LCQMPI 30/09/2016

Introduction
 La multiplication des micro-organismes
 dans les produits peut

 Altérer l’aspect, l’odeur, le goût du produit,

 Produire une corrosion bactérienne
 Engendrer un risque pour la santé

Microbiologie chap 3  Atténuer la durée de vie d’un produit, sa stabilité

 Impacter sur le maintien de la stérilité d’un produit
Licence Contrôle Qualité et Management des Processus Industriels

Introduction Vérification préventive :

Matière première Introduction
Respect des BPF
En cours de fabrication Contrôles qualitatifs de la présence de micro-
Après fabrication organismes
Validation :
Du processus de Contrôles quantitatifs de la présence de micro-
Audit :
stérilisation
Interne
organismes
Procédé de
préservation Contrôle Organisme Contrôle indirect de la présence de micro-
privé
DLC microbiologique organismes
Organisme
Zone d’atmosphère public
contrôlée
Efficacité des
traitements/moyens de Expertise :
correction Identifier l’origine
d’une
contamination

microbiologie 1
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1. Contrôle qualitatif 1. Contrôle qualitatif

Intérêt : 1.1 Examen macroscopique
Identifier Moisissures
l’origine d’une contamination, Aspect du thalle : couleur, aspect
l’origine d’une pathologie ….

Aspergillus

1. Contrôle qualitatif
1.1 Examen macroscopique 1. Contrôle qualitatif
Bactéries / levures 1.1 Examen macroscopique
Aspect des colonies Bactéries / levures
Similaire à des colonies bactériennes Aspect des colonies

Peu utilisé

microbiologie 2
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1. Contrôle qualitatif 1. Contrôle qualitatif

1.2 Examen microscopique 1.2 Examen microscopique
Moisissures Moisissures
Coloration au bleu coton lactique Coloration au bleu coton lactique

1. Contrôle qualitatif
1. Contrôle qualitatif 1.2 Examen microscopique
1.2 Examen microscopique bactéries
Levures Coloration de Gram  différentielle
État frais

microbiologie 3
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1. Contrôle qualitatif 1. Contrôle qualitatif

1.3 Procédure sérologique 1.4 Procédure microbiologique
Test d’agglutination sur lame Présomption d’un germe pathogène
Ag particulaire culture sur des milieux différentiels
Ac pentamérique ou dimérique = milieux qui

1. Contrôle qualitatif 1. Contrôle qualitatif

1.4 Procédure microbiologique
Présomption d’un germe pathogène 1.4 Procédure microbiologique
culture sur des milieux sélectifs Confirmation d’un germe
Milieux qui suspecté comme étant …
Galerie d’identification

microbiologie 4
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1. Contrôle qualitatif 1. Contrôle qualitatif

1.4 Procédure microbiologique 1.5 Test de stérilité
Repose sur des  pour détecter
Tests biochimiques  des bactéries
 ou champignons étrangers
 ou autres micro-organismes
 dans les matières premières brutes, les lots de semence
ou le produit fini

 test de filtration sur membrane

 ou test par inoculation directe.

1. Contrôle qualitatif • Rincer les membranes. 1. Contrôle qualitatif

• Transférer la quantité adéquate du produit à tester.
•
•
Filtrer rapidement le liquide à travers la membrane puis laver la membrane.
Réitérer l’opération sur une nouvelle membrane 1.5 Test de stérilité
1.5 Test de stérilité
14 jours d’incubation
Si aucune croissance microbienne décelée
• Filtrer le bouillon de culture sur l’une des
membranes. produit conforme.
• Faire de même avec le second milieu sur la
seconde membrane.
Si croissance microbienne,
Deuxième contrôle sur plus de lots
si aucune croissance au 14ème jour
• Milieu thioglycolate avec
résazurine pour la détection
• Milieu trypticase soja pour la
détection des bactéries
produit conforme.
des bactéries anaérobies. aérophiles.
• Incuber le milieu à 30-35°C
pendant 14 jours
• Incuber le milieu à 20-25°C
pendant 14 jours
Si une croissance
on ré-effectue un contrôle
• Observer les colonies
• Interpréter les résultats

microbiologie 5
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1. Contrôle qualitatif
1.5 Test de stérilité
Absence de culture
signifie seulement qu’aucun micro-organisme
contaminant n’a pu être décelé dans
l’échantillon examiné dans les conditions de
l’essai.
Le test n’est pas exigé
Si le fabricant a des assurances suffisantes du
bon fonctionnement de la stérilisation:
Preuves physiques >>> essai de stérilité

2. Contrôle quantitatif 2. Contrôle quantitatif

2.1 semi-quantitatif 2.1 semi-quantitatif
Lames gélosées, boites contact Lames gélosées, boites contact
Comparaison à des abaques

Contrôle des surfaces, hygiène (personnels,

matériels).

microbiologie 6
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2. Contrôle quantitatif 2. Contrôle quantitatif

2.1 semi-quantitatif 2.2 dénombrement direct
Lames gélosées, boites contact Cellules de comptage
Comparaison à des abaques

2. Contrôle quantitatif 2. Contrôle quantitatif

2.2 dénombrement direct 2.2 dénombrement direct
Cellules de comptage Turbidimétrie

microbiologie 7
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2. Contrôle quantitatif 2. Contrôle quantitatif

2.3 dénombrement indirect 2.3 dénombrement indirect
Nécessité d’une mise en culture
Echantillon très concentrés en micro-organismes
Dilution en série/en cascade

2. Contrôle quantitatif 2. Contrôle quantitatif

2.3 dénombrement indirect 2.3 dénombrement indirect
Dénombrement en surface Dénombrement dans la masse

microbiologie 8
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2. Contrôle quantitatif 2. Contrôle quantitatif

2.3 dénombrement indirect 2.3 dénombrement indirect
Milieux liquides Milieux liquides
Nombre caractéristique
 table de Mac Grady
Nombre le plus probable

Colimétrie

Trouble

limpide

limpide
Trouble

Trouble

Trouble

Trouble

Trouble

Trouble

Trouble

2. Contrôle quantitatif 2. Contrôle quantitatif

2.3 dénombrement indirect 2.3 dénombrement indirect
Echantillon faiblement concentré
Filtration de volumes ± grands

microbiologie 9
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2. Contrôle quantitatif 2. Contrôle quantitatif

2.3 dénombrement indirect 2.3 dénombrement indirect
Applications possibles Applications possibles
Challenge test : contrôle de la croissance d’une
Contrôle de la contamination microbienne population microbienne
Contrôle de l’état d’hygiène du produit = test de croissance

2. Contrôle quantitatif Challenge test

Pseudomonas
2.3 dénombrement indirect aeruginosa
Staphylococcus aureus
0,2 mL de N

N0 =N/100
Applications possibles : Test de croissance E.coli
Candida albicans T0 20 g de produit
Aspergillus brasiliensis 103 102 UFC/mL
7 jours à 22,5 °C ± 2,5°C
1 ml en masse
107 à 108 N
Un test d’épreuve microbiologique bactéries/mL
106 à 107
Calcul de N
T7
mycètes/mL 1 mL
(ou challenge test) Validation du en masse
neutralisant Gélose TSA ou
Nx
consiste SDA 48 à 72 H à 32,5
°C ± 2,5°C
10ml de diluant neutralisant 10ml de
à introduire des bactéries pathogènes diluant
T14
1 g de
dans un produit Essai Témoin Témoin inoculum 1 mL
produit
1 mL en masse en masse

Nx 48 à 72 H à
et à observer leur croissance, 32,5 °C ± 2,5°C

leur stabilisation
T28
ou leur décroissance au sein de ce produit. 48 à 72 H à 32,5 °C ± 2,5°C 1 mL
en masse
Nv Nv Nv
Nx 48 à 72 H à
f n
Validation si Nv  100 , Nvn proche de Nv et Nvf  0,5 Nvn 32,5 °C ± 2,5°C

microbiologie 10
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2. Contrôle quantitatif 2. Contrôle quantitatif

2.3 dénombrement indirect 2.3 dénombrement indirect
Applications possibles : Test de croissance Applications possibles
Test de vieillissement
« Etude de l’évolution dans un aliment
de populations de microorganismes
qui y sont habituellement présents,
de façon détectable ou non,
dans les conditions préconisées de conservation de
cet aliment »
(NF-V-01-002)

2. Contrôle quantitatif 2. Contrôle quantitatif

2.3 dénombrement indirect 2.3 dénombrement indirect
Applications possibles : Test de vieillissement Applications possibles : Test de vieillissement

Intérêt :
Etablissement d’une DLC théorique
Sélection des flores à rechercher et à dénombrer
Consignes de T° de conservation (T ou t2 >t1)
Vérification de la DLC provisoire sur échantillons issu d’un
lot de la production

microbiologie 11
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2. Contrôle quantitatif 2. Contrôle quantitatif

2.3 dénombrement indirect
2.4 Techniques immunologiques
Applications possibles : Test de vieillissement
ELISA

2. Contrôle quantitatif 2. Contrôle quantitatif

2.4 Techniques immunologiques 2.4 Techniques immunologiques
ELISA

microbiologie 12
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2. Contrôle quantitatif 2. Contrôle quantitatif

2.4 Techniques immunologiques
2.4 Techniques immunologiques
ELFA
ELFA

2. Contrôle quantitatif 2. Contrôle quantitatif

2.4 Techniques 2.4 Techniques immunologiques
immunologiques
Couplage ELISA avec un
composé
phosphorescent bleu

microbiologie 13
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3. Contrôle indirect 3. Contrôle indirect

3.1 détection par PCR 3.1 détection par PCR
Polymerase chain reaction PCR-TaqMan :
Vocabulaire qui dérive de
Taq polymérase et de PacMan

technique de PCR quantitative

par détection en temps réel de la fluorescence

3. Contrôle indirect 3. Contrôle indirect

3.1 détection par PCR 3.1 détection par PCR
obtention d’un signal fluorescent
à partir d’une sonde bi-marquée
augmentation de fluorescence (de la sonde)
est proportionnelle au produit de PCR.
la sonde = « sonde Taqman ».

microbiologie 14
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3. Contrôle indirect 3. Contrôle indirect

3.1 détection par PCR 3.2 Mesure ATP-métrique
spectre d’émission de reporter chevauche le permet une mesure rapide
spectre d’excitation de quencher.
concentration de la biomasse active
L’émission du reporter est atténué par la
proximité du quencher.
basée sur
Si sonde dégradée l’assimilation de l’Adénosine Triphosphate
via exonucléase (Taq) molécule essentielle à la vie
fluorophores ne sont plus reliés entre eux
émission du reporter augmentée.

3. Contrôle indirect 3. Contrôle indirect

3.2 Mesure ATP-métrique 3.2 Mesure ATP-métrique
quantifiée par une réaction de utilise un luminomètre
bioluminescence.
quantité de lumière produite
L’enzyme luciférase
proportionnelle à la quantité d’énergie
réaction entre la luciférine (substrat), l’ATP
(cofacteur) et l’oxygène, biologique présente dans l’échantillon.
linéaire sur une grande échelle

ce qui entraine une émission de lumière.

microbiologie 15
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3. Contrôle indirect
3.2 Mesure ATP-métrique 3. Contrôle indirect
concentration de la biomasse vivante 3.2 Mesure ATP-métrique
ATP intra-cellulaire (cATP)
ATP contenu dans les cellules vivantes.

3. Contrôle indirect 3. Contrôle indirect

3.2 Mesure ATP-métrique
3.3 Recherche d’autres métabolites
l’échantillon
Nécessité de trouver des
soumis à une lyse bactérienne,
métabolites spécifiques
permet de détruire les membranes cellulaires
et de libérer le cATP
Sa surveillance permet
quantifier en temps réel la biomasse active vivante
de suivre sa croissance sous des conditions
optimales
détecter en amont les dérives microbiologiques
responsables de colmatages ou de corrosion des
installations

microbiologie 16
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3. Contrôle indirect Conclusion

3.3 Recherche d’autres métabolites Nécessité de standardiser les techniques
Biosécurité
Exemple : géosmine Manipulation et inoculation de cultures de germes
pathogènes
indicateurs de la présence active de moisissures
Lien avec la biomasse
Permet les comparaisons
(avec des références, entre labo …)
Standardisation du protocole
Choix des souches
Préparation de l’inoculum (concentration, état
physiologique)

Conclusion
Nécessité de standardiser les techniques
Contrôle des conditions d’inoculation, de
conditionnement et de conservation
Nécessité de méthodes d’analyse, si possible,
quantitatives les plus sensibles
Nombre de répétitions et de lots à tester
Expertise pour l’établissement du protocole et pour
l’interprétation des résultats

microbiologie 17