INTRODUCTION

La chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC) est une technique analytique
largement utilisée en chimie et en biochimie pour séparer, identifier et quantifier les composants
d'un mélange complexe. Elle repose sur le principe de la séparation des composants d'un échantillon
en les faisant passer à travers une colonne remplie d'une phase stationnaire, sous l'effet d'un solvant
mobile à haute pression.

La HPLC offre une grande sensibilité, une excellente résolution et une large gamme d'applications,
allant de l'analyse de composés organiques et inorganiques à la caractérisation des protéines et des
acides nucléiques. Elle est largement utilisée dans les domaines de la pharmacie, de
l'agroalimentaire, de la recherche biomédicale et de l'environnement.

Grâce à sa polyvalence et à sa capacité à séparer efficacement les composants d'un mélange

complexe, la chromatographie HPLC est devenue un outil indispensable pour les laboratoires
d'analyse et de recherche dans de nombreux domaines scientifiques.

I. Historique
En 1906 un botaniste d'origine russe TSWETT, présenta à Varsovie son premier article sur une
nouvelle sorte de phénomène d'adsorption et son application à l'analyse biochimique.
Il y décrivait la formation de zones colorées lors de l'élution par l'éther de pétrole de pigments
végétaux dans une colonne remplie de carbonate de calcium.

L'origine du mot chromatographie vient peut-être de cette séparation de composés colorés puisque
CHROMA (Krwma) en grec, signifie couleur.

Puis les travaux de TSWETT tombèrent dans l'oubli pendant une vingtaine d'années et il faudra
attendre 1931 la publication de KUHN et LEDERER sur la séparation des isomères du carotène et de la
xanthophylle pour assister au développement de la chromatographie en tant qu'outil analytique.

A partir de cette date, la chromatographie prit son véritable essor Vers 1940, Martin et Synge
développent la pratique et la théorie de la chromatographie, ils obtiennent le prix Nobel en 1952.

En 1952, mise au point de la Chromatographie en Phase Gazeuse (CPG). En 1968, mise au point de la
Chromatographie Liquide Haute Performance CLHP ou HPLC en anglais.

En 1979, première séparation chirale par HPLC.

I.1 Généralités
Définition La chromatographie est une méthode physique de séparation non destructrice d’un
mélange liquide ou gazeux en ses différents constituants.
C’est également une méthode analytique qui a pour but d’identifier et de quantifier les composés
d’un mélange homogène liquide ou gazeux.

La chromatographie a une place très importante dans la pratique du laboratoire et est utilisée
couramment pour :

- Contrôler la pureté des réactifs et des produits d'une réaction.

- Suivre une réaction par analyse du milieu réactionnel.

- Isoler et purifier des produits d'une réaction.

- Chromatographie gaz-solide (CGS).

La chromatographie supercritique (SFC) La SFC représente un cas intermédiaire entre CPL et CPG, les
fluides supercritiques possédant des propriétés à la frontière entre celles des liquides et celles des
gaz.

I.1.1 Classification selon les phénomènes chromatographiques

Les phénomènes qui donnent lieu à la séparation dépendent de la nature des phases stationnaires,
et on considère :

La chromatographie d’adsorption

La phase stationnaire est un solide finement divisé sur lequel les molécules adhèrent par un double
effet de physisorption et chimisorption.

Le paramètre physico-chimique concerné est le coefficient d’adsorption.

La chromatographie de partage

La phase stationnaire est un liquide immobilisé sur un support solide inerte : soit imprégnée dans un
solide poreux (risques de lessivage), soit greffée sur le solide (phase greffée).

La séparation repose sur le coefficient de partage du soluté dans les deux phases liquides.

La chromatographie par échange d’ions ou chromatographie ionique

La phase stationnaire est formée de macromolécules (résines) portant des groupes fonctionnels
acides ou basiques qui permettent l’échange de contre ions avec des ions de même signe de
l’échantillon.
La séparation repose sur les coefficients de distribution ioniques.

La chromatographie d’exclusion, ou perméation de gel, ou tamisage moléculaire

La phase stationnaire est un solide poreux : les grosses particules sont exclues de la phase fixe, les
petites particules incluses diffusent dans les pores du gel et sont donc retardés.

La chromatographie d’affinité la phase stationnaire est ici un substrat inerte sur lequel est greffé un
“effecteur” qui présente une affinité pour un soluté de l’échantillon à analyser (affinité enzyme-
substrat, ligand récepteur, antigène-anticorps).

I.1.2 Classification d’après le procédé utilisé

Selon l’immobilisation de la phase stationnaire on distingue : La chromatographie sur colonne (CC) La

phase stationnaire est contenue dans une colonne cylindrique en verre ou en métal.

La chromatographie sur papier (CP) Une surface de cellulose considérée comme support maintient
par imbibition une phase stationnaire liquide.

La chromatographie sur couche mince (CCM)

La phase stationnaire est dans ce cas retenue sur une surface plane (verre, matière plastique ou
feuille d’aluminium) qui est recouverte d’une mince couche de 0.2 à 0.3 mm d’épaisseur de gel de
silice, cellulose, d’alumine ou même de grains de résines échangeuses d’ions.

I.1.3 Choix de la technique

Figure 1

Les différentes techniques sont complémentaires plutôt que concurrentes.

Le choix de l’une ou l’autre dépend : De la nature du soluté Gaz, liquide volatil, liquide peu volatil,
solide, macromolécule, espèce organique, polaire, ionique,…

Du but de l’analyse Identification de composants d’un mélange, nécessité ou non de “coupler” la

chromatographie avec une méthode spectroscopique ou avec la spectrométrie de masse (CPG/SM ou
GC/MS), contrôle de pureté, purification de produits (colonnes préparatives), suivi de réaction en
continu pour optimiser des paramètres, dosages (quantification)… I.6 Théorie De Base - Grandeurs
Fondamentales

I.1.4 Le chromatogramme

Le chromatogramme est une courbe qui traduit la variation au cours du temps d’un paramètre relié à
la concentration instantanée du soluté en sortie de colonne. La ligne de base correspond au tracé
obtenu en l’absence de composé élué

(Figure 1).

Ce graphique est utilisé à la fois en analyse qualitative et quantitative.

- Analyse qualitative : permet l’identification des composés par la position du pic.

- Analyse quantitative : évaluer la concentration ou la masse d’un composé en utilisant l’aire des pics
Figure 2 : diagramme montrant les caractéristique d’un chromatogramme

Un pic chromatographique est caractérisé par :

Temps mort

Le temps mort (tm) est le temps mis par un composé non retenu par la phase stationnaire de la
colonne, pour parcourir le trajet entre l’entrée et la sortie de la colonne (ou temps mis par la phase
mobile pour traverser la colonne).

Le temps t0 est le temps du début de l’injection.

Le temps de rétention

Le temps mis par les molécules d’un composé à analyser (soluté) pour parcourir le trajet entre
l’entrée et la sortie de la colonne.

Un constituant est caractérisé par son temps de rétention tr, temps écoulé entre l’instant de
l’injection et celui déterminé au maximum du pic lui correspondant sur le chromatogramme.

Le temps de rétention est indépendant de :

- la quantité injectée,

- la nature et de l’abondance des autres constituants dans le mélange. Par contre il dépend de :

- la masse de phase stationnaire dans la colonne, - débit de la phase mobile,

- volume mort du chromatographe (injecteur, détecteur, canalisations..),

- la nature de la phase stationnaire.

Le temps de rétention corrigé ou réduit tr’

Temps mis par les molécules du soluté pour parcourir le trajet entre l’entrée et la sortie de la colonne
représentant le temps passé dans la phase stationnaire. Il est obtenu par différence entre le temps
de rétention réel et le temps mort. Il est lié uniquement au phénomène de rétention proprement dit.
tr’ = tr – tm

Le volume de rétention

Le volume de rétention de chaque soluté représente le volume de la phase mobile nécessaire pour le
faire migrer d’une extrémité à l’autre de la colonne.

Ce volume correspond sur le chromatogramme au volume de la phase mobile qui s’est écoulé entre
l’instant de l’injection et celui correspondant au maximum du pic.

Si D est le débit alors : Vr = tr × D

On peut également calculer le volume mort correspondant au volume de la phase mobile dans la
colonne (volume interstitiel) : Vm = tm × D

Vitesse linéaire moyenne du soluté et de la phase mobile

- La vitesse linéaire moyenne de progression du soluté v est égale à : = r L ∶ longueur de la colonne

- La vitesse linéaire moyenne de la phase mobile u est égale à : =

I.1.5 Le coefficient de distribution

En chromatographie en phase liquide, les séparations sont basées sur la différence de distribution
des espèces entre deux phases non miscibles l'une stationnaire (particules solides imprégnées ou
non d'un liquide), l'autre mobile (liquide).

Pour un système chromatographique donné, le coefficient de distribution K (ou coefficient de

partage) est défini par : = s m Cs : concentration du soluté dans la phase stationnaire Cm :
concentration du soluté dans la phase mobile

I.1.7 Le facteur de capacité k' (ou facteur de rétention )

Quand on introduit un composé dans la colonne, sa masse totale mT se répartit en deux quantités
mM dans la phase mobile et mS dans la phase stationnaire.
Ces quantités restent constantes au cours de sa migration dans la colonne.

Elles dépendent de mT et de K. Leur rapport est fixe et est appelé facteur de rétention :

Avec Vs : volume de la phase stationnaire qui est calculé par différence entre le volume total de la
colonne et le volume de la phase mobile (VM).

k’ n’est pas une constante mais varie avec les conditions opératoires (température, composition de la
phase mobile…).

C’est le paramètre le plus important en chromatographie pour définir le comportement d’une

colonne. On évite d’avoir des valeurs de k’ trop élevées pour ne pas allonger le temps d’analyse.

k’ peut se déterminer directement à partir du chromatogramme :

Cette relation est également souvent rencontrée sous la forme :

I.1.8 L’efficacité d’une colonne

a) Nombre de plateaux théoriques et de plateaux efficaces
L'efficacité d'une colonne chromatographique, dont dépend l'étalement des pics, est mesurée, pour
chaque composé, par le nombre de plateaux théoriques N de la colonne.

Cette théorie est née de la recherche d'un modèle statique permettant de décrire le fonctionnement
d'une colonne chromatographique comme celui d'une colonne à distiller.

Au lieu de considérer le déplacement réel, continu de la phase mobile, on admet que celle-ci
progresse par sauts successifs et se met en équilibre avec la phase stationnaire entre deux transferts,
ce qui permet de découper fictivement la colonne de longueur L en N petits disques fictifs de même
hauteur H, numérotés de 1 à n.

Pour chacun d’eux, la concentration du soluté dans la phase mobile est en équilibre avec la
concentration dans la phase stationnaire de ce soluté.
À chaque nouvel équilibre le soluté a progressé d’un petit disque supplémentaire dans la colonne,
appelé plateau théorique (Figure 2)

Figure 3: théorie des plateaux

La hauteur équivalente à un plateau théorique (HEPT ou H) vaut donc : 8 = 9

L’efficacité de la colonne augmente lorsque le nombre de plateaux théoriques augmente ou si H

diminue à longueur L constante.

Elle peut varier considérablement selon le type de colonne et la nature des deux phases.

b) Pics d’élution Gaussiens

L’efficacité de la colonne est calculée à partir du pic chromatographique que l’on assimilera à une
courbe de Gauss. La dispersion d’un pic est caractérisée par son écart type σ et sa variance
σ : l’écart type du pic (qui est égal à la demi largeur du pic à 60,6% de sa hauteur totale) variance v =
σ 2 ω : la largeur de la base du pic mesurée à 13,5% de la hauteur totale

L’efficacité d’une colonne est liée à la largeur des pics et on définit cette efficacité comme étant la
variance par unité de longueur de colonne soit :

Comme H est exprimé en unité de longueur, σ et L sont exprimés en unité de longueur.

On peut déterminer la H ou N graphiquement. On mesure graphiquement tr et ω (en unité de

temps).

Ce qui permet de déterminer N puis H.

On peut aussi exprimer cette relation en fonction de la largeur à mi‐hauteur δ. Elle devient

< On utilise généralement cette dernière équation car les pics sont souvent déformés à la base.

c) Efficacité réelle d’une colonne N et H sont deux paramètres utilisés dans la littérature et par les
fabricants d’appareils pour évaluer les performances d’une colonne. Ils sont donnés pour un soluté
défini dans les conditions définies.

Lorsque l’on veut comparer les performances de deux colonnes de conception différentes, il est
préférable de remplacer tr par le temps réduit t’R qui ne tient pas compte du temps mort tm passé
pour tout composé dans la phase mobile.

Les expressions deviennent :

Ces grandeurs corrigées ne sont utiles à considérer que si le temps mort est grand par rapport au
temps de rétention du composé. Ceci est notamment le cas en CPG lorsque l’on veut comparer les
performances d’une colonne capillaire et d’une colonne remplie.

I.6.5 La qualité de la séparation

a) Sélectivité d’une colonne
Le facteur de sélectivité α décrit la position de deux pics adjacents 1 et 2 situés sur un
chromatogramme. Il correspond au rapport des facteurs de rétention de la colonne pour les deux
composés. Il définit si la séparation est chimiquement possible

Figure 4 : facteur de sélectivité b) Résolution La résolution R d’une colonne donne la mesure

quantitative de son aptitude à séparer deux solutés. Elle est définie par :
Figure 5 : facteur de résolution

Une résolution de 1,5 permet la séparation pratiquement complète de 1 et 2, ce qui n’est pas le cas
pour une résolution de 0,75.

Pour une résolution de 1 le pic de 1 contient environ 4% de 2 et le pic de 2 environ 4% de 1.

Pour une résolution de 1,5 le chevauchement est d’environ 0.3%.

On établit facilement l’équation qui lie la résolution d’une colonne et le nombre de ces plateaux
théoriques ainsi que les facteurs de capacité et de sélectivité de deux solutés sur la colonne :

Pour une résolution de 1 le pic de 1 contient environ 4% de 2 et le pic de 2 environ 4% de 1.

Pour une résolution de 1,5 le chevauchement est d’environ 0.3%. On établit facilement l’équation qui
lie la résolution d’une colonne et le nombre de ces plateaux théoriques ainsi que les facteurs de
capacité et de sélectivité de deux solutés sur la colonne :

Facteur de capacité de l’espèce la plus lente et α le facteur de sélectivité.

I.1.8 Optimisation d’une analyse chromatographiq

Table des matières

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ue

La résolution et le temps d’élution sont les deux variables dépendantes les plus importantes à
considérer. Dans toute optimisation, le but est de réussir une séparation suffisante du ou des
composés intéressants en un minimum de temps.
Les paramètres qui conditionnent R et tr sont le nombre de plateaux théoriques N, le facteur de
capacité α et le facteur de sélectivité k’2 :

I.1.9 Modification de la hauteu r équivalente à un plateau théorique La résolution d’une colonne

est par définition proportionnelle à la racine carrée du nombre de plateaux théoriques qu’elle
contient. L’augmentation du nombre de plateaux entraîne un allongement de la durée de la
séparation, sauf si cette augmentation est obtenue en réduisant H.

Les méthodes permettant de minimiser H sont la diminution de diamètre des particules du support
la température (CPG) l’épaisseur du film liquide (HPLC) On peut optimiser également la vitesse
d’écoulement de la phase mobile.

I.2. Modification du facteur de capacité

La séparation peut souvent être améliorée de manière significative en modifiant le facteur de
capacité k’2. L’augmentation de k’2 améliore le facteur de résolution au détriment de la durée de
l’élution.

Les valeurs optimales de k’ sont généralement comprises entre 2 et 5. Le moyen le plus usuel pour
améliorer la résolution est d’optimiser k’ : pour les phases mobiles gazeuses, k’ peut être contrôlé en
modifiant la température. Pour les phases liquides des changements de composition du solvant
permettent souvent d’agir sur k’ de manière à obtenir de meilleures séparations.

I.2.1 Modification du facteur de sélectivité

L’optimisation de k’ et de N ne suffisent pas pour donner une bonne séparation de deux solutés en
un temps raisonnable si α est proche de 1. Dans ce cas on doit chercher à augmenter α tout en
maintenant k’ entre 1 et 10.

Plusieurs options sont possibles, on peut : modifier la phase mobile modifier la température de la
colonne modifier la composition de la phase stationnaire utiliser des effets chimiques spéciaux.

Une augmentation de température entraîne également une augmentation de k’ mais elle a peu
d’effet sur la valeur de α en chromatographie liquide-liquide ou liquide-solide. Par contre la
température a une influence sur l’échange d’ions et sera un paramètre à optimiser.

I.2.2 Analyse qualitative et quantitative

I.2.3 Analyse qualitative
Elle sert essentiellement à l’identification des composants d’un mélange. Elle consiste à identifier les
solutés par leur temps de rétention qui pour des conditions données (solvant, débit, colonne etc) est
caractéristique du composé.

Il peut bien sur arriver que deux composés différents mais très proches aient le même temps de
rétention. On doit donc s’assurer préalablement qu’un pic donné correspond bien à un seul soluté.
C’est l’objet de toute la phase de mise au point des conditions opératoires utilisées. On admet ici
pour la suite que chaque pic correspond à un seul composé.

I.2.4 Analyse quantitative

Une fois identifiés le ou les solutés intéressants, celui-ci permet l’analyse quantitative grâce à la
relation: mi = Ki Ai mi : la masse du soluté i injecté Ai : l’aire du pic représentant ce soluté. Ki : le
coefficient de proportionnalité.

a) Mesure de l’aire de pic Ai

On utilise essentiellement la triangulation manuelle et l’intégration automatique la triangulation : on

assimile le pic à un triangle soit en traçant les tangentes aux points d’inflexion de la courbe et en
calculant l’aire: Ai = ½H’× ω, soit en mesurant la largeur à mi- hauteur et en calculant l’aire par: Ai = H
× δ ou encore en mesurant les largeurs au quart (β) et aux trois quarts (γ) de la hauteur, Ai = ½H× (β +
γ)

Figure 7 : la triangulation
b) Détermination du coefficient de proportionnalité Il est impossible avec les chromatographes
courants de calculer le coefficient de proportionnalité par mesure directe de l’aire du pic enregistré
quand on introduit une masse exacte, connue, d’un soluté d’un injecteur.

Les seringues d’injection ne permettent pas de repérer le volume d’échantillon avec une précision
suffisante. On aura donc recours à des méthodes d’étalonnage, qui, comme en analyse qualitative,
feront de la chromatographie quantitative un procédé relatif vis-à-vis de substances connues.

Voici les principales méthodes utilisées.

Normalisation interne : en considérant que tous les Ki sont égaux (séries homologues telles
qu’alcanes, alcools, etc...). On obtient alors les pourcentages en masse de chaque soluté de la
manière suivante:

Etalonnage interne : dans cette méthode, on compare individuellement chacun des pics à évaluer au
pic d’une substance étalon E, convenablement choisie, introduite en proportion connue dans le
mélange à analyser. il convient évidemment que le pic étalon ne soit confondu avec aucun des pics
du chromatogramme.

On définit alors

On calculera donc la réponse de chaque soluté concerné par rapport à l’étalon. La méthode est
générale.

Elle est précise et reproductible Etalonnage externe : Cette technique n'est valable qu'avec une
excellente qualité d'injection On injecte une masse me de composé étalon en solution (Ve injecté).
On injecte un même volume de solution contenant le composé (mi) et on mesure mi.

II.3 Chromatographie liquide haute performance (CHLP)

II.3.1 Généralités

La chromatographie en phase liquide à haute performance (CLHP) — HPLC en anglais (high

performance liquid chromatography) — initialement chromatographie liquide à haute pression, est
une technique instrumentale qui permet de séparer les composants d’un mélange non volatile,
thermosensible, de polarité élevée afin de les identifier et les quantifier ou encore une technique de
séparation analytique et/ou préparatrice de molécules présentes dans un mélange.

Elle correspond à une évolution de la chromatographie liquide sur colonne dont les performances, en
termes de sélectivité et de résolution, se sont trouvées grandement améliorées par la miniaturisation
et l’utilisation de phases stationnaires très élaborées.

Elle utilise des colonnes remplies d’une phase stationnaire constituée de particules sphériques de
très petites dimensions de diamètre couramment compris entre 2 et 5 µm en utilisant des pompes
très performantes pour maintenir un débit d’éluant suffisant et constant à travers la colonne, ce qui
conduit à de grandes efficacité et résolution.

Le P du sigle, à l'origine signifiait Pression mais lorsque la méthode a été améliorée (réduction des
particules et régulation de la phase stationnaire) le P a été attribué à Performance afin de marquer
cette innovation.

Il existe différents modes possibles en HPLC. Le mode de séparation choisi dépend des propriétés des
molécules à séparer.

Les différents types de chromatographie communément utilisés sont :

La chromatographie de partage (la plus utilisée)

La chromatographie ionique

La chromatographie d’exclusion stérique

La chromatographie d’adsorption (peu utilisée, dédiée à des applications particulières)

Le schéma simplifié ci-dessous vous permettra d’appréhender le mode d’HPLC le mieux adapté à la
séparation des composés selon leurs propriétés

II.3.2 Classification des méthodes chromatographiques

Sous le nom de chromatographie on regroupe un très grand nombre de techniques différentes qui
peuvent se classer en trois catégories selon : La nature physique des phases (mobile et stationnaire).

Le principe du phénomène mis en jeu (type d’équilibre).

Le procédé opératoire (immobilisation de la phase stationnaire).

II.3.3 Classification selon la nature physique des phases

Dans ce classement chromatographie en phase liquide (CPL) Si la phase mobile est un liquide, la
phase stationnaire peut être soit un solide finement pulvérisé soit un liquide immobilisé sur une
phase fixe, la combinaison de ces différents possibilités permet de distinguer deux types de
chromatographie :

- Chromatographie liquide-liquide (CLL).

- Chromatographie liquide-solide (CLS).

Chromatographie en phase gazeuse (CPG)

Si la phase mobile est un gaz (vecteur), la phase stationnaire peut être soit un solide poreux, réservé
à l’analyse de mélanges de gaz à bas points d’ébullition, soit un liquide immobilisé sur un support
solide par imprégnation ou par greffage, la combinaison de ces différentes possibilités permet de
distinguer deux types de chromatographie :

- Chromatographie gaz-liquide (CGL).

II.3.4 Principe
L'échantillon à analyser est poussé par un liquide (appelé phase mobile) dans une colonne remplie
d'une phase stationnaire (les « grains » sont de très petite taille).

Ce débit élevé diminue le temps nécessaire pour séparer les composants le long de la phase
stationnaire.

En effet, pour un même volume de phase stationnaire la surface d'échange augmente si la

granulométrie est fine.

Les composés à séparer (solutés) sont mis en solution dans un solvant.

Ce mélange est introduit dans la phase mobile liquide (éluant), suivant la nature des molécules, elles
interagissent plus ou moins avec la phase stationnaire dans la colonne chromatographique.

La phase mobile poussée par une pompe sous haute pression, parcourt le système
chromatographique. Le mélange à analyser est injecté puis transporté au travers du système
chromatographique. Les composés en solution se répartissent alors suivant leur affinité entre la
phase mobile et la phase stationnaire.

En sortie de colonne grâce à un détecteur approprié les différents solutés sont caractérisés par un pic
chromatographique.
Figure 7: principe de fonctionnement de l’HPLC

II.3.5 Description de l'appareillage U appareil de HPLC comporte quatre parties :

système de pompage, injecteur, colonne et détecteur à travers lesquels un liquide entraine les
substances d’un mélange à séparer.

Un réservoir de solvant (éluant)

Les appareils sont équipés d’un ou plusieurs réservoirs contenant chacun une quantité suffisante la
phase mobile. Plusieurs flacons d'éluant (solvants de polarités différentes) sont disponibles pour
pouvoir réaliser des gradients d'élution (mélange de plusieurs solvants à des concentrations
variables) à l'aide de la pompe doseuse.

2) Dégazeur

Comme son nom l'indique, ce composant permet de retirer le gaz (oxygène) présent dans le(s)
solvant(s) afin d'éviter d'endommager les échantillons ou la phase stationnaire. Deux types de
dégazeurs sont utilisés en HPLC :

• Dégazeur à gaz inerte : On fait barboter un gaz inerte dans la PM (Phase Mobile) pour retirer le gaz
dissous dans le liquide. L'hélium est le gaz inerte le plus utilisé pour cette application.

• Dégazeur par vide : Cette méthode consiste à descendre en pression dans une enceinte où se
trouve le solvant à l'aide d'une pompe à vide primaire, et ainsi séparer le gaz dissous dans le fluide.
Elle est bien plus efficace, ne requiert plus de gaz inerte, et remplace de plus en plus l'ancienne
technique dans le domaine de l'analyse HPLC.

La pression dans l'enceinte est de l'ordre du millibar.

3) La pompe

C'est la partie qui sert à stocker l'éluant et à l'injecter sous pression dans la colonne.

Les pompes demeurent la partie la plus délicate de l’appareillage car elles doivent répondre à des
critères rigoureux :

- Obtention de pressions pouvant aller jusqu’à 420 bars,

- Débit compris entre 0,1 et 10 mL.min-1 et le plus régulier possible,

- Résistance à la corrosion quel que soit le solvant utilisé …

Les pompes les plus utilisées comportent deux pistons, ce qui permet de régulariser le débit.

Elle est munie d'un système de gradient permettant d'effectuer une programmation de la nature du
solvant. Elle permet de travailler :

- En mode isocratique, c'est-à-dire avec 100% d'un même éluant tout au long de l'analyse.

- En mode gradient, c'est-à-dire avec une variation de la concentration des constituants du mélange
d'éluant.

On utilise une pompe pour une élution isocratique ou plusieurs pour une élution par gradient.

Elle est composée de :

Deux pistons alternatifs ;

Réservoirs de phase mobile ;

Électrovannes ;

Amortisseur de pulsations ;

Système de purge et d'amorçage ;

Capteur de pression.

4) L’injecteur

L’injecteur le plus courant est une vanne d’injection à boucle représenté extraction sur phase solide
en ligne.
Des tubes en acier inoxydable, en Téflon, en PEEK ou en silice fondue permettent de relier la ou les
pompes à l'injecteur chromatographique. Il y a plusieurs types d'injecteurs :

Boucle d'injection : permet la répétabilité du volume d'injection ;

Injecteur seringue ;

ci-dessous (figure 6).

Détecteur

Détecteur de chromatographie.

Il existe plusieurs types de détecteurs :

Détecteurs spectroscopiques :

Par spectroscopie d'absorption : ultraviolet-visible (comprenant un détecteur à barrette de diodes

(DAD ou PDA)) ou infrarouge,

Par spectroscopie de fluorescence ;

Réfractométrie ;

Détecteurs électrochimiques (DEC) :

Ampérométriques,

Coulométriques,

polarographiques,

Potentiométriques ;

Conductimétrie ;

Évaporatif à diffusion de la lumière (DEDL) (évaporatoire light scattering detector (ELSD) en anglais) ;
Détection spectrale avec couplage :

À la spectrométrie de masse (MS) avec la chromatographie en phase liquide-spectrométrie de masse,

À la spectroscopie atomique.

Figure 7: injecteur à boucle.

Dans la position remplissage : la vanne fait communiquer la pompe et la colonne.

L’échantillon, en solution, est introduit à l’aide d’une seringue dans un petit volume tubulaire appelé
boucle. Dans la position injection : après rotation de la vanne, la phase mobile entraine l’échantillon
en tête de colonne. L’injection doit se faire en un temps très bref afin de perturber le moins
longtemps possible le régime établi dans la colonne et le détecteur. Il faut introduire en tête de
colonne, sans stopper la circulation de la phase mobile, un volume précis d’échantillon (compris
entre 5 et 500 µL), là où la pression dépasse souvent 104 kPa. 5)

La colonne Une colonne est un tube construit dans un matériau le plus possible inerte aux produits
chimiques, souvent en inox ou en verre. Sa section est constante, de diamètre compris entre 4 et 20
mm pour des longueurs généralement de 15 à 30 cm. La phase stationnaire est maintenue entre
deux disques poreux situés aux extrémités. Le débit de la phase mobile ne peut dépasser quelques
mL.min-1 .

Figure 8 : colonne de chromatographie HPLC

Il existe des micro-colonnes d’une longueur de 5 cm et d’un diamètre de 0,3 mm pour lesquelles le
débit de la phase mobile ne peut dépasser quelques µL.min-1.

Ces colonnes ont l’avantage de consommer très peu d’éluant et de conduire à une meilleure
résolution.

6) Le détecteur

Le détecteur doit fournir un signal électrique reflétant en continu les variations de la composition de
l’éluant à la sortie de la colonne, ce qui permet de détecter le passage des composés successifs.
Aucun détecteur n’est universel, mais un bon détecteur doit réunir les qualités suivantes : - Donner
une réponse proportionnelle à la concentration instantanée pour un même composé - être sensible -
Avoir une faible inertie - être stable dans le temps

- Avoir peu de bruit de fond Il existe plusieurs types de détecteurs dont les plus courants sont cités ci-
dessous. Détecteur spectrophotométrique Les détecteurs spectrophotométriques peuvent faire une
détection monochromatique (détecteur UV avec lampe au deutérium) ou polychromatique
(détecteur à barrette de diodes ce qui permet d’obtenir des renseignements spectraux pouvant
servir à l’identification des composés).

On mesure en permanence l’absorbance de la phase mobile à la sortie de la colonne à une ou

plusieurs longueurs d’onde dans l’UV/visible. Pour pouvoir repérer les solutés, il faut qu’ils absorbent
et que la phase mobile n’absorbe elle-même pas ou très peu.

L’absorbance d’un composé est proportionnelle à sa concentration à condition que celle-ci reste
faible (loi de Beer Lambert). Détecteur spectrofluorimétrique Certains composés sont fluorescents et
l’intensité de la fluorescence d’un composé est proportionnelle à sa concentration à condition que
celle-ci reste faible. Détecteur réfractométrique Son principe est basé sur la différence d’indice de
réfraction entre la phase mobile et l’effluent à la sortie de la colonne. C’est un détecteur assez peu
sensible et qui doit être thermostaté ainsi que la colonne car sa réponse est très sensible aux
variations de température. Il ne peut être utilisé qu’en mode isocratique car la variation de la
composition de l’éluant au cours de l’analyse entraîne une dérive de la ligne de base. Il conduit à des
pics soit négatifs soit positifs, ce qui implique un réglage de la ligne de base à mi-hauteur du graphe.

II.3.7 Interaction moléculaire entre phase mobile et soluté

En chromatographie en phase liquide les principales interactions qui régissent les mécanismes de
rétention et d’élution de solutés sont, en fonction de l’énergie mise en jeu, liées à d’interactions
diélectriques, de liaisons de type hydrogène ou de liaisons de Van der Waals.

1) Force éluante et polarité

• La phase stationnaire

- La phase normale : est constituée de gel de silice. Ce matériau est très polaire. Il faut donc utiliser
un éluant apolaire. Ainsi lors de l'injection d'une solution, les produits polaires sont retenus dans la
colonne, contrairement aux produits apolaire qui sortent en tête. L'inconvénient d'une telle phase,
c'est une détérioration rapide au cours du temps du gel de silice, ce qui entraîne un manque de
reproductibilité des séparations.

- La phase inverse : est majoritairement composée de silice greffée par des chaînes linéaires de 8 ou
18 atomes de carbones (C8 et C18).

Cette phase est apolaire et nécessite donc un éluant polaire (ACN, MeOH, H20). Dans ce cas, ce sont
les composés polaires qui seront élués en premier. Contrairement à une phase normale, il n'y a pas
d'évolution de la phase stationnaire au cours du temps, et la qualité de la séparation est donc
maintenue constante.

• La phase mobile

L'interaction plus ou moins forte entre la phase mobile et la phase stationnaire normale ou à polarité
inversée se répercute sur les temps de rétention des solutés. La polarité de la phase stationnaire
permet de distinguer deux situations de principe :

- Si la phase stationnaire est polaire, on utilisera une phase mobile peu polaire la chromatographie
est dite en phase normale ;

- Si la phase stationnaire est très peu polaire, on choisira une phase mobile polaire (le plus souvent
des mélanges de méthanol ou d'acétonitrile avec de l'eau), c'est la chromatographie en phase
inverse. En modifiant la polarité de la phase mobile, on agit sur les facteurs de rétention k des
composés.

Les silices greffées conduisent en général à une perte importante de polarité. Avec une phase
greffée, l'ordre d'élution est opposé à celui auquel on est habitué avec les phases normales. Ainsi
avec un éluant polaire, un composé polaire migre plus vite qu'un composé apolaire. Dans ces
conditions les hydrocarbures sont fortement retenus. On réalise des gradients d'élution en diminuant
au cours de la séparation la polarité de l'éluant (ex : mélange eau /acétonitrile dont la concentration
en acétonitrile va en croissant au cours de l'élution). On peut, en mélangeant plusieurs solvants,
ajuster le pouvoir d'élution de la phase mobile.
Figure 19 : pouvoir d’élution de la phase mobile en HPLC

2) Polarité selon Snyder

Les solvants dont les interactions avec le soluté sont importantes sont souvent appelés solvants forts
ou solvants polaires.

L’indice de polarité de Snyder est le plus utile en chromatographie de partage pour décrire
quantitativement la polarité d’un solvant. Ce paramètre est basé sur des mesures de solubilité de la
substance étudiée dans trois solvants : le dioxane (accepteur de protons à faible moment dipolaire),
nitrométhane (accepteur de protons à moment dipolaire élevé) et l’alcool éthylique (donneur de
proton à moment dipolaire élevé). L’indice de polarité est donc une mesure numérique des polarités
relatives de différents solvants. La polarité globale d’un mélange de trois solvants sera : P’ =
logK1+logK2+logK3 En normant : x1+x2+x3 = 1 Alors : x1 = logK1/P’

II.3.8 Mécanismes d’interaction avec la colonne

Selon la nature de la phase stationnaire (c’est-à-dire le phénomène physico-chimique sur lequel est
basée la séparation proprement dite) on peut distinguer les mécanismes suivants :

chromatographie d’adsorption, chromatographie de partage, chromatographie par échange d’ions et

chromatographie par exclusion de taille.
1) Chromatographie d’adsorption

• L’adsorption L’adsorption est un phénomène de surface par lequel des molécules se fixent sur la
surface d’un adsorbant, selon divers processus plus ou moins intenses.

Pour que cette adsorption soit utilisable à des fins préparatoires, il faut que cette fixation soit
réversible.

Le phénomène inverse, par lequel les molécules adsorbées sur une surface s’en détachent se
nomment la désorption.

• La chromatographie d’adsorption

La chromatographie

d’adsorption est la plus ancienne méthode de chromatographie (TWSETT, 1906). Elle s’applique à la
plupart des composés organiques de masses molaires inférieures à 3000 et ceci d’autant mieux que
ces masses sont plus élevées. Cette chromatographie liquide-solide est basée sur la répartition des
solutés entre l’adsorbant fixe et la phase liquide mobile. Chacun des solutés est soumis à une force
de rétention (par adsorption) et à une force d’entraînement par la phase mobile. L’équilibre qui en
résulte aboutit à une migration différentielle des solutés de l’échantillon à analyser, ce qui permet
leur séparation.

• Les adsorbants

La surface spécifique des adsorbants correspond à leur surface d’adsorption par unité de masse. Elle
est liée à leur granulométrie et à leur porosité. Une grande surface spécifique est naturellement
souhaitable car elle permet d’obtenir de meilleures séparations tout en diminuant la longueur des
colonnes (important en CL).

L’adsorbant doit être pratiquement insoluble dans les solvants et éluant utilisés d’une part et
présenter, d’autre part, une inertie chimique vis-à-vis des solutés.

L’origine des adsorbants est très diverse. Les poudres de charbon végétal ou animal sont parfois
utilisées mais elles présentent un trop grand pouvoir adsorbant. C’est parmi les oxydes, les
hydroxydes et les sels minéraux insolubles que l’on trouve la plus grande majorité des adsorbants.
Ceux que l’on emploie le plus couramment sont : - La silice (SiO2). Souvent désignée aussi sous le
terme de gel de silice (silice plus ou moins hydratée (4% H2O), provenant de la déshydratation de
l’acide silicique). Elle se présente sous forme d’une poudre blanche de très fines granulométries.
Le mécanisme de rétention sur cet adsorbant est maintenant admis comme résultant de la présence,
à sa surface, de groupes silanols (-OH) et de groupes siloxanes (-O-) qui expliquent sa polarité, son
caractère acide et la possibilité de former des liaisons hydrogènes.

Figure 9: représentation du gel de silice

- L’alumine (Al2O3). Elle s’obtient par déshydratation de l’hydroxyde (Al(OH)3). Selon sa préparation,
elle renfermera un certain nombre de molécules d’eau liées (Al2O3.nH2O).

La silice convient pour les solutés qui sont des bases (les amines aliphatiques et aromatiques).
Inversement, l’alumine convient bien pour la séparation des solutés acides comme : les phénols et
les acides carboxyliques.

Pour ces deux supports les molécules polaires sont toujours les plus adsorbés. A côté de ces
adsorbants, on peut encore citer les sels de calcium (phosphates et carbonates), les oxydes de
magnésium, les silicates de magnésium ainsi que des adsorbants organiques tels que l’urée,
polyamide, saccharose et dérivés du polystyrène. Pour des molécules très polaires la
chromatographie d’adsorption n’est pas adéquate car il y a une très forte rétention d’où la nécessité
d’utiliser la chromatographie de partage.

• Phase mobile

Il faut que le soluté soit soluble dans l’éluant pour que la migration se fasse et il est possible de faire
des mélanges de solvants pour changer sa polarité. Sous réserve de leur miscibilité et de leur
compatibilité avec le système de détection pour obtenir de bonne séparation.

La plupart des séparations chromatographiques s’effectuent en adaptant la polarité de la phase

stationnaire à celle du soluté, on utilise par contre une phase mobile dont la polarité est
extrêmement différente.
Moins un composé est polaire, moins il s’accroche à l’adsorbant, plus il migre avec l’éluant et plus un
composé est polaire, plus il s’accroche à l’adsorbant, moins il migre avec l’éluant.

2) Chromatographie de partage

• Principe La chromatographie de partage est la technique de chromatographie liquide, la plus

utilisée. Elle fonctionne par partage de solutés entre deux phases non miscibles l’une mobile et
l’autre stationnaire.

La phase stationnaire peut-être un film liquide imprégné sur un support en principe inerte (la silice
perd ses propriétés adsorbantes par saturation des sites d’adsorption) mais il a tendance à être
emporté avec la phase mobile ("lessivage", "bleeding"), ou une phase organique fixée par liaison
chimique covalente sur un support (phase greffée). Il s’établit un équilibre qui dépend de la solubilité
relative du soluté dans les deux solvants donc du coefficient de partage. La séparation de deux ou
plusieurs corps sera d’autant efficace que leurs coefficients de partage respectifs seront différents.
Ce mécanisme est surtout utile pour la séparation de molécules très polaires de masses molaires
inférieures à 3000 et aux homologues d’une même série, mal séparés par chromatographie
d’adsorption.

• Support Les supports sont inertes vis-à-vis des composés à séparer. Ils ne servent qu’à immobiliser,
par adsorption ou formation de liaisons chimiques covalentes, la phase stationnaire liquide. Ce sont
des solides très finement divisés qui présentent une très grande surface afin de retenir, sous un petit
volume, une grande quantité de phase stationnaire. Il est nécessaire que leurs rétention soit
énergique et qu’ils ne réagissent pas avec le soluté. Leurs propriétés d’adsorption doivent être
totalement masquées. Les phases stationnaires décrites en chromatographie d’adsorption peuvent
être utilisées comme support.

• Types de chromatographie de partage

Selon la polarité de la phase stationnaire et mobile on peut distinguer :

Chromatographie de partage sur phase normale

La phase stationnaire est polaire, de nature hydrophile, avec des groupements : amine : NH2, nitrile :
CN, dialcool : (CHOH) CH2OH, greffés sur la silice. La phase mobile est un solvant apolaire, de nature
lipophile, l’hexane ou l’éther isopropylique (CH3)2CHOCH(CH3)2). En chromatographie à phase
normale, le constituant le moins polaire est élué le premier, l’augmentation de polarité de la phase
mobile réduit son temps d’élution.
Figure 10: chromatographie de partage sur phase normale

Chromatographie de partage sur phase inversée C’est la phase stationnaire, constituée souvent d’un
hydrocarbure qui est apolaire, de nature lipophile avec des chaines alkyles de C4 à C30, des
groupements propyle, phényle ou diphényle.

La phase mobile est un solvant polaire, tel l'eau, le méthanol, ou le cyanure de méthyle (acéto
nitrile). Dans ces systèmes, le solvant le plus polaire (l'eau) est le moins éluant et la force éluante de
la phase mobile est augmentée par ajout d'un solvant organique (méthanol, acétonitrile), le
constituant le plus polaire est élué le premier et l’augmentation de polarité de la phase mobile
allonge son temps d’élution.
3) chromatographie d’exclusion sur gel

• principe La chromatographie d'exclusion, ou gel filtration ou gel perméation est fondée sur la
“rétention” des molécules de soluté en fonction de leur taille en raison de leur pénétration dans les
pores, remplis de solvant, d'une phase stationnaire appropriée. Si on suppose que les molécules de
soluté ne présentent aucune affinité pour les parois de la phase stationnaire particulaire, les grosses
molécules ne pourront pas pénétrer dans les pores, elles migreront plus rapidement que les petites
molécules qui peuvent, quant à elles, pénétrer dans un plus grand nombre de pores. Les solutés sont
donc élués dans l’ordre inverse des masses moléculaires.

Figure 11: la chromatographie d’exclusion stérique

• La phase stationnaire La phase stationnaire est généralement un polymère poreux dont les pores
ont des dimensions choisies en rapport avec la taille des espèces à séparer. Dans cette technique le
matériel servant de base est un gel.

La filtration de gel est une chromatographie d’exclusion sur un support hydrophile qui est utilisé pour
séparer des espèces polaires. Tandis que la perméation de gel est une chromatographie d’exclusion
sur un support qui est utilisée pour séparer des espèces non polaires. On distingue les gels mous,
semi-rigides et rigides :

- Les gels mous : structures faiblement réticulées et capables d’absorber dans leurs pores de grandes
quantités de solvant. Ils gonflent de plusieurs fois leurs volumes secs et leurs porosités augmentent
en proportion du volume du solvant absorbé. Ils s’utilisent principalement avec des solutions
aqueuses (chromatographie de filtration sur gel). Il s'agit le plus souvent de dextrane rendu insoluble
dans l'eau par réaction à

l'épichlorhydrine. Il existe des gels dont le polymère est du polyacrylamide et des gels mixtes
composés d'acrylamide et de dextranes.

- Les gels semi rigides : ils sont produits par polymérisation, ce sont des dérivés du vinylbenzène en
présence d’agent réticulant. On les utilise principalement avec des solvants organiques : gels de
polystyrène, ce type de gel possède des propriétés remarquables et ne gonfle pratiquement pas, il
peut être utilisé dans la plupart des solvants sauf : l'eau, les alcools, l'acétone, l'acide formique. Il est
utilisable en haute pression.

- Les gels rigides : Ils sont constitués par des silices poreuses ou des verres poreux. Ils ont
évidemment des sites d’adsorption (groupements hydroxyles) qui peuvent retarder excessivement
les espèces polaires. On modifie alors chimiquement la silice.

• La phase mobile

En chromatographie d’exclusion sur gel, le choix de la phase mobile ne s’effectue plus selon la
polarité du solvant comme dans le cas de la chromatographie de partage et celui de la
chromatographie d’adsorption.

En effet, la phase mobile doit surtout être capable de dissoudre l’échantillon et être suffisamment
semblable à la phase stationnaire afin de la mouiller et d’éviter l’adsorption. Lorsque le gel est mou,
le solvant doit aussi le gonfler puisque la taille des pores de ce gel dépend de la quantité de solvant
imbibée. Dans le cas idéal, la phase mobile, le solvant piégé et le gel doivent interagir de manière
identique avec les molécules du soluté, ainsi, on peut être sûr que son déplacement dans les pores
ne se fait que par diffusion. Il faut aussi que le solvant soit compatible avec l’appareillage et le
détecteur si l’on en fait usage directement.

4) La chromatographie sur échangeurs d’ions

• Principe

La chromatographie à échange d’ions (ou chromatographie à ions ou chromatographie échangeuse

d'ions) est un type de chromatographie en phase liquide permettant d'isoler une substance chargée
électriquement d'un mélange de molécules chargées (liquide). La séparation des composés est
assurée dans tout système chromatographique par la phase stationnaire qui, dans le cas de la
chromatographie ionique (CI) est une résine échangeuses d’ions. Cette phase stationnaire est un
support solide comportant des groupes fonctionnels ionisés chargés soit positivement (pour séparer
les anions) soit négativement (pour séparer les cations). L’éluant emporte les anions ou les cations à
séparer. Selon que l’interaction

l'épichlorhydrine. Il existe des gels dont le polymère est du polyacrylamide et des gels mixtes
composés d'acrylamide et de dextranes. - Les gels semi rigides : ils sont produits par polymérisation,
ce sont des dérivés du vinylbenzène en présence d’agent réticulant. On les utilise principalement
avec des solvants organiques : gels de polystyrène, ce type de gel possède des propriétés
remarquables et ne gonfle pratiquement pas, il peut être utilisé dans la plupart des solvants sauf :
l'eau, les alcools, l'acétone, l'acide formique. Il est utilisable en haute pression. - Les gels rigides : Ils
sont constitués par des silices poreuses ou des verres poreux. Ils ont évidemment des sites
d’adsorption (groupements hydroxyles) qui peuvent retarder excessivement les espèces polaires. On
modifie alors chimiquement la silice.

• La phase mobile

En chromatographie d’exclusion sur gel, le choix de la phase mobile ne s’effectue plus selon la
polarité du solvant comme dans le cas de la chromatographie de partage et celui de la
chromatographie d’adsorption.

En effet, la phase mobile doit surtout être capable de dissoudre l’échantillon et être suffisamment
semblable à la phase stationnaire afin de la mouiller et d’éviter l’adsorption. Lorsque le gel est mou,
le solvant doit aussi le gonfler puisque la taille des pores de ce gel dépend de la quantité de solvant
imbibée. Dans le cas idéal, la phase mobile, le solvant piégé et le gel doivent interagir de manière
identique avec les molécules du soluté, ainsi, on peut être sûr que son déplacement dans les pores
ne se fait que par diffusion. Il faut aussi que le solvant soit compatible avec l’appareillage et le
détecteur si l’on en fait usage directement.

4) La chromatographie sur échangeurs d’ions

• Principe La chromatographie à échange d’ions (ou chromatographie à ions ou chromatographie

échangeuse d'ions) est un type de chromatographie en phase liquide permettant d'isoler une
substance chargée électriquement d'un mélange de molécules chargées (liquide).

La séparation des composés est assurée dans tout système chromatographique par la phase
stationnaire qui, dans le cas de la chromatographie ionique (CI) est une résine échangeuses d’ions.
Cette phase stationnaire est un support solide comportant des groupes fonctionnels ionisés chargés
soit positivement (pour séparer les anions) soit négativement (pour séparer les cations).

L’éluant emporte les anions ou les cations à séparer. Selon que l’interaction
Figure 12 : échangeurs cationiques

- Les échangeurs d'anions portent des groupements chargés positivement (+).Le groupement positif,
habituellement une amine ou un ammonium est lié à la résine

(souvent un polymère organique) de façon covalente. L’échange se fait suivant l’équation Résine-
G+ / OH- + anion- Résine-G+ /anion- + OH
Figure 13 : échangeurs anioniques

Les groupements fonctionnels cationiques et anioniques sont classés selon leur aptitude à l’ionisation
:

- Les groupements sont dit forts car leur capacité d’échange est constante et indépendante du pH (ex
: résine cationique SO3 - acide sulfonique, résine anionique N+ (CH3)3 ammonium quaternaire)

- les groupements faibles ne sont pas ionisés à un certain pH (ex : résine cationique COOgroupement
carboxylique, résine anionique NH 3 + amine primaire)

• Support Les supports peuvent être de deux types : minéraux comme la silice et organiques comme
la résine polystyrénique, cellulose, dextrane Les phases stationnaires les plus connues sont obtenues
par copolymérisation styrène/divinylbenzène afin d’obtenir des phases réticulées, résistantes à
l’écrasement. Elles se présentent sous forme de particules sphériques d’un diamètre de quelques
micromètres. Ces particules sont ensuite greffées pour en faire des polyanions ou polycations.

• La phase mobile

La plupart des séparations utilisant les résines échangeuses d’ions s’effectuent avec une solution
aqueuse en raison des propriétés de solubilisation et d’ionisation de l’eau.

Toutefois, il peut être nécessaire d’utiliser des mélanges de solvants polaires (méthanol-eau) afin
d’optimiser une élution ou faciliter la solubilité de certain solutés.
L’élution est assurée par déplacement des équilibres : soit par la présence d’un ion ayant plus
d’affinité pour la résine, soit par l’élévation des concentrations en ions H+ ou OH -, soit, dans le cas
des échangeurs faibles, par modification du pH qui agit ainsi sur l’ionisation aussi bien des
groupements échangeables de la résine que de ceux des solutés.

III.1.Application de la HPLC
La chromatographie en phase liquide à haut performance (HPLC) est une technique d'analyse
largement utilisée dans de nombreux domaines, notamment en chimie, en biologie, en
pharmacologie, en alimentation et en environnement. Voici quelques-unes des applications les plus
courantes de la HPLC :

1. Analyse des composés pharmaceutiques : la HPLC est largement utilisée dans l'industrie
pharmaceutique pour analyser la pureté des médicaments, détecter les impuretés et contrôler la
qualité des produits pharmaceutiques.

2. Analyse des composés alimentaires : la HPLC est utilisée pour détecter et quantifier les composés
présents dans les aliments, tels que les vitamines, les antioxydants, les additifs alimentaires et les
contaminants.

3. Analyse des produits chimiques : la HPLC est utilisée pour l'analyse de divers produits chimiques,
tels que les pesticides, les herbicides, les solvants, les métaux lourds et les polluants
environnementaux.

4. Analyse des biomolécules : la HPLC est largement utilisée pour l'analyse des biomolécules telles
que les acides aminés, les protéines, les peptides, les acides nucléiques et les sucres.

5. Contrôle de la qualité : la HPLC est utilisée pour le contrôle de la qualité des produits industriels
tels que les produits pharmaceutiques, les produits chimiques, les aliments et les boissons.

6. Recherche en sciences de la vie : la HPLC est largement utilisée en biologie et en biochimie pour
l'analyse des molécules biologiques et des processus cellulaires.

En résumé, la chromatographie en phase liquide à haut performance est une technique polyvalente
et puissante qui trouve de nombreuses applications dans divers domaines de la recherche et de
l'industrie.
III.1.2CONCLUSION
La chromatographie HPLC est une technique analytique puissante et largement utilisée pour séparer,
identifier et quantifier les composants d'un mélange complexe. Grâce à sa haute sensibilité, sa
rapidité et sa précision, la chromatographie HPLC est essentielle dans de nombreux domaines tels
que la chimie, la pharmacologie, la biologie et l'industrie alimentaire. En permettant une séparation
efficace des composants, cette technique fournit des données fiables et précises pour des
applications variées. Son évolutivité, sa polyvalence et sa capacité à traiter des échantillons de petite
taille en font un outil incontournable pour les laboratoires de recherche et d'analyse. En somme, la
chromatographie HPLC est un atout majeur pour les scientifiques et les professionnels cherchant à
caractériser et comprendre les compositions complexes des échantillons.

La chromatographie HPLC, ou chromatographie liquide à haute performance, est une technique

analytique puissante utilisée pour séparer, identifier et quantifier les composants d'un mélange.
Grâce à sa haute résolution et à sa sensibilité, la HPLC est largement utilisée dans de nombreux
domaines tels que la chimie, la pharmacologie, la biologie et l'industrie alimentaire. La HPLC est un
outil essentiel pour l'analyse précise des composés chimiques dans divers échantillons.
Notes et références

« Gaston Charlot (1904-1994) et le développement de la chimie analytique moderne - L'Actualité

Chimique [archive] », sur www.lactualitechimique.org (consulté le 1er février 2019)

Andrew Hunt, La chimie de A à Z - 1200 définitions, Dunod, 2006.

Holthoff, E. L., Stratis-Cullum, D. N. et Hankus, M. E. (2011), A nanosensor for TNT detection based on
molecularly imprinted polymers and surface enhanced Raman scattering, Sensors, 11(3), 2700-2714.

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Microscopic fountain pen to be used as a chemical sensor [archive], 15 janvier 2014 (consulté le 25
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