Anexo K

Medios de Cultivo.
A. AGAR BRAIN HEART INFUSION (BHI). Medio de uso general
adecuado para el cultivo de una amplia variedad de tipos de organismos, incluidos
las bacterias, a partir de muestras clínicas.
Fundamento. Medio muy rico en nutrientes, que proporciona un adecuado
desarrollo microbiano. La infusión de cerebro de ternera, la infusión de corazón
vacuno y la peptona, son la fuente de carbono, nitrógeno, y vitaminas. La glucosa
es el hidrato de carbono fermentable, el cloruro de sodio mantiene el balance
osmótico y el fosfato disódico otorga capacidad buffer. El agar cerebro corazón
mantiene los mismos principios que el caldo para el cultivo de estreptococos y otras
bacterias exigentes. Por tratarse de un medio que contiene glucosa, no es un agar
sangre apropiado para la observación de reacciones de hemólisis10.
Siembra e incubación. De acuerdo a los fines de empleo. El tiempo, la temperatura
y la atmósfera de incubación, serán las óptimas y dependerán del microorganismo
que se esté investigando.
Resultados.

Tabla 1. Descripción del crecimiento de microorganismos en Agar BHI.

Microorganismos Crecimiento
Neisseria meningitidis
Streptococcus pyogenes Bueno
Streptococcus pneumoniae

Figura 1. Agar BHI sin inoculación microbiana.

93
B. AGAR CETRIMIDA. Medio utilizado para el aislamiento selectivo de
Pseudomonas aeruginosa y de otras especies del género.
Fundamento. La fórmula de este medio está desarrollada para favorecer la
selección de P. aeruginosa y estimular la formación de pigmentos. En el cual el
cloruro de magnesio y el sulfato de potasio promueven la formación de piocianina,
pioverdina y piomelanina de P. aeruginosa. La cetrimida es un detergente catiónico
que actúa como agente inhibidor, libera el nitrógeno y el fósforo de las células de
casi toda la flora acompañante, aunque inhibe también algunas especies de
Pseudomonas11.
Siembra e incubación. En superficie, por inoculación directa de la muestra o a partir
de un caldo de enriquecimiento (Cerebro Corazón Infusión o Tripteína Soya Caldo).
Incubar a 35-37°C durante 18-24 hrs.
Resultados.
Desarrollo de pigmentos de Pseudomonas aeruginosa.

Figura 2. Crecimiento de Pseudomonas aeruginosa en Agar Cetrimida4.

94
 C. AGAR EOSINA Y AZUL DE METILENO (EMB). Está recomendado para
el aislamiento, cultivo y diferenciación de bacilos entéricos Gram negativos en
muestras clínicas.
Fundamento. Es un medio diferencial utilizado para el aislamiento de
Enterobacterias. El uso de Eosina y Azul de Metileno permite la diferenciación entre
organismos fermentadores y no fermentadores de lactosa. La peptona aporta
nitrógeno, vitaminas, minerales y aminoácidos esenciales para el crecimiento. La
sacarosa se añade además de la lactosa como carbohidrato fermentable, para
detectar coliformes que fermentan la sacarosa más rápidamente que la lactosa. La
eosina y azul de metileno son inhibidores parciales de bacterias Gram-positivas e
indicadores de pH. Debido a la lactosa y la sacarosa en el medio se puede
diferencia en cultivo primario Salmonella y Shigella las cuales son lactosa negativo
y pueden ser diferenciados de otras lactosa negativos y sacarosa positivos tales
como Proteus vulgaris y Citrobacter17.
Siembra e incubación. Sembrar por dilución americana la especie en cuestión,
incubar a 35-37°C durante 18-24 hrs.
Resultados.

Tabla 2. Descripción del crecimiento de las enterobacterias más recurrentes en Agar Eosina y Azul de Metileno.

Microorganismo Crecimiento
Escherichia coli Crecimiento de colonias de coloración verde con brillo
metálico
Enterobacter aerogenes Crecimiento de colonias rosadas
Salmonella typhimurium Crecimiento de colonias incoloras o ámbar

Figura 3. Crecimiento de Escherichia coli en Agar EMB7.

95
D. AGAR MAcCONKEY. Medio selectivo diferencial utilizado para el aislamiento
y diferenciación de bacilos Gram negativo fermentadores y no fermentadores de
lactosa. Se utiliza con frecuencia para el aislamiento de coliformes.
Fundamento. En el medio de cultivo, las peptonas, aportan los nutrientes necesarios
para el desarrollo bacteriano, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, y la
mezcla de sales biliares y el cristal violeta son los agentes selectivos que inhiben el
desarrollo de gran parte de la flora Gram positiva.
Por fermentación de la lactosa, disminuye el pH alrededor de la colonia. Esto
produce un viraje del color del indicador de pH (rojo neutro), la absorción en las
colonias, y la precipitación de las sales biliares. Así, los microorganismos no
fermentadores de lactosa producen colonias incoloras12.
Siembra e incubación. Sembrar por dilución americana la especie en cuestión,
incubar a 35-37°C durante 18-24 hrs.
Resultados.

Tabla 3. Descripción del crecimiento de las enterobacterias más recurrentes en agar MacConkey.

Microorganismo Colonias
Escherichia coli Rojas con halo turbio
Klebsiella pneumoniae Rosadas y mucosas
Salmonella typhimurium Incoloras y
Shigella flexneri transparentes
Proteus mirabilis

A B

Figura 4. Crecimiento en Agar MacConkey

A) Bacterias fermentadoras de la lactosa
B) Bacterias no fermentadoras de la lactosa.

96
E. AGAR MUELLER HINTON. Medio de cultivo recomendado universalmente
para la prueba de sensibilidad a los antimicrobianos.
Fundamento. Su uso es de forma rutinaria para la realización del antibiograma en
medio sólido, debido a una serie de factores que presenta como: buena
reproducibilidad en las pruebas de sensibilidad, su contenido en inhibidores de
sulfonamidas, trimetoprima y tetraciclina es bajo y la mayoría de los patógenos
crece satisfactoriamente8.
Siembra e incubación. Sembrar con un hisopo embebido en una suspensión
proveniente de un tubo con caldo nutritivo igualado al tubo 0.5 del Nefelómetro de
MacFarland (1.5 x 108 UFC) de la cepa a estudiar; luego se aplica el (los) disco (s)
del antimicrobiano en cuestión y se incuba a 35-37°C durante 18 hrs*.
*NOTA: Para aquellas cepas que fallan de crecer satisfactoriamente sobre Agar
Mueller Hinton no suplementado, se agrega sangre desfibrinada de carnero al agar
fundido y enfriado, a una concentración final al 5%.
Resultados. Variabilidad de acuerdo a la sensibilidad presentada por el agente
patógeno ante el antibiótico.

Figura 5. Utilización del Agar Mueller Hinton para la prueba de sensibilidad a los antimicrobianos21.

97
F. AGAR PSEUDOMONAS F. Medio de cultivo utilizado para el aislamiento, la
detección y la diferenciación de especies de Pseudomonas en base a la
producción de fluoresceína.
Fundamento. En el medio de cultivo, la tripteína y la peptona de carne aportan los
nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano, la glicerina favorece la
producción de pigmentos, la concentración de fosfato dipotásico estimula la
producción de fluoresceína e inhibe la producción de piocianina y piorrubina. El
sulfato de magnesio provee los cationes necesarios que incrementan la producción
de fluoresceína14.
Siembra e incubación. A partir de un cultivo puro de 18-24 hrs. del cual se sospeche
la presencia de Pseudomonas spp., tomar una colonia y estriar la superficie del
medio. Incubar en aerobiosis, a 35-37ºC durante 24-48 hrs.*
*NOTA: Si no se observa crecimiento, reincubar a 25-30ºC, o dejar a 22ºC y
observar diariamente hasta 7 días.
Resultados.
Pseudomonas aeruginosa genera una coloración amarillo verdoso.*
*NOTA: Examinar las colonias bajo luz ultravioleta, a 260nm. Se
considera un resultado positivo la observación de fluoresceína, que
es un pigmento de color amarillo-verdoso fluorescente que rodea la
colonia o que se extiende por todo el medio de cultivo debido a
fenómenos de difusión.

Figura 6. Crecimiento de Pseudomonas aeruginosa en Agar Pseudomonas F22.

98
G. AGAR PSEUDOMONAS P. Medio de cultivo utilizado para el aislamiento, la
detección y la diferenciación de especies de Pseudomonas en base a la
producción de piocianina.
Fundamento. En el medio de cultivo, la peptona de gelatina aporta los nutrientes
necesarios para el desarrollo bacteriano, la glicerina favorece la producción de
pigmentos, las sales de magnesio y potasio estimulan la producción de piocianina y
piorrubina e inhiben la producción de fluoresceína15.
Siembra e incubación. A partir de un cultivo puro de 18-24 hrs. del cual se sospeche
la presencia de Pseudomonas spp., tomar una colonia y estriar la superficie del
medio. Incubar en aerobiosis, a 35-37ºC durante 24-48 hrs.*
*NOTA: Si no se observa crecimiento, reincubar a 25-30ºC, o dejar a 22ºC y
observar diariamente hasta 7 días.
Resultados.
Pseudomonas aeruginosa genera una coloración verde o verde azulado.

Figura 7. Crecimiento de Pseudomonas aeruginosa en Agar Pseudomonas P15.

99
H. AGAR SALES Y MANITOL. Medio de cultivo selectivo y diferencial, utilizado
para el aislamiento y diferenciación de estafilococos.
Fundamento. El agar sales y manitol contiene peptonas y extractos de carne bovina,
que suministran los nutrientes esenciales. Una concentración de NaCl de 7,5% tiene
como resultado una inhibición parcial o completa de los organismos bacterianos
diferentes de los estafilococos. La fermentación de manitol, indicada por el cambio
del indicador de rojo fenol, facilita la diferenciación de la especie de estafilococos.
Los estafilococos positivos a la coagulasa (por ejemplo, Staphylococcus aureus)
producen colonias de color amarillo y un medio circundante de color amarillo,
mientras que los estafilococos negativos a la coagulasa producen colonias de color
rojo y no producen cambio de color en el indicador de rojo fenol2.
Siembra e incubación. Por inoculación directa del microorganismo en estudio, ya
sea realizando un sembrado masivo o dilución por estriado. Incubar las placas a 35-
37°C en una atmósfera aerobia. Examinar las placas después de 24-48 horas para
comprobar la extensión del crecimiento, el tamaño de las colonias, la pigmentación
y la selectividad.
Resultados.

Tabla 4. Descripción del crecimiento de microorganismos resistentes a la sal (NaCl).

Microorganismos Crecimiento
Staphylococcus aureus Colonias amarillas de tamaño
medio, amarillo medio.
Staphylococcus epidermidis Colonias blancas de tamaño
pequeño a medio, rojo medio.
Otros Staphylococcus Colonias de tamaño pequeño a
grande, con zonas de color rojo o
amarillo, según la especie.
Enterococcus spp. Sin crecimiento a crecimiento
muy débil
Micrococcus spp. Colonias grandes, de color
blanco a anaranjado.

Figura 8. Crecimiento en Agar Sales y Manitol donde: 1) Manitol es negativo 2) Manitol positivo.

100
I. AGAR SALMONELLA-SHIGELLA (SS). Es un medio selectivo y de
diferenciación para el aislamiento de bacilos entéricos patógenos, en especial los
pertenecientes al género Salmonella, a partir de muestras clínicas.
Fundamento. La diferenciación de los organismos entéricos se logra mediante la
incorporación de lactosa en el medio. Los organismos que fermentan lactosa
producen ácido que, en presencia del indicador rojo neutro, propicia la formación
de colonias de color rojo. Los organismos no fermentadores de lactosa forman
colonias incoloras. Este último grupo incluye la mayoría de los patógenos intestinales,
incluidas Salmonella y Shigella. El tiosulfato sódico y el citrato férrico permiten la
detección de producción de ácido sulfhídrico, como lo demuestran las colonias con
centros de color negro. Este medio se utiliza para el aislamiento primario de
Salmonella a partir de muestras fecales humanas3.
Siembra e incubación. Sembrar por dilución americana la especie en cuestión,
incubar a 35-37°C durante 18-24 hrs.
Resultados.

Tabla 5. Descripción del crecimiento de las enterobacterias más recurrentes en agar Salmonella-Shigella.

Microorganismo Crecimiento
Escherichia coli Crecimiento ligero, color rosa o rojo
Enterobacter spp./Klebsiella spp. Crecimiento leve, color rosa
Proteus spp. Incoloro, con centros blancos
Salmonella spp. Incoloro, generalmente con centro de color negro
Shigella spp. Incoloro

Figura 9. Crecimiento de Salmonella y Shigella en Agar SS20.

101
J. AGAR SANGRE. Medio utilizado para el aislamiento y cultivo de numerosos
microorganismos. Donde la adición de sangre, al medio, es útil tanto para el
aislamiento y cultivo de microorganismos aerobios y anaerobios nutricionalmente
exigentes, a partir de una gran variedad de muestras clínicas, como para la
observación de reacciones de hemólisis.
Fundamento. La infusión de músculo de corazón y la peptona, otorgan al medio un
alto valor nutritivo, que permite el crecimiento de una gran variedad de
microorganismos, aún de aquellos nutricionalmente exigentes. El cloruro de sodio
mantiene el balance osmótico. Mientras que, al agregar sangre (ovina desfibrinada
estéril al 5%) al medio de cultivo, aporta nutrientes para el crecimiento bacteriano,
y permite detectar hemólisis realizada por los mismos9.
Siembra e incubación. Por inoculación directa del microorganismo en estudio, sobre
la superficie del medio de cultivo. El tiempo, temperatura y atmósfera de
incubación, dependerán del microorganismo que se quiera aislar.*
NOTAS:
*Microorganismos de fácil crecimiento: en aerobiosis, a 35-37°C hasta 48 horas.
**Microorganismos exigentes en sus requerimientos nutricionales: en
atmósfera con 5% de CO2 a 35-37°C durante 24-48 horas.
Resultados.

Tabla 6. Descripción del crecimiento y hemólisis de microorganismos en Agar Sangre.

Microorganismos Crecimiento Hemólisis

Staphylococcus aureus (Beta)
Streptococcus agalactiae (Beta)
Streptococcus pyogenes Abundante (Beta)
Streptococcus pneumoniae (Alfa)
Enterococcus faecalis Sin hemólisis
Escherichia coli Sin hemólisis

Figura 10. Diferentes tipos de hemolisis apreciables en Agar Sangre5.

102
K. AGAR SULFITO BISMUTO (SB). Medio altamente selectivo, recomendado
para aislamiento de Salmonella spp. particularmente Salmonella thyphi, en heces.
Fundamento. La peptona y el extracto de carne aportan nitrógeno, vitaminas,
minerales y amino ácidos esenciales para el crecimiento de los organismos. La
dextrosa es el carbohidrato fermentable y provee de carbono y energía. Mientras
que, el indicador de Bismuto Sulfito y el verde Brillante son inhibidores de bacterias
Gram positivas y de algunas bacterias del grupo coliformes. El sulfato ferroso se
incluye para la producción de H2S. Cuando el H2S está presente, el hierro es
precipitado dando colonias positivas características de color marrón a negro con
brillo metálico16.
Siembra e incubación. Inocular por el método siembra en superficie para obtener
colonias aisladas, pero también se puede utilizar el método por vertido, mezclando
la muestra con el medio líquido a temperatura de 45-50ºC y dejando solidificar.
La inoculación también se puede hacer a partir de un cultivo de
preenriquecimiento. Incubar a 35-37ºC durante 40-48 hrs.
Resultados.

Tabla 7. Descripción del crecimiento de las enterobacterias más recurrentes en Agar Sulfito Bismuto.

Microorganismo Crecimiento
Escherichia coli Crecimiento con inhibición parcial, colonias de color marrón-
verde
Salmonella enteriditis Crecimiento de colonias negras o parduzcas con brillo
metálico
Salmonella typhi Crecimiento de colonias negras o parduzcas con brillo
metálico
Shigella flexneri Crecimiento con inhibición parcial, colonias de color marrón

Figura 11. Crecimiento de Salmonella en Agar Sulfito Bismuto5.

103
L. AGAR TIOSULFATO CITRATO BILIS SACAROSA (TCBS). Medio
selectivo para el aislamiento y cultivo de Vibrio cholerae, Vibrio parahemolyticus y
otras especies de Vibrio a partir de heces, agua y alimentos contaminados.
Fundamento. En el medio de cultivo, el extracto de levadura, la peptona de carne
y la tripteína aportan nutrientes para el desarrollo bacteriano. Es este, el medio
selectivo más adecuado para el aislamiento de las especies de Vibrio e inhibidor
para la mayoría de las enterobacterias. Esta inhibición se basa en las altas
concentraciones de tiosulfato y citrato, la presencia de bilis y un pH fuertemente
alcalino. La degradación de la sacarosa es variable entre las especies de Vibrio y
las colonias son verdes para las cepas que no la utilizan y amarillas para aquellas
que producen ácido a partir de este azúcar.
Esto es debido al viraje del color de los indicadores de pH azul de timol y azul de
bromotimol, del color azul al amarillo en medio ácido. Además, el cloruro de sodio
favorece el crecimiento de microorganismos; el tiosulfato de sodio aporta azufre y
junto con el citrato férrico permiten la detección de producción de ácido
sulfhídrico13.
Siembra e incubación.
i. Materia fecal. Suspender 1g de heces o el contenido del hisopo en 10mL de
Agua Peptonada Alcalina e incubar de 6 a 8 hrs. a 35-37°C, en aerobiosis.
ii. Agua. Filtrar el volumen deseado de agua con membrana de 0.22µ.Colocar
la membrana en un recipiente conteniendo en Agua Peptonada Alcalina e
incubar de 6 a 8 hrs. a 35-37°C, en aerobiosis.
iii. Alimentos: Licuar 25g de la muestra con 225mL de Agua Peptonada Alcalina
e incubar de 6 a 8 hrs. a 35-37°C, en aerobiosis.
En todos los casos sembrar una alícuota del caldo de enriquecimiento en la
superficie de una placa de TCBS, por estriado, para el aislamiento de colonias a 37°C
durante 18-24 hrs.
Resultados.
Tabla 8. Descripción del crecimiento de las especies más importantes del género Vibrio.
Especie de Vibrio Crecimiento

V. cholerae Colonias amarillas de 2-3mm de bode traslúcido.

V. parahaemolyticus Colonias verde azulado con bordes traslúcidos.

V. alginolyticus Colonias amarillas grandes.

Figura 12. Crecimiento del género Vibrio en Agar TCBS.

104
 M. AGAR XILOSA LISINA DESOXICOLATO (XLD). Medio moderadamente
selectivo y de diferenciación recomendado para el aislamiento y la diferenciación
de patógenos entéricos Gram negativos (Salmonella y Shigella) a partir de muestras
clínicas.
Fundamento. En el medio la xilosa se incorpora en el medio dado que la fermentan
prácticamente todos los entéricos, excepto Shigella, y esta propiedad hace posible
la diferenciación de dicha especie. La lisina se incluye para permitir la diferenciación
del grupo Salmonella de los organismos no patógenos.
Cuando la Salmonella agota el suministro de xilosa, la lisina es atacada por la enzima
lisina decarboxilasa, lo que genera un cambio a un pH alcalino que imita la reacción
de Shigella. Para evitar el cambio similar en los organismos coliformes positivos a la
lisina, se añaden lactosa y sacarosa para producir ácido en exceso. El Rojo fenol es
el indicador de pH. El extracto de Levadura es la fuente de vitaminas,
particularmente del grupo B esencial para el crecimiento bacteriano. El Cloruro
sódico mantiene el balance osmótico. Y para aumentar la capacidad de
diferenciación de la fórmula, se incluye un sistema indicador de H 2S, formado por
tiosulfato sódico y citrato férrico amónico, para la visualización del ácido sulfhídrico
producido, lo que origina la formación de colonias con centros de color negro 18.
Siembra e incubación. Sembrar por dilución americana la especie en cuestión,
incubar a 35-37°C durante 18-24 hrs.
Resultados.
Tabla 9. Descripción del crecimiento de las enterobacterias más recurrentes en Agar Xilosa Lisina Desoxicolato.

.
Microorganismo Crecimiento
Citrobacter Crecimiento de colonias amarillas y opacas. Pueden presentar
un centro negro y bordes claros
Escherichia coli Crecimiento de colonias amarillas y opacas. Con zona de
Enterobacter precipitación amarilla alrededor de las colonias
Serratia
Klebsiella Crecimiento de colonias grandes, amarillas claro, mucoides u
opacas.
Proteus mirabilis Crecimiento de colonias amarillas, transparentes con bordes
Proteus vulgaris claros. Centro negro especialmente para P. mirabilis
Proteus morganii
Salmonella Colonias rojas y transparentes con centro negro, si produce H2S
Shigella Colonias rojas y transparentes

Figura 13. Agar XLD24 donde: a) Medio sin inoculación; b) Crecimiento de Salmonella
c) Crecimiento de Escherichia coli.

105
N. AGAR YEMA DE HUEVO. Medio para el aislamiento selectivo y diferencial
de Clostridium botulinum, el cual puede aislarse de los cultivos toxigénicos de Medio
Cooked Meat, provenientes de muestras de heces, líquido gástrico o alimentos.
Fundamento. Es un medio en el cual se realiza la prueba de lecitinasa. La cual, se
realiza para determinar la capacidad de los microorganismos para producir la
enzima lecitinasa y degradar a la lecitina de la yema de huevo presente en el medio
de cultivo19.
Siembra e incubación. Realice un aislamiento o una estría en una placa de agar
yema de huevo con el microorganismo a identificar. Incubar durante 1 a 4 días a la
temperatura óptima de crecimiento del microorganismo.
Resultados.
Una prueba de lecitinasa positiva, consiste en la aparición de una zona opaca
alrededor del crecimiento microbiano, como resultado de la hidrólisis de la lecitina
de la yema de huevo.

A B

Figura 14. Agar Yema de Huevo23:

A) Resultado positivo a la degradación de la lecitina
B) Resultado negativo.

106
O. MEDIO DE CARNE COCIDA (Cooked Meat). El medio de carne cocida es
un medio de enriquecimiento utilizado para el cultivo de microorganismos
anaerobios, especialmente los pertenecientes al género Clostridium.
Fundamento. Este medio proporciona un entorno favorable para el crecimiento de
anaerobios dado que la proteína muscular en los gránulos del tejido cardiaco
constituye una fuente de aminoácidos y otros nutrientes. El tejido muscular también
proporciona las sustancias reductoras que favorecen el crecimiento de
microorganismos anaerobios estrictos. La disponibilidad de los grupos sulfidrilos que
aumentan el efecto reductor es mayor en la proteína desnaturalizada, por ello en
este medio se utiliza carne cocida1.
Siembra e incubación. Con un asa bacteriológica, transferir el crecimiento de un
medio de subcultivo reciente, realizando una inoculación densa de partículas de
carne. Incubar los tubos a 35-37°C en condiciones anaerobias durante un máximo
de 7 días.
Resultados.
En el cultivo de clostridios, los organismos sacarolíticos habitualmente producen
ácido y gas. El crecimiento de organismos proteolíticos se caracteriza generalmente
por el oscurecimiento y dilución de las partículas de carne. Además, existe una
turbidez y, en el caso de algunos organismos, con la presencia de burbujas de gas
en el medio.

A B

Figura 15. Medio de Cooked Meat:

A) Medio sin inocular
B) Crecimiento de Clostridium spp.

107
P. MEDIO ORIENTADOR CHROMAGAR. Es un medio no selectivo para el
aislamiento, la identificación directa, la diferenciación y el recuento de patógenos
de las vías urinarias.
Fundamento. En el medio, las peptonas especialmente seleccionadas suministran
los nutrientes. La mezcla de cromógenos está formada por sustratos artificiales
(cromógenos) que liberan compuestos de colores diferentes al ser degradados por
enzimas microbianas específicas, por lo que se asegura la diferenciación directa de
determinadas especies o la detección de ciertos grupos de organismos, con sólo un
mínimo de pruebas de confirmación6.
Siembra e incubación. Sembrado masivo de la especie en cuestión, incubar a 35-
37°C durante 20-24 hrs.*
*NOTA: Evitar la exposición a la luz durante la incubación,
dado que así se podrían destruir los cromógenos.

REALIZAR LAS PRUEBAS DE CONFIRMACIÓN SEGÚN SE REQUIERA

Resultados.
Tabla 10. Descripción del crecimiento de las enterobacterias más recurrentes en el Medio Orientador
CHROMagar.
Microorganismo Crecimiento
Escherichia coli Colonias de tamaño mediano a grande, de rosado oscuro
a rosa, transparentes, con o sin halos en el medio
circundante.
GRUPO KES
(Klebsiella, Colonias medianas, de color azul a azul oscuro, con o sin
Enterobacter y halos violetas.
Serratia)
Grupo PMP Colonias de pálidas a beige, rodeadas de halos marrones.
(Proteus, Morganella y
Providencia)
Proteus mirabilis Crecimiento de colonias amarillas, transparentes con
Proteus vulgaris bordes claros. Centro negro especialmente para P.
Proteus morganii mirabilis
Salmonella Colonias rojas y transparentes con centro negro, si produce
H2S
Shigella Colonias rojas y transparentes
.

Figuras 16 y 17. Denotación del crecimiento de las enterobacterias más comunes en el Medio
Orientador CHROMagar6.

108
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.

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31 de mayo de 2017. Obtenido de:
http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedraMicro/10_C
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mayo de 2017. Obtenido de: https://www.bd.com/resource.aspx?IDX=8771
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el 25 de mayo de 2017. Obtenido de: http://www.bd.com/resource.aspx?IDX=8779
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de 2017. Obtenido de:
file:///C:/Users/LABORATORIO%20FELTON/Downloads/protocolos_micro5%20(1).pdf
7. HYSERVE. EMB Agar Eosin Methylene Blue Agar. [en línea]. Consultado el 01 de junio
de 2017. Obtenido de: https://hyserve.com/produktgruppe.php?lang=es&gr=42
8. Laboratorios Britania. Agar Mueller Hinton. [en línea]. Consultado el 21 de mayo de
2017. Obtenido de:
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9. Laboratorios Britania. Agar Sangre. [en línea]. Consultado el 22 de mayo de 2017.
Obtenido de: http://www.britanialab.com/productos/B02149%20REV%2001-
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10. Laboratorios Britania. Cerebro Corazón Infusión Agar. [en línea]. Consultado el 25 de
mayo de 2017. Obtenido de:
http://www.britanialab.com/productos/B02147%20REV%2001-
CEREBRO%20CORAZON%20INFUSION%20AGAR.pdf
11. Laboratorios Britania. Cetrimida Agar Base. [en línea]. Consultado el 29 de mayo de
2017. Obtenido de:
http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/cetagarbase.htm
12. Laboratorios Britania. Mac Conkey Agar. [en línea]. Consultado el 23 de mayo de
2017. Obtenido de:
http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/maconkeyagar.htm
13. Laboratorios Britania. Medio TCBS. [en línea]. Consultado el 23 de mayo de 2017.
Obtenido de: http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/tcbsmedio.htm
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15. Laboratorios Britania. Pseudomonas Agar P. [en línea]. Consultado el 30 de mayo de
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109
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20 de mayo de 2017. Obtenido de:
http://www.condalab.com/uploads/media/1039_AGAR_EOSINA_Y_AZUL_DE_METIL
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10(51): 3425-9.
22. ThermoFisher. Pseudomonas F Agar. [En línea]. Consultado el 02 de Junio de 2017.
Obtenido de: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R01710
23. UNAM. Pruebas Bioquímicas. [documento en línea]. Consultado el 09 de junio de
2017. Disponible en:
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/U3c_PruebasBioquimicas_17461.PDF
24. VetBact. Xylose lysine deoxycholate agar (XLD agar). [en línea]. Consultado el 06
de junio de 2017. Obtenido de:
http://www.vetbact.org/vetbact/?displayextinfo=46

110
 ANEXO L
Realización de Pruebas
Bioquímicas Secundarias.
A) Bilis Esculina.
Fundamento. Se basa en la capacidad de los estreptococos del grupo D (Enterococcus y
No Enterococos) de crecer en un medio de cultivo que contiene un 40% de bilis y de
hidrolizar la esculina a esculetina por acción de la enzima -glucosidasa, con el fin de
consumir la presencia de glucosa en el medio; donde, la esculetina se combina con el
citrato ferroso que posee el medio, dando un complejo de color castaño oscuro a negro.

Figura 1. Hidrólisis de la esculina a esculetina6.

Figura 2. Formación del complejo de hierro-esculetina6.

Procedimiento. Se realiza sembrando en la superficie del tubo de agar bilis esculina
inclinado e incubar a 37°C durante 24 horas.
Interpretación de resultados.
Una reacción positiva se evidencia como ennegrecimiento del medio.

A B

Figura 4. Prueba de Bilis Esculoina11.

A. Resultado negativo a la prueba
B. Ennegrecimiento del medio significando un resultado positivo a la prueba

111
 B) Prueba de CAMP (Christie, Atkins, Mundi-Petersen).
Fundamento. Sirve principalmente para determinar la capacidad de un microorganismo
(Streptococcus agalactiae) para producir una proteína conocida como factor CAMP
(factor de monofosfato de adenina cíclica) que aumenta la zona de hemólisis producida
por un estafilococo productor de -lisina (Staphylococcus aureus) debido a un sinergismo
con esta.
Procedimiento. Se realiza estriando un cultivo de estreptococo -hemolítico en forma
perpendicular a una estría de un estafilococo productor de -lisina en una placa de Agar
Sangre, se incuba 18-24 horas a 37ºC.
NOTA: Evitar el contacto de una estría con la otra.
Interpretación de resultados.
La prueba positiva se evidencia por la presencia de una zona de potenciación de la
hemólisis en forma de puntas de flecha en el lugar donde se contactan las dos estrías.

(-)

(-)
(+)

(-)

Figura 4. Test de CAMP4 aplicado a diferentes especies del género Streptococcus y Enterococcus.

112
 C) Prueba Citrato de Simmons.
Fundamento. En el medio de cultivo, el fosfato monoamónico es la única fuente de
nitrógeno y el citrato de sodio es la única fuente de carbono. Ambos componentes son
necesarios para el desarrollo bacteriano. Las sales de fosfato forman un sistema buffer, el
magnesio es cofactor enzimático. El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico, y el
azul de bromotimol es el indicador de pH, que vira al color azul en medio alcalino. El medio
de cultivo es diferencial en base a que los microorganismos capaces de utilizar citrato como
única fuente de carbono, usan sales de amonio como única fuente de nitrógeno, con la
consiguiente producción de alcalinidad.
Así, el metabolismo del citrato se realiza, en aquellas bacterias poseedoras de citrato
permeasa, a través del ciclo del ácido tricarboxílico. El desdoblamiento del citrato da
progresivamente, oxalacetato y piruvato. Este último, en presencia de un medio alcalino,
da origen a ácidos orgánicos que, al ser utilizados como fuente de carbono, producen
carbonatos y bicarbonatos alcalinos. El medio entonces vira al azul y esto es indicativo de
la producción de citrato permeasa.

Figura 5. Base bioquímica de la prueba de citratos6.

Procedimiento. A partir de un cultivo puro de 18-24 horas, sembrar en superficie un inóculo

ligero, usando un asa sin arrastrar el agar, incubar a 35-37ºC durante 24-48 horas, en
aerobiosis.
NOTA: Algunos microorganismos pueden requerir hasta 4 días de incubación.
Interpretación de resultados.
Positivo. Crecimiento y color azul en el pico, alcalinidad.
Negativo. El medio permanece de color verde debido a que no hay desarrollo bacteriano
y no hay cambio de color.

Figura 6.
A. Resultado negativo a la prueba.
B. Resultado positivo a la prueba.

113
 D) Prueba de Coagulasa.
Fundamento. Staphylococcus aureus se diferencia de otras especies del mismo género
por la presencia de la enzima coagulasa. Siendo una proteína termoestable similar a la
trombina y al ser un receptor del fibrinógeno activa la conversión del mismo en monómeros
de fibrina. Así, su presencia se evidencia por la formación de un coágulo cuando se inocula
plasma con colonias de estafilococos.

Coagulasa

Figura 7. Acción de la enzima coagulasa sobre el fibrinógeno para la conversión a fibrina.

Procedimiento. Incubar a 37°C durante 2 horas 0.5mL de caldo nutritivo igualado al tubo
0.5 del Nefelómetro de MacFarland (1.5 x 10 8 UFC) utilizando la cepa problema y adicionar
0.5mL de plasma de conejo o humano (Grupo “O” Positivo) y observar los cambios pasado
el tiempo establecido.
NOTA: Si al cabo de ese tiempo no hay coágulo visible, dejar incubando 24 horas.
Interpretación de resultados.
Prueba positiva = se forman coágulos o filamentos de fibrina visibles
NOTA: La coagulación puede ser completa o parcial
Prueba negativa = no hay formación de coágulos y la suspensión se mantiene homogénea.

A B

Figura 8. Prueba de la Coagulasa13.

A. Resultado (+) a la prueba visible por la formación del coágulo.
B. Resultado (-) demostrable por la homogeneidad de la suspensión.

114
 E) Degradación de la Caseína.
Fundamento. La caseína es una proteína encontrada en la leche. Como todas las
proteínas, está compuesta de aminoácidos que son utilizados por las bacterias como fuente
de energía y de carbono. Cuando la leche es mezclada con un medio de cultivo, el medio
pierde su transparencia y se vuelve turbio debido a que la caseína reacciona con los iones
calcio y forma complejos coloidales insolubles de caseinato de calcio.
Por tanto, cuando la caseinasa cataliza la hidrólisis de la caseína, los aminoácidos
resultantes se disuelven en el medio acuoso y el medio se torna de nuevo transparente
alrededor de la colonia de la bacteria. Este fenómeno permite detectar la degradación de
la proteína.
Procedimiento. Sembrar por medio de una estría la cepa problema en el Agar Leche
Descremada e incubar de 24 a 48 horas a 35-37°C.
Interpretación de resultados.
Si se observa un halo de transparencia alrededor de las colonias en el medio se considera
un resultado positivo por tanto, la hidrólisis de la caseína.
Si el medio continua con su coloración blanquecina se considera un resultado negativo.

A B
Figura 9. Degradación de la Caseína13.
A. Resultado negativo
B. Resultado positivo

115
 F) Prueba de DNAsa.
Fundamento. Staphylococcus aureus produce una enzima denominada DNAsa que es
termoestable e hidroliza al DNA, La presencia de la enzima, se puede detectar mediante el
agregado de ácido clorhídrico ya que, el ácido desoxirribonucleico hidrolizado presenta
transparencia, mientras que el ácido desoxirribonucleico polimerizado, precipita y torna
opacidad al medio de cultivo.
Procedimiento. Inocular sobre el agar DNA a la bacteria problema mediante una impronta
incubar a 35-37°C durante 18-24 horas. Revelar el resultado obtenido con HCl al 1N, que
ayuda a la precipitación del DNA nativo en el medio.
Interpretación de resultados.
Positiva = Colonias rodeadas por una zona clara (DNA despolimerizado e hidrolizado)
Negativa = Colonias sin cambio aparente en el medio.

Figura 10. Resultado positivo a la prueba de DNAsa11 debido a la existencia de proteasas en el

medio.

116
 G) Desaminación de la Fenilalanina.
Fundamento. El aminoácido fenilalanina sufre la desaminación oxidativa catalizada por la
enzima fenilalanina desaminasa (es una flavoproteína), para producir ácido fenilpirúvico y
amoníaco. La presencia del ácido fenilpirúvico se demuestra con el agregado de cloruro
férrico en medio ácido, con el cual se forma un quelato de color verdoso entre el ácido
fenilpirúvico y los iones Fe3+. Además, en este medio se suele poner en evidencia la
producción de pigmentos melánicos, como en el caso de Morganella morganii, etc.

Figura 11. Desaminación de la Fenilalanina6.

Procedimiento. A partir de un cultivo puro de 18-24 horas, sembrar un inóculo denso

estriando la superficie del medio, incubar de 18 a 24 horas a 35-37 °C, en aerobiosis. Luego,
se debe realizar el revelado agregando unas gotas de una solución acuosa de FeCl 2 al 10%.
Interpretación de resultados.
Positivo. Desarrollo de color verde pálido a intenso en el pico de flauta y en el líquido de
condensación.
Negativo. Sin cambios de color. El medio permanece amarillo debido al color del reactivo
cloruro férrico.
NOTA: El análisis de los resultados debe realizarse dentro de los primeros 5 minutos.

Figura 12. Resultado negativo y positivo a la prueba en donde en la última de denota la formación
del ácido fenilpirúvico2.

117
 H) Descarboxilación de la Arginina.
Fundamento. Algunas bacterias poseen algunas enzimas descarboxilasas específicas que
son capaces de atacar al grupo carboxilo de determinados aminoácidos, produciendo
anhídrido y una amina (o diamina) en el medio. Así el aminoácido L-arginina posee un
sistema especial de transformación donde, primero por acción de una descarboxilasa se
transforma en un producto intermedio, la agmatina. La cual, por una arginina dehidrolasa
(ADH) pasa a putrescina y urea.

Figura 13. Descarboxilación de la Arginina10.

Procedimiento. A partir de un cultivo puro del microorganismo en estudio, inocular por

picadura con asa recta, incubar en anaerobiosis, durante 18-24 horas a 35-37°C.
NOTA: La anaerobiosis se puede lograr agregando 0.5mL de
aceite mineral al tubo con el medio Arginina.
Interpretación de resultados.
Positivo. Color púrpura turbio a purpura apagado.
Negativo. Color amarillo claro brillante.

Figura 14. Descarboxilación de la Arginina11

visible por el vire del indicador en el tubo marcado como positivo.

118
 I) Fermentación de Carbohidratos.
Fundamento. La fermentación es un proceso metabólico de óxido-reducción que ocurre
en un medio ambiente anaerobio y, en lugar de oxígeno, un sustrato orgánico sirve como
el aceptor final de hidrógeno (electrones). En los sistemas de prueba bacteriológicos, este
proceso se detecta observando cambios de color en indicadores de pH a medida que se
forman productos ácidos.

Las bacterias que fermentan un carbohidrato son por lo general anaerobios facultativos.
Por medio del proceso de fermentación un carbohidrato es degradado y descompuesto
en dos moléculas de carbono que son nuevamente degradadas en diferentes números de
compuestos. Los productos finales varían con cada especie bacteriana y depende del
sistema enzimático existente en la especie y las condiciones del medio ambiente.

El más importante ciclo fermentativo de la degradación de la glucosa es el ciclo de

Embden-Meyerhof, en el cual puede usar diversos carbohidratos para realizar dicho ciclo.
Demostrándolo por medio de la utilización de un indicador de pH puede determinarse sin
una bacteria ha degradado el mismo en varios productos terminales, observando un
cambio de color visible en el medio.

𝐵𝑎𝑐𝑡𝑒𝑟𝑖𝑎
𝐶𝑎𝑟𝑏𝑜ℎ𝑖𝑑𝑟𝑎𝑡𝑜 + 𝐼𝑛𝑑𝑖𝑐𝑎𝑑𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑝𝐻 𝑔𝑙𝑢𝑐ó𝑙𝑖𝑠𝑖𝑠 > 𝐻2 𝐶𝑂2 + 𝑉𝑖𝑟𝑒 𝑑𝑒𝑙 𝑖𝑛 𝑑𝑖𝑐𝑎𝑑𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑝𝐻

Figura 15. Reacción general en la fermentación de carbohidratos.

Procedimiento. Por difusión en el tubo, por medio de un inóculo pesado incubado a una
temperatura de 35-37°C durante 24-48 hrs.
Interpretación de resultados.
Positiva = color amarillo o naranja (ácido)
Negativo = color rosa rojizo (alcalina)

Figura 16. Resultados de la prueba “Fermentación de carbohidratos”2.

119
 J) Hidrólisis del almidón.
Fundamento. Las bacterias pueden usar alimentos macromoleculares; para ello, es
necesario una hidrólisis extracelular preliminar, igual que sucede en los animales. Las
distintas bacterias elaboran para este fin una cierta variedad de enzimas que se segregan
al medio. El almidón es un carbohidrato complejo que es degradado por microorganismos
que contienen amilasas.
Para demostrar que las bacterias en estudio poseen esta enzima, se lleva a cabo la prueba
en un Agar Almidón, el cual después de la incubación, es revelado al adicionar lugol al
medio donde las moléculas de este quedan atrapadas dentro de la hélice no ramificada
de unidades de glucosa de la cadena de amilasa para formar un compuesto de inclusión
de coloración café-púrpura. Si la red se desintegra como ocurre durante la hidrólisis, se
produce una mezcla de dos moléculas de polisacáridos denominados glucosán que son
denotados por un halo transparente alrededor de las colonias presentes en el medio.
Procedimiento. Sembrar por medio de una estría la cepa problema en el Agar Almidón e
incubar 24 horas a 35-37°C. Sumergir la placa en lugol para Gram y buscar las zonas claras
alrededor de las colonias.
Interpretación de resultados.
Si se observa un halo de transparencia alrededor de las colonias en el medio se considera
un resultado positivo por tanto, la hidrólisis del almidón.
Si el medio continua con su coloración blanquecina se considera un resultado negativo.

Figura 17. Resultado negativo (izquierda) y resultado positivo (derecha) a la prueba de la

degradación del almidón13.

120
 K) Hidrólisis del Hipurato.
Fundamento. Demuestra la capacidad de algunas bacterias para hidrolizar el hipurato de
sodio a ácido benzoico y glicina por la acción de la enzima hipuricasa o hipurato hidrolasa.
La hidrólisis del hipurato dará como resultado glicina, que reaccionará con la ninhidrina
provocando un cambio de color; o bien, el benzoato reaccionará con el cloruro férrico
provocando un precipitado.
Procedimiento.
1.- Añadir a un tubo con Medio de Hipurato una impronta por inóculo pesado de la cepa
problema.
2.- Incubar durante 24 horas a 37ºC
3.- Centrifugar a 2500 rpm durante 5 minutos
4.-Separar sobrenadante
5.- A un tubo de ensaye estéril, adicionar 0.4mL del sobrenadante y añadir 0.2 mL de
Ninhidrina para detectar la formación de glicina
6.- A otro tubo de ensaye estéril, adicionar 0.8mL del sobrenadante y añadir 0.3 mL de
Cloruro férrico para detectar la formación de benzoato.
Interpretación de resultados.
- La aparición de un color púrpura intenso en el tubo en el paso número 5 pondrá de
manifiesto la presencia de glicina, dando como resultado una prueba positiva.
- La aparición de un precipitado marrón en el tubo durante el paso número 6 (durante 10
minutos*) pondrá de manifiesto la presencia de benzoato, dando como resultado una
prueba positiva.
*NOTA: Si el hipurato no se hidroliza, tras la adición de los reactivos antes
mencionados, el resultado se considera como una prueba negativa.

A B

Figura 18. Resultados posibles a la Hidrólisis del Hipurato11 dónde:

A. Al existir hidrólisis en el paso 6 por causa del benzoato presente se origina un
precipitado de color marrón.
B. Al existir hidrólisis en el paso 5, la glicina originada reacciona con la ninhidrina y
se produce una coloración púrpura

121
 L) Hidrólisis de la Gelatina.
Fundamento. La gelatina es una proteína fibrosa que al enfriarse forma un gel. Ciertas
bacterias tienen habilidad para romper la molécula mediante la exoenzima gelatinasa,
liberando aminoácidos que se usan como nutrientes para el microorganismo.
Procedimiento. Sembrar a la bacteria en cuestión, en un tubo con gelatina por picadura,
incubar durante 24-48 horas a 35-37°C. Al pasar dicho tiempo, enfriar al menos 5 minutos
para comprobar la formación del gel.

Figura 19. Licuefacción de la gelatina6.

Interpretación de resultados.
Si se hidroliza la gelatina, el tubo permanece líquido cuando se refrigera considerado como
un resultado positivo.
Si el tubo permanece gelificado después de haberse enfriado se considera un resultado
negativo.
NOTA: Evitar agitar el tubo en tanto su contenido permanezca líquido. Si la
fluidificación de la gelatina procede lentamente como generalmente
ocurre, la agitación puede mezclar la gelatina hidrolizada con la no
hidrolizada, dando lugar a una mezcla que se solidifica y da una reacción
falsa negativa.

Figura 20. Resultado positivo y negativo a la prueba, donde se denota la gelificación en el tubo
negativo y la hidrólisis de la gelatina en el tubo positivo11.

122
 M) Prueba de KIA.
Fundamento. En presencia de tiosulfato en el medio o en la degradación de proteínas que
liberan aminoácidos azufrados, algunos microorganismos forman H 2S gaseoso por medio de
las enzimas tiosulfato reductasa y cisteína desulfurilasa. El gas incoloro H 2S se forma en
condiciones ácidas y reacciona con el citrato de amonio férrico para producir un
precipitado negro insoluble de sulfuro ferroso metálico.
Con respecto a la fermentación de los carbohidratos presentes en el medio:
1. Las bacterias incapaces de fermentar utilizan
las peptonas presentes y liberan aminas que
1
alcalinizan todo el medio.
2. A) Las bacterias que solo fermentan la glucosa,
inicialmente utilizan aeróbicamente a la misma
dando una acidificación del medio.
B) Debido a la baja concentración de glucosa
2 A)
(0.1%), metabolizan las peptonas presentes y
alcalinizan finalmente la superficie del medio.
3. Las bacterias fermentadoras de glucosa y
2 B)
lactosa, fermentan la glucosa 0.1% y al término de
esta, fermentan la lactosa 1%, permitiendo la
acidificación completa del medio.
3
Figura 21. Interpretación de resultados en la Prueba de
KIA13.
Procedimiento. Inoculación de la bacteria en cuestión, por picadura y estría en el Medio
de KIA. Incubar a 35-37°C durante 18 horas o hasta las 24 horas y observar resultados.
Interpretación de resultados.
- Fermentación.
1.- Ác/Ác
2.- Alc/Ác
3.- Alc/Alc*
NOTA: Ác = Ácido Alc = Alcalino
- Sulfhídrico.
Positivo = Coloración negra
Negativo = Medio incoloro
- Formación de gas.
Positivo = Formación de burbujas en el medio que
hacen que este se desplace hacia la superficie del
tubo.
Negativo = Medio sin burbujas o cambio de
posición del mismo.

Figura 22. Diversos resultados que pueden observarse al

realizar la prueba de KIA2.

123
 N) Prueba de LIA (Agar de Hierro y Lisina)
Fundamento. Algunos microorganismos son capaces de provocar la descarboxilación de
los aminoácidos por inducción de enzimas específicas, el resultado de esta
descarboxilación es la producción de una amina (o diamina) y dióxido de carbono. Tal es
el caso de la producción de la enzima lisina descarboxilasa la cual al actuar sobre la lisina
produce una diamina llamada cadaverina. En el medio LIA se puede detectar la
producción de la lisina descarboxilasa ya que se produce una reacción coloreada por un
cambio en el pH del medio, que contiene como indicador púrpura de bromocresol. Un
cambio del color original del medio (morado) hacia amarillo en el fondo indica una
reacción ácida por la fermentación de una pequeña cantidad de glucosa en el medio.
Si el microorganismo produce lisina descarboxilasa, la acción de esta enzima sobre la lisina
dará lugar a la cadaverina, la cual provocará un cambio de pH hacia la alcalinidad dando
un color morado que sobrepasa la acidez debida a la glucosa. Así pues, un fondo amarillo
indica que no se produce lisina descarboxilasa y un color morado que si es producida.

A*
B**

A* = Lisina Descarboxilasa
B** = CO2
Figura 23. Descarboxilación del aminoácido L-Lisina6.

Procedimiento. Por punción profunda con asa bacteriológica recta incubar en aerobiosis,
durante 18-24 horas a 35-37 °C.
Interpretación de resultados.
1.- Decarboxilación de la lisina.
1 A) 1 B) 2 A) Negativa. Pico violeta/fondo amarillo.
B) Positiva. Pico violeta/fondo violeta.
2.- Producción de ácido sulfhídrico.
Positiva. Ennegrecimiento del medio.
NOTA: Especialmente en el
límite del pico y fondo.
Negativo. Sin presencia de ennegrecimiento.

Figura 24. Interpretación de resultados sobre la prueba de

LIA11.

124
 O) Prueba de Malonatos.
Fundamento. La prueba pone en evidencia la capacidad de las bacterias de utilizar
malonato como fuente de carbono. Las cantidades mínimas de glucosa del medio,
permiten el desarrollo de organismos que no pueden usar malonato o sales de amonio, sin
embargo esos organismos no pueden mantener un pH alcalino. La producción de ácido
por la fermentación de la glucosa impide una posible alcalinización. Solamente los
microorganismos que pueden usar simultáneamente malonato de sodio como fuente de
carbono y sulfato de amonio como fuente de nitrógeno son capaces de ejercer una acción
buffer produciendo hidróxido de sodio. El aumento de la alcalinidad resultante hace que el
azul de bromotimol cambie de verde a azul.
Procedimiento. Inoculo pesado de la bacteria en estudio sobre el Caldo Malonato e
incubar a 35-37º C por 18-24 horas.
Interpretación de resultados.
Positivo. Crecimiento y coloración azul en el medio, alcalinidad.
Negativo. El medio permanece de color verde debido a que no hay desarrollo bacteriano
capaz de degradar al malonato y por tanto no hay cambio de color.

Positivo Negativo

Figura 25. Resultado positivo VS resultado negativo a la prueba de Malonatos.

125
 P) Prueba de MIO (Movilidad, Indol y Ornitina).
Fundamento. Este medio como su nombre lo indica sirve para observar la movilidad, la
producción de indol y la descarboxilación de la ornitina.
- La movilidad se detectará por la presencia de turbidez alrededor del punto de
inoculación.
- El indol se forma si la bacteria tiene la capacidad de producir la enzima triptofanasa que
desdobla el aminoácido triptófano en indol, ácido pirúvico y amonio. El indol es incoloro
pero al reaccionar con el reactivo de Kovac’s o Ehrlich (p-dimetil-aminobenzaldehído), que
se adiciona después del periodo de incubación, da un color rojo violeta.

Figura 26. Base bioquímica de la prueba de indol 6.

- La descarboxilación de la ornitina se detecta debido a que el medio tiene el indicador

púrpura de bromocresol y una pequeña cantidad de glucosa, cuando esta se fermenta se
produce un color amarillo en el fondo (ornitina descarboxilasa negativa), sin embargo al
descarboxilarse la ornitina se produce putrescina la cual es alcalina y sobrepasa la acidez
dada por la fermentación de las glucosa resultando en un color morado en el fondo.

A*
B**

A* = Ornitina Descarboxilasa B** = CO2

Figura 27. Descarboxilación del amino ácido L-Ornitina6.

Procedimiento. A partir de un cultivo puro del microorganismo en estudio, inocular por

picadura con asa recta, incubar en anaerobiosis*, durante 18-24 horas a 35-37 °C.
Adicionar, 2 gotas del reactivo de Ehrlich o Kovac’s que contiene DMBA
(p-dimetilaminobenzaldehído) y observar resultados.
*NOTA: La anaerobiosis se puede lograr agregando 0.5mL de aceite
mineral al tubo con el medio MIO.

126
Interpretación de resultados.
1.- Movilidad.
Positivo. Presencia de turbidez o crecimiento más allá de la línea de siembra.
Negativo. Crecimiento solamente en la línea de siembra.
2. - Prueba del indol*.
Positivo. Color rojo al agregar el reactivo revelador.
Negativo. El color del reactivo revelador permanece incoloro-amarillento.
*NOTA: Esta prueba regularmente no se realiza en este medio debido a la
adición del aceite mineral, pues puede arrojar falsos positivos.
3.- Ornitina descarboxilasa*.
Positivo. Color púrpura.
Negativo. Color amarillo.
*NOTA: A veces se puede desarrollar un color violáceo en la superficie del medio.

Figura 28. Prueba de MIO11 donde se puede observar:

-Movilidad Positiva
-Indol Positivo
-Descarboxilación de la Ornitina positiva

127
 Q) Prueba de MR-VP (Voges-Proskauer).
Fundamento.
 Fermentación ácido mixta. Los productos finales son ácidos orgánicos que provocan
un descenso brusco del pH inicial del medio (viraje del indicador de amarillo pH por
encima de 5.1) y rojo (pH por debajo de 4.4). Estos microorganismos por cada 4
moléculas de piruvato formadas, reducen dos a ácido láctico y dos las metabolizan
para formar ácido acético y fórmico; parte del acetato pasa a etanol y parte del
fórmico a CO2 y H2 en cantidades iguales. Siendo revelado con la adición del
indicador de pH Rojo de Metilo.
 Fermentación butilenglicólica. En ésta, parte del piruvato se metaboliza
produciendo cantidades menores de ácido láctico, fórmico y acético, la mayor
parte del piruvato se condensa formando acetilmetilcarbinol, que es reducido a 2,3-
butilenglicol, productos que son neutros. Para determinar la presencia de los
productos neutros (prueba de Voges-Proskauer). Se agrega un poco de α-naftol al
5% en etanol (medio adquiere aspecto lechoso), luego se le añade (KOH 40%) que
desaparece el aspecto lechoso, se agita fuertemente.

Acetil-metil- A* 2-3 Butanodiol

Fermentación
Glucosa carbinol + H20 + CO2
Butilenglicólica
(Acetoína) + Etanol

A* = -naftol + KOH al 40%.

Figura 29. Fundamento de la reacción de Voges-Proskauer.

Ácido láctico + Ácido

Fermentación acético + Ácido
Glucosa succínico
Ácido mixta
+ CO2 + H20 + Etanol

A*
Color rojo pH ácido ↓

A* = rojo de metilo
Figura 30. Fundamento de la reacción de Rojo de Metilo.

Procedimiento. Sembrar por inóculo pesado el medio MR-VP, a partir del cultivo en estudio.
Incubar a 35-37°C por 48 horas. Después, dividir la prueba en 2 partes:
 Prueba del rojo de metilo. Añadir unas gotas de una solución de rojo de metilo al
0.04%, observar la coloración del medio.
 Prueba del Voges-Proskauer. Añadir 2 gotas de -naftol al 5% (en EtOH absoluto)
más 2 gotas de KOH al 40%. Agitar vigorosamente el tubo, destapar el tubo y dejar
a temperatura ambiente durante 10-15 minutos. Observar si hay cambio de color en
la superficie del medio.

128
Interpretación de resultados.
Positivo=Coloración rojiza MR Negativo=Incoloro
Positiva=Color rosado-violáceo en la parte superior del tubo VP Negativa=Incoloro

Figura 31. Diferentes resultados a la prueba de MR-VP7 donde:

A) Resultado negativo a la prueba Rojo de Metilo debido a la existencia de un pH neutro en el
medio.
B) Resultado positivo a la prueba Rojo de Metilo debido a la formación de productos ácidos
demostrables por el vire del indicador de pH.
C) Resultado positivo a la prueba Voges-Proskauer después de añadir los reactivos de lectura,
formando un color rojo violáceo debido a la fermentación dada.
D) Resultado negativo a la prueba.

129
 R) Prueba de Reducción de Nitratos.
Fundamento. Determinar la capacidad de las bacterias para reducir los nitratos
convirtiéndolos en nitritos o en nitrógeno, es decir, comprobar la presencia de las enzimas
nitrato reductasa y nitrito reductasa. El nitrito reacciona con dos reactivos: ácido sulfanílico
y naftilamina (o dimetil--naftilamina). La reacción de color se debe a la formación de
un compuesto diazonio, p-sulfobenceno-azo-a-naftilamina. Cuando la prueba resulta
negativa para nitritos se utiliza la adición del Zinc para reducir químicamente los nitratos
presentes a nitritos y formar con los reactivos correspondientes el compuesto colorido.

Figura 32. Reacción química para la reducción de nitratos6.

Procedimiento. Inocular un tubo con medio caldo de nitratos con un inoculo de la cepa
problema e incubar a 25-37°C durante 48 horas, en aerobiosis. Después de la incubación:
Fase 1. Agregar 2 gotas del reactivo A (-naftilamina al 0.5% en ácido acético glacial
5N) y 2 gotas del Reactivo B (ácido sulfanílico al 0.8% en ácido acético glacial 5N) y
observar cambio de coloración a rojizo.
Fase 2. Si no aparece una coloración roja, se añade un poco de polvo de Zinc y se
observa si aparece dicha coloración o permanece incoloro.
NOTA: Si la prueba lo requiere, adicionar una campana de Durham en el medio para
observar la formación de gas por acción de las bacterias
Interpretación de resultados.

Prueba positiva = coloración rojo intenso en la fase

número 1.
Prueba negativa = medio incoloro o cambio de
coloración rojiza en la fase número 2.

Figura 33. Prueba de reducción de Nitratos9 donde:

El tubo 2 y 3 dan un resultado positivo
El tubo 1 y 4 dan un resultado negativo

130
 S) Prueba de Sensibilidad a la Bacitracina.

Fundamento. Esta prueba puede utilizarse como diagnóstico presuntivo en la

identificación de Streptococcus  -hemolítico del grupo A de Lancefield (S. pyogenes); ya
que, a diferencia de la mayoría de los estreptococos, suelen ser sensibles a bajas
concentraciones de Bacitracina (sensidiscos que contienen 0.04UI).
Procedimiento. Se realiza un sembrado masivo, tomado con asa bacteriológica de un
cultivo con colonias sospechosas, se estría sobre una placa de Agar Sangre intentando
obtener un cultivo confluente. Luego se coloca el disco de Bacitracina de 0.04UI y se incuba
18-24 horas a 37ºC.
Interpretación de resultados.
La aparición de cualquier diámetro de halo de inhibición de crecimiento alrededor del
disco se considera prueba positiva.

Figura 34. Susceptibilidad de Streptococcus pyogenes a la Bacitracina en Agar Sangre12.

131
 T) Prueba de Sensibilidad a la Novobiocina.
Fundamento. Se basa en la capacidad que presentan ciertos microorganismos a la
sensibilidad a la novobiocina.
Procedimiento. Se siembra una placa de Agar Mueller Hinton con un hisopo embebido en
una suspensión proveniente de un tubo con caldo nutritivo igualado al tubo 0.5 del
Nefelómetro de MacFarland (1.5 x 108 UFC) de la cepa a estudiar; luego, se coloca el disco
de novobiocina de 5g y se incuba a 35-37°C por 18 horas.
Interpretación de resultados.
Un halo de inhibición de crecimiento:
Menor o igual a 16mm = Resistente (Staphylococcus saprophyticus)
Mayor de 16mm = Sensible (Otras especies de Staphylococcus)

Figura 35. Agar Mueller Hinton en donde se demuestra la Sensibilidad (lado izquierdo) y la Resistencia
(lado derecho) frente a las especies del género Staphylococcus11.

132
 U) Sensibilidad a la Optoquina.
Fundamento. Se basa en la sensibilidad de Streptococcus pneumoniae a una
concentración menor o igual a 5μg de clorhidrato de etil hidrocupreína (optoquina); puesto
que, no afecta al crecimiento de otros Streptococcus -hemolíticos.
Procedimiento. Estriar un cuadrante de una placa de agar sangre en varias direcciones
con una cepa pura a estudiar, se coloca un disco de optoquina en el centro del área
estriada. Incubar 18-24 horas a 37ºC.
Interpretación de resultados.
Halo de inhibición mayor o igual a los 16mm se considera Sensible a la prueba
(Streptococcus pneumoniae.
Halo menor a los 16mm se considera Resistente a la prueba (Otras especies del género
Streptococcus).

Figura 36. Susceptibilidad de Streptococcus pneumoniae a la Optoquina en el Agar Sangre12.

133
 V) Prueba de SIM.
Fundamento.
 Sulfhídrico. En presencia de tiosulfato en el medio o a la degradación de proteínas
que liberan aminoácidos azufrados, algunos microorganismos forman H 2S gaseoso
por medio de las enzimas tiosulfato reductasa y cisteína desulfurilasa. El gas incoloro
H2S reacciona con el citrato de amonio férrico para producir un precipitado negro
insoluble de sulfuro ferroso.

Figura 37. 1ª etapa de la reacción bioquímica de la obtención de H2S6.

Figura 38. 2ª etapa de la reacción bioquímica de la obtención de H2S6.

 Indol. Las enzimas triptofanasas oxidan el triptófano para formar tres metabolitos:
indol, metil indol y ácido indolacético. Los reactivos de Ehrlich o Kovac’s contienen
DMABA (p-dimetilaminobenzaldehído) que reacciona con el indol producido
formado un compuesto quinónico color rojo, que se observa por la aparición de un
anillo en la superficie del medio.

Figura 39. Base bioquímica de la prueba de indol 6.

 Motilidad. El medio de cultivo tiene consistencia semisólida por lo que la movilidad

se observa por el crecimiento del microorganismo en todo el tubo, más allá de la
zona de inoculación (picadura). Los microorganismos inmóviles solo crecerán en la
zona inoculada.
Procedimiento. Inoculación de la bacteria en cuestión, por picadura en el Medio de SIM.
Incubar a 37°C durante 24 horas; adicionar, 2 gotas del reactivo de Ehrlich que contiene
DMBA (p-dimetilaminobenzaldehído) y observar resultados.

134
Interpretación de resultados.

Positivo=Coloración negra S Negativo=Medio incoloro

Positivo=Anillo de color rojo en la superficie I Negativo=Medio Incoloro
Positivo=Crecimiento más allá de la zona de inoculación M Negativo=Crecimiento sólo en
la zona de inoculación.

A B C D

E F
Figura 40, 41 y 42. Resultados a la prueba de SIM13 donde:
A) Producción de ácido sulfhídrico positiva
B) Producción de ácido sulfhídrico negativa
C) Indol positivo
D) Indol negativo
E) Movilidad positiva
F) Movilidad negativa

135
 W) Prueba de Tolerancia a la Sal (NaCl).
Fundamento. Se basa en la capacidad de los Enterococcus de crecer en una
concentración de 6,5% de NaCl. Se trata de un medio de cultivo líquido que contiene
además de NaCl, glucosa y un indicador de pH: púrpura de bromocresol.
Procedimiento. Se inocula el caldo salado con la cepa problema del Streptococcus a
estudiar y se incuba 18-24 horas a 37ºC.
Interpretación de resultados.
Prueba positiva. Cuando aparece turbidez con o sin acidificación del medio.
Cuando se observa el viraje del indicador de pH de color del púrpura al
color amarillo.
Prueba negativa. Presencia de una coloración púrpura en el medio.

Figura 41. Resultados a la prueba de Tolerancia a la Sal12.

136
 X) Prueba de TSI (Hierro y Triple Azúcar).
Fundamento. El agar TSI es uno de los más usados para ver la fermentación de
carbohidratos donde existen varias posibilidades de fermentación de acuerdo a las
características metabólicas del microorganismo como son:
 Utilización de la glucosa. Los microorganismos que fermentan solo la glucosa
provocan en este medio una reacción alcalina en la superficie (roja) sobre un fondo
ácido (amarillo) debido a que realizan una degradación aeróbica de la glucosa en
la superficie, convirtiendo el piruvato en agua y dióxido de carbono. Después de 18
a 24 horas de incubación como la concentración de glucosa es baja (0.1%), los
microorganismos empiezan a utilizar las peptonas que se encuentran en el medio,
causando la liberación de amoniaco y produciendo un pH alcalino (rojo) gracias al
rojo de fenol que tiene el medio como indicador de pH. En el fondo, como no hay
oxígeno, se realiza una degradación anaeróbica y el piruvato se convierte en
lactato con lo cual el pH disminuye quedando el pH ácido (amarillo).
 Utilización de lactosa y/o sacarosa. Algunos microorganismos tienen la facultad de
fermentar la glucosa y la lactosa resultando una reacción ácida en la superficie
(amarilla) y ácida en el fondo (amarilla). En este caso después de 18 a 24 hrs como
la concentración de lactosa es alta (1.0%), no se ha utilizado completamente y la
acidez persiste tanto en el fondo como en la superficie. En el caso de usar sacarosa
la reacción sería la misma.
 Sin utilización de ninguna de las anteriores. En el caso de no utilizar ninguno de los
carbohidratos presentes (glucosa, lactosa y sacarosa), lo que se usaría serían las
peptonas, ya sea aeróbicamente o anaeróbicamente. Sólo utilizándolas
aeróbicamente daría una superficie alcalina (roja) sobre un fondo sin cambio. Si las
usara aeróbicamente daría una superficie alcalina (rojo) sobre fondo alcalino (rojo).
NOTA: En este medio también es posible detectar la producción de gas por la
formación de burbujas dentro del medio, y la producción de ácido sulfhídrico, el cual
reaccionará con un indicador con base de fierro dando un color negro debido al
sulfuro de hierro formado.
Procedimiento. Inoculación de la bacteria en cuestión, por picadura y estría en el Medio
de TSI. Incubar a 35-37°C durante 18-24 horas y observar resultados.
Interpretación de resultados.
 Fermentación.
1.- Ác/Ác = Glucosa, lactosa y/o sacarosa fermentada.
2.- Alc/Ác = Glucosa fermentada; lactosa y/o sacarosa no fermentada.
3.- Alc/Alc* = Ninguno de los tres glúcidos es fermentado.
*Ác = Ácido Alc = Alcalino
 Sulfhídrico.
Positivo = Coloración negra
Negativo = Medio incoloro
 Formación de gas.
Positivo = Formación de burbujas en el medio que hacen que este se
desplace hacia la superficie del tubo.
Negativo = Medio sin burbujas o cambio de posición del mismo.

137
Figura 42. Diversos resultados a la prueba de TSI12 explicados en la tabla anexa.

138
 Y) Prueba de Urea.
Fundamento. Aquellas bacterias que poseen la enzima ureasa, pueden utilizar el nitrógeno
proveniente de la urea, la hidrolizan, liberando amoníaco y dióxido de carbono. Estos
productos metabólicos alcalinizan el medio, haciendo virar el indicador rojo fenol del
amarillo al rosa/rojo.

Figura 43. Reacción catalizada por la ureasa3.

Procedimiento*.
Urea de Stuart. Sembrar por un inóculo pesado a partir de un cultivo puro de 24 horas de la
cepa problema e incubar a 35-37ºC durante 48 horas, en aerobiosis. Observar el tubo a las
12 y 24 horas de incubación.
Urea de Christensen. Sembrar un inóculo por estriado en la superficie del tubo, incubar a
35-37ºC durante 48 horas, en aerobiosis. Observar el tubo a las 8, 12, 24 y 48 horas de
incubación. Para aquellos microorganismos que hidrolizan lentamente la urea, incubar
hasta 72 horas.
*NOTA: Aplicar la metodología necesaria para las necesidades de la bacteria problema.
Interpretación de resultados.
Prueba positiva = coloración rosada
Prueba negativo = coloración amarilla

Urea de Stuart Urea de Christensen

(+) (-) (-) (+)

Figura 44 y 45. Resultado positivo y negativo a la prueba de Urea13.

139
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.

1. Alarcón, L. & Olivas, E. (2011). Manual de prácticas de Microbiología básica y

Microbiología de alimentos. Programa de Nutrición. 3ª ed. Chihuahua, México:
Universidad Autónoma de Ciudad Juárez.
2. Bailón, L. González, R. Cervantes, A. (2005). Atlas de Pruebas Bioquímicas para
Identificar Bacterias. 2ª ed. Distrito federal, México: UNAM.
3. Bolaños, N., Lutz, G. & Herrera, C. (2010). Química de Alimentos: Manual de
laboratorio. 3ª ed. Costa Rica: Universidad de Costa Rica.
4. Club de Informática Médica y Telemedicina (Universidad de Panamá). Prueba de
CAMP para Streptococcus Beta-Hemolíticos. [en línea]. 2009(10). Consultado el 26
de agosto de 2017 Obtenido de:
http://www.telmeds.org/atlas/bacteriologia/cocos-gram-positivos-piogenos-de-
importancia-medica/prueba-de-camp-para-streptococcus-beta-hemoliticos/
5. Koneman. (2006). Diagnóstico bacteriológico: texto y atlas a color. 6ta ed. Buenos
Aires, Argentina: Médica Panamericana.
6. MacFadin. (2003). Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de
importancia clínica. 3ra ed. Buenos Aires, Argentina: Médica Panamericana.
7. MicrobeWorld. Methyl Red/Vogoes-Proskauer. [en línea]. Consultado el 27 de
agosto de 2017. Obtenido de: http://2fwww.microbeworld.org
8. NOM-143-SSA1-1995. (1995). Método de prueba microbiológico para alimentos.
Determinación de Listeria monocytogenes [documento en línea]. Consultado en 30
de enero de 2017. Disponible en: http://www.
salud.gob.mx/unidades/cdi/nom/143ssa15.html.
9. Nutrición Microbiana. Grupos Nutricionales de los Microorganismos. [en línea].
Consultado el 25 de agosto de 2017. Obtenido de:
http://slideplayer.es/slide/1722927/
10. Rodríguez, E., Gamboa, M., Hernández, F. & García, J. (2010). Bacteriología General:
Principios y Prácticas de Laboratorio. 2ª ed. Costa Rica: Universidad de Costa Rica.
11. Sosa, M. Pruebas Bioquímicas de Identificación. [en línea]. Consultado el 25 de
agosto de 2017. Obtenido de:
https://es.slideshare.net/StephaneLovon/pruebasbioquimicasdeidentificacion2433
38506-16283374
12. Universidad Centro Occidental “Lisandro Alvarado”. Microbiología Médica I. [en
línea]. Consultado el 23 de agosto de 2017. Obtenido de:
http://slideplayer.es/slide/1086796/
13. UNAM. Pruebas Bioquímicas. [en línea]. Consultado el 09 de enero de 2017.
Disponible en:
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/U3c_PruebasBioquimicas_17461.PDF

140
 ANEXO M
Realización de Pruebas
Bioquímicas Especiales
A) Prueba del Hilo mucoide o perlado.
Fundamento. Las células bacterianas se lisan por efecto del desoxicolato de sodio, el
DNA liberado ocasionará que la mezcla se haga viscosa. Al retirar lentamente el asa se
formará un “hilo” mucoide. La mayor parte del género Vibrio son positivos.
Procedimiento. Suspender algunas colonias de Vibrio en una gota de solución acuosa
de desoxicolato de sodio al 0.5% en un portaobjetos. Mezclar y observar la formación de
un hilo al retirar el asa bacteriológica.
NOTA: Levantar el asa despacio para evitar la ruptura del hilo viscoso.
Interpretación de resultados.
Positivo = Formación del hilo mucoide
Negativo = No hay presencia de mezcla viscosa

Figura 1. Se muestra una prueba de hilo mucoide positiva para Vibrio cholerae, la cual es un
método rápido y sencillo para distinguir al género Vibrio.6

141
 B) Prueba de la Leche Tornasolada.
Fundamento. Permite diferenciar organismos, como lo son los clostridios, sobre la base de
sus múltiples reacciones metabólicas en un medio lácteo como: fermentación de lactosa,
caseólisis y coagulación de la caseína. El tornasol incorporado a la leche es un indicador
de pH y de óxido-reducción que hace que el medio pueda indicar diversas funciones
metabólicas. La leche contiene lactosa, caseína, lactalbúmina y lactoglobulina, por lo
tanto, un organismo puede mostrar una o varias propiedades metabólicas en la leche
tornasolada ayudando así a la identificación bacteriana:
1. Fermentación de lactosa. Cuando un organismo es capaz de fermentar lactosa,
produce principalmente ácido láctico, con una condición ácida indicada por el
cambio de color del medio que se vuelve rojo rosado.

Lactosa → Glucosa + Galactosa

Glucosa → Ácido Pirúvico → Ácido Láctico + Ácido Butírico +

vvvvvvvvvCO2 + H2O
Figura 5. Fermentación de la lactosa.
Figura 2. Fermentación de la lactosa.
2. Reducción del tornasol. El tornasol es un indicador de pH donde algunos organismos
son capaces de reducir el tornasol a una leucobase.
3. Formación de coágulo. Las enzimas proteolíticas provocan la hidrólisis de las
proteínas de la leche lo que da como resultado su coagulación. La principal enzima
responsable de la formación de coágulo es la renina. La formación del coágulo es
causada por la precipitación de la caseína, por la formación de ácidos o por la
conversión de la caseína en paracaseína por la enzima renina. La caseína es una
fosfoproteína compleja y es la proteína más importante de la leche.
Caseína + Calcio Renina Paracaseína (pp)

Figura 3. Formación del coágulo dada por la enzima renina.

4. Formación de gas. Los gases CO2 y H2 se forman como resultado final de la

fermentación de la lactosa.
Procedimiento. Sembrar por un inóculo denso a partir de un cultivo puro de 24 horas de la
cepa problema e incubar a 35-37ºC durante 18-48 horas. Adicionar una campana de
Durham en el medio para observar la formación de gas.
Interpretación de resultados.
 Coloración.
-Rojo rosado (A). Ácido; fermentador de lactosa
-Azul purpúreo (SC). No fermentación de lactosa; sin cambio del indicador de pH.
-Azul (K). Alcalino; ausencia fermentación lactosa. El organismo ataca las sustancias
nitrogenadas que se encuentran en el medio.
-Blanco(Red). Reducción del tornasol a una leucobase.
 Formación de coágulo (C). Coagulación de la proteína de la leche.
 Gas (G). Producción de burbujas en la campana de Durham.

142
Figura 4. Demostración de la utilidad y de los diversos parámetros que evalúa la prueba de
la leche tornasolada3.

143
 C) Medio de Carne Cocida (Cooked Meat).
Fundamento. El medio de carne cocida es un medio de enriquecimiento utilizado para el
cultivo de microorganismos anaerobios, especialmente los pertenecientes al género
Clostridium. Este medio de cultivo contiene sustancias reductoras que favorecen el
crecimiento de microorganismos anaerobios estrictos. La disponibilidad de los grupos
sulfidrilos que aumentan el efecto reductor es mayor en la proteína desnaturalizada, por
ello en este medio se utiliza carne cocida.
Procedimiento.
1.- Adicionar a un tubo de carne cocina 0.5 cm aproximadamente de tierra que no se
encuentre húmeda y a una profundidad de 10 cm de la superficie.
2.- Calentar a 100°C durante 10 minutos y dejar enfriar posteriormente a temperatura
ambiente.
3.- Incubar a 35-37°C durante 24-48 horas.
4.- Tomar una impronta con un asa y realizar una tinción de Gram
5.- Observar a 40X y 100X.
Interpretación de resultados.
En el cultivo de clostridios, los organismos sacarolíticos habitualmente producen ácido y gas.
El crecimiento de organismos proteolíticos se caracteriza generalmente por el
oscurecimiento y dilución de las partículas de carne.

A B

Figura 5. Medio de Cooked Meat 4:

A) Medio sin inocular
B) Crecimiento de Clostridium spp.

144
 D) Prueba de Satelitismo.
Fundamento. Haemophilus influenzae requiere los factores hemina y NAD para su
crecimiento. No obstante, otras especies de Haemophilus requieren sólo NAD. Las especies
que requieren NAD no crecen en agar sangre a menos que sean hemolíticos y puedan
liberar el NAD de los glóbulos rojos. Sin embargo, crecen bien en agar sangre cerca de
colonias de estafilococos, los cuales son capaces de proveer el NAD. El NAD se difunde en
el medio alrededor de la cepa de Staphylococcus aureus y estimula el crecimiento de
Haemophilus en la zona adyacente. Esto es conocido como satelitismo. Para
Haemophilus spp, la prueba de satelitismo sustituye la prueba del factor V y no requiere la
compra de reactivos.
Procedimiento.
1.- Siembre por confluencia la cepa a evaluar en agar sangre.
2.- Realice dos estrías formando una cruz con una cepa de Staphylococcus aureus.
3.- Incube las cajas durante 24 horas a 35oC o 37oC en CO2 al 5%.
4.- Examine la presencia de colonias satélites alrededor de la cepa de
Staphylococcus aureus.
Interpretación de resultados.
Positivo: Crecimiento de colonias pequeñas alrededor de la cepa de
Staphylococcus aureus.
Negativo: Crecimiento de colonias en el medio sin ninguna concentración particular
alrededor de la cepa de Staphylococcus aureus.
NOTA:
*Haemophilus ducreyi no requiere el factor V, pero debido a su
naturaleza exigente no crecen en agar sangre, ni alrededor de la
cepa de Staphylococcus aureus.
*Haemophilus haemolyticus y Haemophilus parahaemolyticus
pueden crecer sin Staphylococcus aureus y no demuestran el
fenómeno de satelitismo aunque requieren el factor V. Ambos son
hemolíticos y pueden liberar el NAD al medio.

Figura 6. Crecimiento de las colonias de H. influenzae alrededor de la estría de S. aureus.2

145
 E) Tinción de esporas (técnica de Schaeffer y Fulton).
Fundamento. Las endoesporas son formas de resistencia, que son más resistentes a
condiciones adversas, entre ellas al calor, las radiaciones y los desinfectantes. Ocupan una
posición característica dentro de la célula, puede ser terminal, subterminal o central. La
localizacion y el tamaño de la espora varía con la especie bacteriana y generalmente estas
caracteristicas son de valor para su identificación.
Las endoesporas bacterianas son altamente deshidratadas y con una serie de cubiertas
muy poco permeables, lo que hace que sean difíciles de teñir, excepto si se calienta la
preparación para permeabilizarlas. La aplicación de un solo colorante a la célula bacterina
que contiene una endospora, solo tiñe la célula, pero la espora se mantiene incolora, para
lograr introducir el colorante dentro de la espora es necesario aplicar calor. La tinción de
Schaeffer y Fulton emplea verde de malaquita como colorante primario, el cual es
eliminado posteriormente del resto de la célula bacterina, pero no de la espora, mediante
un enguaje con agua. Como contratinción se emplea safranina, la cual tiñe la forma
vegetativa.
Procedimiento.
1.- Realizar un extendido de las bacterias y fijarlo a la llama.
2.- Cubrir con verde de malaquita y calentar durante 10 minutos aplicando la llama de un
mechero o hispo impregando en alcohol por debajo de la lámina. Debe haber emisión de
vapor sin que la preparación llegue a hervir o secarse. Adicionar más colorante cuando se
esté secando.
3.- Dejar enfriar la lámina por 1 o 2 minutos. Lavar con agua corriente por 30 segundos.
4.- Cubrir la preparación con safranina por 30 segundos.
5.- Lavar, escurrir, limpiar el reverso, dejar secar y observar al microscopio (1000X).
Interpretación de resultados. Observar al microscopio la presencia de esporas ya sean
terminales, subterminales o centrales.

Figura 7. Localización y mofología de la esporas en Bacillus8.

Figura 8. Tinciones3 observadas con el objetivo 100X.

146
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.

1. Alarcón, L. & Olivas, E. (2011). Manual de prácticas de Microbiología básica y

Microbiología de alimentos. Programa de Nutrición. 3ª ed. Chihuahua, México:
Universidad Autónoma de Ciudad Juárez.
2. Bacteriología y Laboratorio Clínico. Haemophilus Influenzae y otros Haemophilus.
[en línea]. Consultado el 13 de agosto de 2017. Obtenido de:
https://es.slideshare.net/luzmerymd3/haemophilus-influenzae-y-otros-haemophilus-
spp-exposicion-modo-de-compatibilidad
3. Bailón, L. González, R. Cervantes, A. (2005). Atlas de Pruebas Bioquímicas para
Identificar Bacterias. 2ª ed. Distrito Federal, México: UNAM.
4. Becton, Dickinson and Company. Cooked Meat Medium. [en línea]. Consultado el
31 de mayo de 2017. Obtenido de:
http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedraMicro/10_C
ookedMeatMedium.pdf
5. Bolaños, N., Lutz, G. & Herrera, C. (2010). Química de Alimentos: Manual de
laboratorio. 3ª ed. Costa Rica: Universidad de Costa Rica.
6. Identificación de Vibrio cholerae en el Laboratorio. [en línea]. Consultado el 14 de
agosto de 2017. Obtenido de:
https://www.cdc.gov/cholera/pdf/es/identificaci%C3%B3n-de-vibrio-cholerae-en-
ellaboratorio-cap%C3%ADtulo-6.pdf
7. Koneman. (2006). Diagnóstico bacteriológico: texto y atlas a color. 6ta ed. Buenos
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8. Laboratorio de Microbiología. Tinciones Selectivas. [en línea]. Consultado el 11 de
agosto de 2017. Obtenido de:
http://microbiologiaulat2013.blogspot.mx/2013/12/tinciones-selectivas.html
9. MacFadin. (2003). Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de
importancia clínica. 3ra ed. Buenos Aires, Argentina: Médica Panamericana.
10. Rodríguez, E., Gamboa, M., Hernández, F. & García, J. (2010). Bacteriología General:
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11. UNAM. Pruebas Bioquímicas. [en línea]. Consultado el 09 de enero de 2017.
Disponible en:
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/U3c_PruebasBioquimicas_17461.PDF

147