Rapport PETase MHETase

Kikelomo Garber
Cindy Libero
Ophélie Taddio
Technique de laboratoire - Spécialisation en biotechnologies
Rapport de laboratoire de la PETase-MHETase
Travail présenté à
Catherine Hallé
dans le cadre du cours
210-614-HU
Génie Génétique
Groupe 01
Cégep de l’Outaouais,
Campus Gabrielle-Roy
21 mars 2024
But
L’expérience se présentait sur plusieurs semaines et comportait plusieurs objectifs, afin
d’atteindre le but final qui était de permettre l’expression de l’ADNc du gène PETase dans les
bactéries E. Coli induites et en faire la comparaison avec des bactéries non induites.
Le but global est de réaliser une transformation bactérienne dans la souche E. Coli BL21
(DE3), afin qu’elle puisse produire l’enzyme de la PETase et de la MHETase.
Le tout a d'abord été fait par purification de l’ADN plasmidique (PCJ 191) de bactéries
procurées sur AddGene. Ces plasmides ont été transformés dans des cellules E.coli BL21 (DE3)
chimiocompétentes à l’aide de la méthode de heat-shock. À partir des cellules transformées, une
préparation de cellules induites et non induites a été faite, afin d’observer la différence de
l’expression du gène sur gel d’électrophorèse.
Résultats
Transformation par Heat-choc dans les C41 DE3
Tableau 1 - Dosage de l’ADN plasmidique pCJ 191 purifié au Nanodrop
Échantillon Concentration A260/280 A260/230
(μg/μL)
ADN purifié 0.055 1.91 2.10

pCJ-191
À la suite des mini préparations, la concentration d’ADN plasmidique du pCJ 191 est de
0,055ug/uL. Les rapports (A260/280) et (A230/260) sont des indicateurs de la pureté et de la
qualité de produit d’ADN final. Si la valeur de (A260/280) est égale à 1,8, il n’y a pas une
contamination de protéines. Si le rapport (A260/230) est supérieur à 1,8 , l’échantillon ne
contient pas de contaminant à ARN.

Tableau 2 - Détermination de la pureté de l’ARN des clones induits vs. non-induit au
Nanodrop
Échantillon Concentration A260/280 A260/230
(μg/μL)
Induit 0.004 2.01 0.29
Non-induit 0.047 2.08 0.46
La concentration de l’ARN, après induction, obtenue au NanoDrop est de 0,004 ug/uL pour le
induit. De plus, l’indicateur de contamination aux protéines (A260/230) est de 0,29, tandis que
celui du rapport (A260/280) est de 2,01. Pour le non-induit, sa concentration mesurée est de
0,047ug/uL. Le rapport (A260/230) est de 0,46 et l’autre (A260/280) est de 2,08.
Tableau 3 - Intégrité de l’ARN d’E.coli C41 obtenu au fluorimètre Qubit 4

Échantillon Qualité et intégrité de l’ARN
ARN non-induit 0% ARN de petite taille

100% ARN de grande taille
ARN induit Erreur de mesure

(Quantité inférieure)
Figure 1 - Migration des extractions d’ARN induit et non induits permettant de déterminer leur
niveau d’intégrité
Légende:
Puit 1 : Échelle de poids moléculaire Puit 5 : ARN Non Induit C&E (Charlotte et Élena)
(RNA Millennium Markers) Puit 6 : ARN Induit C&G (Gaëlle et Cédric)
Puit 2 : ARN Induit M&M (Mélia et Maryse) Puit 7 : ARN Induit KCO (Kikelomo, Cindy,
Puit 3 : ARN Non Induit M&M (Mélia et Maryse) Ophélie)
Puit 4 : ARN Induit C&E (Charlotte et Élena) Puit 8 : ARN Non Induit KCO (Kikelomo, Cindy,
Ophélie)
Échelle de poids moléculaire utilisé: RNA Millennium Markers, n’a pas bien migrée dans le gel, voire ANNEXE I
pour la taille des bandes dans l’échelle. 5 μL de loading dye a été ajouté à des aliquots de 20μL des échantillons
induits et non induits.
Figure 2 - Plan de migration de la PETase, MHETase et de la variation de RT
Légende:
Puit 1 : Contrôle positif Puit 5 : Échelle de poids moléculaire
Puit 2 : Échantillon ARN non-induit Puit 6 : RT positif
Puit 3 : Échantillon ARN induit Puit 7 : RT négatif
Puit 4 : Contrôle négatif Puit 8 : Vide
Une échelle de poids moléculaire de 1 Kb a été utilisée pour la comparaison de la migration des échantillons.
Chaque échantillons contenus dans les puits sont colorés par 5 μL de loading dye.
★ Les résultats de la transformation bactérienne n’ont pas été pris en photo.

Discussion
Tout d’abord, des bactéries ont été achetées sur AddGene afin d’extraire leur ADNp (pCJ
191). Durant les mini-preps, tous les contaminants comme les protéines cellulaires, l‘ARN, des
métabolites et l’ADN génomique sont éliminés. Pour s’assurer que l’ADN plasmidique est de
bonne qualité pour les étapes subséquentes, il a été dosé au nanodrop à 260 nm. La concentration
du produit purifié est de 0,055 ug/uL. En ce qui concerne sa pureté, le rapport A260/280 indique
que l’ADNp est légèrement contaminé par les protéines non précipitées lors de l'extraction car sa
valeur (1,91) est supérieure à 1,8. Néanmoins, l’échantillon ne contient pas de contaminations à
l’ARN, car sa valeur (2,10) est supérieure à 2.
Lors de la transformation des cellules chimio compétentes par choc thermique de la
bactérie C41 (DE3), les PCJ 191 extraits ont été introduits dans ces bactéries. Les cellules
bactériennes transformées ont été mises en culture à différentes concentrations, soit dans une
dilution 1:10 et 1:100, dans 3 pétris distincts contenant le milieu de croissance d’agar sélectif LB
et l'antibiotique ampicilline, pour lequel la résistance est portée par le plasmide recombiné.
Toutefois, les résultats de la transformation n’ont pas été une réussite, car une seule colonie a
poussé sur le pétri contenant l’ADNp de pCJ 191 dilué 1:10. Ainsi, quelques-unes des cellules
hôtes C41(DE3) ont réussi à intégrer le plasmide recombinant contenant le gène d'intérêt, celui
de la PETase. L’explication plausible ayant mené à la non-réussite des transformations serait la
perte de la capacité des bactéries à être compétentes avec le temps, car la souche utilisée a été
conservée durant plusieurs mois dans le congélateur à -20°c.
Pour permettre à la bactérie C41 de produire l’enzyme de la PETase, l’induction a été
faite avec l’unique colonie recombinante ayant poussée lors des transformations, puis de l’ajout
de L’IPTG au milieu de croissance. Les bactéries transformées non induites ont également été
faites afin de servir de contrôle négatif. À la suite de l’extraction de l’ARN induit et non induit
via le kit QIAwave, il a été dosé au nanodrop. La concentration de l’ARN induit et non induit
obtenue au NanoDrop à la suite de son extraction est de (0,004 et 0,047) ug/uL respectivement.
Le rapport A230/260 indique que l’ARN n’a pas été contaminé par les protéines car la valeur
(0,29 et 0,46) est inférieure à 0,5. Pour la contamination aux protéines, l’ARN induit et
non-induit est également pur, car la valeur (2,01 et 2,08) est supérieure à 1,8. Toutefois, la faible
quantité des ARN peut être expliquée d’une part par l’inefficacité de la transformation à produire
des clones, ce qui a influencé à la baisse la production de la PETase lors de l’induction. D’autres
part, elle peut également être causée par une mauvaise extraction des plasmides. Pour vérifier
que la structure de l’ARN ait été préservée lors de l’extraction, son intégrité a été mesurée au
fluorimètre Qubit 4. Il en revient que l’ARN non-induit est intègre à 100% d’ARN de grandes
tailles, mais l’intégrité de l’ARN induit n’a pas pu être détectée à cause de sa faible
concentration.
Les résultats obtenus à la suite de la rétrotranscription sont plus ou moins conformes à
ceux attendus. En effet, la rétrotranscription est un processus qui permet de convertir de l’ARN
en ADN complémentaire et de l'amplifier, afin de prévenir sa dégradation et de pouvoir l’étudier.
La présence des bandes à environ 174pb dans les puits 1 (échantillon induit), 2 (échantillon
non-induit) et 3 (contrôle positif) confirme la présence d’ADNc à la suite de la réaction de PCR.
La taille de la bande confirme que le gène d'intérêt, celui de la PETase/MHETase, est exprimé.
Comme les amorces utilisées sont spécifiques à cette région, seule le gène d'intérêt est amplifié.
Le contrôle positif pour le gène (puit 1) provient du même échantillon d’ADN
plasmidique utilisé lors de la transformation et possède le gène permettant l’expression de la
PETase. La bande présente confirme qu’il n’y a pas eu de problème au niveau des amorces ou
tout autre composé du PCR et que la région amplifiée est la bonne.
Dans les puits 2 et 3, l’échantillon non induit et induit ont respectivement une bande de la
même taille, soit environ 174 pb. Ce résultat est celui attendu pour l’échantillon induit. En effet
l’ajout de l’IPTG est ce qui provoque l’expression génique du composé d'intérêt. Sans l’ajout de
celui-ci, aucune expression ne devrait être observée. Cela n’a pas été le cas lors de cette
expérience, puisqu’il y a une bande présente dans l’échantillon non induit. Théoriquement,
aucune bande ne devrait être visible sur le gel. Il est donc possible qu’il y ait eu une
contamination d’ADN plasmidique lors la purification de l’ARN. Ceci reste à être confirmé, un
PCR, ainsi qu’une analyse au fluorimètre pourront être fait pour les échantillons d’ARN purifié
afin de voir si une contamination a eu lieu à ce niveau.
Le contrôle négatif dans le puit 4 permet d’affirmer qu’aucune contamination n’a eu lieu
lors de la préparation des échantillons pour la RT-PCR. L'absence de bande confirme ainsi cela.
La traînée pâle à la fin des puits 1 à 4 sont les déchets du PCR (amorces, dntp, etc.)
En ce qui concerne le RT contrôle positif (puit 6), cet échantillon permet de savoir si
l’étape de la RT-PCR a fonctionné. Les amorces utilisées pour celui-ci sont différentes de celles
utilisées pour les quatres premiers. Elles amplifient un segment dont la taille est de 500pb. Elle
s’agit donc de la bande présente sur le gel, confirmant que la rétrotranscription a fonctionné. Son
contrôle négatif (puit 7) permet de savoir si une contamination a eu lieu lors de la préparation de
la rétrotranscription. Puisqu’il n’y a pas de bande présente, aucune contamination a été détectée.
Conclusion
En conclusion, le but de cette expérience était de réaliser une transformation de la souche
d’E. coli BL21 (DE3), afin qu’elle puisse exprimer le gène de la PETase/MHETase. Le choc
thermique était la méthode utilisée pour effectuer la transformation. Seule une colonie a été
obtenue à la suite du criblage, mais cela était suffisant pour faire les deux bouillons de culture.
Une quantité d’IPTG a été ajoutée dans un des ces bouillons afin de faire une induction et l’ARN
extrait des deux milieux (induit et non induit) a été converti en ADNc à l’aide de la RT-PCR.
Autre que la présence de l’expression du gène dans l’échantillon non induits, les résultats
obtenus à la suite de cette expérience sont conformes à ceux attendus. Il est donc possible de dire
que l’objectif de cette expérience a été atteint.
Afin d’en arriver à sa fin, il serait intéressant d’étudier l’activité enzymatique de la
PETase/MHETase extrait de ces bactéries et d’observer s’il dérade efficacement le plastique.
ANNEXE I
Échelle de poids moléculaire d’ARN

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ADN purifié 0.055 1.91 2.10

0,055ug/uL. Les rapports (A260/280) et (A230/260) sont des indicateurs de la pureté et de la

contamination de protéines. Si le rapport (A260/230) est supérieur à 1,8 , l’échantillon ne

contient pas de contaminant à ARN.

Induit 0.004 2.01 0.29

Non-induit 0.047 2.08 0.46

0,047ug/uL. Le rapport (A260/230) est de 0,46 et l’autre (A260/280) est de 2,08.

Tableau 3 - Intégrité de l’ARN d’E.coli C41 obtenu au fluorimètre Qubit 4

ARN non-induit 0% ARN de petite taille

ARN induit Erreur de mesure

★ Les résultats de la transformation bactérienne n’ont pas été pris en photo.

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