Acides nucléiques

Ce sont des constituants universels de la matière vivante, représentant 10 à 20 % de la masse sèche.

L'ADN constitue le patrimoine génétique de la presque totalité des espèces vivantes (sauf certains virus à ARN). Il est
transmis de génération en génération. Le message transmis par l'ADN spécifie la reproduction et le fonctionnement de
chaque organisme vivant. Chez les eucaryotes, on retrouve la quasi-totalité de l'ADN dans le noyau . Chez les
procaryotes, l'ADN baigne directement dans le cytoplasme
Les acides nucléiques ont un caractère acide et sont regroupés en deux classes :
acides désoxyribonucléiques = ADN et acides ribonucléiques = ARN

Composition
Oses
Deux pentoses peuvent entrer dans la composition des acides nucléiques : le ribose ou sa forme 2 désoxy.

Bases azotées
Les constituants de base des acides nucléiques sont des composés portant plusieurs fonctions amines, ce qui leur
confère un caractère basique. On distingue deux groupes : les bases puriques et les bases pyrimidiques.
- Bases puriques
Deux bases puriques, dérivant de la purine, sont trouvées dans les acides nucléiques : la guanine et l'adénine.

- Bases pyrimidiques
Elles dérivent de la pyrimidine.
La cytosine et l'uracile se trouvent dans les ARN, mais la thymine remplace l'uracile dans les ADN.

Nucléosides
La liaison d'une base et d'un pentose forme un nucléoside.
On numérote les atomes de la base de 1 à 9 (bases puriques) ou de 1 à 6 (bases pyrimidiques). Pour ne pas les
confondre, les atomes du pentose sont numérotés de 1' à 5'.

Nucléotides .
Nucléotides monophosphate
La fonction alcool primaire du carbone 5' du pentose peut être estérifiée par un acide phosphorique. On obtient alors un
nucléotide. Il peut être monophosphate s'il n'y a qu'un seul phosphore.

Base Ribonucléoside Ribonucléotide

Adénine Adénosine Adénylate Adénosine monophosphate (AMP)
Guanine Guanosine Guanylate Guanosine monophosphate (GMP)
Uracile Uridine Uridylate Uridine monophosphate (UMP)
Cytosine Cytidine Cytidylate Cytosine monophosphate (CMP)

Base Désoxyribonucléoside Désoxyribonucléotide

Adénine Désoxyadénosine Désoxyadénylate Désoxyadénosine monophosphate (dAMP)
Guanine Désoxyguanosine Désoxyguanylate Désoxyguanosine monophosphate (dGMP)
Cytosine Désoxycytidine Désoxycytidylate Désoxycytosine monophosphate (CMP)
Thymidine Désoxythymidine Désoxythymidilate DésoxyThymidine monophosphate (TMP)

Nucléotides diphosphate et triphosphate.

Les molécules d'acide phosphorique portées par le pentose peuvent se lier à d'autres molécules du même acide par une
liaison dite phosphodiester. Ces liaisons demandent une grande énergie pour leur formation, mais peuvent restituer cette
énergie lors de leur hydrolyse.
Agencement des nucléotides : les nucléotides sont reliés par le biais du phosphate alfa, donc le PO 4 en 5’ d’un
nucléotide forme une liaison avec le carbone 3’ du nucléotide suivant. Cette liaison est appelée 3’- 5’ phospho- di- ester.

Structures
- Structure primaire
L'alternance pentose - phosphate crée le squelette de l'acide nucléique (ADN et ARN).
- Structure secondaire de l'ADN de Watson et Crick
Relations de Chargaff, A G et A + G ou A + G = T + C
T C T+C
c'est à dire qu'il y a autant de bases puriques que de bases pyrimidiques.
En revanche, A + T est très variable et spécifique
G+C
Les études en Rx (après cristallisation) montrent qu'il s'agit d'une hélice. ⇒ Il existe des liaisons hydrogène.
⇒ La structure est celle d'une double hélice : il y a appariement des bases homologues.
La molécule hélicoïdale est dextrogyre.
Le pas de l'hélice est de 30Å, le diamètre de 20Å.
Il y a toujours la même quantité d'ADN dans un noyau et une composition fixe en bases azotées pour tous les types
cellulaires d'une espèce donnée.
La complémentarité des bases est essentielle à la stabilité de la double hélice. Les deux chaînes sont opposées, ou anti-
parallèles.

Structure secondaire :
La double hélice : l’ADN est formé de 2 chaines enroulées l’une autour de l’autre pour former une double hélice. La
partie sucre- phosphate constituant le squelette est située à l’extérieur de l’hélice, les bases azotées se trouvent au
centre. La double hélice effectue un tour toutes les dix paires de bases, la distance entre bases sur l’axe est 3,4 A°. Un
tour fait 34A°, le diamètre de l’hélice est de 20A° (2nm).(1A=0.1nm).

Propriétés de la molécule d’ADN :

- Complémentarité : les deux chaines de la double hélice sont complémentaires, l’espacement entre les deux hélices
est tel qu’à chaque fois une base purique interagit avec une base pyrimidique, ces bases contractent des liaisons
hydrogènes de faible énergie qui aident à stabiliser la double hélice.

- Antiparallélisme : La chaine poly nucléotide d’ADN possède un 5’ triphosphate libre à une extrémité appelée
extrémité 5’et un groupe 3’ hydroxyle libre à l’autre extrémité appelé extrémité 3’. Ainsi l’ADN a une polarité et on
parle de sens 5’—3’ et 3’—5’ . Par convention, le sens d'un brin d'ADN commence par l'extrémité 5' phosphate libre et
se termine par l'extrémité 3'-OH libre du dernier nucléotide.
La séquence qui code l’information génétique est toujours dans le sens 5’—3’ (sens dans le quel les enzymes
polymérases copient l’ADN).
Chaque brin d’ADN est orienté selon ses extrémités (5’phosphate, 3’ hydroxyle) les deux brins ont des orientations
antiparallèles afin que les bases puissent s’associer correctement par les liaisons hydrogène.
Solubilité de l’ADN
L'ADN est soluble dans l'eau sous forme de sels de sodium (en donnant une solution visqueuse).
Il précipite dans l'éthanol ( ⇒ moyen efficace pour l'isoler puis l'étudier).
Absorption dans l'UV
La présence des bases provoque une absorption caractéristique dans l'UV à 260 nm. Cette absorption est de 30%
inférieure à celle d'un mélange comportant la même quantitéde bases et les mêmes proportions que l'ADN étudié : c'est
l'effet hypochrome, dû aux liaisons hydrogènes entre les bases des deux brins.

-Dénaturation et hybridation : les liaisons hydrogène qui assemblent les bases sont de faible énergie, il est possible de
les couper et séparer ainsi les deux brins avec l’application de la chaleur à 60° à 90°C.

Dénaturation thermique. A partir d'une solution d'ADN natif, lorsqu'on augmente progressivement la température, on
constate une élévation de la DO 260 ⇒courbe de fusion del'ADN. Cette augmentation brusque de la DO est appelée
effet hyperchrome. En même temps, on note une diminution de la viscosité de la solution.
La courbe de fusion correspond à la séparation des deux brins qui forment l'hélice. La rupture des liaisons hydrogène
provoque une déspiralisation de la molécule et l'ADN devient monocaténaire : il est dénaturé.
Les courbes de fusion de deux molécules d'ADN différents présentent des valeurs différentes de température de demi-
dissociation à cause d'une composition différente en bases : lorsque la teneur en G+C augmente, la température
augmente aussi.
Le phénomène est réversible par simple refroidissement progressif de la solution. L'ADN reforme la double hélice et
redevient donc bicaténaire. Si le refroidissement est brusque, les chaînes restent monocaténaires.
La reformation de la double hélice est d'autant meilleure que la complémentarité entre les brins est plus grande.
En conséquence, si on place dans la solution deux brins bicaténaires différents, et qu'on chauffe, les deux donnent
chacun deux brins. Lors du refroidissement, les sections ayant des bases homologues pourront s'apparier, tandis que les
sections non homologues ne le pourront pas. Il y a formation de portions bicaténaires, et de portions en boucles non
appariées. C'est l'hybridation des acides nucléiques.

Structure tertiaire : L'ADN est étroitement lié à certaines protéines pour qu'elle soit condensée au maximum. Dans le
cas contraire, elle ne tiendrait pas dans le noyau (Si on déroulait l'ADN humain, il mesurerait 1.8m). La liaison entre
l'ADN et les protéines est à l’origine de la structure tertiaire. Elle représente en faite : la fibre chromatinienne. Le
chromosome est le support de l’information génétique, il contient en moyenne 6000 million de bases d’ADN soit une
longueur d’environ 1,8 à 2m contenue dans un noyau de 6ɥm de diamètre, alors que la taille du chromosome est de 0,2
à 2ɥm. Les chromosomes résultent de ce fait d’une compaction maximum des filaments inter phasiques. L’ADN
chromosomique étalé est environ 8000 fois plus long que le chromosome lui-même.
- Formation de sillon : il existe trois structures classiques des doubles brins d’ADN, la forme A rarement observée, la
forme B la plus courante et la forme Z observée quelque fois, les deux formes A et B sont composées d’hélice droite
emmêlée en torsade par contre la forme Z est composée d’hélice en zigzag. Pour la forme courante, l’enchainement des
groupements phosphatés crée deux sillons où s’exercent les interactions entre les protéines et l’ADN.
. Petit sillon présente deux groupements accepteurs de la liaison pour les deux paires A – T et C- G, il permet
l’attache des histones (protéines étroitement associées à l'ADN et sont les principaux constituants protéiques des
chromosomes. Les histones jouent un rôle important dans l'empaquetage et le repliement de l'ADN.
. Grand sillon est tapissé aussi d’atomes qui peuvent interagir avec des composants extérieurs aux acides nucléiques
comme les nucléases, les enzymes de destruction, les facteurs de transcription, les polymérases…

Structure secondaire des ARN

Structure et propriétés générales
Leur masse moléculaire est plus faible que celle des ADN : ils sont plus petits. Ce sont des chaînes monocaténaires de
nucléotides : A, G, C, U. Il peut y avoir des portions complémentaires de parties différentes de la chaîne créant des
replis : zones bicaténaires, stabilisées par des liaisons hydrogènes.
Leur solubilité et leur absorption dans l'UV sont proches de celles de l'ADN. On n'obtient pas dans leur cas de courbe de
fusion directement comparable à celle de l'ADN, mais en revanche, on peut provoquer l'hybridation d'un ADN et d'un
ARN. IL n'y a pas d'effet hyperchrome ni d'effet hypochrome.
Différents types d'ARN
A part dans le cas des Virus, le cellules présentent trois types différent d'ARN au moins.
- ARN messagers = ARNm
Il s'agit de la séquence complémentaire d'une portion de l'ADN de la cellule. Il est obtenu par transcription à partir de
l'ADN.

Transcription : on garde le même langage (c'est à dire le code génétique), mais on change d'alphabet (T -> U).

Traduction : on change de langage ⇒ du code génétique en codon, on passe aux protéines constituées d'acides aminés.
Moyen mnémotechnique : les opérations se font dans l'ordre alphabétique inverse.
Les ARN messagers sont "linéaires". Leur masse moléculaire est très élevée, en liaison avec la taille de la protéine qu'ils
codent. Elle évolue au cours de leur maturation (maturation post transcriptionnelle) : une partie de ce qui a été transcrit
est éliminé. En particulier, ils sont souvent précédés, à leur extrémité 3' d'une chaîne de plusieurs adénosines (30 à
200) : ARNm poly A. Cette séquence à une rôle signal intervenant dans la reconnaissance avec les ribosomes.
Les ARNm ont une durée de vie courte (demi-vie de quelques heures pour la plupart), sauf dans des cas particuliers, par
exemple dans les formes de vie ralentie comme les graines des végétaux.
ARN de transfert = ARNt
Les ARNt ont généralement une configuration en feuille de trèfle. Ils présentent des replis et des zones appariées. Une
des boucle porte l'anti-codon, c'est à dire le triplet de bases complémentaires du triplet codant de l'ARN messager.
L'extrémité 3' porte l'acide aminé pour lequel code le codon.
ARN ribosomiaux = ARNr
Ils représentent 80% de l'ARN total de la cellule. Leur masse moléculaire est très importante. On les distingue sur la
base de leur coefficient de sédimentation. Un ribosome est formé de plusieurs chaînes d'acide nucléique.

Les acides nucléiques particuliers

Les bactéries et les virus (procaryotes), d'une part, ainsi que les chloroplastes et les mitochondries ont des acides
nucléiques comparables à ceux des autres cellules d'un point de vue général, mais présentant un certain nombre de
particularités à connaître.
L'ADN n'est par organisé en chromatine ni en chromosome ; il n'est pas enfermé dans une enveloppe nucléaire.
Le code génétique est légèrement différent. C'est chez ces organismes qu'on rencontre le plus de bases rares.
Les ribosomes ont des coefficients de sédimentation différents.
Les rétrovirus présentent la particularité de posséder uniquement une molécule d'ARN, mais pas d'ADN. Cet ARN doit
d'abord être transcrit en ADN par la cellule hôte. L'enzyme impliquée est la transcriptase reverse.
Méthodes d'étude
L'extraction se fait à partir d'un matériel riche en acide nucléique : de préférence des cellules jeunes,
en division. Après broyage (fort, de façon à faire éclater les noyaux) et souvent délipidation,
l'extraction se fait dans une solution saline. L'extrait contient alors gé-
néralement un mélange de protéines et d'acides nucléiques.
Les protéines sont éliminées par centrifugation, puis les acides nucléiques sont précipités
par l'éthanol.
On peut effectuer un dosage colorimétrique portant soit sur le phosphore, soit sur le pen-
tose.
La séparation des différentes classes d'acides se fait généralement par électrophorèse sur
gel, avec des techniques variée (biologie moléculaire). On parvient à caractériser des
groupes d'ARN, par exemple, caractéristiques de telle ou telle phase du développement
de l'organisme, c'est à dire que les protéines correspondantes ne sont synthétisées qu'à
certaines périodes de la vie.
La localisation cellulaire peut être faite par diverses méthodes.
Une coloration de type Feulgen colore spécifiquement l'ADN en rose.
Après l'ajout d'une molécule marquée (par exemple thymine triciée), certaines molécules
d'ADN seront marquées. La préparation cellulaire est fixée, puis on la place sous une pla-
que photographique. Les grains d'argent de l'émulsion photographique sont impression-
nés par l'émission radioactive, ce qui permet de localiser les compartiments cellulaires
dans lesquels s'est fait l'incorporation.
Méthodes d'étude
Préparation de l'échantillon :
Fractionnement cellulaire
Constitution générale des tissus et des
cellules
De l'extérieur vers l'intérieur :
Tissu = ∑ de cellules, entre lesquelles il n'y a pas de vide, mais des parois végétales, des
constituants interstitiels animaux, le tout baignant dans un liquide ± complexe
⇒
on peut
avoir besoin d'analyser les constituants en question.
Cellule :
membrane plasmique : lipides, protéines
cytoplasme / cytosol : gel de protéines, de sels minéraux, de toutes sortes de molécules
organites : enveloppe de 2 membranes + matrice (stroma) propres.
Fractionnement
Lorsque le compartiment cellulaire n'est pas abordable directement, il faut commencer par
le séparer des autres parties du tissu ou de la cellule (le sang est directement isolable, par
exemple
Broyage
fin, mais trop long = pertes / polytron, Moulinex, mortier - pilon, sable de Fontainebleau,...
⇒
poudre fine de préférence
• pH fixé / tampon
• anti-oxydant (pb phénols)
• à froid (enzymes en général)
• BSA : protéases
• osmoticum : organites
• qualitatif / quantitatif : les impératifs ne sont pas les mêmes
Séparation
Solubilisation
selon le composé à isoler :
• solvant organique ⇒ lipides et composés apolaires
• solvant aqueux
⇒
composés polaires : glucides, acides aminés, peptides, ARN de pe-
tite taille,...
• insolubles
⇒
nombreuses substances de composition particulière, ou encore de taille
importante
Mélanges ou successions de solvants :
Un premier passage d'un solvant organique peut par exemple éliminer les lipides (délipi-
dation), et laisser les autres composés. Une élimination spécifique d'un composé est par-
fois plus efficace qu'une tentative de purification directe du composé cherché.

Filtration
La méthode la plus simple de séparer un élément soluble des éléments insolubles (exem-
ple type : la percolation du café!)
Après fractionnement, il reste : des débris cellulaires, des cellules, des organites de taille
variable, qui resteront sur le papier filtre.
Centrifugation
L'application d'une force centrifuge à un échantillon (liquide ou pâteux) équivaut à l'appli-
cation d'une force gravitationnelle contrôlée. On sépare donc les composés en fonction de
leur masse et de leur densité.
Milieu de séparation : tous les composés de densité supérieure à celle du milieu surnage-
ront, tandis que tous les composés de densité inférieure sédimenteront. Le résultat est le
même que celui de la filtration.
Centrifugation sur gradient : il est possible de créer un gradient de densité le long du tube
à centrifuger. Les composés / organites se placent dans la zone correspondant à leur
densité.
Exemple : fractionnement du foie de Rat
Homogénat
↓ 10 min. à 600 g →
culot
↓ 10 min. à 600 g
surnageant culot : noyaux et débris cellulaires
↓ 10 min. à 8 000 g → culot : mitochondries
↓ 10 min. à 15 000 g → culot : lysosomes
↓ 60 min. à 100 000 g → culot : microsomes
surnageant : molécules
Purification
Solubilité différentielle
Exemple : purification des chlorophylles à partir de feuilles d'orties :
Broyage, extraction dans l'acétone à 85% : solubilisation de tous les composés apolaires,
plus une partie des composés polaires.
Filtration sur papier
Chlorure d'ammonium 10% : précipitation des protéines
Ether : les chlorophylles passent préférentiellement dans l'éther, la phase acétone - eau
devient limpide ⇒ élimination
Lavages à l'eau : certaines impuretés peuvent rester dans la phase éthérée, les lavages
permettent de les reprendre et de les éliminer
Méthanol : la chlorophylle b est plus soluble dans l'éthanol que dans l'éther, inverse pour
la chlorophylle a
⇒
les deux chlorophylles sont séparées et peuvent être (théoriquement)
étudiées séparément.

Techniques chromatographiques
Lorsque plusieurs composés présentent les mêmes caractéristiques de solubilité, on peut
les séparer par chromatographie : exemple de mélange de composés polaires :
broyage, extraction à l'eau, filtration : les lipides et les grosses protéines restent sur le fil-
tre, les glucides et les acides aminés passent dans le filtrat.
Chromatographie d'exclusion : les plus grosses molécules (polypeptides, polyosides) pas-
sent rapidement et sont exclues, les petites (acides aminés et glucides simples) sont re-
cueillies ensuite.
Chromatographie d'échange ionique :
• une colonne échangeuse d'anions retient tous les composés cationiques (chargés posi-
tivement) : acides aminés dibasiques notamment
• une colonne échangeuse de cations retient tous les composés chargés négativement :
acides diacides notamment
• l'utilisation consécutive des deux colonnes permet de séparer le mélange en trois clas-
ses : acide, basique et neutre, la dernière correspondant aux glucides et aux acides
aminés neutres.
Caractérisation
Techniques chromatographiques
Les chromatographies d'adsorption (sur papier, sur couche mince de cellulose ou d'alumi-
nium), en phase gazeuse, d'échange d'ions ou d'exclusion permettent soit de faire une
séparation grossière, soit de faire une séparation fine, en fonction des conditions d'utilisa-
tion.
Exemple : chromatographie bidimensionnelle sur papier d'un mélange de composés polai-
res
• dépôt d'un échantillon dans un des coins de la feuille
• migration dans un premier solvant, volatil ; évaporation du solvant (une nuit à 40°C)
• migration dans un second solvant, après retournement de la feuille à 90°
• séchage, révélation
Electrophorèse
L'électrophorèse permet de séparer et de caractériser diverses classes de molécules :
glucides simples ou composés, acides aminés, peptides et protéines. Elle convient un peu
moins aux lipides.
Techniques colorimétriques
Révélation par coloration
Après une chromatographie ou une électrophorèse, les composés n'étant généralement
pas colorés, on cherche leur emplacement sur la feuille grâce à une coloration : révélation
à la ninhydrine pour les acides aminés, au bleu de Coomassie ou au nitrate d'argent pour
les protéines, à l'anthrone pour les glucides, etc.
Dosages par colorimétrie
Lorsque la réaction est quantitative, on peut appliquer la loi de Beer-Lambert :
I = I 0 e-ε c l ⇔ log(I/I 0 ) = D. O. = ε c l
• avec ε = coefficient d'extinction molaire, dépendant - de la longueur d'onde ; - de la na-
ture des liaisons du composé étudié
• c = concentration de la solution
• l = longueur du trajet optique, fixée à 1 cm
Puisque l, ε et λ sont fixés, on a la relation simple : D. O. = f([c]).
On choisit une gamme de concentrations, à laquelle on fait subir la réaction, et on trace la
courbe obtenue :
Il ne faut pas oublier de
DO
faire un à blanc : il corres-
saturation
pond à la valeur zéro de la
concentration, et il permet
de savoir quelle est l'ab-
sorption due spécifique-
ment au réactif, et non au
bruit de fond
[C]
produit à doser. L'à blanc
doit
accompagner
toute
série de déterminations, car les conditions peuvent varier (par exemple durée de passage
et température du bain-marie).
Spectrométrie
Une autre application de la loi de Beer-Lambert est l'obtention de spectres. Dans ce cas,
la concentration est fixée, mais on fait varier la longueur d'onde. La disparition des rayon-
nements d'une longueur d'onde correspond à l'absorption de l'énergie des photons
concernés par une liaison particulière. Un pic d'absorption caractérise donc la présence
d'une liaison dans la solution étudiée. Si la préparation est pure, on est donc à même de
caractériser parfaitement le composé, en fonction des pics obtenus.
Techniques immunologiques
La faculté de reconnaissance antigène - anticorps est de plus en plus utilisée. La spécifici-
té de la réaction est généralement totale, mais dans le même temps, elle ne donne pas de
réponse d'une grande ampleur. A la détection est alors associée une amplification, sous
forme d'une réaction enzymatique dont le produit est coloré.