NTC 4458 DE 2018 : MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS Y DE ALIMENTOS PARA ANIMALES.

MÉTODO
HORIZONTAL PARA EL RECUENTO DE COLIFORMES O Escherichia coli O AMBOS. TÉCNICA DE
RECUENTO DE COLONIAS UTILIZANDO MEDIOS FLUOROGÉNICOS O CROMOGÉNICOS

PRESENTADO A INSTRUCTORA:
CAMILA UBAQUE
 

 
PRESENTADO POR:
SANTIAGO MORENO
z CARLOS BLANCO
MALEIDY CASTRO
OSCAR CETINA
FERNANDA RISCANEVO
MARTHA CUBILLOS
MERYS ANGULO
JAVIER YARA 
 

 
CENTRO NACIONAL HOTELERIA TURISMO Y ALIMENTOS
SERVICIO NACIONAL DE APRENDIZAJE
12 DE MARZO DE 2021
BOGOTA D.C
z Objeto y campo de aplicación
Esta norma proporciona las directrices generales de un
método horizontal para el recuento de coliformes,
Escherichia coli, o ambos, presentes en productos
destinados al consumo humano o alimentación de
animales, por medio de la técnica de recuento de colonias
en un medio sólido cromogénico o fluorogénico después de
su incubación a 35 °C mas o menos 1 °C.
 Principio
z
BACTERIAS COLIFORMES FRENTE A UN MEDIO
CROMOGÉNICO: Cuando se utiliza la técnica
enzimática, el grupo coliforme se define como toda
bacteria que posea la enzima β-D galactosidasa; la cual
tiene la propiedad de actuar sobre el substrato
cromogénico, generando un color especifico,
dependiendo del medio, a partir de la liberación del
cromógeno.
 Escherichia coli FRENTE A UN MEDIO
z FLUOROGÉNICO: Cuando se utiliza la técnica
enzimática, Escherichia coli es definida, como
toda bacteria que da respuesta positiva al grupo
coliforme y posee además la enzima B-
Glucuronidasa, la cual tiene la propiedad de abrir
el substrato fluorogénico, resultando en la
liberación del fluorógeno.

El medio de cultivo utilizado se basa en la

tecnología del substrato definido, el cual
emplea nutrientes - indicadores que producen
color, fluorescencia, o ambos, al ser
metabolizados por los microorganismos
coliformes y E. coli; los cuales son detectados
simultáneamente.
 z
GENERALIDADES
Se realizan siembras utilizando un medio de cultivo
selectivo y empleando una cantidad especificada de la
muestra de ensayo si el producto inicial es líquido, o una
cantidad especificada de una suspensión inicial en el caso
de otros productos.

Se realizan otras siembras en las mismas condiciones,

usando diluciones decimales de la muestra de ensayo o
de la suspensión inicial.

Se incuban las placas a 35 °C +o- 1 °C

durante 24 h.

Se calcula el número de coliformes y E. coli por

mililitro o por gramo de muestra a partir del
número de colonias obtenido en las cajas
seleccionadas
 z
Medios de cultivo

 Certificados de fabricante  Verificación de desempeño

 z
Medio selectivo solido
 Usar medio selectivo solido valido para la identificación por
medio cronomogénico o fluorogénico de E coli.
 EQUIPO Y MATERIA
PARA LABORATORIO

z
APARATO
z DE ESTERILIZACION EN SECO ( Horno) o
HUMEDO ( Autoclave)

La esterilización por calor seco produce la destrucción de los

microorganismos por oxidación de sus componentes celulares. Éste es
un proceso menos eficiente que la esterilización por calor húmedo,
porque los microorganismos mueren con mayor rapidez cuando se
encuentran en presencia de agua, ya que éste permite que se altere con
mayor facilidad la configuración de sus proteínas y proporciona un
medio para distribuir el calor uniformemente en toda la cámara interna
del equipo de esterilización. Por esta razón, para lograr la
esterilización del material empleando el calor seco, se deben aplicar
temperaturas más altas durante mayor tiempo.
z
INCUBADORA

En biología, una incubadora es un dispositivo que sirve

para mantener y hacer crecer cultivos microbiológicos o 
cultivos celulares. La incubadora mantiene la temperatura,
la humedad y otras condiciones en grado óptimo, tales
como el contenido de dióxido de carbono (CO2) y de 
oxígeno en su atmósfera interior. Las incubadoras son
esenciales para una gran cantidad de trabajos
experimentales en biología celular, la microbiología y en 
biología molecular y se utilizan para cultivos celulares,
tanto bacterianos como de células eucariotas.
 CAJAS DE PETRI
z
PIPETAS DE SUMINISTRO TOTAL O MICROPIPETAS

La placa o caja de Petri es un instrumento de laboratorio que consta de una base circular y
sus paredes son de una altura baja, aproximadamente de 1 cm. Posee una cubierta de la
misma forma pero algo más grande de diámetro, para que se pueda colocar encima y cerrar
el recipiente, aunque no de forma hermética, para proteger el cultivo de agentes externos
que lo podrían contaminar.
Este instrumento es de cristal o plástico transparente, lo que permite observar el crecimiento
de los cultivos. Las cápsulas de plástico se desechan una vez que se han utilizado. Las
de vidrio, por su parte, se pueden reutilizar después de haber sido descontaminadas y
esterilizadas.

Miden unos 10 cm de diámetro, aunque esta longitud puede variar

En las placas de Petri se recrean las condiciones necesarias para permitir el crecimiento y
desarrollo de las células. Por lo general, se les proporciona un medio líquido o semisólido y
alimento
 Descripción del equipo
z
 La micro pipeta es un instrumento de laboratorio empleado para absorber y transferir pequeños volúmenes de líquidos y permitir su
manejo en las distintas técnicas científicas.
Los volúmenes captables por estos instrumentos varían según el modelo: los más habituales, denominados p20, p200 y p1000,
admiten un máximo de 20, 200 y 1000 μl, respectivamente.
Es de destacar que el uso de micro pipetas permite emplear distintos líquidos sin tener que lavar el aparato: para ello, se emplean
puntas desechables, de plástico, que habitualmente son estériles. Existen varios tipos de puntas: por ejemplo, las amarillas para
pipetear volúmenes pequeños (por ejemplo, 10 μl), y las azules para pipetear volúmenes grandes (por ejemplo, 800 μl).

 Tipos
Existen micro pipetas manuales, en las que el volumen a aspirar se fija girando un botón en su parte superior que está conectado a
un sistema analógico de confirmación de volumen, y automáticas, en las cuales dicho sistema es digital.
Hay micro pipetas simples, que sólo acogen una punta cada vez, y multicanales, que permiten incorporar múltiples puntas (por
ejemplo, ocho), absorbiendo el mismo volumen en todas ellas.
Actualmente, se reconocen fácilmente en el mercado dos de las mejores marcas que existen: Eppendorf y Nichiryo  

 Operación del Equipo

Técnica de pipeteo para líquidos claros:
a. Se presiona el botón superior suavemente hasta el primer tope.
b. Se sumerge la punta, en la solución que se necesita pipetear estando seguros que la punta este bien colocada y que no haya
ningún tipo de residuos entre la punta y el cuerpo de la pipeta.
c. Mantenga la pipeta verticalmente mientras toma la solución.
d. Para descartar la solución de la punta presione el botón hasta el segundo tope.
e. Descarte las puntas utilizando el eyector que traen las pipetas. Técnica de pipeteo para líquidos con alta viscosidad:
a. Presione el botón superior hasta el segundo tope.
b. Sumerja la punta en la solución (2-3 mm) y suelte el botón despacio. La punta tiene que estar bien llena.
c. Descarte el líquido de la punta presionando suavemente el botón superior hasta el primer tope. Cuidados y Mantenimiento del
Equipo
a. Iniciar el día limpiando la parte externa de las pipetas de polvo o suciedad.
b. Use solamente etanol al 70% para la limpieza de la pipeta. Otro tipo de solvente no es aconsejable.
c. Utilizar las puntas adecuadas a las pipetas y a la cantidad de solución que se va a medir.
d. El pistón y el cilindro pueden ser chequeados dos veces al año si la pipeta es usada diariamente
 z BAÑO DE AGUA
EQUIPO DE RECUENTO DE COLONIAS

 El Baño de María es un equipo de laboratorio el cual esta conformado

como un recipiente lleno de agua caliente. El baño de maría se utiliza para
incubar muestras en agua a una temperatura constante durante un largo
período de tiempo. Todos los baños de agua tienen una interfaz digital o
analógica que permite a los usuarios establecer la temperatura
deseada. Las aplicaciones incluyen calentamiento de reactivos, fusión de
sustratos o incubación de cultivos celulares. También se utiliza para
permitir que ciertas reacciones químicas se produzcan a altas temperaturas.
El baño de maría es una fuente de calor preferida para calentar productos
químicos inflamables en lugar de una llama abierta para evitar la ignición.

 Se utilizan diferentes tipos de baños de agua dependiendo de la aplicación.

Para todos los baños de agua, se puede utilizar hasta 99.9 °C.  Cuando la
temperatura está por encima de 100 °C, se pueden utilizar métodos
alternativos tales como baño de aceite, baño de silicona o baño de arena.
 z

En la microbiología existen aparatos y equipos que facilitan el trabajo y acortan

su tiempo, uno de estos aparatos son los contadores de colonias. Los
contadores de colonias facilitan enormemente este trabajo, por lo que se han
convertido en auxiliares indispensables en todo tipo de laboratorio
bacteriológico. Un contador de colonias es un instrumento mayormente utilizado
en los laboratorios y en la industria farmacéutica. Este aparato sirve para contar
colonias de bacterias y microorganismos que por lo general crecen en una placa
de agar. Las principales ventajas que ofrece este instrumento se encuentran en
el conteo fácil, rápido y seguro de las colonias bacteriológicas, así como su fácil
manejo. El contador de colonias permite la visualización de colonias bacterianas
en un fondo oscuro, ya sea con o sin sistema de iluminación, uniforme y
brillante. El recuento de las colonias se realiza fácilmente con un contador digital
electrónico y mediante el electrodo tipo pluma que generalmente se suministra
con el equipo. Hoy en día, los contadores desempeñan su función
electrónicamente, identificando áreas individuales de oscuridad y otras de luz
 z
MEDIDOR DE P.H

El pH-metro es un sensor utilizado

en el método electroquímico para
medir el pH de una disolución. El
valor de pH consiste en medir el
potencial que se desarrolla a través
de una fina membrana de vidrio que
se encarga de separar dos
soluciones con diferente
concentración. Con esto se logra que
se conozca muy bien la sensibilidad y
la selectividad de las membranas de
vidrio durante el pH
 MUESTREO

z
PREPARACIÒN DE LA MUESTRA DE
z
ENSAYO
 INOCULACIÓN E
INCUBACIÓN
Se toma dos cajas de Petri estériles, usando una pipeta o
una micropipeta, se transfiere a cada caja 1ml de la
muestra de ensayo.

z
Se toman dos cajas de Petri estériles y usando otra pipeta
o micropipeta se transfiere a cada caja 1ml de la primera
disolución decimal (10-1 ) si el producto es liquido, y 1 ml de
la primera disolución decimal (10-2) de la suspensión inicial
en caso de otros productos
Se vierten aproximadamente 10 a 15 ml del medio
de cultivo especifico a 45°C ± 2°C en cada caja de
z Petri.
 Después que se complete la solidificación, se vierten
aproximadamente 4 ml de medio de cultivo que cubra la
superficie a 45°C ± 2°C sobre la superficie del medio ya
z
inoculado.

Se invierten las cajas preparadas y se incuban a 35 °C ± 1 °C

durante 24 h ± 2 h
 z

Si el objetivo del análisis es solo la determinación de

E. coli, es mejor incubar a 34 °C ± 1 las primeras 4
horas y después a 44 °C ± 1 por 18 a 20 h
 RECUENTO DE COLONIAS

Después del periodo indicado de incubación

seleccione las cajas que contengan no mas de
z se cuentan las colonias de
150 1 colonias,
coliformes típicas y no típicas.

Utilizando una lampara de fluorescencia se hace

la lectura de bacterias E. coli fluorescencia
positiva.
EXPRESIÓN DE LOS
RESULTADOS
z
Después del periodo especificado de incubación para coliformes Y para
E.coli, realizar el conteo de coliformes, incluyendo la E. coli y expresar
independiente el conteo de bacterias coliformes del conteo de bacterias
E. coli glucuronidasa positivas, utilizando el equipo para el recuento de
colonias
Escherichia
z
coli - medio fluorogénico

Examinar las cajas de petri usando una lámpara de luz ultravioleta (preferiblemente de 6 watios, de onda
larga (366 nm)). La presencia de fluorescencia es una prueba positiva para E. coli. Si la fluorescencia es
cuestionable incubar por un periodo adicional de 4 h para la prueba con ONPG y hasta por un periodo
adicional de 20 h para verificar la fluorescencia intensificada como prueba de resultado positivo.
 z
Escherichia coli - medio cromogénico
En el agar (TBX- -D glucurónido) las colonias de E. coli presentan un color azul
verdoso. Se debe comprobar la presencia de E. coli mediante pruebas
confirmatorias
Escherichia coli - medio agar con triptona bilis x
glucorónido
z
5-bromo-4-cloro-3-indolil-D-
glucuronido

Examinar las cajas de petri que presentan colonias de color verde azuladas (D-
glucorónido). Se presume que la prueba es positiva para la presencia de E. coli.
Métodos de calculo

Caso general
 Cajas que contengan entre 15 y 150 colonias características:
Lo que se haces que se seleccionan las cajas que contengas no mas de 150 colonias las
características son dos diluciones consecutivas.

 Es necesario que unas de la cajas contenga al menos 15 colonias características.

 Se calcula el numero N de colonias por mililitro o por gramos del producto, estos es
z
dependiendo el caso esto se hace usando la siguiente ecuación.
Se redondea el resultado calculados con dos cifras significativos.
z

Se toma como resultado el numero de unidades formadoras de colonias UFC/ml o UFC/g

de producto expresado como un numero de 1,0 y 9,9 por días 10* donde * es la potencia
apropiada de 10

Casos en los que cada caja contiene menos de 15 colonias características.

Si cada una de las cajas seleccionadas contienen menos de 15 colonias características,
lo que se hace es calcular es numero estimado NE de coliformes usando las misma
ecuación anterior.
Estimación de números pequeños
Si las zdos cajas correspondientes a la muestra de ensayo( productos líquidos)o ala
suspensión inicial (otros productos) contienen menos de 15 colonias características los
resultados se reportan así.

 15 UFC/ml (productos líquidos)

 15 x 1/d (otros productos) en donde d es el facto de dilución de la suspensión inicial.

Colonias no características
Si las os cajas características ala muestra de ensayo (producto liquido) o a la muestra
inicial ( otros productos) no contienen colonias características el resultado es el
siguiente.

 1 UFC/ml (producto liquido

 1x 1/d UFC/g (otros productos) donde d es el factor de dilución de la suspensión
inicial.
Ítem 12.Precision
z
 12.1 cajas que contengan entre 15 y 150 colonias características
12.2 Cada caja tiene menos de 15 Colonias características (ver
numeral 11.2)
z