Faculty of Science

Cadi Ayyad University and Technology

Master:
Production et valorisation des substances
naturelles et des bio-polymères
ChemBioNat.
M11: Processus d’extraction, d’isolement et
de purification
Module en sciences et outils de recherche-développement

Responsable Pr. AMJOUD M’barek 1

 CONTENU:

Extraction, isolement et purification (1/4) Pr. R. JALAL

 Méthodes chromatographiques (1/2 module) Pr. M. AMJOUD
 Assurance -Qualité,… (1/4) Pr. A. ABOUDIA

OBJECTIFS:
• Acquérir les notions de base à la fois théoriques et pratiques de la chromatographie;
• Etrecapable de choisir la méthode d’analyse chromatographique appropriée pour
répondre à une demande;
• Connaître les principaux paramètres qui gouvernent la qualité de l’analyse ou de la
séparation chromatographique;
• Mise en œuvre raisonnée d’une méthode de séparation pour l’optimisation de
l’analyse chromatographique.

2
 ½ Module: METHODES CHROMATOGRAPHIQUES
Chap I - CHROMATOGRAPHIE: GÉNÉRALITÉS (RAPPELS)

Chap II - GRANDEURS FONDAMENTALES

Chap III - CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE (CPG) (Appareillage)

Chap IV - CHROMATOGRAPHIE EN PHASE LIQUIDE HAUTE PERFORMANCE

HPLC (Appareillage)

Chap V - METHODOLOGIE DE L’ANALYSE ET OPTIMISATION

CHROMATOGRAPHIQUE

Chap VI - ANALYSE QUALITATIVE ET IDENTIFICATION

Chap VII - ANALYSE QUANITATIVE

Chap VIII - COUPLAGES CHROMATOGRAPHIES-

CHROMATOGRAPHIES-SPECTOMETROSCOPIES

Chap IX-
IX- RAPPORTS BIBLIOGRAPHIQUES ET EXPOSES
3
 Sources Bibliographiques

Analyses chimiques, Méthodes et techniques instrumentales modernes, F.
ROUESSAC et A. ROUESSAC, édition 4 Dunod Paris 1998

Manuel pratique de chromatographie en phase gazeuse,
Jean TRANCHANT , édition Masson Paris, New York, 1982

Manuel de chromatographie en phase liquide R. Rosset, M. Caude et A. JARDY
édition Masson Paris Milan Barcelone

Méthodes chromatographiques, Introduction, Marcel CAUDE et Alain JARDY
Techniques de l’Ingénieur PE 1 445

Chromatographie en phase liquide Appareillage et applications
Marcel CAUDE et Alain JARDY Techniques de l’Ingénieur PE 1 456

Chromatographie par perméation de gel, Chromatographie d’exclusion stérique
James LESEC Techniques de l’Ingénieur PE 1 465

Chromatographie en phase gazeuse Jean TRANCHANT
Techniques de l’Ingénieur, PE 1 485

Échange d’ions Principes de base François de DARDEL Techniques de
l’Ingénieur J 2 783

Couplages chromatographiques avec la spectrométrie de masse
Frédéric de MAACK et Michel SABLIER Techniques de l’Ingénieur PE 2 614

Sites web: http://scgc.epfl.ch/cours_chimie.htm (école polytechnique fédérale de
Lausanne) http://www.123bio.net/cours/chromato/introchromato.html
4

…….
0- HISTORIQUE DE LA CHROMATOGRAPHIE

-En 1906 : séparation des pigments végétaux colorés sur une colonne remplie de
CaCO3 pulvérulent par le chimiste russe Tswett. Les pigments étaient entraînés
avec de l'éther de pétrole (mélange d’alcanes). Il a observé sur la colonne la
formation de bandes de couleurs différentes (vert, orange, jaune..).
La chromatographie: écriture des couleurs.
-En 1930: Edgar Lederer a purifié par la méthode de Tswett la lutéine du jaune
d’œuf. (lutéine : caroténoïde utilisé par le corps comme antioxydant,…)
-Vers 1940: Martin et Synge développèrent la pratique et la théorie de la
chromatographie, ils obtiennent le prix Nobel en 1952
-En 1952: mise au point de la Chromatographie en Phase Gazeuse (GC).
-En 1968: mise au point de la Chromatographie Liquide Haute Performance
HPLC.
- En 1979: première séparation chirale par HPLC.

5
Schéma simplifié d'une chromatographie liquide

Schéma simplifié de la chromatographie

6
 1. Chromatographie: aspects généraux:
1.1.Définitions:

La chromatographie est une méthode physique de séparation basée sur les

différences d'affinités des substances à analyser ou à séparer à l'égard de
deux phases, l'une stationnaire ou fixe, l'autre mobile.

Selon la technique chromatographique mise en jeu, la séparation des

composants entraînés par la phase mobile, résulte soit de leur:
* adsorption et de leur désorption successives sur la phase
stationnaire,
* solubilité différente dans chaque phase.
On définit un coefficient de partition Kp:
masse de soluté dans la phase stationnaire par unité de volume
Kp =
masse de soluté dans la phase mobile par unité de volume
On peut classer les méthodes chromatographiques d'après la nature des
phases utilisées ou celle des phénomènes mis en oeuvre dans la séparation. 7
 1-2 Nature des phases:
1-2-1 Phase stationnaire:

La phase fixe peut être solide ou liquide.

Solides: silice ou alumine traitées, permettent la séparation des composants

des mélanges grâce à leurs propriétés adsorbantes.
Ils peuvent être employés comme remplissage d'une colonne ou étalés en
couche mince sur une plaque de verre, d'aluminium ou sur une feuille de
matière plastique (chromatographie sur couche mince CCM)

Liquides: liquide imprégnant un support solide ou une chaîne carbonée fixée

sur un support (phase greffée). Ainsi en chromatographie sur papier, la phase
fixe est formée par l'eau que les molécules de cellulose du papier adsorbent,
alors qu'en chromatographie en phase gazeuse, elle est constituée d'un liquide
peu volatil et thermiquement stable imprégnant un granulé poreux.
8
 1-2-2 Phase mobile:
La phase mobile est:
♧ soit un gaz (gaz vecteur ou gaz porteur) (ex: chromatographie en
phase gazeuse CPG ou GC)
♧ soit un liquide (ex: chromatographie sur papier, couche mince ou
colonne HPLC, GPC,…): la phase mobile est appelée éluant.
1-2-3 Nature des phénomènes:
Le mode de chromatographie réfère au mécanisme par lequel les solutés sont
retenus au niveau de la phase stationnaire.
On distingue plusieurs types de phénomènes:
♤ chromatographie d'adsorption
♤ chromatographie de partage
♤ chromatographie ionique
♤ chromatographie d'exclusion
♤ chromatographie de paires d'ions
♤ chromatographie d'affinité
♤ chromatographie adaptée à la séparation d'énantiomères 9
il est possible d'exploiter plus d'un mode pour séparer les mêmes mélanges de
composés.
Exemple: les acides aminés peuvent être séparés soit par échange ionique, soit
par chromatographie en phase inversée

Mode de chromatographie Principe de rétention

Adsorption Polarité
Partage Solubilité
Échange ionique Charge
Affinité Spécificité biochimique
Exclusion moléculaire Poids moléculaire et forme
des molécules

Quelques modes de séparation en chromatographie liquide

10
 1.2. Chromatographie d'adsorption:
C'est la 1° chromatographie réalisée : séparation des pigments végétaux
par adsorption sur de la craie (Tswett 1906).

La chromatographie d’adsorption ou chromatographie liquide-solide (CLS)

utilise comme phases stationnaires des gels de silice et d’alumine. Elle
s’applique bien à la séparation de composés présentant des groupements
fonctionnels polaires différents (cas de nombreuses molécules thérapeutiques)
et des isomères de position.
* Polarité des phases:
Les rétentions sont basées sur le
principe de polarité càd l'existence
de liaisons hydrogène mais
également des liaisons de faible
énergie : interactions dipôle-dipôle
et forces de Van der Waals. La force
des interactions entre les solutés et
l'adsorbant augmente avec la
polarité des solutés. 11
a - Phase mobile:

Le pouvoir éluant d'un liquide (phase mobile) dépend de sa propre polarité.

MTBE: methyl tertiary butyl ether

éther de pétrole série éluotropique. CH3CN: acétonitrile
cyclohexane
tétrachlorométhane
trichloréthène
toluène
benzène
dichlorométhane
éther diéthylique
trichlorométhane
éthanoate d'éthyle
pyridine
propanone
propan-1-ol
éthanol
méthanol
eau
acide éthanoïque

polarité croissante
12
 La force d’élution d'un solvant ε0: l’énergie libre d’adsorption des molécules de
solvant par unité de surface de solvant adsorbé dans les conditions d’activité
standard et s’exprime par le rapport:

∆ G°M : énergie d’adsorption des molécules de la phase mobile.

AM: surface occupée sur l’adsorbant par molécule de solvant,
R : constante molaire des gaz, T: température (K),

Plus le solvant est polaire,

plus l'élution est rapide.

Phase mobile: un ou de plusieurs solvants polaires (méthanol, propanol, acide acétique, etc.)
mélangés avec un solvant de faible polarité tel l'hexane, l'isooctane ou le chloroforme.

13
 Mécanisme de rétention

En CCM: La phase stationnaire est immobilisée et la migration se fait

par capillarité.
d
Le rapport frontal est: Rf =
D
D
La vitesse de migration du solvant est: u=
d tM
et celle du soluté v=
tM D
où tM est le temps de migration. d

v
D’où
Rf =
u
L L
Sur la colonne de longueur L u= et v=
t0 tR

v t0 t0 1
= tR =t0 (1 +K ') =L (1 +K ') Rf = =
1 + k'
d’où Or
u tR u tR
t0 1
Rf = =a k’ facteur de capacité ou de rétention
tR 1 + k' 14
b- phase stationnaire ou Adsorbants :

Papier, cellulose
Kieselguhr, terre de diatomées
Amidon
Sucres
Talc
Forces d'interactions avec des
Carbonate de sodium composés polaires croissantes.
Oxyde de magnésium
Gel de silice
Alumine
Charbon activé

Le gel de silice et l'alumine sont les adsorbants les plus utilisés.

En général, plus un adsorbant est actif, plus il retient fortement les

composés polaires.
Plus la teneur en eau d'un adsorbant est faible plus il est polaire ou actif.

Un gel de silice peut être représenté

15
schématiquement par :
 Ces groupements OH ou groupements silanol, présents à raison
de 4,6 par nm2, confèrent à la silice ses propriétés adsorbantes.
3 types de sites participent, à des degrés divers, au mécanisme de rétention :

☼ les groupements silanol libres ‫ ؛‬SiOH ,

☼ les groupements silanol liés par liaison hydrogène,
☼ les silanols libres recouverts par une molécule d’eau (celle-ci est toujours
présente dans les solvants constituant la phase mobile en équilibre avec la silice).
☼ Les groupements siloxane ‫ ؛‬Si–O–Si‫؛‬.

Un schéma simplifié de la surface d’un gel de silice est donné ci-après:

Groupements fonctionnels à la surface de la silice

16
Les gels de silice ont une structure très poreuse (macrospores) qui leur confère
des surfaces spécifiques très élevées, souvent comprises entre 200 et 600 m2 · g–1
Un très grand nombre de phases stationnaires est commercialisé de granulométrie
comprise entre 3 et 10 µm, de surfaces spécifiques variables et de forme irrégulière
ou sphérique.
- chromatographie Couche SiO2 l'efficacité de
sous pression séparation des
verre
normale billes à surface
poreuse est
-chromatographie
supérieure
préparative
l'efficacité de
séparation est efficacité de
limitée séparation
grandement
supérieure

Forme physique des particules de phase stationnaire en

chromatographie liquide
17
 -la forme et le diamètre déterminent, en grande partie, leurs propriétés comme phase
stationnaire,
- la surface spécifique des particules joue un rôle déterminant sur la capacité du
support et le diamètre moyen des pores et leur volume influencent les phénomènes de
transfert de masse.

La solubilité de la silice augmente rapidement en milieu basique.

Il est recommandé de ne pas dépasser une valeur de pH égale à 7,5.

On utilise de préférence l'alumine pour séparer des solutés basiques comme les amines et
le gel de silice pour les phénols et les acides car les solutés acides sont fortement adsorbés
par l'alumine alors que les solutés basiques le sont par la silice.

18
La nature des groupements fonctionnels portés par les molécules à séparer
détermine la force avec laquelle ces composés sont adsorbés sur le support solide.
Le tableau présente l'affinité relative de plusieurs composés pour la silice. Chacun
porte un groupement fonctionnel (R) différent, greffé à un même squelette
aromatique. Plus le groupement fonctionnel est polaire, plus la molécule montre
d'affinité pour le support.

Affinité Groupement Structure du composè

croissante fonctionnel (R)
pour le
support Méthyl C6H5-CH3
Thiol C6H5-SH
Aldéhyde C6H5-COH
Amine C6H5-NH2
Hydroxyle C6H5-OH

Affinité de différents composés aromatiques pour la silice

19
Le mode de séparation par adsorption sur un support solide de silice ou d'alumine
n'est pas répandu en HPLC (adsorption irréversible). Cependant, il est
avantageusement exploité en CCM.

Ce mode est approprié pour la séparation des composés organiques non polaires, non
volatils et non ioniques, solubles dans les solvants organiques. Exemple: le cholestérol
et certaines vitamines liposolubles A, D, E et K .

La rétention et la sélectivité de la phase stationnaire en chromatographie d'adsorption

sont influencées de façon importante par la présence de très faibles concentrations de
composés polaires, et tout particulièrement d'eau dans la phase mobile. L'humidité des
gels ou celle des solvants d'élution est un paramètre qui doit être considéré et contrôlé.

la majorité des applications utilisent des particules de silice modifiées chimiquement,

c'est-à-dire à phase liée: chromatographie de partage

20
 1.3. Chromatographie de partage C.P :
La plupart des techniques de chromatographie en phase gazeuse et de chromatographie
liquide-liquide reposent sur un mécanisme de partage

C.P : Fondée sur la différence de solubilité des substances à séparer dans deux fluides non
φ.m et φ.s).
miscibles (φ φ.
Ex: C.P. Un des fluides est un liquide retenu sur un support inerte et constitue la phase
stationnaire. L'autre, liquide ou gaz en déplacement (phase mobile). La f.s est soit
adsorbée ou attachée au support solide par l'intermédiaire d'une liaison covalente.
Dans la très grande majorité des applications, la silice macroporeuse constitue le support
dont la surface polaire est modifiée par attachement covalent.

on peut utiliser des phases stationnaires peu ou non polaires, la phase mobile étant
polaire (eau ou mélange eau - méthanol): chromatographie de partage à polarité de
phase inversée RP (Reversed Phase).
On considère que 80 % des séparations sont actuellement réalisées avec des phases
stationnaires apolaires.
Le terme chromatographie en phase normale est utilisé pour décrire ces systèmes où la phase stationnaire
est plus polaire que la phase mobile.

21
Les greffons ou les groupements fixés à la silice peuvent être non polaires (-C18 ou ODS
ou RP18, -C8 ou RP8, et phényle), polaires (-NH2, -CN) ou encore ionisables (-SO3-, -
R4N+, R=(-CH3)). Ils sont greffés par l'intermédiaire des groupements silanols (-Si-OH)
qui réagissent avec des organosilanes, par exemple les composés du type ClSi(CH3)2R,
pour donner des liens siloxanes (Si-O-Si).

Greffage de Si(CH3)2R

Blocage des groupements silanols libres

par -Si(CH3)

phénomènes d'adsorption

Par cette même réaction, plusieurs types de phases liées peuvent être préparés en
modifiant la nature du groupement R
22
 quelques phases greffés par des liens siloxanes

Groupement Structure Application

fonctionnel
Alkyle -CH3 Phase inversée
-C4H9
-C8H17
-C18H37
Phényle -C6H5 Phase inversée
Cyano -(CH2)3CN Phase normale et inversée

Aminé -(CH2)3NH2 Phase normale et inversée et

échangeur ionique faible
Acide sulfonique -(CH2)3SO3- +H Échangeur cationique fort
-C6H4SO3- +H
(CH2)3C6H4SO3- +H
Acide -(CH2)3OCH2COO- +H Échangeur cationique faible
carboxylique (CH2)3COO- +H
(CH2)3C6H4CH2COO- +H
Diméthylamine -(CH2)3N+H(CH3)2 OH- Échangeur anionique faible
Aminé quaternaire -(CH2)3N+(CH3)3 OH- Échangeur anionique fort

23
Les phases d'octadécyle (ODS ou C18) sont très exploitées. Elles sont couplées à des
phases mobiles à base de solutions aqueuses de méthanol ou d'acétonitrile, utilisées en
gradients de concentration et l'élution est accélérée par toute diminution de polarité
de la phase mobile.

L'application très répandue du mode de chromatographie en phase inversée est

associé aux avantages suivants:

les φ.S résistent à la contamination par le matériel polaire;

les φ.S répondent rapidement à tout changement de composition de la phase
mobile;

le mode de séparation est exploitable sur une plage étendue de polarité, ce qui
permet à des échantillons complexes comportant de nombreux composés polaires aussi
bien que non polaires d'être séparés efficacement;

le mode de séparation peut être étendu à la séparation d'espèces chargées en
utilisant, par exemple, l'appariement ou la suppression ionique;

le mode de séparation permet généralement une analyse rapide et procure des
résultats plus reproductibles que les autres modes de séparation en chromatographie
liquide.
24
 Caractéristiques des systèmes en phases normale et inversée

Phase normale Phase inversée

Polarité de la phase Élevée Faible

stationnaire
Polarité de la phase Faible à moyenne Moyenne à élevée
mobile
Phase mobile typique Heptane, chloroforme, MTBE, Mélange méthanol/eau ou
etc. additionnés de quantités acétonitrile/eau, ou THF/eau
variables de solvants polaires
Ordre d'élution Les moins polaires d'abord Les plus polaires d'abord
Procédure pour Diminuer la polarité de la phase Augmenter la polarité de la
augmenter les temps de mobile phase mobile
rétention

(Attention: pH supérieur à 7,5: attaque du réseau siliceux par les ions OH-)
comme alternative et pour obtenir des résultats reproductibles, des polymères
organiques ont été introduits comme φ.S. Les plus utilisés sont des copolymères
styrène-divinylbenzène.
Avantages: Inconvénients:
* grande stabilité de pH= 0 à pH =14 * faible résistance à la pression
* structure homogène * cinétique d’échange plus lente
25
 1.4. Chromatographie ionique:

La phase mobile : solution tampon préparée en solution aqueuse ou

hydroalcoolique

la phase stationnaire: support solide auquel sont liés de façon covalente des
groupements positifs ou des groupements négatifs. La rétention des composés
chargés est un phénomène électrostatique. Les différences d'affinité des molécules
à séparer pour le support chargé sont à la base de leur migration différentielle.
La charge portée par la phase stationnaire est toujours de signe opposée à celle des
composés à séparer.

En échange ionique, seul les molécules chargées sont séparées. Les molécules neutres où
de même signe que la phase stationnaire sont éluées sans être retenues.
De plus, les molécules sont séparées sur la base de leur charge nette. Une molécule très
chargée s'accroche plus solidement au support.

26
 Les phases stationnaires utilisées en CEI sont de trois catégories:

les échangeurs sur silice poreuse;

les échangeurs sur résine organique;

les échangeurs sur support de polysaccharides.

 Les échangeurs sur silice poreuse: sont obtenus par greffage chimique (liaison
covalente) à la surface de silice de groupement fonctionnel approprié: des chaînes
alkylphényles (site de l'échange ionique). Elles sont les plus utilisées à haute pression
dans le domaine de pH 2-8.
 Les échangeurs sur résine organique: Les plus utilisées sont obtenues par la
copolymérisarion du styrène et divinylbenzène. Les groupements fonctionnels chargés
sont attachés à la structure de la résine par l'intermédiaire de benzène.

Copolymère styrène-divinylbenzène
27
La porosité est déterminée par le pourcentage massique de divinylbenzène dans le
copolymère (taux de pontage : il est désigné par la lettre X suivi du pourcentage en
divinylbenzène ; ainsi, X8 désigne un taux de pontage de 8 %).
La principale difficulté réside dans le fait que, pour obtenir une résistance
mécanique satisfaisante, il faut un taux de pontage relativement élevé alors que
pour avoir une bonne accessibilité il faut un taux de pontage faible.
Le compromis généralement adopté correspond à un taux de pontage de 8 % mais
les propriétés mécaniques demeurent médiocres.

Représentation d’un copolymère de styrène et de

divinylbenzène macroporeux

Les capacités d’échange d’ions dépendent de la nature de la matrice et des

groupements fonctionnels. Elles varient dans le cas des échangeurs de cations de 1
meq· g–1 (milliéquivalent par gramme) pour les silices à 5 meq· g–1 pour les résines
macroporeuses (1 équivalent correspond à une mole de charge).

Les phases éluantes sont alors des tampons de pH acides (tampons phosphate à pH
voisin de 3 par exemple) préparés en solution aqueuse ou hydroalcoolique.
28
 Les échangeurs sur résine organique sont très utilisés pour la séparation des molécules de faible taille comme
les acides aminés, les courts peptides et des bases azotée. En effet:
les pores des billes formées sont petites ,
la capacité de ces échangeurs est limitée,
la nature hydrophobe du polymère dénature les grosses molécules comme les protéines.

Dénaturation: changement de la forme de la protéine qui quitte l'état natif sans casser les liaisons covalentes
(T°, UV, pH, ….)

 les échangeurs sur support de polysaccharides ou résines polyosidiques : Les échangeons sont préparés par
attachement du groupement échangeur d'ions sur une matrice hydrophile de cellulose dont la structure est
poreuse.

composée de cellulose
ou de dextranes

Echangeurs anioniques Sephadex Echangeurs cationiques Sephadex

29
 Ces phases permettent l'échange de leurs contre-ions mobiles avec des ions, de
même signe, présents dans la phase mobile.

La séparation repose sur les coefficients de distribution ionique entre les deux
phases.

- Si par exemple à un échangeur cationique on ajoute un mélange de composés ioniques

chargés positivement, ceux-ci déplacent le contre ion à la condition de posséder une
affinité suffisante pour le support. Sinon, ils sont élus sans tarder.

- Si la concentration de contre ions est importante ou qu'un nouvel élément qui possède,
pour le support, une affinité encore plus grande est ajouté au système, les composés à
séparer se détachent de la φ.S, sont élues par la phase mobile.

Les composés à séparer et les contre ions compétitionnent entre eux pour occuper les
sites de liaison disponibles à la surface du support stationnaire.
Les différents ions présentent, pour une φ.S, des affinités variables selon leur densité de
charge qui dépend du nombre de charges porté par l'ion en relation avec sa taille.
30
De façon générale, l'ordre d'affinité croissant des ions pour une phase stationnaire
est:
♦ cations monovalents:
Li+ < H+ < Na+ < NH4+< K+ < Rb+ < Cs+
♦ cations bivalents:
Be2+ <Mn2+ <Mg2+ <Zn2+ <Co2+ <Cu2+ <Cd2+ <Ca2+ <Sr2+ <Ba2+
♦ cations de différentes charges:
Na+ < Ca2+ < La3+ < Th4+

♦ anions monovalents:
OH-, F- < CH3CO2- < HCO2- <H2PO4- < HCO3- < Cl- < NO2- < Br<NO3-
♦ anions de différentes charges:
H2PO4- < HPO42- < PO43-

Séparation par échange ionique de mélanges d'ions 31

En pratique, une fois le choix de la phase stationnaire fait, on choisit les conditions
expérimentales de sorte que les solutés d'intérêt soient liés à l'échangeur d'ions. Ces
conditions sont assurées en choisissant un tampon dont la concentration de contre ions
est faible pour permettre la liaison de toutes les molécules à séparer. Les composés
neutres et de même charge que la résine sont élues sans interagir avec le support. Ils ne
peuvent donc pas être séparés entre eux.
la résolution est optimisée par ajustement de la force ionique, du pH, de la température et
du débit de phase mobile.
• La force ionique est le premier paramètre optimisé en raison de son influence
déterminante sur la force du solvant d'élution (contrôle de la rétention). En effet,
augmenter la concentration de contre ions dans la phase mobile (la force ionique)
provoque une plus forte compétition entre les contre ions et les molécules à séparer et
diminue la rétention.
• La sélectivité est ensuite ajustée par l'intermédiaire du pH. Modifier le pH affecte à la
fois le caractère de la phase stationnaire et l'état d'ionisation des composés à séparer.
De façon générale, des gradients de force ionique sont utilisés pour contrôler la rétention
alors que la sélectivité est modifiée par un gradient de pH.
La constante de sélectivité est donnée par la relation : [AR ][Bϕ .m ] K PA
α AB = =
[Aϕ .m ][BR ] K PB
si αAB> 1 la résine a une affinité préférentielle pour le soluté A+
si αAB < 1 la résine a une affinité préférentielle pour le soluté B+
32
Paramètre de Influence sur les Effet des paramètres sur la rétention et la sélectivité
phase mobile propriétés de la
phase mobile
Force ionique Force du solvant En général, la force du solvant augmente avec toute
augmentation de la force ionique alors que la
sélectivité est peu affectée.
Nature des Force du solvant La nature des contre ions de la phase mobile contrôle
contre ions la force des interactions avec la phase stationnaire.
pH Force et Une augmentation de pH mène à une rétention
sélectivité du moindre en échange canonique mais à une rétention
solvant supérieure en échange d'anions. De faibles variations
de pH peuvent avoir un impact majeur sur la
sélectivité.
Température Efficacité de Des températures d'opération élevées augmentent la
séparation vitesse des échanges entre les phases mobile et
stationnaire et provoquent une diminution de la
viscosité de la phase mobile.
Débit de phase Efficacité de En général, les débits en chromatographie par
mobile séparation échange d'ions sont faibles dans le but de maximiser
la résolution en diminuant l'importance des
phénomènes de résistance au transfert de masse.
Facteurs influençant la résolution en CEI 33
Exemple 1 : Séparation d’un mélange d’acides aminés sur un échangeur cationique :
En milieu acide càd pH<pka (pka le plus petit des acides aminés), les espèces
cationiques sont majoritaires et des différents acides peuvent être fixées sur un
échangeur cationique. Si on élue avec une solution de pH croissant, on observe une
élution dans l’ordre des pKa des acides aminés. En effet, lorsque le pH est > pKa,
l’acide aminé correspondant perd sa charge + et devient neutre et donc non retenu.

34
Exemple 2 : Séparation des ions métalliques Zn2+ et Cd2+ sur un échangeur anionique :
De nombreux métaux à l’état cationiques peuvent être séparer par CEI à l’état de complexe anioniques. En
effet, si leurs caractéristiques physiques sont voisines (charge, rayon de solvatation,….), la séparation sur un
E.C n’est pas suffisante ; il faut associer des réactions chimiques dans la ϕ.m à l’échange simple.
En milieu chlorhydrique, des chloro-complexes anioniques sont plus au moins stables selon la [Cl-].
Leur séparation peut se faire sur une résine anionique sous forme de Cl- en éluant avec une solution
chlorhydrique plus ou moins concentrée.
Avec une solution 0.1 M HCl, le complexe CdCl42- est retenu et le complexe ZnCl42- est détruit et Zn2+ est élué
(Kc1<Kc2). Ensuite avec une solution très diluée 0.001M HCl, on libère le Cd2+.

Les phases stationnaires utilisées en échange ionique peuvent être cationique ou

anionique. Elles peuvent porter des groupements acide ou basiques forts ou faibles.

35
- Exemples de résines échangeuses de cations fortement acides : Amberlite IR120,
Dowex HCRS, Duolite C 20, Lewatit S 100, etc.

- Exemples d’échangeurs de cations faiblement acides : Amberlite IRC86, Lewatit CNP

80, Relite CC, etc.

- Exemples de résines échangeuses d’anions fortement basiques : Amberlite IRA 458,

Duolite A 132

- Exemples d’échangeurs d’anions faiblement basiques: Amberlite IRA 67, Duolite A

375
Le choix du type de groupement fonctionnel est régi par la nature du problème de
séparation : on fera appel à un échangeur de cations dans le cas de la séparation
d’amines ou de bases azotées sous forme protonée et à un échangeur d’anions pour
des acides carboxyliques, sulfoniques ou des nucléotides.

Une phase stationnaire qui porte un groupement fort conserve ses capacités d'échange
(nombre de groupements fonctionnels accessibles à l’échange d’ions par unité de masse
ou de volume d’échangeur) sur une zone étendue de pH. Une phase stationnaire qui
porte un groupement faible perd graduellement ses capacités qd le pH se déplace en
direction de sa constante de dissociation, ou de sa valeur de pKa. 36
- chaque classe d'échangeur ionique est ionisée sur une étendue de pH qui correspond
à la portion horizontale de sa courbe de capacité d'échange en fonction du pH.
par exemple: - un échangeur de cations fort, l'acide sulfonique, est déjà chargé
négativement à une valeur de pH aussi faible que pH 2 (là où la concentration d'ions
H+ est très élevée dans le milieu).
- un échangeur d'anions fort est complètement ionisé et chargé
positivement jusqu'à pH 10.

Variation de la capacité d'échange en fonction du pH et de la nature du groupement impliqué 37

Les groupements acides carboxyliques et aminés sont des groupements acides et base faibles,
respectivement Ils présentent l'avantage de posséder des capacités d'échange supérieures aux
groupements forts mais ne sont utiles que sur une étendue limitée de pH.

Groupement Structure chimique Acronyme pKa

approx.
Échangeur canonique fort -SO3H SA- 1
Acide sulfonique -CH2CH2CH2SO3H SP- 1
Acide sulfopropylique -CH2CH2PO3H PE- 2 et 7
Acide phosphoéthylique (charges -
1et -2)
Échangeur cationique faible -CH2COOH CM- 4,3
Carboxyméthyle -COOH 4,7
Acide carboxylique

Échangeur anionique fort -CH2N(CH3)3 TMA- 10

Triméthylamine Triéthylamine -CH2N(CH2CH3)3 TEA- 10
Aminoéthyle quaternaire CH2CH2N(CH2CH3)2CH2O QAE- 12
HCH3

Échangeur anionique faible -CH2N(CH2CH3)2 DEA-DEAE- 8

Diéthylamine -OCH2CH2N(CH2CH3)2 EA- 9
Diéthylaminoéthyle -OCH2CH2NH2 9
Éthylamine

Groupements fonctionnels des phases stationnaires en échange ionique 38

Applications
* La chromatographie par échange d'ions est utilisée principalement pour
séparer les ions ou les substances aisément ionisables. Elle connaît des
applications dans la séparation des acides aminés, des peptides, des
protéines, des nucléotides, des sucres, des acides organiques, etc.

* adoucir l'eau, épurer l'eau, ...

* récupérer des composés ioniques dans des solutions industrielles:
jus de fermentation,
bains de traitement électrolytique, de traitement
hydrométallurgique [Uranium, Terres Rares, ...]
* séparation chimique à des fins analytiques:(ex: CrIII/CrVI, AsIII/AsV,
...), séparation des Terres Rares, ...

39
1.5. Chromatographie d'exclusion:

La phase stationnaire: silice ou polymère électriquement neutre qui se présente

sous la forme de particules poreuses dont les pores ont des dimensions
soigneusement contrôlées en rapport avec la taille des espèces à séparer.

C’est une sorte de tamis à l'échelle moléculaire, dit à perméation sélective. Le

coefficient de partition s'appelle dans ce cas le coefficient de diffusion.

Cette technique est encore appelée filtration sur gel ou perméation de gel selon la
nature de la phase mobile aqueuse ou organique respectivement.
Le diamètre des pores est une caractéristique de chaque type de gel.
Un mélange de solutés de masses molaires et de formes variables traverse une
épaisseur donnée de gel:
les grosses molécules, celles dont le diamètre est supérieur à celui des pores,
sont exclues et éluées les premières; les petites et moyennes molécules sont
éluées plus tardivement, car incluses, leur migration est freinée en diffusant
dans le gel.
La séparation est donc réalisée par le fait que les solutés sont élués dans l'ordre
inverse des masses molaires.
40
La forme des molécules est importante car deux substances peuvent posséder une
même masse mais être éluées à des temps de rétention différents si l'une d'entre elles
est fortement asymétrique et se présente sous la forme d'une chaîne de structure
désordonnée plus que sous forme globulaire.

M1

M2

diffusion
Mécanisme de séparation par exclusion moléculaire
les molécules volumineuses empruntent les espaces entre les particules de gel
et sont, par conséquent, éluées rapidement. Elles voyagent à la même vitesse que la phase mobile
avec la vitesse Vo.

le volume d’élution Ve d’une macromolécule dans une colonne GPC prend la forme :
Ve = V0 + Kexcl · Vp
Vp: volume des pores; Kexcl: constante d’exclusion
41
La courbe de calibrage ou d’étalonnage est préparée en séparant des composés de
poids moléculaires connus et en portant sur un graphique le logarithme de leurs poids
moléculaires en fonction des volumes de rétention

Les gels poreux de dextrane ou de polyacrylamide ne peuvent être utilisés en

chromatographie haute performance. En effet, les pressions d'opération élevées des
systèmes HPLC entraîneraient le compactage de la structure tendre de ces gels.
Cependant, les particules poreuses de verre ou de silice ainsi que certains polymères
réticulés de styrène-divinylbenzène peuvent supporter la pression.
42
Par rapport aux autres modes de chromatographie, le choix de la phase mobile en
exclusion moléculaire est relativement facile. En effet, un seul solvant est suffisant car
le gel inerte est mouillé par liquide utilisé pour l'élution: la nature de la phase mobile
ne gouverne pas, comme dans les autres modes de séparation, la rétention et la
sélectivité.

En GPC, les gels doivent répondre à un certain nombre de critères:

- La matrice de gel doit être inerte pour que ses fonctions de tamis moléculaire soient
remplies avec le moins d'interférences possible;
-Les interactions entre la matrice et les substances à séparer doivent être minimales;
- Le gel doit être chimiquement stable afin d'en permettre une utilisation prolongée
même sous des conditions d'opération difficiles;
- Les particules doivent être mécaniquement stables et de forme appropriée,
préférablement sphérique, pour s'entasser de façon régulière et procurer un support
homogène et stable;
- Elles doivent avoir la taille et la distribution de taille appropriées.

43
Le tableau montre des exemples de gels ne représentant qu'un échantillonnage très
limité de φ.S disponibles commercialement.
Les gels de différentes structures et compositions chimiques sont disponibles avec des
limites d'exclusion variant de moins de 1 000 à plus de 150⋅⋅106 g/mole.

Propriétés de quelques gels utilisés en chromatographie d'exclusion moléculaire

Gel Diamètre des particules Limites d'exclusion

µm)
(µ (g/mole)

Sephadex G-75 fin 40-120 3000-8000

Bio-Gel P-4 150-300 800-4000

Sepharose 6B 45-165 10000-4000000
Bio-Gel A-15m 150-300 40000-15000000

En plus d'être caractérisé sur la base de ses limites d'exclusion et de la pression

maximale qu'il peut supporter, le gel est aussi caractérisé par le diamètre des
particules dont il est formé qui détermine la perméabilité de la colonne, le volume
occupé par le réseau gélifié, etc.
44
La chromatographie d'exclusion permet la séparation de différentes protéines et
polymères, déterminer le poids moléculaire approximatif d'une molécule et séparer
des molécules de faible taille des autres composés qui constituent, par exemple, la
matrice d'un aliment complexe.
La chromatographie d'exclusion moléculaire est souvent utilisée comme étape
préliminaire dans l'analyse séquentielle de mélanges complexes de composés
organiques. On l'utilise de cette façon dans l'analyse quantitative des pesticides dans
les aliments notamment.

Le poids moléculaire des macromolécules à séparer, protéines par exemple, doit

se situer à l'intérieur des limites d'exclusion du gel.

45
1-6 Chromatographie de paires d'ions

Paire d'ions : entité formée par l'association de deux ions de charge opposée. Elle a
donc une charge nette nulle

K
RCOO-M + Bu4N+M [RCOO-,B4N+]M [RCOO-,B4N+]S

En appariement ionique, une espèce hydrophobe chargée (l'ion d'appariement ou

contre ion) de charge opposée à celle des composés à séparer, est ajouté à la phase
mobile.
Ces composés réagissent avec l'ion d'appariement et les espèces neutres formées
deviennent plus hydrophobes que chacune des espèces chargées d'origine.
Ces complexes hydrophobes peuvent maintenant être séparés par chromatographie
en phase inversée sur colonne de C18, par exemple.

L'appariement ionique regroupe les principes de la chromatographie d'échange d'ion

et de partage. Les techniques qui reposent sur ce mode de séparation surpassent, en
terme d'efficacité et de rapidité, la chromatographie d'échange d'ions.

46
- Les réactifs d'appariement ionique typiques, dans le cas de la séparation de
cations, sont des acides sulfoniques alkylés où le groupement alkyls est un radical
pentane, hexane, heptane, octane, etc

- Dans le cas de la séparation d'anions, ce sont des sels d'ammonium, comme

les sels de tétrabutylammonium par exemple.

Exemple d'appariement ionique dans le cas d'un soluté cationique et d'un soluté anionique.

47
En chromatographie d'appariement ionique, la rétention des composés est contrôlée par:
- la longueur de la chaîne hydrocarbonée portée par l'ion d'appariement.

- la concentration de l'ion d'appariement,

- le pH , la nature et la proportion des différents solvants qui composent la phase mobile.

- Plus la chaîne hydrocarbonée est longue, plus tr augmente car plus le complexe
neutralisé est hydrophobe plus il est retenu à la phase stationnaire de même nature.
- Plus la concentration en ions d'appariement augmente, plus il y a de composés à
séparer sous forme complexée hydrophobe et plus la rétention augmente.
- Modifier le pH détermine l'état d'ionisation des molécules à séparer et comme seules
les molécules chargées réagissent à toute modification de concentration de l'ion
d'appariement, il est possible de modifier ainsi la sélectivité de la colonne.
- la composition de la phase mobile, en terme de proportions des différents solvants
qui la composent, affecte la rétention et la sélectivité de la colonne

48
Les réactifs d'appariement ionique typiques, dans le cas de la séparation de cations, sont
des acides sulfoniques alkylés où le groupement alkyle est un radical pentane, hexane,
heptane, octane, etc.

Qqe contre ions: octanesulfonate: C8H17SO3-,

Dodécanesulfonate: C12H25SO3-, ….

Dans le cas de la séparation d'anions, ce sont des sels d'ammonium, comme les sels
de par exemple.

trimétylcétylammonuim C16H33(CH3)3N+, tétraéthylammonium

tétrabutylammonium, tétrapentyleammonium,,…

49
1-7 chromatographie d'affinité
Ce mode de chromatographie largement utilisé en biotechnologies.
Son principe repose sur la reconnaissance spécifique d'un composé ou
d'un groupe de composés par un ligand attaché à la phase solide
stationnaire et l'exclusion de la majorité des autres. Une fois le composé
C est adsorbé sur le ligand qui le reconnaît, les autres substances A et B
sont lavées de la matrice avec un tampon approprié et l'élution du
composé cible est réalisée avec un tampon différent dont la valeur de pH
ou la force ionique, par exemple, permet de détacher la molécule de son
ligand et de l'entraîner vers l'extrémité inférieure de la colonne. Ligand

Support
Le support solide idéal en chromatographie d'affinité est insoluble et
suffisamment perméable pour posséder une surface considérable. Il est
rigide et ses particules sont de taille uniforme. Il possède la propriété de
ne pas adsorber le composé cible autrement que par le ligand. Il est
chimiquement stable sous les conditions d'adsorption, d'élution et de
régénération. Il est résistant à l'attaque microbienne et enzymatique,
hydrophile, et capable d'accepter l'attachement du ligand ou d'un bras
d'espacement.. Principe de la
chromatographie
d'affinité

50
Plusieurs substances ont été utilisées: l'agarose, les polysaccharides comme le
dextrine et la cellulose, le verre poreux et la silice poreuse, le polyacrylamide,...
L'agarose et la silice poreuse ont la majorité des critères nécessaires à un bon
support.
- L'agarose est utilisé essentiellement pour la chromatographie sur
colonne à pression atmosphérique
- la silice poreuse est utilisée en chromatographie d'affinité haute
performance.
Le ligand est attaché soit directement à la
matrice (support), soit par l'intermédiaire
d'un bras d'espacement (chaîne hydrocarbonée
qui porte, à chacune de son extrémité, un
groupement fonctionnel) dont le rôle est de
séparer physiquement la matrice et le ligand
afin de prévenir les problèmes
d'encombrement stérique qui pourraient
limiter la quantité de solutés fixés au
support.
Liaison des ligands et activité du support stationnaire

51
 ligands susceptibles d'être rencontrés: protéines, peptides, acides aminés, sucres,
acides nucléiques, nucléotides, coenzymes, colorants, acides carboxyliques et
groupements thiols.
Les ligands sont en général attachés au support par l'intermédiaire de leurs
groupements fonctionnels NH2, COOH, CHO, OH et SH.

Les principales applications de la chromatographie d'affinité:

séparation de protéines qui possèdent une activité biologique comme les enzymes et les
anticorps.

- fixation des sucres sur des colonnes sur lesquelles sont greffées des ions boronate qui
ont une affinité pour les diols cis des sucres.

52
2- Classification des techniques de chromatographie

53
 3- Choix d'un mode de séparation

Le mode de séparation en chromatographie

est choisi en fonction de la taille des composés
à séparer et de la solubilité des échantillons.
De plus, le type de groupements fonctionnels
porté par les composés cibles détermine aussi
dans une large mesure le mode à utiliser. La
figure ci-contre résume le cheminement
logique à adopter pour choisir un mode de
chromatographie liquide. Vous y constatez,
que plus d'un mode est possible pour séparer
les mêmes composés. La meilleure approche
pour arrêter le choix d'un mode de séparation
est d'étudier la nature des composés à séparer
et leurs propriétés, de consulter la littérature
existante en rapport avec le problème à
résoudre et de communiquer avec les
représentants des fournisseurs de matériel de
chromatographie.

Choix du mode de séparation en fonction de la

nature de l'échantillon
54
 I- Grandeurs fondamentales

Dans toute méthode chromatographique, les séparations sont basées

sur la différence de distribution des solutés entre deux phases non
miscibles, l’une stationnaire (silice vierge ou greffée, polymère
moléculaire ou échangeur d’ions,…), l’autre mobile (gaz, liquide
constitué par un solvant pur ou plus souvent par un mélange de
solvants).

Le coefficient de distribution ou de partage Kp d’un soluté A est défini

par la relation:

KpA=[A]φs/[A]φ.m

[A]φs et [A]φ.m sont les concentrations de A à l’équilibre dans les phases

stationnaire et mobile respectivement.

Si les quantités injectées sont suffisamment faibles, on observe à la

sortie du détecteur des pics symétriques, sensiblement gaussiens.
 Une bonne séparation en chromatographie implique que :

•Les différents pics soient bien séparés,

•l'analyse soit aussi rapide que possible.

I-1 Grandeurs de rétention

On appelle temps de rétention tR le temps d’élution au maximum du pic,
mesuré à partir de l’injection. Connaissant le débit D, maintenu constant,
de la phase mobile, on définit le volume de rétention VR :

VR=tR.D et D=u.s. εc et εc=V φ.m/Vcolonne

Si dc est le diamètre de la colonne

2
D=u Πd c
εc
4
 VR : volume de phase mobile nécessaire pour éluer le composé
s : section droite de la colonne,
u : vitesse linéaire de la phase mobile,
εc : porosité de la colonne ( 0.37 pour polymères moléculaires ou
échangeurs d’ions, 0,75 pour les silices poreuses)
Vφ.m : volume de la φ.m de la colonne

Le temps ou le volume de rétention sont des grandeurs caractéristiques

de chaque composé, dans des conditions et pour une colonne données ;
ils peuvent servir à l’analyse qualitative du composé.

Les espèces non retenues donc n’ayant aucune affinité pour la φs,
apparaissent dans l’effluent après le temps t0 ou tm dit temps de rétention
nulle ou mort correspondant à l’écoulement du volume Vm ou V0 de φ.m
contenu dans la colonne.
Vm = Vi + Vp et Vm=to.D
 Vi : volume interstitiel et Vp : volume poreux.

εc= (Vi + Vp )/Vcolonne

Le volume de rétention VR est relié directement au coefficient de distribution ou de

partage Kp par la relation : VR = Vm + Kp Vs avec Vs volume de la φs ou sa
masse ou sa surface spécifique selon les unités dans lesquelles K est exprimé.

Pour caractériser la rétention d’un composé, on utilise le facteur de capacité ou de

rétention K’, défini comme le rapport de la quantité de soluté dans la φs à la
quantité de soluté dans la φ.m.

[soluté]ϕs.Vϕ..s Vϕ.s
K'= =K p K’=Kp/β
[soluté]ϕm.Vϕ.m. V ϕ .m
Le paramètre β = Vφm/VφS, appelé rapport de phases est une constante qui caractérise une
colonne de chromatographie.

p
Soit K'=VR −Vm = tR −t0 D’où: tR =t0(1+ K')= L (1+ K')
u
Vm t0
L : longueur de la colonne
 p
Le temps de rétention réduit: t’r = tr-tm = tm(1+K’)-tm=tm.K’

Kp varie avec la température T)

G° est la différence d'énergie libre de dissolution du
p
Soluté entre les 2 phases

Relation entre le temps de rétention réduit et la

température :

Or G° = H° - T* S°

Soit
ln tr' = - H°/RT + S°/R - ln β+ ln tm

(On suppose que H° et S° sont indépendants de la température)

A et B sont des constantes pour un produit donné et une colonne donnée
Pour deux températures T1 et T2 où T2>T1 avec les facteurs de rétention correspondants k'1 et k'2
on aura:

comme t'r1>t'r2, on voit que H° est toujours <0.

I-2 Sélectivité ou facteur de séparation :

Pour caractériser la distance séparant les sommets de deux pics consécutifs 1 et 2,

on utilise la sélectivité α (ou rétention relative) définie par la relation :

α = K 2' = K p = tR 2 −t0
2

K1' K p1 tR1 −t0

Cette grandeur α mesure la différence de distribution thermodynamique des deux

composés 1 et 2; on a :

K ∆G20 −∆G10
Lnα = Ln p2
=−
K p1 RT

∆(∆G0) : différence des enthalpies libres de distribution des deux composés,

T : température (K)
R : constante molaire des gaz =8.31 J/mol/K)
 1.3 Efficacité d'une colonne

l’élargissement des pics est d’autant plus important que l’efficacité de la

séparation est faible. Cette grandeur est mesurée, pour chaque composé,
par le nombre de plateaux théoriques N de la colonne.

Comme nous l’avons signalé, les pics d’élution peuvent être assimiler à des
courbes de Gauss; ce qui permet de calculer N, pour un soluté donné.

N =16(tR )2 =5.54(tR )2
ω δ
ω: largeur du pic à la base, définie comme
la distance entre les points d’intersection
des tangentes d’inflexion avec la ligne de
base.
δ : largeur du pic à mi-hauteur.
ω, tR et δ sont exprimés dans la même
unité. min ou cm
En pratique, on préfère souvent la seconde expression car δ peut être
mesurée d’une façon précise que ω.
Pour pouvoir comparer entre elles des colonnes de différente longueurs,
on définit la hauteur équivalente à un plateau théorique HEPT:

HEPT= Lc
N
N dépend de la nature et de l’intensité de toutes les interactions mises
en jeu et, par suite, des conditions expérimentales et de la nature même
du soluté.
1.4 Résolution
La résolution RS entre deux pics 1et 2 est définie par la relation :

R1 2 =2 t R2 t R1
ω1 +ω2
ω2 et ω1 étant les largeurs à la base des pics des solutés 1 et 2.
La séparation entre deux pics est donc meilleure lorsque RS est plus grand.
Ainsi, la séparation de deux composés est complète quand RS = 1,5 puisqu’il
n’y a alors que 2 % de recouvrement des deux pics. Pour des valeurs de RS
inférieures à 1, les pics se chevauchent et, pour RS < 0,8, la séparation est
généralement insuffisante.

De même, pour une valeur de R donnée, la séparation est d’autant plus

mauvaise que le rapport des aires des deux pics est plus grand.

En supposant les largeurs des pics à la base égales ω1=ω2, donc dans le cas
de pics très voisins, Purnell a exprimé R par la relation :
 Influence du facteur de capacité

R= 1 (α-1)( K'2 ) N 2
4 α 1+ K'2

Influence de la sélectivité Influence de l'efficacité

l’indice 2 se rapportant au composé le plus retenu.

Une autre approximation consiste à supposer le nombre de plateaux

identique pour chacun des deux solutés ( N1 = N2 = N). La résolution est
alors donnée par la relation :
− −

R= 1 (α −1)( K'− ) N K'= K'1+K'2

4 α +1 2
1+ K'
1.5 Perte de charge et facteur de résistance à l'écoulement

La résistance à l’écoulement est une caractéristique importante d’une

colonne chromatographique . La perte de charge d’une colonne est
donnée par la loi de Darcy :

φηLu
∆P=
(d p)2

dp : diamètre moyen des particules, (cm)

L : longueur de la colonne, (cm)
∆ P : perte de charge (Pa) (10–6 bar ≅ 10–6 atm = 10– 1 Pa),
u: vitesse linéaire de la phase mobile, (cm · s–1)
η: viscosité dynamique de la phase mobile, (Pa · s)
φ: facteur de résistance à l’écoulement. (sans dimension)
∆ P mesure la différence de pression entre les deux extrémités de la
colonne. Elle doit être faible.
En pratique, la valeur de φ dépend de la forme des particules, de leur
réparation granulométrique, de la texture de la phase stationnaire et de la
qualité du remplissage. Ainsi φ est voisin de 500 pour des poreuses de forme
sphérique, de 1000 pour des particules poreuses de forme irrégulière

1.6 Capacité disponible

On définit la capacité disponible Cd d’une ϕ.s par la quantité de soluté

injectée qui provoque la saturation de la ϕ.s contenue dans la colonne dans
des conditions déterminées. On l’exprime en nombre de millimoles de
solutés par gramme de ϕ.s:

Qsoluté (ϕ.s)
Cd =
m

Qsoluté(ϕ.s) : quantité de soluté fixée à l’équilibre (à saturation) par la ϕ.s,

m : masse de ϕ.s contenue dans la colonne.
 I-7 Indice de performance

L’indice de performance permet de caractériser les performances

d’une colonne chromatographique.
Il est défini par :

∆P: atmosphère et tR: seconde

N 2
Ip= 103<Ip <105 pour les colonnes remplies et
tR ∆P utilisées dans de bonnes conditions
 II- Grandeurs réduites
Comme vous le savez, l’élargissement d’un pic chromatographique
dépend :

du diamètre et de la nature des particules de la phase stationnaire,

de la nature et de la vitesse de la phase éluante,

de la nature du soluté,

de l'homogénéité du remplissage de la colonne.

Afin de préciser la contribution de chacun de ces paramètres à la

HEPT = Lc = Lc ω 2
2

N 16 t R

et de permettre une optimisation aisée des conditions d’une analyse, on

utilise la notion de grandeurs réduites, adimensionnelles.
Ces dernières permettent alors de comparer entre elles des colonnes
remplies avec des particules de phases stationnaires de dimension et de
nature différentes et utilisées dans des conditions opératoires variées.
1- Longueur réduite

La longueur réduite l d’une colonne est définie par le rapport :

l= Lc
dp
Elle représente le nombre de couches de particules (d’épaisseur dp)
contenues dans la colonne.

Pour des colonnes ayant même l, une molécule de soluté rencontrera

en moyenne le même nombre de particules au cours de sa progression
dans la colonne, et l’on montre que cela conduit à une même efficacité
si elles sont mises en œuvre avec la même vitesse réduite.

Exemple : pour l = 20 000, une colonne de 10 cm remplie avec

des particules de 5 µm a une efficacité analogue à celle d'une colonne
de 100 cm remplie avec des particules de 50 µm.
2- Hauteur de plateau réduite

On définit la hauteur de plateau h= H = l

dp N
réduite h par la relation :

Elle représente le nombre de couches de particules par plateau théorique.

h permet de comparer entre elles les efficacités de colonnes remplies avec

des particules de taille différente. Une colonne efficace utilisée au voisinage
des conditions optimales a une hauteur de plateau réduite comprise entre
2 et 4 environ.
3 Vitesse réduite de la phase mobile

On définit la vitesse réduite de la ud ld p2

v= p
=
phase mobile ν par : Dm t0 Dm

Dm est le coefficient de diffusion moléculaire du soluté dans la phase mobile.

Ex : Dans le cas d’un soluté de masse molaire faible (voisine de 100 g),
Dm = 3 · 10–9 m2 · s–1 dans l'hexane, 10–9 m2 · s–1 dans l'eau
et le 3.10–10 m2 · s–1 dans le propanol.

Dm dépend à la fois de la nature du soluté et de celle de la phase éluante.

Il peut être calculé à l’aide de l’équation :

7,4.10−15T ΨM s (en m2·s–1) (relation de Wilke et Chang)

Dm =
η V 0. 6

T : température (K),
ψ: facteur d’association du solvant égal à 1 pour les solvants non
donneurs de liaisons hydrogène, 1,5 pour l’éthanol, 1,9 pour le
méthanol et 2,6 pour l’eau,
MS : masse molaire du solvant (g),
V : volume molaire du soluté à température ambiante (cm3 · mol–1),
η: viscosité du solvant (Pa · s).
L’équation précédente peut également être utilisée, en première
approximation, dans le cas d’un mélange de solvants A et B en prenant
pour ψ MS la moyenne pondérée des valeurs pour les solvants purs :

(ΨM s) A+ B = X A(ΨM s) A + X B(ΨM s)B

XA et XB désignant les fractions volumiques de A et B dans le mélange

et η étant la valeur calculée au moyen de la relation :
η =(η A)YA.(ηB)YB

YA et YB sont les fractions molaires de A et B dans le mélange.

 III- Cinétique des échanges

III.1 Mécanismes de dispersion d'un pic d'élution

Pour augmenter l’efficacité N d’une colonne, il faut trouver les conditions

où la hauteur réduite h est minimale ( N = l/h). Pour cela, on va étudier
les différents mécanismes d’élargissement d’une bande de soluté au cours
de sa progression au sein d’une colonne chromatographique et préciser
l’influence de chacun de ces facteurs sur la valeur de h.

Dans le cas du développement par élution linéaire, l’étalement d’une

bande a trois origines:

 la dispersion des molécules par diffusion longitudinale : Hdiff. long;

 l'existence de « chemins multiples » dus au remplissage (anisotropie
d'écoulement): Hflux;
 la résistance au transfert de masse dans chacune des deux phases :
Htransfert de masse;
 H globale est la somme de toutes ces contributions:

H =∑Hi= H diff..long + H flux + H transfertdemasse

D’où h = hflux + hdiff. long + htransfert de masse

III.1.1 Anisotropie d'écoulement :

Au cours de son écoulement à travers les

particules de la phase stationnaire, la
phase mobile peut avoir plusieurs
chemins possibles et par suite des vitesses
différentes. Ces différences entraînent un
certain étalement de la bande du soluté.
Ce phénomène se trouve atténué lorsque
le remplissage de la colonne est
homogène et la répartition granulométrique de la phase stationnaire est
uniforme
III.1.2 Diffusion moléculaire longitudinale : h diff. long = B/υ

Ce terme traduit l’influence de la dispersion des molécules du soluté dans

la direction parallèle à l’axe de la colonne. Ces molécules diffusent des
régions de fortes concentrations vers celles de faibles concentrations.
Plus la vitesse réduite de la phase mobile est faible plus la contribution de
ce terme à l’élargissement de la bande augmente hdiff. long..

Cette diffusion intervient dans la phase mobile

circulant dans et autour des particules de la phase
stationnaire et dans la phase liquide stationnaire
tapissant les pores. phase mobile
intraparticulaire
La contribution de ce phénomène à
l’élargissement de la bande de soluté fait
intervenir :
* Dm le coefficient de diffusion du soluté dans la
phase éluante,
* Ds le coefficient de diffusion du soluté dans la
phase liquide stationnaire. phase liquide
stationnaire
La valeur de B est très souvent prise égale à 2 .
 III.1.3 Résistance au transfert de masse : htransfert de masse = C ν

A cause du mouvement relatif des deux phases, l’équilibre de

répartition du soluté (transfert de masse entre les deux phases) n’est pas
atteint. Ce phénomène s’accroît avec la vitesse réduite ν, d’où un
élargissement progressif du pic. htransfert de masse s’accroît avec la vitesse
réduite :

Étalement de la bande de soluté

dû au terme d transfert de masse

Cas général: htransfert de masse = Cm νm + Cf ν m + Ck νm

Cm et Cf sont les coefficients de transfert de masse respectivement en phase

mobile et en phase stationnaire et Ck est le coefficient d’adsorption-désorption.
Finalement la hauteur de plateau varie avec la vitesse réduite selon
l’équation de Knox :
Aux faibles valeurs de ν, le terme B/ ν
prédomine ce qui explique la perte d’efficacité
vers les très faibles vitesses.
Aux grandes vitesses réduites, le terme Cν
prédomine ce qui explique la perte d’efficacité
aux très grandes vitesses.
Dans la région intermédiaire, le terme Aν1/3 est
prépondérant et h passe par un minimum
hmin = 2,4, pour une vitesse réduite optimale
égale à 2,7.
Seules les valeurs de vitesse réduite supérieures à 2,7
présentent un intérêt pratique car le choix de valeurs
inférieures entraîne à la fois une diminution de
l’efficacité et une augmentation de la durée de la
séparation. En revanche, l’augmentation de la vitesse
réduite de νopt = 2,7 à ν = 10, par exemple, permet de
diviser par quatre environ la durée d’une analyse avec
une perte acceptable en efficacité et en résolution.
 C- CHROMATOGRAPHIE EN
PHASE GAZEUSE (CPG)
Introduction:
La CPG s’est développée à partir de 1952 grâce aux travaux de James et Martin. Elle a
pris un essor considérable entre 1960 et 1970 pour devenir l’une des méthodes de séparation et
d’analyse les plus utilisées.

Elle permet la séparation des mélanges gazeux ou susceptibles d’être vaporisés

(liquide ou solide) dont les constituants peuvent différer d’une façon considérable par leur
nature ou leur volatilité.

Les solutés, introduits dans un flux de gaz vecteur (G.V ou ϕ.m), qui exerce une force
d’entraînement, sont retenus par le matériau contenu dans la colonne: phase
stationnaire ϕ.s (liq. ou solide) qui exerce une force de rétention. Il s’établit alors
l’équilibre suivant:
KD
[Solutés] ϕ.s [Solutés] G.V

Qui utilise la GC ?
Les industries: chimiques, pétrochimiques, pharmaceutiques et médicales, biologiques,
agricoles, environnement, alimentaire, contrôle de fabrication, de synthèses, de qualité,
recherche fondamentale, ….
Exemples: Chimie: insecticides, pesticides, plastifiants
Alimentaire: composition d'aliments et de contaminants (cancérigènes, p.ex)
Judiciaire: alcool dans le sang, recherche d'indices après incendie,…
Parfumerie: composition d'un parfum, des huiles essentielles,…
HISTORIQUE

• 1952 : Naissance officielle de la Chromatographie gaz-liquide

(Martin et James) : analyse directe d’acides gras libres

• 1957 : Invention des colonnes capillaires (Golay)

• 1958 : Invention du Détecteur à Ionisation de Flamme (FID)

• 1960 : Invention du Détecteur à Capture d’Electron (ECD)

• 1975 : Emploi très limité de la GC, réservée à l’analyse de mélanges

complexes de composés peu polaires
 I- Grandeurs élémentaires (rappels):

Temps ou volume de rétention (VR, réduit V’R et mort Vm « air ou méthane ») dépend du couple
ϕ.s, débit du G.V, caractéristiques de la colonne (T°, qté ϕ.S, longueur Lc, diamètre dc,
soluté/ϕ
porosité,…), …

L’écoulement gazeux le long de la col. n’est pas constant (compressibilité du GV) ce qui
engendre une perte de charge. D’où le volume de rétention net ou absolu VN = jV’R J: coefficient
de perte de charge ou facteur de James et Martin

Pe et Ps sont la pression d’entrée et de sortie du GV de la colonne

La pression moyenne dans la colonne est: Pmoy=Ps/j

∆p = pe - ps Perméabilité des colonnes

∆p = η.L.ū /Bo
Colonne remplie Colonnes capillaires
η:: Viscosité [g cm-1 s-1 = Poise] Bo = dp 2 / 103 Bo = dc2/32
Bo : Perméabilité spécifique [cm2]
ū : Vélocité linéaire moyenne [cm s-1] dp= Diamètre des grains [cm]
dc= Diamètre de la capillaire [cm]
 gaz vecteur : Viscosité et exemple
Table: Viscosité des gaz vecteurs [µPoise]

100 °C 200 °C 300 °C

Hydrogène H2 103 121 138
Hélium He 229 270 307
Azote N2 208 246 280

Exemple d’un calcul de la pression à l’entrée de la colonne capillaire

25 m x 0,32 mm colonne capillaire, 100 °C, gaz vecteur:He, vélocité linéaire moyenne désirée ū = 35 cm/s.

∆p = 32.L.η. ū/d2c
dc= 0.032 [cm], η = 229 10-6 [Poise], L = 25 102 [cm], ū= 35 [cm s-1]
Résultat: ∆p = 0.63 [bar] = 63 [kPa]

Volume de rétention net ou absolu VN = jV’R

On peu ramener le VN à l’unité de masse du remplissage actif dans la colonne et à

0°C, et l’on obtient le volume de rétention spécifique Vg.

ml: masse da la phase stationnaire liquide

Vg =VN 273 Tc: température de la colonne en K
ml×Tc
logVg =− ∆H +cte ∆H: enthalpie d’adsorption ou de dissolution du soluté
2,3RT
Vg dépend du couple soluté-phase stationnaire et de la température. Il est indépendant
de la masse de la ϕ.s, de la géométrie de la colonne, de la nature de GV, de sa
pression et de la quantité du soluté injectée si elle est faible.

II- Description du chromatographe

Il se compose de plusieurs parties.

Fig.1
 II-1 Gaz vecteur:
Le choix du G. V est lié au type de détecteur utilisé:
H2 ou He pour le catharomètre TCD et N2 ou He pour l’ionisation de flamme FID.

Il doit être inerte et pur (pas

de O2 et H2O: dégradation de la phase
stationnaire avec la T°C et
d’hydrocarbures: dissolution de la ϕ. S:
filtres comme tamis moléculaire ou
système de piégeage).

Il doit avoir une faible

viscosité, un débit contant à sa valeur
optimale (équation de Van Deemter) et
grands coefficients de diffusion des
solutés dans le G.V. Fig 2:

Fig 2
 Le tableau ci-dessous rassemble qques ctes physiques des GV

Gaz H2 He N2 Ar
Conductibilité. Therm. Cal/cm.s.deg. 105 54.3 41.6 7.5 5.2
105 234 212 270
Viscosité à 100°C (poise) 106

Différentes qualités de gaz sont commercialisées.

Ex: Azote R: 50 ppm en eau, Azote U avec 5 ppm (O2+H2O) 99.995%, Azote N60
pureté 99.9999%,
Les débits sont habituellement mesurés avec un débitmètre à film de savon. Les
colonnes et les diverses parties de l’appareillage sont assemblées de façon étanche
par des raccords simples, du type Swagelock.
 II-2 Système d’injection:

L’injecteur joue plusieurs rôles, que

l’échantillon se trouve sous forme liq. gazeuse
ou solide:
* Vaporisation l’échantillon,
* Homogénéité du mélange (G.V + éch.),
* Introduction de l’éch. dans la colonne

a) Injecteur à pastille (septum) pour col.

remplies

Il est presque universel (Fig 3) .

L’éch. Liq. ou gaz est introduit avec
une seringue par passage de l’aiguille à travers
la pastille. L’injection se fait dans un tube Fig 3
cylindrique en verre (Liner) chauffé à une T°
qui dépend de la nature de l’éch. Cet injecteur
permet aussi de l’introduction des gaz avec des
seringues appropriées.
b) Vanne d’injection: Fig 4
Les gaz sont injectés au moyen d’une vanne
spéciale à 6 voies qui assure la reproductibilité de la
quantité injectée. Fig 4

a: position de balayage ou de chargement de la

boucle
b: position d’injection des gaz dans la col. en
tournant la vanne de 60°.

Pour les liquides, les vannes d’injection sont surtout

utilisées en chromato. automatique industrielle.

c) Injecteur pour solides:

Le solide est introduit dans une capsule métallique ou en
verre placée dans la partie chaude de l’inj. Le perçage ou
la brisure de la capsule permet l’analyse de la partie
volatile.

d) Injecteur automatique pour liq.:

C’est un automate muni d’un passeur d’éch. qui assure:

•le rinçage et le remplissage de la seringue dans les flacons
contenant les éch.,
• l’injection à travers la pastille,
•la reproductibilité des volumes injectés.
AUTOSAMPLER
 e) Injecteurs pour colonnes capillaires:
Dans les colonnes capl., la ϕS est sous forme de
film ou de couche mince. Il en résulte une
efficacité élevée, des analyses rapides mais un Fig 5 fuite
facteur de capacité très petit (saturation de la
colonne).
Dans les colonnes à remplissage, les masses
injectables sont de l’ordre de 0,1 à 1 mg. Pour
les capillaires, elles ne sont plus que de 0,01 ou
0,001 mg (éviter la saturation). Il est évident
Split/splitless: Principe:
qu’aucune seringue ne permet de telles
injections. On est par conséquent conduit à • fuite fermée
utiliser un système à division de flux (injecteurs • introduction échantillon: ~3µl
split pour les éch. concentrés et splitless pour les • transfert de +/- 95% (∆t)
dilués) qui permet de ne diriger sur la colonne • ouverture fuite pour purger
qu’une fraction du produit injecté et le reste
s’échappe par la vanne de fuite ou de split Fig 5. Effet de la purge d’injection
f) injecteurs on-column avec purge injection
Ce sont les plus populaires actuellement pour les 20 s après
l’injection
colonnes capillaires classiques.
A l’aide d’une seringue (Dext de l’aiguille métallique est
de 0,23 mm), on injecte l’échantillon dans une zone sans purge
refroidie de la tête de colonne.
On utilise environ 5 µL de solution dans un solvant qui
sera éliminé avant que le produit lui-même ne soit
volatilisé dans la colonne. C8 C7 C6 C5 C4
temps
Avantages:
* une bonne reproductibilité de
l’injection,
* une moins grande exposition de
l’échantillon à des températures élevées,
* la suppression des effets du septum,
quelquefois indésirables.

II-3 Colonnes:
Cerveau du chromatographe: siège des séparations
On distingue deux types de colonnes:
à remplissage et capillaires.
Colonne à remplissage:
C’est un tube en métal, verre ou en téflon. Elle
contient un matériau de grande surface spécifique.
Ce remplissage est soit:
•Un support inerte imprégné par une ϕ.S liq.
•Un adsorbant poreux
 La variation de sa longueur Lc, de son diamètre interne dc, du type du support et de la
teneur de la ϕ.S conduit à une variété de colonnes:
Analytique: séparation des petites quantités 0.1 à 1 µl
Préparative: séparation et purification de grandes qtés. de substances.
Capillaires: ϕ.S déposée sur la paroi interne de la col. grande
perméabilité, haute efficacité et faible perte de charge.

dans les capillaires, on trouve:

* Les colonnes PLOT (Porous Layer Open Tubular) ont une fine couche d’adsorbant inorganique
ou organique revêtant la paroi interne;
* Les colonnes WCOT (Wall Coated Open Tubular) leur paroi est enduite par un film de phase
stationnaire;
* Les colonnes SCOT(Support Coated Open Tubular) présentent une fine couche de support
imprégné de phase stationnaire.

Toutes ces colonnes capillaires présentent un canal central largement ouvert, donc: une faible
perte de charge pour le passage du gaz vecteur et une efficacité élevée (jusqu’a 3 000 plateaux
par mètre) et un rapport de phase β élevé.
 La capacité des colonnes capillaires
Spécification* dc [mm] N/m capacité [ng]
Microbore 0,10 7000 < 20
Minibore 0,18 5000 20 à 100
Narrow bore 0,25 3500 100 à 500
Wide bore 0,32 3000 500 à 1000
Megabore 0,53 1500 1000 à 5000
* adapté de J&W Scientific

Par rapport aux colonnes remplies, les colonnes capillaires présentent une évolution spectaculaire.
Les facteurs les plus importants qui ont contribué à leur développement sont :

• l'utilisation du tube en silice fondue

• les nouvelles méthodes de silanisation pour la désactivation, le greffage et la réticulation de films de
phase stationnaire.

Cela a conduit à :
• une sensibilité et une reproductibilité plus grandes
• une perméabilité jusqu'à 400 fois plus grande, celle-ci permet l'utilisation de colonnes beaucoup plus
longues sans perte de charge excessive et les temps de rétention sont largement réduits
• La pression à l'entrée est sensiblement la même qu'à la sortie de la colonne.
• La vitesse optimale du gaz vecteur qui correspond au minimum de la HEPT peut être maintenue sur
toute la longueur de la colonne.
• le terme A de l'équation de Van Deemter n'existe pas. La courbe du diagramme de la HEPT en fonction
de la vitesse du gaz vecteur est abaissée.
Capillaire remplie (micropacked) :
Elles sont remplies de granulés de très petits diamètres (quelques micromètres)
avec une longueur généralement de quelques mètres au maximum.
Leurs propriétés sont comprises entre celles des Col. remplie et
des col. capil.

Principales caractéristiques des colonnes

Colonnes Colonnes à remplissage Colonnes capillaires

analytiques préparatives classiques remplies

Lc 0.5 à 60 m 2à6m 10 à 100 m 0.25 à 10 m

Dc 2 à 6 mm 6 à 500 mm 0.1 à 0.75 mm 0.5 à 1 mm
HEPT 0.5 à 1 mm 1 à 5 mm 0.1 à 0.5 mm 0.2 à 0.5 mm

V ϕ.m/V ϕ.s 10 à 100 5 à 20 100 à 1000 100 à 1000

Qté. Inj. 0.1 à 1 µl 1 mg à 10 g 0.1 à 1 µg 1 à 10 µg

Pour réduire la perte de charge inévitable du fait de la longueur de la col., il faut avoir des col. de
grande perméabilité Bo. Pour une col remplie, la perméabilité est donnée par la relation Kozeny
Carman:

dp: diamètre des particules cm BPo = d p2 . ε 3

ε : porosité interparticules
180 ( 1 _ ε ) 3
Pour des remplissages usuels, ε ≅ 0.4 le gaz occupe 60% du volume de la colonne
Bo ≅ 10-3.dp2
La perte de charge augmente avec les fines particules pour une longueur de col et un débit donnés

Granulométrie (mesh) dp (mm) Bo.10-7 (cm2)

80-100 0.15-0.177 1.96
35-42 0.35-0.42 9.54
28-32 0.50-0.59 21

Perméabilté des col remplies de chromosorb type P non imprégné de Φ.S

Le diamètre des col est généralement choisi en fonction des raccords existant sur l’injecteur et le
détecteur, souvent 1/8 de pouce (6.35 mm) pour le FID et 1/4 de pouce (3.175 mm) pour le TCD.
 Calcul du rapport de phase β des colonnes capillaires

On peut déduire que le temps d'analyse (tr) augmente si :

- le diamètre intérieur de la colonne capillaire (d) diminue

- l'épaisseur du film de phase stationnaire (e) augmente.

En outre s'il n'y a aucune affinité entre un produit et la phase stationnaire soit K=0, on a tr = tm , ce qui est le cas de
l'air ou en première approximation du méthane.

On peut déduire que :

- pour bien analyser une substance volatile, il faut augmenter k', donc diminuer le diamètre (d) de la colonne et (ou)
augmenter l'épaisseur du film de phase stationnaire (e).
- pour bien analyser une substance peu volatile, il faut diminuer k', donc augmenter le diamètre (d) de la colonne et
(ou) diminuer l'épaisseur du film de phase stationnaire (e).
 Applications des rapports des phases β différents
Rapport des Phases β Substance
< 100 en phase gazeuse, très volatile, bas poids moléculaire
100 -500 typique pour les applications CG pour les substances volatiles
> 500 grand poids moléculaire, peu volatile

β des colonnes capillaires

dc [mm] µm]
Épaisseur du film (e)[µ
0,1 0,3 0,5 1,0 3,0 5,0
0,10 250 83
0,18 450 150 90
0,25 625 208 125 62
0,32 800 267 160 80 27 16
0,53 1325 442 255 132 44 27
Les grandeurs chromatographiques
 Phases chromatographiques et applications

Noms courant de la phase Nature de la phase Applications T° de

fonctionnement
SE30, BP1, CPsil5CB, DB1, Non polaires DMSi Produits pétroliers, 280-320
OV1 SBP1 esters d’acides gras

SE54, SPB5, CPsilar8CB, Légèrement Polluants organiques 280-320

DB5, Ultra 2 polaires: 5% divers
diphényl
OV17, CPsil19, CP2250, Moyennement Produits actifs, Produits 250-2080
DB17, HP17 polaires, 50% chlorés, phénols
phényl
Carbowax, PEG20M, BP20, Polaires Esters d’acides gras 200-240
DBWax, CW20MC, Polyehylèneglycols insaturés
Superox Sucres
 II-3 Détecteurs:

Il délivrent un signal permettant de repérer le passage d’une substance sortante de la

colonne.
On distingue:
-des détecteurs dont la réponse est proportionnelle à la [soluté]: catégorie 1 comme le catharomètre,
- des détecteurs dont la réponse est proportionnelle au débit du gaz vecteur: catégorie 2 comme le
dét. à ionisation de flamme.

a) Détecteur à conductibilité thermique TCD ou catharomètre:

C’est le dét. le plus répandu, simple, universel et sensible au gaz permanents et

inorganiques: He, N2, O2, CO, CO2, NO, NO2, NH3, H2O, H2S, SO2,…

Principe:

la conductibilité thermique d’un matériau est son aptitude à transmettre la chaleur. Le TCD est formé
d’un bloc métallique thermostaté (± ±0.1°C) et des cavités à travers lesquelles circule le gaz vecteur. Le
TCD mesure la différence de cond. thermique entre les filaments de référence tjs balayé par le GV pur
Fig 7: et ceux placés dans l’autre cavité relié à la sortie de la colonne. Ces deux éléments sont placés sur
un pont de weastone. La grande sensibilité est mesurée lorsque les cond. Thermique du GV et du soluté
sont très différentes. Le tableau ci-dessous montre qu’il est préférable d’utiliser H2 ou He comme GV.
 Gaz H2 He N2 Ar butane EtOH C6H6

Conductibilité. 54.3 41.6 7.5 5.2 5.6 5.3 4.1

Therm.
Cal/cm.s.deg. 105

Fig 7
Thermal Conductivity Detector

b) Détecteurs à ionisation de flamme FID

C’est le plus utilisé pour l’analyse des composés organiques. Il est très sensible et
possède un grand domaine de linéarité.
Principe: les fluents de la colonne pénètrent
dans une flamme de combustion (H2/air).
Les composés organiques élués formes des
ions qui sont collectés au moyen de deux
électrodes. Fig 8.

Fig 8

Inconvénients: il est destructif et très peu sensible au gaz permanents et

inorganiques: He, N2, O2, CO, CO2, NO, NO2, NH3, H2O, H2S, SO2,
CH2O(formol), CHOOH (acide formique),…

c) Détecteur à capture d’électrons:

Il est sélectif, sensible et très utilisé.

Principe:
Une source radioactive 63Ni émettant des particules β permet d’ioniser le GV traversant
la cellule où sont placées deux électrodes qui créent un champ électrique. Fig 9
Une grande quantité d’e- est issue de la collision des particules ß avec les molécules du GV.
B + N2 N+2 + e- + B*
Si un composé ayant une forte affinité pour les e- est élué, il en capte au passage ce qui
entraîne une chute du courant

Fig.9 Détecteur à capture d’électrons

e) Détecteur thermoionique (NPD):

Il est sélectif pour les composés contenant des atomes N ou P, très sensible pour l’analyse des
traces.

Principe: Il est dérivé du détecteur FID et se distingue par la présence d’une pastille de sel
alcalin (césium ou rubidium ) dans la flamme entretenue par chauffage électrique. Cette
pastille libère des électrons susceptibles d’entrer en réaction avec des composés azotés ou
phosphorés. Puis il y a collection des ions formés et amplification du courant d’ionisation. La
sensibilité est très élevée.
f) Balance de densité des gaz
C'est un détecteur du même ordre sensibilité que le catharomètre à filaments, universel, et
non destructif. Il est le seul détecteur dont la réponse puisse être calculée à partir des
formules chimiques des solutés qui le traversent. Pour ces raisons, il est utilisé dans les
analyses industrielles en ligne.

Principe:
Le G.V pur pénétrant dans le détecteur est
divisé en deux flux a1 et a2 qui passent sur des
filaments de catharomètre. Le gaz sortant de la
colonne est divisé également en deux flux b1 et
b2.

Tant que le gaz vecteur seul passe il y a équilibre thermique.

La balance est placée dans la position verticale: un soluté plus dense que le gaz vecteur
accroît le débit dans la partie inférieure, donc déséquilibre des filaments et un courant est
noté dans le pont de Wheatstone.
Pour un soluté moins dense que le G.V, on aurait l’inverse.
*
La réponse de la balance à densité est proportionnelle à : M i -M 0
M0
Mi: masse moléculaire du soluté envisagé,
Mo: masse moléculaire du gaz vecteur.
 Tableau: Propriétés de quelques détecteurs

III- Matériaux de la séparation chromatographique

La colonne contient un lit continue et homogène de granulés, soit de produit

adsorbant ou de produit inactif (support) imprégné d’un film mince de liquide lourd à faible
ϕ. S). Pour obtenir des col. performantes, il faut que l’équilibre GV/Φ
tension de vapeur (ϕ ΦS se
fasse rapidement: le film de ΦS sur le support doit être fin, stable et uniforme avec une
grande surface spécifique.

III-1 Support:
Ce sont des matériaux inertes vis-à-vis des solutés et de granulométrie de 0.2 à 0.3 mm de
diam. (si dp diminue le terme A de l’équation de Van deemter diminue et N augmente).

On trouve dans le commerce tous les types de supports, vendus sous des noms de code, dans lesquels
figure l’indication du traitement de purification qu’ils ont subi pour éliminer les matières organiques, les
impuretés métalliques, etc.
 Il s’agit de:
* support naturel, poreux à base de diatomite (chrmosorb P ou W ou G qui diffèrent par
leurs densités et leurs couleurs,…),
* support artificiel poreux type billes de silice (Sphérosil, Porasil,…)
* support non ou peu poreux (billes de verre ou en téflon PTFE, carbone graphité,…)

Caractéristiques des supports

Type du support Granulométrie Surface spécifique Densité de remplissage

mesh m2 /g g /ml

Chromosorb W 80-100 1.0 0.25

Chromosorb P 80-100 4.0 0.45
Chromosorb G 80-100 0.5 0.66
Gas Chrom Q 100-120 - 0.35
Spherosil 125-150 0.013 0.51
Teflon 40-60 11 0.49
Carbopack A 60-80 15 0.67
Carbopack B 60-80 90 0.24

Granulométrie dp HEPT Perte de charge pe-ps

Ce tableau montre l’influence de la du support (Lc=3m, He 7cms-1)
Moy des
granulométrie sur l’efficacité
particules
et la perte de charge
30-35 mesh 0.5 mm 3 mm 0.2
80-100 mesh 0.167 mm 1 mm 2.3
 Ainsi: une col. remplie d’un support. 80-100 mesh est 3 fois plus efficace qu’une col remplie d’un
support 30-35 mesh par contre la perte de charge proportionnelle à dp2 augmente rapidement lorsque
les particules deviennent plus fines.
Pour obtenir des colonnes d’excellentes performances (HEPT petite et faible perte de charge), il faut
utiliser des supports ayant une granulométrie fine et resserrée (grains de dimensions très proches) avec
un faible rapport dc/dp

III-2 Phases stationnaires:

III-2-1. ϕ. S. liq: Ce sont des liq. lourds (molécules à longues chaînes

ou polymères) qui sont déposés en couches minces sur chaque grain du support ou sur la paroi
interne d’une colonne capillaire. Fig 10). La φ.S doit offrir une affinité différente aux divers
composés de l’échantillon.

Fig 10

Section d’un grain de support imprégné de phase

stationnaire

Les solubilités des solutés dans la ϕ. S sont fonction des forces d’interaction (polarité,
liaison hydrogène, interaction chimique,…).
Les phases les plus répandues sont les polymères
siliconés dérivés du diméthyl polysiloxane
caractérisé par une bonne inertie chimique et une
très bonne tenue à la température jusqu'à 300°C.

phase stationnaire dérivée du diméthyl polysiloxane.

Elle est greffée sur la paroi en silice par l'intermédiaire une liaison -O-Si-O-.
Selon le pourcentage de groupement R par rapport aux groupes CH3, on peut modifier la polarité de
la colonne et donc ses propriétés chromatographiques:

Si R= CH3 , la colonne est complétement apolaire et sépare les produits suivant leur point
d'ébullition (noms commerciaux : DB-1, OV101, SE-30...)

Si le % de R= Phényle à 5%, on a la colonne la plus utilisée en CPG, les noms commerciaux sont:
DB5, CPsil5, OV5...

Si on incorpore un substituant cyanopropyle (R=-CH2-CH2-CH2-CN) la polarité augmente (fort
moment dipolaire du groupe -CN). Ce sont les phases DB 1701, CPSil 18...

Il existent d'autres phases beaucoup plus polaires à base de polyethylène glycol.

HO-(-CH2-CH2-O-)n-O-(Silice)

Elles sont greffées sur les parois en silice de la colonne par l'intermédiaire d'une liaison Si-O-C
Les dénominations commerciales de ces phases sont: Carbowax, DB-wax, CP wax 52.
Ces phases sont utilisables entre 20° et 250°C, elles sont moins inertes que les phases siliconées, elles
sont en particulier très sensibles à l'oxygène.
 Les phases stationnaires les plus courantes et classées dans l’ordre de polarité croissantes sont:

* Hydrocarbures apolaires:
-Squalane (polarité = 0)
- (0-120°C) C32H64

-C87 50-200°C: hydrocarbure ramifié en C87

-Apiézon L 50-220°C: mélange d’hydrocarbures ramifiés et peu d’aromatiques

* Silicone:
-SE30 (30-350°C), OV1 (100-350°C), OV101 (0-325°C)
sont de très faible polarité formule:100% méthylsilicone

Mêmes propriétés pour: SE31, SE33, SE96, DC11, DC200, DC330

-SE et XE: General Electric, DC: Dow Corin, OV: Ohio Valley, SP: Supelco, Silar,
DB: J&W Scientific, CB: Chrompack
 -SE52 (50-330°C) Formule: 5 méthyles pour 1 phényle
Si Si Si O
Les équivalents sont: DC550, DC710 O
O
O
n

-OV17 (0-300°C) 50% méthyl 50%phényl silicone Formule:

Apllication: biomédicale, sucre,… Si
O O
Les équivalents sont: DC704, DC710, SP-2250
n

C2H4-CF3
- OV210 (0-275°C) 50% méthyl Si Si Si
Si
50%trifluropropyl silicone Formule O O
O
C2H4-CF3 n

C2H4-CN
- XE60 (50-275°C) 75% méthyl 25%cyanopropyl
silicone Si Si Si Si
O O
O
n
- OV 275 (50-25-25°C) silicone à plus forte C2H4-CN
teneur en cyano,. C’est l’une des phase les Si Si Si Si
plus polaires existantes O O
O
n

* Polyéhtylène glycols:
O
-carbowax20M (70-220°C), carbowax1540, carbowax400, HO nH

carbowax600, …

* Polyesters:
-EGA(100-200°C) poly(éthylèneglycol adipate)
DEGS(100-200°C) poly(diéthylène glycol succinate)

* TCEP(20-150°C) 1,2,3-tris(2-cyanoéthoxy)propane, phase de CH2 O CH2 CN

polarité extême.
CH O CH2 CN
Formule
CH2 O CH2 CN
 III-2-2. f. s. solide:
En chromatographie gaz-solide, on utilise les forces d’attraction des constituants du
mélange vis-à-vis de produits solides, généralement poreux, sur lesquels ils sont adsorbés,
puis désorbés par l’entraînement du G.V.

Parmi ces adsorbants, on distingue: charbon actif, graphite, alumine, tamis moléculaire,
copolymères et billes de verre poreuses. Ils doivent être activés de temps à autre par
étuvage, car leurs sites d’adsorption se saturent, notamment par l’humidité
atmosphérique.

Quand faut-il utiliser la chromato gaz-solide?

-Analyse des gaz permanents;
-Analyse des composés très polaires en particulier les composés fortement associés (hydroxylés
ou aminés);
-Chromato à haute température (spécificité des adsorbants inorganiques; la f.S liq crache à
haute température (bleeding));
-Séparation d’isomères: sur surface plane du graphite, une molécule plane est plus retenue
qu’une molécule non plane, moins plaquée sur la surface.
 III-3 Remplissage des colonnes: Fig 11
Colonnes garnies:

On mélange une quantité connue du support avec une

solution volatile (éther, pentane,…) contenant une φ. s
de concentration bien déterminée (taux de pontage 5 à
30% massique).
Le remplissage s’effectue en introduisant en petite
quantité de ce mélange ( ou un adsorbant) dans un tube
relié à une source de vide et à un vibreur. Fig 11.

Colonnes capillaires: Vibreurs pour remplissage de colonnes

La technique dépend de la nature de colonnes PLOT,

SCOT ou WCOT. Le tube le plus séduisant est la silice
fondue, car il offre le moins de risques de sites chimiques Fig 12
pouvant intervenir dans les analyses, il est plus facile d’y
fixer les phases stationnaires.
Il faut d’abord nettoyer le capillaire et préparer la paroi
en augmentant sa mouillabilité et/ou sa surface spécifique
et en la désactivant. Puis, on introduit la Φ.S en solution
dans un solvant très volatil soit en remplissant tout le
tube de la solution, soit en entrant simplement un petit
volume qui forme un index, puis on pousse lentement à
Une méthode de remplissage
l’aide d’un gaz inerte et la phase choisie se dépose sur la
des colonnes capillaires
paroi par drainage et par suite de l’évaporation du
solvant (fig. 12).
 Comparaison des colonnes capillaire et remplie

A titre comparatif, cette figure montre que le pouvoir de

séparation des colonnes capillaires (N=100000) est
beaucoup plus grand que celui des colonnes remplies
(N=4000).

Chromatogrammes de l'huile "d'iris des marais" obtenus (en

haut) sur une colonne capillaire de 50 m et (en bas) sur une
colonne remplie de 4m.

Intérêt de la programmation de température

Cette figure illustre deux chromatogrammes d'un mélange

d'alcanes linéaires C10-C18, avec deux modes de fonctionnement
différents la température de la colonne du chromatographe.

1- Mode isotherme (chromatogramme de gauche), les produits

légers ne sont pas séparés et les produits lourds "traînent" sur la
colonne

2- Mode en programmation de température (chromatogramme de

droite), tous les produits sont séparés.
 Cours M ster
(ChemBioNat)

CHROMATOGRAPHIE EN PHASE LIQUIDE A HAUTE

PERFORMANCE (HPLC) (Appareillage)
Introduction
Chromatographie liquide

Efficacité ou résolution augmente lorsque la taille des particules de phase

stationnaire dp diminue

Depuis le début de l'histoire des techniques HPLC ( les années 1960), dp

a diminué progressivement. Aujourd'hui, le diamètre excède rarement
µm (dp minimal 3.5 µm, en 2002, dp=1.7 µm).
10µ

Domaines d’applications de l’ HPLC:

la pétrochimie, l’environnement, la pharmacie et fluides biologiques, produits
alimentaires et agroalimentaires, l’analyse de composés inorganiques et de
polymères
Tous les modes de séparation (adsorption, partage, échange ionique,
exclusion moléculaire, affinité, chiralité, etc) sont transposables de façon
intégrale à la HPLC (la phase stationnaire doit résister à l'effet de la pression)

Choix d'un mode de séparation (Rappel)

Il est choisi en fonction de la taille des composés à séparer et de la solubilité
des échantillons.

Le choix se fait aussi en :

- étudiant la nature des composés à séparer et leurs propriétés;
- consultant la littérature existante en rapport avec le problème à résoudre;
- communiquant avec les représentants des fournisseurs de matériel de
chromatographie.
Choix du mode de séparation en fonction de la nature de l'échantillon
APPAREILLAGE

Un appareil de chromatographie en phase liquide comporte:

un ou des réservoir(s) pour le solvant ou la phase mobile, une ou

plusieurs pompe(s) et un dispositif de mesure de la pression, un
dispositif d'injection, une colonne remplie de phase stationnaire, un
détecteur et un système d'enregistrement du signal du détecteur.

Schéma d’un appareil à

chromatographie en phase liquide

Toutes les parties en contact avec la P.M sont construites d'acier inoxydable
(résistent aux solvants organiques et peut supporter une pression continue sans
problème). Le volume entre le point d'application de l'échantillon et le détecteur
doit être le plus faible possible. La tubulure, en HPLC, est donc la plus courte et
la plus fine possible.
Le dégazage de la P.M est obligatoire en
chromatographie liquide. Il se fait par
barbotage d’Hélium dans la phase mobile ou
dégazages aux ultrasons.
Dans les nouveaux appareils ce dégazage se
fait en plaçant un bout de tube poreux
contenant la phase mobile dans une enceinte
où on fait le vide. Seuls les gaz peuvent

s’échapper par les pores du tube. Module de dégazage

sous vide.

POMPES
Les pressions d'opération en HPLC se situent, en général, entre 25 et 400
bars. Elles dépendent de la longueur de la colonne, de la taille des particules
de phase stationnaire, de la viscosité de la phase mobile et de son débit. Elles
sont générées par la pompe dont le rôle est de forcer le passage de la phase
mobile dans la colonne avec un débit constant.
Débits utilisés : 0,1-2 mL/min
Les pompes à piston alternatives : faible
volume interne et utilisable avec des
gradients d’élution
La figure montre le schéma d’un système de
pompage à deux têtes en opposition et où les
pistons sont commandés par une came de
façon à obtenir un débit sans pulsations

II existe deux modes d'élution:

- isocratique où l'éluant est de composition fixe;

- par gradient où l'éluant est de composition variable.
Cet éluant : mélange de 2 à 4 solvants dont les proportions peuvent changer pendant
la séparation.
L’élution graduée est utilisée pour la séparation de mélanges complexes et permet, en
modifiant la composition de l’éluant, d’optimiser les valeurs des facteurs de capacité
et, par là, de réduire la durée des analyses tout en limitant la dispersion des bandes
de solutés (gain en détectabilité).
Le changement dans les proportions des solvants peut être linéaire, concave
ou convexe et même comporter des régions isocratiques.

Exemple: mauvaise résolution en début

de chromatogramme

Si la résolution est mauvaise en fin de chromatogramme, on augmentera la force d’élution au

début et on la diminuera à la fin
INJECTEUR
Les P élevées en tête de
colonne : impossibilité d’une
injection par seringue à travers
un septum comme en CPG.
position load
Injection à l’aide de vannes à
boucle d’échantillonnage
(Vanne 6 voies)

2 positions load et inject:

Remplissage de la boucle
d’injection avec V fixé (5-500
µL).

Envoi de l’échantillon sur la

colonne avec le circuit (pompe, position inject
boucle, colonne).
Filtration de l’échantillon :
On utilise souvent un système de filtration de porosité inférieure à 0,5 µm pour fixer
les micro particules qui pourraient colmater la colonne, ce système de filtration peut
être intégré au circuit H.P.L.C entre injecteur et colonne, mais on peut aussi procéder
en amont en filtrant l’échantillon avant injection.
On utilise alors une seringue pour pousser l’échantillon à travers un filtre de très
faible porosité dont la nature dépend du solvant utilisé (aqueux ou purement
organique) , une fois l’échantillon filtré on procède à son injection.
On protège ainsi également l’injecteur qui peut être obstrué par des particules
insolubles.
Le volume injecté est constant: travail en étalonnage externe pour une
analyse quantitative.
Avantages:

- injections répétées qui donnent des résultats très

reproductibles et donc adaptés aux analyses;
- ne comporte pas de septum;
- peut supporter des pressions qui dépassent 100 bars.

Désavantages: la boucle doit être changée si le volume injecté

doit être modifié.

COLONNES

Tubes en inox de longueur L = 10 à 25 cm

dcol = 4,6 mm le plus courant
dp = 3 à 10 µm
N = 40000 à 60000 plateaux/m
 On place souvent des pré-colonnes qui
font office de filtres ; elles ont un dp
supérieur et protègent la colonne des
impuretés
Col. Remplie
Di= 50 µM
On utilise aussi des
micros colonnes
Avec L = 3 à 7,5 cm
dp = 3 à 5 µm di: 70 µM
- économie de solvant;
- produits utilisés en
quantité réduite;
- temps de séparation
beaucoup plus courts Col. Remplie
di=1000 µM

Support Support polymère

silice polystyrène-
divinylbenzène
(PS-DVB)
Structure du silica gel
L'application très répandue du mode de chromatographie en phase
inversée RP est associé aux avantages suivants:

♦ les F.S résistent à la contamination par le matériel polaire;

♦ les F.S répondent rapidement à tout changement de composition de
la P.M;
♦ le mode de séparation est exploitable sur une plage étendue de
polarité, ce qui permet à des échantillons complexes comportant de
nombreux composés polaires ou non polaires d'être sépares
efficacement;
♦ le mode de séparation peut être étendu à la séparation d'espèces
chargées en utilisant, par exemple, l'appariement ionique;
♦ le mode de séparation permet généralement une analyse rapide et
procure des résultats plus reproductibles que les autres modes de
séparation en chromatographie liquide.
Désavantage

- la plage des pH utilisables se situe entre 2 et 7,5 pour des

phases stationnaires liées à la silice car à pH>7,5, il y a
dissolution de la silice;
Groupement Structure Application
fonctionnel
Alkyle -CH3 Phase inversée
-C4H9 reversed phase ou RP
-C8H17
-C18H37
Phényle -C6H5 Phase inversée

Cyano -(CH2)3CN Phase normale et inversée

Aminé -(CH2)3NH2 Phase normale et inversée

et échangeur ionique
faible
Acide sulfonique -(CH2)3SO3- +H Échangeur cationique fort
-C6H4SO3- +H
-(CH2)3C6H4SO3- +H
Acide -(CH2)3OCH2COO-+H Échangeur cationique
carboxylique -(CH2)3COO-+H faible
-(CH2)3C6H4CH2COO-+H

Diméthylamine -(CH2)3N(CH3)2 Échangeur anionique faible

Aminé -(CH2)3N+(CH3)3 Échangeur anionique fort

quaternaire
Le développement de supports polymériques a
permis de surmonter les difficultés associées à
la présence des groupements silanols et aussi à
élargir la plage de pH de façon à pouvoir faire
des séparations avec une gamme de solvants
beaucoup plus étendue
résines échangeuses d'ions
Propriétés de quelques gels utilisés en chromatographie d'exclusion moléculaire

Gel µm)
Dp (µ Limites d'exclusion (g/mole)

Sephadex G-75 fin 40-120 3000-8000

Bio-Gel P-4 150-300 800-4000
Sepharose 6B 45-165 10000-4000000
Bio-Gel A-15m 150-300 40000-15000000

Stockage des colonnes : Type de colonne Solvant de stockage

Les colonnes non utilisées doivent être C1, C2 , C6, C8, C18, phényle Méthanol
Bouchées imprégnées avec un solvant
approprié pour éviter un assèchement Silice, CN, NH2, PAC, Diol Héxane ou méthanol
très néfaste. DEAE, CM, SAX, SCX Méthanol

Détecteurs

Dispositifs pour déceler la présence des composés séparés et en

permettre la mesure quantitative.

Un bon détecteur : une très grande sensibilité et la capacité de détecter

la présence de tous les éluants de chromatographie
Caractéristiques d’un détecteur

bruits conditionnant la détectabilité ;

dérive, due à la variation de la température,
de la composition de la phase éluante et l’usure
de la source lumineuse ;

sensibilité au débit de la phase éluante et à la
pression dans la cuve de détection;

domaine de linéarité de la réponse et
concentration minimale détectable

sensibilité ; c’est la pente de la partie linéaire
de la courbe d’étalonnage ;

temps de réponse ; c’est le temps nécessaire
Ch : limite supérieure du domaine de linéarité
pour que le signal passe de 10 à 90 % de la ( concentration de la solution du soluté
réponse; fournissant une réponse correspondant à un

quantité minimale détectable ; c’est la plus écart à la linéarité de 5 %),
Cmin : concentration du soluté donne un signal
petite quantité du soluté qui soit détectable après égal à 3 fois le bruit de fond)
injection dans la colonne chromatographique.
 Détécteur spectrophotomètrique UV-visible
Il mesure l'absorption de la lumière par le produit à la sortie de la colonne.
Il existe plusieurs :
* Détecteur à λ fixe : vapeur de Hg (254 nm)
* Détecteur à λ variable
* Détecteur à barrettes de diodes gamme de 190 à 800 nm « détecteur
intelligent » ( mesure et stockage des spectres UV ou visibles des espèces
éluées puis leur comparaison à ceux d’une bibliothèque).

Pour que ce type de détecteur soit utilisable, il faut que :

* le produit à détecter absorbe la lumière à une longueur d'onde accessible à
l'appareil, et que son coefficient d'absorption ε soit suffisamment grand
•la phase mobile n'absorbe pas la lumière à la longueur d'onde choisie par
l'opérateur.

Loi de Beer-Lambert : A = D.O = log (I0 / I) = ε l C

où A est l'absorbance, D.O la densité

optique, Io l'intensité lumineuse incidente, I
l'intensité lumineuse transmise, ε le
coefficient d'extinction molaire
caractéristique de la substance étudiée, l
l'épaisseur traversée en cm et C la
concentration en mol.L-1.
 Détecteur réfractomètrique

Il mesure la variation de l'indice de réfraction du liquide à la sortie de la

colonne. On compare cet indice avec celui de la phase mobile pure :
une référence d'où le terme de variation de l'indice.
Ce détecteur exclut les variations de la composition de la phase mobile ;
il n'est donc possible de travailler qu'en mode isocratique .
Il est sensible mais, il dépend néanmoins de la température du liquide
(Contrôle de la température indispensable à ± 0,1 °C )
La réponse Ri du réfractomètre au soluté i est donnée par la relation :
Ri = Z ( ni - n0)
avec Z constante caractéristique de l’appareil,
ni : indice de réfraction de l’effluent (soluté + éluant) qui sort de la colonne,
n0 : indice de réfraction de la phase éluante.
 Détecteur fluorimétrique

Plusieurs composés sont capables d'absorber de l'énergie lumineuse et de

restituer cette énergie par émission d'un rayonnement de longueur
d'ondes supérieure à celle du rayon absorbé. Ceci constitue le principe
à la base de la détection par fiuorimétrie.

If=k.Iabs= k(Io – I)
Pour une faible concentration et une faible épaisseur traversée
If ≅ 2.3 k.Io ε.l.C = a.C

Les détecteurs fluorimétriques sont donc très sensibles et sont

particulièrement utiles dans la détermination des éléments à l'état de
traces de l’ordre de quelques femtomoles (10-15 mole) injectées .
Détecteur ampérométrique
Il mesure la conductivité de la phase mobile càd le courant associé à
l'oxydation ou à la réduction des solutés qui peuvent être oxydés ou réduits
à une électrode portée au potentiel adéquat (ampérométrique).
C’est le cas en chromatographie d’échange d’ions, de paires d’ions où l’on
utilise des phases éluantes naturellement conductrices, et souvent en
chromatographie de partage à polarité de phases inversée..
Le courant it, qui circule dans la cellule à l’instant t est :

Q = neFNm Donc: It= neF(Ci _ Cf)D

ne : nombre d’électrons mis en jeu dans la réaction

électrochimique
F : constante de Faraday,
Nm : nombre de moles de substance transformées.
Ci : concentration de la substance électroactive à
l’entrée de la cellule (mol.L-1),
Cf :concentration de la substance électroactive à la
sortie de la cellule (mol.L-1),
D: débit de liquide à travers la cellule (L.s-1).
Principe d’un montage de détection
électrochimique
Ce tableau résume les principales caractéristiques des principaux
détecteurs utilisés en chromatographie liquide.
Certains fabricants d'appareils HPLC commercialisent des systèmes
équipés de détecteurs sophistiqués qui combinent plusieurs modes de
détection, exploitables de façon indépendante ou simultanée. Il est donc
possible, en fonction de la nature du matériel analysé, de choisir le
mode de détection qui s'avère le plus approprié.

Les détecteurs en chromatographie liquide

 F- ANALYSE QUALITATIVE ET
IDENTIFICATION

I-Identification par les grandeurs de rétention figure 1

Indices de rétention de Kovàts (1958)

Les indices de rétention proposés par Kovàts (1958)
sont fondés sur la relation linéaire constatée entre le
logarithme du volume de rétention spécifique Vg et
le nombre d’atomes n de carbone du soluté dans
une famille de produits homologues. Exemple:
hydrocarbures saturés aliphatiques (figure 1)

figure 2
Log(Vg)=a.n+b

Cette relation n’est vérifiée qu’à partir de C4

ou C5. Elle n’est vraie qu’en
chromatographie isotherme et isobare
Chromatogramme d’un mélange
(figure 2)
d’hydrocarbures paraffiniques (n-alcanes)

Ce procédé est actuellement supplanté par celui des indices de rétention.

Pour calculer l’indice de Kovats d’un soluté X, celui-ci a préféré la comparaison à deux
hydrocarbures (parafines) normaux dont les pics encadrent celui du soluté figure 3.

figure 3
Le calcul l’indice de rétention Ix peut se faire
graphiquement ou, par la formule :

[log(t')x
- log(t')z ]
Ix = 100[ + 100z
log(t')z +1 - log(t')z ]

avec t’: temps de rétention réduit, x: soluté

inconnu, z: paraffine à z atomes de carbone et Ix est égal au nombre d’atomes de
z+ 1: paraffine à z+ 1 atomes de carbone. Ces carbone de leur chaîne, multiplié par 100.
deux dernières paraffines encadrant le soluté x
La température de la colonne est constante

Dans le cas de la chromatographie à température programmée, on

remplace les logarithmes des temps de rétention par les
températures de sortie des pics considérés :
 Choix d’une phase stationnaire

Comme nous l’avons vu au Chap III, il ∃ un large éventail de φ.s. On trouve sur la fiche
technique des fournisseurs ses T° limites et sa polarité (Cte de Mc Reynolds). Cette constante
permet de caractériser une φ.s par comparaison des indices de Kovats des composés témoins
de structures différentes sur cette φ.s avec leurs indices sur la squalane (Référence).

Cte Mc Reynoldes = ∆I = I φ.s - Isqualane

Le tableau suivant montre les ∆I des composés de structures variées utilisés pour
caractériser des φ.s. La somme des ∆I définit la polarité globale de la φ.s testée.

L’ordre de polarité dépend de la substance de référence choisie.

Exemples: * l’OV17 est plus polaire que le dioctylphtalate ∑∆ ∆I=884 au lieu de 831; il
retarde les composés à double liaison ∑∆ ∆I= 119 au lieu de 92; par contre les alcools sont
∆I=186) que sur OV17 (∆
plus retenus par le dioctylphtalate (∆ ∆I=158).

* Pour séparer un hydrocarbure aromatique d’un mélange contenant des cétones, on

utilise une colonne telle que: ∆I benzène soit assez différent de ∆I méthypropylcétone càd
QF-1 ou OV210 ou Silar5-CP

La valeur élevée d’une constante de McReynolds signifie que la phase stationnaire en

question retarde sélectivement les fonctions chimiques du même groupe.
 les ∆I des composés de structures variées

∆I

φ.s X’ Y’ Z’ U’ S’
Benzène 1-butanol méthylpropy nitropropane pyridine Σ∆I
Σ∆
lcétone
Squalane 0 0 0 0 0 0
Apiézon L 32 22 15 32 42 143
SE-30 15 53 44 64 41 217
OV-1 16 55 44 65 42 227
OV-101 17 57 45 67 43 229
SE-52 32 72 65 98 67 334
Dexsil-300 47 80 103 148 196 474
DC-550 74 116 117 178 135 620
dioctylphtalate 92 186 150 236 167 831
OV-17 119 158 162 243 202 884
QF-1 144 233 365 463 305 1500
OV-210 146 238 358 468 310 1520
XE-60 204 381 340 493 367 1785
Carbowaw 20M 322 536 368 572 510 2308
Silar 5-CP 219 495 446 637 531 2428
Carbowax 1540 371 639 453 666 641 2770
EDSS-X 484 710 585 831 778 3388
Silar 10-C 523 757 659 942 801 3682
OV-275 781 1006 885 1177 1089 4938
II Identification par les méthodes de comparaison

II-1 Méthode des empreintes digitales

Sans avoir besoin d’identifier chacun des pics d’un

chromatogramme, une comparaison de celui-ci pris dans
son ensemble avec un étalon permet de vérifier l’identité
d’un complexe.
Exemple: l’authenticité d’un jus de fruit (vrai ou imité)
(fig.5), d’un spiritueux (alcoolisé), d’une matière grasse
animale ou végétale, etc.

Cette méthode est fréquemment utilisée par le

service des fraudes, contrôlant les produits Fig 5 Exemple d’empreintes digitales :
laitiers, des matières grasses, des parfums, des aromagramme de bananes
flaveurs,... Le contrôle peut se contenter de
l’absence ou de la présence de tel pic.
 II- 2 Utilisation des détecteurs sélectifs.

Certains détecteurs ne répondent qu’à des substances de familles données ou ont une
sensibilité considérable pour celles-là.

On peut utiliser ce fait pour faciliter l’identification des pics en montant en parallèle un
détecteur universel et un détecteur sélectif (figure ci-dessous).

Néanmoins, on n’a ici qu’une indication et non une identification formelle.

Comparaison de chromatogrammes
obtenus avec deux détecteurs
différents montés en parallèle
 III Identification par processus réactionnel

Il s’agit d’identifier les solutés par l’examen des résultats de réactions qu’on leur fait subir
dans le flux de l’appareil, entre l’injection du mélange à analyser et le détecteur.

III-1 Utilisation d’une pré-colonne réactionnelle

But:
Facilité l’analyse des produits complexes ou des mélanges en les simplifiant en des
solutés légers plus simplement identifiables ou bien en retenant certains d’entre eux.

Ex: dans un mélange de gaz permanents, on peut soustraire le CO2 ou le NOx par une
pré-colonne de tamis moléculaire ou adsorber l’eau par une pré-colonne .

On peut utiliser des systèmes soustractifs en se servant d’un « anneau de soustraction »

garni de réactif chimique convenable déposé sur un support.
Ex:
- L’eau transformée en acétylène ou en H2.
- Hydrogénation des composés éthylénique sur une pré-colonne catalytique;
- Hydrolyse des organométalliques par H3PO4
- Décarboxylation d’acides par l’acide phosphorique;
- Oxydation catalytique qui permet l’analyse élémentaire du soluté sous la forme de
CO2, N2, SO2 et H2O
 III-1 Méthodes pyrolytiques

La pyrolyse concerne des composés peu ou pas du tout volatils dans les conditions
chromatographiques; comme les polymères que l’on fragmente par élévation de la température en
produits volatils analysables sur colonne. La pyrolyse permet leur décomposition en monomères
ou à des structures de masses molaires plus élevées (dimères, trimères) mais identifiables.
Les pyrolyseurs placés entre l’injecteurs et la colonne ou dans l’injecteur sont sous forme de
nacelle ou de cuve mais plus fréquemment, on réalise une « pyrolyse éclair ou flash pyrolysis » à
l’aide d’un filament avec un courant de forte intensité. Les produits du craquage sont entraînés
par le G.V dans la colonne.
La comparaison des pyrogrammes de la substance étudiée à les étalons (méthode des empreintes
digitales) permet l’identification des pics.

Pyrochromatogramme d’un
polymère de type poly(sulfure
de phénylène) obtenu par pyrolyse
éclair à 600 oC montrant les
composés spécifiques du
polymère.

Remarque: Le couplage du chromatographe à une technique physico-physico-chimique d’analyse

permet d’identifier et d’étudier tout ou une partie des pics formés.
 IV- Couplage de la CG avec d’autres techniques physico-
physico-chimiques
d’analyse
Pénétration directe des effluents sortant de la colonne chromatographique dans
un autre appareil sans discontinuité

Permettre une identification moléculaire avec des seuils de détection très faibles, de l’ordre
de quelques nanogrammes et sur une plage de masse étendue qui va des petites molécules
jusqu’aux macromolécules.

Les techniques susceptibles de couplage avec la chromatographie sont limitées par les impératifs
suivants :

— le temps de dépouillement par la technique complémentaire doit être au plus égal au temps
de sortie du pic chromatographique (moins de quelques secondes pour les colonnes capillaires) ;

— la technique complémentaire doit pouvoir faire abstraction de l’importante quantité de gaz

vecteur qui dilue le soluté ;

— la technique complémentaire doit fournir un moyen de repérage du produit analysé.

 IV-1 Chromatographie en phase gazeuse/spectrométrie de masse (CG/SM)

but: Couplage CG/SM par

l’intermédiaire d’interfaces
permettant l’enrichissement en
soluté du flux gazeux pénétrant
dans l’analyseur à la sortie de la
colonne.

Les difficultés de ce type de couplage sont:

•Les pressions différentes à l’intérieur de la colonne chromatographique et dans l’enceinte du
SM;
•la synchronisation du temps qui mesure la largeur du pic chromatographique en sortie de
colonne avec celui requis pour l’enregistrement du spectre de masse;
•L’existence de plusieurs types de spectromètres de masse: analyseurs à temps de vol,
analyseurs à résonance cyclotronique et traitement des signaux par transformée de Fourier
(TF-MS), analyseurs magnétiques, quadripolaires ou à trappage d’ions.

Interfaces CG/SM

Pour les colonnes à remplissage ou les colonnes macrocapillaires, on peut

monter, entre le chromatographe et le spectromètre, un séparateur moléculaire qui
soustraira sélectivement une partie de gaz vecteur à la sortie de la colonne.
 Deux types sont proposés:
a) Séparateur de jet de Becker et Ryhage:
le principe est fondé sur la grande diffusibilité de l’hélium ou de
l’hydrogène. À la sortie de la colonne, le jet de gaz diverge rapidement alors que les
molécules de soluté sont pratiquement projetées intégralement dans la tubulure
d’entrée du spectromètre.

Séparateur de Becker et Ryhage

b) Séparateur à membrane de Lewellyn et Littlejohn
Le principe est fondé sur la différence de perméabilité des molécules
organiques de soluté et des molécules inorganiques de gaz vecteur au travers d’un
caoutchouc silicone.
L’inconvénient principal de ce système provient de la limitation de température
d’utilisation imposé par la membrane elle-même : entre 75 et 250 °C.

Séparateur de Lewellyn et Littlejohn

Les colonnes capillaires (diamètre interne de 0,25 mm), qui sont les
plus efficaces pour les séparations chromatographiques, peuvent être raccordées
directement sans l’aide d’un séparateur (introduction directe dans la source de
l’analyseur). Il reste néanmoins des cas où l’on peut utiliser un système
d’enrichissement sélectif de soluté par rapport au gaz vecteur.
Exemple: couplage GC-MS

Cette figure présente un

chromatogramme de 2
isomères: octadécène 1
(A) et n-octadécane (B),
ainsi que les spectres de
masses tracés pour
chacun des deux pics. Les
2 composés ont le même
indice de rétention.
Le couplage de ces deux
techniques est un outil
d’identification
extrêmement puissant.

Couplage chromatographe en phase gazeuse/ spectromètre de masse (à

impact électronique)
I-2 Chromatographe en phase gazeuse/spectromètre infrarouge (CG/IRFT)

Le couplage entre un CG et un spectromètre d’absorption infrarouge avait un double

handicap:
• manque de sensibilité, surtout en phase vapeur;
• durée prohibitive d’obtention des spectres (couramment plusieurs minutes).

Couplages discontinus avec piégeage des solutés entre deux lames (cellule pour le
spectromètre)

1967: apparition d’un spectromètre infrarouge à balayage rapide, capable de tracer un

spectre en quelques secondes.

Branchement de la cellule à gaz du spectromètre directement sur la sortie de la colonne.

 Problème: La faible résolution du spectromètre et sa faible sensibilité limitaient son
emploi à quelques applications bien spécialisées.

Solution: spectromètre infrarouge à transformée de Fourier, capable de tracer un spectre

bien résolu par seconde, pour des quantités de substances aussi faibles que 100 ng.

Actuellement, les chromatographes sont reliés en sortie de colonne au spectromètre par

l’intermédiaire d’une tubulure simple.

La tubulure doit répondre aux conditions suivantes :

• avoir un volume mort faible,
•permettre les réflexions multiples du faisceau
infrarouge;
• avoir une transmittivité élevée.
C’est généralement un tube de verre plaqué or,
avec des fenêtres en KBr.

Tubulure d’assemblage chromatographe en phase gazeuse/spectromètre infrarouge

 Inconvénients des tubes de liaison:
• limite d’emploi en température, 250 °C au maximum,
• risques de décomposition catalytique des effluents à leur contact.

Solution: techniques de piégeage intermédiaire en ligne ou par utilisation de la technique du flux

interrompu (stop-flow chromatography) ou par utilisation d’un collecteur cryogénique.

Couplage chromatographe en
phase gazeuse/ spectromètre
infrarouge
 G- ANALYSE QUANTITATIVE

Cette analyse est essentiellement une méthode comparative basée sur le fait que l'aire des pics
chromatographiques est proportionnelle à la concentration ou à la quantité de produit analysé.

Une fois identifiés le ou les solutés présentant un intérêt dans le chromatogramme, celui-ci
permet l’analyse quantitative grâce à la relation : mi=KiAi
mi: la masse du soluté i injecté, Ai: l’aire du pic, Ki: le coefficient de proportionnalité

Il est donc nécessaire de mesurer les aires des pics et de déterminer, pour chaque soluté,
le coefficient de proportionnalité Ki .

mesure de l’aire des pics.

On utilise essentiellement la triangulation manuelle et

l’intégration automatique.

On peut assimile le pic à un triangle soit en traçant les

tangentes aux points d’inflexion de la courbe et en
calculant l’aire: Ai = ½H’.ωω , soit en mesurant la largeur
δ
à mi - hauteur et en calculant l’aire par: Ai = H.δ
L’intégration se fait surtout par méthode mécanique, ou mieux électronique et informatisée.
Quand les pics sont très pointus et très étroits, on peut se contenter des mesures des hauteurs
H , alors proportionnelles aux aires.

Coefficient de proportionnalité

Les seringues d’injection ne permettent pas de repérer le volume d’échantillon avec une
précision suffisante.

Pour calculer Ki, on aura donc recours à des méthodes d’étalonnage, qui, comme en
analyse qualitative, feront de la chromatographie quantitative un procédé relatif vis-à-
vis de substances connues.

1 Normalisation interne ou 100% normalisé

On mesure les aires de chacun des pics du
chromatogramme A1...An, correspondant
aux solutés de masses m1...mn Le
pourcentage i en masse de l’un quelconque
des soluté Si est obtenu par :

(%) i = KiAi × 100

∑ KiAi
Cette méthode implique toutefois que tous les composés du mélange soient élués avec une
résolution satisfaisante et qu’ils aient été détectés et que leurs coefficients de réponse aient été
déterminés dans les mêmes conditions que l’analyse. Il est donc impossible d’utiliser la
normalisation interne pour l’analyse d’un mélange inconnu.

Méthode de l'étalonnage externe ou méthode des

injections comparées
Elle est utilisée essentiellement en HPLC

L’étalonnage externe est basé sur la

comparaison de deux chromatogrammes
(étalonnage et analyse, ou de deux séries de
chromatogrammes) effectués successivement p = Ki
dans des conditions chromatographiques
invariantes, qui maintiennent bien constant le
coefficient de proportionnalité Ki de la relation :
mi = K Ai.
Droite d’étalonnage: On réalise l’injection d’un volume reproductible des solutions étalons
contenant des masses me connues du composé à doser et on mesure les aires Ae
correspondants. D’où le coefficient de réponse du composé à doser.

On injecte un volume rigoureusement identique à l’injection précédente de l’échantillon

contenant une masse mA inconnue du composé à doser A. Le pic élué a une aire AA

mA = KAA K est connu %(masse) de A =mA/M . 100 M: masse de l’échantillon

 La précision des résultats dépend : des pesées de la substance de référence et de
l'échantillon, des dilutions et de la reproductibilité du volume de l'injection
( remplissage total des boucles d’injection).

2/ Méthode d’étalonnage interne

Elle est utilisée essentiellement en CPG

Dans cette méthode, on compare

individuellement chacun des pics à évaluer
au pic d’une substance étalon E,
convenablement choisie, introduite en
proportion connue dans le mélange à
analyser.

On calcule donc la réponse de chaque soluté concerné par rapport à l’étalon E. La

méthode est générale, valable même si tous les constituants n’ont pas donné de pic
sur l’enregistreur. Elle est précise et reproductible. Elle suppose néanmoins le choix
d’un étalon qui, outre la nécessité de ne pas chevaucher avec les autres solutés, doit
donner un pic de valeur de rétention proche de celle du constituant à mesurer, d’aire
approximativement égale à celle du pic du soluté à doser, et dont la réponse doit se
situer dans la zone de linéarité du détecteur utilisé.
 Une solution étalon est préparée avec le ou les produits que l'on veut doser. Les masses sont
connues m’1, m’2, … et me des composés à doser et de l'étalon purs; à ces masses
correspondent les aires A’1, A’2, …, A'e, sur le chromatogramme.
Dans l'échantillon contenant les masses m1, m2, … de solutés on ajoute me de l'étalon, ce qui
donne les aires A1, A2, Ae.
On obtient :
m'1 = K1 A’1 ; m'2 = K2 A’2 ; me = Ke A'e avec Ki coefficient de proportionnalité

Le coefficient de proportionnalité de i relatif à l’étalon e est: K ie = K i = m'i A'i

K e me A'e
Toutes ces données sont connues d’où la valeur de Ki/e

Dans l'échantillon inconnu on aura : m1 = K1 A1 ; me = Ke Ae

m1 = K1 A1 = K1/ e A1 me, k1/e, A1, Ae sont connus d’où la masse m1.

me K e Ae Ae

Pour avoir plus de précision, nous seront amener à préparer plusieurs solutions étalons pour
déterminer le coefficient de proportionnalité de relatif Ki/e à partir de la pente de la droite
d’étalonnage et traçant : mi Ai
= f( )
me Ae
La précision de cette méthode dépend uniquement de celle des pesées ; elle ne dépend pas (à la
différence de la méthode par étalonnage externe) de la précision des dilutions ni du volume
injecté.
 Cours M aster
(ChemBioNat)

METHODOLOGIE DE L’ANALYSE ET
OPTIMISATION CHROMATOGRAPHIQUE
 I - Choix des paramètres de l’analyse

Deux situations différentes

Mélange totalement Produit sur lequel on a des

inconnu (complexe) renseignements
Tâtonnement pour avoir Ex: fabrication dans
une séparation l’usine
satisfaisante

Raisonnement rigoureux:
Moins de temps possible pour la mise au point de l’analyse
 I-1 Conditions opératoires

Large éventail des conditions pour le choix d’une certaine

colonne et un certain remplissage

En règle générale: Pour la G.L, on commence avec une

colonne dont la polarité de la Φ.S est voisine de celle des
solutés principaux contenus dans le mélange à séparer

Si le mélange est inconnu: on commence par une colonne polaire

ou faiblement polaire. Il est recommandé de travailler avec
un FID usuel pour la CG et à T° de col. Constante.

Amélioration des
Un chromatogramme ± complexe conditions
* Pics mals séparés près de l’injection:
l’injection:
abaisser la T°
T° col., changer le remplissage

* Pics trop séparés à la fin de l’analyse:

l’analyse:
Isotherme 45°C
monter la T°
T° col, changer le remplissage

Isotherme 145°C
* Présence à la fois des pics mals
séparés près de la l’injection et très
écartés par la suite:
suite:
Programmation T° 30-180°C
utiliser une programmation
de température ou de débit,

•Pics avec des traînées:

traînées: remplissage pas assez polaire par rapport au soluté
ou support actif vis-
vis-à-vis du soluté.
Augmenter le taux d’imprégnation du support par la F.S.;
 * Pics présentant un front diffus:
diffus: augmenter la T°T° inj. ou augmenter
la volatilité par dérivatisation (voir plus loin), diminuer la qtté
injectée ou augmenter le taux de la Φ.S.

* Chromatogramme présentant un grand nombre pics mals résolus avec

une col. remplie:
remplie: utilisation d’une col. capillaire;

* Des traces à identifier sortant dans la trainée de pics qui les précèdent:
précèdent:
inverser l’ordre de sortie

A éviter Souhaitable
 II – Technique d’échantillonnage et de préparation des
échantillons

Analyse: l’échantillon doit être

représentatif du produit étudié

II-1 cas des gaz:

Le prélèvement se fait par:
•Un système de dérivation qd on travaille en ligne (usine)
• une boucle d’injection
• une seringue à gaz

II-2 Cas des vapeurs (flaveurs)

Recherche de la composition des odeurs (flaveurs)

Utilisation de la technique de head space (espace de tête)

qui concentre les vapeurs
Le produit est introduit dans un pilulier
fermé par une capsule d’élastomère, on
porte ensuite à une T° choisie puis on
prélève à l’aide d’une seringue à gaz au
travers de l’élastomère.

Analyse d’une flaveur après

concentration par la méthode de
II-3 Solides et liquides l’espace de tête

a) L’adjonction d’un solvant très volatil peut faciliter l’injection

des produits liq et de certains solides dont la T° sub très élevée

Inconvénient: présence du pic qui sature la colonne

Solution: technique splitless (chap III)

b) Dérivatisation: réaction quantitative des constituants du
mélange à analyser avec un réactif choisi qui donne des composés
volatils.: Diminution de la T°éb.
Méthylation, silylation, trifluoroacétylation

EX: - Les acides gras sont difficilement analysables par CPG

Solution: préparation des esters méthyliques des acides gras par le mélange
méthanol-BF3(12,5% p/p)

Ces esters méthyliques donnent des chromatogrammes remarquables.

Renseignements que doit fournir une analyse chromatographique: FICHE TECHNIQUE

Échantillon:
Nom, état, Solvant, concentration de la solution, Masse ou volume injecté,
Moyen d’introduction
Chromatoraphe: marque, modèle
Colonne: Lc, Dint, nature tube forme
Remplissage: nature, granulométrie, support Φ.S, taux imprégnation (g/100g
support), épaisseur du film,…
Détecteur: nature et caractéristiques, conditions d’utilisation
Injecteur: nature et caractéristiques,
Enregistreur: marque, caractéristiques
Conditions opératoires:
* Température: injecteur, colonne, détecteur
* Gaz porteur: nature, débit à la sortie, pressions d’entrées et de sortie
* Programmation:
-de T°: T° initiale, durée, vitesse de montée, T° finale, durée
-de débit: débit initial, durée, programme de débit
* Analyse qualitative: durée de l’analyse, ordre de sortie des pics, rétentions
relatives, indice de rétention,…
* Analyse quantitative: système de mesure utilisé, étalonnage, coefficients de
réponse
III- OPTIMISATION D'UNE SÉPARATION CHROMATOGRAPHIQUE
III-1 Le triangle des compromis
Triangle des compromis CPG HPLC
Trois critères contradictoires sont exigés
pour mener à bien une analyse
chromatographique :
•la résolution (critère de séparation),
•le temps d'analyse (critère de rapidité)
• la sensibilité (critère de quantité à
injecter ).

Si on porte l'accent sur un critère (un sommet du triangle ou de la pyramide), les 2 autres
sont automatiquement défavorisés, ainsi :
-Si on privilégie la sensibilité, il faut souvent injecter une grande quantité de produit, la colonne se
sature, la résolution chute et le temps d'analyse augmente

-Si le temps d'analyse est privilégié, on utilise des colonnes courtes et la résolution chute.

- Si on favorise la résolution, on utilise une colonne plus longue et de plus faible diamètre
intérieur, on peut injecter moins de produit ce qui fait diminuer la sensibilité et
augmenter le temps d'analyse.

Les trois paramètres sont donc à optimiser. Le centre du triangle (pyramide) des compromis
correspond à une situation moyenne
 III-2 Définition des paramètres à optimiser

•Température de l’injecteur est déterminée à partir de la température des solutés.

∆G
. La température de la colonne suit la loi de Van’t Hoff : ln K = −
RT

β: rapport de phases

∆G est la différence d'énergie libre de dissolution du soluté S entre les 2 phases

log Vr ' =
∆H
∆ H
+ cte
∆H
∆ H
log tR ' = + cte‘
RT RT

La résolution

Il est important dans une analyse chromatographique d'obtenir une bonne séparation des
produits. C'est à dire des pics étroits et séparés, caractéristiques d'une bonne résolution
 La résolution est donnée par la formule de Purnell

α = t'rB/t'rA et k' =k/B

Pour accroître R, on peut augmenter l’un quelconque des trois Facteurs: sélectivité, la rétention
des solutés ou la efficacité de la colonne.

Le temps d'analyse:

Le temps d'analyse correspond à l'élution du dernier pic du chromatogramme, il est donc

assimilé à ce temps de rétention ta= trB.
Le temps de rétention (tr) dépend du facteur de rétention (k') et du temps mort (tm):
tr = (1+k')*tm
Comme tm *u = L où u est la vitesse de la phase mobile et L la longueur de la colonne.

comme L= NH

avec la formule de Purnell tr se présente comme suit :

Cette expression est approchée, car h est fonction de u, mais si u>>uopt l'équation de Van
Deemter: h = A + B/ū + C.ū montre que (h/u) est à peu près constant.
h

Knox

uopt ν)
ū (ν
Cette expression et celle de Purnell dépendent donc du même jeu de 3 paramètres α, k' et N.

Pour conduire l'optimisation, on fera varier chaque paramètre indépendamment des 2 autres
pour déterminer leur influence respective sur ta et sur R.

Quantité à injecter
La quantité de soluté qui peut être injectée dans une colonne varie avec les différents types
de chromatographie. On peut définir deux termes Q0 et Qs:

Q0 : quantité minimum détectable (pour avoir un rapport signal sur bruit S/N=3). Ce
paramètre dépend essentiellement de la sensibilité du détecteur du chromatographe.

Qs : la quantité maximum (à saturation) injectable. Ce paramètre est fonction des

caractéristiques de la colonne

En CPG, Qs est proportionnel à la longueur (L) et au rayon de la colonne (r) ainsi qu'à
l'épaisseur du film de phase stationnaire (e).
 α)
III-3 Optimisation par le facteur de séparation (sélectivité) (α

Influence sur la résolution

Si on augmente le facteur de séparation α, c'est à dire la différence d'énergie libre de
dissolution δ(∆G)
δ(∆ entre les deux produits, la résolution augmente. la séparation
n’est possible que si α est différent de l’unité. α est toujours supérieur à 1.

RT ln α = -(∆
∆G°(B) - ∆G°(A))

En théorie, de faibles variations de α au voisinage de 1 peuvent entraîner de grandes variations

de la résolution.

Lorsque α est proche de 1, on a

Variation de la résolution
en fonction de α
Influence de α sur la Résolution
de 2 pics (k' et N sont invariants)

La résolution double si α varie entre 1,11 et 1,25.

En pratique , la sélectivité elle peut être modifiée :
— en changeant la nature et la composition de la phase mobile (HPLC);
— en changeant la nature de la phase stationnaire
— en modifiant la température.
En HPLC, on utilise le triangle de sélectivité de Snyder pour
optimiser la composition d’une phase éluante constituée par
un mélange ternaire de solvants appartenant à trois groupes
de sélectivité différents.

Ils sont toujours utilisés en mélange avec un solvant de

base dépourvu de propriétés sélectives et dont le rôle est
de fixer les facteurs de capacité des solutés dans une
gamme convenable.

La recherche de la phase mobile optimale consiste à effectuer, dans un premier temps, sept
essais avec des phases éluantes binaires, ternaires ou quaternaires conduisant sensiblement à la
même durée d’analyse et dont les compositions sont numérotées 1 à 7 sur la figure.

Les chromatogrammes 1, 2 et 3 sont effectués avec des φ.m constituées par un mélange de
chacun des solvants sélectionnés avec le solvant de base dans des proportions telles que la durée
de la séparation soit sensiblement constante quelles que soient les résolutions. On réalise
ensuite les chromatogrammes correspondant aux φ.m 4, 5 et 6 obtenues par le mélange
équivolumique des mélanges binaires précédents pris deux à deux. Enfin le chromatogramme
no 7 correspond à un mélange quaternaire obtenu par le mélange équivolumique des mélanges
binaires 1, 2 et 3. La φ.m optimale peut ensuite être obtenue après estimation visuelle des
résolutions correspondant aux 7 chromatogrammes tests, ce qui nécessite quelques essais
complémentaires (souvent 2 ou 3) ou à l’aide d’une méthode informatisée utilisant une fonction
de réponse chromatographique.
 Influence sur le temps d'analyse
N= 1600 et k' =3

Variation du temps d'analyse en fonction de α

Le temps d'analyse est extrêmement sensible au paramètre α si il est inférieur à 1,5, il augmente
énormément si α diminue.
Si α passe de 1,5 à 1,1 le temps d'analyse est multiplié par 13,4. S’il passe de 1,05 à 1,01, le ta est
multiplié par 23. Les diminutions du facteur de séparation α se payent donc cher en temps
d'analyse lorsqu’il est trop petit.
En revanche lorsque α est supérieur à 2, le temps d''analyse est relativement insensible à ce
terme.

Pratiquement. Lorsque α est proche de l'unité, cela signifie que la différence d'énergie libre
de dissolution entre les 2 produits est trop faible, il faut donc augmenter α. On peut:
1- soit changer la composition de la phase mobile en HPLC (impossible en CPG)
2- soit prendre une phase stationnaire différente: changer de colonne.
3- en CPG, diminuer la température, car lnα α = -(G°(B) - G°(A))/ RT
 III-4 Optimisation par le facteur de rétention K’

Influence sur la résolution

β).
k' est proportionnel à la constante d'équilibre (coefficient de distribution) K. (k' =K/β

Influence de k' sur la Résolution de 2

Variation de la résolution en fonction de k'. pics ( et N sont invariants)

La courbe montre que la résolution croit avec le terme k'. Comme le terme k'/(1+k') plafonne
vers 1, les gains de résolution deviennent négligeables lorsque k' devient supérieur à 5.
Une valeur de k' comprise entre 5 et 10 entraîne donc une résolution (presque) maximum.
 Influence sur le temps d'analyse

Variation du
temps
d'analyse en
le terme y=(1+k')3/k'2 est
fonction de k'
minimum pour k'=2 puis il
croit lentement lorsque k'
augmente

l'asymétrie de la courbe montre que des valeurs de k' inférieures à 1,5 sont plus
préjudiciables (pas bons) à la rapidité de l'analyse que des valeurs de k' supérieures à 2.

Dans le cas de mélange complexe, en HPLC, où les produits les plus retenus ont des valeurs
de k' trop élevées, on a intérêt à changer la composition de la phase mobile en cours
d'élution de telle sorte que pour chaque soluté la valeur de k' soit optimale. En revanche, si
k' augmente trop, le temps d'analyse devient important.
Cette figure montre l’optimisation de la
séparation de cinq solutés aromatiques (1-5)
par chromatographie de partage à polarité
de phases inversée.
les bandes critiques ont été tracées en
fonction de la composition de la phase
éluante (mélanges ternaires eau-méthanol-
acétonitrile) et pour une résolution égale à
1,6.
le chromatogramme obtenu pour le mélange
ternaire optimal a une la résolution entre
tous les pics adjacents supérieure à 1,6.
Les compositions de phase éluante
correspondant à un chevauchement, même
partiel, des bandes critiques conduisent à une
résolution inférieure à la valeur choisie 1,6.

En CPG, k' est souvent >20, son influence sur la résolution est donc minime.
En revanche en HPLC où k' est plus petit, on peut jouer sur ce terme pour le placer
dans l'intervalle 2-10. k' = 5 étant la valeur "idéale"
Pratiquement, faire varier le facteur de rétention k' revient à:
1- En HPLC changer la phase mobile de manière à faire varier le coefficient de partition K des
produits à séparer (car k' =K/β β ). On peut ainsi changer le solvant pour que k' soit dans
l'intervalle optimum 1-5. (utilisation des gradients de solvant)
2- En CPG et HPLC, changer la phase stationnaire de manière à faire varier le coefficient de
partition K des produits à séparer.
3- En CPG et HPLC faire varier la quantité de phase stationnaire (en CPG augmenter
l'épaisseur du film e dans une colonne capillaire)
β = 4Ke/d).
4- En CPG , faire varier le diamètre intérieur (d) de la colonne (car k' =K/β
∆H/RT +C)
5- en CPG, faire varier la température (car ln(k') = -∆

III-4 Optimisation par le nombre de plateaux théoriques (N)

Influence sur la résolution

La résolution croît seulement comme la racine carrée de l'efficacité (N)

Ainsi augmenter l'efficacité d'une colonne, pour améliorer la séparation de deux produits, ne
donne pas toujours les résultats favorables attendus.
Par exemple en CPG, si on double la longueur d'une colonne, on multiplie le nombre de
plateaux théoriques donc son efficacité par deux, mais la résolution ne sera améliorée que par
un facteur (2)½=1,414
 Influence sur le temps d'analyse

Le temps d'analyse est proportionnel à N et à la longueur L de la colonne, il est multiplié

par 2 si on double la longueur de la colonne.

Pratiquement, on peut augmenter l'efficacité d'une colonne, c'est à dire le nombre de

plateaux théoriques N en effectuant les manipulations suivantes :
1- En HPLC diminuer la granulométrie du support de la phase stationnaire.
2- En CPG et HPLC, augmenter la longueur (L) de la colonne

III-5 Optimisation par la vitesse de la phase mobile (u)

Influence sur la résolution

La courbe de Van Deemter donne la dépendance de H avec u.

Cette courbe montre que l'on pas intérêt à trop diminuer le débit de phase mobile au dessous
de la valeur optimale uopt, car H augmente rapidement et la résolution R se détériore (via
N) pour des valeurs faibles de u.
En revanche, on a parfois intérêt à se placer à une vitesse de phase mobile supérieure à la
valeur optimale (u >uopt) car si la pente de la courbe est plus faible des variations de u
conduiront à des valeurs acceptables de H, N et donc R.
 uopt = √(B/C) et Hopt = A + 2√BC et Nopt = L/Hopt
Cas particulier des colonnes capillaires :
A= 0 d'où uopt = √(B/C) et Hopt = 2√BC
donc Nopt =L/2 (√BC)

En HPLC, on peut augmenter beaucoup plus qu'en CPG la vitesse de la phase mobile (u >uopt)
sans trop de dommage pour la résolution.

Influence de la vitesse de la phase mobile sur le temps d'analyse

tr = tm(1 + k’) = (1+K’) L/u

Si (u >uopt), H augmente relativement peu avec u (presque pas en HPLC) mais par contre
le temps d'analyse ta= tr décroît ce qui peut être très intéressant.

Pratiquement, on peut augmenter l'efficacité d'une colonne, en jouant sur le débit de la phase
mobile en effectuant les manipulations suivantes:
1- En CPG et HPLC, changer la vitesse de la phase mobile (u) pour atteindre u optimale, sur la
courbe de Van Deemter,
2- En HPLC, il faut toujours avoir une vitesse de phase mobile supérieure ou égale à u optimale.
 UNIVERSITE CADI-AYYAD
FACULTE DES SCIENCES & TECHNIQUES
GUELIZ – MARRAKECH

Travaux dirigés de chromatographie ChemBioNat 2

Série 0
Exercice 1:
Trois composés A, B et C sont chromatographiés par CCM sur plaque de silice.
L’éluant utilisé est l’hexane.
c) Si l’éluant est remplacé par de
l’acétone, comment évolueraient les
valeurs de Rf des composés?
d) Si on remplace la plaque de silice par
une plaque d’alumine, quels seraient les
changements des rapports frontaux?

(Les gels d'alumine présentent un nombre de

groupements actifs par unité de surface plus
a) Déterminer le rapport frontal Rf des élevé que la silice. Ils sont peu utilisés, si ce n'est
composés A, B et C. dans le cas de la séparation des hydrocarbures
b) Quel composé (A, B, ou C) est le plus polyaromatiques).
polaire? Justifier.

Exercice 2:
Vous essayez de déterminer le bon
système de solvants à utiliser pour une
CCM, afin de séparer les composés X, Y
et Z. Vous déposez vos trois composés et
utilisez un mélange hexane/acetate
d’ethyle 95:5 comme éluant. Le résultat
est représenté par le schéma suivant:
Comment pourriez-vous changer le
système de solvants afin d’améliorer la
chromatographie?

Exercice 3:
Les composés suivants sont séparés par chromatographie liquide/solide sur gel de silice:
CH3COOCH3, CH3CH2CH3, CH3CH2COOH. Déterminer l’ordre d’élution.

Exercice 4:
La figure ci-après représente le résultat de la scannérisation d’une plaque de CCM en phase normale
(phase mobile: hexane/acétone 80:20). Les trois composés ont pour structures A, B et C.
a) Attribuer à chaque pic de l’enregistrement le composé qui lui correspond.
b) Quel serait l’ordre d’élution des composés A, B et C sur une colonne HPLC contenant le même type
de phase stationnaire et la même phase mobile?
c) Quel serait l’ordre d’élution des composés A, B et C sur une colonne HPLC contenant une phase de
type RP-18 avec comme éluant un mélange acétonitrile/méthanol (8:2)?
d) Calculer le Rf du composé qui migre le plus rapidement sur la plaque.

Exercice 5 :
Un mélange de deux composés A et B conduit après migration à deux tâches aux caractéristiques
suivantes (distance de migration x et diamètre du spot w):
xA=27mm wA=2mm
xB=33mm wB=2.5mm
La migration du front de solvant dans cette expérience est de 60mm.
a) Calculer Rf, N et H pour chacun des composés.
b) Calculer le facteur de résolution entre les deux composés A et B.
c) Etablir la relation entre le facteur de sélectivité et le Rf des deux composés.
Calculer sa valeur numérique.
 UNIVERSITE CADI-AYYAD
FACULTE DES SCIENCES & TECHNIQUES GUELIZ – MARRAKECH

Travaux dirigés de chromatographie Master ChemBioNat (Série 1)

Exercice 1
Pour séparer un mélange de protéines, on utilise une colonne comportant une phase
stationnaire à base de cellulose (R-CH2COOH). Le diamètre interne de la colonne est de 0,75 cm et
sa longueur 20 cm. Le volume mort est 3 ml. Le pH de la phase mobile est ajusté à 4,8 et son débit à
1ml/min,. Sur le chromatogramme, on note trois pics correspondant aux volumes de rétention 12, 18
et 34 ml.
a/ S’agit-il d’une phase anionique ou cationique ?
b/ Calculer les coefficients de distribution des trois composés.
c/ Calculer la durée de l’analyse et prédire si ce temps va être augmenté ou diminué en élevant le
pH de la phase mobile. Justifier votre réponse

Exercice 2 :
Une colonne de filtration sur gel a un rayon r de 0.80 cm et une longueur l de 20 cm.
a) Calculer le volume de la colonne.
b) Le volume Vi de la phase mobile en dehors des particules du gel est de 18.1 ml et le volume total de la
phase mobile est de 35.8 ml. Déterminer le coefficient K pour un soluté élué à 27.4 mL.

Exercice 3:
Le volume de rétention d’une protéine ayant une masse moléculaire de 120 000 sur une colonne
de gel ayant une limite d’exclusion de 80 000 est de 1,5 mL. Le volume de rétention du naphtalène
(M=128g/mol) sur la même colonne est de 124 mL. Un troisième composé a un volume de rétention de
87 mL. En supposant que le naphtalène possède une masse moléculaire juste inférieure à la limite
d’exclusion du gel, déterminer le volume total des pores et le coefficient de distribution pour le
troisième composé.

Exercice 4:
On veut séparer un mélange de polymères dont on connaît les masses moléculaires MM par
chromatographie de perméation de gel. (Phase stationnaire : sephadex et le débit = 5 ml/min).

MM 2 000 000 1 040 000 390 000 110 000 10 200 3 100 680 380
TR (min) 26,5 26,9 28,8 31,3 36,4 39,3 42,8 43,0

a) Calculer les volumes d’élution VR correspondants.

b) Tracer la courbe d’étalonnage (Log MM = f(VR))
c) Calculer les volumes des pores et des interstices (sur le graphique), en déduire le volume mort de la
colonne.

Exercice 5:
Les coefficients de partage entre l’eau et l’hexane pour deux composés M et N sont
respectivement 6,01 et 6,20 (KD = CH2O / CHexane ). Les deux composés sont élués par l’hexane sur
une colonne compacte remplie de gel de silice, à la surface de laquelle est adsorbée de l’eau. Le
rapport de phase pour le remplissage est 0,422.
a) calculer le facteur de capacité pour chacun des solutés
b) calculer le facteur de sélectivité
c) Combien de plateaux sont nécessaires pour obtenir une résolution de 1,5 ?
d) Quelle doit être la longueur de la colonne si la HEPT est 2,2.10-3 cm ?
e) Si la vitesse u de la p.m dans la colonne est de 7,10 cm/min, combien de temps faut il pour éluer
les deux composés ?
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FACULTE DES SCIENCES & TECHNIQUES
GUELIZ - MARRAKECH

Travaux dirigés de chromatographie N° 3

Exercice 1
Soit une courbe de V.D. expérimentale, colonne entre A et B (NB/NA ).
obtenue en HPLC, [ Int .Lab 30, 20 Conclure. Est-il souhaitable de faire
(2000)]; en ordonnée est reportée la l'analyse au point A ou point B?
hauteur de plateau réduite h = H/dp
(où dp = 5 µm est le diamètre des
particules.
On considère deux points particuliers A
et B sur cette courbe .
1- Au point A (débit = 1 ml/mn, U =
0,65 mm/s et h = 2), calculer le temps
mort et le temps d'analyse.
2- Même question au point B (débit =
2,75 ml/mn, U = 1,7 mm/s et h = 2,5).
3- Calculer la perte d'efficacité de la

Exercice 2 calculer sa constante de partition K dans

L’analyse CPG des arômes contenus cette analyse. Conclusion
dans une barre chocolatée se fait dans
les conditions suivantes :
4g "peppermint/chocolate cookie bar "
Prélèvement par espace de tête
Colonne CPG: PTE-5; 30m x 0,25mm
ID; 0,25µm film
Four: 60°C (1 min) jusqu’à 230°C à
10°C/min
phase mobile: hélium, 35cm/sec
Det.: FID, 250°C
Inj.: splitless (split fermé 3 min), 250°C
1- Calculer le temps mort de cette
analyse
2- Calculer le rapport de phase de la
colonne β=Vφm/Vφs
3- Le menthol sortant à 7,80 mn,
Exercice 3
On veut doser une amine secondaire A par C.P.G en utilisant la méthode de l’étalon
interne. On veut d’abord déterminer débit optimal de la phase mobile ; les essais
effectués donnent les résultats suivant :

Débit du gaz Distance de rétention (cm) Largeur du pic(mm)

vecteur(mL/min)
17 6,4 8
20 5 5
25 4 4,2

1/ Ces résultats sont-ils cohérents ? justifier votre réponse et calculer le débit optimal

2/ On veut ensuite déterminer le coefficient de proportionnalité KA/E pour une solution

étalon de A à 5,4.10-2 M/L à laquelle on joute un étalon interne E :

Dans 10 mL de solution étalon, on dissout 6 mg de l’étalon interne E : on

obtient la solution 1

Dans 10mL de solution étalon, on dissout 12 mg de l’étalon interne E : on
obtient la solution 2

Dans 10mL de solution étalon, on dissout 24mg de l’étalon interne E : on
obtient la solution 3
Sachant que les rapports des surface des pics sont surface A/Surface E =14,9 pur la

solution 1 ; 7,5 pour la solution 2 ; 3,75 pour la solution 3, Calculer le coefficient

K. Comment choisit-on un étalon interne ?

3/ Déterminer la concentration de cette amine dans une solution de 10 l à laquelle on a

ajouté 18 mg de l’étalon et dont le rapport des surfaces est de 5 ?
On donne Masse Molaire de A=200 g

Exercice 4
On obtient le chromatogramme suivant pour une solution étalon contenant 13
antidépresseurs à la même concentration de 20 mg/L. Le premier pic correspond à une
impureté contenue dans le solvant.
Un comprimé d'un médicament contenant deux antidépresseurs est dissout dans 250 mL
d'éluant puis injecté dans les mêmes conditions que l'étalon précédent. On obtient le
chromatogramme échantillon suivant.
1- Quels sont les deux antidépresseurs présents ?
2- Quelle masse un comprimé en contient-il ?

Exercice 5
Pour des valeurs constantes de N= 1600 et k' =3, et des valeurs variables de α(=1,25;
1,2; 1,1 et 1,05) calculer les résolutions R obtenues.
Calculer l'influence de α sur tr,
1- lorsque α passe de 1,5 à 1,1.
2- lorsque α passe de 1,05 à 1,01.

Exercice 6
Pour améliorer une séparation, on décide de doubler la longueur de la colonne. Quel
sera le résultat de cette décision sur R et tr ?
Conclure
Exercice 7
On désire analyser une poudre contenant entre autres deux substances A et B.
On procède de la manière suivante :
Préparation l'échantillon à analyser.
➢ On prélève 1,015 g de poudre qu'on traite par extraction liquide-solide.
➢ La totalité de l'extrait alcoolique obtenu est transvasé dans une fiole jaugée de 50 mL
et on
complète à 50 mL avec de l'alcool. On obtient ainsi l'extrait alcoolique (E).
➢ On prélève 5 mL de cet extrait alcoolique (E) qu'on introduit dans une fiole jaugée
de 100
mL.
➢ On ajoute alors 5 mL d'une solution de la substance C de concentration CC = 2 g/L
➢ On complète à 100 mL avec de l'eau distillée.
➢ On obtient ainsi la solution (S).
➢ On injecte la solution (S) obtenue en HPLC et on obtient le chromatogramme
échantillon.
On prépare ensuite une solution étalon en introduisant dans une fiole jaugée de 50 mL :
➢ 10 mL d'une solution de la substance A de concentration CA = 1 g/L
➢ 10 mL d'une solution de la substance B de concentration CB = 2 g/L
➢ 2,5 mL d'une solution de la substance C de concentration CC = 2 g/L
➢ On complète à 50 mL avec de l'eau distillée.
➢ Cette solution est injectée en HPLC et on obtient le chromatogramme Etalon.
1) Quel est l'intérêt d'ajouter la substance C pour tracer les chromatogrammes ?
2) Au vu des rapports d’analyse est-il nécessaire d’utiliser la méthode de l’étalon
interne ?
3)Déterminer la concentration des substances A et B dans la solution (S).
4) Déterminer la concentration des substances A et B dans l'extrait alcoolique (E).
5) Déterminer les teneurs en A et B de la poudre initiale (on exprimera le résultat sous
forme de pourcentages en masse de A et B) .
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Travaux dirigés n° 5 de chromatographie

Exercice 1 : On considère le (±)-1-phényléthane

phényléthane-1,2-diol
diol A dont la structure est représentée ci-dessous.
ci A peut être
synthétisé sous sa forme optiquement active. Une analyse HPLC est effectuée pour en déterminer la pureté optique.

(A) Phase stationnaire : Chiralcel OB

On dispose d'une colonne HPLC chirale de type Chiralcel OB :

Un rapide bilan des solvants de qualité HPLC

HPLC disponibles au laboratoire donne : hexane, eau,

acétonitrile et isopropanol.

1 - Quel type d'éluant faut-ilil utiliser avec ce type de phase ?

2- Donner les interactions qui seront mises en jeu dans la séparation des deux énantiomères du 1-phényléthane-1,2-
1
diol.

vous améliorer la séparation suivante (indiquer brièvement les facteurs sur lesquels on
3- Comment procéderiez-vous
peut influer)

Exercice II- On considère l'acide 2-phénylbutanoïque

phénylbutanoïque pur et son chromatogramme ci-dessous.
ci dessous.

1- Commenter les conditions utilisées pour réaliser cette

cette séparation (élution, débit, détection).

2- Quel type de colonne est la colonne Chiralcel OD-R

OD (normale, inverse, ...) ?

3- Nous observons deux signaux de même intensité (en aire sous le pic). Qu'en déduit-on
déduit à propos de la
colonne utilisée ?

4- Calculer le facteur de résolution R entre les deux pics de ce chromatogramme.

5- A partir de quelle valeur de R peut-on

on considérer que les deux pics sont parfaitement séparés?
Exercice 3 : 1– Pour la séparation d'énantiomères, quel est l'avantage d'utiliser l'HPLC par rapport à la
CPG?
2 – On réalise l'injection d'une solution
solutio contenant de l'ibuprofène (schéma ci-dessous)
dessous) sur une colonne
HPLC contenant une phase stationnaire de type Chiralcel
Chira OD.

Ibuprofène Chiralcel OD
a- A quel type de phase stationnaire
ationnaire appartient cette colonne ?
b- Combien de pics obtiendra t'on sur le chromatogramme ? Justifier.
3 – Si on réalisee l'estérification de l'ibuprofène racémique par du (R,S)-1-phényléthanol,
(R,S) phényléthanol,
combien de pics chromatographiques obtiendra-t'on
obtiendra t'on sur cette phase pour l'ester correspondant ?
Combien de pics obtiendra-t'on t'on pour cet ester sur une phase stationnaire achirale ?
Justifier.

Exercice 4 : La séparation d’acides gras est effectuée sur une colonne de 15 cm de longueur et 4,6 cm de
diamètre interne dont la phase stationnaire est constituée de particules sphériques d’octyl-
d’octyl silice de 4 µm de
diamètre. La phase mobile a la composition suivante : CH3-CN/THF/H3PO4 à 1% (28%/22%/50%
(28% V/V)

La colonne est régulée à 35°C et le débit est de 1 ml.min-1.

ml.min La structure et le temps de rétention (min) des
neufs acides gras sont donnés dans le tableau suivant :

1/ acide linolénique (C18:3,cis) 4,82 6: acide palmitique (C16:O) 9,53

2: acide palmitoléique (C16:1,cis) 6 7: acide oléique (C18:1,cis) 10,47
3: acide trans-héxadécénoïque
héxadécénoïque (C16:1,trans) 6,35 8: acidee élaïdique (C18:1,trans) 11,18
4: acide linoléique (C18:2,cis) 6,94 9: acide stéarique (C18:O) 11,53
5: acide trans-linoléique
linoléique (C18:2,trans) 8

1 - Quel sont le type et le principe de cette séparation ? Quel est le rôle de l’acide phosphorique dans la
phase mobile ? Pourquoi la séparation est-elle
est elle réalisée à 35°C ? Expliquez l’ordre dilution des différents
acides gras ? Quel est le système de détection
déte le mieux adapté ?
2 - La porosité interstitielle est égale à 0,5.
0,5. Quel est le facteur de capacité de ces composés ?
3 - Comment diminueriez-vous vous la durée de l’analyse ? ( εoo = 0,45 et 0,65 respectivement pour le
tétrahydrofurane et pour l’acétonitrile).
e). Quelles sont les limites à vos propositions ?
4 - Quelle est la surface moléculaire apolaire des acides gras de la série C18 sachant que :
ln k’ = 0,04 Sapolaire - 2 avec Sapolaire en 10-20 m2 . Interprétez
terprétez les résultats obtenus.
obtenus

Exercice 5 : Des colonnes chromatographiques récentes sont proposées avec 0,1 cm de diamètre
diamè interne et 5
cm de longueur. Ces colonnes sont garnies de particules sphériques de 0,8 µm de diamètre et de porosité
poros
interstitielle égale à 0,45.
Ces particules sont constituées
es de propyl silice et la phase mobile contenant du 1-hexane
1 hexane sulfonate a une
viscosité égale à 0,5 centipoise.
1) Quels sont les classes ou catégories de composés susceptibles d’être analysés au moyen de ce système ?
2) Quels avantages et inconvénients présente
pré l’utilisation de telles colonnes ?
3) Quel débit de phase mobile doit-onon fixer pour que la perte de charge soit égale à 300 bars ?
4) Avec ce ∆P, quel sera le to ?
5) Quel est le facteur de capacité d’un composé élué à 5 min ?
6) Quelle est le nombre de plateaux théoriques ?
On donne : Ko =dp2.ε3/180(1 - ε)2, HEPT = B.dpβ avec ß = 1,6 et B = 1 1cP = 0,001 Pa.S