2 Parcial Laboratorio

5.
Electroforesis de Proteìnas
- Centrifugaciòn:
La centrìfuga clínica permite separar la sangre dependiendo de las densidades
Este procedimiento lo hacemos durante 10 minutos
El plasma es la fracción de la sangre que contiene los

factores coagulantes. Esta es la parte que estudiaremos
debido a la presencia de proteínas en los factores
coagulantes.
- Preparación de las muestras

Sacamos 2 tubos de 750 uL de plasma y le adicionamos
250 uL de Buffer SDS a cada tubo.
Buffer SDS: Ayuda a desnaturalizar y poner carga negativa

a las proteínas
B-mercaptoetanol: Se encarga de romper puentes disulfuro los cuales ayudan a constituir la
estructura cuaternaria de las proteínas, ayudando así a desnaturalizar las proteínas.
Glicerol: Ayuda a que las proteínas se vayan hacia el fondo.
Tomamos los tubos y les hacemos tres huecos en la tapa. Les ponemos un tipo de cinta
llamada parafilm para sellar las muestras y ponerlas en un flotador para que entren en un baño
María a 95°C.
- Electroforesis.
Se adiciona buffer SDS a la cámara de electroforesis y procedemos a poner el Marcador de
PM. Este tipo de detección de proteínas se basa en una red entrecruzada que permite que
proteínas pequeñas pasen más fácilmente, mientras que proteínas más grandes interactúen
mucho más con la columna. Estas proteínas se mueven hacia el ánodo
A Partir de un análisis de sangre se puede sacar un proteinograma el cual nos ayuda a
identificar patrones de algunas enfermedades.
- Estudio de los resultados

Esto se hace con la ayuda del logPM (que se obtiene con el marcador del PM y su recorrido) y
la distancia recorrida de cada proteína. Para esto necesitamos una curva de calibración la cual
es el PM elevado a la 10.
A partir de este proteinograma podemos

identificar ciertos patrones de
enfermedades para poder tener un
mejor análisis del diagnóstico.
Es muy importante tener en cuenta el

valor relativo de cada curva. Estos son
sus valores relativos:
Alb: 60-70
a1: 1.4-2.7
a2: 7.0 - 11.0
Beta 6- 9
Gamma: 8 - 16
Alfa 1
Aumenta Disminuye
-Procesos inflamatorios agudos - Debido a la disminución de alfa tripsina

-Enfermedades malignas (Tumorales)
-Elevación de alfa fetoproteína por:
(gestación, tumores germinales,
hepatocarcinoma y tumores senos
endodérmicos),
Alfa 2 Globulinas
Aumenta Disminuye
-Principal: Síndrome nefrótico por aumento de -Muy raro

alfa dos macroglobulinas las cuales pasan por -Haptoglobina: Anemia, resolución hematomas
los capilares glomerulares y se empiezan a -Ceruloplasmina: Desnutrición, Síndrome
acumular cuando no funcionan bien nefrótico, enfermedad perdedora de proteínas
-Diabetes
-Hepatopatías
-Reactante de fase aguda
En el síndrome nefrótico podemos evidenciar el

pico de Alfa-2 marcadamente aumentando y el
de albúmina disminuido
Beta globulinas
Aumenta Disminuye
-Falta de preparación del paciente para la -Muy raro

prueba -Nutricional
-Déficit de Hierro
-Dislipidemia
-Hipoteroidismo
-Diabetes
-HTA maligna
Debido a aumento de transferrina en las beta globulinas
Si hay disminución en todos los picos:
Gamma globulinas
Aquí se encuentran todas las globulinas
Aumento Disminuye
Monoclonal: Hipogammaglobulinemia:
Gammapatia monoclonal
-Síndrome Nefrótico
Pico alto y base estrecha -SIDA
60% Mieloma múltiple o plasmocito solitario -Mieloma múltiple perdedor de proteínas por
15% orina
25% no malignas
Policlonal: Mieloma múltiple:

Gammapatia policlonal
Se excreta proteína de Bences Jones por orina
Inflamaciones por IgA IgM virus, parásitos, Se pide electroforesis de orina
malaria o enfermedades autoinmune IgG
Dependiendo de la medición de las
inmunoglobulinas se hace el análisis
Se eleva mas IgM
Proceso inflamatorio de base
6. Extracción de ADN
Para analizar los fenómenos del ADN
Procesamiento del laboratorio Biología Molecular

1. Recepción y ensamblaje
2. Extracción de ARN viral
3. Prueba RT-9 PCR
4. Análisis y reporte de resultados
Explicación:
1. Recepción y ensamblaje
Área con más contención y un protocolo más estricto. Tiene un nivel de seguridad 2. Es muy
importante la trazabilidad (código único de cada muestra) el cual se usa para todo el
procedimiento. Esta es un área limpia, esto quiere decir que está libre de amplicones. Los
amplicones son secuencias de material genético con concentraciones altas, esto se saca por
medio del PCR.
2. Extracción de ARN viral

Más que todo extracción de material genético. Esta es un área contaminada con amplicones
3. Prueba RT-9 PCR

Aquí podemos evidenciar las técnicas de Biología Molecular. Esta es un área contaminada con
amplicones
Proceso de extracción de ADN:

1. Obtención de la muestra de sangre
2. Lisis de glóbulos Rojos
3. Lisis de glóbulos blancos
4. Eliminación de proteínas por precipitación salina
5. Precipitación de ADN
6. LImpieza del ADN
7. Resuspensión del ADN
Explicación de cada uno:
1. Obtención de la muestra de sangre.
2. Lisis de glóbulos rojos.
Procedimiento:
Se toman 500 uL de sangre y se usan 900 uL de sln de lisis de Glóbulos rojos(GR), esto se
mezcla en el vortex por 30 seg y luego se pone en centrifugado por 10 min. Se saca la parte de
arriba, quedando con los glóbulos blancos(GB). Esto se repite varias veces.
Explicación:
La solución de lisis va a producir lisis en los glóbulos blancos.
3. Lisis de glóbulos blancos.
Procedimiento:
Después del tercer lavado para que no quedara ningún glóbulos rojo en la solución, tomamos
300 uL de solución de GB. Se le agregan 50 uL de solución de Proteinasa K y 10 uL de SDS 20
%. Mezclamos por 1 min con el vortex e incubamos a 56°C revolviendo cada 10 min.
Explicación:
La solución de SDS 20% es la que va a propiciar la ruptura de los glóbulos blancos y la
solución de proteinasa se activa con calor y nos ayudará a lisar las proteínas que se
encuentran alrededor del ADN. Es muy importante que en una buena extracción de ADN no se
encuentran proteínas, por lo tanto este es un indicativo de que tuvimos una extracción exitosa.
El vortex o el agitar la muestra nos ayuda a lisar los GB para que junto con el SDS pueda solo
quedar el ADN .
4. Eliminación de proteínas por precipitación salina
Procedimiento:
Adicionar 150 uL de Acetato de Potasio y mezclamos por 30 s en el vortex. Dejamos reposar a
temperatura ambiente por 5 min y centrifugamos a 12.000 rpm por 10 min a 4°C. Tomamos el
sobrenadante en un tubo de 1,5 ml.
Explicación:
El Acetato de potasio es un compuesto iónico que junto con el agua ayuda a disociar proteínas.
Haciendo así que las proteínas precipitan y que se puedan terminar de separar por completo
del ADN. Quedando así el ADN arriba del tubo
5. Precipitación de ADN
Procedimiento:
Adicionar al sobrenadante el mismo volumen (aprox. 400- 500 μL) de Isopropanol frío(poniendo
la misma proporción de ambos). Mezclamos por inversión del tubo suavemente 10 veces.
Observamos la formación de hilos blancos (fibras de ADN enrollado). Centrifugamos a 12.000
rpm por 15 min para recolectar el ADN. Eliminamos el sobrenadante por inversión completa del
tubo, dejando con la boca hacia abajo sobre un pedazo de papel toalla.
Explicación:
Importante saber que en el sobrenadante quedó el ADN y este se va a mezclar con el
isopropanol. El isopropanol nos ayuda a precipitar el ADN y a quitar las moléculas de agua
restantes que se puedan encontrar por allí.
6. LImpieza del ADN
Procedimiento:
Lavar el ADN precipitado adicionando 1 mL de alcohol al 70% frío. Mezclamos por inversión
suave del tubo, lavando las paredes. Centrifugamos a 12.000 rpm por 5 min y luego extraemos
todo el alcohol empleando una pipeta de 1 mL y el residuo con pipeta de 200 μL. Por último
dejamos el tubo invertido sobre una toalla de papel hasta que seque completamente (20 min
aprox.)
Explicación:
Lavamos el ADN para quitar toda presencia de sustancias o moléculas que pudieron haber
quedado del procedimiento. El alcohol es ideal para limpiar el ADN debido a que es una
molécula polar que es afín a las sales y las proteínas.
7. Resuspensión del ADN
Agregamos 50 uL de Buffer ETD el cual mantendrá el ADN estable y liberado
7. Cuantificación de ADN por

espectrofotometría y visualización por
electroforesis en gel agarosa.
Sobre este laboratorio no tendremos detalladamente los procedimientos
Electroforesis:
Cuando hacemos electroforesis a el ADN será de manera vertical
Importancia o finalidad de la electroforesis:

En la electroforesis queremos evidenciar la integridad del ADN. Esto quiere decir que tan poco
fragmentado está el ADN y esto va a establecer un parámetro de calidad.
En este procedimiento usamos un marcador de PM(Peso molecular) que nos ayudará a indicar
cual es el peso de las sustancias, sin embargo un ADN íntegro se mantendrá arriba de la
columna ya que su peso no será incluido en el marcador de PM. Haciendo así que en los
resultados evidenciamos como el ADN debe de quedar en la parte de arriba sin ningún
difuminado. Las demás muestras que se ven con un difuminado no serán íntegras.
Cuando este proceso está bien estandarizado en el laboratorio entonces es utilizado en la

clínica. Lo usamos para mirar si un fármaco está actuando efectivamente, debido a que hay
fármacos que fragmentan el ADN. Se usa mayormente en cáncer, para saber si a una persona
le está funcionando bien el fármaco.
El gel que es usado en este procedimiento es gel de agarosa y es mucho más grueso. Al usar 8
uL de buffer TBE. Importante tener en cuenta que el Ánodo es el que recibe aniones
Datos que salen de la nada de Augusto:

El ADN se puede refrigerar a -20°C por una semana, mientras que si es por un mes deberá ser
refrigerado en un ultracongelador a 80°C
Espectrofotometría
El ADN absorbe la luz a 260 nm. Este procedimiento nos ayuda a medir la concentración de
ADN y su contaminación.
Se miden en tres absorbancias para poder identificar si el ADN contiene otro tipo de sustancias
que absorben la luz en 230 y 280. Despues de que tomamos la absorbancia a 260,280 y 230
procederemos a verificar que la muestra no este contaminada.
260
Contaminación de proteínas: 280
El rango normal de estos será entre 1.8 y 2.0.
260
Contaminación de proteínas: 230
El rango normal es de 2.0 - 2.2

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5.

El plasma es la fracción de la sangre que contiene los

- Preparación de las muestras

Buffer SDS: Ayuda a desnaturalizar y poner carga negativa

- Estudio de los resultados

A partir de este proteinograma podemos

Es muy importante tener en cuenta el

-Procesos inflamatorios agudos - Debido a la disminución de alfa tripsina

-Principal: Síndrome nefrótico por aumento de -Muy raro

En el síndrome nefrótico podemos evidenciar el

-Falta de preparación del paciente para la -Muy raro

Si hay disminución en todos los picos:

Policlonal: Mieloma múltiple:

Proceso inflamatorio de base

Procesamiento del laboratorio Biología Molecular

2. Extracción de ARN viral

3. Prueba RT-9 PCR

Proceso de extracción de ADN:

Explicación de cada uno:

1. Obtención de la muestra de sangre.

2. Lisis de glóbulos rojos.

3. Lisis de glóbulos blancos.

4. Eliminación de proteínas por precipitación salina

6. LImpieza del ADN

7. Resuspensión del ADN

Agregamos 50 uL de Buffer ETD el cual mantendrá el ADN estable y liberado

7. Cuantificación de ADN por

Cuando hacemos electroforesis a el ADN será de manera vertical

Importancia o finalidad de la electroforesis:

Cuando este proceso está bien estandarizado en el laboratorio entonces es utilizado en la

Datos que salen de la nada de Augusto:

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