SEMINARIO DE CLONACIÓN:

1. Define clonación molecular

La clonación de ADN, o clonación molecular, es la introducción de un fragmento de ADN
denominado inserto dentro de una molécula de ADN denominada vector, que puede
replicarse de manera autónoma e independiente del genoma de la célula hospedadora. El
resultado es la obtención de millones de copias de una molécula recombinante o clona
molecular compuesta por ADN proveniente del inserto y del vector.

2. Define vector (usado en clonación).

Un vector se define como una molécula de ADN de doble cadena (DNAds), con capacidad de
albergar un fragmento de ADN exógeno (de otro origen) y que podemos introducir en una
célula huésped.

3. Nombra y define los tipos de vectores que conoces.

- Vectores de clonación: Los vectores son de clonación si su finalidad es el
almacenamiento de secuencias y la obtención de grandes cantidades del ADN
insertado o de la molécula recombinante. Los vectores de clonación suelen ser
plásmidos, fagos, fagémidos, cósmidos y cromosomas artificiales bacterianos o de
levadura.
- Los vectores de expresión: son aquellos cuyo objetivo es producir un transcrito (ARN)
o la proteína producto de ese transcrito. Los vectores de expresión pueden ser
plásmidos o fagos.
- Vector de clonación y expresión: Un vector de clonación contiene elementos como el
origen de replicación, un sitio múltiple de clonación (SMC), que es una secuencia
específica reconocida por diversas enzimas de restricción para poder insertar el
ADNc del gen de interés y un marcador de selección. Un vector de expresión se utiliza
para producir una proteína recombinante y contiene, además de los elementos
mencionados, un promotor y un sitio IRES (sitio de entrada interna al ribosoma), así
como una secuencia de poliadenilación.

4. Características de un vector de clonación.

1. Tiene que poder replicarse independientemente junto con el segmento de ADN de
transferencia.
2. Debe contener algunos sitios de corte para enzimas de restricción, presentes solo
una vez en el vector. Estos sitios de restricción se cortan con una enzima de
restricción y se utilizan para insertar segmentos de ADN cortados con la misma
enzima.PREGUNTAR SI ESTO TAMBIÉN
3. Debe tener algún marcador de selección, para poder distinguir/ seleccionar las
células huésped que transportan el vector de las que no lo contienen.
4. El vector de la célula huésped debe ser fácil de recuperar.
5. Nombra los elementos que forman un vector de clonación.
- Origen de replicación
- Marcador de selección
- Lugar de clonación múltiple.

6. ¿Qué es un ORI? ¿Cuál es su función?

Origen de replicación: Es una secuencia en el ADN del vector que provee un sitio único de
reconocimiento a las proteínas que identifican el sitio de inicio de la replicación (ORI). Los
plásmidos se caracterizan por tener un solo sitio ORI en su genoma y realizar una
replicación unidireccional. *Lugar de reconocimiento para inicio de replicación. Le permite
replicarse de manera autónoma.

7. ¿Qué es un marcador de selección? ¿Cuál es su finalidad?

Es un gen que generalmente confiere resistencia a un antibiótico o genera un fenotipo
particular con el cual puede seleccionarse la célula huésped que incorporó el vector.
- Finalidad: seleccionar las bacterias que han adquirido/ tienen plásmido y las que
no, sometiendolas a un antibiótico, aunque también se puede usar fluorescencia.

8. ¿Qué es un sitio de clonación múltiple? ¿Cuál es su función?

Es un fragmento de ADN que contiene una serie de sitios únicos de reconocimiento para
enzimas de restricción, muy cercanos entre sí, con una amplia gama de posibilidades de
insertar cualquier fragmento de ADN. Los sitios de restricción más comunes presentes en el
sitio de clonación múltiple de la mayoría de los vectores son para las enzimas EcoR I, Hind
III, BamH I, Xho I y Kpn

9. ¿Qué es un vector de clonación? ¿Qué tipos conoces?

Es un vector cuya finalidad va a consistir en el almacenamiento de secuencias y obtención
de grandes cantidades de nuestro insertos.
Existen varios tipos: Plásmidos, bacteriófagos , cósmidos, cromosomas artificiales

13. ¿Qué es un vector de expresión? ¿Para qué se utiliza?

Los vectores de expresión son plásmidos o bien bacteriófagos que se emplean con dos
finalidades: generar el ARN producto de la transcripción o bien producir la proteína
codificada en la secuencia génica que portan (proteína recombinante).

14. ¿Cuáles son los componentes de los vectores de expresión?

- Origen de replicación (ORI)
- Marcador de selección
- Sitio de clonación múltiple
- Promotor de la transcripción eficiente
- Señal finalización de transcripción
- Sitio de entrada al ribosoma/Lugar de unión al ribosoma
- Señal de inicio traducción, codón de inicio ATG
15. ¿Cuáles son los pasos que hay que seguir para clonar un fragmento de ADN?
La clonación de cualquier fragmento de ADN involucra los siguientes pasos:
1. Preparación del inserto de ADN que se va a clonar.
2. Preparación del vector para la clonación.
3. Ligación del inserto y el vector.
4. Preparación/Obtención de células competentes.
5. Transformación celular.
6. Identificación de las colonias celulares que contienen el vector recombinante.

16. Describe cómo se prepara un vector para clonación

- Cortar con enzimas de restricción el plásmido. Una o dos (siempre que sea posible,
las mismas que para el inserto).
- Desfosforilar para evitar que se vuelva a unir(autoligación) y hacer que se
mantenga lineal. Para ello empleamos la fosfatasa.
- Purificar el ADN plasmídico para eliminar todos los contaminantes y enzimas para
que no interfieran posteriormente.

17. Describe cómo se prepara un inserto para clonación

- Cortar ADN con una o dos enzimas de restricción. Lo ideal es cortar con una única
enzima de restricción que genere extremos cohesivos. Si no se puede se usan dos
enzimas, y a poder ser, que generen extremos cohesivos. Esto facilita la unión y que
se inserte en la dirección adecuada.
- Hacemos una electroforesis, comprobamos la presencia de la banda de tamaño
deseado (la que corresponde al tamaño de nuestro inserto) y después seleccionamos
la banda que nos interesa, la recortamos del gel y purificamos.

18. ¿Cómo se logra la unión del inserto con el vector?

Utilizando la enzima ligasa, pues establece los enlaces fosfodiéster entre el inserto y el
vector, dando lugar al ADN recombinante.

19. ¿Qué es una célula competente? ¿Cuál es su utilidad?

Una célula competente es una célula (bacterias) que está apta para recibir DNA exógeno.
La competencia puede ocurrir naturalmente o puede ser producida a través de diferentes
técnicas. La función de todo esto es aumentar su permeabilidad para que nuestro ADN entre
con mayor facilidad, es decir, para que haya una mayor probabilidad de éxito en la
transformación.

20. ¿Cómo introducimos el vector recombinante dentro de la célula receptora?

- Meter en la misma solución de Ca2Cl bacterias y el ADN recombinante.
- Transformación celular, es decir, introducción del ADN recombinante en el interior
bacteriano.

21. Define: transformación, transducción y transfección.

Transformación: Introducción de un inserto a través de un plásmidos en una bacteria.
Transducción: Introducción de ADN mediante bacteriófagos.
Transfección: Introducción de ADN exógeno en células eucariotas.
22. ¿Cómo identificamos las colonias que portan el vector recombinante? DUDA
Para identificar las bacterias transformadas se utilizan marcadores de selección
proporcionados por los vectores. Los más utilizados son los genes de resistencia a
antibióticos, como la ampicilina, la tetraciclina, el cloramfenicol y la kanamicina.

23. ¿Cuáles son las aplicaciones de la clonación molecular? DUDA

La clonación génica tiene múltiples aplicaciones y ha sido el principal impulsor de la
biotecnología y la metodología del ADN recombinante.
Este proceso puede emplearse para:
1. La producción de proteínas eucariotas en bacterias (proteínas recombinantes),
como hormonas, antibióticos, vacunas, generación de cultivos transgénicos
resistentes a plagas o sequías,
2. Producción de organismos transgénicos capaces de producir en su leche proteínas
recombinantes (véase capítulo de organismos transgénicos),
3. El establecimiento de librerías genómicas o genotecas, que han permitido secuenciar
por completo el genoma humano y el de otros organismos.

24. Explica el esquema que aparece a continuación:

Se someten las bacterias, que contienen un plásmido
con un vector de resistencia a un antibiótico; se meten
en un medio de cultivo con el antibiótico al que son
resistentes, cultivamos y sólo obtenemos la bacteria
que nos interesa,que contiene un gen de selección,
resistente a un antibiótico.
1.- Cortamos el inserto/plásmido
2.- Ligamos / Formación de vector de resistencia con
vector combinante
3.- Transformación
4.- Cultivo de esas bacteria de un medio con un antibiótico.

26. Observa el siguiente esquema y responde a las cuestiones:

a) ¿Qué proceso esquematiza la figura?
Producción de insulina, en bacterias
b) ¿Qué tipo de vector se emplea?
Vector de expresión
c) ¿Qué componentes son necesarios en dicho vector para que E.coli
exprese insulina humana? ¿Por qué?
- Origen de replicación (ORI)
- Marcador de selección
- Sitio de clonación múltiple
- Promotor de la transcripción eficiente
- Señal finalización de transcripción
- Sitio de entrada al ribosoma/Lugar de unión al ribosoma
- Señal de inicio traducción, codón ATG
Porque estamos transcribiendo eucariotas en procariotas