TP de biochimie

structurale
Be biologie
Sommaire

SV221 - TP N°1 - Glucides ........................................................................................................................ 3

Dosage de l’amidon total de l’amylose et de l’amylopectine ............................................................. 3
SV221 - TP N°2 - Glucides ........................................................................................................................ 8
Pouvoir Réducteur des Glucides.......................................................................................................... 8
SV221 - TP N°3 - Caractérisation des Lipides......................................................................................... 11
Détermination de l’Indice de Saponification (IS) .............................................................................. 11
SV221 - TP N°4 - Caractérisation des Lipides......................................................................................... 13
Détermination de l’indice d’iode (II) ................................................................................................. 13

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SV221 - TP N°1 - Glucides

Dosage de l’amidon total de l’amylose et de l’amylopectine

Généralités

L’amidon est un polysaccharide de réserve chez les végétaux. C’est une macromolécule constituée,
en pourcentage variable, de deux polymères du D-Glucose : L'amylose et l'amylopectine.
L’amylose est constitué essentiellement d’unités de D-glucoses unies entre elles par des liaisons de
type α(1→4). L’amylopectine consiste essentiellement en unités α(1→4)-D-glucosidiques linéaires
mais branchée, par des liaisons de type α(1→6)-D-glucosidiques à tous les 24-30 unités de glucose
(Figure 1). L’amylopectine contient plus de 106 résidus de D-glucose, la rendant ainsi la
macromolécule biologique la plus volumineuse qui existe. La structure primaire de l’amylopectine est
semblable à celle du glycogène (polysaccharide de réserve chez les animaux) mais le nombre de
résidus de D-glucose dans les ramifications est de l’ordre de 8 à 12 dans le glycogène. En d’autres
termes le glycogène est plus ramifié que l’amylopectine.

Figure 1 - Structures de l’amylose et de l’amylopectine

Principe
L’iode (I2) interagit avec l’amylose et l’amylopectine pour donner une coloration respectivement
bleue et brune. Les spectres des complexes I2-amylose et I2-amylopectine sont différents. De ce fait
ces complexes ont des longueurs d’ondes maximales pour l’amylose (λmax= 630 nm) et l’amylopectine
(λmax = 548 nm) qui sont différentes. En plus l’amylose absorbe dans le proche visible tandis que
l’amylopectine n’y absorbe pas (Figure 2). On peut donc utiliser cette différence spectrale pour doser
simultanément l’amidon total, l’amylose et l’amylopectine dans un matériel biologique. Dans cette

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manipulation on considérera que l’absorbance à 580 nm est liée liée à la fois à l’amylose et à
l’amylopectine, par contre l’absorbance à 720 nm est liée essentiellement à l’amylose.

Figure 2 - Absorbances de l’amidon, de l’amylose et de l’amylopectine (Jarvis, 1993)

Matériel et réactifs
− Spectrophotomètre UV-Vis Vis
− Centrifugeuse
− Bain-marie à 100°C
− Plaques chauffantes
− Tubes à centrifuger
− Tubes à essais 20 ml gradués
− Fioles jaugées de classe A, capacité 100 ml
− Becher 250 ml
− Entonnoir
− Micropipettes
− Pipettes graduées
− Papier pH
− Eau distillée
− Réactif de l’iode : 0,2g de I2 dissous dans 100 ml de KI à 2% (m/v) dans HCl 0,1N
− Solution 1N de KOH
− Solution 1N de HCl

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Mode opératoire
Etalonnage :
Dans un bécher 250 ml, disperser 0,5g d’amidon dans 20 ml d’eau distillée. Y ajouter 80 ml d’eau
distillée bouillante. Agiter légèrement le mélange et continuer l’ébullition pendant 5 min sur une
plaque chauffante pour obtenir une solution d’amidon limpide. Refroidir le mélange, le transférer
dans une fiole jaugée 100 ml et le compléter au trait de jauge avec l’eau distillée. Ceci constitue une
solution mère d’amidon à 5 mg/ml. La courbe d’étalonnage est établie selon le tableau ci-
dessous (faire 3 mesures de l’absorbance pour chaque tube) :

N° Tube 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Solution mère
d’amidon 5 mg 0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 0,08 0,09 0,1
/ml (ml)
H2O (ml) 4,90 4,89 4,88 4,87 4,86 4,85 4,84 4,83 4,82 4,81 4,80
Réactif I2/KI (ml) 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1
Calculer la
concentration
d’amidon en
mg/ml
Incubation pendant 10 minutes

DO 1 à 580 nm
(3 mesures)

DO 2 à 720 nm
(3 mesures)

Moyenne DO 1
Moyenne DO 2

Préparation de l’échantillon à analyser :

Prendre 0.1 g de farine de matériel biologique bien broyé (Ø= 0.5 mm) et y ajouter 5 ml de 1 N KOH.
Bien homogénéiser la solution à la température ambiante et la neutraliser ensuite avec 5 ml de 1 N
HCl. Bien s’assurer que la solution est neutre à l’aide d’un papier pH. Préparer en parallèle un tube
blanc réactifs contenant les mêmes solutions que les tubes échantillons, mais sans farine et qui
subira les mêmes étapes. Mettre ensuite le mélange en ébullition au bain-marie pendant 15 min.
Réajuster le volume du mélange à 10 ml. Centrifuger le mélange et prendre le surnageant. Filtrer au
besoin le surnageant et l’utiliser pour le dosage de l’amidon.

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 Dosage de l’amidon dans l’échantillon:
Préparer les tubes « blanc » et « échantillon » conformément au tableau ci-dessous (faire 3 mesures
de l’absorbance pour chaque tube) :

Réactif / Echantillon BLANC Echantillon : Echantillon :

Echantillon / Blanc (ml) 0,05 0,05 0,05
H2O (ml) 4,85 4,85 4,85
Réactif I2/KI (ml) 0,1 0,1 0,1
Incubation pendant 10 minutes
Moyenne DO (580 nm)
Moyenne DO (720 nm)

Résultats :
A l’aide des mesures réalisées, calculer les proportions d’amidon total, d’amylose et d’amylopectine
dans les échantillons. Donner une conclusion.

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SV221 - TP N°2 - Glucides

Pouvoir Réducteur des Glucides

Généralités

Les glucides ou hydrates de carbone Cn(H2O)n, sont des composés comportant de nombreux
groupements hydroxyles (-OH) responsables de leur caractère très hydrophile. La présence de
groupement carbonyle (-C = O), aldéhyde ou cétonique leur confère un caractère réducteur.

Dans les formes cycliques des oses, ce sont les fonctions hémicétalique et hémiacétalique qui
confèrent le caractère réducteur à ces glucides.

Principe

En milieu alcalin et à chaud, les oses et dans certaines conditions les polyholosides peuvent s’oxyder
et en même temps réduire des substances telles que les sels métalliques. On parle alors de pouvoir
réducteur des sucres. Cette propriété, qui est due à la présence de fonction hémiacétalique libre,
peut être mise en évidence par exemple grâce au réactif de Fehling qui est une solution alcaline
d’ions cuivreux de coloration bleue (les ions Cu+2 sont maintenus en solutions grâce au double

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tartrate de Na+ et K+). Si la réaction est positive, on obtient un précipité rouge brique dont la quantité
est proportionnelle à celle du sucre réducteur présent. La réaction en milieu basique se passe selon
le schéma suivant :

Cétohexose
Si le sucre n’est pas réducteur,, la coloration reste bleue.

Matériel et réactifs
− Bain-marie bouillant
− Agitateur VORTEX
− Tubes à essais
− Pipettes
− propipettes
− papier indicateur de pH
− Solution de soude à 10%
− Acide sulfurique concentré
− Solutions de glucose, fructose, ribose, saccharose et maltose à 1%
− Liqueur de Fehling : La liqueur de Fehling est obtenue en mélangeant deux solutions A et B
(V:V) dont la composition est la suivante :
Solution A : 35 g CuSO4.5H2O + 5 ml H2SO4 concentré + H2O compléter à 1L.
Solution B : 150 g tartrate
te de K et
e Na + 300 ml NaOH + H2O compléter à 1L
Mode opératoire
− Préparer 6 tubes à essai : mettez dans chaque tube 1 ml de la solution A puis 1 ml de la
solution B. (A+B forment la liqueur de Fehling).
− Ajoutez au premier tube 2 ml d’une solution de glucose, au deuxième 2 ml de la solution de
ribose, au troisième 2 ml de la solution de fructose, au quatrième 2 ml de la solution de
saccharose, au cinquième 2 ml de solution de maltose et au sixième 2 ml d’eau distillée.
− Agiter pour bien mélanger le contenu des tubes
tube
− Porter les tubes à ébullition pendant 3 min

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 − Observer et noter le résultat obtenu.
Pouvoir réducteur du produit d’hydrolyse chimique du saccharose
Mode opératoire
− Mettre 5 ml de saccharose dans un tube à essai. Ajouter 3 gouttes de H2SO4 concentré (sous
la hotte). Agiter et porter à ébullition pendant 2 min. Le saccharose est ainsi hydrolysé.
− Ajouter 5 gouttes d’une solution de soude à 10% jusqu’à réaction nettement alcaline (utiliser
papier indicateur de pH).
− Réaliser alors le test suivant : prendre deux tubes et les marquer 1 et 2. Dans le tube 1
mettre 2 ml de la solution de saccharose hydrolysé. Dans le tube 2 mettre 2 ml de la solution
de saccharose non hydrolysé. Dans les deux tubes 1 et 2 ajouter 1 ml de la solution A + 1 ml
de la solution B. Agiter et porter les deux tubes au bain marie bouillant pendant 3 min.
Résultats
− Observer la coloration obtenue dans chaque tube.
− Comparer et justifier la différence des résultats obtenus avec les tubes 1, 2, 3, 4, 5 et 6 dans
la manip précédente.
− Comparer et justifier les résultats obtenus avant et après l’hydrolyse chimique du saccharose.

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SV221 - TP N°3 - Caractérisation des Lipides

Détermination de l’Indice
Indice de Saponification (IS)
Introduction
Les lipides sont en général des esters d’alcool et d’acides gras. La nature de l’alcool est variable et les
acides gras sont saturés ou insaturés, parfois substitués par de l’acide phosphorique et une base
azotée (phospholipides). Les graisses sont généralement
généralement riches en acides gras saturés et les huiles en
acides gras insaturés. Ce sont les longues chaînes paraffiniques des acides gras qui confèrent aux
lipides leur insolubilité dans l’eau et leur solubilité dans les solvants organiques.

Les lipides neutres

eutres les plus abondants sont les acylglycérols (anciennement appelés glycérides), ce
sont des substances de réserve essentiellement constituées de triacylglycérols. Les triacylglycérols
résultent de l’estérification d’un trialcool, le glycérol, par 3 acides
acides gras qui sont différents dans la
plupart des cas (triacylglycérols hétérogènes).

Principe
L’indice de saponification d’un corps gras est le poids de KOH exprimé en milligramme pour
neutraliser les acides gras provenant de l’hydrolyse de 1g de ce corps gras. A un poids déterminé de
ce corps gras, on ajoute un volume connu et en excès de solution de titrée de potasse. Il y a
saponification et les acides gras libérés se combinent avec la potasse pour donner un savon. En
dosant la quantité de potasse non combinée
co par une solution acide (dosage en retour),
retour) on déduit
celle qui a été absorbée par la matière grasse. L'indice de saponification permet de classer les huiles
en fonction de la longueur des chaînes d'acides gras qui les composent, critère lié au poids

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moléculaire (PM) des acides gras. Plus le PM est élevé plus les chaînes carbonées sont longues et
moins labiles (hydrolysables). Ceci rend compte que l’IS varie inversement avec le PM des lipides.
Matériel et réactifs
− Burette
− Ballons ou Erlenmeyers rodés
− Réfrigérant
− Dispositif de chauffage
− Beurre
− Huile d’olive
− HCl 1N
− KOH 1N
− Phénolphtaléine (1g de phénolphtaléine dans 100 ml alcool 95°)
Mode Opératoire
Préparer les montages nécessaires à la réaction de saponification comprenant une plaque
chauffante, un Erlenmeyer rodé et un réfrigérant à reflux.

Chaque binôme utilisera 3 Erlenmeyers : 1 témoin blanc (T) et 2 pour les échantillons (A et B).

− Peser les 2 Erlenmeyers rodés A et B et introduire dans chacun environ exactement 1,5 g de
l’échantillon et noter les masses (mA et mB).
− Ajouter 10 ml de la solution KOH 1N dans chacun des 3 flacons et mélanger les suspensions.
− Brancher l’Erlenmeyer au réfrigérant et faire circuler l’eau froide dans ce dernier. Chauffer
modérément pour amener la solution alcoolique à ébullition douce, poursuivre la
saponification 30 minutes en agitant fréquemment.
− Retirer le ballon et le refroidir sous un courant d’eau de robinet.
− Ajouter 5 gouttes de phénol phtaléine et doser la potasse en excès par la solution HCl 1N.

Résultats

ሺܸܶ − ܸ‫ܧ‬ሻ × ‫ܥ‬ு஼௟ × ‫ܯ‬௄ைு

‫= ܵܫ‬
݉

• IS : Indice de saponification
• VT : Volume de la solution de HCl versée au témoin en L
• VE : Volume de la solution de HCl de l'essai en L
• CHCl : concentration de la solution d'acide chlorhydrique en mol/l
• MKOH : masse molaire du KOH = 56,1 g/mol
• m : masse d'huile exactement pesée en g

Calculer les IS des matières grasses et interpréter les résultats obtenus.

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SV221 - TP N°4 - Caractérisation des Lipides

Détermination de l’indice d’iode (II)

(
Introduction
L'indice d'iode est le poids d'iode en gramme fixé par 100 grammes de corps gras. Il est constant
pour une matière grasse donnée. L’indice d’Iode est alors calculé pour connaître le degré
d'insaturation des acides gras d'un lipide et rendre compte de l'aptitude
l'aptitude du corps gras à l'oxydation.
De même, la détermination l'indice d'iode permet de maîtriser l'hydrogénation et aider à la détection
des fraudes.
Principe
Le principe est basé sur la fixation d’iode (I2) sur les doubles liaisons éthyléniques (>C=C<) d’un
d’ corps
gras insaturé. L’indice d’iode est défini comme le poids d’iode exprimé en gramme qui est fixé par
100 g du corps gras considéré.

L’indice d’iode est alors déterminé de la manière suivante : on ajoute un volume connu d’iode à un
poids déterminé de matière grasse et on dose l’excès d’iode par un dosage en retour à l’aide d’une
solution saturée de thiosulfate de sodium. On en déduit par différence la quantité d’iode fixée sur les
lipides.

Matériel et réactifs
− Burette
− 3 Erlenmeyers 250 ml munis de bouchons
− Réactifs de WIJS : 5 g I2 dans 100 ml éthanol + 5 g de HgCl2dans 100 ml éthanol ; mélanger
les deux solutions et les laisser reposer pendant 12 heures.
heures
− Ether éthylique
− Solution de KI à 25 %
− Solution
olution de thiosulfate de sodium (Na2S2O3) à 0,1 N
− Empois d’amidon à 1 % (solution d'amidon 1% préparée dans l'eau distillée chaude).
chaude)
− Huile d’olive
− Huile de maïs
Mode Opératoire
Erlen Témoin : 5 ml éther + 40 ml réactif de WIJS. Agiter.
Erlens Echantillons : 0,5 g de corps gras + 5 ml éther + 40 ml réactif de WIJS. Agiter.
Boucher les erlens et les mettre à l’obscurité pendant 1h30 min en agitant toutes les 15
minutes.
Ajouter 6 ml de solution d’iodure de potassium dans les erlens et agiter.
Titrer par le thiosulfate 0,1 N l’iode présent dans les erlens jusqu’à l’obtention d’une
coloration jaune claire.

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 Ajouter quelques gouttes d’empois d’amidon comme agent coloré et titrer la solution bleue
obtenue jusqu’au virage à l’incolore.

Résultats

Le calcul de l’indice d’iode se fait de la manière suivante :

‫ܥ‬ሺܵଶ ܱଷଶି ሻ × ሺ்ܸ − ܸா ሻ × ‫ܯܯ‬ሺ‫ܫ‬ଶ ሻ × 100

‫ܫܫ‬ሺ݃ሻ =
2×݉

Où :

• VT : Volume de thiosulfate nécessaire pour le titrage du témoin en L.

• VE : Volume de thiosulfate nécessaire pour le titrage de l’essai en L.
• ‫ܥ‬ሺܵଶ ܱଷଶି ሻ : concentration de la solution de thiosulfate en mol/L.
• ‫ܯܯ‬ሺ‫ܫ‬ଶ ሻ : Masse molaire du di-iode (253,8 g/mol)
• m : masse de l’échantillon de matière grasse exactement pesée en g

Calculer les II des matières grasses et interpréter les résultats obtenus.

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