Prácticas de Microbiología General FCCBB-UNPRG

PRÁCTICA N° 7.

FORMULACIÓN Y PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

INTRODUCCIÓN

Un medio de cultivo es un sustrato en el que se encuentran presente todas las

sustancias nutritivas necesarias para el crecimiento de determinados microorganismos
bajo determinadas condiciones físico-químicas. Entendemos por crecimiento
microbiano el aumento del número de microorganismos a lo largo del tiempo. Por
tanto, no nos referimos al crecimiento de un único microorganismo que
denominaremos ciclo celular, sino al demográfico de una población.

La composición química de los medios de cultivo es variada, pero, de manera general,

todos ellos contienen una fuente de energía (compuesto orgánico o inorgánico), una
fuente carbonada (algunas veces un mismo compuesto puede servir de fuente de
energía y fuente carbonada), sales minerales, vitaminas y agua.

Básicamente un medio de cultivo está constituido por:

Extractos
Son infusiones de carnes, de plantas o de levaduras que producen preparados
acuosos comúnmente utilizados como base nutritiva en los medios de cultivo. Estos
productos contienen aminoácidos, péptidos de bajo peso molecular, carbohidratos,
vitaminas y minerales.

Peptonas -Triptona
Son los productos que se obtienen por la degradación proteolítica de proteínas de
diversos orígenes (carne, soja, malta, caseína, etc), obtenidas por digestión péptica,
tríptica, pancreática, etc. El producto obtenido es rico en aminoácidos libres y péptidos
de pequeño peso molecular. Es utilizado como fuente de Nitrógeno por gran diversidad
de organismos.

Agar-Agar
Poligalactósido que se obtiene a partir de algas rojas marinas. La mayoría de
microorganismos son incapaces de degradarlo y es utilizado en medios de cultivo
como agente solidificante.

HISTORIA Y EVOLUCIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO MICROBIANOS

(1839) Brefeld, que consiguió aislar y cultivar esporas de hongos en medios sólidos
realizados a base de gelatina.

(1840) Loeffler, diseña un caldo de carne líquido como base nutricional para el
aislamiento de bacterias.

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(1878) Lister, popularizó un método enfocado al cultivo puro basado en diluciones

seriadas en un medio líquido.

(1881) Koch utiliza en un primer momento rodajas de papa como soporte nutritivo
sólido, recurriendo luego al caldo de carne líquido, diseñado por Loeffler, al que
añadió gelatina, logrando un medio sólido transparente.

En el año (1882) tiene lugar uno de los grandes avances de la microbiología en

relación con los medios de cultivo: el médico alemán Walther Hesse introduce el agar-
agar (polisacárido extraído de algas rojas) como sustancia solidificante.

(1887) Richard Petri, ayudante de Koch, diseña y utiliza placas de cristal planas,
llamadas desde entonces placas de Petri, para sustituir a las clásicas bandejas de
vidrio cubiertas con campanas.

(1888) Beijerinck y Winogradsky, realizando sus investigaciones sobre las bacterias

quimioautótrofas, utilizaron nitrógeno y azufre a los medios de cultivo, iniciando el
desarrollo de los medios selectivos y de enriquecimiento.

En (1892) Charles Würtz impulsó el uso de los medios diferenciales, incorporando

indicadores de pH a la composición de ciertos medios con lo cual se podía observar la
producción de ácidos en la fermentación en ciertos microorganismos.

En (1979) Dr. A. Rambach desarrolla el primer medio de cultivo cromogénico (para la

detección de Escherichia coli, desencadenando una revolución en el diagnóstico e
identificación de los agentes microbianos dentro del campo clínico y alimentario. Esta
tecnología se basa en el uso de una molécula soluble llamada cromógeno, unida a un
sustrato.

PRESENTACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

1. Medios de cultivo deshidratados

Medios pulverizados o granulados. Deben ser reconstituidos y esterilizados antes
de su uso.

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2. Medios de cultivo listos para usar

Permiten su utilización de forma inmediata o bien con un previo tratamiento.

CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

1. SEGÚN SU ORIGEN:

A. NATURALES: son los preparados a partir de sustancias naturales de origen

animal o vegetal como ser extractos de tejidos o infusiones y cuya composición
química no se conoce exactamente.

B. SINTÉTICOS: son los medios que contienen una composición química definida
cuali y cuantitativamente. Se utilizan para obtener resultados reproducibles.

C. SEMISINTÉTICOS son los sintéticos a los que se les añaden factores de

crecimiento bajo una forma de un extracto orgánico complejo, como por
ejemplo extracto de levadura.

2. SEGÚN SU CONSISTENCIA:

A. LÍQUIDOS “Caldos”, utilizados para suspensiones bacterianas. Ej. Caldo

Peptonado, Caldo Nutritivo, Caldo BHI (infusión cerebro corazón).

B. SÓLIDOS con agente gelificante (agar agar). Ej. Agar Nutritivo, Agar
Tripticasa soya.

C. SEMISÓLIDOS a partir de medios líquidos con menor concentración de

sustancia gelificante. Ej. Medio Amies, Medio SIM, Medio MIO.

3. SEGÚN SU UTILIDAD:

A. Medios comunes:
Son aquellos que poseen los componentes mínimos para que pueda
producirse el crecimiento de microorganismos; permite el desarrollo de una
gran variedad, que no necesiten requerimientos especiales. Ej Agar
nutritivo.

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B. Medios especiales:

 Medios de enriquecimiento:

Son aquellos que, además de las sustancias nutritivas normales,

incorporan una serie de factores indispensables para el crecimiento de
microorganismos exigentes, mejorando su calidad nutricional. Ej. Agar
Sangre, Agar Chocolate.

 Medios selectivos:

Son medios utilizados para favorecer el crecimiento de ciertas bacterias

contenidas en una población polimicrobiana. Se caracterizan por
presentar sustancias que actúan como inhibidores. El fundamento de
estos medios consiste en facilitar nutricionalmente el crecimiento de una
población microbiana específica. Ej. Caldo selenito, Azida de sodio,
Agar Telurito de Potasio.

 Medios diferenciales:

Se utilizan para poner en evidencia características bioquímicas que

ayuden a diferenciar géneros o especies. Se caracterizan por presentar
un indicador de pH. La adición de un azúcar fermentable o un sustrato
metabolizable se utilizan para este fin. Ej. Medio TSI (tres azúcares más
hierro), Caldo lactosado, Caldo úrea, Agar Lisina.

 Medios Selectivos diferenciales:

Se caracterizan por presentar en su composición definida un inhibidor y

un indicador de pH, permitiendo el desarrollo de un determinado grupo
microbiano y así mismo permite diferenciarlos por la utilización del
sustrato metabolizable. Ej. Agar Maconkey, Agar Manitol salado, Agar
SS (Salmonella, Shigella).

C. Medios Cromogénicos:

Se caracterizan por que en su composición presenta una molécula

soluble llamada cromógeno, compuesta de un sustrato, dirigido a una
actividad enzimática específica y un cromóforo. Cuando el conjugado
incoloro es escindido por la enzima del organismo objetivo, se libera el
cromóforo y en su forma no conjugada el cromógeno exhibe su color
distintivo, formando un precipitado por su baja solubilidad. El resultado
es una diferenciación muy distintiva y específica basada en el color que
es claramente distinguible.

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CONDICIONES NECESARIAS PARA EL CRECIMIENTO BACTERIANO

 Disponibilidad de nutrientes adecuados

 Consistencia adecuada del medio
 Presencia (o ausencia) de oxígeno y otros gases
 Condiciones adecuadas de humedad
 Luz ambiental
 Ph
 Temperatura
 Esterilidad del medio

COMPETENCIAS

Al finalizar la práctica el alumno se encontrará en la capacidad de:

 Reconocer los diversos medios de cultivo utilizados para el aislamiento,

identificación conservación y pruebas de sensibilidad.

 Se adiestrará en la preparación de medios de cultivo y aplicará los

fundamentos para su utilización en el aislamiento de microorganismos.

MATERIALES

 Medios de cultivo deshidratados (pulverizados o granulados)

 Espátula
 Balanza analítica.
 Autoclave.
 Matraces de 250 y 500 ml
 Probetas de 250 y 500 ml
 Agua destilada.
 Ph-METRO o cintas indicadoras de Ph

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 Solución de HCL y NaOH al 0.1N (cada uno).

 Suplementos (Sangre de cordero o conejo, Hemoglobina bobina)
 Inhibidores (solución stock de antibióticos).
 Papel Aluminio.
 Pita o pabilo.

PROCEDIMIENTO

1. Leer las especificaciones técnicas del fabricante, descritas en la etiqueta del

medio a preparar.

2. Medir el pH del agua destilada a utilizar (estabilizándolo con NaOH al 0.1N

cuando esta se encuentra muy ácida o con HCL al 0.1N si esta se encuentra muy
alcalina considerando un pH de entre 7.2 a 7.4).

3. Calibrar la balanza analítica (tarar para llevar a cero).

4. Pesar los ingredientes de acuerdo a la formulación del medio a preparar.

5. Colocar los ingredientes en un matraz limpio y agregar agua destilada de acuerdo

al volumen del medio a preparar.

6. Disolver el medio en baño maría hirviente hasta observar que el medio se vuelva
translúcido, evitando que el medio hierva.

7. Dejar enfriar a hasta que alcance 50°C aproximadamente y medir el pH

(estabilizándolo con NaOH al 0.1N cuando esta se encuentra muy ácida o con
HCL al 0.1N si esta se encuentra muy alcalina considerando un pH de entre 7.2 a
7.4)

8. Taponar el matraz con un tapón de algodón forrado con gasa y proteger con
papel aluminio.

9. Esterilizar a calor húmedo (autoclave a 121°C y 15 libras de presión).

10. Dejar enfriar el medio a 40° y servir en placas.

11. Llevar el 10% de placas servidas a control de esterilidad en estufa a 37°C por 18
o 24 horas y almacenar a 4°C.

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FORMULACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

Caldo Nutritivo

 Bacto peptona ……………………………. 1.0 gr

 Extracto de carne ……………………………. 0.3 gr
 Agua destilada ……………………………. 100 ml

Ajustar el ph a 7.2 – 7.4

Para convertirlo en agar nutritivo sólo se agrega Agar agar en proporción de

15 gr por cada litro de caldo.

Caldo Peptona

 Peptona de caseína ……………………………. 1.0 gr

 Cloruro de sodio ……………………………. 0.5 gr
 Agua destilada ……………………………. 100 ml

Ajustar el ph a 7.2 – 7.4

Medio Base para Agar sangre (Tipo Columbia)

 Peptona de Caseína ……………………………. 1.2 gr

 Peptona de Carne ……………………………. 1.1 gr
 Almidón ……………………………. 0.15 gr

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 Cloruro de sodio ……………………………. 0.5 gr

 Agar Agar ……………………………. 1.5 gr
 Agua destilada ……………………………. 100 ml

Ajustar el ph a 7.2 – 7.4

Medio Base para Agar sangre (Tipo Columbia)

 Peptona de Caseína ……………………………. 1.2 gr

 Peptona de Carne ……………………………. 1.1 gr
 Almidón ……………………………. 0.15 gr
 Cloruro de sodio ……………………………. 0.5 gr

Preparación de Agar Sangre

Licuar 100 ml de agar nutritivo, agar base sangre o agar

tripticasa soya (TSA) en baño maría hirviente, dejar enfriar
hasta que el medio alcance 45°C y frente a fugo de
mechero adicionar 10 ml de sangre desfibrinada o
citratada de cordero. Homogenizar hasta obtener una
mezcla uniforme y luego servir en placas de Petri. Dejar
solidificar y someter a prueba de esterilidad.

Preparación de Agar Chocolate (Agar “Sangre quemada”)

Licuar 100 ml de agar nutritivo, agar base sangre o agar

tripticasa soya (TSA) en baño maría hirviente, dejar enfriar
hasta que el medio alcance una T° de 45°C y frente a fugo
de mechero adicionar 10 ml de sangre desfibrinada o
citratada de cordero. Homogenizar hasta obtener una
mezcla uniforme y luego someter nuevamente a
calentamiento en baño maría hirviente por etapas; agitando
constantemente hasta observar que el medio tome un color
chocolate. Dejar enfriar hasta una T° de 45°C y servir en
placas de Petri. Dejar solidificar y someter a prueba de esterilidad.

CUESTIONARIO

1. Esquematice lo realizado en práctica.

2. Mencione otros medios y clasifíquelos de acuerdo a su consistencia y utilidad.
3. Escriba la formulación y preparación del Medio PDA y Agar ARROZ.
4. Atendiendo los requerimientos nutricionales de bacterias del género Clostridium
formule un medio para su aislamiento.

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