Bacteriófagos

DEFINICIÓN

Los bacteriófagos o fagos son virus que infectan y lisan bacterias de manera
especie específica, consisten fundamentalmente de material genético y proteínas.
Su genoma puede componerse de DNA o de RNA el cual puede ser de cadena
doble o de una sola cadena. El mencionado material genético es protegido por una
cubierta de proteínas denominada cápside. La estructura de los fagos, es
determinada por sus proteínas de envoltura (o proteínas estructurales) cuya
función principal es la de proteger al material genético fágico, estas proteínas
pueden además proveer al fago de: cuello, cola, fibras caudales, laminas básales
y/o espículas.

La forma en la que se arreglan las proteínas alrededor del material genético del
virus, define la complejidad estructural y la forma del mismo, de tal modo que
existen fagos icosaédricos, helicoidales o filamentosos.

Su tamaño oscila entre 20 y 200 nm, son ubicuos (están en todas partes) y los
entes más abundantes de la biosfera, y se ha estimado que existen 10 10 fagos/
litro de agua de mar, lo que representa un excelente mecanismo de control de las
bacterias marinas dado que destruyen una parte de esa población bacteriana.

El organismo humano, está acostumbrado al contacto con los fagos dado que son
consumidos regularmente en los alimentos, por lo que son colonizadores
habituales del intestino humano, el cual contiene aproximadamente 1015
bacteriófagos (el ‘phageoma’), de aquí que no resulte extraño que los fagos no
produzcan graves efectos inmunológicos sobre los animales. El phageoma
individual varía dependiendo de la edad y salud de la persona, proporcionando así
un biomarcador útil de la salud humana

ANTECEDENTES O HISTORIA

En 1896 EH Hankin informó que el agua de los ríos Ganges y Jumna, en la India
tenía una acción bactericida marcada que se mantenía aun cuando ésta pasara
por un fino filtro de porcelana y que desaparecía si se hervía. Hankin, además,
estudió este efecto en particular sobre el Vibrio Cholerae y sugirió que, si se
ingería esta agua, la epidemia del cólera no se extendería pues en ella se
encontraba la sustancia responsable de la acción bactericida. Edward Twort en
1915 y Félix d´Herelle en 1917 informaron independientemente el aislamiento de
entidades ultra filtrables capaces de destruir cultivos de bacterias o producir
pequeñas áreas de color más claro cuando las bacterias crecían a confluencia en
placas de medio sólido. Fue el canadiense Félix d´Herelle, en el instituto Pasteur
de Paris, quien dio el nombre de “Bacteriófagos” a estas entidades y utilizó el
sufijo fagos en el sentido de partículas que viven a expensas de y no en el sentido
estricto de comer. Las primeras investigaciones con fagos estuvieron relacionadas
con la definición de la naturaleza de estas partículas, sin embargo, su capacidad
de provocar la lisis celular de microorganismos patógenos constituyó la base de
muchos trabajos encaminados a su uso en medicina. En 1921, Bruynogue y
Maisin comenzaron el tratamiento de infecciones por estafilococos con
bacteriófagos y aunque los resultados fueron muy promisorios se hizo muy poco
en los años sucesivos. La idea de la aplicación terapéutica de los bacteriófagos se
abandonó después de la introducción en la práctica médica asistencial de las
sulfonamidas, y con ellas, los antibióticos. A pesar de esto, la acción lítica de los
bacteriófagos in vitro permitió a los investigadores usar fagos específicos para
diferenciar entre varias especies de bacterias, y se desarrollaron métodos de
diferenciación actualmente muy útiles en las investigaciones epidemiológicas.

Independientemente del fracaso en el uso terapéutico de los bacteriófagos, grupos

aislados de investigadores continuaron las investigaciones para la aplicación de
estos agentes en el tratamiento de enfermedades infecciosas, como la
tuberculosis y la neumonía. La mayoría de los esfuerzos se concentraron en Rusia
y la India, donde los altos precios y la ausencia de disponibilidad de los
antibióticos estimularon la búsqueda de alternativas terapéuticas. La mayoría de
estas investigaciones, aunque mostraron resultados positivos, carecieron de
cuantificación clínica y grupos controles, lo que impidió determinar la eficacia del
tratamiento.
Las bacterias resistentes a antibióticos se propagan por el mundo, también
aquellas resistentes a los antibióticos de última generación como la vancomicina.
Esta resistencia se disemina principalmente a través de plásmidos, transposones y
elementos de inserción. El tratamiento con antibióticos para eliminar
microorganismos resistentes a múltiples medicamentos, generalmente, es
inefectivo y el crecimiento de las bacterias patógenas resistentes es un problema
de gran importancia para la práctica médica asistencial.

En el período1987-1999 se obtuvieron resultados que demostraron que el uso de

bacteriófagos en el tratamiento de diferentes enfermedades, es mucho más eficaz
en comparación con los antibióticos. En el estudio realizado, se incluyeron
pacientes con enfermedades infecciosas persistentes causadas por cepas
resistentes a antibióticos. Inicialmente se aislaron y caracterizaron las cepas
patógenas, se determinó su sensibilidad a bacteriófagos y se preparó un extracto
estéril de fagos que se administró por varias vías. Además del efecto curativo
como fueron desaparición de los síntomas y exámenes bacteriológicos negativos,
se demostró que los bacteriófagos incrementaron la protección contra infecciones
bacterianas mediante la destrucción de los microorganismos y la regulación del
sistema inmunitario. Estas alternativas pueden usarse en combinación con
agentes antimicrobianos como los antibióticos o como único tratamiento en las
infecciones ocasionadas por patógenos de importancia clínica como las cepas de
los géneros Enterococcus, Mycobacterium, Haemophilus, Neisseria,
Pseudamonas, Streptococcus y Staphylococcus, entre otras.

Varios investigadores concuerdan en que el mayor obstáculo para el tratamiento

médico con bacteriófagos es el propio sistema inmunitario que tiende a eliminarlos
con rapidez. Este hecho sugiere que los fagos no permanecen viables, en el
torrente sanguíneo o los tejidos del organismo, el tiempo suficiente como para
alcanzar los sitios de infección e infectar las bacterias patógenas. Esta desventaja
potencial, unida a la aparición de bacterias resistentes a antibióticos, propició la
búsqueda de variantes novedosas de fagos capaces de evadir los mecanismos del
sistema inmunitario.
Con este objetivo se desarrollaron varios métodos, pero los más útiles fueron la
selección de fagos, mutados o no, con mayor tiempo de vida media en los tejidos
del organismo mediante pases múltiples en ratones, y la obtención de
bacteriófagos modificados genéticamente que presenten en su superficie péptidos
o moléculas que antagonicen una o varias de las funciones del sistema
inmunitario. Dentro de las moléculas que pueden expresarse en la cápsida de los
fagos filamentosos con posibilidades de impedir la inactivación de estos virus, se
encuentran: péptidos y moléculas antagonistas de cualquiera de las vías del
sistema del complemento, interleuquinas y otras citoquinas, así como proteínas
glicosiladas y factores de inhibición.

ESTADO ACTUAL DE LA TERAPIA ANTIMICROBIANA CONTRA BACTERIAS

MULTIRRESISTENTES

De acuerdo con informes recientes de la Organización Mundial de la Salud, en EE.

UU. mueren anualmente aproximadamente 14 000 personas por infecciones
resistentes a los medicamentos. Internacionalmente el 60 % de las infecciones
reportadas son resistentes a los agentes antimicrobianos. En América Latina, las
cepas bacterianas más peligrosas han sido denominadas ESKAPE: Enterococcus
faecalis, Staphylococcus aureus, Klebsiella, Acinetobacter baumanii,
Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli.

A pesar de esta problemática, el número de nuevos antibióticos disponibles en el

mercado ha disminuido en la última década. No es un secreto que las grandes
compañías farmacéuticas han perdido el interés en la búsqueda de nuevos
antibióticos. Se estima que menos de diez compañías en EE. UU. y Europa
mantienen programas activos de investigación-desarrollo (I + D) para agentes
antimicrobianos. Este hecho está relacionado con que se estima que se ha
descubierto la mayoría de los blancos terapéuticos que permiten una toxicidad
selectiva de los compuestos y por otra parte, las nuevas metodologías, como la
exploración de los genomas microbianos y los métodos de búsqueda de elevado
tamizaje, no han cumplido las expectativas iniciales. En este escenario, también
ha influido la existencia de muchos antibióticos genéricos en el mercado, que
tienen grados variables de efectividad y que son utilizados como terapia de
primera línea por muchas autoridades sanitarias. Además, la duración de un
tratamiento con agentes antimicrobianos es limitada, lo cual es menos ventajoso
económicamente que la producción de medicamentos para el tratamiento de
enfermedades cardiovasculares, neurológicas, músculo-esqueléticas o el cáncer.6
Finalmente, las normas establecidas por las agencias reguladoras también han
influido en esta situación, como es el caso de la Administración de Alimentos y
Medicamentos en EE. UU. (FDA), que ha insistido en la necesidad de realizar
ensayos clínicos con placebo en pacientes con infecciones bacterianas severas, lo
cual ha frenado la realización de estudios clínicos fase II y III.

Actualmente, se estima que aproximadamente el 70 % de las bacterias que

causan infecciones en hospitales son resistentes, al menos a uno de los
antibióticos de primera línea. Algunas bacterias son resistentes a todos los
antibióticos aprobados y son únicamente tratadas con medicamentos
experimentales y potencialmente tóxicos. Por lo antes expuesto, los científicos y
médicos están reevaluando retrospectivamente la problemática para encontrar un
tratamiento efectivo en la terapia con fagos.

GRUPOS Y GÉNERO

Se pueden dividir según su ciclo de vida en:

 Fagos temperados o avirulentos (FaT), en los que el DNA viral puede

integrarse en el genoma de la bacteria infectada y replicarse junto a esta,
transmitiéndose de una generación a otra sin que se produzca la lisis
celular. Este fenómeno se conoce como lisogenia; a la cepa así infectada
como lisógeno y al DNA viral integrado como profago. En determinadas
condiciones (de temperatura, pH, agentes mutagénicos, etc), el profago
puede comenzar un ciclo lítico que conducirá a la lisis celular. Están
involucrados en la transmisión de genes de virulencia y resistencia
antimicrobiana.
  Fagos líticos o virulentos (FaL), que provocan la lisis de las células
hospedadoras, liberando una nueva progenie fágica en un proceso
conocido como ciclo lítico.

Además, como todos los virus se clasifican de acuerdo al tipo de material genético
que contienen (DNA de cadena simple —ssDNA— o doble —dsDNA—, RNA de
cadena simple —ssRNA— o doble —dsRNA—). Y se han agrupado en las
siguientes familias:

Corticoviridae: cápside icosaédrica, envueltos por una cubierta lipidaca, dsDNA

superenrollado.

Cystoviridae: cápside icosaédrica, envueltos por una cubierta lipidaca, tres

moléculas de dsRNA lineal.

Fuselloviridae: pleomórfico, envueltos por una cubierta lipídica, sin cápside,

dsDNA circular superenrrollado.

Inoviridae (genus Inovirus): largos filamentos con simetría helicoidal, ssDNA

circular.

Inoviridae (genus Plectrovirus): bastones cortos con simetría helicoidal, ssDNA

circular.

Leviviridae: cápsides cuasi icosaédricas, una molécula de ssRNA lineal.

Lipothrixviridae: filamentos envueltos por una cubierta lipídica, dsDNA lineal.

Myoviridae, A1: cola contráctil, cabeza isométrica.

Myoviridae, A2: cola contráctil, cabeza alongada (longitud /ancho ratio = 1,3-1,8).

Myoviridae, A3: cola contráctil, cabeza alongada (longitud/ancho = 2 o más).

Plasmaviridae: pleomórfico, envueltos por una cubierta lipídica, sin cápside,

dsDNA circular superenrollado.

Microviridae: cápside icosahedrica, ssDNA circular.

ESTRUCTURA

Los bacteriófagos complejos poseen una cabeza de simetría icosaédrica que

contiene el genoma, unido a ella se encuentra una estructura helicoidal
denominada cola, la cual permite inyectar el genoma viral en la bacteria
hospedera. Según el tipo de fago, un disco se asocia a esta cola, al cual se
encuentran unidas fibras flexibles de tipo proteico que permiten que este se fije a
la superficie de la bacteria y se produzca la inyección del genoma en su
citoplasma. Los fagos de la serie T par son ejemplos típicos Uno de los fagos más
ampliamente estudiados es el bacteriófago T4; el cual presenta una estructura en
forma de renacuajo, compuesta por una cabeza, cuello y cola; los cuales median
la adherencia del fago a la superficie de las células hospederas. Las fibras de las
colas de los fagos, se unen específicamente a moléculas receptoras de lipo-
polisacáridos presentes en el exterior de la membrana de la célula bacteriana
hospedera. Esta unión desencadena una serie de cambios conformacionales de
las fibras mencionadas que permiten la inyección del material genético: la funda
exterior de la cola y el agujero en el centro se dilatan, y se da la contracción de la
vaina del tubo a través del orificio en la base del disco, lo que permite la inserción
de su genoma a través de la pared celular de la bacteria hospedera; dicho proceso
está probablemente facilitado por una enzima viral (una lisozima), que facilita la
incorporación de la cola del fago por la degradación de la parte exterior de la
pared celular

CICLOS DE VIDA Y MECANISMO DE ACCIÓN

La infección lítica comienza con el reconocimiento de fago receptores en la

superficie bacteriana, tales como: antígenos, pili, glucano, polisacáridos,
proteínas y otras estructuras, dando lugar a la adsorción viral (cabe destacar que
el receptor es específico para cierto tipo de fagos), posteriormente, el fago
implanta su material genético (ARN o ADN) en la bacteria mediante la liberación
de una lisozima del fago a través de su cola, la cual degrada una porción de la
pared celular, esto permite que la vaina de la cola entre en contacto y empiece su
introducción a través de la membrana bacteriana, mientras el ácido nucleico es
liberado y entonces empieza la biosíntesis del ácido nucleico viral por parte de la
bacteria hospedera al mismo tiempo que el ADN de la bacteria es degradado y se
detiene la síntesis de proteínas bacterianas, gracias a que el DNA o RNA del fago
toma el control de la célula bacteriana, utilizando los nucleótidos y enzimas de
replicación de la bacteria, para replicar su genoma. Finalmente, los nuevos fagos
producen holinas y endolisinas, las holinas son proteínas transportadoras que
permiten a las endolisinas (enzimas) atravesar la membrana hasta su sitio de
acción, degradando el peptidoglucano y así formar poros, causando
despolarización que produce lisis bacteriana, con ello la liberación de nuevos
fagos. No obstante, el ciclo lítico puede presentar fallas al destruir el material
genético bacteriano y ensamblar fagos con fragmentos de este, fenómeno llamado
transducción.
La transducción puede ser generalizada o especializada, la primera, por errores en
el ensamblaje de los nuevos fagos, se producen virus con material genético
bacteriano y viral exclusivamente, la segunda, se mezcla el genoma bacteriano y
viral, dando como resultado fagos con ambos genomas, en ambos, si la bacteria
posee genes de resistencia y virulencia, estos serán transmitidos en el siguiente
ciclo, por lo tanto, se deben utilizar FaL no transductores.

En el caso del ciclo lisogénico, tras la adsorción y la penetración del DNA, los
fagos temperados son capaces de establecer una relación con el hospedador. El
DNA viral se integra como un profago en el genoma bacteriano, pudiendo
replicarse junto a este durante numerosas generaciones. Las células
lisogenizadas presentan inmunidad frente a la infección, es decir, no pueden
volver a ser infectadas por el mismo virus. Además de la inmunidad y de algunos
casos concretos de conversión lisogénica, en general exhiben un fenotipo normal

En determinadas condiciones, el profago puede comenzar un ciclo lítico, que

conduce a la destrucción de la celula hospedadora, liberándose nuevos viriones.
Este proceso conocido como inducción puede producirse espontáneamente o
provocarse con luz UV o con mutágenos como la mitomicina C. Los genes
implicados en el establecimiento y mantenimiento de la lisogenia esta agrupados
en el módulo de la lisogenia. Estos módulos tienen una organización genética muy
similar entre todos los Introducción 8 fagos de la familia Siphoviridae que infectan
bacterias gram-positivas de bajo contenido en GC

-Interruptor genético. Mecanismo que determina que tras la infección de un fago

temperado se desencadene el ciclo lítico o ciclo lisogénico. En la mayoría de los
casos se basa en dos proteínas codificadas por el genoma viral y que actúan
como reguladores de la transcripción. Estas proteínas son el represor, CI y Cro
(Ptashne 1986). CI reprime la expresión de los genes líticos provocando el
establecimiento del ciclo lisogénico. Además, es responsable de la inmunidad, ya
que también inhibe la síntesis de RNA de otros viriones que intenten infectar la
misma célula bacteriana. Por el contrario, Cro inhibe la expresión de los genes
lisogénicos tempranos, incluido CI y activa la expresión de los genes líticos.
Debido a que el represor es capaz de reprimir la transcripción de Cro, existe una
competencia entre ambas proteínas, cuyo resultado determinara cuál de los dos
ciclos, líticos o lisogénicos, se lleva a cabo.

SELECCIÓN DE FAGOS

-Recogida de muestra: Los fagos se pueden encontrar en cualquier ambiente,

siendo el agua su hábitat habitual. Elevadas concentraciones de fagos pueden
localizarse en agua dulce, agua de mar y en plantas de tratamientos de residuos.
Con menor frecuencia pueden encontrarse fagos en suelos o en material
inanimado. Otra fuente de origen de fagos, son los seres humanos, tanto sanos
como infectados. Muestras de saliva, piel y heces han mostrado alta concentración
de fagos. Finalmente, cabe destacar que en ambientes más hostiles se han
detectado fagos con un amplio espectro de acción frente a diversas especies
bacterianas.

-Transporte y conservación de la muestra: La muestra recogida se podrá

transportar a temperatura ambiente, será conservada a 4ºC en el laboratorio y
usada como máximo hasta de una semana después de la recogida. Los fagos
requieren que se tengan en cuenta las condiciones en las que son estables, ya
que al ser básicamente estructuras proteicas son susceptibles a diversos factores
que pueden alterar su estabilidad. Todo ello puede generar una reducción del título
de fagos durante el almacenaje o durante la producción. Los factores que pueden
afectar negativamente a la estabilidad de los fagos son las proteasas, los cambios
de temperatura, los cambios en el pH y fuerza iónica. Estas medidas se deben
establecer individualmente para cada fago o para cada cóctel de fagos como
consecuencia de la naturaleza de cada uno de ellos.

-Establecer efectividad: Una vez aislados los fagos a partir de muestras

ambientales es necesario establecer su valor como agentes antimicrobianos, lo
que condicionará su uso como terapia fágica. Para ello es necesario enfrentarlos
en primer lugar a las bacterias de interés y así establecer su capacidad infectiva.
Para esto se pueden utilizar múltiples pruebas como “spot test”, que consiste en la
preparación de placas de doble agar con la bacteria embebida en la capa superior,
el depósito de gotas con una solución con fagos sobre esta capa y la observación
de presencia de lisis tras un período de incubación. Se considerará que un fago es
potencialmente útil frente a una cepa bacteriana concreta cuando sea capaz de
producir un punto de lisis transparente, sin ningún tipo de turbidez que indique la
aparición de resistencia

-Evaluar su genoma: Una vez seleccionado el fago por su capacidad infectiva es

necesario analizar su genoma a fin de detectar la presencia de genes que los
puedan invalidar para su uso en terapia, pero también la de otros genes que los
puedan favorecer como candidatos para la terapia fágica. También se evalúa si
hay presencia de genes deletéreos, descartados en el caso de que se identifique
cualquier gen relacionado con resistencia a antibióticos, factores de virulencia,
toxinas o elementos transductores y si su ciclo de vida es lisogénico

-Cocteles de fago: Generalmente, los fagos se caracterizan por su especificidad

frente al huésped, por lo que una de las estrategias para alcanzar un amplio rango
de huésped es la combinación de distintos fagos en forma de “cócteles de fagos”.
Idealmente, un cóctel de fagos tiene que ser capaz de eliminar al menos el 70-
80% de las cepas clínicas diana. El uso de cócteles de fagos también reduce el
desarrollo de resistencias bacterianas frente a las infecciones por fagos. Los
cócteles de fagos no deben ser mezclas aleatorias de fagos, ya que cada fago
puede interferir con la capacidad de infección del resto de los componentes del
cóctel. Esta interferencia puede ser tanto sinérgica como antagónica, por ello los
efectos de las distintas combinaciones deben ser analizadas sobre las cepas. Si
un fago candidato demuestra una mayor eficiencia colectivamente que
individualmente, la interferencia positiva con los fagos del cóctel está garantizada.

-Combinación con antibióticos: Múltiples trabajos han analizado la actividad

sinérgica de los fagos con los antibióticos mostrando varias importantes
conclusiones: i) Diferentes interacciones entre el fago y el antibiótico son
fuertemente afectados por la clase de antibióticos; ii) Los fagos generalmente
reducen la concentración mínima inhibitoria (MIC) del antibiótico; iii) La
combinación de fagos y los antibióticos modulan la adaptación (resistencia)
bacteriana; iv) La resistencia bacteriana hacia los antibióticos impacta en la terapia
de combinación; v) Factores del paciente tales como el tipo de muestra, afecta a
estos tipos de interacciones; y finalmente vi) Fagos similares pueden producir
resultados dramáticamente diferentes. Por todo ello, es necesario analizar la
combinación de cada cóctel de fagos con un antibiótico o un fago combinado con
múltiples antibióticos.

USOS

Dada la creciente crisis de la resistencia a los antibióticos, se crea la necesidad de

realizar un esfuerzo coordinado por parte del sector de la salud pública para
evaluar el potencial de la terapia con fagos como un complemento de los
antibióticos.15 Actualmente, las aplicaciones de los bacteriófagos, presentan una
gran diversidad que van desde su uso terapéutico para enfermedades infecciosas
como vectores de genes para enfermedades de diversa índole como las
enfermedades neurodegenerativas (utilizándolos como componentes estructurales
para el empaquetamiento del material genético de los cósmidos), así como
biomarcadores del estado de salud/enfermedad y a su vez utilizados como
reporteros de la diversidad microbiana y el control de la microbiota intestinal, entre
otros.

Resistencias

Efectos adversos

Ventajas y desventajas