UNIVERSIDAD NACIONAL DE LOJA

FACULTAD AGROPECUARIA Y DE RECURSOS

NATURALES RENOVABLES
CARRERA DE INGENIERIA AGRONOMÍCA
MICROBIOLOGIA
PRACTICA 1:
PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO
PARA MICROORGANISMOS Y
ESTERILIZACION DE MATERIALES DE
LABORATORIO

INTEGRNATES:
DAYANA CEVALLOS
PABLO FERNANDEZ
ISABEL IÑIGUEZ
LENIN SANCHEZ
JAVIER UCHUARI

CICLO: IV “A”
DOCENTE: DR. TULIO SOLANO

2019 – 2020
 I. TEMA:
Preparación de medios de cultivo para microorganismos y Esterilización de
Materiales de Laboratorio
II. INTRODUCCION
Decimos que un medio de cultivo es un sustrato artificial que contiene elementos
nutritivos para los microorganismos mismos que ayudan para su crecimiento que
contiene o debe contener sustratos naturales que pueden ser equivalentes o
superiores o aun medio de cultivo natural. El presente trabajo se realizar con el
único fin de conocer cual es el procedimiento para la obtención de un medio de
cultivo apto para poder cultivar una sepa ya sea de hongos o bacterias, de la misma
forma se busca conocer los distintos métodos para la obtención de medios de
cultivo ya sea por medio de calor húmedo y calor seco y de la misma forma que
los resultados sean adecuados para poder adquirir una mayor habilidad en la
preparación de estos medios.

III. OBJETIVOS
 Desarrollar habilidades y destrezas en la preparación de medios de cultivo y
técnicas de esterilización en calor húmedo.
 Conocer los principales medios de cultivo utilizado para bacterias, hongos y
actinomicetos.

IV. REVISIÓN DE LITERATURA

4.1. GENERALIDADES

4.2. CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Los medios de cultivo que se utilizan el laboratorio dependen del microorganismo
que se pretende cultivar y de la finalidad de su cultivo. Puede hacerse una
descripción global de los mismos atendiendo a su composición química, a su
estado físico y la finalidad del cultivo. Como la distribución se hace atendiendo a
diferentes criterios un medio de cultivo puede incluirse en más de una categoría:
3.2.1 Según su estado físico (consistencia):
 Medios líquidos: Son los que se presentan en este estado, denominándose
por esta razón caldos. El medio líquido más utilizado es el llamado caldo
nutritivo, compuesto principalmente de extracto de carne, peptona y agua.
Se utiliza fundamentalmente cuando se pretende la obtención de una
suspensión bacteriana de una determinada concentración.
 Medios sólidos: Se preparan a partir de los medios líquidos, agregándoles
un agente gelificaste. Los más utilizados son la gelatina y el agar.
Gelatina: Es una proteína animal obtenida de los huesos. Tiene el
inconveniente de que es hidrolizada por muchas bacterias, y además su uso
está muy limitado porque su punto de fusión es bajo (licúa temperatura
ambiente) razón por la que no puede utilizarse para cultivos a 37ºC, que es
la tempera óptima de crecimiento para muchos microorganismos.
 Agar-agar: Es un polímero de azúcares obtenido de algas marinas. Se trata
de una molécula insoluble en agua, pero soluble en agua caliente; una
solución al 1,5% p/v forma un gel firme entre 32 y 39ºC y no se funde por
debajo de 85ºC. Funde a 90ºC y solidifica una vez fundido alrededor de
los 45ºC
 Medios semisólidos: Se preparan a partir de los medios líquidos,
agregando a éstos un agente solidificante en una proporción menor que
para preparar medios sólidos. Uno de sus usos es la investigación de la
movilidad de las bacterias.
3.2.2 Según su utilización:
 Medios comunes: Son aquellos que poseen los componentes mínimos
para que pueda producirse el crecimiento de bacterias que no necesiten
requerimientos especiales. El medio más conocido de este grupo es el agar
nutritivo o agar común, que resulta de la adición de agar al caldo nutritivo.
Otros representantes de este grupo sonel agar tripticase de soja, el agar
Columbia, etc.
 Medios de enriquecimiento: Son aquellos que, además de las sustancias
nutritivas normales, incorporan una serie de factores indispensables para
el crecimiento de microorganismos exigentes. Este enriquecimiento se
hace por adición de sangre u otros productos biológicos (sangre, suero,
leche, huevo, bilis, etc.) que aportan dichos factores. En ocasiones es
posible añadir suplementos artificiales a los medios para producir un
enriquecimiento del mismo (p. ej. Polivitex, Isovitalex, etc.)
 Medios selectivos: Son medios utilizados para favorecer el crecimiento
de ciertas bacterias contenidas en una población poli microbiana. El
fundamento de estos medios consiste en facilitar nutricionalmente el
crecimiento de una población microbiana específica. Un ejemplo de medio
selectivo es el caldo selenito, que se utiliza para favorecer el crecimiento
de salmonellas y frenar el del resto de entero bacterias.
 Medios inhibidores: Cuando las sustancias añadidas a un medio selectivo
impiden totalmente el crecimiento de una población microbiana, se
denomina inhibidor. Los medios inhibidores podrían considerarse como
una variante más restrictiva de los medios selectivos. Los medios
inhibidores se consiguen habitualmente por adición desustancias
antimicrobianas o de cualquier otra que inhiba completamente el
desarrollo de una población determinada. Un medio inhibidor es el
MacConkey que permite el crecimiento de los gérmenes Gram negativos
e impide el crecimiento de los Gram positivos.
 Medios diferenciales: Se utilizan para poner en evidencia características
bioquímicas que ayuden a diferenciar géneros o especies. La adición de un
azúcar fermentable o un sustrato metabolizable se utilizan para este fin. El
medio MacConkeyes un medio diferencial porque permite distinguir los
gérmenes que fermentan la lactosa de aquellos que no lo hacen.
 Medios de identificación: Son los destinados a comprobar alguna
cualidad específica que puede servirnos para reconocer la identidad de un
microorganismo. (Helena 2018).
3.2.3 Según su origen:
 Naturales: son los preparados a partir de sustancias naturales de origen
animal o vegetal como ser extractos de tejidos o infusiones y cuya
composición química no se conoce exactamente.
 Sintéticos: son los medios que contienen una composición química
definida cualitativa y cuantitativamente. Se utilizan para obtener
resultados reproducibles.
 Semisintéticos son los sintéticos a los que se les añaden factores de
crecimiento bajo una forma de un extracto orgánico complejo, como por
ejemplo extracto de levadura.
3.2.4 Según su composición:
 Comunes o universales: su finalidad es el crecimiento de la mayor parte
de los microorganismos poco existentes. Es el medio más frecuentemente
utilizado para mantener colonias microbianas. Por ejemplo: agar común o
caldo común.
 Enriquecidos: están compuestos de un medio base como apoyo del
crecimiento al cual se le puede agregar un gran exceso de nutrientes como
suplementos nutritivos, por ejemplo: sangre, suero, líquido scítico, etc. Se
utiliza para microorganismos que tienen grandes exigencias nutricionales.
 Selectivos: son sólidos en los que la selectividad se consigue alterando las
condiciones físicas del medio o añadiendo o suprimiendo componentes
químicos específicos con el fin de inhibir el crecimiento de especies
químicas cuyo crecimiento no interesa. Este tipo de medio sólo permite el
crecimiento de un grupo de microorganismos e inhibiendo el de otros. Se
utiliza para seleccionar y aislar microorganismos a partir de poblaciones
mixtas. Por ejemplo Agar salado-manitol o Chapman (permite el
crecimiento de ciertos estafilococos).
 Diferenciales: son medios de cultivos que nos permiten distinguir entre
varios géneros y especies de microorganismos. Por ejemplo si al medio se
le ha añadido un carbohidrato y un indicador y la bacteria que se cultiva
es capaz de fermentar dicho carbohidrato, se produce una acidificación del
medio con el consiguiente viraje de color del indicador por el cambio de
pH.
 De enriquecimiento: son medios líquidos que contienen un agente que
inhibe las especies no deseadas pero que favorece el crecimiento irrestricto
del agente infeccioso. El medio de Muller - Kauffman, permite el
crecimiento de Salmonella inhibiendo a su vez el de numerosos
coliformes. Esto es de gran importancia ya que, en ciertas muestras, por
ejemplo, fecales, el agente infeccioso (Salmonella) es frágil y puede ser
superado en número por agente bacterianos indígenas como E. coli; por lo
tanto, antes de realizar las pruebas de laboratorio es necesario aumentar su
número con respecto a ésta en un caldo de enriquecimiento.
  De transporte: son utilizados para asegurar la viabilidad de la bacteria sin
multiplicación significativa de los microorganismos desde el momento de
su extracción hasta su posterior estudio.

4.3. COMPOSICIÓN GENERAL DE LOS MEDIOS DE CULTIVO (FUENTES DE

NITRÓGENO, FOSFORO, AZUFRE, ETC)

Los medios de cultivo están constituidos por componentes inorgánicos, los

cuales son suministrados en cantidades relativamente grandes
(macronutrientes) y otros añadidos en menor cantidad (micronutrientes).
3.3.1 Los macronutrientes: se encuentran iones de nitrógeno (N), potasio
(K), calcio (Ca), fósforo (P), magnesio (Mg) y azufre (S).
 El nitrógeno se adiciona al medio de cultivo en forma de nitrato o iones
amonio, o la combinación de ambos iones, el sulfato de magnesio (Mg
SO4 7H2O) satisface tanto el requerimiento de magnesio como el de
azufre.
 El fósforo puede adicionarse en cualquiera de las formas NaH2PO4.H2O
ó KH2PO4
 El potasio es un catión que se agrega en forma de KCl, KNO3, ó KH2PO4
 El calcio se adiciona con Ca Cl2.2H2O, Ca(NO3)2.4H2O o la forma
anhidra de cualquier sal.
 El cloro se presenta en forma de KCl ó CaCl2.
3.3.2 Los micronutrientes: que son añadidos a los medios de cultivo son
hierro (Fe), níquel (Ni), cloro (Cl), manganeso (Mn), cinc (Zn), boro (B),
cobre (Cu), y molíbdeno (Mo). Estos elementos junto con el carbono (el C),
oxígeno (O) e hidrógeno (H) constituyen los 17 elementos esenciales. Estos
micronutrientes, aunque son requeridos en menor cantidad son necesarios para
una adecuada actividad metabólica de las células vegetales.
 El Fe y el Mn son esenciales para la síntesis de clorofila y la función de
los cloroplastos.
 El Fe es requerido para la formación de precursores de la clorofila y es un
componente de los citocromos, ferredoxina y lego hemoglobina, esta
última es esencial en la fijación de nitrógeno por las plantas leguminosas.
 El Mn es necesario para el mantenimiento de la ultraestructura y el proceso
fotosintético.
 Cu y Zn son requeridos para la oxidación e hidroxilación de compuestos
fenólicos.
 El Zn está relacionado con la síntesis de triptófano, precursor del ácido
indolacético (AIA) y ejerce control sobre las ribonucleasas lo que permite
mantener la síntesis proteica en caso de estrés ambiental (medio de
cultivo).
 El Cu, además es un componente de la Plastocianina que es esencial en el
funcionamiento del transporte electrónico de la fotosíntesis y es activador
de otras enzimas como la oxidasa del ácido ascórbico (Vitamina C),
tirosinasa, lactasa, fenol asa y citocromoxidasa.
  El Mo forma parte de las nitratorreductasas de las plantas y nitrogenasas
en leguminosas y bacterias fijadoras de nitrógeno.
 El boro (B) es necesario para el mantenimiento de la actividad
meristemática, está involucrado en la síntesis de bases nitrogenadas, en
particular uracilo y adenina y por ello aumenta los niveles de citocininas y
ácidos nucleicos

4.4. MEDIOS DE CULTIVO ESPECÍFICOS PARA HONGOS, BACTERIAS Y

ACTINOMICETOS RELACIONADOS CON LA AGRICULTURA.
(MICROROGANISMO, FORMULA Y PREPARACIÓN)
Los medios que se presentan a continuación son usados para el aislamiento de
hongos fitopatogenos a partir de muestras de suelo y agua.
3.4.1 AGAR CLORURO DE SODIO -GLUCOSA –DICLORAN
Usado como medio selectivo para el aislamiento de Aspergillus flavus de
suelo

Preparación: Disolver todos los componentes en agua destilada y

calentar suavemente hasta disolverlos por completo llevar a auto
clavar por 15 min a 121°C/15 Lbs de presión, después agregar
50 mg de estreptomicina y servir.
3.4.2 AGAR DEXTROSA-PEPTONA-EXTRACTO DE LEVADURA (DPYA)

Para aislamiento y enumeración de hongos del suelo.

 Preparación: Disolver todos los componentes en agua destilada y
calentar suavemente hasta disolverlos por completo llevar a auto
clavar por 15 min a 121°C/15 Lbs de presión, después agregar 30
mg de estreptomicina y servir.
3.4.3 AGAR GUAYACOL

Medio para detectar Bipolaris (Helminthosporium) oryzae y

Alternaria en semillas de arroz.

Preparación: Disolver el guayacol y el agar en un litro de agua

destilada, mezclar bien, esterilizar en autoclave, posteriormente
adicionar la estreptomicina, servir.
3.4.4 AGAR PCNB

Aislamiento de Fusarium spp. a partir de muestras de suelo.

Preparación: Agregar todos los componentes en agua destilada

y calentar suavemente hasta disolverlos por completo llevar a
auto clavar por 15 min a 121°C/15 Lbs de presión, después
agregar la estreptomicina y servir.

4.5. TÉCNICAS DE ESTERILIZACIÓN Y DESINFECCIÓN

3.5.1 TECNICAS DE ESTERILIZACION

Para esto contamos con procedimientos físicos o químicos. Estos últimos ya

han sido vistos al considerar los desinfectantes de alto nivel
 CALOR HUMEDO:
Mecanismo de Acción: Al igual que los procesos de desinfección, la
esterilización térmica destruye a los microorganismos en forma gradual;
es por esto que no hay un único mecanismo de acción, sino más bien
la suma de distintos eventos complejos que se van sucediendo a medida
que aumenta la temperatura. Así, aunque el efecto final de la esterilización
por calor húmedo a 121ºC es la desnaturalización y coagulación de
las proteínas, son importantes otros mecanismos de destrucción, que
justifican la utilización de calor húmedo a temperaturas inferiores, como
veremos más adelante. El primer efecto letal sería la producción de
rupturas de cadena única en el ADN que provocarían la muerte celular
por activación o liberación de enzimas conactividad de endonucleasas.
El punto crítico aquí, para la supervivencia de la célulasería su capacidad
para reparar la lesión, función que depende del estado genético y
fisiológico de la bacteria. A medida que aumenta la temperatura se
agregaría la pérdida de la integridad funcional de la membrana
citoplásmica, lo que produciría interferencias en el intercambio con el
medio externo, los procesos respiratorios y la síntesis proteica .Por
último, las temperaturas más elevadas activarían ribonucleasas que
degradando el ARNr producen la pérdida de viabilidad de las células
expuestas. Las temperaturas a la cual puede usarse el calor húmedo son:
Por debajo de 100ºC --- Pasteurización A 100ºC --- Ebullición y
Tindalización Por encima de 100ºC --- Auto clavado Pasteurización: se
utiliza para la destrucción degérmenes patógenos, con resistencia
térmica similar o inferior a M.tuberculosis, Brucella y Salmonella.
Ebullición: consiste en mantener un objeto o sustancia en un baño a 100ºC
durante 30'. Aplicado así destruye la mayoría de las formas vegetativas
bacterianas, hongos y virus lipídicos (por Ej.: Herpesvirus y HIV). En
cambio, no es efectivo para la destrucción de esporos y virus no envueltos.
La repetición de este proceso durante tres días consecutivos, constituye la
Tindalización. Su fundamento teórico está dado por la destrucción de las
formas vegetativas durante los períodos de ebullición, permitiendo que los
esporos germinen durante el reposo volviéndose susceptibles al próximo
calentamiento. Tampoco aquí se esteriliza. Autoclavado: utiliza vapor de
agua a 121ºC durante 15'o20'. Esta temperatura se logra si se obtiene una
presión de una atmósfera relativa (dos atmósferas absolutas), ya que el
aumento de la presión provoca aumentos proporcionales en el punto de
ebullición del agua. Es el mecanismo de destrucción microbiana más
efectivo, ybien utilizado asegura esterilización.

 CALOR SECO:

Mecanismo de acción: Es diferente al del calor húmedo. El calor seco

(o desecación en general) provocados naturalización de proteínas,
lesiones por oxidación y efectos tóxicos por niveles elevados de
electrolitos. La acción letal es el resultado del calor trasmitido desde el
material con el cual los microorganismos están en contacto, y no desde el
aire caliente que los rodea. Existen tres formas principales de esterilización
 por calor seco: flambeado, incineración y mediante la utilización del horno
Pasteur.
HORNO PASTEUR O POUPINELL: consiste en un recinto metálico de
doble pared con aislante entre ambas (para evitar la pérdida de calor) y una
puerta. La fuente de calor suele ser eléctrica y está incorporada. Posee un
ventilador que facilita la circulación del aire caliente, para homogeneizar
la temperatura. Un termómetro (con alcance mínimo de 200ºC) visible
desde afuera, registra la temperatura del interior del recinto. Por calor
seco se pueden esterilizar: materiales de inyectables, vidrios, instrumentos
quirúrgicos y objetos metálicos, así como aceites, vaselinas y polvos, que
como ya se ha dicho son impermeables al vapor.
3.5.2 TÉCNICAS DE DESINFECCIÓN

Se trata de métodos de limpieza que reducen más intensamente la

contaminación microbiana, destruyendo agentes patógenos tanto en
ambientes como en superficies y objetos.
Mediante la desinfección se pueden destruir formas vegetativas, pero no
elimina las esporas bacterianas. Los procedimientos de desinfección
pueden ser físicos, o químicos. Métodos de desinfección con
procedimientos físicos:
 Desinfección mediante el calor o pasteurización, proceso al que se
someten sustancias líquidas sin llegar al punto de ebullición.
Normalmente se mantiene el líquido a una temperatura de unos 65º
durante un cuarto de hora para destruir patógenos.
 Radiaciones Ultravioletas, que reducen, pero no eliminan totalmente
la carga microbiana.

V. MATERIALES Y MÉTODOS
4.1 MATERIALES
4.1.1 MATERIALES DE LABORATORIO
 Balanza
 Lunas de reloj
 Pesas
 Probetas
 Matraces
 Botellas de base plana
 Tubos de ensayo
 Plato caliente
 Vasos de precipitación
4.1.2 MATERIALES DE OFICINA
 Cuaderno
 Esferos
4.1.3 REACTIVOS
  Agar-agar
 Peptona
 Dextrosa
 Levadura
 Glucosa

4.2 METODOS
4.2.1 PDA (hongos)

 Calentar 500 cm3 de agua destilada en un vaso de precipitación.

 Pelar los 200,0 g de papa, picar y cocinar en el vaso se precipitación
con constante agitación hasta que esté lista, filtrar en un lienzo.
 Calentamos 500 ml de agua destilada hasta que alcance el punto de
ebullición, apagamos el plato caliente, trasvasamos en agua al
Erlenmeyer de 500 ml y, poner los 20 g de dextrosa y 18 gramos
de agar y el filtrado de papa, luego trasvasamos a tubos de ensayo
o Erlenmeyer
 Realizar la esterilización en la autoclave a una temperatura de 121
o C ± 1 ° C y a 1, 5 Kg /cm2 por un lapso de 15 minutos.
4.2.2 Agar Nutriente (bacterias y actinomicetos)

 Se pesa 23 gramos de medio de cultivo y se diluye 1000 cm3 de

agua destilada caliente, colocar en un Erlenmeyer, tapar con
algodón, cubrir con papel o papel periódico.
 Realizar la esterilización en la autoclave a una temperatura de 121
o C ± 1 ° C y a 1, 5 Kg /cm2 por un lapso de 15 minutos.
4.2.3 LPGA (bacterias y actinomicetos)

 Pesar en luna de reloj lo siguiente: extracto de levadura 2 gramos,

peptona 3 gramos, glucosa 10 gramos y Agar 17 gramos
 Calentamos 1000 ml de agua destilada hasta que alcance el punto
de ebullición, apagamos el plato caliente y agregamos los
componentes
 Realizar la esterilización en la autoclave a una temperatura de 121
o C ± 1 ° C y a 1, 5 Kg /cm2 por un lapso de 15 minutos.
4.2.4 Esterilización y desinfección de materiales de laboratorio

 Colocar agua destilada en un Erlenmeyer o en un balón de fondo

plano, tapar con algodón y cubrir con papel aluminio, de forma
igual que los medios de cultivo.
 Envolver las cajas Petri, pinzas, bisturís agujas en papel.
 Realizar la esterilización en la autoclave a una temperatura de 121
o C ± 1 ° C y a 1, 5 Kg /cm2 por un lapso de 20 minutos.

VI. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

 RESULTADOS

Se obtuvo como resultados, medios de cultivo estériles favorables para la

producción y multiplicación de hongos y bacterias

DISCUSION
Mediante la practica lo que se tuvo como objetivo fue la realización de medio de
cultivo aptos para hongos y bacterias, de la misma manera se obtuvo medios de
cultivo solidos con cualidades útiles para su utilización, según Eduardo y Teddy
1980 estos mismos medios de cultivo son los óptimos para este tipo de
microorganismos, para su reproducción y mantenimiento

VII. CONCLUSIONES
 Hemos concluido que los microorganismos se desarrollan en distintos
medios de cultivo, siempre y cuando estos cumplan con lo que los
microorganismos requieran, como un adecuado pH, una temperatura
optima, un medio en donde se encuentre variedad de nutrientes que los
mismos necesitan para su reproducción.
 La esterilización es la técnica para elimina todas las formas de vida
existentes en un medio, esto se lo realiza para tener pureza en el cultivo y
que no se llegue a contaminar el mismo con algún otro microorganismo,
ya que en todas partes abundan estos, por ende, se debe tener precaución
en este tema.

VIII. RECOMENDACIONES
IX. BIBLIOGRAFÍA

 BARRETO, L. C. (201). repository.javeriana.edu. Obtenido de repository.javeriana.edu.:

https://repository.javeriana.edu.co/bitstream/handle/10554/8741/tesis680.pdf?sequ
ence=1

 EcuaRed. (2019). Ecuared . Obtenido de Ecuared :

https://www.ecured.cu/Medios_de_cultivo_para_la_propagaci%C3%B3n_in_vitro

 Santiago, B. (14 de febrero de 2015). slideshare. Obtenido de slideshare:

https://es.slideshare.net/beatriznedsantiago/clasificacion-de-los-medios-de-cultivo

 serkonten. (14 de febrero de 2018). Obtenido de serkonten:

https://www.phsserkonten.com/higiene/metodos-de-desinfeccion/

 VIGNOLI, R. (02 de noviembre de 2019). higiene.edu. Obtenido de higiene.edu.:

http://www.higiene.edu.uy/cefa/Libro2002/Cap%2027.pdf
X. ANEXOS