FACULTAD DE CIENCIAS

DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA Y CIENCIAS AMBIENTALES

LICENCIATURA EN CIENCIAS MENCION BIOLOGIA

ACTIVIDADES PRACTICAS DE MICROBIOLOGIA

Profesor Coordinador: Dra. Marcela Zahr T/ Ayudante: Martín Galaz

GUÍA Nº 3. MORFOLOGÍA DE ORGANISMOS PROCARIONTES:

Observación de microorganismos y sus estructuras

I. INTRODUCCIÓN

Para poder observar los microorganismos directamente, se debe utilizar un instrumento de precisión: el microscopio.
Los tamaños celulares de los organismos procariontes oscilan entre los 0.1 y 50 μm de diámetro. En promedio una bacteria
de forma bacilar mide aproximadamente 1 x 5 μm, un coco bacilo 1 x 3 μm y una bacteria cocoide 0.25 x 1.2 μm.

Si lo que interesa observar es la motilidad o reactividad frente a sustancias químicas, es conveniente examinar las
bacterias sin teñir. Por otra parte, si se quiere visualizar estructuras específicas, es necesario tratar las células con
colorantes, proceso denominado tinción.

Los colorantes son compuestos químicos u orgánicos, generalmente sales, en la que uno de sus iones es el
portador del color. Según su comportamiento químico los colorantes pueden clasificarse en ácidos, básicos y neutros.

Colorante ácido o aniónico: la carga del ión que imparte el color es negativa. Ejemplo: fucsina ácida, eosina, rojo congo.

Colorante básico o catiónico: el ión que imparte el color tiene carga positiva. Ejemplo: cristal violeta, azul de metileno,
safranina.

Colorante neutro: sal compuesta de un colorante ácido y otro básico. Ejemplo: eosinato de azul de metileno, giemsa.

El proceso de tinción supone una reacción de intercambio de iones entre el colorante y los sitios activos de la
superficie o del interior de la célula. Para teñir una preparación se pone una pequeña cantidad del material a examinar en un
portaobjeto limpio y sin grasa. Si el inóculo proviene de un medio sólido, se emulsiona en una gota de solución fisiológica (o
agua destilada) estéril. La muestra se extiende con el asa hasta que quede una fina película. Esta película se conoce como
Frotis.

Una vez realizado el frotis, se procede a la Fijación. Este es un procedimiento que mata las bacterias del frotis y
hace que se adhieran al portaobjeto. La fijación se puede realizar sumergiendo el portaobjeto en alcohol metílico, éter o
formalina, siendo el calor el más indicado para el trabajo de rutina. La fijación por calor se logra pasando el portaobjeto varias
veces por sobre la llama del mechero hasta secar completamente el frotis. Una vez realizado el frotis y la fijación, se procede
a aplicar el o los colorantes según sea la tinción.
En bacteriología se utilizan tres clases de tinciones:

a) Tinción simple es aquella que hace uso de un solo tipo de colorante, y sólo sirve para observar tamaño y forma
celular. Las más comunes son: azul de metileno, carbolfucsina, cristal violeta y safranina

b) Tinciones diferenciales: permiten dividir las bacterias en grupos, de acuerdo a su reacción con los colorantes
utilizados. Entre ellos la tinción de Gram y la de alcohol-ácido resistente son las más usadas.

Tinción de alcohol-ácido resistente: Algunos géneros de bacterias, particularmente las del género Mycobacterium,
como M. tuberculosis y M. marinum, son resistentes a otras tinciones diferenciales y sólo pueden ser visualizadas con este
método, debido a que contienen en la pared celular ácidos grasos (ácidos micólicos) de cadena larga (50 a 90 átomos de
carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloracíón con alcohol-ácido, después de la tinción con colorantes
básicos. Esta tinción es útil en el diagnóstico de tuberculosis en muestras de esputo.

Técnica:
- Realizar el frotis y fijación de la muestra.
- Cubrir la preparación totalmente con carbol-fucsina o fucsina fenicada
- Calentar la preparación hasta la emisión de vapores (añada tinte adicional si éste comienza a
evaporarse) por 5 minutos.
- Lavar con agua y decolorar con alcohol clorhídrico al 3% hasta que no suelte más colorante rojo.
- Lavar con agua y cubrir con azul de metileno durante un minuto.
- Lavar con agua, secar al aire y observar con objetivo de inmersión.
Las bacterias ácido alcohol resistentes quedan teñidas de rojo y las que no lo son, de azul.

c) Tinción especial: Sirven para observar estructuras dentro por ejemplo esporas, o en el exterior de la célula
bacteriana como la presencia de cápsula, inclusiones citoplasmáticas como también algunos microorganismos que
dadas sus características especiales no se tiñen adecuadamente con técnicas rutinarias.

Tinción negativa de cápsula: Muchas bacterias están rodeadas por una envoltura mucosa o cápsula, pero sólo en
algunas se encuentra bien desarrollada, por ejemplo los géneros Klebsiella y Streptococcus. La cápsula se compone de
polisacáridos, polipéptidos y polímeros extracelulares complejos. Como estas estructuras se alteran por el calor, nunca se
podrá utilizar calor en ningunos de los pasos de la tinción simple o diferencial.

Técnica:
- Sobre un portaobjetos limpio colocar una gota de tinta china y emulsionar con ella a los
microorganismos a examinar (con asa de loop).
- Extender la muestra y dejar secar al aire.
- Cubrir con safranina por 30 a 45 segundos.
- Dejar secar.
- Observar al microscopio con inmersión.
La cápsula se verá como un halo transparente rodeando la célula de color rojo y el resto de la preparación aparecerá de color
negro.

Fundamento: La cápsula no tiene afinidad con los colorantes ordinarios pero puede apreciarse un halo transparente
alrededor de la célula. La técnica de la tinción negativa usa tinta china, que se compone de partículas demasiado grandes
para penetrar la célula y un colorante de contraste (safranina), que penetra la célula bacteriana. Al examinar la preparación la
cápsula aparecerá como una zona transparente que rodea la pared celular. No se puede afirmar con certeza absoluta que
todas las regiones claras observadas sean cápsulas, debido a que el encogimiento de las células o la separación de la tinta
china pueden producir resultados anormales. Sin embargo, en general cuando un frotis tratado contiene muchas zonas
transparentes con siluetas uniformes, es probable que sean reales y no artificiales.

Tinción de flagelos: La observación de flagelos en preparaciones teñidas es muy difícil, debido a que se retraen con
mucha facilidad y se adhieren a la pared celular. Se deben utilizar cultivos jóvenes (de menos de 24 horas), sembrados en
agar semisólido, empleándose técnicas que engruesan los flagelos para facilitar su observación.
Tras la realización de la delicada técnica (extensión por inclinación -sin asa-, secado sin calor, fijación con vapores
de óxido de osmio) los flagelos aparecen visibles al microscopio debido al precipitado de plata formado a su alrededor.

II. OBJETIVO

- Conocer la morfología y estructuras de organismos procariontes a través de la observación microscópica y el uso

de distintos tipos de tinciones.

III. ACTIVIDADES

Cada grupo recibirá una gradilla con tres cultivos bacterianos en agar nutritivo (A, B y C) y un tubo con agua
destilada estéril.

1. TINCIÓN DIFERENCIAL DE GRAM.

Sobre un mismo portaobjeto, realice tres frotis diferentes con el contenido de los tubos A, B y C. Cuide rotular
claramente cada uno de los frotis. Realice una tinción diferencial de Gram.

Tinción Gram: es la técnica de uso más común en microbiología, y permite dividir las bacterias en dos grandes grupos:
bacterias Gram positivas y Gram negativas, de acuerdo a las propiedades físicas de la pared celular.

Técnica:
- Realizar el frotis y fijación de la muestra.
- Aplicar cristal violeta durante un minuto (cubrir el frotis).
- Lavar con agua.
- Eliminar exceso de agua e inmediatamente aplicar solución de yodo (lugol) durante un minuto.
- Lavar con etanol durante 30 segundos (agente decolorante).
- Eliminar exceso de alcohol y aplicar safranina por 30 segundos.
- Lavar con agua y secar al aire.

Examinar al microscopio con 40x, observar. Luego para pasar al mayor aumento, depositar una pequeña gota de aceite
de inmersión sobre el frotis y observar con el lente de inmersión (100x).

El mordiente (Lugol) tiene la función de aumentar la afinidad del primer colorante (cristal violeta) utilizado con las
estructuras celulares. El agente decolorante tiene la función de retirar el colorante de la célula. Las bacterias sometidas a la
tinción de Gram que retienen el colorante "cristal violeta” y aparecen de color violeta profundo, se clasifican como bacterias
Gram-positivas. Aquellas que pierden el cristal violeta y se tiñen rojas por el colorante de contraste (safranina), se clasifican
como bacterias Gram-negativas.
 Fundamento: Luego de agregar Cristal violeta, el tratamiento con alcohol (etanol) produce en el caso de las bacterias
Gram positivas, una deshidratación con la consiguiente disminución en el diámetro de los poros del peptidoglicano de la
pared celular. Esto provoca que el cristal violeta quede retenido en el interior de la pared. Las paredes de las bacterias Gram
(-) tienen una cantidad mucho menor de peptidoglicano con ligaduras cruzadas menos extensas (lo que le da una
consistencia mucho más laxa) lo que permite que a pesar de la deshidratación, se produzca la salida del complejo cristal
violeta-yodo y la posterior tinción con la Safranina (rojo) (Cuadro 1).

CUADRO 1: Reacción de las células Gram (+) Gram (-) frente a la tinción de Gram.

COLORANTE GRAM + GRAM -

Cristal violeta violeta violeta
Lugol violeta violeta
Alcohol etílico violeta decolorada
Safranina violeta rojo

2. TINCIÓN ESPECIAL DE ENDOSPORAS

Tinción de esporas: Las esporas son muy impermeables a los colorantes, por lo que se hace necesario usar técnicas
especiales.

Técnica:
- Con el cultivo contenido en el tubo C, realizar un frotis y fijarlo.
- Cubrir el frotis con un pequeño trozo de papel filtro.
- Utilizando una pipeta Pasteur, empapar el papel filtro con colorante verde malaquita.
- Pasar el portaobjeto rápidamente sobre la llama del mechero hasta observar emisión de vapores. Repetir este
procedimiento por 10 min. EVITANDO que el papel filtro se seque, agregando periódicamente más colorante.
- Luego de los 15 min., eliminar el papel filtro utilizando una pinza, enfriar el portaobjetos y lavar con agua.
- Aplicar Safranina por 1 min.
- Lavar con agua y secar al aire para luego observar al microscopio.

Las esporas aparecerán teñidas de color verde y la célula vegetativa roja. La vaporización del colorante sobre la
muestra incrementa la penetración de este en los recubrimientos impermeables de la espora (Cuadro 2).

CUADRO 2: Reacción de las células frente a la tinción de Esporas.

COLORANTE ESPORA CELULA VEGETATIVA

Verde Malaquita verde verde
Agua verde decolorada
Safranina verde roja

MZT/2010