TECNOLÓGICO NACIONAL DE MÉXICO

INSTITUTO TECNOLÓGICO DE TEPIC

ANÁLISIS INSTRUMENTAL 7A y 7B

EXPOSICIÓN SOBRE CROMATOGRAFIA DE LIQUIDOS ESPECIALIZADOS

Ingeniería Química
Unidad III Metodos Cromatrograficos
Docente: Salvador Barajas Gonzales
INTEGRANTES:
Natalia Jimena Miramontes Alvarez Nahomi Mendoza Julio Cesar Ramos Cardenas
Fernanda Maeda Aguayo Rocio Cristal Garcia Aguilar Laura Rocio Soto Ballesteros
Ximena Rosalinda Ramos Lopez Edith Alejndra Peña Garcia Melissa Guzman Romero
Frida Haritzy Echeverria Pavia Angela Nayely Melo Gomez
Hiram Antonio Corella Zapata
Victor Ayllon Lopez Avala Hector Moises Camacho Martinez
Guillermo Adolfo Garcia Ruelas
Yaneli Elizabeth Mundo Aquino
Alexis Michelle Mancilla Soto
Cromatografía Líquida de Alto Rendimiento (HPLC)

Es una técnica que permite separar mezclas complejas de sustancias de

procedencia diversa, productos poco o nada volátiles con el propósito de
identificarlas, cuantificarlas y purificarlas.
La primera cromatografía
La primera cromatografía verdadera suele atribuirse al botánico ruso-italiano Mikhail Tsvet.
Tsvet aplicó sus observaciones sobre la extracción con papel de filtro a los nuevos métodos
de fraccionamiento en columna que se habían desarrollado en la década de 1890 para
separar los componentes del petróleo.
Mikhail Semiónovich Tsvet
Objetivo

Analizar y comprender las diferentes técnicas que existen de análisis en la cromatografía de

líquidos especializados.
De tal manera comprenderemos las partes que componen un cromatógrafo; en sí la utilidad y
papel que cumplen al momento de realizar una prueba de fase móvil o estacionaria en un
solvente líquido.
 Fundamentos

La cromatografía líquida de alta eficacia se encuadra dentro de la cromatografía de elución. En ésta,

un líquido (fase móvil) circula en íntimo contacto con un sólido u otro líquido inmiscible (fase
estacionaria); al introducir una mezcla de substancias (analitos) en la corriente de fase móvil, cada
analito avanzará a lo largo del sistema con una velocidad diferente que dependerá de su afinidad por
cada una de las fases. Esto supone que después de terminado el recorrido de la muestra por la
columna, cada una de las substancias introducidas en el sistema se diluirá con un tiempo diferente, es
decir, estarán separadas.
 Clasificación de la cromatografía líquida

Los diferentes tipos de cromatografía líquida se pueden clasificar

de diferentes maneras, pero la forma más habitual de clasificación
es la realizada en base a la naturaleza de la fase estacionaria, ya
que es ésta la que impone fundamentalmente el mecanismo de
separación; de este modo, se pueden enumerar cuatro tipos de
técnicas:

● Cromatografía de adsorción (líquido-sólido). La fase

estacionaria es un adsorbente y la separación se basa en
repetidas etapas de adsorción-desorción.
Cromatografía de reparto/adsorción (fases ligadas químicamente). La
separación en este caso, se basa en un reparto del soluto entre la fase
móvil y la fase estacionaria.

Cromatografía de intercambio iónico. Este tipo de cromatografía se da

cuando la fase estacionaria presenta en su superficie grupos ionizados
capaces de retener selectivamente a iones de signo contrario que circulan
en la fase móvil.

Cromatografía de exclusión molecular.

La fase estacionaria, en este caso, es un
material poroso de tamaño controlado,
que permite la entrada de ciertas
moléculas de manera selectiva, dejando
fuera otras de mayor tamaño.
 Tipos de cromatografo de liquidos

Cromatógrafo de Líquidos Isocrático.

El equipo de cromatografía de líquidos de alta

resolución Varian ProStar 215, consta de una bomba
para operación isocrática, una válvula de inyección
Pheodyne modelo 7125, un detector ultravioleta/visible
con longitud de onda fija modelo Pro Star 320 y un
detector de índice de refracción con control de
temperatura modelo Pro Star 350, usando como
graficador el programa Star Varian Cromatography
Workstation System Control Versión 5.50 instalado en
un computador personal.
 Tipos de cromatografo de liquidos

Cromatógrafo de Líquidos de Gradiente.

El cromatografo de líquidos de alta resolución, Varian

Vista 5500 consta de una bomba A,B,C para elución
por gradiente con una válvula de inyección Pheadyne
modelo 7125, un detector ultravioleta/visible con
longitud de onda fija modelo 5500 y un detector de
Indice de refracción con control de temperatura
modelo 320 y un registrador de datos tipo linear 1200.
 Instrumentación

Si bien es cierto que para realizar una cromatografía líquida tan solo es necesario disponer de las dos
fases implicadas en el proceso y de la columna, la moderna cromatografía de líquidos de alta eficacia,
debido al pequeño diámetro de las partículas de fase estacionaria que se utilizan, requiere de la
utilización de unos dispositivos que constituyen el cromatógrafo.
Los componentes básicos de un cromatógrafo de líquidos son:

● Dispositivo de suministro de eluyentes (bomba y dispositivo de mezclado de eluyentes).

● Dispositivo de inyección.
● Conducciones y conexiones.
● Detector y registrador.
● Columna
Además de los dispositivos anteriormente mencionados se pueden incorporar en el sistema otros que
pueden simplificar el trabajo o bien mejorar algún aspecto concreto de la técnica cromatográfica, como
pueden ser:

● Inyectores automáticos.
● Colectores de fracciones.
● Sistemas de tratamiento de datos
Recipientes para la fase móvil y sistemas para el tratamiento de los
disolventes

Un aparato moderno de
HPLC se equipa con uno o
más recipientes de vidrio o
de acero inoxidable, cada
uno de los cuales contiene
unos 500 mL de un
disolvente. Los recipientes
a menudo se equipan con
un sistema para eliminar los
gases disueltos -en general
oxígeno y nitrógeno- que
interfieren formando
burbujas en los sistemas de
detección.
Un desgasificador puede consistir en un sistema de bombeo por vacío, un sistema de destilación,
dispositivos para calentar y agitar los disolventes o, como se muestra en la Figura anterior,
sistemas de difusión que permiten arrastrar los gases disueltos fuera de la solución mediante finas
burbujas de un gas inerte de baja solubilidad. Con frecuencia estos sistemas también contienen un
dispositivo para la filtración del polvo y de las partículas sólidas en suspensión de los disolventes.
No es necesario que los desgasificadores y los filtros sean partes integrantes de los sistemas de
HPLC.
Sistemas de bombeo

Los requisitos para un sistema de bombeo en

HPLC son rigurosos e incluyen: (1) la generación
de presiones por encima de 400 kg/cm2, (2) un
flujo libre de pulsaciones, (3) un intervalo de
caudales de 0.1 a 10 mL/min, (4) el control y
reproducibilidad del caudal mejor del 0,5%
relativo y (5) componentes resistentes a la
corrosión (juntas de acero inoxidable o teflón).
Debe subrayarse que las altas presiones que
generan las bombas de HPLC no constituyen un
riesgo de explosión, debido a que los líquidos no
son muy compresibles. De este modo, la rotura
de un componente del sistema sólo supone una
pérdida de disolvente. Es evidente que esta
pérdida puede suponer un riesgo de incendio.
Sistema de inyección de muestras

En cromatografía de líquidos el método más

ampliamente utilizado para la introducción de
la muestra utiliza bucles de muestra, como el
que se muestra en la siguiente imagen. Estos
dispositivos están normalmente integrados en
el equipo cromatográfico y hay bucles
intercambiables que permiten la elección de
tamaños de muestra desde 5 a 500 µL. Con
bucles de este tipo se puede introducir la
muestra a presiones de hasta 500 kg/cm2 con
una precisión relativa de unas décimas por
ciento. También existen válvulas de inyección
de micromuestras, con bucles con volúmenes
de 0,5 a 5 µL.
Columnas
Las columnas para cromatografía de líquidos se construyen de ordinario con tubo de acero
inoxidable de diámetro interno uniforme. Cientos de columnas empaquetadas que difieren en
tamaño y relleno se comercializan por distintos fabricantes y su coste oscila, por lo general, de
30 000 a 100 000 pesetas.
 LOOP

Es un dispositivo
por el que se
introduce la
muestra líquida,
sólida o gaseosa en
la fase móvil o en el
lecho
cromatográfico.
 Sistema de suministro de fase móvil
La misión de la bomba es la de suministrar un caudal constante y libre de
pulsos de la fase móvil a través de la columna, sin que el flujo sea
influido por la presión en cabeza de columna
Un sistema de bombeo ideal debe cumplir las siguientes características:

● Estar construido con materiales químicamente inertes frente a la

fase móvil.
● Ser capaz de trabajar a presiones elevadas.
● Proporcionar un flujo libre de pulsaciones o llevar asociado un
amortiguador de éstas, ya que las pulsaciones, aunque no afectan
a la separación en sí, pueden contribuir al ruido de fondo del
detector y por lo tanto disminuir la sensibilidad.
● Suministrar flujos adecuados para los diferentes tipos de columnas.
● El caudal que suministran debe ser constante a lo largo del tiempo,
ya que de él depende la reproducibilidad de los tiempos de
retención
 TIPOS DE BOMBAS

La clasificación de las bombas utilizadas en

cromatografía de liquidos se puede realizar
atendiendo a la fuerza motriz, así se tendrán:

● Bombas neumáticas:
Bombas de desplazamiento directo.
Bombas amplificadoras de aire.
TIPOS DE BOMBAS

● Bombas de motor eléctrico :

Bombas de jeringa.
Bombas alternantes (pistón o
membrana).
 Sistema de mezcla de fase móvil
Los dos principales métodos de mezclado de los componentes de la fase móvil se conocen como
mezclado a alta presión y mezclado a baja presión.

Mezclado de alta presión: consiste en utilizar una bomba para cada uno de los disolventes que se van a
mezclar, estando la salida de cada bomba conectada a una conexión en "T" o a una pequeña cámara de
mezcla. Como ventajas, una buena reproducibilidad de las mezclas, una rápida respuesta en los cambios de
concentración.

Mezclado de baja presión: En los equipos de mezcla en baja presión, el mezclado de los diferentes
componentes se lleva a cabo antes de éstos, controlando el caudal del sistema cromatográfico por medio de
una sola bomba. El mezclado en baja permite la mezcla de dos o más componentes de la fase móvil con una
buena reproducibilidad
 Sistemas de inyección
El método de introducción de la muestra en CLAR, es de
importancia capital, pues un mal sistema de inyección puede
dar lugar a ensanchamientos de la banda cromatográfica
que deterioren la eficacia del sistema cromatográfico.

Un inyector ideal debe tener las siguientes características:

● Introducir la muestra en la columna como una banda lo

más estrecha posible.
● Ser de fácil manejo.
● Dar lugar a resultados reproducibles, tanto en la
cantidad de muestra inyectada como en el
ensanchamiento que origina en la banda
cromatográfica.
● Ser capaz de trabajar a presiones elevadas.
Tipos de sistemas de inyección:

Inyectores de jeringa: Las ventajas de este tipo de inyector, radican en su facilidad de construcción y
en que permiten sacar todo el partido a la eficacia ofrecida por la columna; por el contrario, son
inyectores que presentan una gran falta de reproducibilidad, tienen una presión de trabajo limitada y son
de gran dificultad de manejo.

La inyección mediante válvulas: Consiste en una válvula de seis vías, dos de las cuales están
conectadas entre sí por medio de una espira, Esta espira es un tubo de volumen conocido, cuya misión
es la de contener la muestra antes de efectuar la inyección.
 Conducción

El tubo de conducción puede considerarse como un volumen muerto del sistema y, por lo tanto, es de
vital importancia la utilización para esta finalidad de tubos capilares en los que el diámetro interno sea
pequeño y evitar al máximo posible la utilización de grandes longitudes de tubo de conexión; de este
modo, se consigue reducir en la medida de lo posible el volumen muerto del sistema.
Las características de un detector para cromatografía, son principalmente:
1.- Características que no afectan a la eficacia de la separación.

Respuesta: Es la señal ofrecida por el detector ante una determinada variación de la propiedad física
del eluyente que es medida. Esta propiedad debe ser proporcional a la variación de masa del soluto que
sale de la columna o a su concentración.
Ruido: Es cualquier perturbación de la señal generada por el detector y que no es originada por la salida
de un soluto de la columna. El ruido de fondo del detector, se compone a su vez de otros dos tipos de
ruido: ruido de corto alcance y ruido de largo alcance.
Deriva: Es la variación de la señal de base a lo largo del tiempo, que origina una variación lenta y
progresiva de la línea de base
Sensibilidad: Este parámetro indica la cantidad mínima de soluto que es posible detectar, y es
dependiente del ruido y deriva de la señal de un detector ruido del detector.
Rango dinámico: Es el rango de concentraciones de soluto entre las cuales el detector produce una
respuesta dependiente de la concentración de soluto a la salida de la columna. El valor mínimo, se
corresponde con la sensibilidad del detector, y el máximo, con la concentración de soluto a partir de la
cual la respuesta del detector es constante.
2.- Características que afectan a la eficacia de la separación

Volumen de la cubeta: El volumen de la cubeta puede provocar una pérdida considerable de la eficacia
del sistema, ya que volúmenes grandes de célula originan un efecto de dilución exponencial del soluto
que sale de la columna, formándose el pico y pudiéndose mezclar dos solutos que salen separados de la
columna.

Constante de tiempo:
Indica el tiempo que necesita la electrónica del detector
para asumir la señal instantánea originada por el soluto.
TIPOS DE DETECTORES

El detector es el módulo del cromatógrafo de

líquidos, situado a la salida de la columna,
que proporciona de forma continua
información acerca de la composición del
flujo que circula a través de él. Generalmente
origina una señal eléctrica continua, que
debidamente amplificada y registrada,
constituye el denominado cromatograma, del El detector es la parte del equipo cromatográfico que
que se extrae información cuantitativa y permite “ver” y ubicar en tiempo y espacio la posición
cualitativa de la muestra inyectada. de cada componente de una muestra a la salida de la
La existencia de un detector on-line eleva a la columna cromatográfica. Se trata del módulo del
categoría de instrumento al cromatógrafo de cromatógrafo de líquidos, situado a la salida de la
líquidos. columna, que proporciona información de forma
continua acerca de la composición del flujo que circula
a través de él.
Detector UV-Vis

Es el detector más empleado en HPLC. Posee buena sensibilidad y rango lineal, y permite detectar analitos en el orden
de los nanogramos. No es destructivo y puede emplearse con gradiente de disolventes, con la única limitación de que
éstos sean transparentes en la longitud de trabajo . En general permiten cambiar el volumen de su celda, típicamente con
volúmenes de 1 a 12 mL. Es un detector muy poco sensible a los cambios de caudal y de temperatura. El detector UV
opera en el rango de 190 a 350 nm, y suele extenderse a la zona visible del espectro 350-700 nm recibiendo así el
nombre de detector UV-Vis. La concentración del analito en la muestra se determina por la aplicación de la ley de Beer
A=abc, donde A es la absorbancia, a es la absortividad molar del analito, b es el camino óptico de la celda medido en cm
y c es la concentración del analito en la muestra expresado en mol/L. Existen dos tipos de detectores UV: los detectores
de onda fija y los de longitud de onda variable.
Detectores de absorbancia ultravioleta con filtros
Los detectores de absorción UV más simples son los fotómetros de filtros con una lámpara de mercurio
como fuente. Lo más común en estos casos es aislar la línea intensa a 254 nm por medio de filtros; en
algunos equipos también se pueden utilizar las líneas a 250, 313, 334 y 365 nm empleando otros filtros.
Resulta obvio que este tipo de detector se utiliza de forma restringida para aquellos solutos que
absorben a alguna de estas longitudes de onda.

Detectores de absorbancia ultravioleta con monocrornadores

La mayoría de los fabricantes de instrumentos de HPLC ofrecen detectores que consisten en un
espectrofotómetro de barrido con óptica de red. Algunos se limitan a la radiación ultravioleta;
mientras que otros abarcan la radiación ultravioleta y la visible.
Detectores de absorbancia
El flujo de líquido que sale de la columna pasa a través de una pequeña celda, de pequeño volumen
(entre 1 a 10 μL), para minimizar el ensanchamiento de banda. La medida de la absorbancia del líquido
que la atraviesa en función del tiempo constituye el cromatograma. Su límite de detección oscila entre
0’1 y 1 ng y puede emplearse en cromatografía de elución en gradiente.

Detectores de fluorescencia

Los detectores de fluorescencia para HPLC son semejantes en diseño

a los fluorímetros y espectrofluorímetros. En la mayoría de ellos, la
fluorescencia se detecta por medio de un detector fotoeléctrico
colocado perpendicularmente respecto al haz de excitación. Los
detectores más sencillos utilizan una fuente de excitación de mercurio,
y uno o más filtros para aislar la radiación fluorescente.
Detectores electroquímicos

Los fabricantes de instrumentos proporcionan en la actualidad varios tipos de detectores

electroquímicos. Estos dispositivos se basan en cuatro métodos electroanalíticos que incluyen la
amperometría, la voltamperometría, la coulombimetría y la conductimetría.
Columna
La columna es el elemento fundamental de un cromatógrafo de líquidos, puesto
que es en ella donde tiene lugar la separación.
Las columnas más utilizadas en cromatografía de líquidos son las de relleno; estas
columnas consisten en un tubo, generalmente de acero, relleno de una fase
estacionaria adecuada al tipo separación que se pretende llevar a cabo. El
diámetro interno varía entre 2 y 60 mm dependiendo su utilización, a escala
analítica o semipreparativa, y su longitud varía entre 5 y 30 cm.
Las características de la columna que influyen sobre su capacidad de
separación son:
● Diámetro interno
● Longitud
● Conexiones (reducciones)
● Relleno
● Tamaño de partícula del relleno
Las partes de que se compone una
columna de cromatografía líquida.
 Diámetro de la columna

La elección del diámetro interno de la columna se realiza en función de la cantidad de

muestra a separar. Para las separaciones a escala analítica se suelen usar columnas de
pequeños diámetros (1 a 6 mm) mientras que en los trabajos a escala preparativa se
superan los 10 mm de diámetro interno.

Las columnas analíticas de más amplio uso suelen tener 4,6 mm de diámetro interno.
 Longitud de columna

La eficacia de la columna depende, entre otros factores, de la longitud de la columna y, a

igualdad de otros parámetros, mayores longitudes de la columna permitirán obtener
mayores eficacias. Las columnas de cromatografía líquida en ningún caso pueden tener
longitudes extremadamente grandes.
 Conexiones

En los extremos de la columna se montan los sistemas de conexión

para poderlas unir al detector y a los sistemas de inyección y bombeo
de eluyentes.
La conexión, en este caso, es realmente una unión reductora de
compresión radial, que permite una perfecta unión del tubo de la
columna con el capilar que la conecta a los restantes dispositivos del
cromatógrafo. Estas uniones no deben presentar volumen muerto,
deben permitir el paso de secciones anchas de tubo a capilares, y
deben ser fácilmente montables y desmontables.
 Relleno
Las fases estacionarias en cromatografía de líquidos, están constituidas generalmente por
partículas de materiales rígidos o semirrígidos, y en la gran mayoría de los rellenos se suele utilizar
sílice con este fin, aunque también es posible encontrar rellenos basados en polímeros sintéticos.

En la mayoría de los rellenos de columnas de cromatografía líquida, la sílice utilizada realiza una
de las tres funciones siguientes:
● Superficie adsorbente.
● Soporte de la fase estacionaria.
● Actuación como substrato microporoso.

Las propiedades de la sílice que propician su utilización como soporte se pueden resumir en:

● Gran resistencia mecánica

● Amplia gama de formas, tamaños y diámetros de poro, lo que permite
conseguir una gran variedad de estructuras
● Gran variedad de sílices en cuanto a superficie específica
 Tamaño de partícula

El tamaño de partícula juega un papel importantísimo en la calidad y

eficacia de la columna.
Las partículas utilizadas inicialmente para rellenos en cromatografía
líquida, eran bastante grandes (de más de 40 µm) y totalmente porosas.
En la actualidad, los tamaños de partícula habituales se encuentran
comprendidos entre 3 y 10 µm de diámetro, aunque en la gran mayoría de
los casos, los análisis se están realizando con rellenos de 5 ó 10 µm.
Como dato importante, cuanto menor sea el tamaño de partícula, la
presión en cabeza de columna se incrementa de forma proporcionalmente
inversa al cuadrado del tamaño de la partícula.
Elección de la partícula y de la fase móvil
La elección del sistema cromatográfico debe realizarse en función de la naturaleza de las substancias a
separar.
Es necesario, por lo tanto, conocer los mecanismos de separación más generales utilizados en
cromatografía de líquidos. Básicamente éstos se pueden dividir en:
➔ Adsorción.
● Cromatografía líquido-sólido (CLS).
➔ Adsorción/reparto.
● Cromatografía con fases ligadas (CFL).
● Cromatografía de fase normal (CFL).
● Cromatografía de fase reversa (CFR).
➔ Intercambio iónico.
● Cromatografía de intercambio iónico (CII).
● Cromatografía de cambio catiónico.
● Cromatografía de cambio aniónico.
➔ Tamaño molecular.
● Cromatografía de exclusión molecular (CEM).
● Cromatografía de filtración en gel (CFG).
Cromatografía de adsorción

Fundamentalmente, se tiene este mecanismo de separación cuando la fase estacionaria es un sólido, con una
superficie que contiene grupos funcionales cuyas características les permiten interaccionar con los compuestos a
separar y con la fase móvil. La cromatografía sólido-líquido se fundamenta en este mecanismo y los sólidos utilizados
habitualmente como fase estacionaria son alúmina o sílice. Este tipo de cromatografía es el más antiguo de todos (es
el usado por Tswett en 1903).

La teoría más aceptada por los cromatografistas para explicar las interacciones que se producen en cromatografía de
adsorción, es la denominada mecanismo de desplazamiento, que permite comprender el comportamiento de los
diferentes sistemas de cromatografía de adsorción.
Equilibrios:
● Cantidad de puntos activos sobre la superficie de la fase estacionaria.
● La fuerza eleuotrópica (,o ) de la fase movil (fuerza
de adsorción del eluyente sobre la fase móvil).
● Relación de fases. Fase movil adsorbida/ fase movil sin adsorber.
● El soluto.
Las fases estacionarias más utilizadas en cromatografía de adsorción son la sílice y la alúmina, cuya
principal característica común reside en la elevada actividad superficial. Los parámetros que permiten
orientar sobre la actividad de estas fases estacionarias son:

● La superficie específica
● El tamaño de poro de la partícula

La fase móvil juega un papel principal en la cromatografía líquida, ya que es la variable del sistema que
permite mayor variación y que, por otra parte, permite efectuar los pequeños retoques necesarios para
lograr una perfecta separación.Cromatografía con fases ligadas

Estas fases ligadas químicamente han dado origen a dos modos de separación:
● Cromatografía en fase inversa
● Cromatografía en fase normal.
El mecanismo por el que se produce la retención en la cromatografía de fase inversa se puede explicar
de dos formas:
● Reparto entre dos fases líquidas.
● Adsorción del soluto a la fase estacionaria.
En la elección de fases estacionarias, las más habitualmente utilizadas son:
● Cadenas hidrocarbonadas de 18 carbonos para fase inversa.
● Cadenas con extremos amino para fase normal.
La fase móvil

Cromatografía de fase normal -cromatografía sólido-líquido,

Cromatografía de intercambio iónico

Todos aquellos compuestos que presentan un grupo funcional cargado eléctricamente, en disolución
acuosa, pueden ser separados atendiendo al signo y la carga neta que presentan. Esta propiedad es
aprovechada para realizar separaciones mediante la técnica de cromatografía que se conoce con el
nombre de intercambio iónico.

Las fases estacionarías para intercambio iónico pueden clasificarse, según la carga del grupo funcional,
en intercambiadoras de aniones o de cationes.
La fase móvil juega el papel principal en la retención del soluto ya que, en este caso, permite controlar
los equilibrios entre soluto, contraion y fase estacionaria
Variables:
● La fuerza iónica.
● El pH.
● El modificador orgánico.
Cromatografía de exclusión molecular

Este tipo de cromatografía líquida, se basa en la diferencia de tamaños de las moléculas a separar, comportando
esta técnica como un auténtico tamiz (por lo que recibe también el nombre de cromatografía de tamiz molecular).
La fase estacionaria actúa como un pequeño tamiz, que deja penetrar a las moléculas más pequeñas en los
poros del relleno, mientras que las más grandes son arrastradas rápidamente por la fase móvil.
Las características que debe cumplir la fase estacionaria de cromatografía de exclusión son:
● Tener estructuras poliméricas rígidas.
● Tener un tamaño de poro controlado.
● El tamaño del poro no debe variar en las condiciones cromatográficas.
● Debe ser inerte frente a los solutos y a la fase móvil
La fase móvil utilizada para este tipo de cromatografía
debe reunir las siguientes características:
● Debe solubilizar perfectamente a la muestra.
● No debe disolver la fase estacionaria.
● No debe interaccionar ni con la muestra ni con la fase estacionaria.
Aplicaciones de cromatografía líquida

Es la técnica escogida para el aislamiento y purificación de productos de valor en las industrias químicas y farmacéuticas así como en
la biotecnología y la bioquímica. La cromatografía preparativa comprende un amplio rango de aplicaciones, desde el aislamiento de
1µg de muestra para identificación espectroscópica hasta el aislamiento de un compuesto puro de una mezcla de 100 g.

El campo de aplicación de la técnica en refractometría líquida es muy extenso. Algunas de las aplicaciones se enumeran a
continuación:

● Productos farmacéuticos: antibióticos, sedantes, esteroides, analgésicos

● Bioquímica: aminoácidos, proteínas, carbohidratos, lípidos
● Alimentación: edulcorantes artificiales, antioxidantes, aditivos
● Contaminantes: plaguicidas, herbicidas, fenoles, PCBs
● Química forense: drogas, venenos, alcohol en sangre, narcóticos
● Medicina clínica: ácidos biliares, metabolitos de drogas, extractos de orina y
estrógenos.
Algunas aplicaciones importantes de la HPLC preparativa

La HPLC es capaz de separar macromoléculas y especies iónicas, productos naturales lábiles, materiales poliméricos y una gran
variedad de otros grupos polifuncionales de alto peso molecular. Con una fase móvil líquida interactiva, otro parámetro se encuentra
disponible para la selectividad, en adición a una fase estacionaria activa.

La HPLC ofrece una mayor variedad de fases estacionarias, lo que permite una mayor gama de estas interacciones selectivas y más
posibilidades para la separación.

● Separación y purificación de metabolitos

● Separación y purificación de los metabolitos de las drogas procedentes de
muestras de orina
● Purificación y separación de enantiómeros
● Purificación de compuestos naturales
● Purificación y caracterización de enzimas y proteínas