O2-), se forma en macrfagos y neutrfilos en los
procesos de inflamacin y se le reconoce como actividad mutagnica.
En resumen, puede decirse que entre los efectos de las especies reactivas de oxgeno y nitrgeno
sobre el DNA, estn los daos a las bases, a sus azcares, entrecruzamiento de protenas con
el DNA, rupturas de una sola cadena y de doble cadena as como formacin de sitios absicos.
La guanina que tiene un bajo potencial de ionizacin es susceptible de ser oxidada por
los radicales hidroxilo, oxgeno singulete y peroxinitrito. La adicin del OH al C8 de
2-desoxiguanosina produce un radical de aducto-C8-OH que puede llevar a la formacin
de 8-oxo-7,8-dihidro-2-desoxiguanosina (8-oxo-Guo). Las lesiones oxidativas sobre la adenina
son semejantes en su formacin pero el dao permanece por menor tiempo. La timina y la
citosina tambin son sensibles a desaminaciones por los radicales nitrogenados y responden
finalmente con mutaciones o rupturas de cadena.
Las reacciones con el radical hidroxilo son muy rpidas y poco especficas; en cambio, con
el radical de oxgeno singulete son muy especficas y se tienen datos de la formacin de
8-oxodGuo como producto final. Es importante completar que la formacin de aductos
tambin se ve aumentada por la lipoperoxidacin, cuyos productos pueden ser el 4-hidroxi2-nonenal, el malonaldehdo, la acrolena y el crotonaldehdo. Estos electrfilos reactivos
pueden alquilar las bases del DNA con la generacin de las respuestas mutagnicas, antes
mencionadas (Medeiros 2008).
La apoptosis
La apoptosis se ha considerado relacionada con el estrs oxidativo. En la actualidad, la
comprensin del fenmeno se ha definido con mucha mayor precisin, lo que ha permitido
hacer distinciones de orden molecular en isoformas, pesos moleculares, estados fosforilados
o desfosforilados, concentraciones crticas de las reacciones que se llevan a cabo, donde
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cada condicin por s sola es capaz de generar transformaciones. De manera consecuente,

la conjuncin de dichos detalles micromoleculares establece una red de comportamientos
dinmicos. En este momento se tiene un esquema muy complejo de las interacciones en cascada
que se dan en el fenmeno y las maneras en que ste es regulado. En una etapa temprana, la
apoptosis se vincula con sistemas que generan xido ntrico (NO) y con la NADH oxidasa
que produce superxido (O2-) y perxido de hidrgeno (H2O2). La primera correlacin entre
el estrs oxidativo y la apoptosis tom evidencia por el conocimiento de los miembros de una
familia de protenas, las Bcl-2, y otras que no slo interfieren con la apoptosis sino que inducen
mecanismos que neutralizan el dao del estrs oxidativo. En la actualidad, los investigadores
de este fascinante campo de comportamiento celular enfatizan que en algunos procesos el
estrs oxidativo es una causa para llevarse a cabo la apoptosis y en otras, el estrs oxidativo es
una consecuencia de este tipo de muerte celular (Gmez et al. 2008).
Discusin
A la luz de la informacin de los daos que las especies reactivas de oxgeno generan en las
molculas fundamentales de los sistemas biolgicos, parece plausible relacionar la informacin
terica con muchos datos de la toxicidad por contaminantes ambientales y en el caso concreto
con H y EH referida en los estudios realizados en sistemas in vitro como en resultados en
organismos vivos, los cuales son escasos.
En este sentido los estudios de cnceres citados por Tessier y Matsurama (2001), Cassidy et
al. (2006) y Valavanidis et al. (2006) son concluyentes, puesto que los mismos investigadores
hacen sealamientos de estrs oxidativo responsable de peroxidacin de lpidos de membrana,
de dao a protenas y de entrecruzamientos internos de DNA as como entrecruzamientos del
DNA con protenas.
La informacin que se tiene sobre la muy alta reactividad de las ERO, su presencia en diversos
fenmenos, desde la actividad respiratoria en mitocondria, la iniciacin del proceso apopttico
y muchas ms, conduce a darse cuenta que la clula tiene estrategias para vivir en los ambientes
aerbicos y ha evolucionado hasta tener activos mecanismos reguladores para contender de sus
potenciales daos. La actividad reguladora ms estudiada es el paquete reductor que las clulas
generan por medio de vas metablicas como el ciclo de las pentosas y la produccin de NADH.
Adicionalmente, actan los sustratos reducidos como el glutatin y las enzimas antioxidantes
como las superxido dismutasas, las glutatin transferasas, la glutatin peroxidasa y la catalasa.
La presencia de carotenos, cido ascrbico, tocoferoles y el selenio reafirman la actividad
antioxidante con las cuales los organismos neutralizan el dao por el estrs oxidativo. Esta
serie de acoplamientos modula el estado redox de los compartimentos celulares protegiendo
las estructuras y con ello, las funciones que la clula realiza.
De tal modo que la disminucin de sustratos y enzimas antioxidantes sealada en las
investigaciones de Dehn et al. (2004) se relaciona claramente con la actividad de las ERO.
Estos valores encontrados dan cuenta que los sistemas de estudio estn siendo sujetos del
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efecto oxidante. Los autores hallaron disminuidas las concentraciones de glutatin y vieron
modificadas las concentraciones de enzimas antioxidantes glutatin-S-tranferasas, catalasa y
superxido dismutasa.
Es muy conocido que existe una diversidad de isoformas del sistema de monooxigenasas,
la familia del P450, las cuales estn implicadas en reacciones de hidroxilacin, oxigenacin,
peroxidacin y epoxidacin en casi la generalidad de los organismos de la escala filogentica.
Por la clara proximidad entre la implicacin de estas protenas y las respuestas de disruptores
endocrinos que el heptacloro y su epxido expresan (Dehn et al. 2004 y Laville et al. 2006),
se puede inferir que los radicales libres generados tienen consecuencias en el estrs oxidativo
manifiesto. Se ha estimado que en la mitocondria de clulas de mamferos, la concentracin de
intermediarios en estado estacionario para la especie hidroxilo OH es del orden de 1 x 10-16
M, con una vida media de 1 x 10-9 s, y que el DNA mitocondrial es ms susceptible a daos que
el DNA nuclear (Yakes and Van Houten 1997).
De acuerdo a lo expuesto, entre los efectos de las ERO sobre el DNA estn la formacin
de aductos que Laouedj et al. (1995) evidenciaron con la formacin de desoxi-8-guanosina,
adiciones covalentes que no permitieron la lectura correcta de la informacin gnica y sta se
manifest con mutagnesis. Cuando la respuesta fue de proliferacin celular, la cual se expres
como oncognica para el EH, se encontraron aumentadas las concentraciones de quinasas
(Hansen y Matsurama 2001a), reguladores del ciclo celular y la protena p53 dej de funcionar
como un factor protector ante la tumorignesis, segn los datos ofrecidos por Chuang y
Chuang en 1998. Es posible tambin que el efecto sobre mecanismos de reparacin del DNA
por escisin de bases sealada por Suralls et al. (1995) sea una consecuencia del dao que las
ERO generan en las purinas y pirimidinas que constituyen la estructura del DNA.
Una de las investigaciones que analiz la respuesta del heptacloro como un promotor de
mutagnesis fue la de Okoumassoun et al. (2003). En el trabajo realizado, los autores dieron
evidencias del comportamiento de la familia de Bcl-2, sus isoformas y su vinculacin con la
apoptosis que se bloque con la incorporacin de heptacloro en concentraciones 10 mM. La
orientacin que convendra obtener a la luz de las ERO sera verificar si el superxido (O2-)
o algn otro radical interviniese, en qu momento y organelo se generase y de esa manera,
ratificar con su identificacin, su implicacin en la actividad mutagnica.
Tambin es factible conectar el dao inmunolgico analizado por los estudios de Rough et
al. (1999) y los datos presentados por Smialowicz et al. (2001) con la informacin que en los
macrfagos y neutrfilos se generan respuestas conectadas con los radicales de xido ntrico
(NO) y superxido (O2-) en los procesos inflamatorios.
Llama la atencin la interrelacin que hacen algunos estudiosos si la alteracin en la
incorporacin de calcio inico (Jangi et al. 2008) por la presencia de epxido de heptacloro
(Hansen et al. 2006) lo hace responsable de ser un agente promotor de proliferacin celular
y si tal influencia est dictada por los radicales oxidativos que el txico provoca, entre ellos el
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ROO que a su vez, modifica la sntesis o la conformacin de la Ca.-ATPasa. En la calidad del

calcio inico de ser un segundo mensajero, sera conveniente valorar otras funciones en las que
est involucrado el propio in calcio.
La afirmacin que en los estados de hipoxia o con cloruro de cobalto se producen radicales
oxidantes y la relacin de ellos con los daos en el DNA, mitocondrial sugiere verificar la
equivalencia de este fenmeno a la exposicin con H y/o EH. Est ratificada la informacin
de la ruptura de una sola banda del DNA total que se encuentra con el Ensayo Cometa
(Prado et al. 2008) y parece que hay clara similitud. Por tanto, resulta conveniente comprobar
si en el origen de la respuesta txica al plaguicida, estn involucrados los mismos radicales
generadores de la respuesta hipxica, ya que por hoy, se reconoce al H2O2 como el principal
responsable. El perxido de hidrgeno acta como segundo mensajero en la estabilizacin del
factor inducible por hipoxia, el HIF-1a. Conviene comentar que las investigaciones en esta
rea del conocimiento sealan que en los descensos de oxgeno, el complejo III de la cadena
respiratoria mitocondrial aumenta la produccin del radical superxido y que a travs de los
canales inicos, ste pasa al citosol para ser transformado en H2O2 por la superxido dismutasa
(SOD), y entonces acta en la estabilizacin del HIF-1a (Lluis and Morales 2008). Esta
comprobacin dara explicacin, por lo menos parcialmente, a la disminucin del crecimiento
y a las dbiles respuestas energticas en los organismos expuestos al txico.
Si en los anlisis de las ERO en las exposiciones a H o al EH se identificara al H2O2 en
concentraciones semejantes, en los organelos y en las mismas condiciones a las manejadas en
los estudios de Yakes y Van Houten (1997), podra reforzarse que la produccin de ERO es
un mecanismo de toxicidad de los plaguicidas de estudio, siendo el origen de algunas de las
respuestas que han sido sealadas. La identificacin del radical superxido (O2-) tambin sera
una va de explicacin, ya que este radical sufre la dismutacin ya referida, que lo convierte
en el H2O2.
Los entrecruzamientos de DNA con protenas y la formacin de aductos que han sido
registrados como efectos txicos de H y de EH, guardan similitud con las respuestas sealadas
por las ERO. Como antes ha sido mencionado, tambin en este caso es conveniente conocer
la naturaleza y proporcin de esas especies de alto poder oxidante que fuesen generadas en
las exposiciones a H y a EH y que tienen efectos sobre los fenmenos de la replicacin y de la
transcripcin del DNA.
Los resultados que se han obtenido acerca de las exposiciones al H y al EH referentes a la
alteracin en la comunicacin celular, ruptura de una banda del DNA y transformaciones
en los mecanismos reparadores del DNA pueden verse de una manera independiente, o
pueden analizarse desde la perspectiva que son las ERO las responsables originales de estas
manifestaciones sobre la informacin codificada en el DNA.
La relacin que se da entre el H y el EH y la toxicidad mediante las posibles vinculaciones
con la produccin de ERO, conduce a una argumentacin que se sostiene en el aspecto
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terico. Es necesaria la confirmacin de estas presunciones sobre las especies generadas en

rganos y organelos diana; ellas darn mayor claridad a los efectos enunciados y seguramente
aumentarn la informacin si dichos radicales, cundo y cmo son responsables de daos tan
diversos.
Seguramente no hay un solo mecanismo de la accin citotxica y genotxica del H y del EH.
Junto con el mecanismo del estrs oxidativo, existe el argumento de participacin de otras
formas de manifestar su toxicidad. Desde la influencia de las propiedades de quiralidad como
ha sido propuesto por Hegeman y Laane (2002), los genticos y los epigenticos (Okoumassoun
et al. 2003), que junto con los primeros, sern motivo del avance de la ciencia en el campo de
la contaminacin ambiental de evidente importancia para la salud.
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La dinmica compleja en electroencefalogramas.

Modelo animal de epilepsia
Electroencefalografa bsica
Las ondulaciones de los potenciales elctricos del cerebro se denominan ondas cerebrales
y su registro es el electroencefalograma (EEG). La electroencefalografa es una rama de la
electrofisiologa, encargada de estudiar la actividad elctrica espontnea que genera el SNC
como resultado de la actividad metablica celular a nivel de la corteza cerebral, los ncleos
subcorticales y el tallo cerebral (Martnez Villar, 1998). Las seales cerebrales se caracterizan
por su frecuencia y amplitud particulares.
En 1928 Hans Berger (1873-1941), psiquiatra y neurlogo alemn, desarroll un mtodo para
registrar la seal elctrica en seres humanos, descubriendo el ritmo de Berger, ahora conocido
como ritmo alfa. Berger es considerado el padre de la electroencefalografa (Teplan, 2002).
La electroencefalografa se utiliza en el estudio, deteccin, diagnstico y tratamiento de
anormalidades cerebrales en trastornos neurolgicos y psiquitricos. El EEG convencional
registra grficamente la actividad elctrica espontnea que se genera en la corteza cerebral.
La actividad rtmica de la corteza cerebral depende de los impulsos que recibe del tlamo,
cuyas clulas originan una inhibicin peridica de las proyecciones talamocorticales con
frecuencia de 10 veces por segundo. La proyeccin de estos impulsos hacia la corteza
cerebral produce potenciales postsinpticos que se registran en el EEG en forma de ondas
con frecuencia de 10 Hz. Las neuronas de la corteza cerebral se encuentran dispuestas
en columnas perpendiculares a la superficie del cerebro, los cambios que se registran son
producidos por la suma de las corrientes que producen estos potenciales, captados por los
electrodos y transformados en una seal electrnica amplificada en el electroencefalgrafo
(Martnez Villar, 2004; Waxman, 2004).
La intensidad de las ondas cerebrales depende del nmero de neuronas y fibras descargadas
de manera sincronizada. La forma de las ondas depende de la actividad cerebral y estado
fisiolgico del individuo. La mayor parte se clasifica en: alfa (entre 8 y 13 Hz); beta (mayor a 13
Hz); delta (entre 0.5 y 4 Hz) y theta (entre 4 y 8 Hz) (Teplan, 2002).
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La dinmica compleja en electroencefalogramas
Un equipo de EEG capta las diferencias de potencial de la corriente elctrica que se producen
entre un electrodo de registro y otro. En el EEG la descarga siempre es contra lateral al sitio
de la manifestacin clnica. El cerebro en su hemisferio izquierdo controla la parte derecha
del cuerpo y viceversa (Martnez Villar, 1998). Un EEG se obtiene mediante la colocacin
de electrodos en una posicin especfica de la corteza cerebral, definida por un sistema de
medicin y terminologa comn, utilizados internacionalmente desde 1958, llamado sistema
10-20. Se realiza mediante la medicin de ciertas reas del crneo, de tal manera que los
puntos correspondientes se encuentran a igual distancia uno del otro (a 10 o a 20%). Cada
electrodo tiene su simtrico en cada lado y se representa con una abreviatura que identifica la
zona del cerebro sobre la que est colocado, creando una nomenclatura formada por una letra
y un nmero (par para el hemisferio derecho e impar para el izquierdo). La lnea de referencia
se identifica por las letra C y Z (correspondiente a Zero). Las letras correspondientes a las
zonas del cerebro son: F (frontal), C (la cisura central o de Rolando), P (parietal), O (occipital),
T (temporal), A (auricular). Sobre la lnea de referencia se colocan los electrodos Fz (frontal
cero o frontal medio), Cz (central medio o vrtex) y Pz (parietal cero o parietal medio) (Franco
Salazar, 2006).
Epilepsia
La epilepsia es un padecimiento crnico caracterizado por crisis recurrentes, debidas a una
descarga excesiva de las neuronas cerebrales. Su definicin formal se formul en 1973, por
la OMS y la ILAE (Liga Internacional contra la Epilepsia) y actualmente se define como la
presentacin crnica y recurrente o repetitiva de fenmenos paroxsticos que se originan por descargas neuronales
desordenadas y excesivas, que tiene causas diversas y manifestaciones clnicas variables. Alrededor del 5%
de la poblacin mundial la padece y la ubicada en el lbulo temporal (TLE) es el tipo ms
frecuente (60%). La etiologa conocida abarca desde problemas perinatales, trauma obsttrico,
trastornos por malformaciones, infecciones, trauma craneoenceflico, parasitosis, herencia,
entre otras. En gran parte de los casos, es desconocida. Los signos y sntomas pueden ser de
tipo clnico (aportados por la historia clnica y la exploracin fsica; los tipos, modalidad y
repeticin de las crisis; la existencia de trastornos neurolgicos, psiquitricos o psicolgicos,
entre otros) o paraclnicos (alteraciones en EEG, IRM o TAG) (Sesin sobre epilepsia, 2006).
El tratamiento de la epilepsia abarca de manera conjunta la administracin de frmacos
antiepilpticos (AED) (alrededor de 65% de los casos), el registro de las crisis y evitar factores
precipitantes. El 40% de los casos no obtiene beneficio con frmacos (epilepsia refractaria), de
este porcentaje, slo el 10% es candidato a ciruga para extirpar el foco epilptico. Los criterios
de clasificacin de las crisis epilpticas son la manifestacin clnica y electroencefalogrfica.
Los periodos en los que se dividen las crisis epilpticas, abarcan desde el momento en que
inicia una crisis, hasta el inicio de la siguiente, considerando los intervalos entre una y otra.
Los trminos utilizados para cada etapa son (Esteller et al., 1999) el periodo interictal, el
tiempo entre una crisis y la siguiente; el periodo ictal, el tiempo cuando la crisis se manifiesta
y desarrolla; el periodo preictal, el tiempo que precede a un periodo ictal, el periodo
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postictal, el que sigue a un periodo ictal; el inicio clnico, el momento en que una crisis
clnica es percibida por un observador externo que est observando al paciente cuyo EEG
est siendo registrado y el inicio electroencefalogrfico, el momento en el que una crisis
comienza, marcado visualmente por un experto al analizar el EEG.
La complejidad cerebral
Sistemas complejos y caos. No existe una definicin exacta para sistema complejo, sin
embargo, la complejidad implica ciertas propiedades; un sistema complejo posee un gran
nmero de grados de libertad o variables independientes, est compuesto por elementos
simples que modifican su estructura de acuerdo al intercambio que reciben del entorno y de sus
propias interacciones; presentan las leyes de potencia (de colas pesadas) en las distribuciones
de frecuencia de sus eventos; son inestables en su mayora y dado que cualquier variacin de
alguno de sus elementos puede ocasionar un cambio global en todo el sistema, se consideran
impredecibles. Estas variaciones provocan que se encuentre continuamente entre un estado de
orden y desorden o caos. Se considera que el caos es el comportamiento aperidico a largo
plazo de un sistema determinstico limitado que presenta dependencia sensible a las condiciones
iniciales (Clinton J., 2003). Cuando un sistema dinmico no lineal tiene un comportamiento
impredecible, se le llama sistema catico. Los mtodos no lineales para el estudio de sistemas
dinmicos, basados en la teora del caos, han logrado resultados satisfactorios para identificar
parmetros patolgicos en medicina. Actualmente an se estudia el comportamiento catico
del cerebro, tratando de determinar el comportamiento de la compleja red neuronal, el papel
de los neurotransmisores y el efecto de los frmacos (Bahrami B., 2005 y otros).
La complejidad del cerebro. El cerebro posee caractersticas de un sistema complejo,
dinmico, lo que indica que es recomendable el uso de herramientas de anlisis no lineal
para su estudio (Litt et al., 2002). En la literatura se han reportado numerosos estudios de
EEG en diferentes estados fisiolgicos en personas sanas y con distintos trastornos neuronales:
durante el sueo, en vigilia, en estado de meditacin o estimulacin, con trastorno bipolar,
depresin y Alzheimer (Kannathal et al., 2004; Lutz et al., 2004; Susmakova, 2004; Jeongn,
2002; Bahrami et al., 2005). La epilepsia ha sido el padecimiento ms ampliamente estudiado
(Martinerie et al., 1998; Chavez et al., 2003; DAlessandro et al., 2003; Le Van et al., 2003,
2005; Winterhalder et al., 2003, 2006; Maiwald et al., 2004; Lutz et al., 2004; Harrison 2005;
Mormann et al., 2005, 2006).
En el caso de la epilepsia, el primer propsito de caracterizar matemticamente lo que sucede
en el cerebro en una crisis y bajo la accin de un antiepilptico analizando EEG antes, durante
y despus, es definir comportamientos que permitan detectar la aparicin de sta, i.e. qu
cambios ocurren en el EEG cuando comienza y usar estos parmetros para identificarla antes
de que inicie.
Actualmente, en el software de equipos electroencefalogrficos digitales, se ofrecen herramientas
de anlisis, que incluyen detectores de inicio de crisis en rangos de frecuencia difciles de
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detectar por observacin clnica (Stellate, Harmonie Signal File Browser Software, 2007). Sin
embargo, no son suficientes para el especialista. Al no ser ptima la tasa de falsas detecciones,
no se resuelve el problema de la revisin manual de todo el registro. An se encuentran en fase
de investigacin mtodos que permitan una deteccin correcta en registros de largo plazo y en
lnea. Por otro lado, un mtodo de prediccin debera ser capaz de anticipar una crisis inminente,
disparando una alarma, en un lapso de tiempo antes del inicio, que permitiera la intervencin
de un mecanismo para evitarla. Es ms probable la identificacin, caracterizacin y prediccin
cuando se presenta una transicin entre un periodo interictal y preictal, esto ocurre en las crisis
de tipo focal.
Mormann (2007) realiz una compilacin de los estudios sobre prediccin de crisis epilpticas
realizadas en las ltimas dcadas, desde los aos 70 cuando se realizaron los primeros intentos
por determinar precursores de crisis. Las mediciones utilizadas han sido de diversa ndole,
entre ellas: energa acumulada, sincrona/complejidad, densidad de correlacin, dimensin
de correlacin, disimilaridad, entrenamiento dinmico, entropa de Kolmogorov, densidad de
Lerner, predictabilidad marginal, clustering de fase, sincronizacin de fase, periodograma de
signo, ndice de similaridad, red neuronal simulada y sincronizacin/correlacin. Maiwald
(2004) define lo que idealmente sera una correcta prediccin: despus de la seal de alarma,
durante el tiempo mnimo de intervencin, no ocurre ninguna crisis, sino hasta que inicia el horizonte
de prediccin. Las crisis que suceden fuera del horizonte de prediccin no son anticipadas por el
sistema y se clasifican como falsos negativos. Las seales de alarma que no son seguidas de una
crisis durante el horizonte de prediccin, son predicciones falsas, mientras que cuando la crisis
s ocurre, se trata de una prediccin verdadera.
El estado del arte en el tema tanto de deteccin como de prediccin de crisis epilpticas est en
continuo desarrollo, beneficindose de los avances tecnolgicos respecto a almacenamiento
y velocidad de procesamiento de los algoritmos. Peridicamente se han realizado eventos
como el International Workshop on Seizure Prediction (Lehnertza et al., 2005), cuya cuarta
emisin se llevar a cabo en Kansas, EUA, en Junio de 2009 (http://www.iwsp4.org). El
tercer evento realiz en octubre de 2007, en Freiburg, Alemania, en donde se presentaron
investigaciones que actualmente se llevan a cabo alrededor de mundo. Los enfoques de dichas
investigaciones se presentan en distintos vrtices: aproximaciones tericas de prediccin de
crisis; modelizacin de clulas y redes neuronales y aproximaciones experimentales en cortes
in vivo; estado del arte en deteccin de crisis y formas de onda y su aplicabilidad en sistemas
de intervencin y alarma; transiciones interictal-ictal en modelo animal y EEG humano;
modelacin dinmica y anlisis estadstico; control de crisis: implementacin tcnica de
sistemas de ciclo cerrado y desarrollos recientes en prediccin de crisis. Se presentaron
tambin los enfoques de la industria para la comercializacin de dispositivos de alarma/
prevencin, analizando restricciones tecnolgicas y requerimientos de aplicacin clnica.
Entre los mtodos utilizados para la deteccin de crisis sobresalen: el anlisis de frecuencias,
el reconocimiento de patrones, la sincronizacin de fase, el anlisis de microcrisis y otras
oscilaciones. En prediccin se utilizan entre otros, redes neuronales no lineales, anlisis con
mtodos estocsticos, sistemas neurodifusos, anlisis espectral, teora de la matriz aleatoria,
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aproximaciones de sincronizacin multivariada y modelo de pequeo mundo. Hasta la fecha,

no existe algoritmo alguno cuyo rendimiento sea suficientemente superior al de un sistema
aleatorio de prediccin de crisis, por lo cual, los esfuerzos continan. Florian Mormann,
fsico y mdico experto en el tema, enfatiza que la tendencia en prediccin de crisis debe
enfocarse sistmicamente, sobreponindose al estudio nico de clulas o redes de clulas. Los
temas a enfocarse: la transicin interictal-ictal, beneficindose del estudio de la neurofisiologa
animal, la dinmica de redes y la modelacin de seales electrofisiolgicas (3rd Workshop on
Epileptic Seizure Prediction, 2007).
EEG como serie de tiempo. Para el anlisis estadstico de un registro de EEG, ste puede
considerarse como una serie de tiempo: una secuencia de datos de una variable, registrados
en intervalos de tiempo sucesivos e iguales. Una serie de tiempo permite modelar y comprender
el mecanismo que describe aquello que produjo los datos, as como monitorear, predecir y
controlar el fenmeno. El anlisis de series de tiempo considera que los datos registrados poseen
una estructura interna, como la auto-correlacin, la variacin estacional y la tendencia. Las
series de tiempo se utilizan entre otras aplicaciones, en prediccin, en trminos de comparar
su rendimiento predictivo bajo distintas condiciones (Clinton Sprott, 2003).
El uso de la dimensin fractal para la deteccin y prediccin de crisis epilpticas

La geometra fractal es una teora matemtica derivada de la teora del caos, que fue
desarrollada por el matemtico polaco Benot Mandelbrot, en 1977. Tambin llamada teora
de fractales, es un lenguaje matemtico utilizado para caracterizar fenmenos que presentan
invarianza de escala, su propiedad principal; el mismo modelo es vlido para todas las escalas.
Mandelbrot defini como fractal aquello que tiene una forma, bien sea sumamente irregular, bien
sumamente interrumpida o fragmentada y sigue siendo as a cualquier escala que se produzca el examen. Los
fragmentos de un objeto fractal son copias exactas o estadsticas del todo y pueden hacerse
coincidir con el objeto en su totalidad creciendo o decreciendo su escala (Mandelbrot, 1997;
Balankin A.S., 2003). La dimensin fractal es un cuantificador de la complejidad que describe
el comportamiento de un fenmeno. Se refiere al nmero mnimo de variables independientes
necesarias para representar el fenmeno. Otra caracterstica primordial de los fractales es la
autosimilitud (self-similarity). A un fractal que no vara bajo ciertas transformaciones de escala,
se le llama autosimilar, es decir, cada segmento del objeto tiene las mismas caractersticas del
objeto en su totalidad. Estadsticamente, en cada rea del fractal se conservan las propiedades
globales (Mandelbrot, 1997). Los fractales pueden ser determinsticos, cuando son exactamente
(o geomtricamente) autosimilares, al menos en el lmite de una escala pequea; o aleatorios,
cuando nicamente son autosimilares estadsticamente.
El EEG posee autosimilitud estadstica. Se ha desarrollado el espectro fractal de EEG humano
(Kulish et al., 2006) y se han utilizado parmetros fractales para identificacin de diferencias
en periodos preictales e ictales (Esteller et al., 2000 entre otros). Existe una gran variedad
de mtodos para calcular la dimensin fractal de fractales autosimilares, cada uno de ellos
utilizado para distintos tipos de datos. Tambin puede describirse su comportamiento fractal a
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travs de la estimacin de parmetros como el exponente de Hurst (H), el cual determina la

persistencia de una serie de tiempo, estableciendo la dependencia a largo plazo.

H est definido como:
H = log(R/S)/log (T)
(1)
donde T es la duracin de la muestra de datos y R/S el valor correspondiente del rango reescalado.
Est relacionado con la dimensin fractal como:
D = 2 H
(2)
Si H = 0.5 el fenmeno se considera aleatorio o ruido blanco; si 0.5 < H se le considera

persistente (existe invarianza de escala asociada a correlaciones positivas a largo plazo); si 0 <
H < 0.5, es considerado antipersistente (existe invarianza en la escala asociada a correlaciones
negativas a largo plazo)
Kannathal et al., (2004) afirm que la no estacionalidad local est presente usualmente
en datos fisiolgicos y puede comprometer la habilidad de algunos mtodos para estimar
la autosimilitud. En el caso de las series de tiempo de EEG, el exponente de Hurst puede
caracterizar el comportamiento no estacionario. Existen varios mtodos para calcular H.
Mtodo del Rango Reescalado (R/S)
Propuesto por Mandelbrot y Wallis, se utiliza para calcular el exponente de Hurst como
parmetro de autosimilitud y para estimar la dependencia a largo plazo de una serie de tiempo.
Para una serie de tiempo de longitud n, X = {X, :t = 1,2,..., n}, R/s se define como el cociente
del rango mximo normalizado de la seal integrada R(n) entre la desviacin estndar S(n):
R(n) max {0,r, :t = 1,2,...,n}- min{0,rt : = 1,2,..., n}
=

S(n)
S2 (n)
n
k
t =1 X t
n

donde:
rk =
t =1
Xt
1/2
n
n
2
1
1

S(n) = X t X t
n t=1
n t=1
(3)
(4)
(5)
La exactitud en el clculo de H en todos los intervalos de tiempo, depende del nmero de

datos que sean utilizados.
Si es razonablemente grande (es decir, cuando el intervalo del
tiempo mximo es trazado varias veces), se espera que la curva R/s proporcione informacin
sobre la auto-similitud de todos los intervalos de tiempo. Si el tiempo registrado posee slo
correlaciones a corto plazo, entonces la grfica en escala logartmica es tambin una lnea recta
con pendiente de 0.5 (Benoit Software).
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Mtodo de rugosidad-longitud
Se utiliza la desviacin estndar o rugosidad de la raz cuadrada de la media de los datos, en
las escalas de tiempo t . Para un trazado auto-afn, la rugosidad SD, medida en una escala de
tiempo t , est relacionada con H como:

SD ?H
(6)
donde SD es la desviacin estndar.

Mtodo del Variograma
La distribucin del tiempo de Xi puede ser caracterizada por una funcin de semivarianza,
llamada variograma, la cual se define como:

1
V(n) =
(X X )

(7)
2N
N/2
i= 0
i+n
donde N es el nmero de parejas de puntos separados por un intervalo n (el desfasamiento del
intervalo). Cuando la semivarianza

estimada es graficada contra n, sta puede aproximarse
asintticamente a un valor constante (umbral) o puede incrementarse sin lmites conforme
aumente n. Los variogramas sin lmites sugieren que la variacin est dndose en un rango
continuo de escalas de tiempo. Tanto el variograma transitivo, con un umbral finito, y los
variogramas sin lmites pueden ser analizados en una grfica a escala logartmica. Si el
logaritmo de una semivarianza es graficado contra el logaritmo de n, entonces la pendiente es
2H. Por consiguiente:
(8)
(Benoit Software).
Teora de rugosidad cintica. El comportamiento de los sistemas dinmicos complejos

presenta una invarianza a diferentes escalas en sus variables, ya sea temporales o de espacio.
Esta caracterstica permite su estudio a travs del escalamiento dinmico derivado de la teora de
rugosidad cintica, que en trminos generales, estudia el crecimiento de superficies en medios
no homogneos (condiciones de no-equilibrio). Una de sus aplicaciones es la caracterizacin y
modelacin de fluctuaciones de series de tiempo del mundo real (Balankin A.S., 2007) y se ha
utilizado, junto con la teora de fractales, para estudiar modelos de crecimiento de superficies
rugosas (Barabsi A.L., Stanley H.E., 1995; Ramasco et al., 2000). Existen procesos que no
tienen una superficie como tal, pero eligiendo las variables adecuadas, puede mapearse a una
funcin matemtica cuya rugosidad es susceptible a un anlisis con los mismos mtodos que las
interfaces reales (Barabsi A.L., Stanley H.E., 1995).
La funcin estructura por permite analizar la memoria a largo plazo en las fluctuaciones de las
series de tiempo:

(9)

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la barra denota un promedio de toda t en una serie de longitud T-t; T es la longitud de la serie
original z(t). Los corchetes angulares denotan un promedio entre diferentes muestreos de la
ventana de tiempo de tamao dt (Balankin A.S., 2007).
El espectro de potencia como la funcin estructura presentan un comportamiento de ley
de potencia: s a (dt)z y S a q-q con q = 2z+1. El exponente de escalamiento z (o de
Hurst) caracteriza la fuerza de las correlaciones de largo plazo en el comportamiento
de las fluctuaciones (Balankin A.S., 2007). Sin embargo este parmetro no determina el
comportamiento de escalamiento universal, que clasifica una gran variedad de modelos en
trminos de su comportamiento colectivo (dor G., 2003). La dinmica de las fluctuaciones
de series de tiempo puede comprenderse bajo el estudio de la correlacin de variables locales
en diferentes intervalos de muestreo. La autoafinidad de las fluctuaciones de series de tiempo
se caracteriza por el comportamiento de escalamiento. Cuando la funcin de estructura
presenta un comportamiento de z constante en intervalos de dt, el exponente dinmico z
est dado por:
t c
(10)
El espectro de potencia y la funcin de estructura a su vez escalan con el intervalo de muestreo

t como:
(11)
y
donde es el exponente de crecimiento. Estos exponentes de escalamiento satisfacen la

relacin de escalamiento z = z/.
Los procesos de crecimiento pueden dividirse en clases de universalidad de acuerdo a los

valores de los exponentes caractersticos como el de escalamiento (Hurst), el de crecimiento
y el de rugosidad local o global. Particularmente para determinar la clase de universalidad de
la dinmica de fluctuacin asociada a los dos exponentes de escalamiento independientes: z
y z. El conocer una clase de universalidad permite comprender los procesos que gobiernan
la dinmica del sistema y as caracterizar, modelar y hacer prediccin de series de tiempo de
diferente naturaleza (Balankin et al., 2007).
Anlisis de EEG de modelo animal de epilepsia. Un modelo animal se refiere a un
animal que puede presentar una enfermedad igual o similar que en los seres humanos. Se usa
para estudiar el desarrollo y evolucin de las enfermedades y para probar nuevos tratamientos
antes de ser administrados en seres humanos. Existen varios tipos de modelos animales experimentales
de epilepsia, con los que se logra inducir una condicin persistente del tipo epilptico, provocando
sensibilidad a la generacin de crisis y permite el anlisis de la generacin de las crisis, as como
de las transiciones de periodos interictal a ictal, e ictal a postictal y del efecto de medicamentos.
Algunos modelos usados en roedores son: mutaciones espontneas, modelo qumico, estatus
epilepticus, radiacin, Kindling, modelo crnico lmbico, gentico (3rd Workshop on Seizure
Prediction, 2007).
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En los siguientes prrafos se describe una investigacin realizada por un grupo interdisciplinario
del Instituto Politcnico Nacional, la Universidad Autnoma Metropolitana y el Instituto
Nacional de Neurologa y Neurociruga Manuel Velasco Surez.
1) Identificacin del problema: Se han publicado diversos estudios en los ltimos aos, relacionados
con la caracterizacin de EEG, con el propsito de predecir la ocurrencia de las crisis
epilpticas. Un tema abierto a la investigacin en este campo es la caracterizacin estadstica
de EEG epilptico bajo distintas condiciones, por ejemplo, el mecanismo de accin de
frmacos antiepilpticos in situ (Duncan J., 2002; Mormann et al., 2006). El objetivo de esta
investigacin est centrado en la caracterizacin del comportamiento cerebral en el inicio y
desarrollo de una crisis, particularmente originada en el lbulo temporal de ratas, mediante
el anlisis estadstico y fractal de EEG bajo el efecto de un frmaco epilptico ocluido en un
reservorio nanoestructurado de liberacin controlada.
2) Hiptesis: El comportamiento de las reas cerebrales involucradas en la crisis epilptica
no permanece con la misma tendencia en el periodo interictal, por lo que es identificable la
transicin ictal. En reaccin al efecto del frmaco liberado, se recobra un comportamiento
cercano al periodo de control. La determinacin de los parmetros que gobiernan la dinmica
del fenmeno posibilitar su modelacin en trminos de la teora de rugosidad cintica y
permitir hacer prediccin de las series de tiempo de estas variables dinmicas.
3) Obtencin de datos: Los EEG digitales se obtuvieron en el Instituto Nacional de Neurologa
y Neurociruga Manuel Velasco Surez. Provienen de dos grupos de ratas Wistar (180
a 250 grs.), cada uno formado por 5 ratas estimuladas mediante Kindling qumico: con la
administracin de PTZ (pentilenetetrazol) (35mg/kg) en periodos de tiempo continuos, se
generaron crisis epilpticas en cinco fases definidas por Racine (Racine R.J., 1972), desde
movimientos oculares, hasta una crisis generalizada. Los EEG fueron tomados en las distintas
etapas del mtodo, en las tres fases de las crisis (interictal, ictal y postictal). El nmero de
estimulaciones de PTZ administradas es 8 en dosis promedio de 25 ui. Al segundo grupo
de ratas se les insert en la amgdala basolateral (ABL), mediante ciruga estereotxica,
un reservorio de estructura nanomtrica de titania sol-gel, en el que se ocluy un frmaco
antiepilptico: cido valproico (VPA) (Lpez et al., 2006). En la figura 1 se muestra el lugar de
colocacin del reservorio en una imagen del Atlas Estereotxico del cerebro de la rata.
Para el grupo de ratas sin reservorio, se colocaron dos electrodos formando tres canales (conector
de 5 terminales: tierra, corteza izquierda y corteza derecha en montaje referencial y amgdala
en montaje bipolar) mientras que para el grupo de ratas con reservorio, se colocaron un par
de electrodos formando un solo canal (conector de 3 terminales: tierra y corteza izquierda y
derecha en montaje bipolar).
Se realizaron los registros de los electroencefalogramas en un equipo de video EEG de 18
canales, con un muestreo de 200 MHz. Los registros se realizaron cada tercer da, comenzando
con un periodo de control y posterior a la administracin del PTZ, durante un lapso de tiempo
de 20 minutos.
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Figura 1. Lugar de colocacin del reservorio. Fuente: Adaptado de Bregma 2.30 mm en Paxinos y
Watson (1998)
4) Anlisis experimental: Los EEG fueron segmentados para su procesamiento por etapas de las
crisis: periodo de control, preictal, ictal y postical y divididos en ventanas de 5 y 10 segundos.
En la figura 2 se observa el periodo de control y una crisis en fase IV de la escala de Racine.
a)
b)
Figura 2. EEG en periodos de a) control, b) ictal en fase IV de una rata con reservorio de Ti2O con cido
Valproico
Se obtuvo z mediante mtodos de trazado auto afn, con el software Benoit (anlisis de rango
reescalado, longitud de rugosidad y variograma).
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Resultados
En los resultados preliminares de la investigacin, el primer grupo de ratas con Kindling se
presenta una tendencia a la persistencia, incrementando z conforme la crisis se desarrolla.
En el comportamiento de los resultados esperados con EEG de ratas con el reservorio
nanoestructurado insertado ocluido con cido valproico, el valor se estabiliza hacia lo
presentado en periodo de control, proporcionalmente a las fases de crisis.
Figura 3. Variacin del exponente de escalamiento z para los periodos preictal, ictal y postictal
Los exponentes de escalamiento y z permitirn la modelacin de estas series de datos,

correspondiente a alguna clase de universalidad, lo que permitir realizar predicciones de su
comportamiento.
Conclusin
El comportamiento complejo y fractal del cerebro puede estudiarse mediante el anlisis con
mtodos no lineales de las seales elctricas. Actualmente el rea de investigacin en deteccin
y prediccin de crisis epilpticas se encuentra en desarrollo, beneficindose de aportaciones
provenientes de estudios con modelos animales, para el mejoramiento de tratamientos
farmacolgicos, con el propsito de desarrollar dispositivos de liberacin controlada.
El presente trabajo an se encuentra en etapa de desarrollo, en la obtencin de y es parte de
una investigacin conjunta de las instituciones mencionadas.
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Farmacocintica y farmacodinamia
Introduccin
La farmacologa es la ciencia que estudia las drogas: lo que son, como trabajan y que es lo que
hacen. Esta ciencia se divide en farmacocintica y farmacodinamia.
La farmacocintica es la parte de la farmacologa que estudia las concentraciones de un
frmaco en el organismo, en funcin del tiempo y de la dosis (Mycek et al., 1997). Estudia,
desde el punto de vista dinmico y cuantitativo, los fenmenos que determinan la disposicin
de un frmaco en su lugar de accin (adsorcin, distribucin, biotransformacin y
eliminacin de frmacos) (figura 1) a partir de la forma de dosificacin bajo la que se
administra. Tales factores, determinarn la concentracin del frmaco en el lugar de accin y
de la cual depender en gran parte, la accin teraputica de la droga. De manera ms simple,
podemos definir a la farmacocintica como las modificaciones que impone el organismo al
frmaco (Malgor et al., 2000).
Figura 1. Fenmenos que determinan la disposicin de un frmaco
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La farmacocintica tambin incluye el conocimiento de los siguientes parmetros (Tozer et al.,

2006; Smith et al., 1993):

Volumen aparente de distribucin

Aclaramiento de la droga (clearance)
Vida media plasmtica
Biodisponibilidad
Para que se pueda llevar a cabo una teraputica cientfica y segura para el paciente, el mdico
debe conocer claramente los mecanismos por los cuales una determinada droga se absorbe,
circula en la sangre y se distribuye.
La absorcin de una droga es necesaria para que esta cumpla su accin farmacolgica en
el sitio de accin (Katzung el al., 1991). Esto implica que la droga debe pasar a travs de las
membranas biolgicas semipermeables, para posteriormente alcanzar la sangre, en donde se
distribuye, circula y se metaboliza para finalmente ser excretada por el organismo.
Factores fsicos que determinarn el proceso de absorcin son (Domnguez.Gil et al., 2001):
a) Flujo sanguneo en el sitio de adsorcin
b) rea total disponible para la absorcin
c) Tiempo de contacto en la superficie de absorcin
Es muy importante conocer los mecanismos mediante los cuales las drogas atraviesan las
membranas celulares, porque de ellos depender la concentracin final en los sitios de accin.
En los procesos de absorcin, se presentan los siguientes mecanismos:

Transporte pasivo
Absorcin convectiva
Transporte activo
Difusin facilitada
Pinocitosis
Absorcin por asociacin de pares de iones
Para todos estos mecanismos, es importante tambin considerar los factores que modifican la
absorcin, como la solubilidad de la droga (se absorbe ms rpido cuando se encuentra en forma
acuosa), la cintica de disolucin de la forma farmacutica del medicamento, concentracin,
circulacin en el centro de accin, superficie de absorcin y va de administracin.
Una vez que el frmaco sufri los procesos de la absorcin, ingresa a la sangre y en el plasma
sanguneo se liga a protenas en parte y el resto circula en forma de molculas libres. La unin a
las protenas es usualmente lbil y reversible, generalmente a travs de enlaces inicos, puentes
o en laces de hidrgeno, fuerzas de Van der Walls y raramente enlaces covalentes. La fraccin
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ligada a las protenas guarda siempre un equilibrio con la fraccin libre. Debe considerarse que
solo esta fraccin de molculas libres puede atravesar las membranas que separan los distintos
compartimentos, por lo que de ella dependen los efectos teraputicos. Cuando molculas de
la fraccin libre salen del plasma y se distribuyen en el organismo, una fraccin equivalente de
molculas se desliga de las protenas y pasa a reemplazar a las molculas de la fraccin libre.
De esa manera la proporcin fraccin ligada/fraccin libre se mantiene constante aunque la
concentracin total vaya disminuyendo progresivamente en el plasma (Curtis et al., 1992).
El transporte plasmtico es tambin un punto importante en el fenmeno de las interacciones
entre drogas. Cuando se administran dos o ms drogas es relativamente frecuente que las mismas
interaccionen a nivel del transporte (Cluter et al., 1994). Esto puede ocurrir cuando dos drogas
que utilizan el mismo transportador plasmtico compiten por el mismo luego de los procesos
de la absorcin. En tal sentido aquella droga que posea mayor afinidad y/o se encuentre en
mayor concentracin desplazar a la segunda del sitio de unin y consecuentemente la fraccin
libre de esta ltima droga se incrementar en el plasma. Los frmacos en su distribucin y
circulacin encuentran algunos tejidos por los que resulta muy difcil su pasaje. Dentro de las
estas barreras, las ms importantes son (Gladtke et al., 1979; Gibaldi et al., 1982):
a) Barrera hematoenceflica: Est localizada entre el plasma sanguneo de los vasos
cerebrales y el espacio extracelular del encfalo. El paso de las drogas en el cerebro
aunque est sujeto a las mismas leyes que rigen el pasaje de drogas a travs de otras
membranas biolgicas, presenta claras diferencias, ya que muchas drogas atraviesan
con mucha dificultad o directamente no atraviesan esta barrera, alcanzando niveles de
concentracin muy diferentes a otros rganos o tejidos.
b) Barrera sangre lquido cefalorraqudeo Esta localizada a nivel de los plexos
coroideos e impide el paso de ciertas drogas al LCR. Los capilares de los plexos
coroideos son similares a los capilares extracraneales, pero se encuentran recubiertos
por clulas epiteliales que posiblemente sean responsables de las diferencias en la
absorcin. En general los antibiticos solo alcanzan un porcentaje de la concentracin
plasmtica cuando se administran por otra va que no sea la intratecal. En tal sentido la
inflamacin de las meninges puede modificar el pasaje de drogas a travs de la misma.
c) Barrera placentaria El conocimiento de este punto es de gran importancia desde el
momento que muchas drogas administradas a la madre pueden ejercer efectos en el feto.
Es especialmente importante la administracin de cualquier droga en el perodo de la
organognesis que comprende en forma prctica el primer trimestre del embarazo, ya
que los frmacos liposolubles, no ionizados pasan con facilidad y por difusin pasiva la
barrera placentaria, por ej. la morfina, anestsicos gaseosos, lquidos voltiles, salicilatos
sulfamidas, benzodiacepinas, neurolpticos, el alcohol, etc. La glucosa y otras hexosas
atraviesan la placenta por difusin facilitada, los iones y aminocidos por transporte
activo, las inmunoglobulinas y protenas por pinocitosis.
d) Barrera hemato-ocular En el ojo el epitelio de los procesos ciliares es una barrera
difcil de atravesar, por ello la mayora de los frmacos, no alcanzan niveles teraputicos
en humor acuoso vtreo, cuando se administran por va parenteral.
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Los frmacos para ser eliminados del organismo deben ser biotransformados o metabolizados
en compuestos polares (Levine et al., 2000). Los mecanismos de biotransformacin de drogas
pueden dividirse en dos grupos, que dependen de distintos procesos bioqumicos En general los
compuestos xenobiticos (Frmacos y txicos) sobre todo aquellos con actividad farmacolgica,
tienden a ser muy lipoflicos y se encuentran no ionizados al pH fisiolgico es por ello que su
excrecin por va renal es muy dificultosa porque aunque por el tamao molecular pueden
atravesar las membranas por filtracin glomerular, sufren un intenso proceso de reabsorcin
tubular.
Los mecanismos de biotransformacin (figura 2) o metabolizacin originan modificaciones
de las drogas llamados metabolitos, que son usualmente sustancias ms hidrosolubles, menos
liposolubles, ms polares y se encuentran ms ionizadas que el frmaco original. Por ello
generalmente total o parcialmente (carecen) de actividad biolgica, no se ligan eficientemente
a las protenas plasmticas, son menos difusibles y se eliminan con mayor facilidad por rin.
Figura 2. Mecanismos de biotransformacin de drogas1
Las reacciones de metabolizacin se pueden dividir en dos grupos fundamentales:

a) Reacciones de Fase I: Catalizadas por los sistemas de citocromos P450 (Cit P450) y afines,
llevan a la formacin de metabolitos intermedios mediante reacciones metablicas reductivas
y oxidativas. Estas permiten posteriormente la conjugacin de los metabolitos intermedios
formados, aumentando as su polaridad, en la llamada Fase II. Las reacciones adversas a
drogas se relacionan con la presencia de metabolitos intermedios en Fase I.
http://www2.uah.es/tejedor_bio/bioquimica_ambiental/imagenes/biotransformacion-complu.gif
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Las enzimas de Cit P450 son una familia compleja de enzimas bajo control gentico de la
que an desconocemos la mayor parte. Bsicamente corresponden a hemoprotenas capaces
de transferir electrones y son de gran importancia en las reacciones de Fase I y generacin
de metabolitos txicos reactivos. Los metabolitos generados por estas hemoprotenas son
principalmente de dos tipos: electrfilos y radicales libres.
Los electrfilos son producidos por la oxidacin de drogas y generan metabolitos reactivos que
actan como arilantes o alquilantes, unindose covalentemente a sitios nucleoflicos, ejerciendo
su toxicidad a travs de la formacin de enlaces covalentes.
Los radicales libres que se producen por reacciones de oxidacin o reduccin de los sistemas
de Cit P450, pueden unirse de manera covalente a protenas o cidos grasos no saturados y
extraen electrones de estos cidos grasos desde fosfolpidos de membrana. Los radicales libres
pueden combinarse con oxgeno y formar radicales peroxidados de cidos grasos, que a su vez
extraen un electrn del cido graso no saturado inmediatamente adyacente. Esto trae consigo
una reaccin en cadena que es capaz de autopropagarse, alterando gravemente la composicin
de las membranas.
b) Reacciones de Fase II: En estas reacciones no interviene la formacin de metabolitos
intermediarios e involucra a una gran variedad de reacciones de conjugacin, donde se
agregan molculas polares tales como cido glucurnico, sulfatos, aminocidos y muy
especialmente glutation (GSH). El GSH juega un papel extremadamente importante por
cunto el principal sitio nucleoflico es el grupo tiol de la cistena y en las clulas, el GSH es
la mayor reserva de tioles. De esta forma, ste sirve como substancia protectora ya que las
GSH transferasas (una familia de enzimas en el hepatocito), catalizan la detoxificacin va
conjugacin de metabolitos reactivos con GSH. As, los metabolitos electroflicos interactan
preferentemente con el grupo tiol de GSH en vez de hacerlo con las protenas constitutivas
de membrana o enzimas, y slo cuando ste se agota los metabolitos electroflicos producen
el dao (Lllman et al., 2004).
Biodisponibilidad y Bioequivalencia
La biodisponibilidad, bioequivalencia y seleccin de drogas han emergido como temas crticos
en farmacia y medicina en las pasadas cuatro dcadas. Con respecto a la disminucin de
gastos que en cuestiones de salud, normalmente suele hacer la gente, el uso de medicamentos
genricos ha incrementado de manera considerable. Tan solo en la dcada de los 90s el 50%
de las prescripciones podan ser sustituidas con un producto genrico2 y cerca del 80% de las
drogas podan obtenerse de al menos ms de una fuente. Con la creciente disponibilidad y
uso de productos genricos, los profesionales de la salud se enfrentan a una enorme lista de
productos, de los cuales deben seleccionar aquellos que son teraputicamente equivalentes.
Miller S.W., Strom J.G., Drug Product Selection: Implications for the Geriatric Patient, The Consultant
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La biodisponibilidad de una droga es la fraccin de droga administrada, que logra alcanzar la

circulacin sistmica (figura 3). Se expresa como la fraccin de droga que consigue acceso a la
circulacin sistmica en su forma qumicamente inalterada. Es una estimacin de la cantidad
de frmaco que puede alcanzar el lugar de accin. La biodisponibilidad suele ser diferente
segn la va de administracin. Se expresa en porcentaje. Nos da la idea de su velocidad de
absorcin y de la cantidad que llega a la biofase de los receptores tisulares en los que debe
ejercer su accin. Un valor de biodisponibilidad oral cercano a uno, significa que el frmaco
se absorbe bien y sufre escaso metabolismo.
Figura 3. Curva de concentracin mxima de un frmaco en plasma.
Tabla I. Factores que afectan la biodisponibilidad del frmaco

Metabolismo heptico de primer paso
Si la droga es rpidamente metabolizada por el

hgado, disminuye la cantidad de droga que llega
intacta a la circulacin sistmica
Solubilidad de la droga
Para que una droga sea rpidamente absorbida

debe ser en gran parte hidrofbica pero tener
una ligera solubilidad en soluciones acuosas.
Inestabilidad qumica
Naturaleza de la formulacin
Tamao
de
partcula,
forma
de
la
sal,
cristalinidad, presencia de excipientes.
El trmino bioequivalencia, se refiere a la velocidad y proporcin en que el mismo principio

activo de dos medicamentos iguales alcanza la circulacin sistmica. Dos drogas son
bioequivalentes si muestran comparable biodisponibilidad y tiempos iguales para logra el pico
de concentracin sangunea (Rosenfeld et al., 2007).
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Figura 4. Niveles del frmaco vs. tiempo. Aqu se representa la evolucin temporal de las concentraciones
sanguneas del frmaco administrado por va intravenosa (curva punteada) o por va oral (curva continua).
Modelos farmacocinticos
Una ecuacin farmacocintica describe las relaciones entre los regmenes de dosificacin y el
perfil de concentracin de la droga en la sangre en funcin del tiempo.
Para que la interpretacin de las relaciones entre concentraciones y efecto sea correcta es
necesario proponer un modelo farmacocintico que simplifique el complejo sistema biolgico
que es el organismo y los procesos que el frmaco experimenta en l. Los modelos se conciben
mediante trminos matemticos que son una forma concisa de expresar relaciones cuantitativas.
El nmero de parmetros necesarios para describir un modelo depender de la complejidad
de los procesos implicados y de la va de administracin y puesto que los parmetros no se
determinan experimentalmente sino a partir de pares de datos concentracin (variable
dependiente)-tiempo (variable independiente), la limitacin en el nmero de datos disponibles
es una de las ms importantes a la hora de estimar parmetros farmacocinticos. Los modelos
empleados en farmacocintica son (Goodman et al., 1996):
1.
2.
3.
4.
Anlisis compartimental (tradicional)

Anlisis anticompartimental
Farmacocintica fisiolgica.
Farmacocintica de poblacin
Los modelos farmacocinticos son tiles para:

Predecir concentraciones plasmticas, tisulares y urinarias con cualquier rgimen de
dosificacin.
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Calcular el rgimen de dosificacin ptimo para cada paciente.

Estimar la posible acumulacin del frmaco o sus metabolitos.
Correlacionar concentraciones de frmaco con efecto farmacolgico o toxicolgico.
Evaluar diferencias en la biodisponibilidad y bioequivalencia de las formulaciones
Describir el efecto de los cambios fisiolgicos o patolgicos en la absorcin, distribucin
y eliminacin de los frmacos.
Explicar interacciones entre frmacos.
La Farmacodinamia se define como el estudio de los efectos bioqumicos y fisiolgicos de los
frmacos y sus mecanismos de accin. Estudia el efecto y mecanismo de accin de los frmacos
sobre el organismo. Efecto es toda modificacin bioqumica o fisiolgica que produce una
droga sobre el organismo. La Farmacodinamia tambin estudia la relacin entre la estructura
qumica de la droga y su actividad farmacolgica. Desde un punto de vista prctico se puede
definir a la Farmacodinamia como los cambios que el frmaco ejerce en el organismo.
Por lo general los medicamentos no crean nuevas funciones sino que modifican funciones
existentes. El mecanismo de accin, se refiere a las modificaciones que ocurren a nivel
molecular.
En funcin de sus propiedades o de la va de administracin, un frmaco puede actuar
solamente en un rea especfica del cuerpo. La interaccin con su diana (rgano o tejido),
produce generalmente el efecto teraputico deseado, mientras que la interaccin con otros
tejidos u rganos puede causar efectos secundarios.
En farmacodinamia, es fundamental el concepto de receptor farmacolgico, que es una
estructura que ha sido plenamente identificada para numerosas drogas. La gran mayora de
los frmacos cumplen su mecanismo de accin a travs de la interaccin con los receptores de
frmacos.
Receptores

Muchos frmacos se adhieren a las clulas mediante receptores que se encuentran
en la superficie de stas. Las clulas en su mayora tienen muchos receptores de superficie que
permiten que la actividad celular se vea influenciada por las sustancia qumicas (frmacos u
hormonas), que estn localizadas fuera de la clula (figura 5). La mayor parte de los receptores
son protenas. Este grupo incluye, aparte de molculas que son propiamente receptoras de
sustancias endgenas (que median la transmisin de mensajes en el organismo), enzimas
importantes de vas metablicas, protenas transportadoras, protenas estructurales, etc.
Un receptor de la superficie de la clula presenta una configuracin que permite que una
sustancia qumica determinada, como un frmaco, una hormona o un neurotransmisor,
pueda unirse a l, dado que dicha sustancia qumica presenta una configuracin que se ajusta
perfectamente al receptor.
Existen dos parmetros fundamentales en la accin del frmaco con el receptor: la afinidad
(mutua atraccin entre el frmaco y su objetivo) y la eficacia o actividad intrnseca (medida
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Figura 5. Esquema de los receptores celulares
de la capacidad del frmaco para producir un efecto farmacolgico). Un ejemplo de accin

sera la accin sobre el centro termoregulador que puede producir un frmaco antipirtico.
Mientras que el efecto de un frmaco podra decirse que es la manifestacin externa de la
accin farmacolgica, en este sentido la disminucin de la temperatura sera el efecto del
antipirtico (Koppanyi et al., 1963).
Hay que tener en cuenta que para que exista efecto farmacolgico es necesaria previamente
la accin farmacolgica y hay que tener en cuenta tambin, que puede haber accin y no
haber efecto.
La accin que un frmaco puede realizar sobre el organismo puede ser accin estimulante,
depresora, sustitutiva, anti infecciosa.
Curva dosis-respuesta
La correspondencia entre la cantidad de txico y la magnitud del efecto es lo que se conoce
como la relacin dosis-efecto o dosis-respuesta.
Una curva de dosis-respuesta es una representacin grfica de la correlacin entre una serie
de dosis, consideradas como la variable independiente y por lo tanto representadas en el eje x
de coordenadas, y el efecto observado, considerado como la variable dependiente y graficado
en el eje y.
Las curvas de dosis-respuesta pueden tomar diferentes formas de acuerdo a los mecanismos que
representan (Velsquez-Lorenzo et al., 1993). En algunos casos es posible obtener una mejor
representacin usando una escala aritmtica para la dosis, como en el caso del estudio de la
inhibicin de la actividad de colinesterasas de acuerdo a una serie de dosis de organofosforados
en la dieta.
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Caractersticas de una curva dosis-respuesta. La potencia se refiere a la localizacin

de la curva a lo largo del eje X, representativo de la concentracin del frmaco o de la dosis del
mismo. En otras palabras, se refiere a la dosis necesaria de un frmaco para alcanzar un efecto
determinado. En la figura 7, los frmacos B y C tienen la misma potencia para su respectivo
efecto mximo (alcanzan dicho efecto a la misma dosis). Este parmetro indicara, pues, la
afinidad de un frmaco por su receptor (Kluter et al., 1994).
Si comparamos la potencia de dos frmacos, se utiliza la potencia relativa, la cual no es ms
que el cociente entre la potencia de un frmaco respecto a la de otro tomado como patrn.
En la figura 6, los frmacos B y D tienen la misma eficacia, puesto que alcanzan igual efecto
mximo.
La pendiente, es una caracterstica de importancia menos clnica que de investigacin, puesto
que informa sobre la forma de interaccin de una droga con su receptor. Sin embargo es de
utilidad en la determinacin del rango de dosis en el que un frmaco puede ser administrado.
Figura 6. Curva dosis-respuesta
Por otro lado, la variabilidad biolgica, se refiere al hecho de que no todos los individuos
reaccionan del mismo modo ante la misma droga, de tal manera que una curva dosis-respuesta
de un individuo slo puede aplicarse al mismo.
Respecto a este parmetro, se deben destacar los siguientes trminos:
Hipo e Hiperrreactividad: dificultad o facilidad (mayores o menores dosis
requeridas) para el logro del efecto deseado.
Tolerancia: requerimiento ulterior de mayores dosis para lograr un efecto que antes se
lograba con dosis menores.
Idiosincrasia: efectos inusuales de la droga, dados en un pequeo porcentaje de la
poblacin.
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Antagonismo farmacolgico
Un antagonista se puede definir como una molcula que se une al receptor sin inducir
en l la produccin de la funcin a la que est destinado, por lo que su accin sera la de
impedir la del agonista endgeno. En general, por el tipo de unin al receptor, existen dos
tipos de antagonista: si se unen al sitio en que el agonista normalmente lo hace se trata de
antagonistas competitivos; si lo hacen en otro sitio del receptor, se trata de antagonistas
no competitivos (Hughes et al., 1989).
En el primero de los casos, es posible que el agonista en altas concentraciones (y en funcin de
la Ley de Accin de Masas) desplace al antagonista, permitiendo que la funcin se presente;
sin embargo se logra de manera ms difcil. Puede deducirse entonces que estas drogas actan
sobre la potencia de un receptor (reducindola), sin alterar la eficacia, puesto que el efecto
mximo an puede ser alcanzado (an cuando slo es a dosis mucho mayores del agonista que
las requeridas habitualmente). Esta posibilidad de que se pueda alcanzar an el efecto mximo
hace que este antagonismo tambin se conozca como antagonismo superable.
Los antagonistas no competitivos, al situarse en otro sitio del receptor, no pueden ser
desplazados por el agonista, por lo que su efecto persistira an en presencia de dosis altas de
aqul. Por esta razn, este antagonismo tambin se conoce como no superable.
Hasta hace poco tiempo el concepto de agonista y antagonista se entenda solamente como
un mecanismo relativamente simple en el cual el agonista se una al receptor modificndolo
y activando procesos en la membrana y el antagonista solo actuaba interfiriendo con la
unin del agonista al receptor, compitiendo por afinidad al receptor y evitando su activacin
(antagonismo competitivo).
Por ejemplo, en el escenario de los receptores de histamina, el poder de un agonista o de un
antagonista dependa solamente de la afinidad (fuerza de unin) que se tuviera con el receptor.
Sin embargo, Church y colaboradores (2002) encontraron que por lo menos los receptores
acoplados a protenas G (GPCRs) no funcionan en esta forma tan simple de apagado y
encendido. Ahora se ha demostrado que la unin del agonista con el receptor estabiliza
al GPCR en su forma activa y en cambio la unin del ahora llamado agonista inverso
(antihistamnico) con el mismo receptor lo estabiliza en su forma inactiva evitando as el efecto
biolgico. Se ha encontrado tambin que los receptores tienden a permanecer parcialmente
en su forma activa (actividad constitutiva) y el agonista los estabiliza para mantener este efecto
en forma ms intensa y prolongada. En este nuevo escenario ahora el agonista inverso, el
antihistamnico, puede tener un efecto an sin la presencia del agonista, de la histamina, y
no depender solo del bloqueo competitivo que se crea antes. As el antihistamnico puede
ejercer una accin negativa sobre el receptor al estabilizarlo en la fase inactiva. Hasta ahora
se ha demostrado que por lo menos los receptores H1, H2 y H3 funcionan de esta forma.
Alternativamente se han encontrado antihistamnicos anti H2 que se unen igual al receptor
en su conformacin activa o inactiva sin alterar la funcin del receptor, por lo que se les ha
llamado antagonistas neutrales y estos s compiten solamente con la unin de los agonistas.
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Se puede cuantificar la capacidad de un antagonista competitivo. Esto se hace por medio de

un ndice conocido como potencia antagnica (pAx), que es el logaritmo negativo de la
concentracin del antagonista que se precisa para hace que se requiera una dosis de agonista x
veces mayor que la requerida para lograr el efecto deseado en ausencia del antagonista.
Es posible el uso de drogas que generen un efecto opuesto por medio de un mecanismo no
asociado al receptor que media la funcin que se desea modificar. En este caso, la interaccin
se conoce como antagonismo funcional o fisiolgico.
Sinergismo farmacolgico
Las interacciones entre dos frmacos no siempre son en sentido negativo, es decir que no
siempre se manifiestan como la disminucin del efecto de uno por la presencia de otro. Hay
combinaciones farmacolgicas en las cuales la respuesta puede acrecentarse en lugar de
inhibirse. Este fenmeno se llama sinergismo, y comprende dos posibilidades:
De suma: se refiere al hecho de que los dos frmacos implicados en la respuesta tienen
actividad por s solos, la cual se suma al estar presentes ambos para producir un efecto
que es la SUMA de los efectos individuales. Generalmente se da cuando los mecanismos
de produccin del efecto de cada frmaco son diferentes. Ejemplo: uso concomitante
de agonistas adrenrgicos y antagonistas muscarnicos: Ambos son capaces de producir
taquicardia, la cual se manifiesta en presencia de los dos en forma ms intensa (suma de
los efectos).
De potenciacin: uno de los frmacos presenta actividad intrnseca, es decir es capaz
de producir el efecto; el otro frmaco es capaz de ayudar a que ese efecto se realice
ms fcilmente, pero de por s, no posee actividad. Ejemplo: Uso de penicilinas en
conjunto con inhibidores de las betalactamasas.
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Farmacogenmica: medicina personalizada

Dra. Marisol Lpez Lpez
Introduccin
Uno de los principales objetivos de la medicina del siglo XXI es el desarrollo de nuevos
medicamentos, mejor dirigidos a sus sitios blanco y mejor tolerados por la mayora de los
pacientes. Esta meta ha estado favorecida por el rpido aumento en el conocimiento del
genoma humano, basado principalmente en los datos obtenidos del Proyecto del Genoma
Humano (International Human Genome Sequencing Consortium, 2001; Little, 2005). A
partir de esta investigacin han surgido nuevas ideas sobre la susceptibilidad y la patognesis
de las enfermedades, as como de la interaccin entre los humanos y las sustancias exgenas,
como las drogas o frmacos.
En la teraputica farmacolgica frente a una enfermedad, la primera observacin del mdico
es la gran variabilidad interindividual de la respuesta. Dicha variabilidad es resultado de las
caractersticas genticas del sujeto moduladas por factores fisiolgicos, patolgicos y ambientales
como estilo de vida, dieta, edad, funcionamiento heptico y renal, estado nutricional y la
severidad de la enfermedad a tratar, entre otros (Lpez et al, 2004). De esta manera, una
particular dotacin gentica del sujeto influye tanto en los factores farmacocinticos (absorcin,
distribucin, metabolismo y excrecin) determinantes de la concentracin del frmaco en su
sitio de accin, como en los factores farmacodinmicos (accin especfica del frmaco) ligados
a la manifestacin propia de la enfermedad y a la reaccin adversa.
Es importante sealar que la variabilidad en la respuesta de los individuos a los medicamentos
constituye la regla, y no la excepcin, para la mayora de los mismos. En ciertas personas se
presentan efectos teraputicos (eficacia), en otras efectos adversos (toxicidad), y en algunas
el efecto es menor al esperado (ineficacia). Adems, en general, la eficacia de una terapia
farmacolgica dista mucho de ser ptima; de hecho se ha calculado que la respuesta favorable
a los frmacos de la prctica clnica actual slo ocurre en 30 a 70% de los pacientes (Sade
and Dai, 2005). Aunado a lo anterior, el amplio uso de los medicamentos en todo el mundo ha
revelado tambin importantes diferencias intertnicas en la respuesta a los mismos.
Actualmente existe una gran expectacin de que el avance cientfico repercuta en mejorar
las tcnicas diagnsticas y en el desarrollo de medicamentos personalizados, es decir, cuya
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prescripcin se realice acorde al paciente individual para maximizar el efecto teraputico y

minimizar el riesgo de una reaccin adversa.
Antecedentes y reacciones adversas a los frmacos
En la dcada de los cincuenta se document que ciertas anomalas enzimticas predisponan
a presentar reacciones adversas no esperadas. Una de ellas fue la deficiencia de glucosa-6fosfato deshidrogenasa que ocasion anemia hemoltica en soldados afroamericanos despus
de la administracin del agente antipaldico primaquina (Weber, 1997). En 1957, Arno
Motulsky propuso que estas reacciones adversas estaban causadas por variaciones genticas
individuales que resultan en deficiente o nula actividad enzimtica (Motulsky, 1957). La
palabra farmacogentica fue acuada en 1959 por Friedrich Vogel para designar la ciencia
que estudia las variaciones hereditarias que afectan la respuesta individual a los frmacos
(Vogel, 1959). A finales de los aos sesenta, se demostr que en los gemelos monozigticos,
que comparten el 100% de sus genes, exista una gran similitud en la disposicin de varios
frmacos; en comparacin con los gemelos dizigticos que slo comparten el 50% de sus genes
(Vesell and Page, 1968).
En la dcada de los noventa y como resultado de la fusin entre la farmacogentica y la genmica
(rama de la biologa que se encarga del estudio de los genomas) surge la farmacogenmica, la
cual introduce una gran dimensin para la medicina predictiva e individualizada debido a los
adelantos tecnolgicos para el anlisis del genoma (Goldstein et al, 2003).
Para propsitos prcticos los trminos farmacogentica y farmacogenmica son sinnimos y
aunque las definiciones difieren, farmacogentica se refiere al estudio de las interacciones de los
frmacos con un nmero relativamente restringido de genes, mientras que la farmacogenmica
implica el estudio de las interacciones de los frmacos con el complemento completo de genes,
es decir, del genoma (Court, 2007).
Las reacciones adversas a los frmacos (RAF) constituyen un serio problema de salud. Un
estudio realizado en Estados Unidos calcul que 6.7% de los pacientes hospitalizados
presentaron RAF severas y 0.32% tuvieron RAF fatales, lo que correspondera a 2 millones 216
mil y 106 mil casos respectivamente, situando a estas reacciones entre la cuarta y sexta causa
de muerte en ese pas (Lazarou et al, 1998). Aun cuando estas cifras se han criticado, existen
otras evidencias similares de que las RAF constituyen de 5-7% del total de hospitalizaciones
(Einarson 1993; Green et al, 2000), adems de que se ha estimado que incrementan dos das la
estancia en el hospital (Bates et al, 1997).
Por otro lado, las RAF son una de las causas ms comunes para retirar un medicamento del
mercado (Jefferys et al, 1998), lo que representa una importante repercusin financiera para
la industria farmacutica, siendo fundamental el conocimiento de los factores genticos que
afectan la respuesta farmacolgica individual tanto para la terapia como para el desarrollo de
los frmacos.
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Variabilidad gentica y metabolismo de frmacos

El concepto subyacente de la farmacogenmica es que la respuesta a la terapia farmacolgica es
variable en gran medida por la variacin gentica. Aproximadamente el 99.9% de la secuencia
de ADN es idntica entre los diferentes individuos. El restante 0.1% que es variable, an
cuando representa una pequea proporcin del genoma total, es responsable de una variacin
significativa en el fenotipo (Ziv and Burchard, 2003). Las diferencias de las secuencias de ADN
en los genes de los individuos que ocurren en la poblacin con una frecuencia >1% se denominan
polimorfismos. Las variaciones ms comunes del genoma humano son los polimorfismos de
nucletido sencillo o SNP (por sus siglas en ingls, single nucleotide polymorphism) que representan
aproximadamente el 90% (Syvanen, 2005). El cambio en la secuencia nucleotdica de un gen
puede conducir al cambio de la secuencia de aminocidos de una protena y alterar su accin
enzimtica, su estabilidad o su capacidad de unin a otras molculas. Por lo tanto, la variacin
gentica puede afectar la eficacia y seguridad de una droga cuando las mutaciones ocurren en
protenas receptoras, transportadoras o en enzimas metabolizadoras de drogas o frmacos.
A diferencia de otros factores, las variantes hereditarias generalmente permanecen estables
durante la vida de las personas.
La importancia del metabolismo en las reacciones adversas ha sido sealada en un estudio
que encontr que el 59% de los 27 frmacos ms frecuentemente implicados en las RAF
eran metabolizados al menos por una enzima con una variante allica reportada que causa
alteracin del metabolismo, mientras que slo 7-22% de frmacos seleccionados al azar
cumplen con este criterio (Phillips et al, 2001).
Las enzimas metabolizadoras de frmacos (EMF) desempean un papel muy importante en
la biotransformacin de frmacos o xenobiticos (compuestos qumicos extraos) que son
introducidos al cuerpo humano para poder excretarlos. De manera general, las EMF protegen
o defienden el cuerpo contra agentes potencialmente dainos del medio ambiente, adems
de metabolizar una diversidad de sustancias que normalmente estn en el cuerpo humano
como hormonas y cidos biliares, entre otras. El hgado es el sitio principal del metabolismo
de drogas, pero estas enzimas tambin se localizan en pulmn, placenta, rin, mucosa nasal
y tracto gastrointestinal; de hecho, algunas EMF forman parte de la barrera hematoenceflica
(El-Bachan, 1999).
El metabolismo de la mayora de las drogas o frmacos se realiza en dos pasos denominados
fase I y fase II. Las reacciones de fase I son de ataque directo al frmaco e involucran reacciones
de oxidacin, hidrlisis y reduccin, mientras que las de fase II comprenden reacciones de
glucuronizacin, acetilacin, metilacin, sulfacin, conjugacin con glutatin y conjugacin
con amino cidos (Wilkinson, 2001). Ambos tipos de reacciones (fase I y II) pueden ser reducidas
o inactivadas por polimorfismos genticos que modifican o alteran la eficiencia de cualquiera
de los sistemas enzimticos que catalizan estas reacciones generales de destoxificacin.
Las principales EMF de fase I son los citocromos P450 (CYP), que reciben este nombre porque
se encuentran unidos a las membranas celulares (cito) y contienen un pigmento heme (cromo y
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P) que absorbe luz a una longitud de onda de 450 nm cuando se expone a dixido de carbono.
En el humano, los citocromos P450 son una sper familia de ms de 50 enzimas implicada en
ms del 90% del metabolismo de los frmacos. Se han descrito polimorfismos genticos de
varios citocromos P450; sin embargo, CYP2C9, CYP2C19, y CYP2D6 son las enzimas ms
polimrficas y metabolizan cerca del 40% de los medicamentos actualmente en el mercado,
por lo que han sido las ms relevantes para la farmacogentica.
Como ejemplo describiremos a la enzima CYP2D6 (producto proteico codificado por el gen
CYP2D6) que es responsable del metabolismo del 25-33% de los frmacos de la prctica clnica
actual, entre los que se encuentran antidepresivos (ej: imipramina, amitriptilina y paroxetina),
antipsicticos (ej. haloperidol y risperidona) y beta bloqueadores (ej: carvedilol y metoprolol),
entre otros (Ingelman-Sundberg, 2005).
El gen CYP2D6 se localiza en el cromosoma 22q13.1 y a la fecha se han descrito ms de 75
polimorfismos (http://www.ki.se/CYPalleles/), por lo que dependiendo de las variantes que
presente cada individuo, se pueden clasificar en cuatro fenotipos basados en la capacidad para
metabolizar los frmacos:

metabolizador ultra rpido (MU)

rpido (MR)
intermedio (MI)
lento (ML)
Los pacientes ML presentan una baja o nula actividad de la enzima CYP2D6 lo que resulta
en una alteracin del metabolismo y excrecin de muchos frmacos, por lo que tienen ms
probabilidad de mostrar RAF a estos medicamentos. En contraste, los sujetos MU tienen
riesgo de presentar ineficacia al tratamiento farmacolgico por lo que requerirn dosis ms
altas que las que se prescriben normalmente para conseguir concentraciones teraputicas
(Oscarson, 2003).
Tambin se han observado diferencias en las frecuencias de individuos ML, MR y MU
dependiendo del origen tnico de la poblacin. La frecuencia de individuos ML es de 1-2% en
asiticos, 5% en afroamericanos, y de 6-10% en poblaciones caucsicas. Los etopes presentan
29% de individuos MU, los rabes sauditas 20%, los caucsicos de 1-2%, a excepcin de los
espaoles (7-10%) (Lpez et al, 2004).
En fechas recientes realizamos una investigacin de CYP2D6 en la poblacin mestiza
mexicana. Los resultados mostraron que la frecuencia de individuos ML fue de 10% y la de
MU de 6.5%. El estudio tambin mostr una distribucin nica para las frecuencias de las
variantes genticas de CYP2D6 (Lpez et al, 2005). Estos datos pueden tener implicaciones
importantes para el uso de frmacos que sean sustratos de CYP2D6 y posean una estrecha
ventana teraputica.
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Aplicaciones clnicas
La farmacogenmica es una de las primeras aplicaciones clnicas de la era posgenmica,
aunque su implementacin en la prctica clnica presenta retos significativos por lo que su
beneficio es todava limitado. Entre los principales actores de estos retos estn la industria
farmacutica, las instituciones de investigacin, las agencias regulatorias, los mdicos y los
pacientes (Swen et al, 2007). Sin embargo, se han identificado varios polimorfismos genticos
en EMF que son relevantes para prevenir o reducir el riesgo de RAF en la quimioterapia
del cncer, entre ellos destacan el de la tiopurina S-metiltransferasa (TPMT) y el de la
uridina difosfato glucoroniltransferasa 1A1 (UGT1A1). La TPMT es una enzima que metila
la 6-mercaptopurina, una droga utilizada en el tratamiento de la leucemia linfoblstica
aguda. Se han identificado variantes del gen TPMT con menor actividad causantes de una
mielotoxicidad excesiva del frmaco, por lo que los pacientes portadores de estas variantes
allicas deben ser tratados a dosis menores a las convencionales (Weinshilboum, 2006). La
enzima UGT1A1 constituye la va ms importante del metabolismo del agente antineoplsico
irinotecn a travs de la glucuronizacin de su forma activa, SN38. Se han descrito diferentes
polimorfismos de la UGT1A1 con disminucin de su actividad, causantes de concentraciones
elevadas de SN38 que conducen a toxicidad grave (diarrea y neutropenia) al irinotecn (Kim
e Innocenti, 2007). En importante sealar que en respuesta a estos hallazgos la Agencia
para la Administracin de los Alimentos y Drogas de Estados Unidos (FDA, US Food Drug
Administration) ha aprobado la inclusin de informacin farmacogentica en los marbetes de la
6-mercaptopurina y del irinotecn (Haga et al, 2006). Tambin han sido aprobadas dos pruebas
farmacogenticas disponibles comercialmente que apoyan la personalizacin del tratamiento
farmacolgico. Estas pruebas detectan variaciones en los genes que codifican para tres enzimas
metabolizadoras de drogas: CYP2D6 y CYP2C19 (Roche AmpliChip, http://www.roche.
com/) y UGT1A1 (Molecular Assay; Third Wave Technologies, http://www.twt.com/).
Descubrimiento y desarrollo de nuevos frmacos
La farmacogenmica tambin est cambiando la forma en que se disean, desarrollan y
emplean los frmacos. Primero, identifica los genes de susceptibilidad a enfermedades que
representen blancos teraputicos potenciales. A partir del blanco teraputico se disean
ensayos clnicos para tamizar los compuestos qumicos posibles y determinar su valor. Las
molculas que demuestren efecto sobre el blanco son evaluadas para determinar su potencia
y seguridad. En esta etapa se pueden modificar los compuestos seleccionados para aumentar
su eficacia, disminuir su toxicidad y facilitar su absorcin y excrecin. En los ltimos aos, las
pruebas farmacogenticas han sido incorporadas a los ensayos clnicos de los frmacos para
ayudar en la interpretacin de los datos en la investigacin farmacutica. De esta manera, la
farmacogenmica representa un gran potencial en la lnea de produccin de los medicamentos
moleculares en la industria farmacutica, desde su diseo hasta su comercializacin.
La oncologa es el rea que mejor ha aprovechado del uso de una estrategia farmacogenmica.
Un mayor entendimiento de la biologa de muchos cnceres ha identificado blancos o dianas
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moleculares precisas para el diseo de nuevos frmacos proporcionando la oportunidad de

seleccionar una terapia ptima. El trastuzumab (Herceptin; F.Hoffman- La Roche Ltd) es un
anticuerpo monoclonal dirigido a la protena HER-2 (por sus siglas en ingls, human epidemal
growth factor receptor 2) y se prescribe para una variante gentica del cncer de mama que sobre
expresa esta protena (Baselga et al, 2007). Otro ejemplo es el mesilato de imatinib (Gleevec;
Novartis) que inhibe la actividad de la protena cinasa Bcr-Abl sintetizada como consecuencia
de la translocacin entre los cromosomas 9 y 22 que ocurre en la leucemia mieloide crnica
(Deininger et al, 2005).
Un avance significativo en el desarrollo de nuevos frmacos es la aplicacin de la ciencia
de la toxigenmica. El concepto de toxigenmica fue introducido por primera vez en 1999
(Nuwaysir et al, 1999) y puede ser definido como el estudio de la relacin entre la estructura
y actividad del genoma y los efectos biolgicos adversos de agentes exgenos (Aardema y
McGregor, 2002). La aplicacin de la toxigenmica provee una oportunidad excepcional para
identificar los procesos biolgicos afectados por la exposicin a compuestos farmacuticos y/o
xenobiticos. Los mtodos convencionales para evaluar la toxicidad de una droga son, en
general, costosos y tardados. Una de las principales metas de la toxigenmica es predecir los
efectos a largo plazo de los compuestos utilizando ensayos rpidos. En este sentido, los perfiles
genticos de expresin global poseen el poder de predecir respuestas txicas. Se asume que
los compuestos que inducen toxicidad mediante mecanismos similares, mostrarn perfiles de
expresin gentica caractersticos. Al agrupar los perfiles genticos de compuestos modelo bien
caracterizados y comparar estos cambios fenotpicos con ndices de toxicidad convencionales,
se puede obtener una firma o huella de la expresin gentica relacionada con la toxicidad a un
rgano especfico y usarse para predecir la toxicidad de un frmaco candidato. La capacidad
predictiva de los perfiles de expresin gentica ya ha sido probada en estudios recientes de
compuestos hepatotxicos (McMillian et al, 2005) y nefrotxicos (Thukral et al, 2005).
Adems de la clasificacin de drogas con base en sus perfiles de expresin gentica, la
toxigenmica podra proveer datos valiosos de los mecanismos de toxicidad implicados.
Esta estrategia toxicolgica mecanstica es muy importante, especialmente en la evaluacin
del riesgo de compuestos candidatos durante el desarrollo de nuevos frmacos. Muchos
compuestos farmacuticos o xenobiticos pueden inducir eventos especficos o no especficos
de transduccin de seales celulares que activen varias respuestas fisiolgicas y farmacolgicas
incluyendo homeostasis, proliferacin, diferenciacin, apoptosis o necrosis, todas las que pueden
ser detectadas a nivel transcripcional. Al examinar alteraciones en la expresin gentica de la
respuesta farmacolgica, es posible generar hiptesis de los mecanismos subyacentes de la
toxicidad, que podran ser cruciales para la identificacin de riesgos potenciales de seguridad
durante el proceso temprano de desarrollo del frmaco. La aplicacin de la toxigenmica
para propsitos mecansticos podra jugar un papel relevante cuando la toxicidad de los
frmacos candidatos no est asociada con biomarcadores bien establecidos o con cambios
morfolgicos significativos. Por ejemplo, varias publicaciones han demostrado la habilidad
de los perfiles de expresin gentica en la elucidacin de las bases moleculares de la toxicidad
testicular (Khor et al, 2006).
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Perspectivas futuras
El conocimiento de las bases moleculares de la accin farmacolgica o txica de los
medicamentos, as como los polimorfismos genticos que influyen en la variabilidad de
la respuesta farmacolgica, optimizar el uso de los mismos en lo que ya se conoce como
medicina personalizada o a la carta. Esto se traducir en la prescripcin a cada individuo del
medicamento adecuado a la enfermedad que presenta y a la dosis apropiada para salvaguardar
la eficacia y seguridad del mismo. Uno de los principales problemas para que la medicina
personalizada sea una realidad es el de poder disponer de una metodologa analtica que nos
permita identificar la existencia de un determinado polimorfismo gentico en la persona a la
que se pretende medicar y que pueda, en algn sentido, condicionar dicha medicacin. Sin
embargo, en los ltimos aos se ha avanzado mucho en el desarrollo de tcnicas analticas
muy poderosas como los microarreglos de cDNA (DNA complementario al RNA mensajero)
que permiten estudiar la expresin genmica o transcriptoma. Ms aun, en un futuro cercano
la combinacin del estudio de todas las protenas codificadas por el genoma (proteoma) y del
perfil metablico (metabonmica) podran complementar a la genmica para lograr la terapia
farmacolgica personalizada (Nebert and Vesell, 2007).
La farmacogenmica tambin permitir alcanzar una mayor habilidad para predecir las
reacciones adversas en etapas tempranas del desarrollo de frmacos. Al disminuir los eventos
adversos e incrementar la eficacia teraputica se podran tener costos menores en los servicios
de salud. La deteccin de variaciones en genes implicados en el metabolismo de frmacos o
en la destoxificacin de compuestos, permite establecer el perfil gentico individual que tendr
un profundo impacto en la prediccin de la respuesta farmacolgica y har posible la terapia
personalizada.
Es importante sealar que el uso y la utilidad de las pruebas farmacogenticas para reducir las
RAF y mejorar la eficacia de los frmacos debe ser probada por estudios clnicos prospectivos
y estudios farmacoeconmicos relacionados que demuestren el beneficio de la genotipificacin
para estos propsitos (Manolopoulos, 2007).
Una de las barreras ms importantes para la implementacin de la farmacogentica en la
prctica clnica es la educacin de esta disciplina, no slo en los profesionistas de la salud si
no tambin en el pblico general. Los mdicos clnicos tienden a ignorar la gran cantidad de
informacin farmacogentica nueva y la ven como una carga adicional y una complicacin
para el complejo proceso de decisin teraputica. Esto parece ser resultado de la falta de
educacin de esta ciencia y del potencial que la genmica ofrece en la aplicacin mdica
de esta tecnologa (Frueh and Gurwitz, 2004). La educacin gentica a nivel de pregrado,
posgrado y educacin continua ha ido rezagada del enorme avance cientfico y tcnico del
rea, por lo que es imperativo que el diseo de nuevos programas educativos de licenciatura y
posgrado en el rea de la salud incluyan los principios y aplicaciones de la farmacogenmica
para permitir a estos profesionistas entender las bases moleculares de la variabilidad individual
en la respuesta farmacolgica y los mecanismos moleculares de la accin de los mismos. Esta
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accin es vital para asegurar la implementacin rpida y segura de la medicina personalizada

en la prctica mdica, acorde con el surgimiento de herramientas genmicas de diagnstico
para el beneficio de toda la sociedad.
Por ltimo, cabe subrayar que la implementacin de la farmacogenmica en los servicios de
salud deber estar acompaada de un marco legal slido que asegure una aplicacin tica y
socialmente correcta.
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Alteraciones a nivel celular e inmunofenotipo en

nios desnutridos
Dra. Oralia Njera Medina
Dra. Mara Cristina Gonzlez Torres
Introduccin
La desnutricin calrico-proteica es un problema de Salud Pblica que afecta principalmente
a nios preescolares hacindolos ms susceptibles a las infecciones por eso a estos nios se les
considera como inmunodeprimidos (Chandra, 1991).
Con el inters de dilucidar algunos de los factores que intervienen en la inmuno-supresin
de los nios desnutridos, se han desarrollado diversos trabajos de investigacin para explorar
diferentes aspectos a nivel celular que puedan explicar sus efectos en estos nios. Para el
desarrollo de estos trabajos se han utilizando varias tcnicas de laboratorio como son:
A. Citometra de flujo, para la caracterizacin del inmunofenotipo y deteccin de clulas
CD4 con funciones de memoria (clulas que han entrado en contacto con los antgenos) y
linfocitos con funciones efectoras (clulas encargadas de la defensa del organismo ante un
agente infeccioso).
B. Ensayo del cometa, tcnica que permite indagar sobre los posibles daos que puede
presentar el material gentico.
C. Tcnicas de biologa molecular para estudiar algunos aspectos moleculares, como son la
expresin de genes en estos nios.
A. Inmunofenotipo en nios desnutridos
Desde hace varios aos se ha venido trabajando sobre el tema de la inmunidad mediada por
clulas en nios desnutridos. La investigacin se ha centrado principalmente en el estudio de
las subpoblaciones de linfocitos en nios desnutridos infectados; lo que ha permitido estudiar
tambin estas subpoblaciones en nios bien nutridos con infecciones y en nios bien nutridos
sin infeccin; estos grupos de estudio permiten, por un lado analizar los cambios que propicia
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Alteraciones a nivel celular e inmunofenotipo en nios desnutridos
la presencia de la infeccin en las subpoblaciones de linfocitos, y por otro, las diferencias que
se pueden encontrar por la presencia de la desnutricin. Adems ha sido necesario para la
realizacin de este trabajo, definir los parmetros de referencia de estas subpoblaciones en
nios sanos.
Este trabajo se ha realizado con la ayuda de tcnicas de laboratorio como la citometra de
flujo (CF), la que gracias al empleo de anticuerpos monoclonales de diferente especificidad
conjugados con fluorocromos, permite identificar varias caractersticas a nivel celular: tamao,
forma y complejidad interna, as como caractersticas funcionales. Su eficacia y precisin ha
incrementado el uso de esta tcnica tanto en los laboratorios de investigacin bsica como en
los laboratorios clnicos (Barrera et al., 2004).
La citometra constituye un complemento valioso de las tcnicas clsicas utilizadas para el
estudio de la morfologa, biologa y bioqumica celular. Adems, en comparacin con los
mtodos bioqumicos de anlisis celular, en los que se obtiene un resultado promedio para
toda la muestra, la CF es capaz de proporcionar informacin cuantitativa sobre cada clula en
particular y permite identificar en una muestra subpoblaciones de clulas diferentes, incluso
cuando estn escasamente representadas. Adems la citometra ha demostrado tener muy
diversas aplicaciones en el rea de la gentica (Ortiz et al., 2006a).
Para que el citmetro pueda medir las diferentes caractersticas de la clula requiere de los
siguientes sistemas:
1. Fluidos: para introducir y alinear las clulas para ser medidas.
2. pticos: una fuente de excitacin (lser de 488 nm) y coleccin ptica para generar y colectar
las seales de luz.
3. Electrnicos: para convertir las seales pticas a seales electrnicas proporcionales y
digitalizadas para anlisis en la computadora.
Para la interpretacin de los datos se obtienen grficas de puntos, a travs de las cuales
primero se regionaliza, para que a partir de la regin se adquieran los datos de las diferentes
subpoblaciones. Las regiones pueden ser del total de los linfocitos o de una subpoblacin en
especfico (Figura 1).
A partir de la regionalizacin se pueden analizar las subpoblaciones de linfocitos con las
grficas de puntos que se muestran en la Figura 2.
Los principales hallazgos derivados del estudio en los grupos de trabajo se sealarn
considerando primero los encontrados en el grupo testigo, posteriormente a los nios con
infecciones para terminar con los hallazgos en los nios desnutridos infectados.
1. Grupo testigo (nios bien nutridos)
a) Se encontr a nivel de leucocitos (linfocitos, granulocitos y monocitos) que los nios entre
recin nacidos y hasta la edad de 4 aos presentan variaciones en su porcentaje, de tal manera,
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Dra. Oralia Njera Medina y col.

a)
b)
b)
CD3 PerCP
Figura 1. a) Grfica de puntos (FSC contra SSC) para definir la regin R1 (total de linfocitos); b) grfica de
puntos (FL-3 contra SSC) para definir subpoblaciones especficas (linfocitos CD3+, CD4+ etc.).
a)
b)
b)
CD45RO
CD45RA-CD45RO+
CD45RA
CD45RA+CD45RO+
CD45RA+CD45RO-
Figura 2. a) Grficas de puntos con las diferentes subpoblaciones linfocitarias, por medio de cuadrantes y b) grficas
de puntos con las clulas vrgenes (CD45RA) y de memoria (CD45RO).
que a los 4 aos se podra considerar que alcanzan su madurez, dado que sus valores se acercan
al de los adultos. En los nios estudiados se observaron diferencias relacionadas con el sexo slo
en los granulocitos (Njera et al., 2003).
b) En las subpoblaciones de linfocitos slo se observaron diferencias de acuerdo a la edad
en los porcentajes de los linfocitos T (CD3+) y en los B (CD19+ y CD20+). Estas variaciones
pueden estar relacionadas con la raza, dado que no han sido sealadas en caucsicos,
asiticos ni en otros grupos raciales (Huenecke et al., 2008; Ilkinciogullari et al., 2004;
Llovera y Solano, 2004). Asimismo, se consider que el grupo control alcanz la madurez
y la expansin de sus subpoblaciones de linfocitos a la edad de dos aos, en este momento
sus porcentajes promedio se acercan a los porcentajes de los adultos obtenidos en nuestro
laboratorio (Njera et al., 2003).
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c) En las clulas vrgenes y de memoria a nivel del total de linfocitos y dentro de las
clulas CD4+ se encontraron diferencias de acuerdo a la edad, conforme los nios son de
mayor edad, las clulas vrgenes disminuyen y las clulas de memoria aumentan. Adems
se encontraron diferencias vinculadas a la edad en las clulas CD4+CD45RA+/CD45RO+
(dobles positivas) (Njera et al., 2003), considerando este dato como otra probable relacin
con la raza, dado que tampoco ha sido sealado para asiticos y caucsicos (Osugi et al.,
1995; Huenecke et al., 2008).
d) En la activacin in vitro de las subpoblaciones de linfocitos T CD3+ se observaron claras
diferencias en la capacidad de respuesta ante la presencia del mitgeno, entre nios menores
y mayores de tres aos. Los nios menores de tres aos presentaron una menor proporcin de
clulas activas (Njera et al., 2003). En la figura 4 se muestran los anticuerpos utilizados para
el estudio de estas clulas.
Los hallazgos antes mencionados en subpoblaciones de linfocitos y en el mbito de leucocitos
confirman que los nios menores de tres aos presentan rasgos de inmadurez de su sistema
inmunolgico tanto a nivel celular como funcional. Los rasgos ms evidentes de inmadurez
funcional fueron la baja proporcin de clulas activadas aunada a la baja proporcin de clulas
de memoria con relacin a los nios mayores de tres aos (Njera et al., 2003).

ESTUDIO DEL INMUNOFENOTIPO EN

LINFOCITOS

B (CD20++)
T (CD3++)
CD4++
NK (CD56++CD16++)
CD8++
ANLISIS DE SUB - POBLACIONES

VRGENES, DE MEMORIA Y DOBLES POSITIVAS
CD3 ++CD4 ++
++
CD4++CD45RA
CD45
(V RGENES)
++
++
++
CD4++CD45RA
CD45RO
CD4++CD45RO
CD45
CD45
CD45
(DOBLES POSITIVAS) (MEMORIA)
ANLISIS DE SUB - POBLACIONES

EFECTORAS
CD3+
Figura 3. Principales fenotipos de linfocitosCD4+CD62Ldeterminados CD8+CD28en los grupos de estudio en sangre perifrica.
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2. Grupo de nios bien nutridos infectados

a) En los nios bien nutridos infectados (BNI), se observ que ante la presencia de infeccin,
en sangre perifrica tienden a disminuir los linfocitos CD3+, CD4+, CD8+ y aumentar las
clulas CD19+ y/o CD20+ (linfocitos B) con relacin a nios sanos. La disminucin de los
linfocitos T y el incremento de los linfocitos B son hallazgos importantes que muestran los
cambios a nivel perifrico de las subpoblaciones de linfocitos como respuesta ante la infeccin
(Njera et al., 2004). En pacientes peditricos con infecciones respiratorias recurrentes tambin
se ha encontrado porcentaje alto de linfocitos B (CD5+/CD20+) y disminucin de monocitos
(CD11c+/CD18+) (Wasik et al., 2005).

ESTUDIO DEL INMUNOFENOTIPO Y LA ACTIVACIN

CELULAR
T (CD3 ++)
B (CD19 ++)
NK (CD56 ++)
CD4++ CD8++
CD4++CD69 ++
CD19++CD69++
CD56++CD69++
CD8++CD69++
(CD69
++
Clulas Activadas)
Activadas)
Figura 4. Inmunofenotipo de linfocitos activados
b) Los nios bien nutridos infectados presentaron en las clulas CD4+CD45RO+ (memoria)
un aumento y una disminucin de las clulas CD4+CD45RA+ (vrgenes) con relacin a nios
sanos, que orientan sobre un buen funcionamiento de la capacidad de los linfocitos T CD4+
para diferenciarse de clulas vrgenes a clulas de memoria, como un mecanismo de defensa del
organismo ante la infeccin (Njera et al., 2001b). As mismo, al analizar clulas con funciones
efectoras de tipo ayudadoras (CD4+CD62L-) y citotxicas (CD8+CD28-) se encontr que
estas clulas se encuentran aumentadas con relacin a nios sanos, evidenciando en estos
nios que ante la presencia de una infeccin la presencia de estas clulas son necesarias para
la defensa del organismo ante agentes patgenos (Njera et al., 2007). Las clulas efectoras
son capaces de producir citocinas y de generar mecanismos inmunolgicos necesarios para la
defensa del organismo (Williams and Bevan, 2007).
c) En el caso de la activacin in vitro, se observ un aumento significativo de respuesta a los
mitgenos en el total de los linfocitos T (CD3+) y en los CD8+ con relacin a nios sanos. Este
dato puede orientar al aumento de respuesta celular ante la infeccin (Njera et al., 2001a).
De acuerdo a la informacin antes mencionada, la presencia de infecciones desarrolla cambios
en las subpoblaciones de linfocitos que permiten al sistema inmunolgico reaccionar ante
el dao. Una subpoblacin importante fue la presencia de altos porcentajes de clulas de
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memoria (CD4+CD45RO+), clulas que son capaces de producir citocinas y ejercer funciones
efectoras (Lanzavecchia and Sallusto, 2005). Al indagar la presencia de clulas con funciones
efectoras (CD4+CD62L- y CD8+CD28-) se encontr que se encuentran aumentadas en
nios infectados en comparacin a nios sanos, evidenciando lo que podramos considerar
como un buen funcionamiento del sistema inmunolgico. Adems, estas clulas se encuentran
sensibilizadas, dado que pueden reaccionar rpidamente ante cualquier estmulo, en este
caso se utiliz un mitgeno, observando que un mayor porcentaje de clulas se activaron en
los nios infectados en comparacin a los nios sanos. Estos datos orientan a la movilizacin y
accin que desarrolla el sistema inmunolgico ante una infeccin. Es importante sealar que
estos datos (sobre clulas de memoria, efectoras y la capacidad de activacin) no haban sido
reportados en la literatura internacional.
3. Grupo de nios desnutridos infectados
a) En los nios desnutridos ante la presencia de infecciones sus subpoblaciones de linfocitos T
CD3+, presentan las mismas tendencias que los nios bien nutridos con infeccin. Slo en los
linfocitos B (CD19+ y/o CD20+) muestran una marcada disminucin en comparacin a los
nios bien nutridos infectados; este es un hallazgo no descrito previamente con relacin a la
desnutricin (Njera et al., 2004).
b) Los nios desnutridos infectados mostraron una disminucin significativa en las clulas
de memoria (CD4+CD45RO+), con aumento de la fraccin de clulas dobles positivas
(CD4+CD45RA+/CD45RO+) con relacin a los nios bien nutridos infectados, lo que fue
interpretado como una alteracin o retardo en la funcionalidad (diferenciacin) de estas clulas
(Njera et al., 2001b). Adems al estudiar la presencia de clulas con funciones efectoras
(CD4+CD62L- y CD8+CD28-) stas se encontraron disminuidas con relacin a nios bien
nutridos infectados (Njera et al., 2007).
c) Adems, se encontr una importante disminucin en la activacin/ funcionalidad de las
subpoblaciones de linfocitos T (CD3+, CD4+ y CD8+), en los nios con desnutricin ante
la presencia de un mitgeno in vitro, ya que no son capaces de responder ante el estmulo,
comparada con la respuesta de los nios bien nutridos con infeccin, se comportan como los
nios sanos (Njera et al., 2001a).
Los cambios encontrados en los linfocitos B (CD19+ y/o CD20+), en las clulas de memoria, las
dobles positivas, en clulas con funciones efectoras y en la activacin, son hallazgos importantes que
pueden contribuir a entender la causa de la inmunodepresin observada en los nios desnutridos.
Adems se pudo constatar estas mismas alteraciones tanto en nios con desnutricin de tercer
grado como de segundo grado; esto ltimo no se haba sealado en la literatura internacional,
dado que se sealan alteraciones solo en nios desnutridos de tercer grado.
As mismo, se encontraron diferencias de acuerdo al grado y tipo de desnutricin: En los nios
con desnutricin tipo kwashiorkor, las clulas que mostraron ms dificultad en la activacin
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fueron en los linfocitos totales (CD3+) y los CD8+; en cambio, los nios con segundo grado de
desnutricin presentaron mayor dificultad en el cambio de clulas CD4+ de vrgenes a clulas
de memoria al presentar el porcentaje ms alto de clulas dobles positivas (CD4+ CD45RA+
/CD45RO+). Se requiere realizar estudios adicionales con un mayor nmero de pacientes
desnutridos para corroborar estas tendencias.
Se considera que las pruebas de activacin temprana (CD69) de linfocitos, el anlisis de
los isotipos CD45RO (memoria) y CD45RA/CD45RO (dobles positivas) en los linfocitos
CD4+, y el de clulas efectoras (CD4+CD62L- y CD8+CD28-) podran ser las causas de la
inmunosupresin en los desnutridos.
B. Daos en el material gentico de nios desnutridos
Otros estudios que se han realizado tratando de entender la inmunodeficiencia que presentan
los nios desnutridos, fue evaluar si la desnutricin podra estar relacionada con un incremento
en la cantidad de rompimientos de cadena doble y de cadena sencilla de las molculas de
ADN, dado que ya haba antecedentes de que la desnutricin induce dao al ADN, lo que
se determin por la presencia en linfocitos de estos nios de aberraciones cromosmicas y de
intercambio de cromtidas hermanas (Betancourt et al., 1979; Ortiz et al., 2004). Para poder
trabajar en esta parte de la investigacin se utiliz el ensayo cometa.
El ensayo cometa o electroforesis unicelular detecta fundamentalmente rompimientos de
cadena sencilla inducidos en la molcula de ADN y ha mostrado ser sensible para evaluar
el dao al ADN causado por diversos agentes (Tice, 1995). Con esta tcnica tambin se
detectan rompimientos de cadena doble, as como daos en regiones sensibles al lcali, y
sitios incompletamente reparados por escisin de bases o de nucletidos, en estos dos ltimos
casos un nivel alto de rompimientos puede indicar, tanto dao como reparacin eficiente.
Esta metodologa tiene diversas ventajas: se requiere una cantidad pequea de muestra para
realizarse, es factible evaluar el dao al ADN en clulas no proliferantes, el anlisis se efecta
en clulas individuales, se puede realizar en diferentes tipos celulares, en diversas especies y es
adems relativamente simple y rpida (Ortiz et al., 2006b).
En esta tcnica las clulas se colocan dentro de un gel de agarosa sobre un portaobjetos,
posteriormente son sometidas a un campo elctrico, en una cmara de electroforesis horizontal,
por poco tiempo bajo condiciones alcalinas. Los ncleos son teidos con bromuro de etidio
para medir la longitud de migracin del ADN en el microscopio de fluorescencia utilizando el
analizador de imgenes.En la Figura 5 se muestran las imgenes que se pueden observar en el
microscopio de fluorescencia.
Dentro de la lnea de investigacin de Efectos de la desnutricin a nivel celular los principales
hallazgos que se detectaron fueron:
a). En leucocitos de nios desnutridos se observ un incremento en los niveles de dao y adems
por primera vez se seal que las infecciones graves y los medicamentos podran influir en el
305
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a)
b)
Figura 5. Cometa donde la longitud de la cauda evidencia dao al ADN.
incremento de los niveles de dao al ADN en nios sanos y desnutridos ambos con infeccin
(Betancourt et al., 1995; Gonzlez et al., 2002a).
b) Con el mismo mtodo se determin que los linfocitos de nios desnutridos despus de la
induccin de dao al ADN con perxido de hidrgeno, tienen una menor capacidad para
repararlo comparados con los nios bien nutridos con infeccin (Gonzlez et al., 2002b).
La mayor cantidad de dao en la molcula de ADN y la incapacidad para reparar este dao, en
los linfocitos de nios desnutridos podra relacionarse con la deficiente respuesta inmunolgica
observada en ellos, ya que los linfocitos son clulas que tienen una funcin primordial en la
respuesta inmunolgica de tipo especfica. El alto nivel de dao en el ADN podra interferir
con la correcta expresin de los genes de los nios desnutridos.
C. Estudios a nivel molecular en nios desnutridos
El siguiente nivel de estudio se deriv de los resultados del incremento de dao al ADN, ya que
se consider importante evaluar si la expresin gnica se encontraba alterada en los nios con
desnutricin.
Para estudiar la expresin de genes en linfocitos de nios desnutridos se han utilizado dos
estrategias experimentales:
a) Anlisis diferenciales.
b) Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real.
a) Para los anlisis diferenciales se trabaj con la siguiente metodologa: 1) Se aislaron
linfocitos de sangre perifrica usando Linfograd (Microlab, Mxico); 2) Los linfocitos fueron
lisados mediante la tcnica de congelacin-descongelacin, la que se aplic dos veces; 3) El
RNA mensajero fue retrotranscrito (RT), para producir cDNA; 4) Posteriormente los cDNAs
fueron digeridos con la enzima de restriccin EcoRI y fueron ligados al vector Lambda Zap
III (Stratagene, La Jolla, CA); 5) El primer anlisis de expresin diferencial fue realizado con
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autoradiografa y la confirmacin de la identidad de los clones fue obtenida por Southern blot.
4) Las clonas de cDNA fueron secuenciadas usando el secuenciados Perkin Elmer (Wellesley),
la base de datos usada fue la de la National Center for Biotechnology Information, usando el
servidor BLAST algorithm [Gltschul et al., 1990].
Los resultados fueron: Despus de analizar 12,000 clonas, se encontraron 16 genes en los
linfocitos de los nios desnutridos con expresin claramente diferencial, de los cuales 15 estaban
sub-expresados y uno sobre-expresado con relacin a nios bien nutridos infectados. Los genes
fueron secuenciados e identificados, observando que nueve de los 16 genes sub-expresados,
correspondan a una protena relacionada con el metabolismo mitocondrial (metaxina) y uno
ms a la protena 451 con estructura de dedos de zinc que al parecer est relacionada con el
control de la trascripcin (Gonzlez et al., 2006).
Estos datos fueron interpretados como que la desnutricin calrico-proteica est relacionada
con la sub-expresin o sobre-expresin de los genes relacionados con la funcin mitocondrial,
y con el desarrollo y diferenciacin celular.
b) La PCR en tiempo real se ha realizado utilizando sondas TaqMan en un termociclador de
tiempo real (marca Light Cycler). Para hacer el ensayo se obtuvieron muestras de cDNA con
la misma metodologa descrita previamente. Se disearon los oligonucletidos para evaluar la
expresin de los genes de Interleucina-2 (IL-2), IL-4, IL-6, IL-10, Factor de Necrosis Tumoral
(TNF) e Interfern gama (IFN).
Los resultados mostraron que hay disminucin en los linfocitos de los nios desnutridos
infectados de la expresin de los genes de IL-2, IL-6, e IFN y un aumento en la expresin de IL4, IL-10 y TNF con relacin a nios bien nutridos infectados (Gonzlez-Martnez et al., 2008).
Estos resultados claramente estn relacionados con alteraciones en la respuesta inmunolgica
de los nios desnutridos. La disminucin de la expresin de dos genes relacionados con la
respuesta T1 (IL-2 e IFN), evidencia una alteracin en la respuesta T1/T2 y puede explicar
las alteraciones observadas en la respuesta celular de los nios desnutridos y su dificultad para
erradicar infecciones.
Cabra sealar que nuestros estudios sobre la expresin de genes en nios desnutridos con
infeccin, son los primeros de este tipo que se publican a nivel internacional.
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Clulas troncales embrionarias

M. en C. Teresa Florencia Lpez-Murillo
Introduccin
Gracias a los avances tecnolgicos y al inters cada vez mayor de muchos investigadores en
el campo de la biologa molecular y celular, en medicina regenerativa y en terapia gnica,
se ha avanzado en el conocimiento de las clulas troncales embrionarias en aspectos como:
marcadores celulares, protenas constitutivas; tanto membranales como citoplsmicas, sobre
los mecanismos de metilacin y acetilacin del ADN, las vas de sealizacin celular, los
medios de cultivo y la aplicacin y el uso potencial de las clulas troncales embrionarias.
Sin embargo, muchos de estos procesos no estn del todo claros o completos, debido a la
dificultad de trabajar con clulas embrionarias humana, dadas las implicaciones bioticas. Los
proyectos de investigacin son evaluados por las leyes y organismos que regulan el uso de las
clulas troncales embrionarias humanas, como el Partners Embryonic Stem Cell Research
Oversight comit (Pruszak et al., 2007) y autorizados por Human Embryo and Fertilisation
Authority (HFEA) (http://www.iscr.ed.ac.uk). La mayor informacin generada al respecto
proviene de embriones de primates no humanos, ratones y pollos, principalmente.
Caractersticas de las clulas troncales embrionarias
El estudio de las clulas troncales embrionarias (ES, del ingls Stem Cells), est documentado
desde 1981 con las investigaciones de Martn y Evans y Kaufman, que trabajaron con las
clulas ES de la masa interna del blastocisto de ratn, desarrollando los primeros cultivos in
vitro (Anzalda et al., 2007; http://stemcells. nih.gov/info/scireport/chapter3).
Las clula ES tienen su origen en la mrula disociada (Anzalda et al., 2007) y en la masa
interna de clulas del blastocisto (Belkind-Gerson et al., 2003; Merchant, 2007; Nakatsuji,
2001; Nagano et al., 2002a; http://www.amyshah. com.2007/04/). Son clulas con gran
capacidad de proliferacin ( Anzalda et al., 2007; Merchant, 2007). In vitro las clulas ES
pueden producir hasta 10 mil millones de clulas sin diferenciarse (http://stemcells.nih.gob/
info/scireport/ appendixb). Se auto renuevan (Li y Leder, 2007; Young, 2004, http://www.
amyshah.com.2007/04/), mediante divisin celular mittica simtrica; formando clulas hijas
indiferenciadas (Burdon et al., 2002), con capacidad de diferenciarse en diversos tipos celulares
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(Merchant, 2007) in vivo e in vitro (Merchant, 2007), por largos periodos de tiempo. (http://
stemcells.nih. gov/info/scireport/2001report; Prelle et al., 2002). Son clulas pluripotentes,
con potencialidad para formar clulas de las tres capas germinales: del endodermo, el
mesodermo y el ectodermo (Anzalda 2004; Henson et al., 2005; Konno et al., 2006; Nagano
et al., 2002a; Nikatsuji, 2001; Niwa, 2001; Prelle, et al., 2002; Ulloa et al., 2005).
Las clulas ES de ratn presentan un ncleo grande (Young et al., 2004) con escasa cantidad
de citoplasma (Tada y Tada, 2001). Su genotipo muestra un cariotipo normal estable (Prelle et
al., 2002; Henson et al., 2005), diploide, caracterstico de cada especie. Young y colaboradores
(2004), observaron gran actividad de la telomerasa en ests clulas indiferenciadas.
Marcadores celulares
Los marcadores celulares de superficie son antgenos formados por azcares y/o protenas
de membrana celular (http://www.antibody.com/index2.html). Las clulas ES expresan un
grupo de marcadores superficiales que caracterizan a las clulas embrionarias indiferenciadas
(Young et al., 2004), pluripotentes y en proliferacin, que distinguen entre las clulas ES del
ratn, del mono y las humanas (Ito et al., 2007). Los marcadores que identifican a las clulas
ES humanas (hES, del ingls human Stem cells) son: SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60 y TRA1-81 (Pruszak et al., 2007; http://www.antibody.com/index2.html), Oct-4, telomerasa y la
fosfatasa alcalina. En ratn: SSEA-1, fosfatasa alcalina, Oct-4 y la telomerasa y en el mono:
SSEA-1, SSEA-4. TRA-1-60. TRA-1-81, la fosfatasa alcalina y Oct-4 (http://stemcells.nih.
gov/info/scireport/appendixb).
Entre las tcnicas utilizadas para poder evidenciar y seleccionar (sorting) a las clulas que
portan el marcador de superficie de inters, estn: a) la tcnicas de tincin fluorescentes (Fig.
1), como la protena verde fluorescente (GPF), que consiste en insertar en la clula un gene
reportero, b) la inmunofluorescencia (Humprey et al., 2004), c) el mtodo de etiquetado
y seleccin con anticuerpos fluorocromo-conjugados (FACs (Pruszak et al., 2007; http://
stgemcells.nih.gov/info/ scireport/appendixe) y d) la separacin celular inmunomagntica
(MACS) (Pruszak et al., 2007).
Li y Leder (2007), utilizaron la tcnica del vector gen trampa retroviral (Virus murino de la
leucemia MMVL) y los genes Neo reporteros, acoplados a los anlisis de la GFP y los FACs,
teniendo como blanco los genes expresados en clulas troncales embrionarias indiferenciadas,
clonadas. Con est tcnica observaron, in vivo, que la actividad transcripcional se reduce y que
hay genes endgenos se apagan cuando estn diferenciadas las clulas.
Protenas
Nagano y colaboradores (2002b) y Kunomura y colaboradores (2002), disearon metodologas
para obtener el perfil protemico de la superficie membranal en clulas troncales embrionarias,
mediante etiquetado o marcaje celular, acompaado por cromatografa lquida ligada a la
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M. en C. Teresa Florencia Lpez-Murillo y col.
superficie celular usando etiquetas fluorescentes (Terese Winslow, http://

Figura 1: Marcadores de
stemcells.nih.gov/info/ scireport/appendixe)
espectrometra de masas. Encontraron que el 80% de pptidos identificados eran derivados
transmembranales o protenas asociadas a membrana. stas incluyen la fosfatasa alcalina,
caderina 1, CD9, CD98, antgeno CDw92, receptor A2 Eph, integrina a y b, laminita a1
y protena 2 transmembranal. Identificaron en clulas ES la presencia de entre 987-1233
protena, en clulas en crecimiento, como enzimas citolticas, protenas de citoesqueleto,
transmembranales, receptores y molculas de adhesin. Consideran que la expresin de ests
protenas est regulada por la va se sealizacin LIF (factor de inhibicin de leucemia).
Mediante anlisis de DNA y Northern- and Western-blot se ha confirmado la presencia de
Zfp57 (zinc finger protein), protena presente en clulas en estado indiferenciado, regulada la
expresin de su gen por el factor de trascripcin STAT3 (Agagi et al., 2002). La protena
Zfp-57 fue localizada en el ncleo celular (Li y Leder, 2007)
Genes
Es difcil, in vivo, identificar los genes y factores que participan en el la bioqumica de las clula
hES, por lo antes mencionado, as que gran parte de la informacin gentica y molecular
provienen de estudios en clulas ES de ratn in vitro (http://stemcells.nih.gob/info/scireport/
appendixa).
Los microarreglos son comnmente reconocidos como una herramienta para evaluar la
expresin de genes va anlisis del cDNA o RNA (Yamazoe e Itawa, 2005). La expresin de
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genes puede ser monitoreada mediante el uso de GFP (gen reportero) (Li y Leder, 2007) en
clulas hES (Kuroda et al., 2004) y en mono (Shigehiko et al., 2006). Los FACs, son usados
para evidenciar con mayor facilidad la expresin de genes (Kuroda et al., 2004). La Actividad
o inactividad de estos genes se ha podido identificar mediante tcnicas como la reaccin en
cadena de la polimerasa (PCR) o la transcriptasa inversa RTPCR (Ko et al., 2006). Mediante
manipulacin gentica se han elaborar plsmidos para la introduccin del gen de inters (Boer
et al., 2007; Ito et al., 2007). Y la tcnica de Knockout para identificar la funcin de un gen en
particular (Humprey et al., 2004).
En clulas clonadas ES de ratn se encontr cuatro genes diferentes, tres localizados en un
intrn; una nueva isoforma embrionaria para CSL/RBP-Jkappa, el cual codifica el factor de
trascripcin para la va LIN-12/Notch pathway. Otro fue interno y puede codificar para la
transcripcin de RNA no codificante. Esta isoforma es especfica para clulas indiferenciadas y
es posible que juegue un papel importante en la generacin y mantenimiento de ciertas clulas
troncales durante el desarrollo embrionario. (Li y Leder, 2007).
Metilacin y acetilacin del DNA
La metilacin del DNA es un proceso en el que se aade grupos metilos a residuos especficos de
citosina en las regiones promotoras del DNA. Cuando el grupo metilo est unido a una regin
en el DNA, los factores de transcripcin no pueden unirse al DNA y los genes de transcripcin
se apagan. Es un mecanismo de regulacin de la expresin de genes (Gilbert, 2000 en http://
stemcells. nih.gov/info/scireport/appendixa).
Despus de la fecundacin los niveles de metilacin son bajos y se mantienen hasta la
preimplantacin, los genes no expresados de las clulas no diferenciadas permanecen
desmetilados. Pero antes de la gastrulacin, el DNA de la clulas somticas embrionarias
empiezan a remetilarse y los genes son selectivamente encendidos o apagados (Tucker et
al., 1996 en http://stemcells.nih.gov/info/scireport/appendixa). Cuatro genes han sido
identificados en ratn y en humano que llevan el dominio metil C-pG (MBD), MBD1, MBD2,
MBD3 y MBD4. La regulacin de la metilacin y de la demetilacin es desconocida (Tada y
Tada, 2001).
La acetilacin se realiza a travs de la accin de la histona acetilasa (HATs), que se correlaciona
con la activacin de genes. La desacetilacin de histonas es va histona desacetilasa (HDACs)
y se le atribuye la inactivacin de genes. sta consiste en conservar residuos de Lys en aminos
terminales de histonas H3, H4, H2A y H2B que directamente contribuyen con la regulacin
transcripcional. Su mecanismo es desconocido. En clulas troncales embrionarias de ratn estn
hipometiladas en comparacin con las clulas somticas diferenciadas (Tada y Tada, 2001).
Factores transcripcionales
Un factor de transcripcin, es una protena que se unen al sitio promotor del DNA e intensifican
el proceso de transcripcin, activando o inactivando genes que regulan la expresin de las
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caractersticas especficas de las clulas. Los factores de transcripcin reconocidos para clulas
ES son Oct4, Nanog (Herg et al., en Ulloa-Montoya et al., 2005), Sox2 (Boer et al., 2007), y
posiblemente Zfp57 (Agari et al., 2002).
Factor de transcripcin oct-4 o oct3/4. Se considera a oct-4, uno de los marcadores
importantes presentes en las clulas no diferenciadas, en divisin y pluripotentes (Ko et al.,
2006; Kurosawa et al., 2006). Conocido como Oct-3 u Oct-3/4 (http://stemcells.nih.gob/
info/ scireport/appendixb). Es un octmero rico en adeninas y timinas, miembro de la clase 5
POU, codificado por el gene Pou5f1 (Niwa, 2001). El factor de transcripcin Oct-4 puede activar
o reprimir la expresin de varios genes y dependiendo del gen blanco, Oct-4 puede requerir
de la presencia del coactivador E1A o del cofactor transcripcional Sox2 (http://stemcells.nih.
gob/info/scireport/ appendixa). Oct-4 es considerado como el regulador maestro de la
pluripotencia en clulas ES (niwa et al., 2000).
Desde 1989, Schler y colaboradores identificaron a Oct-4 y Oct-5, como factores de
trascripcin presentes en clulas troncales embrionarias, concluyendo que los niveles de estos
factores decrecen durante la diferenciacin.
Cofactores para oct-4.
a) E1A (adenovirus), sirve como un puente de unin entre Oct-4 y la maquinaria transcripcional
(Niwa, 2001).
b) Sox2 (Cofactor transcripcional), es un factor proteico, que activa a los genes Fgf-4, Utf-1, e
inhibe al gen Opn, formando un homodmero con Oct-4. Sox y el octmero son esenciales
para la activacin de genes especficos para la pluripotencialidad. Se ha observado que las
secuencias de DNA en Oct-4 y Sox son idnticas entre humanos, ratones y monos (Kuroda
et al., 2004)
c) Zfp57, protena expresada especficamente clulas en estado indiferenciado. Su expresin
est regulada por STAT3. Es posible que acte como cofactor de Oct-4 (Agagi et al., 2002).
La cooperacin entre Oct-4 y sus cofactores (Boer et al., 2007) se ha analizado con el
procedimiento de squelching. Mediante la activacin de promotores artificiales, se observ
la importancia del balance cuantitativo entre estos factores, que forman un complejo ternario
que consiste en Oct-4, E1A y la maquinaria transcripcional. Los excesos de Oct-4 o de E1A
previenen la formacin del complejo activo por saturacin de sitos de unin. El exceso de Oct4 conlleva a la no activacin de genes blanco, pero la represin o sobre expresin de Oct-4
activa algunos genes como Zfp42/Rex-1 y Upp/383 (Niwa, 2001). El complejo formado con
Sox2 ha mostrado que pequeos cambios en los niveles de Sox2:Oct-4, alteran en destino
de la clulas ES (Boer et al., 2007). Es importante, el equilibrio entre la expresin de Oct-4
y sus cofactores, ya que expresiones por arriba del 50% de lo requerido puede promover la
diferenciacin de clulas del endodermo primitivo y el mesodermo, y niveles bajos de Oct-4
puede llevar a las clulas de la masa interna del blastocisto a la diferenciacin en clulas del
trofoectodermo (Niwa et al., 2000; Niwa, 2001). Boer y colaboradores (2007), encontraron
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que la elevacin mnima de los niveles de Sox2, se inhibe la accin sobre los genes y la sobre
expresin de Oct-4 o Nanog no inhibe la relacin Sox2:Oct-4.
Genes blanco para oct-4.
Se ha observado que los genes que regula Oct-4 en coordinacin con los cofactores son: Utf1(cofactor transcripcional), Zfp42/Rex-1 (Protena Zinc-finger), PDGFr (receptor del factor
de crecimiento) Fgf-4 (factor de crecimiento de fibroblastos), UPP/383 (Uridin fosforilasa) y
Tera/226. Estos genes se expresan en clulas ES pero los patrones de expresin son diferentes
dependiendo de la etapa embrionaria de pre o postimplantacin (Niwa, 2001)
Factor de transcripcin Nanog. La accin sinrgica entre Oct4 y Sox2 posiblemente
regulen al gen Nanog, Este gen es especfico de clula pluripotentes. El factor transcripcional
es requerido para el mantenimiento del estado indiferenciado de las clulas troncales. Sin
embargo, los mecanismos de regulacin de este gen son desconocidos (Kuroda et al., 2004)
Seales del transduccin para el mantenimiento de la auto renovacin en clulas
troncales embrionarias
El proceso de transduccin es un mecanismo de respuestas a estmulos externos, donde la
unin de estos estmulos (molculas qumicas), a sus receptores membranales activan una serie
de respuestas intracelulares que pueden activar o inactivar un gen. El anlisis de las seales de
transduccin es difcil debido a las bajas concentraciones las molculas participantes (http://
www.ims.u-tokyo.ac.jp/ stem/annual02.pdf).
El factor de inhibicin de la leucemia (LIF), la glicoprotena (gp130), la transduccin de seales
y el activador de la va de trascripcin 3 (STAT3) son esenciales en el mantenimiento de la
pluripotencia en ES de ratn (Sumi et al., 2004) y para la auto renovacin de clulas ES en
primates, incluyendo al humano y al chango, es necesaria la relacin LIF/gp130/SATAT3
(Sumi et al., 2004)
Humphrey y colaboradores 2004), observaron que STAT3 no se fosforila en clulas
indiferenciadas hES , concluyendo que esta va no es suficiente para prevenir su diferenciacin.
La auto renovacin es mantenida por el factor inhibidor de la leucemia, participando dos
factores de transcripcin, STAT3 y Oct-4 (Agagi et al., 2002). La va de activacin de STAT3
ha podido ser estudiadas mediante la tcnica de RT-PCR (Konno et al., 2006).
Elementos participantes en los caminos de sealizacin.
a) Factor inhibidor de la leucemia (LIF). Su gen y el mRNA para su receptor (LIFR) son expresados
en el blastocisto. Es una citosina (Gearing et al., 1991), del grupo de las interleucinas-6 (IL6). Liberado por la capa alimentadora de fibroblasto de ratn o por protenas recombinantes
(Burdon et al., 2002). Inhibe la diferenciacin de clulas ES en ratones(Dahron 2004; Konno
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et al., 2006; Nagano et al., 2002a; Ko et al., 2006), sin embargo, esto no sucede en humanos
ya que es considerado un factor que induce la diferenciacin en clula de la leucemia tipo M1
(Niwa, 2001). En cultivos de ratn es requerido para la sobrevivencia, el estado indiferenciado
y la proliferacin de clulas de la masa interna del blastocisto. Mediante la tcnica de
inmovilizacin de LIF, se ha podido determinar la influencia de LIF en la activacin de
STAT3 y Oct-4 (Makino et al., 2004). Sin embargo, Dahron (2004), encontr que el receptor
LIF y la subunidad gp130 se expresan en clulas troncales embrionarias humanas y que
LIF puede inducir la fosforilacin de STAT3 y la translocacin nuclear y LIF es incapaz de
mantener la pluripotencia. Tambin, observ que los cultivos con capas alimentadoras que
mantienen el estado indiferenciado no muestran activacin de STAT3, lo que sugiere que el
camino de sealizacin que dirige la auto renovacin en clulas humanas es distinto. Nagano
y colaboradores (2002a), encontraron que la va de sealizacin de LIF es importante para
mantener la pluripotencia de las clulas ES.
Gearing y colaboradores (1991) aislaron, en humanos y ratones, el receptor LIF mediante
hibridacin e identificaron una regin transmembranal y una citoplsmica (soluble) relacionada con la gp130. La accin de LIF es mediante su receptor especfico que estimula la
diferenciacin-induccin, diferenciacin-supresin, proliferacin o activacin dependiendo
del tipo de clula (Gearing et al., 1991)
b) Factor de transcripcin STAT3. Es un factor proteico. Juega un papel importante el la va de
sealizacin LIF, en el mantenimiento de la proliferacin y el estado no diferenciado (Dahron,
2004) en las clulas pluripotentes de la masa interna del blastocisto (Burdon et al., 2002)
La activacin de STAT3 es suficiente para la auto renovacin de clulas ES (Agagi et al., 2002)
c) Factor de crecimiento de fibroblastos (FGF-4). Es un factor proteico que se expresa junto con
Oct-4 en la masa de clulas interna y el epiblasto. FGF-4 acta como una seal parcrina,
(liberada en la masa interna y acta alrededor del trofodermo) o como una seal autcrina
(que puede actan en la misma masa de clulas internas que la liberan). Codificado por el Gen
Fgf4 (http://stemcells.nih. gov/info/scireport/appendixa)
Dos posibles vas de transduccin de seales mantienen el estado de auto renovacin de clula
ES, son la va JAK/STAT3 y la SHP2.
Va de sealizacin jak-stat3. (fig. 2). La va de sealizacin de LIF es importante para
mantener la pluripotencia LIF se une a un complejo de receptores de membrana, el receptor
LIF y la protena gp130; mediante sealizaciones moleculares se activa la va JAK-STAT3 o
la ERK, o SH2 (http://ims.u-tokyo.ac.jp/stem/annual02.pdf). Se ha observado en ratones
que LIF se une a su receptor membranal, LIFR que forma un heterodmero con la protena
gp130. Se asocia con la tirosina cinasa (JAK) y este complejo se fosforila, lo cual activa la va
JAK-STAT3 (Humphrey et al., 2004). La fosforilacin de de STAT3 induce la expresin de
Oct-4 (Konno et al., 2006), que promueve la auto renovacin (Burdon et al., 2002) y el estado
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indiferenciado de las clulas ES en ratn. Estudios en humanos de la va de sealizacin LIF/

STAT3, concluye que la activacin de STAT3 va gp130 no contribuye a la pluripotencia en
clulas ES humanas (Dahron et al., 2004; Humphrey et al., 2004) y primates no humanos
(Sumi et al., 2004).
Va de sealizacin SHP. La auto renovacin de las clulas del ES del ratn parece ser
influenciada por la actividad de SHP-2 y de ERK. SHP-2 es una fosfatasa de tirosina (una
enzima que elimina grupos fosfato a los residuos del Tirosina de varias protenas). SHP-2 acta
recprocamente con el dominio intracelular (del amino terminal) del receptor gp130. ERK es
una de varias clases de enzimas que se activa cuando se estimulan el receptor gp130 y otros
receptores de la superficie celular. ERK y SHP-2 son componentes de una va de seales de
transduccin que acta en contra de la activacin de STAT3 y por lo tanto la proliferacin
celular. Por lo tanto, si ERK y SHP-2 estn activos, se inhibe la auto renovacin de la clula del
ES (http://stemcells.nih.gob/info/scireport/appendixb; Burdon et al., 2002).

Figura 2: Va de sealizacin LIF-STAT3 va que promueve la auto renovacin de clulas troncales
embrionarias ( Terese 2001 Winslow, Lydia Kibiuk en http://stemcells.nih.gob /info/scireport/appendixb)
Cultivo de clulas troncales embrionarias

Solo tres especies de mamferos se han mantenido en cultivos a largo plazo de clulas con
auto renovacin; los ratones, los monos y los seres humanos (http://stemcells.nih.gob/info/
scireport/chapter2/.
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Las clulas troncales embrionarias se obtienen de de embriones en la etapa de mrula, de

blastocistos completos o los obtenidos por inmunociruga a partir de la masa interna celular del
blastocisto (Anzalda et al., 2007), de clulas de la sangre del cordn umbilical, por embriones
generados por fertilizacin in vitro por clonacin (trasplante nuclear) o partenognesis
(Belkind-Gerson et al., 2003; www.iscr.ed.ac.uk), de abortos espontneos (www.iscr.ed.ac.uk) o
congelados (http;//www.revista.unam.mx/vol.5/num2/art7/art7.htm), del fluido amnitico
de roedores y humanos, que expresan marcadores para clulas embrionaria y adultas (De
Coppi et al., 2007)
El medio de cultivo (MEF) es elaborado con suero fetal de becerro, que proporciona factores
del crecimiento. Se coloca una capa de clulas de fibroblasto de ratn, llamada capa
alimentadora, que se utilizan como sustrato de adherencia y LIF. Las clulas del fibroblasto son
tratadas qumicamente para evitar su proliferacin (http://stemcells.nih.gov/info/scireport/
appendixb). Los fibroblastos embrionarios del ratn mantienen la pluripotencia (Humphrey
et al., 2004), el estado indiferenciado (Li y Leder, 2007) y la proliferacin de las clulas de la
masa interna del blastocisto.
MEF es el medio de cultivo tradicional para proliferar clulas ES, sin embargo, se han hecho
observaciones del peligro potencial de de trasmitir algn patgeno a clulas hES, si se utiliza
este medio. El equipo de Yoo ha proliferado exitosamente clulas hES a partir de clulas
semejantes a los fibroblastos (DiffMiz-hES6) derivadas de linajes humanos (Yoo et al., 2005).
Las clulas hES se han cultivado en capas alimentadoras de fibroblastos embrionarios, de piel
y msculo fetal, de fibroblastos de clula adultas, de clulas de la mdula (Ulloa-Montoya et
al., 2005). Se ha podido sustituir las capas alimentadoras con Matrigel, o colgeno purificado
tipo IV, laminina, y fibronectina, medios que minimizan cambios genticos y optimizan el
mantenimiento del estado indiferenciado (Draper et al., 2004)
Medios de cultivos artificiales. Makino y colaboradores (2004), proponen una tcnica de
cultivo de ES de ratones mediante la inmovilizacin de LIF, logrando la expresin de Oct-4.
Tomohiro Konno y colaboradores (2006), aplicaron la tcnica de Polmeros fotoinmovilizados
y observaron liberacin de fosfatasa alcalina, la activacin del factor de transcripcin STAT3
y la expresin del factor de trascripcin Oct-4. Demostrando en este estudio que las diferentes
superficies de cultivo afectan la morfologa, el crecimiento y la diferenciacin de ES.
Variantes a estos cultivos son los cultivos qumicos inmovilizados de fibroblastos embrionarios
de ratn o epitelio amnitico humano. Estos cultivos pueden usarse repetidamente sin perder
la habilidad de mantener el crecimiento de clulas ES indiferenciadas. Los resultados obtenidos
en las muestras de ratn y mono expresan fosfatasa alcalina, Oct-4 y los marcadores SSEA-1,
en ratn y SSEA-4, en monos (Ito et al., 2007)
Un novedoso medio de cultivo que incrementa la conexin entre clulas ES de ratn,
fue elaborado con mercaptoetanol, glutamina, aminocidos no esenciales, penicilina,
estreptomicina y LIF (Amano et al., 2006)
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Cultivo con biorreactores para la proliferacin y diferenciacin de ES. Existen gran

variedad de biorreactores para cultivo de clulas y es posible que sean adaptadas al cultivo de
clulas ES, manipulando las condiciones para generar lneas celulares de ES con la finalidad
de aplicarse en terapia celular (Ulloa-Montoya et al., 2005; Yin et al., 2007).
Anzalda y colaboradores, (2007), hacen una revisin en relacin a las pruebas que se realizan
a las lneas celulares ES obtenidas in vitro, conocidas como de caracterizacin, en las que
se encuentran: a) las de crecimiento y subcultivo, b) el uso de marcadores moleculares de
superficie y para factores de trascripcin, c) la aplicacin de enzimas citoplsmicas, d) el
estudio del cariotipo y e) la diferenciacin y formacin de cuerpos embroides. Mientras que
las pruebas para lnea obtenidas in vivo son: a) la formacin de animales quimricos y b) el
desarrollo de teratomas (Nakatsuji 2001).
La pluripotencia es otra prueba requerida para las lnea celulares obtenidas (http://stemcells.
nih.gob/info/scireport/chapter2). In vitro los laboratorios han podido probar la pluripotencia
de clulas ES humanas. In vivo, solo se ha probado la pluripotencia de clula humanas
inyectadas en ratones inmunodeficientes que forman los teratomas (http://stemcells.nih.gov/
info/scireport/chapter3).
Efecto del O2 in vitro en clulas troncales embrionarias de ratones. Se considera
que el oxgeno juega un papel importante en los medios de cultivo ya que es necesario para
metabolizar los nutrientes, su restriccin cesa la proliferacin y por lo tanto hay diferenciacin.
En cultivos sometidos a una tensin de entre el 5% y el 20% de O2, decrece la actividad de la
fosfatasa alcalina y la expresin del gen Oct-4 y hay diferenciacin espontnea. Con 40% de
O2, se retarda la diferenciacin, se observa actividad de la fosfatasa alcalina (hasta el tercer da)
y se registra la mayor expresin del gen para Oct-4. Esos resultados sugieren que el oxigeno
regula la expresin de genes en ES (Kurosawa et al., 2006)
Uso y aplicacin potencial de las clula troncales embrionarias
Se han abierto campos de investigacin en diferenciacin celular dirigida, en la clonacin
teraputica, en la reprogramacin celular y en la medicina regenerativa, entre otros.
Diferenciacin celular dirigida. Para dirigir la diferenciacin es necesario cambiar las
condiciones del crecimiento de manera especficas, agregando factores del crecimiento al
medio de cultivo o cambiando la composicin qumica de la superficie en la cual las clulas
ES estn creciendo (http://stemcells.nih.gob/info/scireport/chapter2). Esto es posible por la
plasticidad celular (capacidad de diferenciarse) presentada por las clulas ES embrionarias
(Belkind-Gerson et al., 2003).
Se han diferenciado neuronas motoras a partir de clulas ES de ratn aadiendo al medio
del cultivo el ganglio dorsal de un polluelo, se obtuvieron principalmente neurona motoras,
GABArgicas, serotonrgicas y colinrgicas (Ayako y Shimizu, 2007). Takahisa y colaboradores
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(2007), generaron a partir de ES de ratn, clulas positivas a la insulina, y Yin y colaboradores

(2007), generaron a partir de cuerpos embroides de ratn un linaje de clulas hepticas. Pruszak
y colaboradores (2007), obtuvieron clulas neurales a partir de clulas troncales embrionarias
humanas.
En la actualidad hay lneas de investigacin encaminadas a generar vasos sanguneos primitivos,
neuronas que liberen dopamina y serotonina y produccin de clulas del islote pancretico
(http://stemcells.nih.gov/info/scireport/appendixb).
Clonacin teraputica. La clonacin teraputica, consiste en obtener clulas de un adulto
enfermo, posteriormente se extrae el ncleo de una de ellas y el ncleo se inyecta a un vulo
(sin ncleo). El vulo se desarrolla hasta formar un embrin, de este embrin se extraen y se
cultivan clulas madre. Las clulas se desarrollan en laboratorio hasta la formacin de tejidos,
seo, digestivo, muscular, neurona. Finalmente pueden ser injertados en el paciente sin peligro
de rechazo inmunolgico. (http://ww.jornada.unam.mx/2001/08/06/cien-patricia.html)
Reprogramacin celular. Despus de la maduracin algunas clulas somticas, retienen
ciertas propiedades semejantes a las de las clulas troncales. La reprogramacin de clulas
somticas puede ser inducida por factores derivados de clulas ES mediante hibridacin con
clulas somticas (Nakatsuji, 2001). Por ejemplo, linfocitos de timo llevan consigo el transgen
Oct4-GFP, que es un marcador para identificar clula troncales toti-/pluripotenciales. El gen
Oct4 es reactivado en 48 horas, se cree que es el tiempo en el que el DNA se replica y la clula
se divide y esto puede ser un requerimiento para inducir la reactivacin Se ha demostrado que
los ovocitos de mamferos no fertilizados contienen factores que son capaces de reprogramar
el ncleo somtico desde un estado totalmente diferenciado a uno toti-/pluripotencial (Tada
y Tada, 2001)
Mediante la fusin de clulas troncales adultas con clulas troncales embrionarias se han
logrado que las primeras presenten caractersticas de clulas troncales embrionarias (Nakatsuji,
2001; Kevin y Hughes en htt://bioeducation.net/news/ pdf/melton6-esp.pdf)
Al respecto se consideran dos posibles procesos celulares, la desdiferenciacin y la transdiferenciacin celular. La desdiferenciacin se refiere a la capacidad de las clulas troncales maduras
a adquirir estados inmaduros y posteriormente diferenciarse a un linaje especfico. Mientras
que la transdiferenciacin es cuando una clula madura de un linaje especfico se fusiona con
otra clula de otro linaje y adquiere las caractersticas de esta ltima clula (Berlkind-Gerson
et al., 2003)
Medicina regenerativa. El estudio de clulas troncales se enfoca en el uso potencial para la
cura de enfermedades como el Parkinson, Alzheimer (Anzalda et al., 2007) daos en espina
dorsal, la diabetes tipo II (Li y Leder, 2007, stemcells.nih.gov/info/basics/) y malformaciones
congnitas cardiacas (Salamanca-Gmez, 2005), la degeneracin de la clula de Purkinje,
la distrofia muscular de Duchenne, enfermedades cardacas, y prdida de la visin y de
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odo (http:77stemcells.nih.gov/info/ scireport/chapter3), infarto cerebral y dao nerviosos

(Berkind-Gerson, 2003) y reemplazo de rganos (http://www.amyshah.com. 2007/04/) y
tejidos (www.revista.unam.mx/vol.5/num2/art7/art7.html), que son necesarios sustituir
debido a patologas o traumatismos (Merchant, 2007). Con este objetivo, en California, se ha
fundado el Institute of Regenerative Medicine (http://www.antibody.com/index2.html).
A casi 30 aos de investigaciones en diversos pases de todo el mundo se ha avanzado en
el conocimiento de las clulas troncales embrionarias, sin embargo, an quedan muchas
interrogantes por resolver. Es importante duplicar esfuerzos dada la importancia que
representan para la cura de diversas enfermedades.
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Diferenciacin sexual cerebral

El proceso de diferenciacin sexual cerebral en los mamferos y en las ratas es consecuencia de una
expresin diferencial del genoma neuronal de machos y hembras y depende fundamentalmente
del ambiente hormonal circundante en el que se encuentre el SN. Este ambiente hormonal es
necesario ya que gracias a l se lleva a cabo la organizacin del sustrato antomo - funcional y
de las vas neuroendcrinas preexistentes determinantes de las diferencias sexuales.
La mayora de los circuitos dimrficos del cerebro relacionados con el proceso de diferenciacin
sexual estn relacionados con el hipotlamo. Este, regula la secrecin hormonal y funciona
como interfase entre el sistema endocrino y nervioso, presenta gran cantidad de receptores
a hormonas sexuales como andrgenos y estrgenos (Pfaff and Schwartz-Giblin, 1998). Este
rgano es tambin el centro regulador funcional del cuerpo, controlando vas relacionadas
con funciones autnomas, endocrinas, emocionales, somticas y de comportamiento sexual.
El hipotlamo es un rgano complejo a nivel neuroqumico y neuroanatmico; se divide en
4 regiones y 25 ncleos organizados de acuerdo a su estructura anatmica y funcional. As
mismo presenta diferentes ncleos dimrficos que se relacionan directamente con la fisiologa
y la conducta sexual; estos ncleos son el ncleo ventromedial, supraquiasmtico y preptico
(Goy and McEwen, 1980; Robinson et al, 1986; Doler et al, 1986). Durante el periodo
perinatal la presencia de andrgenos determinarn el desarrollo del dimorfismo sexual en
ncleos especficos del hipotlamo en aspectos como conducta sexual, patrones de secrecin
de gonadotropinas, teniendo como resultado la masculinizacin o feminizacin durante el
periodo crtico de diferenciacin.
Las diferencias morfolgicas, fisiolgicas, bioqumicas y del comportamiento de machos
y hembras se denominan, en su conjunto, dimorfismo sexual. Actualmente es claro que el
estradiol es el principal inductor de la diferenciacin sexual y que esta hormona acta en
etapas tempranas del desarrollo neuronal, a lo cual se le conoce como periodo crtico.
Tambin se sabe que el estradiol ocasiona cambios permanentes en estructuras del cerebro los
cuales impactan los procesos reproductivos. Esta hormona puede regular la transcripcin de
varias familias de genes que protegen a las neuronas de la apoptosis (neuroproteccin) y otros
involucrados en el ciclo celular (neurognesis) a travs de la unin diferencial a los receptores
o (Herrera et al., 2006).
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MECANISMOS DE ACCIN DEL ESTRADIOL DURANTE LA DIFERENCIACIN

SEXUAL
La diferenciacin sexual del cerebro de la rata, particularmente de algunas regiones intra y
extrahipotalmicas, es de gran importancia en el desarrollo del patrn fisiolgico indispensable
para que el animal adulto presente la secrecin endcrina y el patrn de comportamiento
caractersticos de cada sexo. La diferenciacin sexual en la rata ocurre durante el periodo
conocido como periodo crtico que se extiende de algunas horas o das antes del nacimiento
hasta algunas horas o das despus del nacimiento. Durante este proceso los estrgenos
desempean un papel muy importante (Babichev et al., 1990).
Recientemente se ha encontrado, a nivel genmico, que la actividad del estradiol se ejerce
originando diferencias sexuales en los niveles de expresin de algunos genes en ciertas
reas hipotalmicas (Simerly 2002; Tobet, 2002; Herrera et al., 2006), que pueden alterar
el desarrollo, crecimiento o interaccin sinptica entre diversos ncleos hipotalmicos, Se
ha propuesto que el establecimiento de las conexiones neuronales de reas dimrficas debe
continuar despus de la terminacin del periodo crtico, para completar la organizacin
funcional definitiva de las reas dimrficas. Esto es compatible con el hecho de que los
esteroides actan nicamente durante el periodo crtico, promoviendo el desarrollo de un
mayor nmero de neuronas, ya que este aumento en la cantidad de clulas es necesario
para el establecimiento de las conexiones neuronales que se utilizarn posteriormente para
el adecuado funcionamiento neuronal. Los esteroides pueden influir en la determinacin
del nmero de neuronas que componen los ncleos dimrficos a travs de diferentes
mecanismos: (I) estimulan la neurognesis o prolongan el periodo en el que sta ocurre,
(II) promueven la supervivencia neuronal, por medio de una neuroproteccin, durante el
periodo crtico de diferenciacin, (III) influyen sobre la localizacin neuronal, en trminos
de funcionalidad e identificacin neuroqumica, (IV) controlan la muerte celular, (V)
regulan el ciclo celular
I.- La neurognesis ocurre paulatinamente durante la etapa prenatal y es posible que
de manera simultnea se presente la migracin neuronal, la diferenciacin neural y la
sinaptognesis. Adems, las distintas fases de desarrollo neural presentan un carcter temporal
y regional, o sea, que dependen de la regin cerebral en desarrollo y pueden extenderse
hacia el desarrollo postnatal tardo y la madurez. Durante el desarrollo prenatal o postanatal
temprano, los factores hormonales y genticos controlan la neurognesis, el proceso de
supervivencia o desencadenamiento de la muerte por apoptosis, as como el desarrollo y la
formacin de conexiones entre las neuronas. Despus del nacimiento, ocurre un proceso de
plasticidad sinptica, en el cual los factores ambientales y experiencias provocan cambios en el
sistema nervioso, influenciando el desarrollo de los circuitos neuronales. En la edad adulta, la
experiencia altera las sinapsis nerviosas mediante el aprendizaje y la memoria. As, los procesos
que se llevan a cabo durante el desarrollo del sistema nervioso central son extremadamente
complejos y en ellos intervienen numerosos factores genticos y ambientales que pueden
modificar este desarrollo en cualquiera de sus fases (Herrera et al., 2006).
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Dra. Marcela Vergara Onofre y col.
II.- La neurognesis implica proliferacin y diferenciacin, que en el mbito del ciclo celular, se
traduce en la re-entrada y salida de neuroblastos en el ciclo celular, la cual regular y determinar
el nmero de neuronas del cerebro. En este sentido, el nmero de neuroblastos que salen del
ciclo celular y se diferencian incrementa con el transcurso del desarrollo. La diferenciacin
neuronal es un proceso clave en el desarrollo y se encuentra estrechamente vinculada con el ciclo
celular, ya que las clulas que salen del ciclo celular en fases tempranas exhiben determinadas
caractersticas, mientras que las que salen en las fases tardas exhiben otras. Por ello, debe existir
una coordinacin precisa entre el ciclo celular y la diferenciacin neural, la cual estar regulada
por los factores que regulan ambos procesos (Herrera et al., 2006).
Durante la diferenciacin sexual las clulas neuronales sufren un proceso apopttico. El
estradiol puede regular la muerte celular de las neuronas por apoptosis. Se han realizado
estudios donde se observan clulas apoptticas en el desarrollo del dimorfismo sexual del SNC,
as como en procesos naturales y patolgicos (Nielsen et al., 2000; Adrienne et al., 2000).
A travs de varios estudios se ha encontrado que algunas hormonas esteroides (como la
testosterona y estradiol) desempean un papel importante en la diferenciacin sexual cerebral.
Por su funcin neuroprotectora, los estrgenos pueden tener diferente efecto en hembras y en
machos, debido a la distinta sensibilidad que presenta el tejido hacia estas hormonas, al tipo
de receptor, la localizacin de ste y a la cantidad de hormona presente (Green et al., 2000,
Garca Segura et al., 2001).
Trabajos realizados in vitro con clulas hipotalmicas de rata, demostraron que para que
los estrgenos ejerzan su accin neuroprotectora las clulas deben presentar receptores a y
, ya que las que slo presentaron el receptor b tuvieron un mayor ndice de muerte neuronal
(Nielsen et al., 2000; Temple et al., 2001), debido muy probablemente al efecto antagnico
que tiene la activacin del receptor sobre el efecto neuroprotector del estradiol. El efecto
neuroprotector de los estrgenos en clulas hipotalmicas, se debe a que este esteroide acta
sobre el receptor a para inducir la sobreexpresin de genes antiapoptticos de la familia de
bcl-2, mientras que en el caso de las clulas que slo expresan el receptor b, el estradiol activa
el sistema primario de induccin de apoptosis Fas-Fas ligando (FasL) (Mor et al., 2000). Una
vez que los estrgenos regulan la expresin del FasL, el sistema activa a la caspasa 10, que
a su vez activa a la caspasa 3, y sta a las endonucleasas, encargadas de fragmentar el ADN
durante el proceso de apoptosis. En el desarrollo del sistema nervioso central (SNC), alrededor
de la mitad de las clulas mueren, (Oppenheim et al., 1991; Mooney et al., 2000). Las neuronas
que mueren durante el desarrollo del SNC presentan signos de muerte por apoptosis y este tipo
de muerte es un importante mecanismo que determinar el tamao y forma del SNC (Chia
et al., 2000).
III.- Las hormonas gonadales activan la conducta sexual mediante un efecto local en las
estructuras del sistema nervioso. Esta accin se realiza como parte del funcionamiento normal
de las neuronas y modula la interaccin entre ellas. Ello, de hecho, supone la interaccin entre
las hormonas gonadales y los neurotransmisores que actan como mediadores qumicos en la
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comunicacin interneuronal. Existen evidencias que sugieren que los neurotransmisores podran
participar en el desarrollo de las diferencias sexuales del SNC, ya que la administracin prenatal
de drogas que afectan sistemas adrenrgicos, colinrgicos, serotoninrgicos, dopaminrgicos
(Dhler et al., 1991) y gabargicos (Segovia et al., 1991). Son capaces de modificar el desarrollo
de las diferencias sexuales en el cerebro y de las conductas reproductivas. Se han encontrado
diferencias entre los sexos en cuanto al contenido de neurotransmisores y de la actividad
enzimtica en los sistemas serotoninrgico, dopaminrgico, colinrgico (De Vries et al., 1984),
as como en el nmero de sus receptores (Segovia et al., 1991, Avissar et al., 1981; Orensanz et
al., 1983) y de algunos sistemas enzimticos relacionados con estrs oxidativo (Herrera et al.,
2006). Este dimorfismo encontrado en animales adultos no slo indica un dimorfismo sexual
funcional, sino tambin un posible dimorfismo estructural en los ncleos que sintetizan estos
neurotransmisores y en los patrones de distribucin de las fibras que los liberan.
IV.- Durante el desarrollo del SNC, se genera un nmero excesivo de neuronas, siendo
selectivamente eliminadas las que no establecen correctamente sus conexiones (Oppenheim,
1991). Durante la diferenciacin sexual del hipotlamo, la muerte celular reduce a la mitad
el nmero de neuronas que se generaron durante las etapas tempranas de la neurognesis.
Se piensa que esta prdida sirve para afinar la funcin neuronal y parece estar asociada
con un incremento en la especializacin de las funciones cerebrales en diferentes regiones
del cerebro. La apoptosis es esencial para el desarrollo y mantenimiento de los organismos
multicelulares, y ocurre de manera natural durante el desarrollo del SNC. De acuerdo con la
teora trfica, los factores trficos producidos en las clulas diana protegen las proyecciones
neuronales de la muerte celular programada (Oppenheim, 1991). En este sentido, las neuronas
necesitan de una serie de factores de crecimiento para sobrevivir. Se han descrito muchos
posibles factores de crecimiento, siendo los ms conocidos el factor de crecimiento nervioso
(NGF), el factor neurotrfico derivado del cerebro (BDNF), neurotrofina (NT-3) y el factor
de crecimiento insulnico del tipo 1 (IGI-1) (Daz-Horta et al., 2002), los cuales promueven la
proliferacin y diferenciacin celular. Estos factores de crecimiento se encuentran en el SNC
en concentraciones muy bajas, con estos niveles las neuronas tienen que competir entre s por
ellos y al no conseguirlos mueren por apoptosis. La muerte de las neuronas presinpticas puede
servir para una variedad de funciones biolgicas entre las cules se puede incluir la regulacin
poblacional de clulas neurales precursoras que son necesarias para la propia morfognesis
cerebral, seleccionando las poblaciones regionales apropiadas y/o los fenotipos neuronales
especficos, y eliminando las clulas con anormalidades genticas (Herrera et al., 2006).
Morfolgica y bioqumicamente, la apoptosis se caracteriza por una serie de alteraciones
esencialmente nucleares pero tambin citoplasmticas, tales como la condensacin de la
cromatina, la fragmentacin del DNA, la desorganizacin del citoesqueleto, la formacin de
cuerpos apoptticos, la activacin de caspasas, la presencia de marcadores fagocticos en la
superficie celular, etc.
V.- La expresin del homlogo celular de la mielocitomatsis (c-myc) es necesaria para la
progresin del ciclo celular, tanto a nivel del paso de G0 a G1 como de G1 a S. Recientemente,
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se ha involucrado la regulacin de c-myc con las cinasas de la familia Src, a travs de la

activacin de las GTPasas Rho, para la progresin de G0 a G1 del ciclo celular (Brewer G,
1999). En los ltimos aos, se ha relacionado tambin a la va de Raf/ERK y PI-3K/Akt con la
estabilidad de la protena Myc, mediante la fosforilacin de la Ser-62. La expresin de c-myc, es
estrictamente requerida para la transmisin de seales mitognicas inducidas por los factores
de crecimiento como el M-CSF o PDGF y es suprimida por inhibidores de la proliferacin o
seales de diferenciacin como por ejemplo por adenosin monofosfato cclico (AMPc), el factor
de crecimiento transformante (TGF-a), IFN-a (interfern alfa), el inhibidor del ciclo celular,
p21Waf1, u otros inhibidores de la proliferacin celular (Chang et al., 2000). Varios estudios
han demostrado que la regulacin de los niveles de c-Myc son estrictamente esenciales para
el correcto funcionamiento de la clula, puesto que la eliminacin por delecin homocigtica
de los genes de c-myc resulta letal a nivel embrionario (Brewer G, 1999), mientras que la
sobreexpresin de estas protenas, ya sea en cultivos celulares como en animales transgnicos,
bloquea la diferenciacin, e induce la transformacin neoplsica y sensibiliza a las clulas a
morir por fenmenos de apoptosis (Diaz Horta et al., 2002).
APOPTOSIS Y ESTRS OXIDATIVO.
La apoptosis constituye un mecanismo fisiolgico esencial para la eliminacin selectiva de
las clulas y participa de manera integral en diversos eventos biolgicos. La proliferacin y
muerte celular son procesos muy complejos e involucran la participacin de muchos genes. En
la muerte por apoptosis, la mitocondria tiene un papel central en la fase de ejecucin, debido
a que almacena en su espacio intermembranal, activadores y efectores de muerte, como el
citocromo c, entre otros. La permeabilizacin de la membrana externa, est asociada con
disfuncin mitocondrial, alteracin del potencial membranal (Dym), colapso del organelo y
liberacin de factores pro apoptoticos. En el proceso de apoptosis se observa, la translocacin
de protenas de sealizacin y molculas efectoras entre el ncleo, el citoplasma y las
mitocondrias. De particular inters resulta la movilizacin de protenas pro apoptoticas hasta
la mitocondria donde inducen disfuncin de este organelo, en este grupo se encuentran las
protenas relacionadas con el estrs oxidativo. (Moll et al., 2001).
El estrs oxidativo se ha implicado en el envejecimiento cerebral y en los trastornos
neurodegenerativos asociados con la edad. Puesto que recientemente se ha demostrado que
la N-acetilcistena (NAC) previene el dao oxidativo en el cerebro senescente, se ha explorado
los efectos de este antioxidante tilico sobre los parmetros relacionados con el estrs oxidativo
asociado al envejecimiento cerebral y diferenciacin en determinadas regiones cerebrales de
la rata (Shing et al., 2007).
La glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD) es la primera enzima de la va pentosa fosfato y la
principal fuente intracelular de nicotidamina adenina dinucletido fosfato reducido (NADPH),
compuesto comprometido en diversos procesos fisiolgicos, por ejemplo defensa antioxidante
modulacin del crecimiento endotelial, eritropoyesis, vascularizacin y fagocitosis.
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El proceso de apopptosis sigue a la eliminacin de ciertas clulas selectivas durante el

crecimiento, desarrollo o procesos homeostticos. La disponibilidad de GSH (glutation
reducido) inter y extracelular podra ser la diferencia entre la vida y la muerte, y en su caso
contrario su agotamiento podra resultar en un compromiso de la clula a su capacidad para
eliminar intermediarios metablicos altamente reactivos formados durante condiciones de
estrs oxidativo (Bassin et al., l997)
La especializacin de las propiedades intracelulares del GSH puede estar involucrada en la
apoptosis o trmino que se ha referido generalmente como muerte celular programada. La
apoptosis se puede caracterizar por cambios celulares que incluyen fragmentacin nuclear,
formacin de cuerpos apoptoticos, y su ingestin por fagocitosis. El proceso de apopptosis
sigue a la eliminacin de ciertas clulas selectivas durante el crecimiento, desarrollo o procesos
homeostticos. La disponibilidad de GSH al inter y extracelular podra ser la diferencia entre
la vida y la muerte, y en su caso contrario su agotamiento podra resultar en un compromiso
de la clula a su capacidad para eliminar intermediarios metablicos altamente reactivos
formados durante condiciones de estrs oxidativo (Ortega-Camarillo et al., 2009).

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Sistema de liberacin controlada de

medicamentos
Introduccin
El diseo y aplicacin de sistemas de dosificacin controlada de medicamentos y los sistemas
de direccin localizada de la actividad de un determinado frmaco es actualmente uno de los
aspectos de mayor relevancia en el desarrollo de nuevas formas de medicacin. La utilizacin
de materiales polimricos como soportes de frmacos para regular y dosificar su liberacin en
aplicaciones especficas es una perspectiva que ha adquirido gran inters (Fig. 1) (Virginia, 2002).
Figura 1. Disciplinas cientficas relacionadas con liberacin de frmacos.
El objetivo principal de la liberacin controlada es simple: conseguir la cantidad correcta del

agente activo, en el momento adecuado y en el lugar preciso. Este mtodo de liberacin se usa
habitualmente para prolongar el tiempo que la dosis teraputica est presente de forma efectiva
utilizando una nica dosis, y para eliminar o minimizar las concentraciones que exceden los
requerimientos teraputicos.
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Sistema de liberacin controlada de medicamentos
En la actualidad se definen como formas dosificadas de liberacin modificada aquellos

preparados que han modificado la velocidad y/o el tiempo y/o el sitio de cesin del ingrediente
activo, para obtener una respuesta teraputica especfica que no se lograba con las formas de
dosificacin convencional administradas similarmente, puesto que stas permiten una rpida
liberacin del principio activo. Este trmino lo emplea la Real Farmacopea Espaola para
denominar a los sistemas controlled release en la literatura anglosajona.
Actualmente existen dos mtodos para mejorar la accin de los frmacos (Virginia, 2003):
Liberacin controlada, que trata de eliminar o reducir los efectos secundarios produciendo una
concentracin teraputica del frmaco que sea estable en el organismo. Se trata de alcanzar
una cintica de liberacin de orden cero y no suelen existir cambios en la concentracin del
frmaco en el organismo (comparndolo con los cambios intermitentes de concentracin en
las dosificaciones convencionales).
Liberacin dirigida hacia lugares especficos, que trata de asegurar que el frmaco es liberado
en el lugar requerido y al mismo tiempo mantiene el frmaco inactivo en cualquier otro lugar
del organismo.
La aplicacin ms frecuente en la actualidad de estos sistemas est dada por el recubrimiento
eficaz del medicamento con un material adecuado, con lo que se consigue no solo una seccin
gradual y sostenida sino una liberacin que se produzca a modo de pulso a determinados pH.
Tambin se puede conseguir la reduccin del efecto directo irritante causado por algunos
medicamentos en la mucosa gstrica, mediante el recubrimiento del principio activo con un
material no soluble al pH gstrico.
Desde una ptica biofarmacutico y teraputico, los beneficios de la microencapsulacin en la
formulacin de medicamentos podra resumirse en lo siguiente (Benitas, 1996):
Reduccin del efecto gstrico irritante, causado por algunos medicamentos en la mucosa
gstrica: El ejemplo ms ilustrativo lo representa, de modo general, los medicamentos
de carcter cido, de los cuales un caso singular es la aspirina. El recubrimiento de estos
medicamentos con un material no soluble al pH gstrico ha permitido reducir sensiblemente
la irritacin gstrica causada por los mismos.
Enmascaramiento del olor y del sabor del medicamento: Es importante para mejorar la
aceptacin por parte del paciente y se utiliza en medicamentos con caractersticas organolpticas
indeseables. Este recubrimiento se puede llevar a cabo para formas farmacuticas slidas como
son los comprimidos, sin embargo, en el caso de formulaciones peditricas, es ms deseable
disponer de formas lquidas constituidas por una suspensin de microparticulas, para lo cual se
ha de recurrir a la microencapsulacin.
Conseguir una liberacin sostenida o controlada del principio activo a partir de la forma
farmacutica: Con esto se logra un suministro gradual y sostenido del principio activo durante
el tiempo de duracin del tratamiento, logrndose mejor efectividad y asimilacin del mismo.
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Los materiales polimricos permiten liberar de forma controlada frmacos de bajo peso
molecular y permiten una gran variedad de rutas de administracin (oral, parenteral,
transdermal, nasal, ocular, etc.). En casos en los que la actividad de los frmacos convencionales
se pierde o se ve disminuida en el medio corporal, la combinacin con macromolculas puede
mejorar la eficacia de estos frmacos, aliviando la respuesta inmunolgica del paciente y
reduciendo la inactivacin biolgica del agente teraputico (Nakamura, 2004).
Se puede entonces resumir las categoras de los sistemas de suministro mediante liberacin no
inmediata de la siguiente forma:
1. LIBERACIN RETARDADA: Utilizan emisiones intermitentes y repetidas de la droga
a partir de una o ms unidades de liberacin inmediata incorporadas en una sola forma
posolgica.
2. LIBERACIN SOSTENIDA: Comprende todo sistema de suministro de drogas que
produzca su liberacin lenta por un perodo prolongado.
a) Liberacin controlada: Se mantiene un nivel constante de la droga en la sangre o en los
tejidos de destino.
b) liberacin prolongada: Prolonga la duracin de la accin en comparacin con el
suministro convencional.
3. LIBERACIN ESPECFICA EN UN SITIO
4.LIBERACIN EN EL RECEPTOR
Ventajas de los sistemas de liberacin no inmediata (Kumaresh, 2001):
Se evitan problemas por incumplimientos de los pacientes.
Se utiliza menos cantidad total de principio activo.
Reduccin o eliminacin de los efectos colaterales sistmicos.
Se obtiene menos potenciacin o reduccin de la actividad del principio activo durante el
uso prolongado.
Se reduce a un mnimo la acumulacin del principio activo en los tratamientos prolongados.
Se mejora la eficiencia del tratamiento, al evitarse la fluctuacin de los niveles sanguneos
del principio activo y su biodisponibilidad.
Economa.
Desventajas de los sistemas de liberacin no inmediata:
Si se presentan reacciones adversas stas duran ms tiempo que si se compara con los
medicamentos convencionales.
Requieren de un mayor costo de elaboracin, incluyendo, en ocasiones, equipos y procesos
costosos.
No todos los p.a pueden ser empleados en estos sistemas (t1/2 elevados, dosis muy elevadas).
Diseo con parmetros farmacocinticos medios poblacionales.
Peligro de liberacin brusca de todo el contenido.
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Requerimientos para garantizar la obtencin de formulaciones de liberacin modificada

(Majeti, 2000):
Los medicamentos cuyas dosis teraputicas sean muy altas traeran dificultades tcnicas a la
hora de la elaboracin.
Los frmacos que presenten tiempos de vida media muy prolongados (>12 horas) o muy
pequeos (<1 hora), no son apropiados para su inclusin en este tipo de preparado.
Es un riesgo la administracin de frmacos de bajo ndice teraputico a partir de esta forma
farmacutica, por ejemplo, anticoagulantes, ya que al liberarse ms rpido de lo esperado
puede ser peligroso para el paciente.
Los frmacos pueden administrarse por varias vas. Se pueden ingerir (va oral) o inyectar en una
vena (va intravenosa), en un msculo (va intramuscular) o debajo de la piel (va subcutnea).
Se pueden colocar debajo de la lengua (va sublingual), introducir en el recto (va rectal), instilar
en el ojo (va ocular), vaporizar en las fosas nasales (va nasal) o en la boca (inhalacin), o
bien aplicar sobre la piel con efecto local (tpico) o sistmico (transdrmico). Estas vas de
administracin tienen objetivos especficos, as como ventajas y desventajas (Deasey, 1996).
Administracin
Los frmacos administrados por va oral se absorben en el tracto gastrointestinal. La absorcin
comienza en la boca y el estmago pero se efecta principalmente en el intestino delgado
(Bakan,1973). Para llegar a la circulacin general, el frmaco debe primero atravesar la pared
intestinal y luego el hgado. La pared intestinal y el hgado alteran qumicamente (metabolizan)
muchos frmacos, disminuyendo la cantidad absorbida.
Algunos frmacos administrados por va oral irritan el tracto gastrointestinal y pueden daar
el revestimiento del estmago y del intestino delgado, favoreciendo as el desarrollo de lceras,
como, por ejemplo, la aspirina y muchos otros antinflamatorios no esteroideos. La absorcin de
ciertos frmacos en el tracto gastrointestinal puede ser limitada o irregular, o pueden destruirse
en el estmago por el medio cido y las enzimas digestivas. A pesar de estas limitaciones, la va
oral se usa ms que las otras vas de administracin de frmacos. Las dems vas se reservan
generalmente para los casos en que un individuo no pueda ingerir nada por va oral o cuando
un frmaco tiene que ser administrado con rapidez, a dosis muy precisa, o cuando se trata de
un frmaco cuya absorcin es limitada e irregular.
Absorcin
La biodisponibilidad de un frmaco est relacionada con la proporcin y el grado de absorcin
de este en la sangre. La biodisponibilidad depende de varios factores que incluyen el modo
en que se disea y produce un frmaco, sus propiedades fsicas y qumicas y la fisiologa de la
persona que toma el frmaco (Reynoso, 1997)
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ABSORCION DE UN FARMACO
1. Paso al tubo digestivo por el esfago.
2. Disolucin del medicamento en pequeas partculas.
3. Absorcin, que puede tener lugar a nivel del estmago, pero que se lleva a cabo
principalmente en el intestino.
Figura 2. Pasos de Absorcin del

frmaco.
Figura 3. Principales Tejidos que interviene en la Absorcin del frmaco.
Una vez absorbido a nivel de la circulacin sangunea el frmaco circula a travs del cuerpo, y
penetra en los diferentes tejidos. El metabolismo de los frmacos se lleva a cabo principalmente
en el hgado.
Si un comprimido se disuelve y libera el principio activo demasiado rpido se obtendrn unos
valores en sangre que provocarn una respuesta excesiva. Por otra parte, si el comprimido no
se disuelve y no libera el principio activo con suficiente rapidez, gran parte del mismo pasar
a las heces sin ser absorbido. Por lo tanto, los alimentos, otros frmacos y las enfermedades
gastrointestinales pueden influir en la biodisponibilidad de un frmaco.
Es conveniente que la biodisponibilidad sea una propiedad constante entre productos
farmacuticos. Los que son qumicamente equivalentes contienen el mismo frmaco activo
pero pueden tener componentes inactivos diferentes que afecten a la proporcin y al grado de
absorcin.
A pesar de ser administrado a una misma dosis, los efectos del frmaco podran variar de
un producto farmacutico a otro. Los productos farmacuticos son bioequivalentes cuando
contienen el mismo principio activo y cuando se obtienen los mismos valores del frmaco en
la sangre.
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La bioequivalencia asegura as la equivalencia teraputica y los productos bioequivalentes son

intercambiables (Madan, 1981).
Algunos productos farmacuticos estn especialmente formulados para liberar sus principios
activos lentamente, en general al cabo de 12 horas o ms. Estas formas de liberacin controlada
retrasan la proporcin en que se disuelve un frmaco. Por ejemplo, pueden revestirse las
partculas del frmaco contenidas en una cpsula con un polmero (una sustancia qumica) de
grosor variable. El diseo de este polmero permite su disolucin en el tracto gastrointestinal
en distintos momentos.
El material de proteccin (entrico) que reviste algunos comprimidos y cpsulas est destinado
a prevenir los daos que puedan causar las sustancias irritantes (como la aspirina) en el
revestimiento del estmago; tambin evita que las sustancias se descompongan en el medio
cido del estmago. La disolucin de este material empieza cuando entra en contacto con
un medio menos cido o con las enzimas digestivas del intestino delgado. Dado que este
revestimiento protector no siempre se disuelve, son muchas las personas (especialmente las de
edad avanzada) que eliminan en las heces los productos farmacuticos todava intactos.
Distribucin
El frmaco circula rpidamente por todo el organismo una vez absorbido en la sangre, debido
a que el tiempo promedio de la circulacin de la sangre es de un minuto. Sin embargo, es
posible que el frmaco se mueva con lentitud desde la sangre hasta los tejidos del organismo
(Kibbe, 2000).
La distribucin de los frmacos despus de su absorcin no es uniforme en todo el organismo.
Algunos tienden a permanecer dentro de los tejidos acuosos de la sangre y de los msculos,
mientras que otros se concentran en tejidos especficos como la glndula tiroides, el hgado
y los riones. Otros se adhieren estrechamente a las protenas de la sangre, abandonando la
circulacin sangunea de forma lenta, en contraste con los que la abandonan rpidamente
dirigindose a otros tejidos. Algunos tejidos acumulan tan elevadas cantidades de un frmaco
que sirven como reserva de ste, prolongando as su distribucin. Por otros lados algunos
frmacos como los que se acumulan en los tejidos grasos, abandonan stos con lentitud y,
en consecuencia, siguen circulando en la sangre varios das despus de que el paciente haya
dejado de tomarlos.
Eliminacin
Los frmacos son metabolizados o bien eliminados intactos. El metabolismo es el proceso qumico
por medio del cual el organismo altera un frmaco. El hgado es el principal, pero no el nico
lugar del organismo donde se metabolizan los frmacos. Los productos del metabolismo, los
metabolitos, pueden ser inactivos o bien, por el contrario, pueden tener una accin teraputica
o una toxicidad similar o distinta a la del frmaco original. Los denominados profrmacos son
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los frmacos que se administran en forma inactiva. Los metabolitos de estos profr-macos son
activos y cumplen con el efecto deseado. Luego se eliminan (principalmente en la orina o las
heces) o bien son convertidos en otros metabolitos que finalmente son excretados.
Los frmacos se excretan principalmente por la orina. El hgado tambin excreta algunos
frmacos a travs de la bilis, conducida por el conducto coldoco hacia el intestino, para ser
eliminada finalmente con las materias fecales.
Figura 5. Eliminacin del Frmaco como materias fecales.
Figura 4. Eliminacin del frmarco por la orina.
Los riones filtran los frmacos de la sangre y los excretan en la orina, pero existen muchos
factores que afectan a la capacidad de excrecin de los riones. Un frmaco o un metabolito
debe ser soluble en agua y no estar demasiado unido a las protenas del plasma. La acidez
de la orina afecta la proporcin en que se excretan algunos frmacos cidos o alcalinos. La
capacidad de los riones para excretar frmacos depende tambin del flujo de orina, del flujo
de sangre a travs de los riones y del estado de stos.
A travs de la bilis, el hgado excreta algunos frmacos que a su vez penetran en el tracto
gastrointestinal y terminan en las heces, en caso de no ser reabsorbidos en la sangre ni
descompuestos. Pequeas cantidades de algunos frmacos tambin se eliminan en la saliva, el
sudor, la leche materna y el aire espirado.
Principales mtodos empleados en la obtencin de medicamentos de liberacin
controlada.
1-Sistema de reservorio.
Fundamento: En este tipo de sistema el frmaco se encuentra depositado dentro de un
reservorio formado por un polmero insoluble de membrana (poroso o no), el cual controla la
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porcin liberada debido a su permeabilidad especfica. El principio activo puede existir dentro
del reservorio en forma slida, suspensin o solucin (Aso,1994).

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2-Sistema Osmtico
Fundamento: Estos son sistemas fabricados por encapsulacin de un frmaco activo
osmticamente (o la combinacin de un frmaco inactivo con una sal activa) dentro de una
membrana semipermeable hecha de un polmero biocompatible como por ejemplo acetato de
celulosa.
La liberacin controlada del soluto se produce a travs de un orificio de entrega, de dimetro
especfico (0.2-0.4mm), realizado sobre la membrana de cubierta mediante rayo lser (Vila, 1997).
3-Sistemas matriciales
En estos sistemas el reservorio del frmaco est preparado por una dispersin homognea de
partculas de la droga en una matriz polimrica que controla la porcin liberada, la cual est
elaborada con polmeros lipoflicos, hidroflicos o plsticos (Singh, 1998).
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Matrices lipdicas
Fundamento: Estos sistemas se preparan incorporando el principio activo en el material
lipdico no absorbible, pero capaz de disolverse lentamente o ceder el frmaco por lixiviacin
en este sitio.
Ejemplos de polmeros lipdicos: cera de carnauba, cera de castor, alcohol estearlico, cido esterico,
alcohol cetlico, monoestearato de polietilenglicol y triglicridos entre otros (Chiang, 2003).
Matrices Hidroflicas
Fundamento: Este mtodo, se basa en la utilizacin de un polmero hinchable capaz de formar
un hidrogel (Aulton, 2002).
Matrices Hidrfilas
Con elevada proporcin de sustancias hidrfilas gelificables: ejemplo, carbopol, teres
de celulosa
Secuencia
Frmaco superficial se cede con rapidez
Formacin de una capa de gel alrededor del comprimido
Difusin del frmaco en la capa del gel
Disolucin progresiva del gel y gelificacin de nuevas capas
Sustancias solubles: incrementan velocidad de cesin (por formar canalculos (lactosa,
manitol)
Sustancias insolubles: disminuyen la velocidad de cesin por dar mayor consistencia al
comprimido (fosfato clcico, silicatos)
Variantes :
A. Flotantes: de densidad inferior a ( < jugo gstrico .004-1.014)
Para ajustar la densidad: adicin de sustancias hidrfobas de densidad inferior, ejemplo:
alcohol cetlico mirstico, esterico, mono y diestearato de glicerilo, aceites hidrogenados.
La flotabilidad es el resultado del aumento del volumen por hidratacin del polmero y
por la porosidad del comprimido no hidratado (que depende en parte de la fuerza de
compresin)
B. Multicapa
Capas de carboximetilcelulosa con el frmaco + capas de carboximetilcelulosa reticulada
(es insoluble). En el tracto gastrointestinal las capas reticuladas gelifican y se hinchan
formando una membrana coloidal que regula la cesin del principio activo
C. Bioadhesivos:
Polmeros bioadhesivos
Molcula flexible
Con numerosos grupos hidroflicos
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Se esponjan en medio lquido

Las cadenas de polmero difunden a travs de las molculas de mucina y forman puentes
de hidrgeno: biomucoadhesin
Ejemplos: carboximetilcelulosa, carbono, alginato sdico, hidroxipropilmetilcelulosa
Resumen del comportamiento de matrices hidroflicas.
(Shozo, 1999)
Matrices inertes
Fundamento: Este tipo de sistema est constituido por algn tipo de polmero inerte que es
mezclado ntimamente con el principio activo, no interactuando con los fluidos biolgicos.
Las formas farmacuticas ms empleadas son las slidas y especficamente las tabletas. En el
comprimido, adems del polmero plstico y los principios activos, se utilizan coadyuvantes
especiales denominados acanalantes o canalizadores, que son sustancias muy solubles en agua
que al disolverse, aumentan la porosidad de la matriz permitiendo que el lquido penetre y
promueva la salida del frmaco desde el interior de la misma (Katstra, 2000).
Algunos de los productos utilizados para la fabricacin de matrices inertes son: polietileno,
etilcelulosa, cloruro de polivinilo, siliconas, copolmeros acrlicos, poliamida, copolmeros de
acetato y de cloruro de vinilo, entre otros. (Ngo, 1997)
Sistemas o Dispositivos Teraputicos.
Son dispositivos que ceden el principio activo de modo continuo en una cantidad fija
predeterminada (orden cero) durante un periodo de tiempo fijo.

Reservorio de frmaco + coadyuvantes

Elemento de control
Fuente de energa
Superficie o abertura de salida
Se estudiarn atendiendo a la va de administracin y al tipo de accin (local o sistmica).

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Accin Sistmica Oral

Transdrmica
Subcutnea
Accin Local
Ocular
Uterina
Sistemas Transdrmicos
Propiedades fisicoqumicas del frmaco: Peso molecular, Coeficiente difusin, Lipofilia.
No ser irritantes ni alergizantes.
Frmacos activos a bajas concentraciones
Clasificacin: segn el sistema de control de la liberacin
Los dispositivos transdrmicos son semejantes a un apsito que se adhiere sobre la
piel y proporcionan (a partir de un reservorio por diversos mecanismos de control),
cantidades determinadas de frmaco por unidad de tiempo, que penetran por difusin a travs
de la piel y pasan a la circulacin general.
Uso Ocular
Ocusert: sistema de liberacin controlada por membrana (copolmero de etileno y acetato de
polivinilo)
Uso Uterino
Dispositivos intrauterinos que llevan el frmaco incorporado en un reservorio y recubiertos por
una membrana de control (EVAc). Ejemplo: ProgestasertR (65 microgramos/da progesterona)
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Fronteras de la Ciencia y Universidad Moderna

La universidad debe impartir el conocimiento al nivel ms avanzado posible: R.P. Atcon
La ciencia en sus lmites extremos representa un logro del pensamiento humano; la
Universidad por otra parte es el medio donde se llevan a cabo, entre otros sitios, los programas
de investigacin, algunos de los cuales estn en el borde o en la interseccin entre el quehacer
cientfico y el acadmico-docente propio de la funcin sustantiva de la universidad.
Un nuevo elemento hace esta relacin ciencia universidad ms compleja: los sistemas de
informacin actuales que junto con los avances de los instrumentos va dirigiendo la investigacin
cientfica y tecnolgica por derroteros de competencia sin parangn, ni referente histrico
comparable como se puede ver en el cuadro, el crecimiento de la informacin en cualquier

rubro de la ciencia es astronmico
y mantenerse en la lnea de competencia es buena parte de
la labor de los cientficos; hay adems historia, la ciencia se desarrolla desde caminos variados
y distintos unos de otros; esto significa que el grado de avance de la ciencia por s misma y en
los centros educativos depende en alto grado de las condiciones sociales en que el complejo
ciencia-universidad se desarrolle; condicin de subdesarrollo es necesariamente subdesarrollo
de la ciencia; en estos casos la actividad cientfica llega a tener
tintes de herosmo.
Genoma
1,030,000
Es importante ubicar la actividad cientfica en el contexto real social
o se corre el riesgo de tener un grupo seleccionado que produce una
ciencia vlida pero carente de significado en el contexto propio.
Genoma
16,700,000
Ecologa
10,600,000
Cuando se quiere impulsar la ciencia, se encuentra que no hay

polticas pblicas o bien stas no son las adecuadas para renovar
e impulsar proyectos cientficos; entonces, la actividad cientfica
carece de base social y no tiene peso ni reconocimiento.
Ecology
38,500,000
Bioqumica
1,220,000
Las carreras cientficas son desconocidas por la inmensa mayora

de los estudiantes; slo despus de la enseanza media superior se
orientan algunas vocaciones hacia la ciencia y ocurre en el sistema
educativo estatal y con menos frecuencia en los sistemas privados.
Taxonoma
361,000
Taxonomy
13,900,000
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Biochemistry 19,900,000
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El auge de la Biotecnologa, de los avances en los sistemas de diagnstico mdicos, de los

sistemas de comunicacin est reorientando hacia las ciencias bsicas y sus derivados a un
buen nmero de alumnos que ven en la ciencia una posibilidad real de realizacin, al no ser
ms una labor ajena al discurso social; la ciencia es ahora atractiva sin que ello no implique una
entrega y lucha por recursos y comprensin de sus significados.
Es clara la relacin entre ciencia, tecnologa y progreso, los ejemplos son variados pero por
brevedad y sentido de este trabajo se limitarn a tres que llaman la atencin: E.U.A., Kenia y
Japn. En el primer caso, en el ao de 1996 se definieron por la Academia de Ciencias de los
E.U.A. los estndares de la educacin para la ciencia, fijando los estndares para los diferentes
niveles de educacin de los contenidos mnimos para los profesores y para los alumnos, lo
que signific al mismo tiempo de un impulso a programas que privilegiaron en la ciencia una
homogeneidad de contenidos y prcticas; se especificaron no slo lo ya mencionado sino se
dio preferencia a las actitudes y se impuls de manera determinante la carrera docente de las
ciencias, con lo cual los profesores lograron especializarse en enseanza de la ciencia y en la
investigacin docente sobre la efectividad de los programas que pasan a ser nacionales. Los
estndares son parte de una poltica pblica nacional y los efectos se notan a corto y mediano
plazo; es evidente la influencia que el sistema social tiene a travs de sus representantes y como
se refleja esto en presupuestos y empleos pblicos y privados relacionados con la actividad
cientfica y tecnolgica; los estndares no slo comprenden la actividad cientfica en s, sino la
historia y sociologa de la ciencia: por ello la generacin de personas dedicadas a la ciencia no es
un hecho fuera del contexto acadmico sino que impacta en otras reas del conocimiento, con
lo cual se logra una cohesin que no descuida el entorno escolar ni el social; este movimiento
va relacionado con la produccin de manuales y textos especializados en los variados aspectos
de estos programas. El resultado pleno se ver en unos aos en el aumento de las personas
dedicadas a la actividad cientfica y se podr medir en el aumento de la productividad cientfica
y tecnolgica.
En otra escala pero siguiendo la lnea de pases ms avanzados est el caso de Kenia. Las
polticas gubernamentales han privilegiado la ciencia en dos sentidos: uno como formador
de personal de alto nivel y competitividad y el otro dirigido hacia una apropiacin de teoras
universales en el contexto de su realidad; desde la enseanza pre-primaria se inician conceptos
generales y ms bien difusos sobre algunas nociones cientficas, en este nivel el papel del
maestro es determinante y claro, si no formalmente, al menos en las prcticas escolares se
impulsan actividades de interrogacin que conducen a ideas precientficas.
En la escuela primaria, los conceptos del nivel anterior se exploran de manera menos informal,
son al menos 12 unidades por ao en los tres primeros aos de la primaria, en los siguientes
tres aos son 7 unidades por ao, en este nivel, son menos pero son ms profundas tanto en
nfasis como en profundidad.
En la educacin secundaria, es intensiva y se cursan cuatro aos de Biologa, Qumica y Fsica,
lo que representa casi dos tercios de la educacin secundaria.
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Siguiendo esa lnea en la universidad, la ciencia se divide en disciplinas de la manera siguiente: 4

aos de Bioqumica, Qumica, Geologa, Fsica y Zoologa, cada disciplina puede ser estudiada
sola o en combinacin con otras, para obtener un diploma de bachiller en cualquiera de las
ciencias mencionadas.
En los niveles de maestra y doctorado cada una de las ciencias se subdivide en especialidades
como, biologa molecular, gentica, endocrinologa, etc. Hay que hacer notar, revisando
cuidadosamente sus planes y programas de estudio, que no se quedan solamente en descripciones
de materias sino que se dirigen a los fundamentos experimentales ms que a los descriptivos.
En el caso de Japn es evidente la relacin entre ciencia y sistema educativo. El avance indiscutible
se proyecta en ciencia y tecnologa de primer nivel: un ejemplo de ello es la Universidad de
Tsukuba, donde en sus institutos se investigan desde problemas educativos hasta problemas
de plasmas, pasando por nanotecnologa, cultivo de tejidos vegetales y animales, ecosistemas
martimos y terrestres, etc. No es la nica institucin que lleva a cabo esto, pero es notorio
por la gran concentracin de cientficos y tecnlogos concentrados ah. El nivel cientfico y
tecnolgico japons se debe entre otras cosas a un sistema social que respeta, promueve y
privilegia la actividad cientfica. Esta Universidad es nica en muchos aspectos: a diferencia
de otras, la educacin general no graduada est organizada de acuerdo a grupos de colegios
que proveen un apoyo muy variado de actividades extracurriculares para estudiantes dentro y
fuera del campus universitario; esto incluye actividades cientficas como parte fundamental del
conglomerado de actividades formativas ligadas a la investigacin cientfica; sta tiene entonces
una gran prioridad y una difusin que rompe con las lneas tradicionales tanto de divulgacin
como de iniciacin en las ciencias cubriendo un amplio espectro de campos acadmicos, en
los cuales se realiza investigacin y docencia de alta calidad; la actividad docente est ligada
de manera determinante con las instituciones de investigacin localizadas en la Ciudad de la
Investigacin de Tsukuba. En cada estamento de la Universidad de Tsukuba se encuentran los
planes y programas de estudio con laboratorios dentro y fuera de la universidad con el personal
y el equipamiento tcnico idneo para la docencia e investigacin de alto desempeo; de esta
forma recluta a los alumnos con vocacin, excelencia y talento y sobre todo inters en un campo
de la ciencia y la tecnologa. Por ejemplo, el Colegio de Ciencias de la Ingeniera, con nfasis en
la Ingeniera Molecular y de Materiales donde cubren temas como los polmeros dielctricos,
nuevos materiales como los orgnicos magnticos, el desarrollo de catalizadores para convertir
bixido de carbono en metanol, desarrollo de nuevas cermicas para la superconductividad de
alta temperatura, etc.
Para esto, cuenta con el apoyo de al menos trece laboratorios de alto nivel que apoyan la labor
de los docentes y proveen de tcnicas y materiales de punta a los alumnos teniendo como
consecuencia un nivel de competitividad muy alto.
Por qu hacer estas descripciones y como se asocian a nuestra situacin? En primer lugar
porque el curso nos ha orientado y demostrado el nivel que tenemos en este momento y tambin
la forma de superar el nivel y arribar a un estrato verdaderamente universitario; en segundo
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lugar para hacer una historia que refleje el camino seguido por la ciencia en la UAM-X y lo que
se espera ocurra en los prximos aos; por ello se har a continuacin una resea del camino
seguido al menos en E.U.A., donde nuestra dependencia de todos tipos es mayor, incluyendo
por supuesto la cientfica. Editado por P. Handler, se public en 1970 una obra denominada
BIOLOGY AN THE FUTURE OF MAN en ella la Academia de Ciencias de los Estados Unidos
de Amrica fijaba con precisin las lneas de accin y los campos prioritarios de la ciencia para
ese momento; en esa poca tena importancia primordial la Biologa Molecular, sobre todo en
los aspectos de funcin de ADN/ARN, informacin gentica, naturaleza de ella, duplicacin,
etc. Al mismo tiempo se fijaron las metas a corto y largo plazo, entre las primeras estaban las
de comprender a fondo los mecanismos y procesos de funcin de los genes, como operan con
precisin cuando se habla de enzimas y como es la programacin de las funciones celulares
desde el ADN.
En las lneas de accin de largo plazo estaban entre otras las de la comprensin del papel del
ADN y la sntesis de protenas en el desarrollo de organismos multicelulares. Bajo esta premisa de
anlisis se establece primero el campo de la ciencia sobre el cual se va a dar un mayor desarrollo
y enseguida se establecen las metas a lograrse en un plazo determinado; de esta manera se
expusieron los temas siguientes: materiales de la vida y sus transformaciones (protenas, grasas,
carbohidratos), la clula como estructura fundamental de la vida comprendiendo todos los
aspectos de una biologa celular incluyendo problemas de accin de los virus y la relacin con
el cncer.
Los orgenes de la vida, la biologa del desarrollo, las funciones de tejidos y rganos, el sistema
nervioso, la biologa del comportamiento, la ecologa, la herencia y la evolucin, la diversidad
de la vida, la computadoras digitales y las ciencias de la vida, la alimentacin humana, la
ciencia y la prctica mdica, los recursos naturales, la biologa y el desarrollo tecnolgico, la
salud ambiental y por ltimo la biologa y el futuro del hombre, ntese que en este tiempo no
se mencionan de manera directa la nanotecnologa, las clulas troncales, o genoma.
En el ao de 1989, se public la obra Opportunities in Biology por el National Research Council,
Comisin sobre las Ciencias de la Vida, en cuyo prefacio se aclara la diferencia con la obra
anterior, debida al enorme avance que mediaba entre las dos publicaciones y al problema toral
de la cantidad de informacin generada en esos aos; la diferencia esencial es el nfasis. En
este caso se destaca de manera clara el valor de las nuevas tecnologas e instrumentaciones; sin
embargo, se vuelve a tocar el punto de la estructura y funcin molecular, en especial las nuevas
tcnicas e instrumentaciones, en particular, la relacin entre la estructura y funcin molecular
y la computacin, que en la actualidad permite dilucidar una buena parte de los genomas de
los seres vivos incluyendo por supuesto el genoma humano. Al igual que en la obra anterior no
aparecen como prioritarios algunos de los temas de gran relevancia en la actualidad.
La Ciencia en la Frontera (Greenwood 1992,) producto de la Academia Nacional de Ciencias,
ampla el campo de accin de las ciencias a campos no tratados en los otros reportes o tratados
en obras distintas, como son los sistemas dinmicos, la geologa, la astrofsica, las imgenes
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por resonancia magntica, la regulacin gentica, y las redes neuronales entre otras. De 10
captulos, slo 4 estn dedicados especficamente a biologa o a medicina, para este tiempo, se
han dedicado ya volmenes especiales para cada captulo de las ciencias actuales.
Esta revisin conduce a una pregunta: Qu debemos ensear? Aunque tambin Qu
podemos ensear? La informacin crece por horas y no es posible tener un panorama completo
excepto de algunas reas reducidas y muy especializadas; adems, hay que considerar el nivel
de desinformacin de los alumnos: en ellos la idea de ciencia es algo deformado por los cursos
de enseanza media, los cuales no reflejan desde ningn punto de vista el avance y nivel de las
ciencias actuales; por ello, el esfuerzo de llevar los temas avanzados de este curso representan
un reto a enfrentar. Al no ser posible cubrir la totalidad de los contenidos revisados, se puede
hacer una serie de propuestas sobre los temas y las carreras donde pueden tener mayor
trascendencia; esto constituye la segunda parte del ensayo, revisando de forma parcial a que
corresponderan del conocimiento actual en el mundo, como es comprensible, pueden variar
los criterios por lo que estn sujetos a discusin todo el tiempo.
Para Marshall (2000), el campo y la velocidad a la que se expande la investigacin biotecnolgica,
hace difcil definir las reas de accin, ya que estn cambiando a la misma velocidad de la
investigacin, ligado a la alta plusvala de la informacin para aplicaciones industriales, hace
de la biotecnologa una de las inversiones ms rentables y susceptibles de ser incorporadas a
los curricula de las carreras.
Las clulas troncales, (Bajaj,2002), como resultado de una conferencia internacional sobre lneas
emergentes en biotecnologa, considera a las clulas troncales como una de las investigaciones
ms prometedoras y apasionantes, como los elementos potenciales de tratamiento de
enfermedades como Parkinson, Alzheimer, diabetes, desrdenes cardiacos entre otras. En este
caso, la incorporacin a las carreras de la Salud dara una visin diferente y ms avanzada.
Es importante destacar como una gran posibilidad y avance, el trabajo con el ADN,
desde el desciframiento del genoma humano hasta la estructura y funciones de las
histonas y nucleosomas, relacionadas con la regulacin epigentica de la expresin
gnica. (Recillas, 2007).
En donde hay un gran campo de expansin en este momento, es en la nanotecnologa, es
tambin recomendable incorporarlo en los programas de estudio considerando que hay
personal acadmico de la UAM-X, experto en el tema; el por qu es obvio pero es importante
destacar algunos aspectos centrales; para Foladori e Invernizzi (2006), representa la revolucin
tecnolgica a imponerse en uno o en cuatro decenios, los autores examinan las posibles
consecuencias en varios niveles, desde lo que puede significar no desarrollarla o hacerlo
tardamente hasta sus efectos en la salud o en la economa; la forma en que la nanotecnologa
influir en la vida futura no es previsible en su totalidad; segn estos autores, la novedad se da al
menos en cuatro aspectos: En primer lugar es construir de lo ms pequeo(tomos y molculas)
a lo ms grande.
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En segundo lugar, en ese nivel no hay diferencia entre el nivel bitico y abitico, de tal manera
que es posible, aplicar procedimientos biolgicos a los procesos materiales, o interferir con
materiales en los cuerpos vivos.
En tercer lugar, cualquiera de los elementos qumicos manipulados a nivel nano, despliega
propiedades fsicas diferentes a las de una escala mayor.
En cuarto lugar, la nanotecnologa combina varias tecnologas y ciencias, como la informtica,
biotecnologa y tecnologa de materiales.
Para Moghimi y colaboradores (2005), la nanotecnologa presenta la gran oportunidad, a travs
de la nanomedicina, de contribuir a comprender algunas de las enfermedades de etiologa
ms compleja, as como, a resolver algunas de ellas. Estos autores consideran tambin que la
investigacin en la direccin hacia blancos precisos, con agentes de diagnstico, farmacuticos
y teraputicos son los temas que marchan a la vanguardia de la investigacin en nanomedicina.
Estas cuestiones involucran la identificacin de blancos precisos, como clulas, y seleccionar los
nanomedios precisos para tener reacciones colaterales menos dainas; los blancos pueden ser,
fagocitos mononucleares, dendritas, tumores cancerosos, etc.
En este tiempo, la nanotecnologa particularmente en sus aplicaciones mdicas, representa un
nicho muy promisorio para el desarrollo mdico industrial.
Minakshi (2005), afirma que en los ltimos aos ha ocurrido una revolucin cientfica
en la Biologa; considera que las tcnicas se han desarrollado para producir molculas
medicinalmente valiosas, que podran cambiar los rasgos hereditarios de plantas y animales,
diagnosticar enfermedades y curarlas a travs de protenas y polipptidos formando un nuevo
grupo de drogas potentes o bien de vacunas inmunodiagnosticadas; de esas y otras maneras la
Biotecnologa est teniendo un gran impacto en la salud, alimentacin, agricultura e incluso
en la proteccin ambiental.
Finalmente, el nmero de Scientific American edicin especial de Nanotecnologa (2007), dedica
dos artculos a la nanotecnologa, el primero de N.C. Seeman se dirige hacia el uso del ADN no
slo en sus caractersticas bioqumicas, sino como los bloques para hacer otras combinaciones;
menciona que otros investigadores demostraron como el ADN puede ser utilizado como
dispositivo computacional. En su artculo, el autor expone otros usos no biolgicos del ADN, la
construccin de dispositivos y estructuras cuyos mecanismos y elementos esenciales van de 1 a
100 nanmetros, esto es en una palabra nanotecnologa.
Agrega el uso potencial de estos arreglos, como enrejados de ADN que podran contener
copias de grandes molculas biolgicas en arreglo ordenado para cristalografa de rayos-X y
con ello determinar su estructura, para a su vez hacer un diseo ms racional de frmacos.
En el mismo nmero de la revista, Shapiro y Benenson, desarrollan la idea de una mquina
de Turing (en 1936, pens en una mquina computadora programable) con una maquinaria
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biolgica, en este caso el ribosoma, considerando la forma en que el ribosoma junto con ARN
mensajero, traduce con precisin las ordenes del ADN, as, las mquinas moleculares naturales,
procesaran la informacin en el sentido en que Turing pens la mquina programable, quien
guarda la informacin (ADN) y quien la interpreta y traduce (ARN) en forma de protenas
(enzimas), pueden ser programables para protenas ms especficas con lo que se lograran
frmacos de gran precisin y tal vez individualizados por enfermedad y persona.
Durante el curso hemos constatado al menos dos cosas: la primera es que en Mxico, a pesar
del personal cientfico y acadmico con el que se cuenta, los presupuestos y las facilidades son
escasos, por lo que tratar de incorporar la informacin al campo de estudios profesionales o
de posgrado resulta casi imposible; la segunda tiene que ver con algunos elementos que se
dan hacia el interior de la institucin: la dificultad de cambiar los planes y programas y la
velocidad a la que sera necesario hacerlo, para al menos saber de manera razonable cual es
la ubicacin de los planes y programas; en el fondo debatimos otros aspectos de la educacin.
La ciencia carece de un valor social, no hay polticas pblicas claras de apoyo y desarrollo, se
piensa que las prioridades son otras y se relega a un plano inferior la actividad cientfica; al no
haber un reconocimiento y validacin social, no hay tampoco una historia acadmica en los
estratos anteriores que apoyen la ciencia. Por esta razn las carreras de disciplinas cientficas se
encuentran en una crisis de alumnado.
Para terminar es necesario hacer propuestas, adems de expresar las ideas. Para esto y con
base en el curso y la literatura, comparndolas con los planes actuales en la D.C.B.S. de la
U.A.M.-X., se sugieren los temas que deberan formar parte de los diversos curricula y en los que
actualmente, aun teniendo a los profesores-investigadores, no estn incorporados de manera
expresa; en el cuadro siguiente se plantean los contenidos que podran ser incorporados y en
las carreras en las que al menos en una primera etapa actualizaran los planes y programas de
estudio. Los criterios de inicio seran entre otros, el estado actual de las carreras y los indicadores
los planes y programas, las facilidades, tanto para informacin como de laboratorios; con
base en el curso y la separacin que se hizo en el programa, habra un nfasis variable segn
la carrera, habra que agregar el tiempo en el que se llevara a cabo y como se creara y
conservara un sistema de informacin permanente y de actualizacin docente para mantener
un nivel aceptable de comunicacin.
A
Temas
Microbiologa
Procesos
Gentica
Carreras
y Ecologa
Celulares
Genmica
Biomedicina
Nutricin
Fundamentales
Biologa
xxx
xxx
xxxx
xx
xx
Medicina
xxx
xxx
xxxxx
xxxx
xxx
M.V.Z.
xxxx
xxxx
xxxxx
xx
xxx
Q.F.B.
xxxx
xxxxx
xxxxx
xxxx
xxxx

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Las X, representan el nfasis de cada una de las divisiones y el impacto que tendran en las
carreras de una, el menor a cinco el mayor.
La propuesta es, finalmente, incorporar primero en los profesores y luego en los planes y
programas de estudio, en cursos y seminarios permanentes, los contenidos actualizados, segn
carrera y eventualmente posgrados de los avances de las ciencias en especial de las fsicas y
naturales.
Referencias
Bajaj BS. (2002) Emerging trends in biotechnology-stem cells. Current Science, 83: 202-203.
Commission on Life Sciences (1989). Opportunities in Biology. Commision on Life Science,
National Academy Press. Washington, D. C.
Foladori G, Invernizzi N. (2006). La nanotecnologa: una solucin en busca de problemas.
Comercio Exterior 56 No.4: 326-334.
Greenwood A. (1992) Science at the Frontier. National Academy Press. Washington, D. C.
Handler P. (1970). Biology and the Future of Man Edited by Philip Handler. New York. Oxford
University Press.
Marshall A. (2000). Keeping track of the trends. Nature Biotechnology, 18, IT1.
Minaksi D. (2005). Recent trends in biotechnology. Current Science 88: 1030-1031.
Moghimi SM, Hunter AC, Murray C. Nanomedicine: current status and future prospects. The
FASEB Journal 19:311-330.
Recillas F. (2007). Epigentica y Epigenmica. (Conferencia) Curso: Impacto de las Nuevas
tecnologas de la Biologa Molecular. UAM-X. D.C.B.S. Septiembre.
Shapiro E, Benenson Y. (2007) Bringing DNA computers to life. Scientific American 17: 41-47
Seeman NC. (2007). Nanotechnology and the double helix. Scientific American 17: 31-39
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Francisco Fierro Fierro y Marcela Guevara Onofre
INSTITUCIONES PARTICIPANTES
PROCEDENCIA
Centro de Investigacin Sobre Enfermedades Infecciosas
Instituto Mexicano del Seguro Social
Centro Mdico Nacional Siglo XXI. Unidad de Investigacin Mdica en Bioqumica
Instituto Nacional de Neurologa y Neurociruga MVS
Instituto Nacional de Neurologa y Neurociruga MVS
Instituto Nacional de Salud Pblica
Instituto Politcnico Nacional
Estudios de Posgrado e Investigacin
Universidad Autnoma del Estado de Mxico
Facultad de Medicina
Universidad Autnoma Metropolitana Unidad Iztapalapa
Departamento de Biotecnologa
Departamento de Reproduccin Animal.
Universidad Autnoma Metropolitana Unidad Xochimilco
Depto. de Atencin a la Salud
Depto. de Produccin Agrcola y Animal
Depto. de Sistemas Biolgicos.
Universidad de Habana
Centro de Ingeniera e Investigaciones Qumicas C, Habana, Cuba
Universidad Nacional Autnoma de Mxico
Facultad de Ciencias. Depto. de Ecologa y Recursos naturales
Facultad de Qumica. Departamento de Alimentos y Biotecnologa
Instituto de Ecologa
Instituto de Ingeniera
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Impacto de la Biologa Molecular
IMPACTO DE LA BIOLOGA MOLECULAR Y LAS NUEVAS

TECNOLOGAS EN EL CONOCIMIENTO DE LA FUNCIN
CELULAR Y SUS APLICACIONES
PARTICIPANTE
PROCEDENCIA
Adolfo Rosado Garca

Prof. Titular C
Depto. de Reproduccin Animal.
Universidad Autnoma Metropolitana
Miembro del Sistema Nacional de Investigadores.
Alejandro valos Rodrguez

Prof. Titular C
Depto. de Produccin Agrcola y Animal
Universidad Autnoma Metropolitana Unidad
Xochimilco.
Alma Pieyro Nelson

Instituto de Ecologa
Universidad Autnoma Meropolitana.
Ana Ma. Rosales Torres

Prof. Titular C
Depto. Produccin Agrcola y Animal
Xochimilco.
Araceli Tomasini Campocosio

Profesor titular C
Universidad Autnoma Metropolitana-Unidad
Iztapalapa
Araly A Salgado Parra

Facultad de Medicina,
Universidad Autonma del Estado de Mexico
Armando Meja lvarez

Profesor Titular C
Iztapalapa
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PARTICIPANTE
PROCEDENCIA
Avedis Aznavurian Apajian

Prof. Titular C.
Depto. Atencin a la Salud
Xochimilco
Carmen Wacher Rodarte

Dra. Ma. del Carmen Wacher Rodarte

Profesor de Carrera
Departamento de Alimentos y Biotecnologa
Facultad de Qumica, UNAM
SNI Investigador Nacional Nivel II
Clara Ortega Camarillo

Investigador Asociado D
Unidad de Investigacin Mdica en Bioqumica,
Hospital Especialidades,
IMSS Centro Medico Nacional sXXI.
Claudia Lizbeth Martnez

Gonzlez
Estudios de Posgrado e Investigacin

Instituto Politcnico Nacional
Emma Elisa Ortiz Islas

Investigador en Ciencias Mdicas

Instituto Nacional de Neurologa y Neurociruga
MVS
Francisco Fierro Fierro

Profesor Titular C
Departamento de Produccin Agrcola y Animal
Universidad Autnoma Metropolitana- Unidad
Xochimilco
Francisco J. Fernndez

Profesor Titular C
Iztapalapa
Gloria Daz-Ruiz

Tcnico Acadmico, Departamento de Alimentos

y Biotecnologa
Facultad de Qumica, UNAM
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Impacto de la Biologa Molecular
PARTICIPANTE
PROCEDENCIA
Guadalupe Prado Flores

Profesora Titular
Departamento de Produccin Agrcola y Animal
Universidad Autnoma Metropolitana- Unidad
Xochimilco
Jaime A. Bustos Martnez.

Profesor Titular C
Departamento de Atencin a la Salud
Xochimilco
Javier Barrios Gonzlez

Profesor-Investigador Titular C
Iztapalapa
Jess Martnez Barnetche

Jefe del Departamento de Inmunologa

Centro de Investigacin Sobre Enfermedades
Infecciosas
Instituto Nacional de Salud Pblica
Marcela Vergara Onofre

Prof. Titular C
Depto. de Produccin Agrcola y Animal.
Xochimilco
Marcelo Rojas-Oropeza

Profesor de Asignatura A
Depto. de Ecologa y Recursos naturales
Facultad de Ciencias UNAM.
Mara Cristina Gonzlez Torres

Prof. Titular C.
Departamento de Ciencias de la Salud
Iztapalapa
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PARTICIPANTE
PROCEDENCIA
Marisol Lpez Lpez.

Prof. Titular C
Depto. de Sistemas Biolgicos.
Xochimilco
Mayra A. Alvarez Lemus

Investigadora en Ciencias Mdicas b

Instituto Nacional de Neurologa y Neurociruga
MVS
Mayra Gonzlez Hurtado

Investigadora Auxiliar
Centro de Ingeniera e Investigaciones
Qumicas C, Habana, Cuba
Profesora Adjunta, Facultad de Qumica
Universidad de Habana
Nathalie Cabirol

Profesor de Asignatura A
Departamento de Biologa Celular
Facultad de Ciencias, UNAM
Instituto de Ingeniera, UNAM
Miembro del Sistema Nacional de Investigadores
Oralia Njera Medina

Profesor Titular C
Departamento de Atencin a la Salud
Xochimilco
Rebeca Garca Macedo.

Investigador Asociado D
Unidad de Investigacin Mdica en Bioqumica,
Hospital Especialidades,
IMSS Centro Medico Nacional sXXI.
Romn Espinosa Cervantes

Prof. Titular C
Depto. Produccin Agrcola y Animal
Xochimilco
Sonia Recillas Gispert

Instituto de Qumica de la UNAM

Teresa Florencia Lpez-Murillo Prof. Titular A


Xochimilco
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Impacto de la biologa molecular y las nuevas

tecnologas en el conocimiento de la funcin
celular y sus aplicaciones. Editado por la
Divisin de Ciencias Biolgicas y de la Salud
de la Universidad Autnoma Metropolitana,
se termino de imprimir en diciembre de 2011
en los talleres de Impresin Comunicacin
Grfica, S.A. de C.V.
La edicin consta de 500 ejemplares.
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