UNIVERSITÉ DE NGAOUNDÉRÉ

FACULTÉ DES SCIENCES

Département des Sciences Biomédicales

Travaux pratiques "TP" de Bactériologie I/Virologie

Enseignants : Dr. Talom et Dr Iwewe

I. Matériels
Écouvillon, Autoclave, Boîtes de Pétri, Flacon pour milieu de culture, Bec Bunsen, grattoir,
Etuve.

Grattoir

Ecouvillon Bec Bunsen Autoclave

Boîte de Pétri Etuve pour culture Boîte pour culture

Anse de platine

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II. Règles à suivre durant les travaux pratiques de microbiologie
OBJECTIFS : Se familiariser avec un laboratoire de microbiologie, son équipement et son
fonctionnement
l. Visite des locaux :
- Structure
- Présentation des gros matériels (étuves, autoclave, …)
2. Présentation d'un poste de travail :
- Matériels (bec bunsen, pipettes, verres, béchers, anse, pinces, lame...),
- Produits (eau, alcool, colorants divers...)
3. Les consignes de sécurité :
 Procéder à un lavage minutieux des mains, avec brossage des ongles avant et après les
manipulations, et avant toute sortie même momentanée de la salle de TP.
 Éviter les ouvertures des fenêtres pendant les manipulations
 Ouvrir avec précaution les récipients contenant des cultures microbiennes, afin d’éviter
toute projection.
 Flamber, avant et après manipulations, les anses métalliques utilisées pour les
prélèvements, en commençant par chauffer la partie moyenne de l'instrument afin de
dessécher les restes de culture avant de porter l'extrémité dans la flamme, ceci pour
éviter toute projection.
 Prévenir immédiatement le responsable de TP en cas de bris d'un récipient contenant
une culture en cas de contamination accidentelle d'un manipulateur ou tout incident
dispersant le matériel microbien.
 Interdiction formelle de boire, manger et fumer pendant les TP
 Stériliser tout le matériel septique à la fin de la manipulation
 Prendre toutes dispositions indispensables pour la mise à l'abri des souches
microbiennes ainsi que leur destruction afin d'éviter toute contamination.

III. La stérilisation
La stérilisation est l'opération qui consiste à éliminer les micro-organismes d'un objet, et ce de
manière durable. En microbiologie, le but de la stérilisation est d'une part de maîtriser les micro-
organismes introduits dans le milieu d'étude, et d'autre part d'éviter la contamination du milieu
extérieur et des personnes. Il existe deux grands moyens de Stérilisation : La chaleur et La
filtration
A. La stérilisation par la chaleur
La chaleur détruit les bactéries et les spores. On distingue les procédés à chaleur « sèche » ou
« humide ».
1. Chaleur sèche :
a. Flambage : Le passage dans la flamme (bec BUNSEN) de la surface de matériel non
inflammable assure une parfaite stérilisation. On stérilise de cette façon les fils de platine et les
pipettes Pasteur.
b. Four pasteur : C'est un four-étuve à air chaud et sec. Il est utilisé à180°C pendant 90
minutes. Cet appareil n'est utilisé que pour la stérilisation de la verrerie préalablement nettoyée
et séchée ou de matériels métalliques (instruments de dissection) pouvant tolérer de très hautes
températures. Zone de stérilité d’un bec bunsen. Le matériel ainsi stérilisé sera laissé dans
l’étuve jusqu’à son refroidissement complet, puis stocké à l’abri des poussières.
2. Chaleur humide
La stérilisation par la chaleur humide, reconnaît trois modalités : la stérilisation à l’autoclave,
La Pasteurisation et La Tyndallisation.
a. Autoclave : c’est un appareil indispensable dans un laboratoire de microbiologie. Le
chauffage a lieu sous pression de vapeur d’eau, à une température de 121°C pendant une durée
qui varie en fonction du milieu, de la température utilisée et du volume des récipients. Ce
procédé tue toutes les cellules végétatives et les endospores.
b. Pasteurisation : la pasteurisation est un traitement à chaud de liquides, tuant des pathogènes
mais pas forcément toutes les bactéries. Les températures de la pasteurisation se situent entre
75 à 80°C.
c. Tyndallisation : La tyndallisation est une série de 3 chauffages, bref à des températures de
70°C à intervalles réguliers, ceci afin de laisser aux formes résistantes la possibilité de germer
pour les tuer au chauffage suivant. Par exemple la destruction des pathogènes du lait se fait par
un cycle de 63°C pendant 30 minutes suivie de 73°C pendant 15 minutes.
B. La filtration
La filtration est une technique qui consiste à faire passer un liquide à travers un filtre dont les
pores ont un diamètre de 0,2 µm. Les micro-organismes sont trop gros et sont donc retenus par
le filtre. Cette technique est intéressante lors d'utilisation de produits thermolabiles comme
certains acides aminés aromatiques, vitamines, hormones de croissance, acides nucléiques et
une bonne partie des antibiotiques.
C. Autres procédés de stérilisation
Certaines matières (Plastiques, Caoutchoucs …) ne tolèrent pas l’autoclave ou se détériorent
rapidement après des expositions répétées à la chaleur.
1. Radiations :
La stérilisation par les U.V. est utilisée au laboratoire pour la décontamination de l’air et des
paillasses situées sous la hotte de protection. Le rayonnement n’agit que de façon directe et sa
pénétration est faible. D’autres radiations (rayons X), peuvent servir pour la stérilisation
industrielle des boites de Pétri en matière plastique et de produit pharmaceutiques.
2. Agents chimiques :
Ils sont utilisés en général pour la désinfection des salles de travail et pour la destruction
des germes portés par des instruments souillés. Ce mode de stérilisation doit être
systématiquement pratiqué dans le laboratoire pour les lames et pour la verrerie qui ne passe
pas en autoclave.

IV. Mise en évidence de la présence de micro-organismes au labo

1- Matériel : milieux gélosés en boîte de pétri, écouvillon, eau de robinet, cheveu, bec
bunsen, pièce de monnaie
2- Mode opératoire :
Prendre 3 milieux gélosés en boîte de pétri :
- Diviser la boîte N°1 en 2 secteurs : déposer un cheveu sur le premier et quelques
gouttes d’eau du robinet sur le second.

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 - Diviser la boîte N°2 en 4 secteurs : appliquer une trace de doigt sur le premier, refaire
l’opération sur le second après s’être lavé les mains, déposer une pièce de monnaie
sur le troisième, frotter un écouvillon sur la paillasse et appliquer celui-ci sur le
dernier secteur.
- Laisser la troisième boîte ouverte au-dessus de la paillasse (environ 10 min).
Remarque : une série de 5 boîtes de pétri de 55 mm est laissée ouverte sur la paillasse près d’un
bec bunsen allumé.
A la fin de la manipulation, regrouper les différentes boîtes de pétri et les placer à l’étuve à
37°C/ 24 heures
Pour éviter que l’eau de condensation dans les boîtes de pétri perturbe la surface du milieu
gélosé, on place les boîtes en position retournée dans l’étuve.
-
V. L’examen microscopique des bactéries
L’observation microscopique permet de faire une étude morphologique des
cellules d’une espèce bactérienne. Elle comprend :
IV-1 : I.’ examen à l’état frais
C’est l’examen microscopique de bactéries vivantes, en milieu liquide. Il permet
d’apprécier leur mobilité (ou immobilité) et leur morphologie.
Préparation :
1. A partir d’une culture en milieu liquide :
Déposer sur une lame propre soit le contenu d’une « anse de platine
» soit « une petite goutte » à l’aide d’une pipette Pasteur. Recouvrir la goutte d’une
lamelle.
2. A partir d’une culture sur milieu solide :
Déposer une gouttelette de liquide (milieu liquide ou eau) sur la lame.
Prélever une trace de culture à l’anse de platine et l’émulsionner dans le liquide.
Recouvrir d’une lamelle.

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 VI. EXAMEN APRÈS COLORATION
L’examen après coloration permet d’observer des bactéries tuées fixées sur une
lame et ayant subi l’action d’un ou plusieurs colorants. Les colorations, réalisées
sur des frottis sèches et fixes, sont classées en :
• Coloration simple (un seul colorant)
• Coloration différentielle type Gram
• Colorations spéciales des structures bactériennes (capsules, spores...).
Remarque : La réalisation de frottis de bonne qualité est une condition préalable à toute
coloration.
1. Réalisation des frottis : Les frottis doivent être étalés en couche mince et régulière,
puis séchés et fixés.
Mode opératoire :
 Etalement sur lame de verre :
 Notez la référence de l’échantillon sur une lame parfaitement propres
et dégraissées.
 Prélevez stérilement à l’aide d’une anse de platine une goutte de culture
bactérienne et étalez un film mince,
2. Séchage :
Le séchage est effectué à l’aire libre jusqu’à ce que le frottis présente un aspect
mat.
3. Fixation du frottis sec :
Cette étape consiste à tuer les bactéries et les coller sur la lame, sans en
altérer la structure. La fixation s’effectue par la chaleur :

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 La lame, tenue par une pince (frottis situé sur le dessus) est passée 3ou 4 fois
dans la flamme du bec Bunsen. Laisser refroidir avant d’entreprendre une coloration.
Mode opératoire :
 Identifier la lame
 Dépose rune goutte d’eau
 Flamber l’anse
 Prélever une partie d’une colonie isolée
 Mélanger les bactéries avec la goutte d’eau
 Laisser sécher l’étalement à l’air
 Fixé le frottis en passant délicatement et rapidement la lame 2-3
fois au-dessus de la Flamme

V-1. COLORATIONS SIMPLES : (Coloration au bleu de Méthylène)

La coloration au bleu de méthylène peut apporter des informations concernant
la morphologie des germes.
Mode opératoire :
Sur le frottis fixé et refroidi :
- Faire couler la solution de bleu de méthylène phéniqué jusqu’à ce que
toute la lame soit recouverte.
- Laisser agir1 minute.
- Rincer abondamment la lame avec le jet d’une pissette d’eau distillée,
ou à l'eau du robinet jusqu'à élimination des colorants en excès.
- Sécher à l'air ou sur une platine chauffante, ou encore sécher délicatement entre
deux feuilles de papier filtre fin (ou buvard), sans frotter.
- Examiner au microscope, objectif à immersion.
Résultats
Les bactéries sont colorées en bleu sombre. Cette coloration est
intéressante pour l'observation rapide des frottis mais elle permet seulement
l'étude de la morphologie des bactéries.

V-2 COLORATION DIFFERENTIELLE DE GRAM

C’est la coloration de base en bactériologie qui permet de distinguer les
bactéries en Gram positif et en Gram négatif, cette distinction est fondamentale
pour leur identification.
En effet, le violet de gentiane se fixe sur des composants cytoplasmiques
et après ce temps de coloration, toutes les bactéries sont violettes. Chez les
bactéries à Gram négatif, la paroi, riche en lipides, laisse passer l'alcool (ou le
mélange alcool + acétone) qui décolore le cytoplasme alors que, chez les bactéries
à Gram positif, la paroi constitue une barrière imperméable à l'alcool et le
cytoplasme demeure coloré en violet.
Réactifs :
- Violet de gentiane phénique

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 - Lugol (iodo-iodure de potassium)
- Alcool à 95% (ou mélange alcool absolu+ 1/5ème d’acétone)
- Safranine (ou Fuchsine phéniqué edeziehl)
Mode opératoire :
1. Réaliser un frottis et le fixer à la flamme
2. Verser le Violet de Gentiane sur la lame ; laisser en contact1 minute
3. Jeter le colorant et finir de la chasser par la solution de Lugol
; laisser agir le Lugol environ 1 min
4. Jeter le Lugol et faire couler de l’alcool sur la préparation ; rincer
immédiatement à l’eau
5. Recouvrir la préparation de Safranine, laisser agir environ 1 min. laver
abondamment.
6. Sécher au-dessus de la flamme d’un bec Bunsen.
Résultats :
A l’issue de cette coloration, on peut distinguer :
- Des bactéries colorées en violet foncé ; elles ont gardé le violet, ‘le gram’
elle sont dites ‘Gram positif’ ;
- Des bactéries colorées en rose ou rouge pâle ; elles ont perdu le
violet, ‘le Gram’ elles sont dites ‘Gram négatif.

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Comptage des cellules (Cellule de Thoma)