Trabajo Practico N°5: Aislamiento de Microorganismos

Aislamiento y caracterización de microorganismos

Ecología microbiana: Estudio de las interrelaciones de los microorganismos y su medio ambiente bajo determinadas
condiciones físicas, químicas y biológicas. Su objetivo es lograr un conocimiento que contribuya al control de especies
patógenas, mejorar el rendimiento de reacciones fermentativas y a mejorar la producción en la industria alimenticia.

Para ello se debe determinar que microorganismos viven en un habitad dado y para eso es necesario aislarlos en
cultivos puros. Esto puede ser realizado mediante características particulares como requerimientos nutricionales o de
temperatura, productos metabólicos, con el objetivo de favorecer el desarrollo de un microorganismo sobre sus
competidores. Por ejemplo: a pH 4 no crecen la mayoría de bacterias, promoviendo el de levaduras y mohos.

La identificación de bacterias está basada en: morfología, fisiología, patogenicidad, serología e información molecular.

Para asegurar cultivos puros, frecuentemente se estría un medio solido con un inoculo procedente de un medio liquido
de enriquecimiento. Una o dos transferencias del cultivo a través de un medio liquido eliminan a la mayoría de los
microorganismos competidores. Los medios selectivos y los de enriquecimiento deben aproximarse a los
requerimientos nutricionales mínimos de una especie para evitar el crecimiento de una población heterogénea.

Consideraciones que ayudan a detectar y aislar cierta clase de organismos:

• Elección de la muestra adecuada.

• Tratamiento especial de la muestra:
o Secado de muestras de suelo para esporulantes.
o Filtración de muestras de agua.
o Centrifugación.
o Etc.
• ¿Enriquecimiento o siembra directa? Cuando se deben llevar a cabo recuentos de microorganismos (o si el
microorganismo de interés es muy abundante), la muestra no se somete a enriquecimiento y se siembra
directamente en placa. Con frecuencia, la muestra se inocula en un medio líquido, proceso llamado
enriquecimiento. Si este medio liquido tiene condiciones que suprimen el crecimiento de competidores, se
denomina enriquecimiento selectivo.
• Formulación adecuada del medio de aislamiento. La técnica de aislamiento se repetirá tantas veces como sea
necesario hasta obtener un cultivo puro o axénico. La selectividad puede alcanzarse:
o Agregando un agente selectivo.
o Haciendo el medio restrictivo, ya sea por inclusión de un nutriente que solo unos pocos organismos
sean capaces de utilizar o excluyendo nutrientes.
• Condiciones de incubación: Temperatura, oxigeno, luz o dióxido de carbono.

Detección de los microorganismos buscados:

• Apariencia de las colonias.

• Presencia de endosporas en microscopio.
• Forma, tamaño y distribución de las células.
• Movilidad por observación en montaje húmedo.
• Pigmentos difusibles al medio.

Condiciones de cultivo: Dependen de los requerimientos del microorganismo a aislar y de la flora acompañante. Es
necesario conocer el metabolismo.

• Medio de cultivo adecuado.

o Disponibilidad de nutrientes (C, N, sales, vitaminas).
o Esterilidad.
o pH.
o Humedad.
• Temperatura de incubación adecuada: Va a depender de la
temperatura óptima de crecimiento del microorganismo.
 • Disponibilidad de oxígeno, va a depender del metabolismo del microorganismo.
o Aerobios estrictos/obligados: Dependen del oxígeno para crecer (aceptor final de electrones).
o Anaerobios facultativos: En presencia de oxígeno realizan respiración aeróbica pero en su ausencia
pueden utilizar otros aceptores de electrones.
o Microaerófilos: Aerobios que no toleran la concentración atmosférica de oxígeno. Suelen requerir
niveles entre el 2% y el 10%.
o Anaerobios aerotolerantes: No utilizan el oxígeno pero tampoco les afecta.
o Anaerobios estrictos/obligados: No toleran el oxígeno y mueren en su presencia. Se colocan en jarras
anaerobias.

Clasificación de los medios de cultivo:

• Según su composición:
o Complejos: Se agregan ingredientes cuya composición exacta se desconoce (extractos, peptonas,
etc.). Ejemplo: Agar MacConkey.
Peptonas son hidrolizados de proteínas preparadas por digestión proteolítica parcial de carne,
caseína, harina de soja, gelatina y otras fuentes de proteínas. Sirven como fuente de carbono, energía
y nitrógeno.
Extracto de carne son extractos acuosos de carne magra de res que contiene aminoácidos, péptidos,
nucleótidos, ácidos orgánicos, vitaminas y minerales.
Extracto de verdura son derivados hidrosolubles de la levadura autolisada. Alto contenido de
vitaminas B, compuestos de nitrógeno y carbono.

o Sintéticos o definidos: Los componentes del medio y sus concentraciones son conocidos. Ej: Caldo M9
con glucosa.

o Semisintéticos.
o También pueden clasificarse en medio mínimo (posee la cantidad mínima de nutrientes requeridos
para el crecimiento, es un medio definido) y medio rico (posee gran variedad de nutrientes y en
abundancia, provenientes de extractos y peptonas, por lo general son medio complejos como LB).
 • Según su utilización o función:
o Soporte: Medios ricos, no selectivos, que sustentan el crecimiento de gran variedad de
microorganismos. Ej.: Agar Nutritivo.
o Enriquecimiento: Se utilizan generalmente como primer paso en el aislamiento. Contienen sustancias
que permiten enriquecer el cultivo en el organismo de interés.
o Selectivos: Poseen sustancias que permiten el crecimiento de un grupo de bacterias y que inhiben el
desarrollo de otros grupos.
o Diferenciales: Contienen compuestos que permiten detectar algún cambio de color en el medio
cuando ocurre una determinada reacción química.
o Transporte: Medios que conservan a los microorganismos durante su transporte pero no sustentan
su crecimiento.
• Según su consistencia:
o Líquidos.
o Solidos.
o Semisólidos.

Aislamiento de bacilos gram negativos de muestras de agua.

El nivel de contaminación fecal es monitoreado contando el número de bacterias no patogénicas o indicadoras. Estas
últimas son casi completamente de origen fecal, se encuentran presentes en grandes números en residuos cloacales
y sobreviven en agua (sin multiplicarse) durante periodos lo suficientemente largos como para ser contados de forma
satisfactoria. La bacteria que mejor satisface esto es E. coli, además suele ser más fácil de aislar debido a su capacidad
de fermentar lactosa. Aunque en la práctica puede ser complicado debido a la presencia de otras bacterias que
también fermentan lactosa y comparten otras características que hacen difícil distinguirlas. Estas bacterias pertenecen
al grupo de las coliformes, bacilos gram negativos enterobacterias que fermentan lactosa para producir acido y gas al
ser incubados durante 48 hs a 37°C.

La calidad del agua también se determina estableciendo la presencia de otros bacilos gram negativos que no son
fermentadores pertenecientes a la familia Pseudomonadaceae y los organismos llamados del grupo de la Burkholderia.
Algunos de estos microorganismos son patógenos oportunistas. Debido a sus bajas exigencias nutricionales, estos
microorganismos pueden formar biofilms que se establecen y desarrollan en cañerías de agua, liberando bacterias en
forma persistente. Son aerobios estrictos no fermentadores. También producen pigmentos (piocianina, pioverdina,
piomelanina y fluoresceína) que fluorescen con la luz UV.

Aislamiento de enterobacterias fermentadoras:

Procedimiento:

• Tomar 10 ml de muestra y sembrar en 10 ml de caldo Mac Conkey 2X.

o Este medio es de enriquecimiento y selección para el aislamiento de enterobacterias.
o Contiene:
▪ Peptona de gelatina
▪ Lactosa
▪ Bilis de Buey (impide crecimiento gram positivas).
▪ Purpura de Bromocresol (indicador de pH). Si se acidifica el medio se vuelve amarillo.
• Incubar por 48 hs a 37°C con campana de Durham
o La campana retiene los gases producidos durante la fermentación.
o Si hay fermentación de lactosa, se acidifica el medio (color amarillo) y se
producen gases.

• Tomar muestra con el ansa y estriar en agar Mac Conkey y agar EMB, incubar a 37°C por 24 hs.
o Agar Mac Conkey es un medio selectivo y diferencial que contiene:
▪ Peptona de Caseína.
▪ Peptona de Carne.
▪ Cloruro de Sodio.
▪ Lactosa.
▪ Sales biliares (impide crecimiento gram positivas).
▪ Cristal violeta (impide crecimiento gram positivas).
▪ Rojo Neutro (Indicador de pH).

Precipitado sales biliares

o Agar EMB es un medio selectivo y diferencial para enterobacterias patógenas, contiene:

▪ Peptona de Carne.
▪ Hidrogenofosfato dipotásico.
▪ Lactosa.
▪ Sacarosa.
▪ Eosina Amarillenta.
▪ Azul de Metileno.
 • Estriar las colonias de interés en Agar nutritivo.

Aislamiento de bacilos Gram negativos respiradores aerobios estrictos (Pseudomonas):

Procedimiento:

• Sembrar 0,5 ml-1 ml de agua en 10 ml de caldo M9. Incubar 48 hs a 42°C.

o Es un medio mínimo salino de enriquecimiento y selección (temperatura y condiciones salinas),
contiene:
▪ Na2HPO4.
▪ KH2PO4.
▪ NH4Cl.
▪ NaCl.
▪ MgSO4.
▪ CaCl2.
▪ Glicerol (puede ser Glucosa o Asparagina).
• Tomar muestra con el ansa y estriar sobre agar Cetrimida. Incubar 48 hs a 37°C.
o Es un medio selectivo para Pseudomonas aeruginosa.
o Contiene:
▪ Peptona de Gelatina como fuente de nitrógeno.
▪ MgCl2.
▪ SO4K2.
▪ Cetrimida (Inhibidor mayoría competidores menos Pseudomonas).
▪ Glicerol (favorece formación de pigmentos verdes característicos de Pseudomonas).
Aislamiento de bacilos gram negativos de muestras de agua.
Staphylococcus aureus es una bacteria comensal muy vulnerable frente a tratamientos térmicos y a casi todos los
agentes sanitizantes. Tiene capacidad de crecer en altas concentraciones de sal y es posible distinguirla de otros
Staphylococcus no patógenos por su capacidad de fermentar manitol y de secretar exoenzimas. Es un coco gram
positivo, aerobio facultativo, fermenta glucosa y genera ácido láctico, resiste altas concentraciones salinas.

Enterococcus faecalis es una bacteria Gram positiva comensal muy resistente a condiciones adversas.

Procedimiento:

1. Agregar 10 g de ricota a un Erlenmeyer con 50 ml de agua peptonada estéril.

2. Agitar e incubar 2 horas a temperatura ambiente.
3. Mezclar 50 ml de caldo cerebro-corazon 2x con 13% de NaCl (SELECCIÓN) con el agua peptonada con ricota
en partes iguales.
Caldo cerebro corazón es un medio de enriquecimiento y selección, tiene:
Infusion de cerebro e infusion de corazón
Peptona de caseina
Digerido peptídico de tejido animal
Glucosa
NaCl (selectivo)
Hidrogenofosfatodisodico
pH = 7,4
4. Incubar 48 horas a 37°C.
5. Si hay crecimiento, tomar una muestra con ansa y estriar en agar manitol salado y Agar Baird Parker.
6. Incubar 48 horas a 37°C.
7. Observar crecimiento:
a. Agar manitol Salado: Es un medio selectivo y diferencial que permite distinguir entre S. aureus y otras
especies no patógenas. Está compuesto de peptona de carne, extracto de carne, NaCl 6,5% (selectivo),
manitol (diferencial) y rojo fenol. Colonias amarillas rodeadas de un halo amarillo (S. aureus: manitol
+) o colonias rojas sin cambio de color en el medio (S. epidermidis: manitol -)

b. Medio Baird-Parker: Es un medio selectivo y diferencial. Contiene LiCl y telurito para la inhibición de
la flora acompañante, en tanto que el piruvato y la glicina actúan favoreciendo el crecimiento de
Staphylococcus. También tiene peptona de carne, extracto de carne, extracto de levadura y yema de
huevo. Debido a la reducción del telurito a teluro, se desarrollan colonias negras. La yema de huevo
es hidrolizada por los patógenos por actividad lecitinasa, también se puede ver una secreción de
lipasas. En este medio: colonias negras con halo (S. aureus: Reduccion de Telurito, lecitinasa-).
Enterococcus faecalis crece muy poco en ambos medios.

8. Estriar las colonias de interés en Agar Nutritivo.

Aislamiento de bacilos Gram positivos esporulados de muestras de arroz
Bacillus cereus es un bacilo gram positivo, aeróbico facultativo, que produce endosporas resistentes a distintos tipos
de estrés. Para distinguir este organismo de otras especies no patogénicas, se analiza la fermentación de manitol y la
secreción de enzimas. B. cereus es manitol negativo, por lo cual el contenido de manitol del medio posibilita la
separación de la flora acompañante manitol positiva, que se caracteriza por un viraje al amarillo del indicador de pH
rojo fenol. La flora usual de acompañamiento es inhibida por el agregado de polimixina al medio, a la que B. cereus es
relativamente resistente. B. cereus produce lecitinasa, esta enzima degrada la lecitina de la yema de huevo y los
productos de degradación insolubles se acumulan alrededor de las colonias formando un precipitado blanco.

Procedimiento:

1. 5g de Arroz en 25 ml de PBS (80°C por 5 minutos). Selección, quedan esporas, elimina vegetativas.
2. 1 ml de sobrenadante en caldo nutritivo. Enriquecimiento.
3. Estriar en Agar Mossel con emulsión de yema de huevo. Selectivo y diferencial. Permite distinguir entre
Bacillus cereus y B. subtilis.
Peptona de carne
Extracto de carne
Manitol (diferencial)
NaCl
Rojo Fenol
Emulsión de yema de huevo (actividad lecitinasa presente en cereus, halos blancos).
Polimixina B (inhibitorio gram negativos, selección).

Aislamiento de bacterias lácticas a partir de verduras fermentadas

Bacterias acido lácticas son gram positivos, bacilos o cocos, microaerófilos o aerotolerantes, fermentan carbohidratos
y producen acido lactico, tolerantes a pH acido.

Para aislarlas se realiza una fermentación de verduras en salmuera y se toman muestras a distintos tiempos, se
siembran en distintos medios.

BALs: Cicloheximida es un inhibidor de hongos y levaduras. Citrato de amonio, acetato de sodio y Tween 80 favorece
crecimiento acido lácticas impidiendo crecimiento flora acompañante. Se cultiva en una frasco de anaerobiosis con un
sobregenerador de microaerobiosis.

Enterobacterias: Agar EMB con cicloheximida.

Hongos y levaduras: Medio YPD compuesto por extracto de levadura, peptona y dextrosa con cloranfenicol para inhibir
crecimiento de bacterias.
Pruebas bioquímicas
Permiten determinar la actividad metabólica de una cepa pura mediante pruebas de crecimiento, motilidad,
producción de pigmentos, sensibilidad a antibióticos, enzimas respiratorias, metabolismo de hidratos de carbono y
uso de compuestos nitrogenados. Son empleadas principalmente en la identificación y clasificación de bacterias y
hongos.

Hidrolisis del Almidón

Hidrolisis producida por una enzima extracelular. El almidón es producido principalmente por plantas superiores y esta
compuesto por dos polímeros de glucosa: amilosa y amilopectina.

Agar Almidón

• Sustrato: Almidon
• Enzima: Amilasa (exoenzima).
• Producto: Glucosa.
• Revelador: Lugol.
• El lugol con el almidon forman un complejo color café-purpura que desaparece cuando el almidon ha sido
degradado.
Catalasa
Cataliza la degradación del H2O2 y se libera oxígeno (se ven burbujas) y agua como producto. El peróxido de hidrogeno
es uno de los productos del metabolismo aeróbico de los hidratos de carbono. La enzima catalasa se encuentra en la
mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas o microaerófilos que poseen citocromo, la excepción es
Streptococcus.

Se puede realizar de distintas maneras, volcar H2O2 sobre la colonia. En los tubos se agrega agua oxigenada. La
producción de burbujas indica la presencia de la enzima catalasa.

Oxidasa
Esta prueba sirve para determinar aquellos organismos que poseen la citocromo C oxidasa en la cadena de transporte
de electrones. Oxida al citocromo para formar agua en el ultimo paso de la cadena. Todas las bacterias que son oxidasa
positiva son aeróbicas y pueden usar oxigeno como aceptor final de electrones en la respiración (no significa que sean
aerobios estrictos). Las bacterias oxidasa negativas pueden ser anaerobias, aerobias estrictas o facultativas (no tienen
la citocromo oxidasa pero pueden utilizar otras oxidasas en la cadena de transporte de electrones).

Se utiliza un compuesto incoloro reducido que se oxida con la citocromo C oxidasa y cambia de color a azul.

Pruebas para la identificación de Enterobacterias

Las enterobacterias son Coco-bacilos Gram negativos, aerobios facultativos (catalasa positivos), fermentadores de
Glucosa y Oxidasa negativos.

• IMViC (4 pruebas):
o Prueba del Indol
 o Rojo Metilo
o Voges Proskauer
o Utilización de Citrato como única fuente de carbono.
• Agar Hierro de Kligler.

Prueba del Indol

Se usa para determinar la capacidad de una bacteria de hidrolizar el aminoácido triptófano. La enzima encargada de
esta reacción es la triptofanasa. El reactivo de Kovacs reacciona con el indol y se forma un producto coloreado rojo.

Rojo de Metilo / Voges Proskauer

Son dos pruebas que se realizan en paralelo. Permite diferenciar entre microorganismos que realizan fermentación
acido mixta (Rojo Metilo positivos) o butilenglicolica (Voges Proskauer positivos) en presencia de glucosa. Se usa el
caldo RM/VP

• Sustrato: Glucosa.
• Vías: Fermentacion acido mixta o butilenglucolica.
• Producto: Ácidos orgánicos o acetoina/2,3-butanodiol.
• Reveladores: Solucion de Rojo de Metil (rojo a pH 4.4 y amarillo a pH 6.2) / Alfa Naftol y KOH 40%.

Rojo de metilo: En la fermentación acido mixta los productos finales son ácidos orgánicos que provocan un brusco
descenso del pH inicial del medio y viraje del indicador rojo metilo de amarillo a rojo. Los productos ácidos son ácido
láctico, ácido acético y fórmico. Parte del acetato pasa a etanol y parte del fórmico a CO2 y H2 en cantidades iguales.
Voges Proskauer: En la fermentación butilenglicolica parte del piruvato se metaboliza produciendo cantidades
menores de acido lactico, formico y acetico, la mayor parte del piruvato se condensa formando acetoina y 2,3-
butanediol, productos que son neutros.

Utilización de Citrato
Permite diferenciar enterobacterias capaces de utilizar citrato como fuente de carbono y energía. Estas
enterobacterias requieren de permeasas y citrasas.

Medio de Citrato de Simmons:

• Sustrato: Citrato de sodio.

• Vía: Varias dependientes del pH del medio.
• Productos: Acetato/formato en condiciones alcalinas y Acetato, CO2, lactato/Acetoina en condiciones acidas.
• Indicador: Azul de bromotimol (verde a pH 6.9 y azul a pH 7.6).

El medio contiene citrato de sodio como única fuente de C y fosfato de amonio como única fuente de N. Las bacterias
capaces de crecer en este medio convierten el amonio a amoniaco e hidróxido de amonio, que alcalinizan el medio,
tornándolo azul. Además, el exceso de dióxido de carbono con el agua y el sodio formando carbonatos que alcalinizan
aún más el medio. Positivos: Klebsiella, Salmonella y Pseudomonas.
Agar hierro de Kligler (KIA)
Es un medio diseñado para diferenciar grupos o géneros de enterobacterias (gram negativas, fermentadores de
glucosa con producción de ácido) y para distinguir entre enterobacterias y otros bacilos gram negativos intestinales.

Permite diferenciar bacterias en base a la fermentación de glucosa, lactosa y la producción de H2S.

Además de los azucares fermentables, hay peptonas de origen animal como fuentes de C y N. Tiosulfato de sodio es
sustrato para la producción de H2S y sales de hierro para detección de H2S. El indicador de pH rojo fenol vira a amarillo
cuando se acidifica el pH, indicativo de fermentación con producción de ácidos.

• Digesto Pancreativo de Caseina 10g.

• Peptonas animales 10g.
• Lactosa 10g.
• Glucosa 10g.
• Citrato de hierro y amonio 0,5g
• NaCl 5g.
• Tiosulfato de sodio 0.5g
 • Agar 15g
• Agua destilada 1L
• pH 7

Posibles resultados:

1. No fermentan nada por lo que no hay acidificación de pH, se va a ver la alcalinizacion. No hay crecimiento en
profundidad, solo en superficie. La superficie se alcaliniza y se ve roja, el fondo también se ve rojo o sin cambio
(rojo-naranja). No ocurrió fermentación de carbohidratos. Las peptonas se metabolizan en condiciones
anaeróbicas y/o aeróbicas (pH alcalino por producción de amoniaco). Ej. Pseudomonas.

2. Únicamente fermentación de glucosa, este microorganismo al principio tiene fermentación de glucosa, pero
hay poca, así que se pone todo amarillo tanto en profundidad como en superficie. Cuando se agota la glucosa
se comienzan a consumir las peptonas del medio, esto genera la alcalinización del medio y se pone rojo. La
superficie se alcaliniza por lo que se ve roja y el fondo acido amarillo con o sin producción de gas (se rompe el
agar). En profundidad el medio sigue amarillo por la poca disponibilidad de oxigeno y el menor crecimiento de
los microorganismos.

3. Fermentadores de lactosa. Puede ocurrir que se quiebre el agar por la formación de gases. La superficie se ve
amarilla al igual que el fondo.

4. Precipitado negro por reducción de azufre inorganico por el tiosulfato de sodio que tenia el medio. En
presencia de sales de hierro se forman los compuestos precipitados negros. Estas reacciones se dan cuando
hay pH acido, por lo que requieren fermentación de glucosa o lactosa. Si se ve rojo se puede decir que el
microorganismo solo fermento la glucosa, si se ve amarillo significa fermentación de lactosa. Se produce H2S
por reducción de azufre inorganico.
Motilidad

Análisis secuencias RNAr 16S

El RNAr 16S forma parte de la subunidad menor del ribosoma, esta acopado con 21 proteínas. Se secuencia el gen rrs
(que codifica para el 16S) utilizando oligonucleótidos específicos y PCR. Es un gen que tiene 1500pb.

El gen contiene regiones conservadas y regiones variables, estas ultimas se utilizan para la identificación de
microorganismos.

¿Por qué usar esta secuencia?

1. Se trata de una molécula muy antigua, presente en todas las bacterias actuales.
2. Los cambios ocurren de manera suficientemente lenta como para aportar información acerca de todos los
procariotas a lo largo de su escala evolutiva. Sin embargo, contienen suficiente variabilidad para diferenciar
organismos.
3. El tamaño relativamente largo minimiza las fluctuaciones estadísticas.
4. La conservación en estructura secundaria puede servir de ayuda en las comparaciones.