Génie génétique

Les outils du génie génétique

Principaux outils enzymatiques pour la

manipulation des acides nucléiques

1
 1. Nucléases
B B B B B

3’ 3’ 3’ 3’ 3’
P P P P P P
a
5’ 5’ 5’ 5’ 5’
b

• Ribonucléases
• Désoxyribonucléases

• Endonucléases
• Exonucléases :
• 3’ → 5’
• 5’ → 3’ 2
 1. Nucléases
1.1. DNAse I
– Désoxyribonucléases I
• Endonucléase : hydrolyse ADN db, sb
• + Mg 2+ ⇒ attaque indépendante

5’ 3’ DNase I 5’ 3’
p
p
3’ 5’ Mg2+ 3’ 5’

• + Mn 2+ ⇒ clive les 2 brins sur même site

5’ 3’ DNase I 5’ 3’
p
p
3’ 5’ Mn2+ 3’ 5’

3
 Applications DNase I
• Technique de DNA footprinting
• Permet d’identifier les régions de liaison des protéines à l’ADN
– Principe : Digestion des fragments d’ADN par DNase
empêchée par la liaison de la protéine

4
Passarge, 1995
 Applications DNase I
DNA footpinting
1. Marquage de l’ADN à une extrémité

5’CCCTGATGGAT TGCCTGAAGTCTGGAATGGCCTCTGGGCCT 3’
3’GGGACTACCTAACGGACTTCAGACCTTACCGGAGACCCGGA 5’

2. Interaction protéine - ADN

5’CCCTGATGGAT TGCCTGAAGTCTGGAATGGCCTCTGGGCCT 3’
3’GGGACTACCTAACGGACTTCAGACCTTACCGGAGACCCGGA 5’

3. Digestion partielle à la DNase I

5’CCCTGATGGAT TGCCTGAAGTCTGGAATGGCCTCTGGGCCT 3’
3’GGGACTACCTAACGGACTTCAGACCTTACCGGAGACCCGGA 5’
5
 Analyse des interactions protéines – ADN : DNA footpinting
3. Digestion partielle à la DNase I

5’CCCTGATGGAT TGCCTGAAGTCTGGAATGGCCTCTGGGCCT 3’
3’GGGACTACCTAACGGACTTCAGACCTTACCGGAGACCCGGA 5’

5’C 5’CCCTGAT 3’ 5’CCCTGATGGA 3’

3’GG’ 3’GGGACTA5’ 3’GGGACTACC5’

5’CC’
5’CCCTGATG 3’
3’GGGA 3’GGGACTACCT5’

5’CCC 3’ 5’CCCTGATGG 3’
3’GG5’ 3’GGGACTACCT5’

5’CCCT 3’ 5’CCCTGATGGAT TGCCTGAAGTC 3’

3’GGGACTA5’
3’GGGACTACCTAACGGACTTCAGACCTTACC5’
5’CCCTG 3’
3’GGGACTA5’

5’CCCTGA 3’
3’GGGACTA5’
5’CCCTGATGGAT TGCCTGAAGTCT3’
3’GGGACTACCTAACGGACTTCAGACCT 5’ …6
 DNA footpinting
4. Dénaturation de l’ADN
3’GG5’
5’CCCTGATGGAT 3’
5’CC’
5’CCCTGATG 3’
5’CCCTGATGGA 3’ 3’GGGACTAC5’

5’CCC 3’ 5’CCCTGATGG 3’
3’GGGACTACCT5’

5’CCCT 3’ 5’CCCTGATGGAT 3’
TGCCTGAAGTC
3’GGGACTA5’
5’CCCTG 3’ 3’GGGACTACCTAACGGACTTCAGACCTTACC5’

5’CCCTGA 3’
5’CCCTGATGGAT TGCCTGAAGTCT3’ …
3’GGGACTA5’
3’GGGACTACCTAACGGACTTCAGACCT 5’

3’GGGACTA5’
5’C 5’CCCTGAT 3’

5. Migration sur gel de polyacrylamide dénaturant

6. Révélation 7
 DNA footpinting
5’CCCTGATGGATTGCCTGAAGTCTGGAATGGCCTCTGGGCCT 3’
5’CCCTGATGGATTGCCTGAAGTCTGGAATGGCCTCTGGGCC 3’ Gel d’électrophorèse
5’CCCTGATGGATTGCCTGAAGTCTGGAATGGCCTCTGGGC 3’
5’CCCTGATGGATTGCCTGAAGTCTGGAATGGCCTCTGGG 3’
5’CCCTGATGGATTGCCTGAAGTCTGGAATGGCCTCTGG 3’
5’CCCTGATGGATTGCCTGAAGTCTGGAATGGCCTCTG 3’
5’CCCTGATGGATTGCCTGAAGTCTGGAATGGCCTCT 3’ Sens de la migration
5’CCCTGATGGATTGCCTGAAGTCTGGAATGGCCTC 3’
5’CCCTGATGGATTGCCTGAAGTCTGGAATGGCCT 3’
5’CCCTGATGGATTGCCTGAAGTCTGGAATGGCC 3’
5’CCCTGATGGATTGCCTGAAGTCTGGAATGGC 3’
5’CCCTGATGGATTGCCTGAAGTCTGGAATGG 3’
5’CCCTGATGGATTGCCTGAAGTCTGGAATG 3’
5’CCCTGATGGATTGCCTGAAGTCTGGAAT3’
5’CCCTGATGGATTGCCTGAAGTCTGGAA 3’
5’CCCTGATGGATTGCCTGAAGTCTGGA 3’
5’CCCTGATGGATTGCCTGAAGTCTGG 3’
5’CCCTGATGGATTGCCTGAAGTCTG 3’
5’CCCTGATGGATTGCCTGAAGTCT 3’
5’CCCTGATGGATTGCCTGAAGTC 3’

Bandes absentes dans la

zone de liaison de la
protéine

5’CCCTGATGGA 3’
5’CCCTGATGG 3’
5’CCCTGATG 3’
5’CCCTGAT 3’
5’CCCTGA 3’
5’CCCTG 3’
5’CCCT 3’
5’CCC3’ 8
5’CC 3’
5’C 3’
 1. Nucléases
1.2. Nucléase S1
• Endonucléase : hydrolyse ADN sb ou ARN
(sur ADN db qd qté enzyme élevée et force ionique faible)

5’ 3’ Nucléase S1
nucléotides

5’ 3’ Nucléase S1 5’ 3’ 5’ 3’

3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’
• pH optimum : 4 - 4,6 (inactive pH =6)
• besoin Zn2+
(réaction stoppée par EDTA)
• Vitesse hydrolyse : 75.000 x + gde sur sb que sur db 9
 1. Nucléases
1.2.Nucléase S1
• Applications :
– Ouverture boucle lors de la synthèse cDNA

10
 1.2. Nucléase S1
• Applications :
– Ouverture boucle lors de la synthèse ADNc
5’ 3’
Action de la AAAAAA(A)n
reverse 3’
TTTTTT (T)n
5’
transcriptase
Dénaturation de l’hybride ARNm-ADNc par chauffage
ou Hydrolyse de l’ARNm (avec alcali)

TTTTTT (T)n
3’ 5’
3’
TTTTTT (T)n
ADN polymérase 5’
Boucle en épingle à cheveux
dATP, dTTP, dGTP, dCTP
3’
TTTTTT (T)n
5’
ADNc double brin

AAAAAA(A)n11 3’
TTTTTT (T)n
5’
1.2. Nucléase S1
• Applications :
– Ouverture boucle lors de la synthèse ADNc
ADNc double brin
AAAAAA(A)n 3’
TTTTTT (T)n
5’

Digestion avec la
nucléase S1

5’ AAAAAA(A)n 3’
TTTTTT (T)n
3’ 5’

12
 1. Nucléases
1.3. Nucléase BAL31
• Exonucléase / Endonucléase :
5’ 3’

3’ Ca2+ 5’
Bal31

5’ 3’
3’ 5’
Ca2+ Bal31

5’ 3’
5’
3’

3’ Queue sb env. 5 nucl.

5’ (80-90%) 13
3’ 5’
https://www.neb.com/en/products/m0213-nuclease-bal-31#Product%20Information

14
 1. Nucléases
1.3. Nucléase BAL31
• Exonucléase (petits ADN sb)
5’ 3’

Ca2+ Bal31

5’ 3’

• Applications :
– Raccourcir ADN db progressivement à partir de
chaque extrémité
15
 1. Nucléases
1.4. Exonucléase III
• Agit sur des extrémités 3’ OH appariées
5’ 3’ ExoIII 5’ 3’

3’ 5’ 3’ 5’

5’ 3’ ExoIII 5’ 3’

3’ 5’ 3’ 5’

Pas d’action
5’ 3’ ExoIII 5’ 3’

3’ 5’ 3’ 5’
16
 1. Nucléases
1.4. Exonucléase III
• Digestion directionnelle
1. Action de l’ExoIII
5’ 3’ ExoIII
5’ 3’
3’ 5’ 3’ 5’

2. Action de la nucléase SI

5’ 3’

3’ 5’

17
 1. Nucléases
1.4. Exonucléase III
• Applications : générations
de fragments délétés à
une extrémité

Klenow is the large fragment of DNA polymerase

I that retains the 5' to 3' DNA polymerase and 3'
to 5' exonuclease activities of intact DNA
Polymerase I but lacks the 5' to 3' exonuclease
activity. It is provided at 5 U/µL 18
 1. Nucléases
1.4. Exonucléase III
• Applications : générations
de fragments délétés à
une extrémité
• Séquençage direct avec
un ensemble de mutants
délétés

19
 1. Nucléases
1.4. Enzymes de restriction
• Système de restriction –modification chez les bactéries
E. coli K possède un
système de restriction
E. coli K
EOP = 1
Restriction de
croissance sur
E. coli K
EOP = 10-4 EOP = 1

EOP = 1
E. coli C
E. coli C ne possède pas de
système de restriction
EOP = Efficacité de « plating »
20
= Efficacité de formation de plages de lyse
 1. Nucléases
1.4. Enzymes de restriction
• Les diverses enzymes de restriction

✓ Enzymes de type I (peu utilisée en génie génétique)

Nécessite ATP et cofacteur SAM (transfert -CH3)
3 sous unités
- sous unité de reconnaissance site spécifique
- sous unité de modification  méthylation
- endonucléase : clive ADN non protégé
Site de clivage non spécifique (distant de >1000 pb du site de
reconnaissance)

Env.600 gènes ≠

21
 1. Nucléases
1.4. Enzymes de restriction
• Les diverses enzymes de restriction
✓ Enzymes de type I
✓ Enzymes de type II (très utilisée en génie génétique)
Endonucléase et méthylase séparées
- méthylase site spécifique
- endonucléase site spécifique
Site de clivage palindrome (ou proche du site de reconnaissance)

3600 gènes ≠

22
 1. Nucléases
1.4. Enzymes de restriction
• Les diverses enzymes de restriction
✓ Enzymes de type I
✓ Enzymes de type II
✓ Enzymes de type III (peu utilisée en génie génétique)
Nécessite ATP et cofacteur SAM (transfert gpt CH3)
- méthylase site spécifique
- endonucléase site spécifique
✓ Enzymes de type IV (peu utilisée en génie génétique)
Clive ADN modifié : HMC glycosylée
(HMC = hydroxyméthylcytosine)

Env.227 gènes ≠

23
 1. Nucléases
1.4. Enzymes de restriction
• Les diverses enzymes de restriction
Structure Site de Site de Restriction
protéique reconnaissance clivage et
méthylation

Enzymes de type I Enzyme En 2 parties et Non spécifique, Mutuellement

bifonctionnelle asymétrique distant de >1000 pb exclusives
3 sous-unités du site de
reconnaissance

Enzymes de type II Endonucléase Séquence de Le même ou proche Réactions

et méthylase 4-6 pb, du site de séparées
séparées souvent reconnaissance
palindromique

Enzymes de type III Enzyme Séquence 24-26 pb en aval du Simultanées

bifonctionnelle asymétrique site de
2 sous-unités de 5-7 pb reconnaissance
24
Enzymes de type IV HMC glycosylée
 1. Nucléases
1.4. Enzymes de restriction
• Méthylation de l’ADN
NH - CH3 NH2

N 4 CH3
6
N 5 7 N 3 5
1
2 4 8 2 6
3 9 O 1
N N N

6- méthyl adénosine 5- méthyl cytosine

Eucaryotes : - 10% C méthylées

- très faible méthylation A
- méthylation influence sur l’expression des gènes
Procaryotes : - méthylation A et C
25
 1. Nucléases
1.4. Enzymes de restriction
• Méthylation de l’ADN
Procaryotes : - méthylation A et C

Escherichia coli : 3 méthylases

✓ Système « hsd » - confère spécificité caractéristique de l’hôte
- méthylation A
✓ Système « dam » - distingue les chaînes nouvellement synthétisées
- méthylation A
✓ Système « dcm » - fonction inconnue
- méthylation C

26
 1. Nucléases
1.4. Enzymes de restriction
• Modes de coupure
1. Coupures conduisant à des extrémités franches (blunt ends)
Ex : HindII
5’- GTCGAC - 3’ 5’- GTC GAC - 3’
3’- CAGCTG - 5’ 3’- CAG CTG - 5’

2. Coupures conduisant à des extrémités cohésives (bouts collants ou sticky ends)

- extrémités 5’ protrudantes
Ex : EcoRI 5’- GAATTC - 3’ 5’- G 5’AATTC - 3’
3’- CTTAAG - 5’ 3’- CTTAA-5’ G - 5’

- extrémités 3’ protrudantes
Ex : PstI
5’- CTGCAG - 3’ 5’- CTGCA-3’ G - 3’
3’- GACGTC - 5’ 3’- G 3’- ACGTC - 5’ 27
 1. Nucléases
1.4. Enzymes de restriction
• Nomenclature
Nom enzymes :
3 premières lettres en italique
dérive nom de la souche bactérienne

Ex : HindII

Genre : Haemophilius
Espèce : Haemophilus influenzae
Souche Rd
2° enzyme isolée

Ex : EcoRI

Genre : Escherichia
Espèce : Escherichia coli
Souche R 28
1° enzyme isolée
 1. Nucléases
1.4. Enzymes de restriction
• Richesse des enzymes de restriction
a) Isoschizomères
✓sites de reconnaissance identiques
✓ clivage pas forcément au même endroit
✓parfois sensibilté différente à la méthylation
Exemples :

HindII et MsuI 5’- AAGCTT - 3’ Sites de clivage identiques

SmaI 5’- CCCGGG - 3’ Sites de clivage différents

et XmaI 5’- CCCGGG - 3’

MboI 5’- GATC - 3’

Me Sensibilité différente à la méthylation
et Sau3A 5’- GATC - 3’ 5’- GATC - 3’ 29
 1. Nucléases
1.4. Enzymes de restriction
• Richesse des enzymes de restriction
b) Digestion par 2 enzymes de restriction différentes mais
présentant des extrémités compatibles
BglII 5’- AGATCT - 3’ 5’- A GATCT - 3’
3’- TCTAGA - 5’ 3’- TCTAG A - 5’

BamHI 5’- GGATCC - 3’ 5’- G GATCC- 3’

3’- CCTAGG - 5’ 3’- CCTAG G - 5’

Recombinants 5’- A GATCG- 3’ 5’- G GATCT - 3’

3’- TCTAG C - 5’ 3’- CCTAG A - 5’

BglII MboI BamHI

Sau3A
30
 1. Nucléases
1.4. Enzymes de restriction
• Richesse des enzymes de restriction
c) Enzymes avec plusieurs sites de reconnaissance

Ex : HaeII
5’- PuGCGCPy - 3’

5’- AGCGCC - 3’

5’- AGCGCT - 3’

5’- GGCGCC - 3’

5’- GGCGCT - 3’

31
 1. Nucléases
1.4. Enzymes de restriction
• Fréquence de coupure
– Nombre de sites de clivage dans ADN fct de
» 1. Longueur de la séquence reconnue par l’enzyme
» 2. Taille de l’ADN
» 3. Composition en bases
» 4. Contenu GC de la séquence reconnue

Sites de reconnaissance situés au hasard (ADN contenant 50% GC et 50% AT)

1. Probabilité de trouver un tétranucléotide

1 1
P=
4
=  1 site tous les 256 pb
4 256
2. Probabilité de trouver un hexanucléotide
1
P=  1 site tous les 4096 pb
46

3. Probabilité de trouver un hexanucléotide composé uniquement de GC

1
P= 32
46. 42  1 site tous les 65536 pb
 1. Nucléases
1.4. Enzymes de restriction
• Fréquence de coupure
• Exemples de clivage

pBR322 : 4363 pb SV40 : 5243 pb

plasmide procaryote virus animal
Enzyme Séquence 54% GC 40,8% GC
BamHI GGATCC 1 1
EcoRI GAATTC 1 1
PstI CTGGAG 1 2
SmaI CCCGGG 0 0

1. Certains ADN contiennent 75% AT 25%GC (Euglena fragilis)

P trouver séquence 5’ CCCGGG 3’
1 1
P= =
6
4 .82 262144
33
 1. Nucléases
1.4. Enzymes de restriction
• Fréquence de coupure
2. 5’ CpG 3’ : rares chez eucaryotes (plus fréquents chez procaryotes)
pBR322 SV40
CCGG 26 1
GGCC 22 19

 utilisation de ce type d’enzyme pour obtenir de grands fragments

Exemple : gène codant facteur VIII de coagulation : 200 kb
SstI CCGCGG
 Clivage / 150 kb  1 site
PvuI CGATCG
EcoRI GAATTC  Clivage / 4096 pb  50 sites
3. Autre façon d’obtenir de grands fragments :
Enzymes de restriction qui reconnaissent de très grandes séquences
34
Ex : SfiI GGCC NNNNN GGCC
 1. Nucléases
1.4. Enzymes de restriction
• Purification des endonucléases
– Chromatographie

• Unité enzymatique
– Quantité d’enzyme nécessaire pour digérer complètement 1mg
ADN en 15 ou 60 minutes à température optimale de l’enzyme
(souvent 37°C)

35
 1. Nucléases
1.4. Enzymes de restriction
• Conditions de réaction :
– Digestion : importance provenance de l’enzyme

– Milieu d’incubation
» MgCl2 10 mM
» DTT ou b-mercaptoéthanol
» [NaCl] : faible : 0 mM
moyenne : 50 mM
élevée : 100 mM – 150 mM
» Tampon Tris pH 7,5 10 mM
» KCl (rare – SmaI)
» BSA 100 mg/ml

– Température d’incubation
37° c (parfois 55-60°c)

36
– Quantité d’enzyme
 1. Nucléases
1.4. Enzymes de restriction
• Déviation des conditions optimales :
altération spécificité clivage
Ex : EcoRI
5’- GAATTC- 3’

Conditions réactions :
100mM NaCl
5mM MgCl2
pH 7,3

pH
[ ] NaCl 5’- AATT- 3’ Activité STAR
Mn au lieu Mg

• Changement substrat
Substrat préférentiel : db
Certaines enzymes clivent sb mais temps incubation et conc.
enzyme plus élevées 37
 1. Nucléases
1.4. Enzymes de restriction
• Nouvelles conditions de réactions :
– Enzymes de restriction modifiées, utilisable avec 1 seul tampon
» Fast digest avec enzymes restriction
» 100% activité avec toutes les enzymes de restriction
FastDigest
» Fonctionne avec les enzymes de modification :
» Ligases
» phosphatases
» Kinases
» DNA polymerases
• Avantages:
• Digestions double ou multiples avec un seul tampon.
• Pas de digestions “séquentielles” ou de changement de tampon.

38