Análisis de Imágenes de Células Nerviosas

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Histología es la ciencia que estudia todo lo relacionado con los tejidos orgánicos: su
estructura microscópica, su desarrollo y sus funciones. La histología se identifica a
veces con lo que se ha llamado anatomía microscópica, pues su estudio no se detiene
en los tejidos, sino que va más allá, observando también las células interiormente y
otros corpúsculos, relacionándose con la bioquímica y la citología.

Así, tenemos que un tejido es un conjunto de células similares que suelen tener un
origen embrionario común y que funcionan en asociación para desarrollar actividades
especializadas. Las propiedades fisiológicas de las células, son expresadas en 4 tejidos
fundamentales:

1.El tejido conectivo sostiene y une otros tejidos como el óseo, el sanguíneo y el
linfático.

2.El tejido epitelial sirve de cobertura; entre éstos se encuentran la piel y el

revestimiento de varios conductos en el interior del cuerpo.

3.El tejido muscular consta de músculos estriados o voluntarios que mueven el

esqueleto y de músculo liso, tal como el que rodea al estómago.

4.El tejido nervioso está formado por células nerviosas o neuronas y sirve para llevar
"mensajes" hacia y desde varias partes del cuerpo.

Mientras tanto que; las células se constituyen principalmente de proteínas, éstas

pueden estar en las células o solas o combinadas, tienen una importancia funcional y
estructural se puede ver diversamente manifiesta en diversos grupos celulares, éstas
antes mencionadas forman parte de la composición de los componentes corporales y
entre ellos se pueden encontrar otros tipos, como pueden ser: sustancias
intercelulares y líquidos corporales, pero en general La célula se compone de los
siguientes organelos:

5.Membrana plasmática: Separa la célula de su entorno; regula el movimiento de

materiales hacia dentro y fuera de la célula.

6.Mitocondria: Oxida combustible para oxidar ATP.

7.Retículo endoplásmico rugoso (RER): Síntesis de proteínas.

8.Retículo endoplásmico liso (REL): Síntesis de lípidos; metabolismo de fármacos.

9.Envoltura nuclear: Segrega la cromatina (ADN + Proteína) del citoplasma.

10.Nucléolo: Síntesis de ARN ribosómico.

11.Núcleo: Contiene los genes (la cromatina).

12.Complejo de Golgi: Procesa, empaqueta y distribuye proteínas a otros orgánulos

para su exportación.

13.Pared celular: Confiere forma y rigidez; protege a la célula del hinchamiento

osmótico.

14.Citoesqueleto: Soporte estructural de las células; facilita el movimiento de los

organelos.

15.Glioxisoma: Contiene los enzimas del ciclo del glioxilato.

16.Ribosomas: Síntesis de proteínas.

17.Plasmodesmos: Permiten el paso entre dos células vegetales.

18.Vacuola: Degrada y recicla macromoléculas y almacena metabolitos.

19.Tilacoides: Sintetizan el ATP con aprovechamiento de la energía lumínica.

20.Gránulos de almidón: Almacén temporal de glúcidos, productor de la fotosíntesis.

21.Cloroplasto: Almacena la energía solar, produce ATP y glúcidos.

Sin embargo para poder conocer los componentes, su funcionamiento y estructura,

se han requerido de la utilización de microscopios, los hay de varios tipos de acuerdo
a la composición o corte a observar. Para obtener un corte, se requiere de una
preparación previa del mismo para poder ser observable y estudiado, hay diversas
técnicas para preparar cortes de tejido.

Microscopía: Un microscopio óptico es un microscopio basado en lentes ópticos.

También se le conoce como microscopio de luz, (que utiliza luz o "fotones") o
microscopio de campo claro. El desarrollo de este aparato suele asociarse con los
trabajos de Anton van Leeuwenhoek. Los microscopios de Leeuwenhoek constaban
de una única lente pequeña y convexa, montada sobre una plancha, con un
mecanismo para sujetar el material que se iba a examinar (la muestra o espécimen).
Este uso de una única lente convexa se conoce como microscopio simple, en el que se
incluye la lupa, entre otros aparatos ópticos.

Un microscopio electrónico es aquél que utiliza electrones en lugar de fotones o luz

visible para formar imágenes de objetos diminutos. Los microscopios electrónicos
permiten alcanzar ampliaciones hasta 5000 veces más potentes que los mejores
microscopios ópticos, debido a que la longitud de onda de los electrones es mucho
menor que la de los fotones "visibles". El primer microscopio electrónico fue diseñado
por Ernst Ruska y Max Knoll entre 1925 y 1930, quiénes se basaron en los estudios de
Louis-Victor de Broglie acerca de las propiedades ondulatorias de los electrones.

Un microscopio electrónico, como el de la imagen (Figura 1), funciona con un haz de

electrones generados por un cañón electrónico, acelerados por un alto voltaje y
focalizados por medio de lentes magnéticas (todo ello al alto vacío ya que los
electrones son absorbidos por el aire). Un rayo de electrones atraviesa la muestra
(debidamente deshidratada y en algunos casos recubierta de una fina capa metálica
para resaltar su textura) y la amplificación se produce por un conjunto de lentes
magnéticas que forman una imagen sobre una placa fotográfica o sobre una pantalla
sensible al impacto de los electrones que transfiere la imagen formada a la pantalla
de un ordenador. Los microscopios electrónicos producen imágenes sin ninguna clase
de información de color, puesto que este es una propiedad de la luz y no hay una
forma posible de reproducir este fenómeno mediante los electrones; sin embargo, es
posible colorizar las imágenes posteriormente, aplicando técnicas de retoque digital a
través del ordenador.

Figura 1. Con un microscopio electrónico podemos diferenciar objetos separados

0,003 µm, frente a los 0,25 µm del microscopio óptico y los 200 µm del ojo humano.

Parece factible que, si deseamos estudiar una célula o una asociación de ellas, para
conocer su estructura morfológica microscópica y deducir, en lo posible sus
funciones, bastaría examinarlas a través de los instrumentos que amplían imágenes
de los objetos observados (microscopios fotónicos y electrónicos); este procedimiento
no es factible de realizar; al intentar hacerlo se presentan serias dificultades en la
manipulación de los especímenes y el inicio de los procesos propios de desarreglo
molecular (autolisis) y celular que suelen presentarse después que las células y los
tejidos abandonan su hábitat natural. Por lo tanto, es necesario utilizar una serie de
procedimientos y artificios que nos permitan describir, comprender y analizar la
estructura microscópica de las células, tejidos y órganos.
Se denomina TÉCNICA HISTOLOGICA al conjunto de procedimientos aplicados a un
material biológico (animal o vegetal) con la finalidad de prepararlo y conferirle las
condiciones óptimas para poder observar, examinar y analizar sus componentes
morfológicos a través de los microscopios fotónicos y electrónicos.

PROCEDIMIENTOS INMEDIATOS O VITALES Permiten la observación y el estudio de

protozoarios, células sanguíneas, células descamadas o disociadas, células en cultivo
de tejidos; estructuras muy delgadas y translúcidas como la membrana peritoneal de
animales pequeños o epidermis de vegetales, granos de polen etc. suspendidas en los
líquidos de su hábitat natural o solución salina balanceada. Para una observación
óptima suele utilizarse tipos especiales de microscopios fotónicos como el de campo
oscuro o el de contraste de fases: observación al estado fresco. En ciertos casos,
cuando se requiera destacar alguna estructura celular o tisular se pueden emplear
colorantes inocuos para la vida de las células, no modifican la estructura de ellas ni
interfieren en sus funciones. A este procedimiento se le conoce como coloración vital.
Para el estudio de las manifestaciones vitales de las muestras suelen emplearse una
serie de microinstrumentos que facilitan la introducción, al interior de las células, de
sustancias o la extracción de ciertos componentes mediante microinyectores,
micropipetas, microelectrodos o instrumentos que emiten haces sumamente delgado
de radiaciones de alta energía (rayos laser). Uno de ellos es:

La COLORACIÓN VITAL; Puede ser de dos tipos:

1.Coloración intravital, consiste en la administración de colorantes vitales a través de

las vías digestiva o intratraqueal; mediante inyecciones sanguíneas, linfáticas,
subcutánea, o intraperitoneal. Las soluciones de uso más frecuente son: tinta china,
carmín de litio, azul tripan (partículas colorantes que demuestran la capacidad
fagocítica).

2.Coloración supravital, En este procedimiento se emplean colorantes que se aplican

a células o tejidos provenientes de organismos vivos. Se demuestran: mitocondrias
con el verde de Jano, los gránulos de las células cebadas con el rojo neutro, la
sustancia granulofilamentosa de los reticulocitos con el azul brillante de cresyl,
ramificaciones nerviosas con el azul de metileno; o el ADN y el ARN de las células con
naranja de acridina (empleando el microscopio de fluorescencia).

PROCEDIMIENTOS MEDIATOS O POSTVITALES. Tienen por finalidad preparar células,

tejidos y órganos procedentes de seres en los que los procesos vitales se han
detenido y es necesario conservar la estructura que tenían en vida. De manera
general, para alcanzar este objetivo es necesario realizar los siguientes pasos:

Toma de la muestra - Fijación - Inclusión - Microtomía - Coloración o tinción - Montaje

A) TOMA DE LA MUESTRA: La calidad y la fidelidad con que una célula o un tejido
muestren una imagen al microscopio, con las características morfológicas que
poseían cuando estaban con vida, dependen esencialmente de la prontitud y el
cuidado que se aplicó para obtener la muestra a ser procesada mediante los pasos
mencionados anteriormente. Existen diversos procedimientos que permiten obtener
muestras de tejidos y órganos para conseguir preparaciones histológicas de buena
calidad. Estos son:

Biopsia: (del griego bios = vida y opsis = visión), consiste en la toma de un fragmento
de tejido u órgano de un ser vivo. Realiza a través de una operación quirúrgica hecha
exprofesamente o durante la intervención quirúrgica efectuada en pacientes y
corroborar así un diagnóstico de una determinada lesión. La biopsia puede ser:

Øincisional

Øexcisional

Øpor sacabocados

Øpor punción y absorción

Øpor raspado

Øpor trepanación

El estudio de células de superficies epiteliales de renovación constante (mucosas

bucal, gástrica, vaginal, uretral), se realiza a través de la Citología Exfoliativa. En otros
casos células obtenidas mediante punción (células sanguíneas o de la médula ósea)
se extienden en una lámina portaobjetos para hacer los "frotis”, colorearlas y
examinarlas (Figura 2).

Figura 2: La tinción nos permite separar cierto tipo de celulas. La diferencia en la

tinción radica en las estructuras de la pared celular de las bacterias.

Necropsia, las muestras se obtienen de seres muertos: En este caso es recomendable

que los tejidos y órganos se obtengan inmediatamente después de producida la
muerte. Las recomendaciones para la toma de las muestras es que los tejidos y los
órganos provenientes de biopsias y necropsias se seccionar empleando bisturís o
navajas de afeitar nuevos, sin hacer presión sobre ellos. No es recomendable el uso
de tijeras para cortar los tejidos pues éstas ocasionan compresiones y jalonamientos
de los tejidos y órganos que distorsionar su estructura microscópica. El tamaño de las
muestras no debe exceder de 10 mm por lado con un grosor de 5 mm.

B) FIJACION. Es un procedimiento cuya finalidad, al aplicarlo es Detener la vida de las

células e impedir las modificaciones post mortem que pueda sufrir la célula (procesos
autolíticos), manteniendo la estructura morfológica de células y tejidos sin que
ocurran cambios notables en ellos. Esto se consigue inmovilizando (por coagulación o
precipitación) las moléculas proteínicas e inhibiendo principalmente las enzimáticas
haciéndolas insolubles. Esta acción garantiza la integridad de las células y tejidos; se
efectúa por mediante agentes químicos denominados fijadores. Los fijadores se
clasifican en dos grandes grupos:

Oxidantes: el tetraóxido de osmio (ácido ósmico), el bicromato de potasio, ácido

crómico, bicloruro de mercurio o "sublimado corrosivo”, ácido pícrico, ácido acético.

Reductores: el formaldehido, el glutaraldehido, el alcohol etílico, el alcohol metílico.

La acción oxidante o reductora de los fijadores le confieren a las células ciertas

condiciones que posibilitan una mejor aplicación de las sustancias colorantes, por
ejemplo: el alcohol etílico absoluto conserva el glucógeno, el bicloruro de mercurio
provoca que las anilinas coloreen de manera más brillante a las fibras colágenas, el
bicromato de potasio facilita la coloración de las mitocondrias, el ácido acético
permite una mejor tinción de los núcleos, el cloruro de calcio conserva e insolubiliza
parcialmente a los lípidos. Los fijadores son:

a) Gaseosos: como el formaldehido

b) líquidos: como el ácido acético, al alcohol etílico, la acetona, etc.

c) sólidos: como el bicloruro de mercurio, el bicromato de potasio, etc.

Condiciones de un buen fijador. Una sustancia fijadora para que ejerza de manera
eficiente y adecuada sus funciones debe poseer las siguientes condiciones:

ØMatar inmediatamente a las células, impidiendo la aparición de los procesos

autolíticos. Para tal fin el fijador debe poseer:

ØUn buen poder de penetración, que en contados instantes se introduzca con rapidez
en el espesor de la muestra Un buen poder de difusión, que no fije sólo la porción
superficial de la muestra sino que alcance las porciones más profundas de la misma.

ØProducir cierta dureza a los tejidos sin que se provoque excesiva retracción o
hacerlos quebradizos y friables.
ØDebe de ser de fácil manipulación.

ØNo debe disolver componentes celulares.

ØQue sea fácil de conseguir y que sea barato.

Mientras que, las soluciones fijadoras suelen ser fijadores simples, o fijadores
compuestos (mezclas fijadoras) en las que utilizan más de una sustancia fijadora.
Ejemplo de fijador simple: Formol o formalina. Está considerado como la sustancia
fijadora de mayor uso en los laboratorios que realizan técnica histológica. El formol
comercial consiste en una solución acuosa del gas formaldehido al 39 - 40%. Se
presenta como un líquido claro, incoloro, que emite vapores sumamente irritantes
para las conjuntivas y la mucosa respiratoria. Su acción fijadora se ejerce coagulando
las proteínas. Es un fijador que posee un buen poder de penetración y difusión.
Mantiene de manera adecuada la estructura y facilita la coloración posterior de los
componentes celulares y tisulares. Endurece bien las muestras. Conserva bastante
bien a las grasas. Se le emplea en una solución al 10% (10 del formol comercial y 90
partes de agua) El tiempo de fijación de las muestras, dependiendo del tamaño de
ellas, debe ser de 24 a 48 horas como mínimo y si es posible, en refrigeración.
Fijadores compuestos. Una sola sustancia fijadora difícilmente reúne todas las
condiciones para ejercer una buena fijación, por lo tanto es aconsejable usar mezclas
fijadoras a través de las cuales se acrecientan las cualidades de un fijador y se
atenúan sus defectos y desventajas. A continuación se presentan algunos ejemplos de
fijadores compuestos o mezclas fijadoras que se emplean con mayor frecuencia:

Técnicas Histológicas

La reciente implantación y desarrollo de técnicas de detección y análisis de moléculas

individuales (SMD, del inglés "single-molecule detection") está permitiendo el acceso a
información sobre las propiedades dinámicas de las biomoléculas, que hasta hace
poco, permanecía oculta.

No es una exageración afirmar que las técnicas SMD están abriendo una nueva era de
la investigación. Las técnicas SMD permiten la visualización y manipulación de
moléculas aisladas sin dañarlas. El análisis de moléculas aisladas está actualmente
dominado por tres tipos de aproximaciones metodológicas diferentes: la técnica
electrofisiológica del pinzamiento zonal de membranas (patch-clamp), la microscopía
de fuerza atómica y métodos ópticos basados en la fluorescencia.

Patch-Clamp O Técnica Del Pinzamiento Zonal De Membranas.

La mayor parte de nuestro conocimiento actual sobre los canales iónicos procede de
la implantación de la técnica del pinzamiento zonal, introducida en 1976 por Erwin
Neher y Bert Sakmann (lo que les valió a ambos el Premio Nobel de Medicina y
Fisiología en 1991). Esta técnica permite el registro de las corrientes iónicas a través
de zonas minúsculas de membranas celulares. La técnica consiste, esencialmente, en
presionar la punta de una micropipeta de vidrio contra la superficie de la membrana
con ayuda de un microscopio y un micromanipulador, formándose un cierre
hermético. Hacia 1982 ya se habían desarrollado técnicas para sellar el fragmento de
membrana contra la punta de la pipeta, obteniéndose resistencias del orden de
gigaohmios, lo cual permitía registrar corrientes tan pequeñas como 0.1 pA. Este
elevadísimo grado de sensibilidad permitió detectar las corrientes iónicas debidas a
canales iónicos aislados.

Esta técnica puede ser aplicada en una amplia variedad de células, pero es
especialmente útil en el estudio de células excitables como las neuronas,
cardiomiocitos, fibras musculares y células pancreáticas beta. También puede ser
aplicada al estudio de los canales iónicos en las bacterias principalmente en
esferoplastos gigantes preparados (Figura 3).

Figura 3: Un esferoblasto arreglado con una pipeta de cristalLa grabación en la

fijación de membrana usa una micropipeta como electrodo que tiene una punta
abierta de cerca de un micrómetro de diámetro, un tamaño que encierra un área
superficial que a menudo contiene uno o pocos canales iónicos moleculares. Este tipo
de electrodo es diferente del Sharp microelectrode utilizado para implantar células en
registros intracelulares tradicionales donde es sellado en la superficie de la
membrana celular, en lugar de insertarlas. En algunos experimentos la punta de la
micropipeta es calentada en una micro forja para producir una superficie suave que
ayuda a formar un sello de alta resistencia con la membrana. El interior de la pipeta
es llenado con la solución correspondiente a la composición iónica de la solución de
baño, como en el caso de la grabación conectada por células o el citoplasma de todas
las células.Un alambre de cloruro de plata es puesto en contacto con esta solución y
conduce la corriente eléctrica al amplificador. El investigador puede cambiar la
composición de la solución o adicionar medicinas para estudiar los canales iónicos
bajo diferentes condiciones. La micropipeta presiona otra vez la membrana celular
para ayudar a la formación de un sello de alta resistencia entre el vidrio y la
membrana (un gigasello ya que la resistencia eléctrica es mayor a la de un sello
gigahomio). La gran resistencia de este sello hace posible aislar eléctricamente las
corrientes moderadas a través de la fijación de membrana con la incursión de poco
ruido, de esta forma brinda una estabilidad mecánica a la grabación.A diferencia de la
grabación tradicional de la abrazadera de voltaje con dos electrodos, la fijación de
membranas usa un solo electrodo para registrar corrientes. Muchos amplificadores
de la fijación de membranas no utilizan un verdadero circuito de abrazadera de
voltaje sino amplificadores diferenciales que utilizan un electrodo para establecer el
nivel cero de corriente. Esto permite al investigador mantener un voltaje constante
mientras se observa cambios en la corriente. Alternativamente puede ser sujetada
completamente manteniendo la energía constante mientras se observan cambios en
el voltaje de la membranaLa técnica del pinzamiento zonal admite diversas variantes.
Si después de sellar la punta de la pipeta contra la membrana se aplica una pequeña
succión, el fragmento de membrana pinzado se rompe, con lo que se consigue el
registro de la célula completa ("whole-cell recording", en inglés), que permite
cuantificar la corriente que atraviesa toda la superficie de una célula individual.
Separando la pipeta de la célula a partir de esta configuración, los bordes de la
membrana unidos a la punta de la pipeta se sellan, permitiendo así el registro
exterior-fuera ("outside-out patch recording", en inglés), en el que se pueden
determinar las corrientes iónicas que atraviesan los canales presentes en el
fragmento de membrana atrapado. Como el diámetro de la micropipeta empleada es
extremadamente pequeño, la corriente detectada corresponde a apenas uno o dos
canales iónicos. Por último, separando la pipeta de la célula antes de aplicar la
pequeña succión, se puede obtener el registro interior-fuera ("inside-out patch
recording", en inglés), ya que el parche de membrana queda revertido (Figura 4).
Figura 4. El diagrama muestra las variaciones de la técnica de fijación de
membranaWhole CellEl whole-cell (Figura 5) involucra grabaciones de corrientes a
través de múltiples canales a la vez sobre toda la membrana celular. El electrodo se
deja en el lugar de la célula, pero se aplica mas succión para romper cierto "pedazo”
de la membrana, produciendo así un acceso al espacio intracelular. La ventaja del
whole-cell patch sobre la grabación con micro electrodo de punta, es que la apertura
más grande del pico en la fijación de membrana provee menor resistencia y en
consecuencia mayor acceso eléctrico al interior de la célula. Una desventaja de esta
técnica es que el volumen del electrodo es mayor que el de la célula, de este modo el
contenido al interior de la célula es lentamente remplazado por el que está en el
electrodo, esto se conoce como la diálisis del contenido. Debido a esto cualquier
propiedad de la célula que dependa del contenido intercelular se altera. Usualmente
la solución utilizada en la pipeta se aproxima a un contenido con mucho potasio como
en el interior celular. Generalmente el comienzo del whole-cell patch tarda
aproximadamente 10 minutos, en este espacio es posible hacer mediciones antes de
comenzar la diálisis.

Figura 5. Grabación de una célula entera de una neurona del Hipocampo. La pipeta en
la fotografía ha sido marcada con un color leve azul.

Outside-Out PatchDespués de formado el whole-cell patch, el electrodo puede ser

lentamente retirado de la célula, permitiendo a una burbuja de la membrana salir de
la célula. Cuando el electrodo es retirado lo suficiente, esta burbuja se separa de la
célula y se reforma como una membrana convexa en el final del electrodo (como una
pelota abierta en la punta del electrodo), con la parte exterior de la membrana hacia
el exterior del electrodo, de esta manera si la burbuja de la membrana es lo
suficientemente pequeña es posible realizar grabaciones de un solo canal. "Outside-
out patch” brinda al investigador la oportunidad de estudiar las propiedades de un
canal iónico cuando se aísle de la célula y se expone a diferentes soluciones en la
superficie extracelular de la membrana. Esta es la ventaja distintiva que tiene el
"Outside-out patch” frente al "whole-cell patch”. Sin embargo es más difícil de realizar
ya que conlleva más pasos en su elaboración.Inside Out PatchDespués de la
formación del gigasello, la micropipeta es rápidamente retirada de la célula, de esta
forma rasgado el parche de la membrana celular, el parche queda unido a la micro
pipeta, de esta forma queda la superficie intracelular de la membrana queda
expuesta al medio externo. Esto es muy útil para el investigador cuando desea
manipular el medio ambiente en la superficie intracelular de los canales iónicos. Por
ejemplo los canales que se activan por ligamentos intracelulares pueden ser
estudiados a través de un rango de concentraciones de ligandos.Fijación De
Membrana PerforadaEs una variación del whole-cell patch en la que el investigador
comienza desde la creación del gigahom, pero no usa succión para romper el
"pedazo” de la membrana. En este método el electrodo contiene una concentración
menor de la solución de un agente antibiótico o antifúngico como el anfotericina beta,
nistatina, la gramicidina. Como las moléculas de antibiótico se difunden dentro de la
membrana fijada en pequeñas perforaciones, proveen acceso eléctrico al interior de
la célula. Este método tiene la ventaja de reducir la diálisis de la célula que ocurre en
el whole-cell patch , pero también tiene varias desventajas. En primer lugar la
resistencia al acceso es alta en relación con el whole-cell patch, debido a que la
membrana parcial ocupa la punta del electrodo (la resistencia al acceso resulta siendo
la suma de la resistencia del electrodo y la resistencia a la unión electrodo-célula).Esto
disminuiría el acceso eléctrico y en consecuencia la proporción de corriente, además
se incrementa el ruido en la grabación y se magnifica cualquier serie de error de
resistencia. Segundo, puede tomar una significante cantidad de tiempo para que el
antibiótico perfore la membrana (10-30 minutos, pero puede ser reducido situando
los electrodos en la forma correcta). Tercero, la membrana debajo de la punta del
electrodo es debilitada debido a las perforaciones formadas por el antibiótico y puede
romperse. Si el "pedazo” de membrana se rompe la grabación cambia a toda la célula
y el antibiótico contamina el interior de la célula.Parche SueltoLa fijación suelta de
membrana se diferencia ya que usa un sello suelto en lugar de un gigacello hermético
usado en la técnica convencional .Una ventaja del sello suelto es que la pipeta que se
usa puede ser movida repetitivamente de la membrana luego de la grabación y aun
así la membrana permanecerá intacta. Este método permite repetir mediciones en
varios lugares de la célula sin destruir la integridad de la membrana. Por otro lado un
gran desventaja es que la resistencia entre la pipeta y la membrana es reducida
grandemente, permitiendo a la corriente filtrarse a través del sello. Este filtrado
puede ser corregido, pero de todos modos este método ofrece la oportunidad de
comparar y constatar grabaciones hechas desde diferentes áreas en la célula de
interés.Técnica De Agrupación De CélulasEn esta técnica el electrodo es sellado a un
trozo de membrana y la célula permanece intacta. Esto permite la grabación de las
corrientes a través de un solo canal iónico en esa parte específica de la membrana,
sin perturbar el interior de la célula. Para los canales que están modulados por
receptores metatrópicos, el neurotransmisor o droga en estudio es usualmente
incluido dentro de la solución en la pipeta, donde puede hacer contacto con lo que
había sido la superficie externa de la membrana. Mientras la actividad resultante del
canal puede atribuirse a la droga usada, usualmente no es posible cambiar la
concentración de la droga. Así, la técnica se limita a un punto en la curva de respuesta
de dosis por cada parte. Habitualmente la reacción de la dosis se lleva a cavo usando
varias células y membranas. De todas formas el "voltage-gated ion channels” puede
ser sujetado en diferentes potenciales de membrana usando el mismo lugar, lo que
causa la activación del canal y completa la curva I-v (corriente-voltaje) puede ser
estabilizada con una sola fijación de membrana.OTRAS TÉCNICASMicroscopía de
fuerza atómica.Gerd Binnig introdujo esta técnica en 1986, el mismo año en que
recibió el Premio Nobel de Física (junto con Heinrich Rohrer y Ernst Ruska) por el
desarrollo de la microscopía de efecto túnel. En la actualidad, la microscopía de fuerza
atómica es la única técnica que permite obtener imágenes de muestras con
resolución por debajo del nanómetro y que puede operar en disolución. El
microscopio de fuerza atómica usa una aguja muy fina al final de un soporte flexible
para hacer un barrido sobre la superficie de la muestra. Las deflecciones del soporte
medidas a una resolución de unos pocos ángstroms sirven para determinar el
contorno de la muestra, generando imágenes que muestran la topografía de la
superficie de las biomoléculas analizadas. Esta técnica resulta particularmente
atractiva porque no sólo revela la superficie de un objeto en su estado nativo sino que
además ofrece una relación señal-ruido excepcionalmente elevada. Con esta técnica
ya se han conseguido sorprendentes imágenes que revelan características
submoleculares de biomoléculas aisladas. Es más, se pueden detectar mínimos
cambios estructurales en la superficie de una biomolécula con una resolución
temporal de unos pocos milisegundos, suficiente para poder monitorizar los cambios
conformacionales implicados en procesos biológicos concretos. Además, la aguja del
microscopio de fuerza atómica puede considerarse una nanoherramienta que
permite manipular moléculas aisladas (Figura 6). Figura 6. Micrografías de un
polímero que se obtuvieron con un Microscopio de Fuerza Atómica Nanoscope IV de
Digital Instruments en modo Tapping usando puntas de nitruro de silicio.Técnicas
ópticas.A diferencia de la microscopía de fuerza atómica, las técnicas ópticas no se
restringen al análisis de superficies y, por tanto, resultan mucho más versátiles en
relación al ambiente molecular, ofreciendo una aproximación particularmente
atractiva para analizar moléculas en equilibrio termodinámico, ya que estas técnicas
causan una mínima interferencia con el sistema biológico sometido a estudio.Aunque
ya se ha conseguido SMD (del inglés "single-molecule detection") aplicando la
espectroscopía Raman, la inmensa mayoría de las aplicaciones de técnicas ópticas
para SMD están basadas en métodos espectroscópicos para la detección de
moléculas fluorescentes. Un principio espectroscópico que ha progresado
recientemente hasta convertirse en una de las más prominentes herramientas para el
estudio de moléculas individuales es la transferencia de energía de resonancia (FRET).
La FRET es un proceso no radiactivo por el cual la energía de un fluoróforo donador
excitado es transferida a un fluoróforo aceptor en estado basal situado a una
distancia en el rango del nanómetro. El empleo de la FRET permite realizar estudios
de colocalización y/o interacción biomolécula-biomolécula, así como analizar cambios
conformacionales dentro de una biomolécula dada.Haces de luz láser pueden ser
empleados como auténticas pinzas ópticas que permiten atrapar y manipular
biomoléculas individuales con gran precisión. Manipulando la fuerza que se aplica a
estas pinzas ópticas se obtiene una respuesta similar a los cambios en el estado de
compresión de un muelle regidos por la ley de Hook. Se pueden registrar
desplazamientos con una precisión por debajo del nanómetro, que corresponde con
una precisión en la medida de la fuerza aplicada por debajo del piconewton. De esta
forma, ya es posible analizar el funcionamiento de motores moleculares
individuales.El desarrollo de estas técnicas implica también el desarrollo de la
tecnología relacionada. Un ejemplo de esto, lo constituye la estación de trabajo de
fisiología FN1 de Nikon, la cual ha sido diseñada especialmente para cubrir estas
demandas con manipulación eficiente y un ruido mínimo. (Figura 7).

Figura 7. Esquema del experimento de transmisión óptica asistida por ordenador

Figura 8. Corte sagital en donde se muestra la inserción de la sonda de microdiálisis,

en el núcleo estriado, así como la técnica estereotáxica.

Uno de los inconvenientes que presenta la técnica de microdiálisis es que no se

recoge el 100% de las sustancias presentes en el espacio extracelular, ni las sustancias
que se administran difunden por completo al medio. Esto depende de factores tales
como el tipo de membrana, el tamaño de la sustancia, su permeabilidad a través de la
membrana y el flujo de perfusión. De manera que, para una determinada sustancia, si
aplicamos flujos elevados, la difusión será baja, mientras que si disminuimos el flujo
de perfusión la difusión será mayor.Para indicar la cantidad de la sustancia que
atraviesa una sonda bajo unas determinadas condiciones experimentales, se define el
término recuperación como la relación entre la concentración de una sustancia
medida en el dializado recogido y su concentración en el medio exterior a la
membrana de microdiálisis. Esta recuperación normalmente se determina in vitro y se
expresa como porcentaje.Para calcular la recuperación de las diferentes sondas para
cada una de las sustancias estudiadas, se colocan las sondas en una disolución de
dichas sustancias a una concentración conocida. Después de perfundir la sonda con
medio Ringer, se recogen las muestras y se analizan midiendo la concentración de la
sustancia estudida en dichos dializados. La recuperación de la sonda para esa
sustancia se determina calculando el porcentaje que representan las cantidades
medidas en los dializados, respecto a la cantidad total presente en el medio externo a
la sonda.Las muestras obtenidas por microdiálisis son analizadas por cromatografía
líquida de alta eficacia (HPLC) con detección electroquímica. En la figura 9, se
muestran varios tipos y formas de sensores, cada uno registra respuestas diferentes.

Figura 9. Diferentes sensores utilizados en las neurociencias

Bibliografía.

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Última modificación: viernes, 15 de febrero de 2019, 15:45

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