Rohart Thse Mlanges : Lait et polysaccharides

Mélanges lait / polysaccharides : création de
microstructures par effet de compétition entre

gélification acide et séparation de phases
Anne Rohart
To cite this version:

Anne Rohart. Mélanges lait / polysaccharides : création de microstructures par effet de compétition
entre gélification acide et séparation de phases. Alimentation et Nutrition. AgroParisTech, 2014.
Français. �NNT : 2014AGPT0017�. �tel-03635216�
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Doctorat ParisTech
THÈSE
pour obtenir le grade de docteur délivré par
L’Institut des Sciences et Industries

du Vivant et de l’Environnement
(AgroParisTech)
Spécialité : Sciences et Procédés des Aliments
présentée et soutenue publiquement par
Anne ROHART
le 31 mars 2014
Mélanges lait / polysaccharides :

création de microstructures par effet de compétition
entre gélification acide et séparation de phases
Directrice de thèse : Camille MICHON
Jury
Mme Sylvie TURGEON, Professeur, Dépt sciences des aliments & nutrition, Université Laval, Canada Rapporteur
M. Philippe CAYOT, Professeur, UMR PAM, Agrosup Dijon Rapporteur
Mme Catherine DACREMONT, Professeur, UMR CSGA, Agrosup Dijon Examinateur
Mme Véronique BOYER, Responsable de projet, Senoble Examinateur
Mme Camille MICHON, Professeur, UMR Ingénierie Procédés Aliments, AgroParisTech, Massy Examinateur
AgroParisTech
UMR1145 Ingénierie Procédés Aliments, AgroParisTech / INRA / CNAM
1, avenue des Olympiades – 91744 Massy Cedex
Merci à tous ceux qui m’ont aidée à mener à bien ce travail
ainsi qu’à ceux qui ont accepté de le juger.

Sommaire
SOMMAIRE
INTRODUCTION........................................................................................................................................................ 1
CHAPITRE 1 : ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE ....................................................................................................... 3
I. FORMATION DES GELS LAITIERS ACIDES ....................................................................................... 3
I.1. LE LAIT ..................................................................................................................................................... 3

I.1.1. Composition et principales caractéristiques..................................................................................... 3
I.1.2. Composition protéique...................................................................................................................... 3
I.2. LE PROCESSUS DE GELIFICATION ACIDE : DU LAIT AU GEL......................................................................... 8
I.3. FACTEURS INFLUENÇANT LES PROPRIETES DES GELS ACIDES BRASSES .................................................... 11
I.3.1. Traitement thermique...................................................................................................................... 11
I.3.2. Méthode d’acidification.................................................................................................................. 15
I.3.3. Température et vitesse d’acidification............................................................................................ 17
I.3.4. Traitement mécanique..................................................................................................................... 19
II. STABILITE DES MELANGES DE BIOPOLYMERES ....................................................................... 20
II.1. LES PHENOMENES DE SEPARATION DE PHASES ....................................................................................... 20

II.1.1. Interactions polymères / polymères ............................................................................................... 20
II.1.2. Interactions polymères / particules colloïdales : les phénomènes de floculation.......................... 24
II.2. LES PHENOMENES DE SEPARATION DE PHASES DANS LES MELANGES LAIT / POLYSACCHARIDES ............ 27
II.2.1. Séparation de phases de mélanges protéines de lait / polysaccharides neutres............................ 28
II.2.2. Séparation de phases de mélanges protéines de lait / polysaccharides chargés ........................... 33
III. GELIFICATION EN PRESENCE D’UNE SEPARATION DE PHASES.......................................... 42
III.1. EFFET DE LA GELIFICATION D’AU MOINS UNE DES DEUX PHASES .......................................................... 42
III.1.1. Propriétés des gels en présence d’une séparation de phases....................................................... 42
III.1.2. Effet de la gélification sur la séparation de phases ..................................................................... 45
III.1.3. Gélification sous cisaillement de systèmes en présence d’une séparation de phases .................. 48
III.2. GELIFICATION DE MELANGES PROTEINES DE LAIT / POLYSACCHARIDES EN PRESENCE D’UNE
SEPARATION DE PHASES ............................................................................................................................................ 52
III.2.1. Propriétés des gels acides en présence d’une séparation de phases............................................ 53

III.2.2. Effet de la gélification sur la séparation de phases de mélanges protéines de lait /
polysaccharides................................................................................................................................................... 58
Sommaire
CHAPITRE 2 : MATERIELS ET METHODES .................................................................................................... 61
I. FABRICATION DES GELS LAITIERS ENRICHIS EN POLYSACCHARIDES .............................. 61
I.1. LES MATIERES PREMIERES ....................................................................................................................... 61

I.1.1. Le lait.............................................................................................................................................. 61
I.1.2. Les polysaccharides........................................................................................................................ 61
I.1.3. Les agents acidifiants...................................................................................................................... 62
I.2. PREPARATION DES MELANGES LAIT / POLYSACCHARIDES ....................................................................... 63
I.2.1. Reconstitution du lait ...................................................................................................................... 63
I.2.2. Traitement thermique du lait .......................................................................................................... 63
I.2.3. Solubilisation des polysaccharides ................................................................................................. 63
I.3. FABRICATION DES GELS ACIDES .............................................................................................................. 64
I.3.1. Acidification.................................................................................................................................... 64
I.3.2. Brassage des gels fermes acides ..................................................................................................... 65
II. CARACTERISATION DES MELANGES ET DES GELS ACIDES ENRICHIS EN

POLYSACCHARIDES PAR DES METHODES INSTRUMENTALES ............................................................. 66
II.1. COMPORTEMENT DE SEPARATION DE PHASES DANS LES MELANGES LAIT / POLYSACCHARIDES EN

MILIEUX NEUTRES ET ACIDIFIES ................................................................................................................................ 66
II.2. MESURE DU PH ...................................................................................................................................... 67

II.3. MESURES RHEOLOGIQUES ...................................................................................................................... 68
II.3.1. Propriétés d’écoulement................................................................................................................ 68
II.3.2. Détermination de la viscosité intrinsèque des polysaccharides .................................................... 69
II.3.3. Mesure des propriétés viscoélastiques en régime dynamique ....................................................... 71
II.4. OBSERVATION DES SYSTEMES PAR MICROSCOPIE................................................................................... 73
II.4.1. Microscopie optique et à épifluorescence ..................................................................................... 73
II.4.2. Microscopie confocale à balayage laser ....................................................................................... 74
II.5. AUTRES CARACTERISATIONS ................................................................................................................. 77
II.5.1. Mesure du potentiel zêta de solutions de polysaccharides ............................................................ 77
II.5.2. Etude des interactions protéines de lait / polysaccharides par une méthode spectrophotométrique
............................................................................................................................................................................. 77
II.5.3. Détermination de la teneur en matière sèche des micro-gels........................................................ 78
II.5.4. Détermination de la concentration en protéines des micro-gels ................................................... 79
III. CARACTERISATION SENSORIELLE ET INSTRUMENTALE DES YAOURTS ENRICHIS EN

MICRO-GELS ........................................................................................................................................................... 80
III.1. PREPARATION DES YAOURTS ENRICHIS EN MICRO-GELS ....................................................................... 80

III.1.1. Milieu de dispersion..................................................................................................................... 80
Sommaire
III.1.2. Micro-gels .................................................................................................................................... 80

III.2. ANALYSE SENSORIELLE DES YAOURTS ENRICHIS EN MICRO-GELS ........................................................ 80
III.3. CARACTERISATION INSTRUMENTALE DES YAOURTS ENRICHIS EN MICRO-GELS .................................... 81
III.3.1. Détermination de la distribution granulométrique ...................................................................... 81
III.3.2. Propriétés rhéologiques ............................................................................................................... 82
III.3.3. Observation microscopique.......................................................................................................... 83
III.4. ANALYSES STATISTIQUES ..................................................................................................................... 83
CHAPITRE 3 : MELANGES LAIT / GUAR AVANT ET APRES GELIFICATION........................................ 85
I. PROPRIETES DES MELANGES LAIT / GUAR AVANT ET APRES GELIFICATION ................. 85
I.1. PROPRIETES DES MELANGES LAIT / GUAR AVANT GELIFICATION ............................................................. 85

I.1.1. Propriétés des mélanges lait / guar avant séparation de phases .................................................... 85
I.1.2. Suivi de la séparation de phases des mélanges lait / guar.............................................................. 89
I.1.3. Propriétés des mélanges lait / guar à l’équilibre............................................................................ 94
I.2. PROPRIETES DES GELS ACIDES ENRICHIS EN GUAR................................................................................... 97
I.2.1. Comportement macroscopique des gels fermes acides avant brassage.......................................... 97
I.2.2. Microstructure des gels acides brassés .......................................................................................... 99
I.2.3. Propriétés viscoélastiques des gels acides brassés....................................................................... 100
II. EFFET DE LA GELIFICATION AU REGARD DE LA CINETIQUE DE SEPARATION DE

PHASES .................................................................................................................................................................... 102
II.1. EFFET DE LA CINETIQUE DE GELIFICATION SUR LES PROPRIETES DES GELS ACIDES BRASSES ................ 102
II.1.1. Effet de la concentration en GDL sur la cinétique de gélification .............................................. 102
II.1.2. Effet de la cinétique de gélification sur les propriétés des gels à 0,3% de guar ......................... 104
II.1.3. Effet de la cinétique de gélification sur les propriétés des gels à 0-0,5% de guar ...................... 108
II.2. EFFET DE LA CINETIQUE DE SEPARATION DE PHASES SUR LES PROPRIETES DES GELS ACIDES BRASSES 116
III. CONCLUSION....................................................................................................................................... 118
CHAPITRE 4 : MELANGES LAIT / XANTHANE AVANT ET APRES GELIFICATION........................... 119
I. EXISTENCE D’INTERACTIONS ASSOCIATIVES ENTRE PROTEINES DE LAIT ET

XANTHANE ?.......................................................................................................................................................... 121
II. PROPRIETES DES MELANGES LAIT / XANTHANE AVANT GELIFICATION ....................... 139
II.1. MICROSTRUCTURE DES MELANGES LAIT / XANTHANE.......................................................................... 139

II.2. PROPRIETES RHEOLOGIQUES DES MELANGES LAIT / XANTHANE ........................................................... 140
II.2.1. Propriétés d’écoulement.............................................................................................................. 140
II.2.2. Propriétés viscoélastiques ........................................................................................................... 142
Sommaire
III. PROPRIETES DES GELS ACIDES BRASSES ENRICHIS EN XANTHANE .............................. 143
III.1. ACIDIFICATION A L’AIDE DE HCL ....................................................................................................... 143

III.2. ACIDIFICATION A L’AIDE DE GDL ...................................................................................................... 147
III.3. MECANISMES DE FORMATION DES STRUCTURES FIBREUSES ............................................................... 162
IV. CONCLUSION....................................................................................................................................... 163
CHAPITRE 5 : EFFET DE L’HISTOIRE THERMOMECANIQUE SUR LES PROPRIETES DES GELS

ACIDES ENRICHIS EN POLYSACCHARIDES ................................................................................................ 166
I. EFFET DE L’HISTOIRE THERMIQUE............................................................................................... 166
I.1. EFFET DE LA TEMPERATURE D’ACIDIFICATION ...................................................................................... 166

I.2. MODIFICATION DE L’HISTOIRE THERMIQUE AVANT GELIFICATION ........................................................ 185
II. EFFET D’UN TRAITEMENT MECANIQUE ..................................................................................... 191
III. CONCLUSION....................................................................................................................................... 197
CHAPITRE 6 : INFLUENCE DE LA MICROSTRUCTURE SUR LA PERCEPTION SENSORIELLE DE

YAOURTS BRASSES ENRICHIS EN MICRO-GELS ....................................................................................... 198
I. STRATEGIE EXPERIMENTALE ......................................................................................................... 198
II. PROPRIETES SENSORIELLES........................................................................................................... 200
III. CARACTERISATION INSTRUMENTALE ...................................................................................... 203
IV. RELATION ENTRE DONNEES SENSORIELLES ET INSTRUMENTALES .............................. 206
V. RELATION ENTRE LES PARAMETRES DE STRUCTURE ET LES DONNEES

SENSORIELLES ..................................................................................................................................................... 208
VI. CONCLUSION....................................................................................................................................... 211
CHAPITRE 7 : DISCUSSION GENERALE ET CONCLUSION ...................................................................... 213
I. DISCUSSION GENERALE ..................................................................................................................... 213
II. CONCLUSION GENERALE ................................................................................................................. 221
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ............................................................................................................... 227

Avant-propos
Avant-propos
Ce travail de recherche a été réalisé dans le cadre du projet FUI « SATIAROME » (2010-2014)
coordonné par SENOBLE. Il a bénéficié d’une convention CIFRE portée par SENOBLE et a été
mené au sein de l’UMR1145 Ingénierie Procédés Aliments AgroParisTech / INRA / CNAM
(GENIAL) dans l’équipe « Structuration des Produits par le Procédé » (SP2) sous la direction
scientifique du Professeur Camille Michon.
Les résultats obtenus dans le cadre de cette thèse ont fait l’objet des publications et
communications suivantes :
• Publications dans des revues internationales à comité de lecture
Rohart A. and Michon C. (2014). Designing microstructure into xanthan gum-enriched acid milk
gels. Innovative Food Science and Emerging Technologies. doi: 10.1016/j.ifset.2014.01.002. Sous
presse.
Rohart A., Moulin G. and Michon C. (2014). Interplay between phase separation and gel formation in
stirred acid milk/guar gum gels: effect of acidification rate. Biopolymers. 101(9), pp. 966–974.
doi: 10.1002/bip.22484.
Rohart A., Jouan-Rimbaud Bouveresse D., Rutledge D.N. and Michon C. (2014). Spectrophotometric
analysis of polysaccharide / milk protein interactions with methylene blue using Independent
Components Analysis. Food Hydrocolloids. Soumis.
Rohart A., Sieffermann J.M. and Michon C. (2014). Effect of micro-gel shape and concentration on
sensory perception of micro-gels-enriched stirred yoghurts. Colloids and Surfaces A:
Physicochemical and Engineering Aspects. Soumis.
• Publications dans des actes de conférences
Rohart A. and Michon C. (2013). Designing microstructure into acid skim milk/guar gum gels.
InsideFood Symposium. Leuven, Belgium, 6 pages. www.insidefood.eu.
Rohart A. and Michon C. (2014). Phase separation and gel formation in kinetically trapped guar
gum/acid milk gels. In: Gums and Stabilizers for the Food Industry, 17, Eds P.A. Williams and G.O.
Phillips. Royal Society of Chemistry, Cambridge. pp. 205-213.
Avant-propos
• Communications orales
Rohart A. and Michon C. Phase separation and gel formation in kinetically trapped guar gum/acid
milk gels. Gums and Stabilizers for the Food Industry 17. Wrexham, UK, 26-28 juin 2013.
Rohart A. and Michon C. Designing microstructure into xanthan gum enriched acid milk gels.
FORMULA VII. Mulhouse, France, 1-4 juillet 2013.
Rohart A. and Michon C. Designing microstructure through kinetical trapping of guar gum / acid
milk gels. Biopolymers 2013. Nantes, France, 3-5 décembre 2013.
Rohart A. et Michon C. Design de particules de gels laitiers acides en maîtrisant la compétition entre
gélification et séparation de phases à l’aide d’un galactomannane. Workshop « Structuration des gels
laitiers mixtes ». Paris, France, 1er avril 2014.
Jouan-Rimbaud Bouveresse D., Rohart A., Michon C. et Rutledge D.N. Intérêt de l’analyse en
composantes indépendantes pour l’étude des interactions polysaccharides / protéines de lait.
Workshop « Structuration des gels laitiers mixtes ». Paris, France, 1er avril 2014.
Rohart A. et Michon C. Effet de la taille et de la forme de micro-gels laitiers sur la perception

sensorielle du granuleux en bouche. Workshop « Structuration des gels laitiers mixtes ». Paris,
France, 1er avril 2014.
• Posters
Rohart A. et Michon C. Utilisation de mesures rhéologiques comme outil de sélection de formules de

yaourts brassés. Journées des Jeunes Rhéologues. Saint-Rémy-lès-Chevreuse, France, 21-23 mars
2012.
Rohart A. and Michon C. Designing microstructure into guar gum enriched acid milk gels.
InsideFood Symposium. Leuven, Belgium, 9-12 avril 2013.
Rohart A. and Michon C. Designing microstructure into xanthan gum enriched acid milk gels.
DREAM International Conference "From Model Foods to Food Models". Nantes, France, 24-26 juin
2013.
Rohart A. and Michon C. Effect of the microstructure design on sensory perception of micro-gels-
enriched stirred yoghurts. 15th Food Colloids Conference. Karlsruhe, Germany, 13-16 avril 2014.
Introduction
Introduction
La consommation de produits laitiers frais, et particulièrement des laits fermentés, représente

une part de marché en constante augmentation en France et dans le monde. Dans cette filière très
dynamique, le haut degré de concurrence conduit les industriels à de constants renouvellements et
optimisations des formules nécessitant bien souvent une connaissance approfondie de ces systèmes. A
l’exemple du secteur des yaourts sans matière grasse, la formulation de produits présentant des
propriétés organoleptiques séduisantes pour les consommateurs reste un défi pour les industriels. Afin
de développer des textures mieux adaptées ou de prévenir certains défauts de qualité, il est d’usage
d’intégrer des agents épaississants et gélifiants au sein des produits laitiers. A l’exception de la
gélatine, tous ces additifs alimentaires sont des polysaccharides : galactomannanes, carraghénanes,
xanthane, pectines, amidons…
Présentes dans la majorité des aliments, les protéines peuvent participer de manière directe à la
structuration des produits, aboutissant dans le cas des yaourts à un réseau gélifié qui se forme suite à
la précipitation des micelles de caséines par acidification. Dans certaines formulations, la mise en
place de la structure requiert également l’utilisation de polysaccharides qui sont alors en mélange
avec les protéines de lait. Néanmoins, la thermodynamique des solutions de polymères prévoit que
ces mélanges sont incompatibles, ce qui conduit généralement à une séparation de phases, la
miscibilité étant l’exception. Dans cette situation, deux possibilités s’offrent alors au formulateur :
maîtriser l’évolution de la texture et la stabilité du produit pendant son temps de conservation avant
consommation, ou exploiter cette immiscibilité, entre autres, pour créer des nouvelles textures. C’est
vers ce second axe de développement que ce travail de recherche s’est orienté.
L’objectif de cette étude a été de contribuer à une meilleure compréhension de la structuration

des systèmes mixtes brassés protéines de lait / polysaccharides subissant à la fois une séparation de
phases et une gélification. Dans ce but, il s’agissait d’identifier les paramètres de composition et de
procédé déterminant la morphologie des micro-gels aux propriétés rhéologiques et sensorielles
originales.
Pour répondre à cet objectif, la stratégie mise en œuvre a consisté, dans un premier temps, à
étudier de manière détaillée les propriétés microstructurales et rhéologiques de deux mélanges lait /
polysaccharides en milieux neutres et acidifiés. Le premier système intégrant un polysaccharide
neutre, le guar, peut être considéré comme un modèle ségrégatif. En revanche, le second mélange
composé de xanthane chargé négativement a été utilisé entre autres comme élément de comparaison,
1
Introduction
afin d’étudier l’effet de l’encombrement stérique et d’éventuelles interactions associatives. Ces deux
mélanges ont en commun la présence de protéines de lait, en quantité légèrement supérieure à celle
d’un lait classique afin de pallier l’absence de matière grasse tout en se rapprochant d’un système réel
tel qu’un yaourt brassé maigre. Au sein de l’ensemble des mélanges, l’acidification a été menée par
un ajout de glucono-δ-lactone ou ponctuellement par l’action de ferments et le brassage réalisé de
manière standardisée. Dans un second temps, une modification des histoires thermiques et
mécaniques des mélanges lait / guar a permis d’élargir les conditions explorées dans ce travail. Tout
au long de cette étude, l’originalité de la démarche adoptée a consisté à prendre en compte l’aspect
cinétique des phénomènes.
Le manuscrit est composé de sept chapitres.
La synthèse bibliographique, objet du premier chapitre, décrit l’état des connaissances sur le
sujet. Après un rappel des mécanismes qui permettent la mise en place d’un réseau gélifié à partir de
micelles de caséines, les phénomènes de séparation de phases dans les mélanges mixtes sont détaillés
à l’aide d’exemples de divers polysaccharides neutres et chargés. Ensuite, l’accent est mis sur le
phénomène de compétition entre séparation de phases et gélification.
Le deuxième chapitre est consacré aux matériels et méthodes utilisés lors de cette étude.
Les quatre chapitres suivants présentent les résultats obtenus comprenant certaines parties sous
la forme de publications soumises dans des revues à comité de lecture. Les chapitres 3 et 4 concernent
respectivement l’étude des mélanges lait / guar et lait / xanthane avant et après gélification sur la base
d’une analyse des propriétés macroscopiques, microstructurales et rhéologiques. Le chapitre 5
s’attache plus particulièrement à identifier les facteurs clés de la microstructure des gels brassés par
une modification de l’histoire thermomécanique subie par les mélanges avant et après leur
gélification. De manière complémentaire, une étude sensorielle est proposée dans le chapitre 6 afin
d’appréhender l’impact de la morphologie des micro-gels sur les textures sensorielle et instrumentale
des produits.
Pour conclure, le chapitre 7 vise à répondre à la question d’une généralisation des phénomènes
aboutissant à différents types de morphologies de micro-gels et enfin à proposer un schéma général
d’interprétation faisant appel à un effet de compétition entre les processus de gélification et de
séparation de phases.
2
Chapitre 1 : Etude bibliographique
I. FORMATION DES GELS LAITIERS ACIDES
I.1. Le lait
I.1.1. Composition et principales caractéristiques
D’un point de vue physico-chimique, le lait est une suspension colloïdale dans laquelle deux
types de particules sont dispersés : les globules de matière grasse et les micelles de caséines. La phase
dispersante, composée essentiellement de sels minéraux, de lactose, de protéines sériques et de
vitamines hydrosolubles, constitue le lactosérum (Figure 1). Les caractéristiques de la matière grasse
ne seront pas détaillées puisque du lait écrémé a été utilisé dans cette étude. Le pH du lait est
d’environ 6,7 à 20°C et la force ionique d’environ 0,1 M.
Eau : 870 Protéines : 32-35

Caséines : 26-28
Matière grasse : 33-47 β-Lb : 3
Lactose : 46
α-Lb : 1
SAB : 0,4
Cendres : 7 Lf : 0,2
Figure 1 : Composition moyenne du lait de vache (g.L-1) avec le détail de sa composition en protéines (g.L-1) (β-Lb :
β-lactoglobuline, α-Lb : α-lactalbumine, SAB : albumine de sérum bovin, Lf : lactoferrine) (d'après Cayot &
Lorient, 1998 ; Johnson, 1978 ; Swaisgood, 1982 ; Ribadeau Dumas & Grappin, 1989)
I.1.2. Composition protéique
Les protéines du lait sont subdivisées en deux grandes catégories :
− les caséines, regroupées sous la forme de micelles de caséines, un ensemble

supramoléculaire comprenant ces différents types de protéines ;
− les protéines sériques, qui ne précipitent pas à pH 4,6 lors d’une acidification du lait ou
après ajout de chymosine.
I.1.2.1. Caséines et micelles de caséines
I.1.2.1.1. Caractéristiques physico-chimiques et composition
Les caséines constituent environ 80% des protéines du lait, avec quatre fractions principales :
les caséines αs1, αs2, β et κ selon un rapport massique moyen de 3 / 0,8 / 3 / 1. Leur concentration
3
dans le lait écrémé est donnée sur la Figure 1. Ces fractions de caséines sont associées à des
minéraux, en particulier sous forme de phosphate de calcium.
Bien qu’à des degrés différents, toutes les caséines contiennent du phosphore intégré aux
chaînes peptidiques sous forme de groupements phosphoséryl ainsi qu’une proportion importante de
groupements hydrophobes. Elles se distinguent par leur nombre de groupements phosphorylés, par
leur caractère hydrophobe ou encore par la présence ou non de résidus cystéine et de groupements
glycosylés (Tableau 1).
Tableau 1 : Caractéristiques des différentes fractions de caséines (d’après Walstra & Jenness, 1984)
αs1 αs2 β κ
Résidus acides aminés 199 207 209 169
Résidus cystéine 0 2 0 2
Groupements phosphorylés (nombre par
8-9 10-13 5 1-2
mole)
Groupements hydrophobes (nombre par
88 69 111 88
mole)
Groupements glycosylés (nombre par mole) 0 0 0 0à5
Charge à pH 6,6 -20,9 -14,8 -12,3 -3
Sensibilité au calcium ++ +++ + -
Par ailleurs, la répartition des charges et des groupements hydrophobes le long des chaînes
peptidiques des différentes fractions n’est pas uniforme (Figure 2). De ce point de vue, la caséine κ
présente un caractère amphiphile particulièrement marqué avec une partie C-terminale très hydrophile
et une partie N-terminale hydrophobe. D’autre part, la fraction κ possède une région étendue d’acides
aminés (entre les résidus 20 et 115) qui, à l’exception d’un seul, sont exclusivement chargés
positivement. Cet excès de charge positive demeure même à des pH alcalins (Snoeren et al., 1975).
4
Figure 2 : Répartition des charges et des zones hydrophiles et hydrophobes le long des molécules de caséines. Les
courbes continues représentent la distribution lissée de l’hydrophobicité des acides aminés individuels et les barres
verticales indiquent les charges distinctes de chaque acide aminé (d'après Fuquay et al., 2011)
Dans le lait, environ 95% des caséines sont structurées en un édifice supramoléculaire
sphérique et volumineux, la micelle, dont la taille varie de 20 à 600 nm, avec un diamètre moyen
voisin de 180 nm (Cayot & Lorient, 1998). Outre les caséines, les micelles de caséines sont
composées d’eau et de minéraux notamment. Le potentiel zêta des micelles de caséines est de l’ordre
de -20 mV à pH 6,7 et leur point isoélectrique est d’environ 4,6 (Dalgleish, 2011).
I.1.2.1.2. Organisation des micelles de caséines
L’organisation des différentes caséines au sein de la micelle s’explique par leur sensibilité au
calcium et le positionnement de leurs groupements hydrophobes. Etant très sensibles à la présence de
calcium, les caséines αs1, αs2 et β se situent à l’intérieur de la micelle. En revanche, l’insensibilité au
calcium de la caséine κ lui permet de se positionner en périphérie et ainsi d’aider à la stabilisation des
autres caséines par la formation d’une structure « chevelue » (Holt & Horne, 1996).
Même si à ce jour, la structure micellaire des caséines n’est pas complètement élucidée, de
nombreux modèles de micelles de caséines se sont succédé (Figure 3a-d) (le modèle noyau-enveloppe
(Payens, 1966), le modèle à structure interne (Ribadeau Dumas & Garnier, 1970), le modèle sub-
micellaire (Schmidt, 1982 ; Walstra & Jenness, 1984 ; Ono & Obata, 1989) et le modèle à structure
ouverte (Holt & Horne, 1996). Un grand nombre d’interactions contribue au maintien de l’édifice
5
micellaire. Néanmoins, le phosphate de calcium joue un rôle déterminant dans la formation de la

micelle, c’est sur ce point que varient les hypothèses.
a b
Couche
chevelue
Submicelle Chaîne Phosphate Nanocluster de

protubérante de calcium phosphate de calcium
c d
Nanocluster de Caséine Nanocluster de Caséine Caséine κ Interactions

phosphate de phosphate de positionnée à la hydrophobes mobiles
calcium calcium surface avec la caséine β
Figure 3 : Modèles de la micelle de caséines (a) submicellaire (d'après Walstra, 1999) (b) à structure ouverte (d'après
Holt & Horne, 1996), modèles proposés par (c) McMahon & Oommen (2008) et par (d) Dalgleish (2011)
Le modèle submicellaire est basé sur l’idée que les caséines forment un ensemble de
submicelles maintenues notamment par des ponts phosphocalciques (Schmidt, 1982 ; Walstra, 1999)
(Figure 3a). Néanmoins, une étude de diffraction de neutrons (Holt et al., 2003) a remis en question la
structure submicellaire de la micelle de caséines. Ainsi, la micelle de caséines serait un assemblage
protéique poreux et sa croissance se ferait autour de granules de phosphate de calcium (Holt & Horne,
1996) (Figure 3b).
6
Plus récemment, McMahon & Oommen (2008) ont proposé un modèle dans lequel des agrégats
de caséines ainsi que des agrégats de caséines/phosphate de calcium contribueraient à l’intégrité
micellaire (Figure 3c). Les caséines formeraient des chaînes linéaires et branchées de 2 à 5 unités
protéiques imbriquées dans les nanoclusters de phosphate de calcium via des interactions
hydrophobes, électrostatiques et des ponts phosphocalciques. La combinaison d’une structure en
réseau imbriqué et des multiples interactions mises en jeu résulterait en une supramolécule colloïdale
ouverte, en éponge.
Dalgleish (2011) a repris ce modèle et défini également l’intérieur de la micelle de caséines

comme un système bicontinu de canaux d’eau et d’agrégats de caséines/phosphate de calcium
(Figure 3d). Ces agrégats de caséines αs/phosphate de calcium seraient stabilisés au sein de la micelle
de caséines par des interactions avec la caséine β, hautement amphiphile et mobile. Cette structure
ouverte contribuerait à l’hydratation de la micelle de caséines.
Les différents modèles proposés s’accordent toutefois sur la localisation de la caséine κ en

périphérie de la micelle et son rôle clé dans la stabilisation des micelles de caséines. Bien que la
structure réelle de la micelle de caséines reste complexe, les modèles les plus récents contribuent à
décrire de plus en plus fidèlement cet édifice supramoléculaire et ainsi à expliquer la réactivité des
micelles de caséines entre elles mais également vis-à-vis des autres macromolécules des milieux dans
lesquels elles sont mises en œuvre.
I.1.2.1.3. Stabilité des micelles de caséines
La stabilité des micelles de caséines résulte d’un équilibre entre les forces répulsives, de nature
électrostatique ou stérique, et les forces attractives dues aux interactions hydrophobes,
électrostatiques ou de Van der Waals. Dans le lait, différents aspects confèrent à la micelle de
caséines une stabilité remarquable :
− sa charge nette négative due à la localisation en surface de la partie hydrophile de la

caséine κ. Elle crée des répulsions électrostatiques entre les micelles de caséines ;
− les répulsions stériques dues aux excroissances de caséine κ très hydrophiles s’étendant
à partir de la surface de la micelle, sur une épaisseur de 6 à 12 nm ;
− le haut degré d’hydratation des micelles, entre 3 et 4 kg d’eau pour 1 kg de protéines

(Dalgleish, 2011), qui forme une couche protectrice vis-à-vis des autres particules en suspension.
7
Les micelles de caséines peuvent devenir un édifice instable en fonction des conditions du
milieu, ce qui peut mener à leur agrégation. Cette instabilité vis-à-vis de l’agrégation dépend à la fois
de l’environnement (force ionique, pH) et de la composition micellaire (caséines, phosphate et
calcium). Par ailleurs, l’action d’enzymes protéolytiques, telles que la présure, ou encore le traitement
thermique modifient la réactivité des micelles vis-à-vis de leur agrégation. L’effet de la diminution du
pH sur la structure et la stabilité des micelles de caséines sera détaillé dans le paragraphe I.2 de ce
chapitre.
I.1.2.2. Protéines sériques
Les protéines sériques, ou protéines du lactosérum, sont définies comme l’ensemble des
protéines ne coagulant pas à pH 4,6 à 20°C. Elles sont composées à 90% de β-lactoglobuline, d’α-
lactalbumine, d’albumine de sérum bovin et d’immunoglobulines. D’un point de vue fonctionnel et
quantitatif, les deux protéines principales sont la β-lactoglobuline et l’α-lactalbumine, qui
représentent respectivement environ 50% et 20% des protéines du lactosérum (Cayot & Lorient,
1998). A la différence des caséines, les protéines sériques sont des protéines globulaires possédant
une conformation tridimensionnelle très organisée, ce qui les rend thermosensibles. La sensibilité au
traitement thermique des protéines sériques sera discutée dans le paragraphe I.3.1 de ce chapitre.
I.2. Le processus de gélification acide : du lait au gel

La transformation du lait en gel résulte en la mise en place d’une structure complexe et d’un
changement important des propriétés rhéologiques du système : le produit passe d’un état liquide
Newtonien à un état de gel viscoélastique dont la déstructuration est irréversible. Différentes
méthodes peuvent être utilisées pour obtenir un gel laitier : l’emprésurage, lors duquel la partie C-
terminale de la caséine κ est coupée par la chymosine (principe de la fabrication des fromages) et
l’acidification (principe de la fabrication des yaourts). Seuls les mécanismes de l’acidification seront
détaillés.
Lors de la baisse du pH, les micelles de caséines subissent des changements importants. De
nombreux modèles de mécanismes de gélification acide du lait ont été proposés (Heertje et al., 1985 ;
Banon & Hardy, 1991 ; Gastaldi, 1994 ; Herbert et al., 1999 ; Famelart et al., 2004). Dans tous ces
modèles, la mise en place du réseau gélifié implique des mécanismes de dissociation et d’association
au sein et entre les micelles de caséines. Plus récemment, McMahon et al. (2009) ont proposé un
modèle de gélification acide du lait en trois phases en utilisant la microscopie électronique (Figure 4).
8
10
5
Potentiel zêta (mV)
200 nm
0 200 nm
-5
pHi caséines β
-10 200 nm
-15 200 nm
200 nm
-20
6,75 6,50 6,25 6,00 5,75 5,50 5,25 5,00 4,75 4,50 pH
Agrégation
Désintégration Contraction Structure finale
Micelles de caséines originales
Mèche micelle Néo-micelles Réseau
Solubilisation progressive du calcium Calcium micellaire ~ 0
Nouvelles interactions des caséines β

Libération des caséines β
avec les autres caséines
Volume de Diminution progressive
la micelle du volume
Min Max
Figure 4 : Potentiel zêta mesuré lors de l’acidification de micelles de caséines dans le lait écrémé et proposition
d’interprétation des évènements ayant lieu lors de la formation de la structure (d’après Walstra & Jenness, 1984 ;
Heertje et al., 1985). Les schémas sont issus d’observations obtenues en microscopie électronique d’un lait acidifié à
l’aide de GDL à 40°C. Les micelles de caséines natives sont représentées en noir et les agrégats de protéines
enchevêtrées de manière lâche en gris (d’après McMahon et al., 2009)
La première phase, entre un pH de 6,7 et 5,3, implique la dissociation des caséines de la micelle
(Dalgleish & Law, 1988). Lorsque le pH diminue, cette dissociation entraîne la libération de caséines,
formant ainsi des agrégats de protéines enchevêtrées de manière lâche et de taille aussi grande que les
micelles de caséines natives. A pH 5,70, une diminution de la taille des micelles de caséines a lieu
(30 à 50 nm).
La deuxième phase a lieu entre un pH de 5,3 et 4,9. Celle-ci implique la réassociation des
protéines avec les micelles de caséines libres ou avec les agrégats de protéines enchevêtrées, formant
ainsi des particules colloïdales plus compactes et de grande taille (200 à 300 nm).
9
Enfin, à pH 5,2, la micelle de caséines perd son intégrité et les protéines dissociées forment des
agrégats denses. Le réseau gélifié résultant intègre des chaînes de particules compactes. Par ailleurs,
le réarrangement des particules conduit à une contraction du gel à un pH inférieur à 4,8 (Heertje et al.,
1985).
Les mécanismes physico-chimiques à l’origine de la modification de la structure micellaire lors

de l’acidification peuvent être expliqués par le suivi de différents paramètres.
L’acidification du lait s’accompagne d’une importante solubilisation des minéraux colloïdaux

(Lucey et al., 1996). Lorsque le pH atteint 5, la solubilisation du calcium micellaire est totale (Heertje
et al., 1985). Puisque le phosphate de calcium micellaire permet d’assurer en partie l’intégrité de la
structure micellaire, sa solubilisation résulte en une dissociation de certaines molécules de caséines.
La caséine β, qui possède peu de résidus de phosphosérine, est la première à fuir la micelle.
Cependant, les particules résiduelles formées par un enchevêtrement des caséines αs gardent la forme
et la taille des micelles de caséines natives (Cayot & Lorient, 1998).
Le suivi du potentiel zêta en fonction du pH permet d’expliquer les interactions électrostatiques

ayant lieu lors de l’acidification. De manière générale, le potentiel zêta augmente à mesure que le pH
diminue, en passant d’environ -18 mV à 0 mV au point isoélectrique de la micelle de caséines,
principalement en raison de la protonation des groupes carboxyliques. Cependant, cette chute n’est
pas linéaire : un minimum et un maximum local sont atteints à respectivement pH 5,2 et 4,9
(Figure 4). Le minimum de potentiel zêta observé autour de pH 5,2 serait lié à la réintégration dans la
structure micellaire de la caséine β dont le pHi se situe à environ pH 5,2 (Heertje et al., 1985). En
s’associant à la micelle de caséines encore chargée négativement, la caséine β augmenterait
ponctuellement la charge nette de la micelle, sans toutefois en modifier son volume.
La transition sol-gel fait intervenir des interactions intermoléculaires de nature hydrophobe et

électrostatique (Horne, 1999). D’une part, les interactions hydrophobes aident à maintenir l’intégrité
micellaire malgré la solubilisation du phosphate de calcium. D’autre part, à l’approche du pHi de la
micelle de caséines, la neutralisation des charges s’accompagne d’une diminution des répulsions
électrostatiques entre les groupements protéiques de la micelle de caséines. La protonation des
groupes carboxyliques des acides aminés diminue la capacité de stabilisation de la micelle par effet
stérique lié au positionnement de la caséine κ à l’extérieur de la micelle. Ainsi, les répulsions
électrostatiques et stériques assurées par la couche chevelue de la caséine κ s’atténuent
considérablement à mesure que le pH décroît.
10
Tableau 2 : Phénomènes de désagrégation et d’agrégation et modifications physico-chimiques conduisant à la

coagulation des micelles (d’après Fox & McSweeney, 2003 ; Tamine, 2009)
Désagrégation Agrégation
pH > 5,3 pH < 5,3
Solubilisation du phosphate de calcium colloïdal Force ionique du sérum
Répulsions électrostatiques et stériques
Interactions hydrophobes
Dissociation des caséines de la micelle Réabsorption des caséines de la micelle à leur pHi
Hydratation de la micelle Hydratation de la micelle
Volume de la micelle (gonflement) Volume de la micelle (rétrécissement)
Finalement, l’acidification du lait est accompagnée d’un ensemble de changements physico-

chimiques, qui se distinguent en deux phénomènes opposés (Tableau 2) : une tendance à la
désagrégation à un pH supérieur à 5,3, et à l’inverse, une tendance à l’agrégation à un pH inférieur à
5,3, qui mène à une structure gélifiée.
I.3. Facteurs influençant les propriétés des gels acides brassés

I.3.1. Traitement thermique
I.3.1.1. Dénaturation des protéines sériques et formation des complexes
L’utilisation d’un traitement thermique du lait conduit à l’obtention d’un gel acide aux
propriétés très différentes d’un gel obtenu à partir d’un lait non chauffé. Le chauffage préalable du
lait à des températures supérieures à 60°C provoque une dénaturation irréversible des protéines
sériques, en particulier de la β-lactoglobuline et de l’α-lactalbumine. En perdant leur structure
secondaire et tertiaire, elles se déploient et interagissent par l’intermédiaire de ponts disulfures et
d’interactions hydrophobes pour former des complexes thermo-induits.
Dans le lait, ces complexes sont présents sous la forme de complexes thermo-induits solubles et
sous la forme de complexes ou agrégats micellaires, situés en surface de la micelle de caséines. D’une
part, la formation des complexes solubles implique les interactions de la β-lactoglobuline avec les
résidus cystéine d’autres molécules de β-lactoglobuline et/ou α-lactalbumine. D’autre part, les
interactions de la β-lactoglobuline avec la caséine κ, située au niveau de la couche chevelue de la
micelle de caséines, conduisent au recouvrement des micelles par les macromolécules de β-
lactoglobuline (Donato & Guyomarc’h, 2009 ; Morand et al., 2011). Des quantités importantes d’α-
lactalbumine et de protéines sériques mineures peuvent également interagir avec les micelles de
caséines (Corredig & Dalgleish, 1996). Dans ce cas, la fixation de l’α-lactalbumine à la surface des
11
micelles de caséines en supplément de la β-lactoglobuline diminue l’aptitude du lait à la gélification

par acidification (Mottar et al., 1989 ; Cayot & Lorient, 1998).
Le pH du lait avant traitement thermique oriente la répartition entre complexes solubles de

protéines sériques et complexes protéines sériques-micelles (Anema et al., 2004 ; Anema & Li, 2003 ;
Anema & Klostermeyer, 1997 ; Corredig & Dalgleish, 1996 ; Vasbinder & de Kruif, 2003 ;
Vasbinder et al., 2003). Ainsi, lorsque le traitement thermique est effectué à pH 6,5, la plupart des
protéines sériques s’associe aux micelles de caséines, alors que s’il est réalisé à un pH plus élevé, la
proportion de protéines sériques solubles augmente et les caséines κ se dissocient progressivement de
la micelle de caséines (Vasbinder & de Kruif, 2003).
Le traitement thermique du lait conduit à la formation d’un mélange complexe de protéines

sériques natives et dénaturées présentes sous la forme d’agrégats solubles et d’agrégats micellaires.
L’intensité de la dénaturation des protéines sériques est fonction de la température et du temps de
traitement thermique, mais aussi de la composition et du pH du système. A titre d’exemple, dans le
cas de traitements thermiques à 85°C pendant 30 min et à 90°C pendant 2 min, le taux de
dénaturation des protéines sériques est respectivement de 76,5% et 55% (Hui & Sherkat, 2006).
I.3.1.2. Effet du traitement thermique sur la micelle de caséines
Il est généralement admis que les caséines, considérées dans leur état monomérique, sont moins
sensibles à la dénaturation que les protéines sériques (Cayot & Lorient, 1998). Toutefois des
modifications notables interviennent également sur la structure micellaire lors d’un chauffage,
notamment en raison de l’interaction de protéines sériques dénaturées sur la micelle (Figure 5).
Formation de complexes
micellaires Augmentation du phosphate
Protéines sériques
Phosphate de calcium de calcium colloïdal
Taille de la micelle
pH
Hydrophobicité de surface
Caséine κ Charge de la micelle
Libération de caséines κ
Relâchement de la structure
Relâchement de la structure
Figure 5 : Modifications micellaires provoquées par un traitement thermique supérieur à 90°C (schéma de la micelle
d’après Dalgleish, 2011)
Lorsqu’un traitement thermique de 90°C est appliqué, Anema & Li (2003) ont montré que la
formation de complexes micellaires conduit à une augmentation de la taille des micelles de caséines
d’environ 30 à 35 nm. Cette augmentation s’expliquerait par l’association des protéines sériques, en
12
particulier de la β-lactoglobuline, sur la surface des micelles de caséines plutôt que par la formation
de complexes de protéines sériques solubles.
Malgré la nature poreuse de la micelle de caséines (Holt & Horne, 1996 ; Dalgleish, 2011),
seule une faible fraction des caséines semble mobile, mais en présence de protéines sériques et à
température élevée, un relâchement de la structure de la micelle est mis en évidence (Cayot &
Lorient, 1998).
Par ailleurs, la surface de la micelle de caséines subit des transformations importantes en raison
de l’association des protéines sériques avec la caséine κ. D’une part, la formation de protubérances
contribue à une augmentation des irrégularités et de l’hydrophobicité de la surface (Dalgleish et al.,
2004). D’autre part, la couche « chevelue » créée par les caséines κ tend à diminuer. En effet, à des
pH supérieurs à 6,5, l’association entre les caséines κ et les molécules de β-lactoglobuline implique
une redistribution des ponts disulfures, ce qui revient à dépolymériser la caséine κ. Les chaînes de
caséines κ associées à celles de la β-lactoglobuline pourraient finalement être arrachées de la surface
de la micelle. En revanche, pour des pH inférieurs à 6,5, l’agrégation probable de β-lactoglobuline en
surface de micelle limiterait la perte de caséines κ (Cayot & Lorient, 1998).
Outre les modifications des protéines, les équilibres minéraux sont fortement perturbés,
notamment pour des températures de traitement thermique supérieures à 90°C (Gaucheron et al.,
2004 ; Tamine & Robinson, 2007). Ainsi, le traitement thermique peut donner lieu à un transfert du
phosphate de calcium de la phase soluble vers la phase micellaire ainsi qu’à une « précipitation » de
phosphate de calcium. Jusqu’à 35% de la quantité totale de phosphate de calcium pourraient être ainsi
« échangeables » (Cayot & Lorient, 1998). Une des conséquences de ces altérations d’équilibres
minéraux est la diminution du pH du lait consécutive à la transformation des sels phosphocalciques et
à une dégradation du lactose en produits acides. La réduction de la charge des micelles est également
accentuée par ces changements physico-chimiques (Gaucheron et al., 2004).
I.3.1.3. Effet du traitement thermique sur les propriétés des gels acides
Le traitement thermique du lait conduit à des modifications physico-chimiques lors de

l’acidification. Un décalage du pH de gélification de 4,6 (point isoélectrique des caséines) à 5,3 (point
isoélectrique des β-lactoglobulines) est mis en évidence lors de l’application d’un traitement
thermique du lait (Lucey et al., 1998 ; Heertje et al., 1985 ; Vasbinder et al., 2003).
13
Ce comportement est une conséquence de l’incorporation des protéines sériques dénaturées à la

structure du gel acide. En effet, dans le lait non chauffé, les protéines sériques natives restent solubles
et n’interviennent pas dans le processus de gélification. En revanche, dans un lait traité
thermiquement, elles sont dénaturées et insolubles à leur point isoélectrique. Les complexes de
protéines sériques de caséines κ solubles ou micellaires participent alors à la formation du réseau
protéique (Figure 6).
Acidification
pH 6,6 pH 5,5 pH 5,0 pH 4,6
Lait non chauffé
Lait chauffé
Agrégat protéines sériques / Agrégat protéines sériques /

Micelle de caséines
caséine κ colloïdal caséine κ soluble
Figure 6 : Schématisation de l’effet du traitement thermique du lait sur la microstructure des gels acides (d’après
Famelart et al., 2004)
L’association des protéines sériques dénaturées avec les micelles de caséines contribue à
augmenter le nombre et la force des liaisons entre protéines (Lucey et al., 1998). Cette augmentation
du nombre de points de contacts entre micelles de caséines conduit alors à une fermeté du gel plus
élevée et à une diminution de l’expulsion de lactosérum (Figure 7) (Lucey et al., 1999 ; Xu et al.,
2008). L’épaulement à 5000 s (Figure 7), correspondant à un pH proche de 5, est attribué à la
déstructuration de la micelle de caséines suite à la dissociation du phosphate de calcium (Donato &
Guyomarc’h, 2009).
14
G’ (Pa)
Temps (s)
Figure 7 : Module élastique (G’) en fonction du temps pour des gels laitiers fermentés à 45°C à base de lait écrémé
non traité thermiquement ( ), traité thermiquement à ( ) 80°C, ( ) 85°C, ( ) 90°C ou ( ) 95°C pendant une
minute (d'après Xu et al., 2008)
Les complexes thermo-induits solubles interviennent également de manière importante dans la

structuration du gel (Donato & Guyomarc’h, 2009 ; Vasbinder & de Kruif, 2003 ; Anema et al.,
2004). Ainsi, en ralentissant les phénomènes d’agrégation des micelles de caséines, une
microstructure fine serait favorisée pour les gels à base de lait traité thermiquement, alors que de gros
agrégats seraient présents dans les gels obtenus par gélification acide d’un lait non traité
thermiquement (Figure 8) (Lucey et al., 1998).
a b
Figure 8 : Images obtenues en microscopie confocale à balayage laser de gels laitiers acidifiés à 30°C à l’aide de
1,3% de GDL à partir de lait (a) non traité thermiquement et (b) traité thermiquement à 80°C pendant 30 min. La
barre représente 20 µm (d'après Lucey et al., 1999)
I.3.2. Méthode d’acidification
Seule une cinétique d’acidification lente associée à une absence d’agitation lors de la transition
sol-gel permet d’obtenir un gel ferme et cohésif. En effet, dans le cas d’une dissociation brutale des
caséines de la micelle, l’effondrement de la structure empêche la mise en place d’un réseau gélifié.
15
De nombreuses études scientifiques ont été réalisées en utilisant une acidification chimique, au
moyen d’acide chlorhydrique (HCl), et plus fréquemment de glucono-δ-lactone (GDL).
Contrairement à l’HCl, la GDL s’hydrolyse progressivement. De plus, elle présente l’avantage de
s’affranchir des variations de l’activité bactérienne lors de l’utilisation de ferments, tout en assurant
une acidification du lait (Cayot & Lorient, 1998). En effet, l’utilisation de bactéries lactiques, telles
que généralement Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus et Streptococcus thermophilus dans le cas
de la fabrication des yaourts, expose à une production d’exopolysaccharides et une activité
protéolytique variables (Duboc & Mollet, 2001 ; Ruas-Madiedo et al., 2002 ; Hassan et al., 2003).
Néanmoins, Lucey et al. (1998) ont montré des différences rhéologiques et microstructurales entre les
gels acides obtenus par hydrolyse de GDL ou par fermentation.
En comparaison avec une acidification par fermentation, les gels obtenus par acidification
chimique à l’aide de GDL présentent un temps de gélification plus court (Figure 9) mais un module
élastique G’ plus élevé (Figure 10). La zone de transition sol-gel, proche du point isoélectrique des
micelles de caséines, plus longue pour l’acidification au moyen de GDL, pourrait expliquer en partie
la valeur élevée de G’ (Figure 9) (Lucey et al., 1998). Il est à noter que les cinétiques d’acidification
sont largement influencées par la température, ce qui est vrai aussi bien pour une acidification à l’aide
de GDL que lors de l’utilisation de ferments (paragraphe I.3.3 de ce chapitre).
7,0
6,5
6,0
pH
5,5
Transition sol-gel
5,0
4,5
4,0
0 5 10 15 20
Temps (ks)
Figure 9 : Suivi du pH lors de l’acidification à 42°C d’un lait acidifié à l’aide de ( ) 1,3% de GDL ou ( ) 2% de
ferments. Le traitement thermique était de 85°C pendant 30 min (d’après Lucey et al., 1998)
16
La microstructure est également affectée par la méthode d’acidification. Des gels ayant une
microstructure plus fine et homogène sont obtenus lors d’une acidification chimique, alors que la
fermentation bactérienne génère des gels contenant de plus grands agrégats de particules et des pores
de plus grande taille, augmentant ainsi la séparation de lactosérum (Figure 10). L’hétérogénéité des
gels obtenus via l’utilisation de bactéries lactiques serait provoquée par un gradient de pH, en raison
d’une production d’acide plus importante dans certaines zones confinées de croissance des colonies
de bactéries (Laligant et al., 2003 ; Renan et al., 2008).
tan δ
G’ (Pa)
Temps (ks)
Figure 10 : Module élastique G’ (lignes pleines) et tan δ (lignes en pointillés) en fonction du temps et images
obtenues en microscopie confocale à balayage laser de gels laitiers acidifiés à 30°C pour des gels laitiers acidifiés à
42°C à l’aide de ( ) 1,3% de GDL ou (∇) 2% de ferments. Le traitement thermique était de 85°C pendant 30 min.
La barre représente 10 µm (d'après Lucey et al., 1998)
I.3.3. Température et vitesse d’acidification
Les cinétiques d’acidification dépendent certes de la méthode d’acidification (Figure 9), mais
aussi de la température. Ainsi, l’utilisation de températures d’acidification élevées résulte en une
diminution du temps de formation du gel mais en une augmentation du pH de gélification (environ
0,1 unité pH pour une variation de température de 10°C) (Haque et al., 2001). En revanche, l’effet de
la température d’acidification sur le module G’ varie en fonction de la méthode d’acidification. Alors
que Lucey et al. (1998), utilisant la GDL, obtiennent un gel plus faible pour une température
d’acidification de 42°C en comparaison avec 30°C, Haque et al. (2001) montrent une augmentation
du module élastique G’ lorsque la température d’acidification augmente, suite à une acidification à
l’aide de ferments. Selon Haque et al. (2001), les interactions hydrophobes, favorisées aux
températures d’acidification élevées, seraient la force conductrice de l’agrégation des micelles, et
17
augmenteraient la force du gel. De plus, ces interactions hydrophobes permettraient au gel de se

former à des pH plus élevés, en nécessitant une diminution des répulsions électrostatiques moins
importante pour que l’agrégation ait lieu (Haque et al., 2001 ; McMahon et al., 2009 ; Niki et al.,
2000).
De manière générale, les résultats de la littérature ne sont pas consensuels quant aux propriétés
des gels obtenus aux différentes vitesses d’acidification en considérant la méthode d’acidification
utilisée (Jacob et al., 2011 ; Lee & Lucey, 2004 ; Kristo et al., 2003 ; Peng et al., 2009 ; Béal et al.,
1999). Cependant, même si le pH de gélification n’est pas modifié par la vitesse d’acidification pour
une température d’acidification donnée (McMahon et al., 2009), les variations de vitesse de
solubilisation du phosphate de calcium et du temps disponible pour le réarrangement des particules
génèrent un réseau de particules de caséines contenant différents niveaux de minéralisation, ce qui
pourrait participer à une variation importante de la microstructure des gels.
La température d’acidification a une influence importante sur la microstructure des gels obtenus
par acidification chimique et non sur celle des gels fermentaires (Lucey et al., 1998). La perméabilité,
la taille des pores et la séparation de lactosérum sont autant de paramètres qui augmentent lorsque la
température d’acidification est élevée. La nature compacte mais poreuse du réseau formé aux
températures élevées s’explique par la force des interactions hydrophobes, suffisantes pour maintenir
les protéines sous forme de particules colloïdales sphériques, ce qui diminue les zones de contact
entre protéines. Au contraire, l’agrégation lente des caséines aux faibles températures d’acidification,
augmenterait le nombre de jonctions entre les agrégats de caséines et par conséquent, la finesse du
réseau (Figure 11) (McMahon et al., 2009 ; Vétier et al., 1997 ; Lee & Lucey, 2004).
10°C 20°C 30°C 40°C
Figure 11 : Schémas issus d’observations en microscopie électronique de gels laitiers à pH 4,8 à base de lait acidifié
à l’aide de GDL à différentes températures (de 10°C à 40°C). Les micelles de caséines natives sont représentées en
noir et les agrégats de protéines enchevêtrées de manière lâche en gris. La barre représente 200 nm (d'après
McMahon et al., 2009)
18
I.3.4. Traitement mécanique
Le passage du gel ferme au gel brassé aboutit à la formation d’une dispersion concentrée de
morceaux de gel dans le sérum. Sous l’effet d’un cisaillement suffisant, le gel ferme se rompt puis les
agrégats sont réduits en des fragments de plus en plus petits (Figure 12) (van Marle et al., 1999).
Réseau 1
Viscosité
Agrégats 2
Particules
Temps
Figure 12 : Représentation schématique de la rupture des agrégats protéiques dans un champ de cisaillement.
(1) Occupation de l’espace par le réseau ; (2) Ecoulement des agrégats ; (3) Ecoulement des particules (d'après van
Marle et al., 1999)
L’intensité de la déstructuration dépend non seulement du cisaillement appliqué, mais aussi des
propriétés du gel ferme initial dont son homogénéité (van Marle, 1998). Ainsi, la structure et les
propriétés rhéologiques du gel ferme initial sont conservées au sein des fragments de gel après
brassage (Cayot et al., 2003 ; Renan et al., 2009).
La viscosité d’un tel système dépend du volume total occupé par les morceaux de gel (fraction
volumique), des propriétés des morceaux de gel (telle que la déformabilité sous écoulement) mais
également de leur interaction (Zoon & van Marle, 1998 ; Zoon, 2003). Une restructuration du gel a
lieu lors du stockage, ce qui contribue à une thixotropie partielle du gel brassé (Dejmek & Cuvelier,
1998 ; Ramaswamy & Basak, 1991). Cette reprise en texture juste après brassage s’explique par la
diminution de la température lors du brassage, par une post-acidification ou une production
d’exopolysaccharides par les bactéries, mais aussi par le pH auquel a lieu le brassage qui modifie
l’intensité des interactions électrostatiques (Renan et al., 2009). Cependant, la relation entre les
propriétés intrinsèques des morceaux de gel et leur interaction et les propriétés rhéologiques du gel
brassé n’est pas encore élucidée, laissant ainsi le champ à de nouvelles recherches.
19
II. STABILITE DES MELANGES DE BIOPOLYMERES
II.1. Les phénomènes de séparation de phases

II.1.1. Interactions polymères / polymères
II.1.1.1. Aspects généraux
Le mélange de deux polymères dans un solvant aboutit généralement à une séparation de

phases lorsque les concentrations sont suffisamment élevées, la miscibilité totale étant l’exception
(Tolstoguzov, 1991 ; Syrbe et al., 1998). L’interaction entre les polymères produit principalement
quatre types de systèmes (Figure 13) constitués d’une phase dans le cas de milieux extrêmement
dilués ou de la formation de complexes solubles, ou de deux phases suite à une séparation de phases
microscopique ou macroscopique (Tolstoguzov, 1991).
P1 P2
MELANGE
(P1 et P2) (P1) et (P2)

Incompatibilité de type ASSOCIATIF Incompatibilité de type SEGREGATIF
C < Cseuil C > Cseuil
(P1 et P2) S P2+ S S

(P1) et (P2)
(P1 et P2) +S (P1) et (P2)
+S P1+ S
+S +S
Complexes Précipitation des Co-solubilité Séparation de Séparation de
solubles complexes insolubles phases phases
S S
P1 P2 P1 P2
Figure 13 : Types de phénomènes de séparation de phases et représentation schématique des diagrammes de phases
pour un mélange ternaire polymère (P1) / polymère (P2) / solvant S
20
Lors d’une séparation de phases, les deux polymères se répartissent inégalement dans le
mélange en raison d’une répulsion ou d’une attraction entre les macromolécules. Deux types de
séparation de phases peuvent alors se présenter :
• Séparation de phases de type ségrégatif ou incompatibilité thermodynamique
Dans ce cas, qui est le plus courant, les interactions solvant / polymères sont privilégiées au
détriment des interactions polymères / polymères et solvant / solvant. Le système résulte en la
formation de deux phases enrichies chacune en l’un des polymères, le solvant se répartissant plus ou
moins équitablement entre ces deux phases. Dans certaines conditions, le système se présente sous la
forme de gouttelettes et peut ainsi être considéré comme une émulsion eau dans eau (Tolstoguzov,
2003). Ce système biphasique se produit classiquement dans les mélanges de polymères non ioniques,
les mélanges de polymères ioniques et non ioniques ou enfin lorsque les polymères sont chargés de la
même manière (Grinberg & Tolstoguzov, 1997).
• Séparation de phases de type associatif ou coacervation complexe
En condition de compatibilité thermodynamique, une attraction électrostatique entre les

polymères conduit à la formation de complexes solubles ou insolubles. Dans le cas de complexes
insolubles, deux phases se forment suite à une différence de densité du complexe avec le milieu
environnant, les deux polymères étant concentrés dans une phase alors que l’autre contient
essentiellement le solvant. Ce type de séparation de phases se produit généralement au sein d'un
mélange de polyélectrolytes de charges globales différentes, par exemple des mélanges entre des
protéines à un pH inférieur à leur point isoélectrique et des polysaccharides anioniques.
A l’équilibre thermodynamique, les mélanges de polymères peuvent être décrits par leur
diagramme de phases (Tolstoguzov, 1991). Toutefois il faut garder à l’esprit que la séparation de
phases relève d’un phénomène cinétique. La Figure 13 correspond à deux diagrammes de phases en
représentation triangulaire, relatifs à des systèmes respectivement associatifs et ségrégatifs.
Néanmoins, la représentation en coordonnées cartésiennes (Figure 14) est plus courante puisque le
solvant est le constituant majoritaire. La binodale délimite la frontière entre la zone monophasique de
miscibilité et la zone biphasique d’incompatibilité. Les points situés sur la binodale sont reliés par des
lignes de conjugaison. Tous les mélanges situés sur une même droite de conjugaison conduisent à des
phases de même composition, mais avec des volumes respectifs différents. Enfin, il est possible
d’identifier une zone supplémentaire située à l’intérieur de la zone biphasique d’incompatibilité. Elle
21
est délimitée par une ligne appelée spinodale. Les mélanges dont la composition se situe dans cette
zone présentent une cinétique de séparation de phases particulièrement rapide.
Binodale
Spinodale
Zone
Polymère 1
d’incompatibilité
Lignes de
conjugaison
Zone
métastable
Zone de miscibilité
Polymère 2
Figure 14 : Représentation schématique d’un diagramme de phases de type ségrégatif en coordonnées cartésiennes
d’un mélange polymère 1 / polymère 2 / solvant
Le tracé du diagramme de phases se fait en deux étapes complémentaires. D’une part, la

détermination visuelle de la stabilité des mélanges permet d’accéder aux limites des zones stables et
instables et ainsi à la binodale. Dans certains cas, la séparation de phases macroscopique des systèmes
métastables peut être masquée par des viscosités élevées voire la gélification d’un des composés.
D’autre part, les lignes de conjugaison peuvent être déterminées par une analyse de la composition de
chaque phase appartenant au domaine biphasique, ce qui permet de confirmer le type d’interactions
impliquées (Tolstoguzov, 1991 ; Michon et al., 1997).
De nombreux paramètres ont une influence sur les diagrammes de phases. Outre la
concentration en polymères, la masse molaire, la force ionique, le pH ou encore la température
modifient le comportement de phases des mélanges (Polyakov et al., 1997 ; Schmitt & Turgeon,
2011 ; de Kruif et al., 2004).
II.1.1.2. Aspect cinétique de la séparation de phases
Les phénomènes de séparation de phases dans les systèmes protéines / polysaccharides sont des
procédés cinétiques qui évoluent dans le temps selon les systèmes. Ainsi, deux modèles généraux sont
principalement utilisés pour décrire les cinétiques de séparation de phases : la décomposition
spinodale et la nucléation et croissance (Sanchez et al., 2002 ; Turgeon et al., 2003).
22
Temps
Figure 15 : Représentation schématique du mécanisme de (a) décomposition spinodale et (b) nucléation et

croissance en fonction du temps (d’après Turgeon et al., 2003)
La décomposition spinodale a lieu lors d’un passage rapide de la zone stable à une région
suffisamment profonde de la zone instable, à l’intérieur de la spinodale (Figure 15a). De petites
fluctuations de concentration entraînent la formation rapide et spontanée de zones de taille identique
qui se concentrent sans évolution de taille, donnant lieu à un réseau biphasique interconnecté.
Le mécanisme de nucléation et croissance est observé dans la zone métastable située entre la
binodale et la spinodale (Figure 15b). Dans cette région, les fluctuations de concentration doivent
dépasser une taille critique pour franchir la barrière énergétique et pouvoir subsister. Au-delà de cette
valeur seuil, les noyaux formés croissent en taille, bien que ce phénomène soit aléatoire et lent.
II.1.1.3. Approche thermodynamique
Pour comprendre les phénomènes d’incompatibilité thermodynamique, différents modèles ont

été proposés (Edmond & Ogston, 1968 ; Flory, 1942). La théorie la plus largement admise, et
considérée comme la pierre angulaire de la thermodynamique des polymères en solution, est celle de
Flory-Huggins (1942). Elle permet de calculer l’enthalpie libre des mélanges en absence d’interaction
spécifique entre les macromolécules, pour des systèmes peu concentrés en polymères et pour des
polymères neutres (Flory, 1942).
D’un point de vue thermodynamique, l’enthalpie libre de mélange ∆Gm doit être minimale pour
que les polymères soient compatibles.
∆Gm = ∆H m − T∆S m Eq. 1
avec ∆Hm : enthalpie de mélange ; ∆Sm : entropie de mélange.
Dans le cas des polymères, l’entropie de mélange est relativement faible et la variation de ∆Gm
dépend donc essentiellement de ∆Hm.
23
Le paramètre d’interaction de Flory-Huggins χ intervient dans l'expression de l'enthalpie et

donc dans celle de l'enthalpie libre. Celui-ci permet de prévoir la compatibilité des deux polymères.
Ainsi, la séparation de phases apparaît lorsque le paramètre d’interaction de Flory-Huggins dépasse
une valeur critique qui dépend de la masse molaire des polymères.
Cette approche, appliquée à l’origine au cas de deux polymères dans un solvant organique, ne
convient pas aussi parfaitement aux mélanges protéines / polysaccharides en milieu aqueux. De plus,
le modèle est applicable uniquement dans le cas de protéines ayant une conformation en pelote
statistique (Doublier et al., 2000). Partant de ce constat, d’autres auteurs ont proposé des alternatives
à cette approche, notamment pour les systèmes contenant une molécule semi-flexible ou repliée
comme les protéines globulaires. Pour ces systèmes, le modèle basé sur le développement du viriel
(ou théorie de la déplétion-floculation) (Edmond & Ogston, 1968) est souvent utilisé.
II.1.2. Interactions polymères / particules colloïdales : les phénomènes de

floculation
Contrairement aux protéines globulaires natives, les micelles de caséines possèdent une taille
suffisamment élevée pour être considérées comme des colloïdes au sens classique du terme. Dans le
cas de mélanges particules / polysaccharides, la thermodynamique relève de phénomènes de
floculation générés soit par des interactions de déplétion (séparation de phases de type ségrégatif),
soit par pontage entre les particules (séparation de phases de type associatif).
II.1.2.1. Déplétion-floculation : absence d’affinité des polymères pour la surface des

particules
Le principe de la déplétion-floculation a été décrit pour la première fois par Asakura & Oosawa
(1958) dans le cas théorique de sphères dures en présence de polymères de taille plus petite et non
adsorbants (Figure 16). Chaque particule de diamètre σ est entourée d’une couche de déplétion
d’épaisseur rg correspondant au rayon de giration du polymère. Puisque l’espace entre les deux
particules n’est plus accessible au polymère pour des raisons entropiques, le polymère se trouve exclu
de la zone interparticulaire. Si deux particules se rapprochent du fait des mouvements browniens,
leurs couches de déplétion s’interpénètrent et définissent un micro-volume dans lequel la pression
osmotique π1 est inférieure à celle du reste de la solution π2. Une force d’attraction générée par le
gradient de pression osmotique s’exerce entre les particules et conduit à leur floculation.
24
Suspension de rg Exclusion du polymère Attraction des particules

particules
σ
π1
+ polymères
π1 < π2
Figure 16 : Représentation schématique du mécanisme de déplétion-floculation (d’après Asakura & Oosawa, 1958)
Cette force attractive dépend non seulement des tailles et formes des polymères et particules,
mais aussi de leurs concentrations respectives. Ainsi, la floculation par déplétion ne se produit qu’au-
delà d’une concentration minimale en polymères libres et conduit à une séparation de phases
(Figure 17a et b). Aux concentrations élevées en polymères, les effets de déplétion peuvent être
masqués par des viscosités élevées qui ralentissent l’agrégation (Figure 17c), alors que de hautes
concentrations en particules conduisent à une pseudostabilité due à la cohésion des particules entre
elles qui forment un réseau (Figure 17b*). Cependant, il s’agit, dans ces deux cas, d’une stabilité
relative à une échelle de temps considérée et variable selon le réarrangement des particules et chaînes
de polymères (Syrbe et al., 1998).
Concentration en polymères
Concentration en particules
Figure 17 : Influence de la concentration en polymères et en particules sur la stabilité du mélange particules /

polymères. Cas de l’absence d’affinité entre polymères et particules. Lors d’une augmentation de la concentration en
polymères, le système passe par la transition d’un mélange (a) stable ; (b) à une déstabilisation du mélange par
déplétion-floculation ; (c) à un mélange stable. Aux hautes fractions volumiques en particules, une région de
pseudostabilité se forme (b*) (d'après Syrbe et al., 1998)
25
La réversibilité de la déplétion est rendue possible par la nature faiblement énergétique des
liaisons entre les particules. D’une part, une dilution du système ou une modification des conditions
du milieu permet de redisperser les particules floculées, et d’autre part, un ajout de polymères après
dilution conduit de nouveau à la précipitation.
II.1.2.2. Floculation par pontage : affinité des polymères pour la surface des
particules
La floculation par pontage se produit dans le cas d’un polymère adsorbant, c’est-à-dire
présentant une affinité particulière pour la surface de la particule. Elle fait intervenir des interactions
spécifiques, généralement de nature électrostatique, entre la surface de la particule et le polymère de
charges opposées. En fonction de la concentration en polymères, le système peut aboutir à une
floculation ou à une stabilisation stérique.
Concentration en polymères
Figure 18 : Influence de la concentration en polymères sur la stabilité du mélange particules / polymères. Cas de la
présence d’affinité entre polymères et particules. (a) Floculation par pontage ; (b) stabilisation ; (c) déstabilisation
par déplétion-floculation ; (d) stabilisation par enchevêtrement des polymères (d’après Syrbe et al., 1998)
Dans le cas de très faibles concentrations en polymères, une chaîne de polymères peut
s’adsorber sur plusieurs particules, formant ainsi un agrégat lâche qui sédimente le plus souvent par
différence de densité avec le milieu (Figure 18a) (Dickinson, 1998 ; Syrbe et al., 1998). Cependant, le
pontage ne peut se produire que dans des conditions d’extension suffisante de la chaîne du polymère
dans le milieu, ce qui permet de limiter la répulsion électrostatique entre les particules. Par ailleurs, le
maximum de floculation a lieu pour un recouvrement de 50% de la surface des particules
(Maroziene & de Kruif, 2000).
Au-delà de ce taux de recouvrement de la surface des particules, les polymères adsorbés

contribuent à une stabilisation stérique du système (Figure 18b). En effet, la saturation du
recouvrement de la surface des particules provoque un recouvrement par une couche de polymères
26
dont la mobilité diminue et une répulsion entre les particules. Finalement, les particules sont
immobilisées et stabilisées dans un réseau formé par les chaînes enchevêtrées de polymères
(Figure 18d) (Dickinson, 1998).
Un troisième type de floculation, qui fait intervenir à la fois les phénomènes de déplétion et de
pontage, peut se produire (Figure 18c). Lorsque le recouvrement de la surface des particules par les
polymères est total, les polymères libres non adsorbés peuvent induire un phénomène de déplétion-
floculation et donc une séparation de phases suite à la sédimentation des particules (Syrbe et al.,
1998).
II.2. Les phénomènes de séparation de phases dans les mélanges lait /

polysaccharides
Lors de l’étude du comportement de mélanges de protéines de lait et polysaccharides, le pH et
la force ionique peuvent influencer de manière importante l’association des protéines. Par conséquent,
seuls les systèmes en milieu neutre, se situant au-dessus du point isoélectrique des protéines, seront
traités dans cette partie.
Puisque la nature des interactions entre les polysaccharides et les micelles de caséines
(floculation par déplétion ou par pontage) fait intervenir ou non les charges des polymères, une
distinction entre la catégorie des polysaccharides neutres et chargés a été effectuée. Ainsi, la densité
de charges des différents polysaccharides étudiés en mélange avec les protéines de lait dans la
littérature a été récapitulée dans la Figure 19.
Carraghénanes
Guar
κ ι λ
Caroube
β-glucanes Xanthane DS 0,7 CMC DS élevé
Dextrane Gellane
Dextrane
HM Pectines LM
sulfate
0 0,25 0,5 1 1,5 2

Densité de charges (mol / mol de monosaccharide)
Figure 19 : Densité de charges de différents polysaccharides. DS : degré de substitution (d’après de Jong & van de
Velde, 2007)
27
II.2.1. Séparation de phases de mélanges protéines de lait /

polysaccharides neutres
De manière consensuelle, toutes les études portant sur les mélanges entre un polysaccharide
neutre et les protéines de lait concluent à un phénomène de séparation de phases de type ségrégatif
entre les deux composés en présence (Tableau 3). Une distinction peut toutefois être faite entre les
systèmes en fonction de la nature des protéines. En effet, les systèmes contenant des micelles de
caséines, pouvant être considérées comme étant de nature particulaire, conduisent à une floculation
des micelles par déplétion, alors que les caséinates, de taille nanométrique, sont décrits comme
conduisant à une incompatibilité thermodynamique.
Lorsqu’un système mixte atteint l’équilibre thermodynamique et se sépare en deux phases

distinctes, la composition en polymères de chaque phase peut être évaluée et représentée sous la
forme d’un diagramme de phases (Figure 14). Cependant, à l’échelle microscopique et hors équilibre,
ces systèmes protéines de lait / polysaccharides neutres peuvent être considérés comme une émulsion
eau dans eau avant que la séparation de phases macroscopique intervienne. Au sein de cette émulsion,
la phase ayant la plus grande fraction volumique à l’équilibre tend à former la phase continue (Frith,
2010 ; Tolstoguzov, 2003). A titre d’exemple, le mélange de concentrations initiales en lait écrémé de
41% et en caroube de 0,45% ayant un rapport volumique de 75/25 entre les micelles de caséines et la
caroube conduit à la dispersion de la caroube sous forme de gouttelettes dans une phase continue
enrichie en protéines ; les deux phases étant inversées dans le cas d’un rapport de 25/75 entre les
micelles de caséines et la caroube. Au point d’inversion de phases, le mélange aboutit à un système
bicontinu dans lequel les deux phases occupent chacune 50% du volume total (Figure 20) (Schorsch
et al., 1999).
28
Tableau 3 : Récapitulatif des principales études effectuées sur les mélanges polysaccharides neutres / protéines de
lait en milieu neutre. Le type de phénomène est donné tel que décrit par les auteurs.
Protéine
Polysaccharide Conditions Phénomène Références
de lait
Guar
pH 7, 20°C,
Déplétion-floculation Bourriot et al., 1999b
Non 0,25 M NaCl
dépolymérisé Micelles pH 6,86, 20°C, Incompatibilité
Antonov et al., 1998
de >0,15 M NaCl thermodynamique
caséines
pH 6,6 à 7, 20°C, Bourriot et al., 1999b ;
Dépolymérisé Déplétion-floculation
0,25 M NaCl Tuinier et al., 2000
pH 6,86, 20°C,
Compatibilité Antonov et al., 1998
<0,01 M NaCl
Caséinates
Non de sodium pH 6 à 6,86, 20°C, Incompatibilité Antonov et al., 1998 ;
dépolymérisé >0,01 M NaCl thermodynamique Spyropoulos et al., 2010
Lait
pH 6,7, 25°C Déplétion-floculation Thaiudom & Goff, 2003
écrémé
Caroube
pH 7, 20°C,
Micelles Déplétion-floculation Bourriot et al., 1999c
0,25 M NaCl
de
pH 6,8, 5°C, Incompatibilité
caséines Schorsch et al.,1999
0,08 M NaCl thermodynamique
Non
Caséinates Incompatibilité
dépolymérisé pH 6, 20°C Spyropoulos et al., 2010
de sodium thermodynamique
pH 6,8, 5°C, Incompatibilité
Lait Schorsch et al., 1999
0,08 M NaCl thermodynamique
écrémé
pH 6,7, 25°C Déplétion-floculation Thaiudom & Goff, 2003
β-glucanes
Incompatibilité
Non Lait Lazaridou et al., 2008 ;
pH neutre thermodynamique
dépolymérisé écrémé Vasiljevic et al., 2007
(déplétion-floculation)
Dextrane
Micelles
Non pH 7, 20°C,
de Déplétion-floculation Bourriot, 1999
dépolymérisé 0,25 M NaCl
caséines
29
Caroube (%)
75 % caroube (phase continue)

25 % lait (phase dispersée)
Système bicontinu
(fraction volumique de 50/50%)
25 % caroube (phase dispersée)

75 % lait (phase continue)
Poudre de lait écrémé (%)

Figure 20 : Microstructure du système ternaire protéines de lait / caroube / sucre à 20% obtenue par microscopie
confocale à 5°C en fonction de la proportion lait / caroube (d'après Schorsch et al., 1999)
Les émulsions eau dans eau sont gouvernées en grande partie par les mêmes principes
physiques, incluant les mécanismes menant à la rupture et la coalescence des gouttelettes, que dans le
cas des émulsions huile dans eau conventionnelles (Foster et al., 1997). Néanmoins, certaines
caractéristiques spécifiques des émulsions eau dans eau peuvent être identifiées :
− une miscibilité partielle des deux phases en raison de la présence d’un solvant commun,
l’eau. Ainsi plus de 90% du solvant peut se déplacer entre les deux phases, ce qui pose la question de
la présence d’une interface dans ces systèmes et de la façon dont elle est stabilisée (Cullen, 2009) ;
− l’absence de positionnement préférentiel des tensio-actifs à l’interface. En effet, les

molécules tensio-actives tendent davantage à rester dans les phases aqueuses sous forme micellaire en
raison de l’absence de phase hydrophobe dans le système ;
− une très faible tension interfaciale, de 0,5 à 500 µN.m-1, soit d’un ordre de grandeur
deux à trois fois plus faible que dans les systèmes huile dans eau (Tolstoguzov, 2003 ; Ding et al.,
2002) ;
− une différence de densité relativement faible entre les deux phases aqueuses.
30
L’ensemble de ces propriétés contribue d’une part à la déformabilité élevée des gouttelettes et
d’autre part, à un ralentissement de la déstabilisation par sédimentation ou crémage (Tolstoguzov,
1991). Néanmoins, de manière générale, les facteurs qui déterminent la stabilité de ces gouttelettes en
suspension sont définis par la loi de Stokes (Eq. 2).
2r 2 g∆ρ
v= Eq. 2
9η
avec v : vitesse de sédimentation (m.s-1) ; r : rayon de la particule (m) ; g : accélération de la
pesanteur (m.s-2) ; ∆ρ : différence de masse volumique entre les deux phases (kg.m-3) ; η : viscosité
de la phase continue (Pa.s).
Ainsi, de la même manière que les émulsions huile dans eau classiques, les émulsions eau dans
eau sont soumises à des phénomènes de déstabilisation tels que la coalescence, le crémage ou la
sédimentation (Foster et al., 1997). Hors équilibre thermodynamique, les séparations de phases des
systèmes polysaccharides / protéines de lait relèvent donc d’un processus cinétique (Figure 21).
a b
Figure 21 : Evolution de la microstructure du mélange 0,4% caroube / 40% de poudre de lait écrémé / 20% de sucre
observée par microscopie confocale à 5°C et (a) juste après mélange ou (b) une minute après arrêt du mélange. La
barre représente 50 µm (d'après Schorsch et al., 1999)
La vitesse de coalescence dépend donc de l’état des gouttelettes (déformabilité et forme), des
forces de collision entre gouttelettes et du temps de contact (Foster et al., 1997 ; Schorsch et al.,
1999). Ceci pourrait expliquer la tendance des gouttelettes enrichies en polysaccharides à coalescer
dans le mélange contenant majoritairement des micelles de caséines (Figure 20). Ainsi, la faible
viscosité de la phase continue protéique favorise la fusion des gouttelettes qui conservent alors une
forme non parfaitement sphérique immédiatement après leur coalescence.
Les vitesses de sédimentation et de crémage sont largement influencées par la différence de

densité entre les deux phases, la viscosité de la phase continue et la taille des gouttelettes. Lorsque la
mobilité des gouttelettes est réduite, par exemple dans les cas d’une faible différence de densité entre
les phases ou d’une viscosité de la phase continue élevée, la séparation de phases peut parfois ne pas
31
être visible sur l’échelle de temps considérée (Frith, 2010 ; Syrbe et al., 1998). Au contraire, une
grande taille de gouttelettes accélère le phénomène de déstabilisation (Foster et al., 1997).
Certains facteurs, liés aux caractéristiques des protéines ou des polysaccharides ainsi que celles
du solvant, peuvent moduler les phénomènes de séparation de phases. En comparaison avec la poudre
de lait écrémé, l’utilisation de micelles de caséines augmente l’incompatibilité du système, ce qui met
en lumière l’influence de la nature des protéines dans la stabilité des mélanges (Schorsch et al., 1999).
Plusieurs études menées sur différents mélanges guar / protéines de lait ont montré que
l’incompatibilité est d’autant plus marquée que la masse moléculaire du polysaccharide est
importante (Bourriot et al., 1999b ; Tuinier et al., 2000). Par ailleurs, en multipliant la concentration
en galactomannane par la viscosité intrinsèque de chaque galactomannane, une courbe maîtresse est
obtenue par Bourriot et al. (1997) (Figure 22), montrant ainsi que pour un polysaccharide donné, les
phénomènes d’incompatibilité thermodynamique sont gouvernés par le volume occupé par les
chaînes.
Figure 22 : Influence de la viscosité intrinsèque sur le comportement de séparation de phases de mélanges caséines /
galactomannanes (Bourriot et al., 1997)
La compatibilité entre les polysaccharides et les protéines de lait est également affectée par la
qualité du solvant. Ainsi, Antonov et al. (1998) se sont intéressés à l’influence de la force ionique sur
le comportement de systèmes guar / caséinates, montrant une zone de compatibilité d’autant plus
étendue que la force ionique du milieu est faible, ce qui est typique des mélanges présentant une
incompatibilité thermodynamique. Par ailleurs, une augmentation de la miscibilité des systèmes
caroube / protéines de lait a été observée après l’ajout d’une teneur en sucre inférieure à 15% dans le
cas des caséinates et 20% pour les micelles de caséines (Schorsch et al., 1999 ; Spyropoulos et al.,
2010).
32
La microstructure spécifique des mélanges lait / polysaccharides neutres confère à ces systèmes
des propriétés rhéologiques particulières. Il est à noter que la caractérisation doit s’effectuer avant que
la déstabilisation ne soit observée à l’échelle macroscopique. D’un point de vue rhéologique, un effet
de synergie a été observé suite à l’ajout de polysaccharides aux micelles de caséines. Ainsi, la
viscosité apparente du mélange est supérieure à la somme des viscosités des composés individuels
aux mêmes concentrations en raison d’une surconcentration en guar dans la phase continue. Par
ailleurs, la boucle d’hystérésis présente pour le mélange micelles de caséines / guar peut être
vraisemblablement attribuée à la structure du système sous la forme d’une émulsion eau dans eau qui
pourrait être modifiée par le cisaillement (Figure 23) (Bourriot et al., 1999c).
Figure 23 : Courbes d’écoulement d’une solution de guar à 0,2% (GG), d’une suspension de micelles de caséines à
3% (MC) et d’un mélange de 0,2% de guar et 3% de micelles de caséines dans 0,25 M NaCl (Bourriot et al., 1999c)
II.2.2. Séparation de phases de mélanges protéines de lait /

polysaccharides chargés
A la différence des systèmes précédents qui faisaient intervenir des espèces neutres, il faut tenir
compte des charges apportées par les polysaccharides. Lorsqu’un polysaccharide chargé est mélangé
à des protéines de lait, la question d’une éventuelle interaction entre les deux composés se pose. Une
des approches consiste à analyser les mécanismes intervenant dans le système mixte en fonction de la
densité de charges des polymères. Cependant, quelle que soit la charge des polysaccharides,
l’ensemble des mélanges polysaccharides chargés / protéines de lait décrits dans la littérature, à
l’exception de ceux contenant du carraghénane (Tableau 5) et d’un cas particulier avec le xanthane
(Tableau 4) est attribué à un phénomène de déplétion-floculation ou à une incompatibilité
thermodynamique (Tableau 4 et Tableau 5). Par ailleurs, le type de charge portée par le
polysaccharide est également susceptible de rendre possible ou non une association avec les protéines
de lait.
33
Tableau 4 : Récapitulatif des principales études effectuées sur les mélanges polysaccharides chargés de type
carboxylé / protéines de lait en milieu neutre. Le type de phénomène est donné tel que décrit par les auteurs (DE :
degré d’estérification ; DS : degré de substitution ; CMC : carboxyméthylcellulose ; HM : hautement méthylées ;
LM : faiblement méthylées ; LMA : faiblement méthylées et amidées ; EPS : exopolysaccharides).
Polysaccharide Protéine Conditions Phénomène Références

Xanthane Densité de charges : 0,25 mol / mol de monosaccharide
Micelles de
pH 6,8, 20°C Déplétion-floculation Bhat et al., 2006
caséines
Incompatibilité
pH neutre, 20°C Hemar et al., 2001
thermodynamique
Caséinates de
Association faible
sodium
pH 6,6 (interactions Kobori et al., 2009
hydrophobes)
Thaiudom & Goff,
2003 ; Hemar et al.,
pH 6,5 à 6,7, 20 à
Lait écrémé Déplétion-floculation 2001 ; Aichinger et
40°C
al., 2007 ; Antonov et
al., 1994
Pectines Densité de charges : pectines HM : 0,3 ; LM : 0,65 mol / mol de monosaccharide
Micelles de Incompatibilité Tuinier & de Kruif,
HM (DE 61%) pH 6,7 à 5, 20°C
caséines thermodynamique 2002
Caséinates de Incompatibilité Rediguieri et al.,
HM (DE 68%) pH > 6
sodium thermodynamique 2007
Maroziene & de
HM (DE 73%) pH 6,7 Déplétion-floculation Kruif, 2000 ; Acero
Lopez et al., 2009
Lait écrémé
Maroziene & de
LM (DE 35%) pH 6,7 Déplétion-floculation
Kruif, 2000
LMA (DE 35% et Maroziene & de
pH 6,7 Déplétion-floculation
amidé à 20%) Kruif, 2000
CMC Densité de charges : variable selon DS
Incompatibilité
CMC (DS 0,85) Lait écrémé pH 6,8, 20°C Tolstoguzov, 1993
thermodynamique
EPS Densité de charges : variable
Micelles de pH 6,8,
EPS anionique Déplétion-floculation Antonov et al., 1994
caséines 0,08 M NaCl
Girard & Schaffer-
EPS anionique Lait écrémé pH neutre Déplétion-floculation
Lequart, 2007
pH 6,6 à 6,7, Tuinier & de Kruif,
Non précisé Lait écrémé 0,1 M NaCl Déplétion-floculation 1998 ; Hassan et al.,
2003
34
Tableau 5 : Récapitulatif des principales études effectuées sur les mélanges polysaccharides chargés de type sulfaté /
protéines de lait en milieu neutre. Le type de phénomène est donné tel que décrit par les auteurs.
Polysaccharide Protéine Conditions Phénomène Références

Densité de charges : kappa : 0,5 ; iota : 1 ; lambda : 1,5 mol / mol de
Carraghénane monosaccharide
Snoeren, 1976 ;
Caséine κ 20°C Association Snoeren et al.,
1975
Caséine α
Déplétion-floculation Snoeren, 1976
et β
20°C, 50°C, Bourriot et al.,
Déplétion- floculation
0,25 M NaCl 1999a
Micelles de Association / Déplétion- Schorsch et al.,
25°C / 60°C
caséines floculation 2000
Spagnuolo et al.,
25°C Association
2005
Hemar et al.,
Caséinates Incompatibilité
20°C 2002 ; Nono et al.,
de sodium thermodynamique
2011
Kappa Alexander &
25°C / 55 ou Dalgleish, 2007 ;
Association / Déplétion-
60°C Langendorff et al.,
floculation
25°C / 60°C 1997 ; Langendorff
et al., 2000
Hemar et al.,
20°C Déplétion-floculation 2002 ; Drohan et
Lait écrémé al., 1997
Dalgleish &
Morris, 1988 ;
Tziboula & Horne,
5 à 25°C Association
1999 ; Martin et
al., 2006 ; Ji et al.,
2008
Garnier et al.,
Micelles de
20 à 60°C Association 2003; Michon et
caséines
al., 2003
Langendorff et al.,
1997 ;
Iota Association / Déplétion-
25°C / 70°C Langendorff,
floculation
Lait écrémé 1998 ; Langendorff
et al., 2000
Dalgleish &
25°C Association
Morris, 1988
Langendorff et al.,
Association / Déplétion-
Lambda Lait écrémé 25°C / 60°C 2000 ; Dalgleish &
floculation
Morris, 1988
Dextrane Densité de charges : 2 mol / mol de monosaccharide
Garnier et al.,
Micelles de pH 7, 20°C,
Sulfaté Déplétion-floculation 1998 ; Bourriot,
caséines 0,25 M NaCl
1999
35
Il a été montré que les polysaccharides sulfatés tels que les carraghénanes interagissent
davantage avec les protéines que les polysaccharides carboxylés tels que les pectines (Doublier et al.,
2000). Partant de ce constat, les résultats obtenus avec deux polysaccharides carboxylés, le xanthane
et les pectines, et deux polysaccharides sulfatés, le dextrane et les carraghénanes, en mélange avec les
protéines de lait, sont plus particulièrement décrits ci-après.
II.2.2.1. Cas du xanthane
D’une manière générale, les études menées sur l’ajout de xanthane à du lait attribuent la
séparation de phases de type ségrégatif à un mécanisme de déplétion-floculation (Figure 24)
(Tableau 4) (Aichinger et al., 2007 ; Bhat et al., 2006 ; Hemar et al., 2001 ; Thaiudom & Goff, 2003 ;
Antonov et al., 1994).
Lait écrémé (% p/p)
Xanthane (% p/p)
Figure 24 : Diagramme de phases de mélanges lait écrémé / xanthane (d'après Hemar et al., 2001)
Cependant, une différenciation du comportement de phases entre les mélanges lait / xanthane et
caséinates de sodium / xanthane a été mise en évidence. Alors qu’une séparation de phases
macroscopique est visible dans le lait à des concentrations bien inférieures à 0,1% de xanthane, le
mélange xanthane / caséinates de sodium ne se sépare qu’à partir de 0,5% de polysaccharide ajouté
(Figure 25a, c et d). A l’échelle microscopique, de petits domaines enrichis en protéines, de forme
non parfaitement sphérique, ont été observés après un ajout de 0,5% de xanthane dans le lait
(Figure 25a et b). Des petits filaments individuels uniformément distribués ont été mis en évidence
par AFM (Kobori et al., 2009) et par microscopie confocale (Hemar et al., 2001) dans le cas de
mélanges en présence de caséinates de sodium. Les opinions divergent quant à l’interprétation de ces
structures. Selon Hemar et al. (2001), la présence de caséinates favoriserait l’auto-association des
36
molécules de xanthane en raison d’interactions répulsives entre les deux composés. La seconde
explication est donnée par Kobori et al. (2009) qui émet l’hypothèse d’une liaison de particules
individuelles de caséinates de sodium sur la chaîne de xanthane au travers d’interactions
hydrophobes. Cependant, ces interactions hydrophobes seraient faiblement attractives en raison de la
répulsion électrostatique. Il faut en outre noter que la caséine κ n’interviendrait pas dans la formation
de ces structures.
a b c d
Figure 25 : Images obtenues en microscopie confocale de mélanges de (a) 5% poudre de lait écrémé / 0,1%
xanthane ; (b) 5% poudre de lait écrémé / 0,5% xanthane ; (c) 5% caséinates de sodium / 0,1% xanthane ; (d) 5%
caséinates de sodium / 1% xanthane. La barre représente 10 µm (d'après Hemar et al., 2001)
II.2.2.2. Cas des pectines
Au pH du lait, un phénomène de déplétion-floculation est décrit pour toutes les études portant
sur les mélanges lait / pectines (Tuinier et al., 2002 ; Maroziene & de Kruif, 2000 ; Acero Lopez et
al., 2009). La compatibilité des pectines avec les protéines de lait dépend peu de leur degré
d’estérification, qui est typiquement de 70% et 35% respectivement pour les pectines HM (hautement
méthylées) et LM (faiblement méthylées). Néanmoins, la zone d’incompatibilité est légèrement plus
étendue pour les pectines LM que dans le cas des pectines HM en raison d’un volume
hydrodynamique plus élevé pour les pectines LM (Figure 26) (Maroziene & de Kruif, 2000).
37
HM ; ∆ LMA ; LM ; Gel
Phase gélifiée
Pectines (% p/p)
Deux phases
Stable
Micelles de caséines (% p/v)

Figure 26 : Diagramme de phases de mélanges micelles de caséines / pectines. Aux concentrations en pectines LMA
(faiblement méthylées et amidées) et HM (hautement méthylées) élevées, un réseau gélifié se forme (d'après
Maroziene & de Kruif, 2000)
Enfin, il faut noter que bien que les pectines LM n’interagissent pas avec les micelles de
caséines à pH neutre, elles sont sensibles aux ions calcium, ce qui peut aboutir à leur gélification.
L’apport du calcium par les protéines du lait, notamment lors d’un début de solubilisation du
phosphate de calcium micellaire en cas d’une légère diminution du pH, peut conduire à la formation
d’un gel mixte (Harte et al., 2007).
II.2.2.3. Cas du dextrane sulfate
Les mélanges dextrane sulfate / protéines de lait n’ont que rarement été étudiés dans la
littérature (Garnier et al., 1998 ; Bourriot, 1999) (Tableau 5) en raison des propriétés peu
viscosifiantes et non gélifiantes du dextrane. Toutefois, la charge élevée de ce polymère, sous la
forme de groupements sulfates, présente un intérêt tout particulier pour l’étude des mélanges en
présence de polysaccharides chargés (Figure 19).
Un phénomène de déplétion-floculation serait à l’origine de la séparation de phases

macroscopique. L’allure inhabituelle du diagramme de phases, c’est-à-dire que la binodale n’est pas
asymptotique à l’axe des abscisses aux concentrations élevées en protéines, est attribuée à une
compétition entre le phénomène de séparation de phases et l’augmentation de la viscosité du système
dans cette zone (Figure 27).
38
Dextrane (% p/p)
25 µm
Micelles de caséines (% p/p)

Figure 27 : Diagramme de phases de mélanges micelles de caséines / dextrane et image obtenue en microscopie
confocale de la microstructure du mélange de 6% de dextrane / 3% de micelles de caséines à 20°C dans 0,25 M NaCl
(d’après Bourriot, 1999)
A l’échelle microscopique, un système hétérogène présentant des zones diffuses de 10 à

100 µm concentrées en protéines est observé (Figure 27). A la différence des systèmes faisant
intervenir des polysaccharides neutres, ces zones concentrées aux contours diffus n’ont pas
l’apparence de gouttelettes sphériques, ce qui suggère l’existence de complexes formés entre le
polymère chargé et les protéines de lait.
II.2.2.4. Cas des carraghénanes
Les mélanges entre les carraghénanes et les protéines de lait ont fait l’objet de nombreuses
études en vue d’une meilleure compréhension des interactions intervenant entre les deux composés
(Tableau 5). La principale question de divergence concerne l’adsorption des carraghénanes sur les
micelles de caséines et les conditions dans lesquelles ce phénomène se produit.
La plupart des auteurs s’accordent sur le fait qu’à des températures inférieures à la température
de transition pelote-hélice, le carraghénane s’associe avec les micelles de caséines au travers
d’interactions électrostatiques entre ses groupes sulfates chargés négativement et une région chargée
positivement de la caséine κ (Figure 28) (Snoeren, 1976 ; Dalgleish & Morris, 1988). Ce phénomène
suppose que la zone positive de la caséine κ soit accessible et implique la pénétration des chaînes de
carraghénanes dans la couche chevelue de la micelle de caséines, ce qui serait de prime abord difficile
39
à concrétiser pour des raisons stériques et électrostatiques (Bourriot et al., 1999a). Cependant, le
mécanisme faisant intervenir l’adsorption des carraghénanes sur les protéines est celui qui prévaut
aujourd’hui. Il est à noter que des interactions directes entre les ions calcium et les groupements
sulfates portés par les chaînes de carraghénanes pourraient également intervenir.
Figure 28 : Image obtenue en microscopie électronique à balayage d’un mélange de 11% de poudre de lait et de
0,015% de kappa-carraghénane. La barre représente 200 µm (Spagnuolo et al., 2005)
Les interactions associatives entre les iota et kappa-carraghénanes et les micelles de caséines
ont lieu quelle que soit la température et donc la conformation du polysaccharide (Snoeren, 1976 ;
Garnier et al., 2003). Néanmoins, ce mécanisme est couplé à un phénomène de séparation de phases.
En effet, au-delà du recouvrement total des micelles de caséines par les chaînes de carraghénane, les
agrégats pontés sont floculés par les carraghénanes libres (Schorsch et al., 2000). Ainsi, à des
concentrations faibles en micelles de caséines, les agrégats seraient dispersés dans la phase continue
stabilisée par des liaisons carraghénane / carraghénane. Au contraire, à des concentrations élevées en
micelles de caséines, un seul réseau stabilisé majoritairement par des liaisons carraghénane / micelles
de caséines structurerait le système (Figure 29a et b) (Garnier et al., 2003).
a b c
10 µm 10 µm 25 µm
Figure 29 : Images obtenues en microscopie confocale de mélanges de 3% de micelles de caséines et de (a) 0,1% de
iota-carraghénane (d'après Garnier et al., 2003) ; (b) 1% de iota-carraghénane à 0,1 M NaCl (d'après Garnier et al.,
2003) ; (c) 1% de kappa-carraghénane à 0,25 M NaCl à 20°C (d’après Bourriot et al., 1999a)
Même si les trois types de carraghénanes (iota, kappa et lambda) s’adsorbent sur les micelles de
caséines, leur différence de densité de charges semble intervenir dans les microstructures observées.
40
Pour un rapport identique en micelles de caséines et en carraghénane, le mélange obtenu en présence

de iota-carraghénane apparaît granuleux (Figure 29b) alors que la microstructure du mélange kappa-
carraghénane / micelles de caséines semble plus diffuse et grossière (Figure 29c). Puisque la densité
de charges des carraghénanes est différente, la stœchiométrie des agrégats carraghénane / micelles de
caséines est très probablement différente.
Différentes méthodes ont été utilisées pour mettre en évidence l’existence d’interactions
attractives entre les carraghénanes et les micelles de caséines. Par des mesures de mobilité
électrophorétique, Dalgleish & Morris (1988) ont montré une augmentation de la densité de charges
des micelles de caséines suite à l’adsorption des chaînes de carraghénane. Par ailleurs, la taille des
micelles de caséines augmente lorsque l’adsorption des carraghénanes a lieu (Langendorff, 1998 ;
Spagnuolo et al., 2005 ; Dalgleish & Morris, 1988).
a b c
DOBM+CI+MC -DOBM+CI
DOBM+CI+MC
DOBM+CI
Longueur d’onde (nm) Longueur d’onde (nm) Longueur d’onde (nm)
Figure 30 : Spectres de densité optique (DO) à différentes températures, de 20°C à 60°C, et 0,1 M NaCl de mélanges
(a) bleu de méthylène (BM) / 0,002% iota-carraghénane (CI) ; (b) bleu de méthylène (BM) / 0,002% iota-
carraghénane (CI) / 0,005% micelles de caséines (MC) ; (c) soustraction des deux spectres de densité optique
(∆DO = DOBM+CI+MC - DOBM+CI) (d'après Garnier et al., 2003)
Une autre méthode consiste à étudier le comportement du spectre du bleu de méthylène suite à
l’ajout de carraghénane ou d’un mélange de micelles de caséines et de carraghénane (Snoeren, 1976 ;
Garnier et al., 2003). En effet, les interactions électrostatiques entre les chaînes de carraghénane
sulfaté et les molécules de bleu de méthylène modifient le spectre du bleu de méthylène. Le pic de la
solution de bleu de méthylène à 663 nm diminue au profit d’un épaulement à 554 nm correspondant
aux complexes bleu de méthylène / carraghénane (Figure 30a). Lorsque des micelles de caséines sont
introduites dans ce mélange, une compétition a lieu entre les plans cationiques du bleu de méthylène
et les micelles de caséines pour les groupes sulfates du carraghénane. Si les molécules de bleu de
méthylène sont déplacées des sites sulfates et libérées en solution, le pic à 663 nm augmente alors que
l’épaulement à 554 nm diminue (Figure 30b). Une soustraction des spectres des mélanges micelles de
caséines / carraghénane avec ceux obtenus sans ajout de protéines permet de mettre en évidence les
41
interactions associatives micelles de caséines / carraghénane (Figure 30c). Ainsi, l’association des
micelles de caséines avec les groupes sulfates du carraghénane conduit à une libération des molécules
de bleu de méthylène à des températures supérieures à la transconformation des carraghénanes.
Cependant, l’adsorption des carraghénanes a également lieu en dessous de 40°C, bien que le pic à
663 nm ne soit pas modifié en raison d’une augmentation de la rigidité des chaînes de carraghénane
(Garnier et al., 2003). Ces expériences confirment donc l’association des chaînes de carraghénane
avec les micelles de caséines quelle que soit la conformation du carraghénane. Cette interaction est de
nature électrostatique et s’opère au niveau de régions positives des caséines κ (Snoeren, 1976).
III. GELIFICATION EN PRESENCE D’UNE SEPARATION DE PHASES
III.1. Effet de la gélification d’au moins une des deux phases

III.1.1. Propriétés des gels en présence d’une séparation de phases
Lorsqu’une séparation de phases de type liquide-liquide entre deux polymères a lieu, la

gélification a pour effet de diminuer voire de supprimer la mobilité de l’un ou des deux composants
du mélange. Dans le cas des systèmes mixtes protéines de lait / polysaccharides, chacun des deux
composés est susceptible de contribuer au réseau par gélification, seul ou en mélange. Il convient
donc de distinguer trois cas (Figure 31 et Figure 32) :
• les gels particulaires, mettant en œuvre l’association de particules. Dans le cas des
gels laitiers acides, les particules résultent de l’agrégation des micelles de caséines (paragraphe I.2 de
ce chapitre) et peuvent être pontées par l’intermédiaire des protéines sériques lorsqu’un traitement
thermique suffisant a été appliqué (paragraphe I.3.1 de ce chapitre) ;
• les gels mixtes de polymères à chaîne étendue (Morris, 1986). En considérant la

participation de l’un ou des deux polymères à la formation du réseau, une distinction peut être faite
entre les réseaux dits « simples », structurés par un seul composant, et les réseaux dits « composés »
formés à partir des deux polymères ;
o Au sein des réseaux « simples », les phénomènes de volume exclu sont les plus
fréquents, une miscibilité parfaite entre les deux polymères étant peu probable.
o L’organisation d’un réseau « composé » dépend notamment des interactions entre les
polymères, des conditions de mélange ainsi que des cinétiques de formation du réseau. Plusieurs cas
peuvent être envisagés :
42
- les réseaux interpénétrés, constitués de deux réseaux indépendants n’interagissant

qu’au travers d’enchevêtrements. En raison de l’incompatibilité de la majorité des polymères entre
eux, un effet de volume exclu est souvent mis en évidence.
- les réseaux couplés, qui nécessitent une interaction de type associatif entre les deux
polymères. Trois cas peuvent alors se présenter :
- incapables de gélifier seuls, les polymères en mélange peuvent former un

réseau couplé grâce à leur interaction ;
- seul un polymère est gélifiant, le réseau est partiellement couplé grâce aux
interactions intrapolymères et interpolymères ;
- les deux polymères peuvent gélifier séparément, permettant de combiner à la

fois les interactions individuelles de chaque polymère gélifiant et celles des deux polymères entre
eux.
• les gels mixtes remplis mettant en œuvre des particules et des polymères à chaîne
étendue. En fonction de la capacité à gélifier de chacun des composants, différents cas peuvent être
distingués :
o les particules peuvent s’agréger alors que le polymère est non gélifiant. Cette situation
conduit classiquement au phénomène de déplétion-floculation, en incluant toutefois l’effet de la
gélification. Il sera traité en détail dans le paragraphe III.1 de ce chapitre ;
o le polymère est gélifiant alors que les particules sont inertes. Comme l’illustre la
Figure 32, les particules ne gênent pas la mise en place du réseau et ont un rôle de remplissage du gel
par occupation de l’espace si la fraction volumique des particules est suffisamment faible ;
o lorsque les particules s’agrègent en parallèle de la formation d’un gel par le polymère,
deux réseaux se forment, ce qui relève du cas des réseaux interpénétrés ;
o aucun composant n’a la capacité de gélifier individuellement. Les interactions de

nature associatives entre les particules et les polymères aboutissent à un mécanisme de pontage qui
structure le système ;
o la combinaison de l’agrégation des particules et d’un phénomène de gélification

additionné ou non de pontage du polymère sur les particules donne lieu à un système complexe. En
effet, le pontage peut perturber l’agrégation des particules pour des raisons stériques.
43
Gels particulaires
Agrégation Agrégation + Pontage
Figure 31 : Représentation schématique des types de gels particulaires, mettant en œuvre l’association de particules
(adapté de Michon et al., 2010)
Gels mixtes
Polymères à chaîne étendue P1 et P2
Particules P + Polymères à chaîne étendue P1
Simples Composés
P1 et P2 gélifiant
P1 gélifiant seul
P et P1 gélifiant
P ou P1 gélifiant seul
(seuls ou par interaction)
Interpénétrés Couplés
Polymères à chaîne étendue P1 et P2 Polymères à chaîne étendue P1 et P2
P1 ou P2 gélifiant seul P1 et P2 gélifiant seuls
Pas d’effet de P1 et P2 gélifiant P1 gélifiant seul, P1 et P2 gélifiants seuls

volume exclu Volume exclu Interpénétrés Volume exclu par interaction P2 par interaction et par interaction
Particules P + Polymères à chaîne étendue P1 Particules P + Polymères à chaîne étendue P1

P1 gélifiant seul P et P1 gélifiant seuls
Pas d’effet de P et P1 gélifiant P gélifiant seul, P et P1 gélifiants seuls
volume exclu Volume exclu Interpénétrés Volume exclu par interaction P1 par interaction et par interaction
P gélifiant seul
Pas d’effet de
volume exclu Volume exclu
Figure 32 : Représentation schématique des différents types d’organisation des gels mixtes de particules et de
polymères à chaîne étendue. Les échelles ne sont pas respectées. Les schémas entourés en pointillés représentent des
cas rares et peu probables. P : particules ; P1 et P2 : polymères à chaîne étendue (adapté de Michon et al., 2010 ;
Michon, 1995 ; Morris, 2006)
Seuls les travaux sur les gels formés à partir d’un polymère gélifiant et d’un second polymère
non gélifiant seront décrits dans cette synthèse, puisque c’est le cas des mélanges étudiés dans ce
travail.
44
Sur la base de la classification des gels mixtes, il convient de distinguer les gels protéiques des
gels de polysaccharides à chaîne étendue. Alors que la grande majorité des gels protéiques sont
produits par agrégation des protéines, par exemple au moyen d’un traitement thermique ou d’une
acidification, la gélification des polysaccharides à chaîne étendue tels que les carraghénanes est
souvent associée à un changement de conformation (Renard et al., 2006). Il est à noter que la gélatine,
protéine d’origine animale, constitue un cas particulier. Elle subit une transition pelote-hélice qui
permet l’association des chaînes entre elles et à ce titre, se comporte davantage comme un
polysaccharide à chaîne étendue gélifiant.
Lorsqu’une seule phase du système mixte gélifie, la répartition des fractions volumiques de
chacune des phases a un rôle déterminant sur les propriétés mécaniques. En effet, si le polymère
gélifiant constitue la phase continue, des particules liquides enrichies par l’autre polymère seront
dispersées dans une matrice solide. En revanche, si la phase dispersée est gélifiée, le système
possédera des propriétés semblables à une suspension de particules solides (Frith, 2010 ; Foster et al.,
1997).
De manière générale, l’ajout d’un polysaccharide à un gel produit un effet antagoniste ou de

synergie sur les propriétés du gel résultant. L’effet antagoniste se traduit par un affaiblissement du gel
obtenu à partir du mélange par rapport aux biopolymères pris individuellement. Une séparation de
type ségrégatif peut limiter l’agrégation protéique ou plus spécifiquement la connexion entre les
agrégats de protéines, ce qui aboutit à une diminution de l’élasticité des gels. En présence
d’interactions associatives, une neutralisation des complexes peut favoriser leur insolubilité et donc la
formation d’agrégats au détriment de la formation d’un réseau (Bertrand & Turgeon, 2007 ; Bertrand,
2008). Au contraire, l’effet de synergie aboutit à un renforcement du gel en raison d’une
augmentation de la réticulation du gel et donc de la densité du réseau. Généralement, ce phénomène
est lié à des effets d’exclusion de volume et de redistribution du solvant entre les deux phases
(Tolstoguzov, 1995). En effet, la séparation de phases entre protéines et polysaccharides est
accompagnée d’une répartition inégale du solvant, avec l’apparition d’une phase concentrée en
protéines en équilibre avec une phase riche en polysaccharides. La concentration locale en protéines
augmente ainsi la connectivité des particules protéiques (Zasypkin et al., 1997 ; Tolstoguzov, 2007).
III.1.2. Effet de la gélification sur la séparation de phases
Au sein des systèmes mixtes, la gélification peut avoir deux types d’effet contradictoire sur la
séparation de phases, soit en intensifiant l’apparition des deux phases, soit en ralentissant voire en
45
bloquant ce phénomène. Les limites de co-solubilité, c’est-à-dire la position de la binodale sur le

diagramme de phases, peuvent ainsi être déplacées lors de la gélification d’un polymère.
Ainsi, dans certains cas, la séparation de phases a lieu à des concentrations plus faibles
lorsqu’elle est accompagnée d’une gélification. A titre d’exemple, un mélange constitué de 2% de
gélatine et 2% de dextrane est miscible en conditions non gélifiantes, alors qu’une séparation de
phases apparaît consécutivement au changement de conformation de la gélatine (Tromp et al., 2004).
Par ailleurs, il est à noter que la concentration critique de gélification diminue dans un système mixte
par rapport à un système binaire polymères / solvant, ce qui est notamment le cas des mélanges
gélatine / maltodextrine, dextrane ou alginate (Zasypkin et al., 1997).
Un décalage de la zone de compatibilité a été observé dans des mélanges gélatine / amidon et
gélatine / maltodextrine suite à la gélification de la gélatine (Figure 33) (Lundin et al., 2000).
Gélatine LH1e (% p/p)
SA2 (% p/p)
Figure 33 : Diagramme de phases du système gélatine « limed hide » (LH1e, type B) / maltodextrine (SA2) / eau
dans 0,1 M NaCl à différentes températures obtenu à partir de mesures de turbidité à une vitesse de refroidissement
de 1°C/min (d’après Lundin et al., 2000)
Lorsque la température diminue de 60°C à 25°C, la contribution de l’entropie du mélange

diminue et à partir de 40°C, la gélatine subit une transition de la conformation pelote à la
conformation hélice, chaque macromolécule de gélatine occupant un volume beaucoup plus grand
lorsqu’elle est en conformation hélice. Ces deux facteurs entraînent une augmentation de
l’incompatibilité de la maltodextrine vis-à-vis de la gélatine. Par ailleurs, la formation d’un gel
influence non seulement le positionnement de la binodale, mais aussi la capacité du système à
atteindre l’état d’équilibre. En effet, l’augmentation de la rigidité des chaînes diminue
considérablement la mobilité des polymères, jusqu’à leur emprisonnement dans le réseau gélifié. Par
conséquent, la gélification peut intervenir comme un événement perturbateur de la séparation de
phases.
46
De nombreuses études ont décrit la structure des gels formés par les mélanges de gélatine et
d’autres polysaccharides tels que la maltodextrine (Kasapis et al., 1993 ; Lorén, 2001 ; Lundin et al.,
2000), le dextrane (Tromp et al., 2004 ; Pacek et al., 2003) ou encore les protéines de lait
(Hermansson et al., 1998). Comme illustré sur la Figure 34, la vitesse de refroidissement a une
influence sur la structure microscopique du gel. Plus le gel se forme rapidement, plus la taille des
inclusions de maltodextrine diminue, mettant en évidence un phénomène de séparation de phases
incomplet, frustré par la gélification de la gélatine.
Figure 34 : Images obtenues en microscopie confocale montrant l’effet de la vitesse de refroidissement d’un
mélange de 5% de gélatine « pig skin » (type A) et 4% de maltodextrine sur les microstructures. Les mélanges ont
été chauffés à 60°C quelques minutes puis refroidis de 60°C à 10°C à des vitesses de refroidissement de (a) 0,2 ;
(b) 1 ; (c) 10°C/min (d'après Lorén et al., 1999)
Une compétition a donc lieu entre la gélification qui tend à figer le système et la séparation de
phases qui maintient le système en état de non équilibre (Frith, 2010 ; Lorén & Hermansson, 2000).
Par conséquent, les cinétiques relatives de gélification et de séparation de phases ont un rôle clé sur
les propriétés microstructurales du système (Figure 35).
Equilibre des cinétiques Phase gélifiante

de séparation de phases
et gélification Continue Dispersée
a b
Vsép > Vgél
c d
Vsép < Vgél
Figure 35 : Influence des vitesses relatives de séparation de phases (Vsép) et de gélification (Vgél) sur la
morphologie de gels mixtes à base d’un polymère gélifiant (avec quadrillage) et un autre polymère non gélifiant
(sans quadrillage)
47
Lorsque la séparation de phases s’opère plus rapidement que la gélification, une structure sous
la forme de gouttelettes, similaire à celle obtenue en absence de gélification, est obtenue (Figure 35a
et b). Si les cinétiques de formation du gel et de séparation de phases sont proches, la séparation de
phases se produit pendant la formation du gel, ce qui conduit à une compétition entre les deux
phénomènes et à des microstructures variées. La dernière situation implique une gélification qui a lieu
plus rapidement que la séparation de phases (Figure 35c et d). Dans ce cas, la séparation de phases est
incomplète et le procédé de gélification a pour effet de stopper l’évolution de la structure biphasique
dans un état intermédiaire de non équilibre. Si la phase continue est gélifiée, alors de petites
inclusions liquides sont piégées dans le gel (Figure 35c). Au contraire, une suspension de petites
particules gélifiées est observée lorsque la phase dispersée est gélifiante (Figure 35d). Il est à noter
que pour l’ensemble de ces matrices, les gouttelettes peuvent sédimenter et/ou coalescer à différents
degrés suivant le délai avant gélification et les paramètres déterminés par la loi de Stokes (Eq. 2).
Finalement, les facteurs clés qui déterminent les microstructures après gélification sont :
− le début de la séparation de phases et de la gélification ;

− les cinétiques relatives de séparation de phases et de gélification ;
− le contexte de gélification dans lequel la séparation de phases a lieu (notamment les
concentrations en polymères, la viscosité des deux phases et la mobilité des polymères) (Lorén,
2001).
III.1.3. Gélification sous cisaillement de systèmes en présence d’une séparation

de phases
De même que le blocage de l’évolution des structures suite à la formation d’un gel,
l’application d’un cisaillement en présence d’une gélification constitue une seconde approche
permettant de créer des structures bien définies.
III.1.3.1. Effet du cisaillement avant gélification
Lorsqu’un système présentant une séparation de phases est soumis à un cisaillement, il convient
de distinguer différents cas en fonction de l’intensité du cisaillement appliqué.
D’une part, l’application d’une déformation suffisamment petite permet l’alignement des
gouttelettes dans la direction du champ de cisaillement, sans engendrer de rupture des gouttelettes par
instabilité de Rayleigh (Butler, 2002 ; Frith, 2010). Dans ce cas, l’intensité de déformation des
gouttelettes est déterminée certes par la vitesse de cisaillement, mais aussi par la taille initiale des
48
gouttelettes, par le rapport de viscosité entre les deux phases et par la tension interfaciale. Ainsi, le
degré d’asymétrie des particules dispersées augmente lorsque la vitesse de cisaillement est élevée.
Cependant, si la vitesse de cisaillement reste constante, la déformabilité des particules dispersées est
maximale lorsque la viscosité des deux phases est similaire, et augmente si la tension interfaciale
diminue ou si le diamètre des gouttelettes augmente (Tolstoguzov, 1986).
D’autre part, au-dessus d’une vitesse de cisaillement critique, un équilibre entre la coalescence
des gouttelettes et leur rupture par instabilité de Rayleigh conduit à une taille de gouttelettes stable
tant que le cisaillement est mis en œuvre (van Puyvelde et al., 2003 ; Butler & Heppenstall-Bultler,
2003). Le système apparaît alors comme homogène macroscopiquement jusqu’à ce qu’il se
déstabilise de nouveau après arrêt du cisaillement. A titre d’exemple, la binodale du mélange
gélatine / dextrane déterminée en condition de repos et sous un cisaillement constant à 60 s-1 est
montrée sur la Figure 36. Sous l’application d’un cisaillement, la zone de compatibilité
monophasique s’agrandit, l’effet devenant plus significatif aux concentrations en polymères élevées
(Antonov et al., 2012 ; Lundin et al., 2003).
Dextrane (% p/p)
Gélatine (% p/p)
Figure 36 : Diagramme de phases du système gélatine / dextrane au repos (ligne entière) et sous un cisaillement
constant de 60 s-1 (ligne en pointillés) à 45°C, avec une force ionique de 0,002 M et à pH 5 (d'après Antonov et al.,
2003)
III.1.3.2. Effet du cisaillement pendant la gélification
Lorsqu’un facteur de cisaillement se superpose à la combinaison des mécanismes de séparation

de phases et de gélification, la considération des propriétés physiques des gouttelettes est essentielle
pour prédire et interpréter les structures formées. En présence d’une gélification, les gouttelettes sous
cisaillement deviennent plus résistantes à la rupture et se rétractent en raison d’une modification de la
49
rhéologie des gouttelettes et d’une augmentation de la tension interfaciale (Foster et al., 1997 ; Wolf
et al., 2001).
Dans certains cas, l’effet combiné d’un cisaillement et d’une gélification peut conduire à une
inversion de phases. En condition de repos, la phase continue est constituée par le polymère ayant la
fraction volumique la plus élevée. Cependant, lorsque le mélange est soumis à un champ de
cisaillement suffisamment élevé pendant la gélification, la phase continue constituée du polymère
gélifiant devient la phase dispersée. Il est à noter que cette inversion de phases se produit pour des
fractions volumiques de phase continue avant inversion atteignant 75% dans le cas de mélanges
gélatine / amidon ou maltodextrine (Foster et al., 1996 ; Foster et al., 1997). Ce phénomène
d’inversion de phases est en général associé à l’augmentation de la viscosité au cours de la
gélification de la phase continue riche en gélatine. La viscosité devient ainsi supérieure à celle de la
phase riche en amidon ou en maltodextrine.
La compréhension de la relation entre la morphologie des gouttelettes et l’histoire

thermomécanique appliquée pendant le procédé de fabrication est d’un intérêt tout particulier. Les
mélanges de biopolymères constituent des systèmes idéaux en raison de leur évolution structurale
lente, qui permet au gel de se former dans un champ de cisaillement suffisamment faible pour éviter
la rupture des gouttelettes ou la destruction de la structure biphasique (Norton & Frith, 2001 ;
Turgeon et al., 2003). Néanmoins, la formation de morphologies variées implique des conditions à
satisfaire et parmi elles, une faible différence de viscosité entre les deux phases, une faible tension
interfaciale ainsi qu’une transition sol-gel rapide sous cisaillement. En effet, dans le cas extrême, une
gélification lente conduit à une relaxation complète de la forme de la gouttelette et à la formation de
particules sphériques gélifiées (Tolstoguzov, 1986 ; Wolf et al., 2001).
La déformation d’une émulsion eau dans eau au cours de la gélification de l’une ou des deux
phases donne naissance à un matériau anisotropique possédant une structure fibrillaire ou lamellaire.
La structure du matériau dépend certes des conditions de cisaillement, mais aussi de la fraction
volumique de la phase gélifiante. Lorsque la phase continue gélifie, une structure capillaire remplie
de fibres orientées liquides est formée (Tolstoguzov, 1986). En revanche, si le polymère gélifiant
constitue la phase dispersée, trois cas sont à envisager en fonction de la concentration en gouttelettes
dispersées (Figure 37) (Tolstoguzov, 1986 ; Tolstoguzov, 2003).
50
Effet de la fraction volumique
Écoulement Fibres
Déformation des gouttelettes
Écoulement
Fibres
cylindres liquides
Coalescence
Rupture des
Écoulement
Structure en
couches fibreuses
Équilibre dynamique
Figure 37 : Schéma général de la déformation de particules dispersées au sein d’une émulsion eau dans eau sous
cisaillement (d'après Tolstoguzov, 2003)
Une faible fraction volumique de gouttelettes liquides dispersées résulte en des fibres
individuelles de volume identique aux gouttelettes initiales. Lorsque la concentration en particules
dispersées augmente, la coalescence des gouttelettes conduit à une élongation des fibres. Aux
fractions volumiques en gouttelettes élevées, la coalescence des particules a lieu à la fois dans la
direction du champ de cisaillement et celle perpendiculaire, ce qui aboutit à une structure en couches
de structures fibreuses.
D’un point de vue rhéologique, la contribution des gouttelettes gélifiées à la viscosité du

système est variable selon leur morphologie. Les suspensions de particules gélifiées allongées sont
davantage rhéofluidifiantes et possèdent une viscosité aux faibles contraintes de cisaillement plus
élevée que les solutions de particules sphériques. Ainsi, les particules sphériques gélifiées confèrent
des propriétés liquides presque Newtoniennes alors que la présence de filaments gélifiés apporte un
seuil d’écoulement important aux petites vitesses de cisaillement (Figure 38) (Norton & Frith, 2001).
Par ailleurs, il est important de garder à l’esprit que les particules allongées sont flexibles, ce qui leur
confère une possibilité d’alignement dans le champ de cisaillement aux vitesses de cisaillement
élevées (Wolf et al., 2002 ; Norton & Frith, 2003).
51
Viscosité relative
Contrainte de cisaillement (Pa)

Figure 38 : Viscosité relative de suspensions de différentes particules de gels de fraction volumique constante en
fonction de la contrainte de cisaillement. Les images au microscope montrent les trois types de particules de forme
sphérique, ovoïde ou très allongée (d'après Norton & Frith, 2001)
III.1.3.3. Effet du cisaillement après la gélification
Sous l’application d’un cisaillement à la suite de la gélification des gouttelettes dispersées, les
inclusions gélifiées peuvent s’agréger en des agrégats de plus grande taille ou se rompre. La taille des
agrégats est contrôlée à la fois par un choix approprié de la vitesse de cisaillement, et des temps
relatifs de début de gélification et de cisaillement (Pacek et al., 2003 ; Foster et al., 1997).
III.2. Gélification de mélanges protéines de lait / polysaccharides en

présence d’une séparation de phases
A la différence des déstabilisations dans les mélanges protéines de lait / polysaccharides ou des
mécanismes de la formation des gels acides, la combinaison d’une gélification acide en présence
d’une séparation de phases a fait l’objet de moins d’études dans la littérature. En effet, la
transformation du lait en gel est accompagnée d’un ensemble de changements physico-chimiques
responsables d’une complexité supplémentaire, et notamment une solubilisation du phosphate de
calcium ainsi qu’une modification de la charge et de la structure micellaire (paragraphe I.2 de ce
chapitre).
52
III.2.1. Propriétés des gels acides en présence d’une séparation de phases
De la même manière que dans le cas des mélanges protéines de lait / polysaccharides en milieu
non acidifié, une classification entre les polysaccharides neutres et chargés peut être effectuée
(Figure 19) (Everett & McLeod, 2005).
III.2.1.1. Gélification acide des mélanges protéines de lait / polysaccharides neutres
Quel que soit le pH du milieu, les polysaccharides neutres tels que les galactomannanes ou les
β-glucanes ne sont pas capables de s’associer avec les micelles de caséines (Tableau 3 et Tableau 6).
Il s’ensuit qu’un phénomène de déplétion-floculation entre les protéines et les polysaccharides
intervient, y compris lors de l’acidification.
Tableau 6 : Récapitulatif des principales études effectuées sur les mélanges polysaccharides neutres / protéines de
lait en milieu acidifié. Le type de phénomène est donné tel que décrit par les auteurs.
Conditions (méthode
Polysaccharide Protéine d’acidification, pH du gel, Phénomène Références
température d’acidification)
Guar
Everett & McLeod,
Lait écrémé Ferments, pH 4,25, 30°C Déplétion-floculation
2005
Caroube
GDL, pH 4,6, 42°C Déplétion-floculation Sanchez et al., 2000
Lait écrémé Everett & McLeod,
Ferments, pH 4,25, 30°C Déplétion-floculation
2005
Caséinates de Incompatibilité
GDL, pH 4,6, 10°C Perrechil et al., 2009
sodium thermodynamique
β-glucanes
Incompatibilité Vasiljevic et al.,
Lait écrémé Ferments, pH 4,5, 42°C
thermodynamique 2007
Incompatibilité
thermodynamique Lazaridou et al.,
Lait écrémé GDL, pH 4,8, 42°C
(déplétion- 2008
floculation)
Sur la base d’observations microscopiques et de mesures rhéologiques, Sanchez et al. (2000) et

Everett & McLeod (2005) ont montré que l’ajout de faibles concentrations en caroube ou guar
(jusqu’à 0,1%) induit une structure spongieuse constituée d’agrégats protéiques compacts (Figure 39),
aboutissant à une augmentation de la synérèse et à une diminution de la viscosité après brassage. La
microstructure qui en résulte serait à l’origine d’un équilibre entre l’agrégation des protéines lors de
la diminution de pH et les effets d’exclusion de volume provoqués par la floculation par déplétion des
micelles de caséines (Sanchez et al., 2000).
53
a b c
d e f
Figure 39 : Images obtenues en microscopie optique à contraste de phase (a, b, c) et en microscopie électronique à
balayage (d, e, f) de gels laitiers à base de lait écrémé à pH 4,6 enrichis en caroube à (a et d) 0,001% ; (b et e)
0,02% ; (c et f) 0,1%. Les agrégats protéiques apparaissent en clair. Les barres représentent 40 µm (d’après Sanchez
et al., 2000)
A des concentrations en polysaccharides élevées, des agrégats protéiques compacts sont piégés
dans une phase continue enrichie en polysaccharides (Everett & McLeod, 2005 ; Perrechil et al.,
2009). Ainsi, l’incorporation de 0,5% de guar ou de 2% de β-glucanes empêcherait la formation d’un
réseau protéique tel que présent dans les gels laitiers acides classiques, en interférant avec le
processus d’agrégation des micelles de caséines. Dans ce cas particulier, les propriétés rhéologiques
du système sont proches de celles d’une solution enrichie en polysaccharides (Everett & McLeod,
2005 ; Perrechil et al., 2009 ; Lazaridou et al., 2008).
III.2.1.2. Gélification acide des mélanges protéines de lait / polysaccharides chargés
Malgré un phénomène de déplétion-floculation décrit pour la majorité des mélanges protéines

de lait / polysaccharides chargés constaté au pH du lait (6,7), de nombreux auteurs observent des
phénomènes d’association entre les deux composés lorsque la gélification acide conduit le système à
un pH situé en dessous du point isoélectrique des protéines (Tableau 7).
54
Tableau 7 : Récapitulatif des principales études effectuées sur les mélanges polysaccharides chargés / protéines de
lait en milieu acidifié. Le type de phénomène est donné tel que décrit par les auteurs.
Conditions (méthode
d’acidification, pH du gel,
Polysaccharide Protéine température
Phénomène Références
d’acidification)
Xanthane Densité de charges : 0,25 mol / mol de monosaccharide
GDL, pH 4,6, 40°C Déplétion-floculation Aichinger et al., 2007
Lait Ferments, pH 4,25, Everett & McLeod,
Déplétion-floculation
écrémé 30°C 2005
GDL, pH 4,6, 42°C Interactions non spécifiques Sanchez et al., 2000
HCl, pH 2,7, 37°C Interactions électrostatiques Kobori et al., 2009
Agrégation des caséinates le
HCl, pH 4,2, 37°C Kobori et al., 2009
long du xanthane
Caséinates
de sodium Réseau principal de
caséinates avec inclusions
GDL, pH 4,6, 10°C Braga & Cunha, 2004
de molécules de xanthane
regroupées
Gellane Densité de charges : 0,25 mol / mol de monosaccharide
Caséinates Franco Picone &
GDL, pH 4, 10°C Interactions électrostatiques
de sodium Cunha, 2010
Pectines Densité de charges : pectines HM : 0,3 ; LM : 0,65 mol / mol de monosaccharide
HCl 5 mol.L-1, Maroziene & de Kruif,
HM (DE 73%) Adsorption
pH 5,3 2000
GDL, pH 4,6, 25°C Complexation Harte et al., 2007
LM Ferments, pH 4,25, Everett & McLeod,
Adsorption
30°C 2005
Lait
HCl 5 mol.L-1, Maroziene & de Kruif,
LM (DE 35%) écrémé Adsorption
pH 5,3 2000
LMA (DE 35% et HCl 5 mol.L-1, Maroziene & de Kruif,
Adsorption
amidé à 20%) pH 5,3 2000
LMA (DE 28% et
GDL, pH 4,6, 30°C Association Kouame et al., 2010
amidé à 18%)
Acide citrique
HM (DE 68%) Complexation Rediguieri et al., 2007
Caséinates 1 mol.L-1, pH < 6
LMA (DE 31% et de sodium Matia-Merino et al.,
GDL, pH 4, 25°C Complexation
amidé à 17%) 2004
EPS Densité de charges : variable
Lait Ferments, pH 4,3,
Non précisé Déplétion-floculation Hassan et al., 2003
écrémé 40°C
Neutre (dextrane) Déplétion-floculation Mende et al., 2013
écrémé 37°C
Anionique linéaire Interactions électrostatiques Gentès et al., 2011
écrémé 42°C
Lait Girard & Schaffer-
Anionique Ferments Interactions associatives
écrémé Lequart, 2007
HCl 0,01 mol.L-1, Girard & Schaffer-
Anionique Caséinates Interactions associatives
pH 4,5 Lequart, 2008
Carraghénane Densité de charges : kappa : 0,5 ; lambda : 1,5 mol / mol de monosaccharide
Lait Ferments, pH 4,6, Kalab & Emmons,
Kappa Interactions associatives
Lait Ferments, pH 4,25, Everett & McLeod,
Lambda Adsorption
55
III.2.1.2.1. Cas du xanthane
Etant donné la faible densité de charges du xanthane et la rigidité de sa chaîne, les mécanismes
de déplétion-floculation observés pour les galactomannanes sembleraient, de prime abord, également
applicables au xanthane dans les gels laitiers acides (Everett & McLeod, 2005 ; Aichinger et al.,
2007). Cependant, une structure très organisée sous forme de fibres riches en particules de caséines a
été observée lors de l’ajout de 0,02% et 0,1% de xanthane (Figure 40) (Sanchez et al., 2000).
a b c
d e f
Figure 40 : Images obtenues en microscopie optique à contraste de phase (a, b, c) et en microscopie électronique à
balayage (d, e, f) de gels laitiers à base de lait écrémé à pH 4,6 enrichis en xanthane à (a et d) 0,001% ; (b et
e) 0,02% ; (c et f) 0,1%. Les agrégats protéiques apparaissent en clair. Les barres représentent 40 µm (d’après
Sanchez et al., 2000)
L’origine de cette microstructure particulière pourrait être liée à la combinaison de deux

phénomènes : un mécanisme de déplétion-floculation se produisant avant acidification et des
interactions non spécifiques entre le xanthane chargé négativement et les micelles de caséines, de
moins en moins chargées négativement au cours du procédé d’acidification (Sanchez et al., 2000 ;
Laneuville et al., 2000). Par ailleurs, Kobori et al. (2009) ont constaté la présence d’interactions entre
les caséinates de sodium et le xanthane à pH 2,7 mais leur absence à pH 5,1 et 6,6 (Figure 41).
56
pH 6,6 pH 5,1 pH 2,7
Chaîne de xanthane Caséinate de sodium selon la charge
Figure 41 : Représentation schématique des interactions entre les caséinates de sodium et le xanthane en fonction du
pH. A pH 6,6, les caséinates sont faiblement associés aux chaînes de xanthane au moyen d’interactions hydrophobes.
A pH 5,1, une agrégation des caséinates le long de la chaîne de xanthane permet des interactions intra-chaînes.
A pH 2,7, les caséinates se chargent positivement et s’associent au xanthane par des interactions électrostatiques. Les
couleurs des caséinates de sodium représentent les charges électrostatiques en surface (bleu : charge négative ; gris :
charge neutre ; rouge : charge positive). La taille plus petite des caséinates à pH 2,7 indique la modification des
protéines par l’acidification (d'après Kobori et al., 2009)
Alors que les caséinates sont liés de manière individuelle au xanthane au travers d’interactions
hydrophobes à pH neutre, une structure fibrillaire se forme à pH 2,7 suite à des interactions
associatives entre les deux composés de charges opposées (Kobori et al., 2009).
III.2.1.2.2. Cas des pectines
A travers son rôle dans la modification des charges des protéines, le pH est un facteur clé
responsable des interactions électrostatiques entre les protéines et les pectines. Ainsi, l’adsorption des
pectines LM et HM est rendue possible lorsque le pH est inférieur à 5,3 (Maroziene & de Kruif,
2000 ; Tuinier et al., 2002), ce phénomène agissant comme une barrière stérique à l’agrégation des
micelles de caséines. Comme illustré sur la Figure 18, un phénomène de floculation par pontage suivi
d’une déstabilisation par déplétion-floculation et d’une stabilisation stérique se produit pour des
concentrations en pectines croissantes. Par ailleurs, des études rhéologiques mettent en évidence un
affaiblissement du gel lors de l’ajout de pectines, qui peut aboutir à une absence de la connectivité du
réseau protéique lorsque le recouvrement des micelles de caséines par les chaînes de pectines est total
(Matia-Merino et al., 2004 ; Everett & McLeod, 2005).
Contrairement aux pectines HM, la gélification des pectines LM est induite par les ions
calcium. Au cours de l’acidification, une quantité croissante d’ions calcium migre des micelles de
caséines vers le lactosérum, se rendant ainsi disponible pour se lier à la pectine et assurer sa
gélification (Gaucheron et al., 2004 ; Harte et al., 2007 ; Arltoft et al., 2006). Ce réseau gélifié
supplémentaire contribue à une augmentation de la fermeté du gel (Matia-Merino et al., 2004).
Finalement, le réseau tridimensionnel résultant relève de la combinaison des interactions caséines-
caséines suite à leur gélification acide, des interactions pectines-pectines à travers leur liaison avec le
57
calcium, ainsi que des complexes caséines-pectines formés au cours de l’acidification (Figure 42)
(Matia-Merino & Singh, 2007 ; Harte et al., 2007).
Liaison ionique Adsorption des pectines LM

Caséine κ Pectine LM Pectine LM pectine / pectine sur les micelles de caséines
Figure 42 : Modèle d’interaction entre les micelles de caséines (CM) et la pectine LM lors de l’acidification du lait
(d'après Harte et al., 2007)
III.2.1.2.3. Cas des carraghénanes
Bien que très étudiées dans les desserts laitiers neutres, les interactions entre les carraghénanes
et les protéines de lait sont beaucoup moins abordées au sein des gels acides puisque les
carraghénanes sont hydrolysées par dépolymérisation de la chaîne osidique lorsque le pH diminue. Ce
polysaccharide n’est donc pas adapté à la formulation de gels acides. Cependant, il semble que la
complexation des carraghénanes avec la caséine κ des micelles de caséines ayant lieu à pH neutre
apparaît également après gélification acide et pourrait même s’accentuer à mesure que le pH décroît.
Une étude rhéologique des propriétés des gels acides brassés enrichis en lambda-carraghénane a mis
en évidence l’implication de mécanismes d’interactions similaires à ceux de la pectine LM (Everett &
McLeod, 2005). Lorsque la concentration en lambda-carraghénane augmente, un phénomène
d’adsorption, de déplétion-floculation puis de stabilisation stérique partielle avec une faible
agrégation des caséines a lieu, sans toutefois intégrer d’interactions carraghénane / carraghénane en
raison de la conformation pelote de la chaîne (Everett & McLeod, 2005). Par ailleurs, des
observations microscopiques de gels laitiers acides ont montré la formation de fibres longues et fines
connectées avec des agrégats de micelles de caséines lors de l’ajout de kappa-carraghénane (Kalab &
Emmons, 1975), confirmant la présence d’interactions associatives.
III.2.2. Effet de la gélification sur la séparation de phases de mélanges protéines

de lait / polysaccharides
Aucune étude dans la littérature ne mentionne un effet d’intensification du phénomène de

séparation de phases lors de la gélification acide des protéines de lait. Toutefois, il est probable que
l’augmentation de la taille des micelles de caséines au cours de leur gélification accentue le
mécanisme de déplétion-floculation dans les mélanges protéines / polysaccharides (Tan et al., 2007).
58
Dans les mélanges mixtes de biopolymères sujets à la fois à une séparation de phases et à une
gélification, les vitesses relatives de ces deux événements contribuent aux macrostructures et
microstructures finales. En effet, les phénomènes de séparation de phases sont susceptibles d’être
bloqués par la prise en gel de la phase protéique (traitement thermique dans le cas des protéines
sériques, gélification acide ou présure dans le cas des micelles de caséines) ou de la phase
polysaccharidique si celui-ci est gélifiant. Une vitesse de séparation de phases rapide diminue les
propriétés rhéologiques du gel, jusqu’à empêcher la formation du gel protéique et provoquer une
inversion de phases dans le cas d’un rapport polysaccharides / protéines élevé (Rediguieri et al.,
2007 ; Everett & McLeod, 2005 ; Aichinger et al., 2007 ; Acero Lopez et al., 2009 ; Perrechil et al.,
2009). En revanche, si à une concentration en polysaccharides suffisamment faible, le procédé de
gélification se produit plus rapidement que le mécanisme de séparation de phases, alors la gélification
fige le système dans les premiers stades de la séparation de phases par une diminution importante puis
une suppression de la mobilité des molécules. Cet effet aboutit à une structure présentant une micro-
séparation de phases et contenant des inclusions de polysaccharides dispersées dans un réseau
protéique continu (Perrechil et al., 2009 ; Acero Lopez et al., 2009 ; Syrbe et al., 1998).
Dans le cas d’interactions entre les polysaccharides chargés et les protéines, la microstructure
dépend de la possibilité de complexation entre les composants et donc de leur densité de charges
respective (de Jong et al., 2009 ; de Jong & van de Velde, 2007). Une complexité supplémentaire
intervient alors en raison de la migration du polysaccharide chargé vers la phase protéique à mesure
que le pH décroît. Lors d’un mélange pectines HM / caséinates, une acidification lente aboutit à la
formation de particules sphériques, alors qu’elles perdent leur sphéricité lorsque le pH chute
rapidement (Figure 43A) (Rediguieri et al., 2007). En effet, la diffusion des molécules de pectines au
travers des deux phases puis leur adsorption sur les caséinates nécessite un certain temps pour
s’établir. Par conséquent, seule une partie des caséinates est stabilisée par les pectines en condition
d’acidification rapide. Cette situation se produit également lorsque la concentration en pectines n’est
pas suffisante pour stabiliser l’ensemble des caséinates (Figure 43B et C).
59
Pectines (g/L)
Caséinates (g/L)
Acidification Acidification Acidification
Acidification
lente lente lente
rapide
Figure 43 : Images obtenues en microscopie confocale de mélanges de pectines / caséinates à trois positions
différentes du diagramme de phases (A, B et C), avant et après acidification. Les barres représentent 10 µm. Les
zones claires correspondent aux phases riches en pectine (d'après Rediguieri et al., 2007)
Une autre stratégie a permis également de moduler la vitesse de gélification, en modifiant soit
la température d’acidification, soit la concentration en GDL de gels de protéines sériques obtenus
après acidification à froid d’agrégats prétraités thermiquement (de Jong et al., 2009).
GDL constante T constante

T variable GDL variable
0,06±0,03
6°C pH/h pH 5,5
0,25±0,03
37°C pH 4,3
pH/h
160 µm
Figure 44 : Microstructure de gels mixtes de 3% d’isolat de protéines sériques et 0,1% de caroube obtenus à des
vitesses d’acidification équivalentes soit par modification de la température d’incubation (T), soit en changeant la
concentration en GDL (0,22 ou 0,36% p/p) (d'après de Jong et al., 2009)
Pour une vitesse d’acidification donnée, des microstructures comparables sont mises en
évidence, et ce, quel que soit le procédé de fabrication des gels utilisé (Figure 44). Partant de ce
constat, la morphologie du gel sera une conséquence des cinétiques relatives de séparation de phases
et de formation du gel.
60
Chapitre 2 : Matériels et méthodes
I. FABRICATION DES GELS LAITIERS ENRICHIS EN POLYSACCHARIDES
I.1. Les matières premières

I.1.1. Le lait
L’ensemble de l’étude a été mené sur du lait reconstitué à partir de lait écrémé en poudre à
faible taux de dénaturation des protéines (« low heat ») fourni par la société Ingredia (Arras, France).
La composition chimique de cette poudre de lait est donnée dans le Tableau 8. Afin de s’affranchir de
l’effet des variations saisonnières de la composition du lait, un même lot a été utilisé tout au long de
l’étude. La poudre a été conditionnée en sachets de 200 g et stockée à température ambiante.
Tableau 8 : Composition chimique de la poudre de lait écrémé « low heat » Ingredia utilisée au cours de l’étude
Concentration
(g.kg-1 de poudre)
Matière sèche 963
Cendres 75
Protéines 333
Lactose 555
I.1.2. Les polysaccharides
Les échantillons de guar Viscogum MP (Cargill, USA) et de xanthane Satiaxane CX (Cargill,

USA) ont été utilisés sans étape de purification complémentaire. Leur viscosité intrinsèque respective,
déterminée selon le protocole décrit au paragraphe II.3.2 de ce chapitre, est d’environ 11 ± 2 et
70 ± 10 dL.g-1 en solution dans 0,1 M NaCl.
Les solutions de guar et de xanthane ont été préparées par dispersion sous agitation magnétique
des poudres dans de l’eau Millipore ultra pure en présence de 0,1 M NaCl à 60°C pendant 30 min.
Un échantillon de kappa-carraghénane (Cargill, Baupte, France) a été utilisé de façon

ponctuelle afin de valider des hypothèses de mécanismes d’interaction entre micelles de caséines et
polysaccharides. La viscosité intrinsèque de ce polysaccharide est d’environ 7 ± 0,4 dL.g-1 (Matignon,
2013).
Les caractéristiques physico-chimiques des trois polysaccharides étudiés sont présentées dans
le Tableau 9.
61
Tableau 9 : Structure chimique et propriétés physico-chimiques du guar, du xanthane et du kappa-carraghénane
Guar Xanthane Kappa-carraghénane
Structure
primaire
van de Velde et al.,

Chawla & Patil, 2010 Chawla & Patil, 2010
2005
Densité de
charges (mol /
mol de 0 0,25 0,5
monosaccha-
ride)
Type de
groupements Carboxyles Sulfates
chargés
Viscosité
intrinsèque de
11 ± 2 70 ± 10 7 ± 0,4
l’échantillon
(dL.g-1)
I.1.3. Les agents acidifiants
Deux agents acidifiants ont principalement été utilisés pour la préparation des gels acides : la
glucono-δ-lactone (GDL) et les ferments.
La glucono-δ-lactone (GDL) est un précurseur d'acide qui, en milieu aqueux, se décompose

lentement en acide gluconique, ce qui conduit à une acidification progressive du milieu. La GDL
utilisée se présente sous forme de poudre blanche cristallisée, commercialisée par la société Sigma
Chemicals (St Louis, MO, USA).
Deux souches de ferments lactiques, constitués chacun d’une souche de Streptococcus

thermophilus et d’une souche de Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, ont été utilisées
ponctuellement pour comparer les résultats avec ceux obtenus par acidification avec de la GDL. La
souche « Ferment 1 » était conditionnée sous forme de pellets congelés et la souche « Ferment 2 »,
sous forme lyophilisée. Ces deux souches étaient peu productrices d’exopolysaccharides.
62
I.2. Préparation des mélanges lait / polysaccharides

L’ensemble des concentrations de solutions de polysaccharides, de polysaccharides en mélange
dans le lait et de GDL ajoutée au mélange est exprimé en % p/p.
I.2.1. Reconstitution du lait
Le lait a été reconstitué à partir de la poudre de lait écrémé « low heat » par dispersion pendant
1 h à température ambiante dans de l’eau purifiée à l’aide d’un passage à travers successivement une
résine à échange d’ions puis une membrane d’osmose et enfin un système d’électrodialyse
(Elix 3, Millipore, France). La concentration en protéines de lait était de 46 g.kg-1, ce qui correspond
à un lait « poudré » tel qu’utilisé pour la fabrication des yaourts « maigres » permettant ainsi
d’augmenter la force du gel acide obtenu après acidification tout en limitant la synérèse. Le lait ainsi
reconstitué a ensuite été stocké à 4°C pendant une nuit de manière à assurer une bonne réhydratation
de la poudre et un équilibrage des ions.
I.2.2. Traitement thermique du lait
Le lait a été traité thermiquement à 80°C pendant 7 min à l’aide d’un bain-marie sous agitation
magnétique. Le taux de dénaturation des protéines n’a pas été évalué, toutefois le traitement
thermique a été réalisé de manière standardisée et était suffisant pour renforcer le réseau protéique.
Après traitement thermique, le lait a été refroidi dans un bain d’eau froide jusqu’à la température
souhaitée.
I.2.3. Solubilisation des polysaccharides
Les mélanges lait / polysaccharides ont été réalisés en incorporant la poudre de polysaccharides
dans le lait préalablement chauffé à 60°C sous une agitation magnétique d’environ 700 rpm pendant
30 min. La température de mélange a été déterminée de manière à permettre la solubilisation des
polysaccharides quels que soient la concentration et le type de polysaccharides utilisé tout en limitant
la dénaturation des protéines du lactosérum durant cette étape. Après solubilisation des
polysaccharides dans le lait, le mélange a été refroidi dans un bain d’eau froide sous agitation
magnétique jusqu’à la température d’acidification.
63
I.3. Fabrication des gels acides

Dans le cadre de cette étude, le terme de « micro-gel » a été utilisé pour désigner les
gouttelettes enrichies en protéines après leur gélification acide, obtenues par séparation de phases de
systèmes enrichis en guar. Les « filaments » sont définis comme des micro-gels très allongés, d’une
taille généralement comprise entre 100 et 400 µm.
Au sein des gels laitiers enrichis en xanthane, le terme de « structure fibreuse » a été utilisé
pour désigner les micro-gels très allongés obtenus par un effet de compétition entre séparation de
phases et gélification, et après fracturation du gel ferme par l’étape de brassage. De manière
complémentaire, les « complexes fibreux » obtenus par acidification d’un mélange lait / xanthane à
l’aide de HCl incluent la présence de xanthane au cœur des structures gélifiées.
I.3.1. Acidification
Deux méthodes d’acidification ont principalement été utilisées pour l’obtention des gels laitiers
acides : ajout de GDL ou de ferments lactiques, l’acidification à l’aide de HCl ayant été utilisée
ponctuellement. L’acidification du lait par la GDL permet de garantir une meilleure reproductibilité et
de s’affranchir de la variabilité de l’activité bactérienne. Cependant, les gels obtenus à l’aide de GDL
ne sont pas identiques à ceux obtenus par voie fermentaire du fait, notamment, de l’absence totale
d'exopolysaccharide et de la non consommation de lactose (Lucey et al., 1998).
I.3.1.1. Acidification à l’aide de GDL
La GDL a été ajoutée dans le lait ou le mélange lait / polysaccharides préalablement chauffé à
la température d’acidification sous une agitation magnétique d’environ 700 rpm pendant 2 min afin
d’assurer sa dissolution. Le lait ou le mélange lait / polysaccharides additionné de GDL a ensuite été
réparti dans des flacons stériles étanches de 40 mL (VWR, France) placés dans une étuve (Memmert,
France). La température d’acidification était de 43°C dans la majorité des cas ; dans le cas contraire,
ceci sera précisé lors de la description des résultats concernés. Les cinétiques d’acidification étaient
fortement dépendantes de la concentration en GDL ainsi que de la température. En effet, des
concentrations ou températures croissantes entraînent une hydrolyse de la GDL plus rapide.
L’acidification était considérée comme terminée lorsque le pH de 4,6 était atteint. Le système était
ensuite refroidi rapidement dans un bain d’eau froide afin de limiter toute post-acidification.
64
I.3.1.2. Acidification à l’aide de ferments
L’ensemencement a été effectué dans le lait ou le mélange lait / polysaccharides à 43°C au taux
de 200g/1000L pour la souche « Ferments 1 » et 200U/1000L pour la souche « Ferment 2 ». Le lait
ou le mélange lait / polysaccharides a ensuite été réparti dans des flacons stériles étanches de 40 mL
(VWR, France) placés dans une étuve (Memmert, France) à 43°C. Lors de certaines expériences, une
agitation magnétique a été appliquée à 700 rpm environ dans le flacon placé dans un bain-marie à
43°C pendant la diminution du pH et jusqu’à l’obtention du pH souhaité. Le mélange a ensuite été
réparti dans les flacons et mis dans une étuve à 43°C jusqu’à l’obtention du pH 4,6. La fermentation a
été considérée comme étant terminée lorsque la diminution de pH devenait lente aux environs de
pH 4,6.
I.3.1.3. Acidification à l’aide de HCl
Préalablement à son acidification par un ajout de HCl, le lait enrichi en polysaccharides a été
dilué à 1/10ème à l’aide d’eau à 0,1 M NaCl, qui correspond à la force ionique du lait. Afin d’assurer
une répartition homogène de l’acide ajouté, un cisaillement de 100 à 500 rpm selon les expériences a
systématiquement été appliqué. L’acide chlorhydrique a été ajouté en petite quantité et à différentes
concentrations (de 0,05 à 1 mol.L-1) dans une quantité de 30 mL de lait enrichi en polysaccharides et
sous agitation mécanique de manière à ce que le pH puisse s’équilibrer dans le milieu entre deux
ajouts successifs.
I.3.2. Brassage des gels fermes acides
Après refroidissement à 20°C dans un bain d’eau froide pendant 1 h, les gels ont été cisaillés.
Pour la fabrication des gels acides brassés, un décaillage a été effectué à l’aide d’un test de rétro-
extrusion. Une sonde s’enfonce dans le produit à 0,5 mm.s-1 sur une profondeur de 30 mm. Le
cisaillement du gel généré dans l’espace annulaire, situé entre le bord du flacon de 2,7 cm de diamètre
et la sonde de 2 cm de diamètre, a permis une rupture grossière du gel, réalisée de manière
parfaitement standardisée. Ensuite, le gel a été poussé avec un débit de 380 mL.min-1 à l’aide d’une
pompe péristaltique (Masterflex®, Cole Parmer, Vernon Hills, USA) à travers deux tuyaux en
plastique successifs (40 cm de longueur et 7 mm de diamètre interne ; 100 cm de longueur et 3 mm de
diamètre interne) munis d’un filtre d’une taille de pores de 500 µm dans la partie terminale. Il est à
noter que le filtre n’a pas pu être utilisé pour certains gels présentant des structures fibrillaires de
taille trop élevée. Pour ces gels, l’étape de brassage a consisté en un passage au travers des deux
65
tuyaux successifs mais sans l’ajout de filtre ; ceci sera précisé lors de la description des résultats
lorsque que tel aura été le cas. Les gels brassés ont ensuite été conservés un jour à 4°C avant analyse.
II. CARACTERISATION DES MELANGES ET DES GELS ACIDES ENRICHIS EN

POLYSACCHARIDES PAR DES METHODES INSTRUMENTALES
II.1. Comportement de séparation de phases dans les mélanges lait /

polysaccharides en milieux neutres et acidifiés
Une technique reposant sur la diffusion multiple de la lumière a été utilisée pour suivre les
phénomènes de séparation de phases et de formation du gel. L’étude a été menée à l’aide de deux
appareils, le Turbiscan Classic et le Turbiscan Lab Expert (Formulaction, Toulouse, France) qui
réalisent des mesures optiques basées sur l’analyse de la dispersion des photons au sein d’un produit
contenu dans une cellule de verre cylindrique.
L’organe central des analyseurs optiques est la tête de lecture : elle effectue un balayage
vertical de l’échantillon (jusqu’à 80 mm pour le Turbiscan Classic et 55 mm pour le Turbiscan Lab
Expert) avec une diode électroluminescente dans le proche infrarouge (850 nm). Une mesure est
effectuée tous les 40 µm grâce à deux détecteurs qui reçoivent les photons transmis et rétrodiffusés
par l’échantillon, au travers de deux fentes placées respectivement à 180° et 45° du rayon incident.
Les courbes obtenues donnent les flux lumineux de transmission et de rétrodiffusion en fonction de la
hauteur de l’échantillon (en mm) exprimés en pourcentage par rapport à des références internes à
l’appareil (étalon d’huile de silicone pour la mesure de la transmission, tube en téflon pour la
rétrodiffusion) (Figure 45).
Hauteur (mm)
Lumière
transmise
Transmission
Source de Rétrodiffusion
lumière
Intensité (%)
Lumière
rétrodiffusée
Figure 45 : Principe d’analyse du Turbiscan Lab Expert et du Turbiscan Classic
66
Les intensités des lumières rétrodiffusées et transmises par l’échantillon dépendent de trois
paramètres : le diamètre des particules, leur concentration et l’indice de réfraction relatif entre les
phases dispersée et continue. Ainsi, un changement dû à une variation de taille (floculation,
coalescence) ou une variation locale de la concentration (phénomènes migratoires : sédimentation,
crémage) sont détectés par les capteurs optiques.
Présentant la possibilité d’être thermorégulé de 25 à 60°C, le Turbiscan Lab Expert a été

utilisé pour l’analyse des cinétiques de séparation de phases ayant lieu dans les mélanges lait /
polysaccharides et le suivi de la gélification des gels acides. Le comportement des mélanges lait /
polysaccharides a été observé à température constante (de 25 à 60°C) au cours du temps dans des
tubes en verre de diamètre 2,3 cm (20 g d’échantillon) pendant 1 h. Dans le cas des mélanges
additionnés de GDL, la gélification a eu lieu in situ dans l’appareil préalablement chauffé à la
température d’acidification jusqu’à l’obtention du pH 4,6.
Les analyses réalisées à l’aide du Turbiscan Classic ont permis de calculer les hauteurs
relatives (hauteur de sédiment ou de surnageant rapportée à la hauteur totale) à partir des courbes de
rétrodiffusion et de transmission obtenues pour les systèmes mixtes acidifiés ou non. Après avoir
laissé les mélanges lait / polysaccharides au repos dans un bain à sec thermorégulé à une température
donnée pendant 4 h, les tubes ont été conservés une nuit à 4°C avant analyse. Les gels fermes acides
ont été fabriqués dans les tubes in situ jusqu’à l’obtention du pH 4,6, conservés à 4°C puis analysés à
J+1 après fabrication.
II.2. Mesure du pH
La mesure du pH a été réalisée directement lors de la formation du gel en étuve avec un
pHmètre Consort D130 (Turnhout, Belgique) relié à un ordinateur. Le pHmètre a été calibré
régulièrement au moyen des solutions tampon pH 7,00 et pH 4,00. Les mesures de pH ont permis de
suivre les cinétiques d’acidification après ajout de GDL ou de ferments lactiques (Figure 46).
67
7,0
6,5
pH 6,0
5,5
5,0
4,5
0 1 2 3 4 5 6
Temps (h)
Figure 46 : Evolution du pH au cours de l'acidification à 43°C d'un lait écrémé à 46 g/kg de protéines par ajout de
1,5% de GDL (ligne pleine) ou de ferments lactiques « Ferment 1 » au taux de 200g/1000L (ligne en pointillés). Les
barres d’erreur représentées correspondent à des mesures réalisées en triple sur des échantillons différents.
II.3. Mesures rhéologiques

La caractérisation rhéologique des mélanges lait / polysaccharides et des gels acides brassés a
été réalisée aux grandes déformations pour caractériser les propriétés d’écoulement, ainsi qu’aux
petites déformations, afin de caractériser les propriétés viscoélastiques.
II.3.1. Propriétés d’écoulement
Les mesures rhéologiques en écoulement permettent d’établir la relation entre la contrainte et la

vitesse de cisaillement en régime laminaire. La viscosité apparente est définie comme le rapport entre
la contrainte de cisaillement et la vitesse de cisaillement :
σ
η= • Eq. 3
γ
•
où σ est la contrainte de cisaillement (Pa) et γ la vitesse de cisaillement (s-1).
Le rhéomètre MCR 301 (Anton Paar, Autriche) piloté en contrainte et équipé d’une géométrie à
double entrefer (Figure 47a) a été utilisé pour mesurer les propriétés d’écoulement du lait, des
solutions de polysaccharides ainsi que des mélanges lait / guar. Le Carri-Med CSL²100 (TA
Instruments, UK) piloté en contrainte et muni d’une géométrie cône-plan (6 cm de diamètre, 4°
d’angle, 106 µm de troncature) (Figure 47b) a été utilisé pour caractériser les mélanges lait / xanthane
68
et les yaourts brassés enrichis en micro-gels. Pour les deux rhéomètres utilisés, une courbe
d’écoulement a été réalisée de 1 à 100 s-1 en 7,5 min à 43°C en utilisant une boucle de régulation
contrainte-vitesse de cisaillement.
a b
0,473 mm
3 cm
40 mm
α = 4°
0,422 mm
Figure 47 : Représentation schématique des géométries (a) à double entrefer (MCR 301) et (b) cône-plan (Carri-Med
CSL²100)
II.3.2. Détermination de la viscosité intrinsèque des polysaccharides
La viscosité intrinsèque des chaînes de guar et de xanthane a été déterminée à différentes forces
ioniques (de 0 à 0,3 M NaCl) à 43°C à pH 6,8 par des mesures de viscosimétrie en milieu dilué. Cette
grandeur reflète le volume hydrodynamique occupé par une unité de masse de l'espèce étudiée et est
définie pour un solvant et une température donnés. Elle est déterminée par une extrapolation à
dilution infinie de la viscosité spécifique réduite ηsp/C :
η −η 0 η sp
[η ] = lim = lim Eq. 4
C →0η 0C C →0 C
η −η0
avec : η sp = Eq. 5
η0
où C est la concentration en polymères (g.dL-1), η la viscosité de la solution (Pa.s), η0 la
viscosité du solvant (Pa.s), ηsp la viscosité spécifique (sans unité).
L’équation de Huggins est appliquée aux résultats obtenus (Eq. 6) :
η sp
= [η ] + λ H [η ] C
2
Equation de Huggins : Eq. 6
C
avec λH la constante de Huggins. Pour un bon solvant, 0,3 < λ < 1.
69
L’appareil de mesure utilisé était un rhéomètre MCR 301 (Anton Paar, Autriche) équipé d’une
géométrie à double entrefer (Figure 47a) qui présentait l’avantage d’apporter une sensibilité adaptée
aux produits de faible viscosité. La viscosité a été déterminée en effectuant un balayage en vitesse de
cisaillement de 10 à 500 s-1. La viscosité spécifique a été calculée à partir des valeurs de la viscosité
prises dans le plateau Newtonien, en faisant une moyenne sur trois valeurs de viscosité pour chaque
concentration en polymères. A titre d’exemple, un comportement Newtonien a été relevé pour des
concentrations comprises entre 0,0025 et 0,0075 g.dL-1 pour le xanthane et entre 0,03 et 0,075 g.dL-1
pour le guar. Ensuite, la viscosité intrinsèque du guar a été estimée en extrapolant la régression
linéaire correspondant à l’équation de Huggins à concentration nulle (Figure 48a).
η/η0 (Eq n°1) ou ln(η/η0) (Eq n°2) ou 1-(1/(η/η0)) (Eq n°3)

20 2,0
a b Eq. n°1
Eq. n°2
18 Eq. n°3
1,5
ηsp/C (dL.g )
-1
16 y = 96 x + 1
R2 = 0,99
1,0
14
y = 113 x + 11,5 y = 72 x
R2 = 0,97 R2 = 0,99
0,5
12 y = 55 x
R2 = 0,97
10 0,0
0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
-1 2 -1
Concentration en guar (g.dL ) Concentration en xanthane C*10 (g.dL )
Figure 48 : Détermination de la viscosité intrinsèque dans de l’eau distillée à 0,1 M NaCl à 43°C (a) du guar à l’aide
de l’équation de Huggins et (b) du xanthane à partir des trois équations de Tanglertpaibul et Rao (Tanglertpaibul &
Rao, 1987)
η sp
La relation non linéaire entre et la concentration en xanthane a rendu impossible la
C
détermination de la viscosité intrinsèque par extrapolation. En effet, les polysaccharides non chargés
tels que le guar présentent une pente linéaire (Figure 48a) alors qu’une forte augmentation de la pente
aux faibles concentrations apparaît pour les polysaccharides chargés comme le xanthane. Cette
spécificité serait due à la répulsion électrostatique entre les segments de chaîne (Higiro et al., 2007).
Dans ce cas, trois équations données par Tanglertpaibul et Rao (1987) ont été utilisées (Eq. 7, Eq. 8 et
Eq. 9) (Figure 48b).
70
η
Equation de Tanglertpaibul et Rao n°1 : = 1 + [η ]C Eq. 7
η0
η
Equation de Tanglertpaibul et Rao n°2 : = e[η ]C Eq. 8
η0
η 1
Equation de Tanglertpaibul et Rao n°3 : = Eq. 9
η 0 1 − [η ]C
II.3.3. Mesure des propriétés viscoélastiques en régime dynamique
Afin de déterminer les propriétés viscoélastiques des solutions de polysaccharides, des

mélanges lait / polysaccharides et des gels acides brassés enrichis en polysaccharides, des mesures en
régime dynamique ont été réalisées sur chaque échantillon. Ces mesures sont non destructives et
déterminées aux petites déformations, dans le domaine des propriétés linéaires.
L’essai harmonique consiste à appliquer au système une déformation γ*(t) ou une contrainte
σ*(t), fonctions sinusoïdales du temps, de pulsation ω (Figure 49).
γ(t) = γ0.cos(ωt) Eq. 10
La contrainte associée est alors de la forme :

σ(t) = σ0.cos(ωt + δ) Eq. 11
où δ désigne l’angle de déphasage entre la déformation et la contrainte (appelé également

angle de perte), γ0 et σ0 sont respectivement les amplitudes maximales de la déformation et de la
contrainte.
Déformation imposée
Contrainte résultante
γ0
σ0
δ
Figure 49 : Principe des mesures en régime dynamique
71
Elles permettent d’accéder à G’ et G’’, composantes réelle et imaginaire du module complexe :
σ*
G* = = G '+iG ' ' = G ' 2 +G ' '2 Eq. 12
γ*
σ0
avec : G ' = ( ) cos δ Eq. 13
γ0
σ0
G' ' = ( ) sin δ Eq. 14
γ0
G’, module conservatif, traduit la composante élastique du milieu ;
G’’, module dissipatif, prend en compte la dissipation d’énergie au sein du milieu et est relatif
au caractère visqueux.
La tangente de l’angle de déphasage ou angle de perte, tan δ, traduit la part respective de ces
deux composantes et donc les propriétés viscoélastiques du matériau :
G' '
tan δ = Eq. 15
G'
Pour une fréquence donnée, la linéarité des propriétés est classiquement vérifiée en faisant
varier l’amplitude du signal imposé (γ0 ou σ0) et en observant l’évolution de G’ et G’’ qui restent
constants dans le domaine linéaire.
Le spectre mécanique peut être obtenu en faisant varier la fréquence dans le domaine linéaire. Il
permet de caractériser le comportement viscoélastique du milieu et renseigne sur sa structure puisque
G* dépend des mouvements des segments de chaînes ou d’agrégats et de la durée de vie des
enchevêtrements.
Les mesures ont été réalisées avec le rhéomètre Carri-Med CSL²100 (TA Instruments, UK)
équipé d’une géométrie cône-plan (6 cm de diamètre, 4° d’angle, 106 µm de troncature) (Figure 47b).
Un balayage en fréquence de 0,01 à 100 Hz a été effectué à 4°C en imposant une contrainte
permettant de rester dans le domaine linéaire. Le Tableau 10 présente les amplitudes de contrainte
imposées lors des mesures en régime dynamique pour différents types de structures de systèmes
laitiers mixtes neutres ou acidifiés et permettant de se situer dans le domaine linéaire.
72
Tableau 10 : Contrainte imposée lors des mesures en régime dynamique permettant de se situer dans le domaine
linéaire. Les concentrations en polysaccharides permettant d’obtenir ces structures sont données à titre indicatif et
dépendent notamment des conditions de procédé utilisé.
Concentration en Contrainte
Type d’échantillon
polysaccharides (%) imposée (Pa)
Lait 0
Lait enrichi en xanthane 0-0,25
0,03
Micro-gels sphériques à légèrement allongés dispersés dans une phase < 0,35
continue riche en guar
Micro-gels sphériques dispersés dans une phase continue riche en guar 0,4-0,5 0,1
Longs filaments enchevêtrés dispersés dans une phase continue riche
0,15-0,3
en guar
1
Gel protéique sans polysaccharides 0
Gel protéique peu enrichi en guar < 0,1
< 0,03 ou
Micro-gels dispersés dans une phase continue riche en xanthane 1 à 10
> 0,085
Micro-gels dispersés dans une phase continue riche en xanthane 0,05 50
Lors des tests en écoulement et en régime dynamique, il était essentiel de s’assurer que les
systèmes étudiés ne sédimentent pas de manière sensible dans l’entrefer pendant la mesure. Sachant
que les temps de mesure des tests en écoulement et en dynamique ont été respectivement inférieurs à
20 min et 15 min, la hauteur de sédiment s’étant formée dans le bas du tube de Turbiscan a été
évaluée au terme de ce temps. A titre d’exemple, la hauteur de sédiment du mélange de lait enrichi à
0,3% de guar représente moins de 1% de la hauteur totale après 15 min à 43°C. De même, pour les
particules d’un gel brassé enrichi en guar à 0,3% et acidifié à l’aide de GDL à 1,5%, la hauteur de
sédiment est inférieure à 2% de la hauteur totale en fin de mesure en régime dynamique. Par
conséquent, la décantation des particules lors de la mesure a été considérée comme négligeable pour
ces deux systèmes.
II.4. Observation des systèmes par microscopie

II.4.1. Microscopie optique et à épifluorescence
La microscopie à épifluorescence est une technique utilisant un microscope optique qui permet,
grâce à un marquage spécifique, de visualiser un ou plusieurs composés fluorescents. Pour
fonctionner en fluorescence, le microscope comprend une source lumineuse adéquate constituée d'une
lampe à vapeur de mercure dont le spectre est polychromatique. Des filtres d'excitation permettent de
choisir la longueur d'onde incidente. Ce faisceau est ensuite réfléchi vers l'échantillon par un miroir
dichroïque et le rayonnement émis par l'échantillon est sélectionné par un filtre barrière.
73
Les images de microscopie en fluorescence ont été réalisées avec un microscope optique
Olympus BX51 (Olympus America, Lake Success, NY) équipé d’une lampe à vapeur de mercure
(Olympus, France) avec un objectif x10.
Le marquage a été réalisé à l’aide d'une solution de rouge de Nil solubilisé dans 0,1% d’acétone
(longueur d’onde d’excitation de 553 nm) ajoutée directement dans les gels acides brassés, de
manière à obtenir une concentration en fluorochrome de 2,5 µL.g-1 d’échantillon. Une aliquote de
chaque échantillon a été disposée entre lame et lamelle et laissée pendant 30 min à température
ambiante pour permettre la diffusion du marqueur.
Les dimensions géométriques des gels acides brassés enrichis en polysaccharides présentant des
structures gélifiées dispersées dans une phase continue riche en polysaccharides ont été quantifiées
par analyse d’images. Les images ont été obtenues à l’aide du microscope optique Olympus BX51
(Olympus America, Lake Success, NY) et une attention particulière a été prise à ne pas endommager
les particules lors de la préparation des lamelles. Les particules ont été mesurées manuellement, d’où
un nombre limité de particules analysées (10 particules pour chaque échantillon). Selon
l’agrandissement de l’image, la plus petite dimension des particules mesurée a été de 15 µm. Pour
chaque particule, la longueur L et la largeur l ont été déterminées, L et l correspondant respectivement
à la plus grande et la plus petite ligne droite. Lorsque la largeur l n’était pas constante sur toute la
longueur de la particule, une moyenne a été effectuée. Pour la caractérisation de la forme, le rapport
de la longueur L sur la largeur l a également été calculé.
II.4.2. Microscopie confocale à balayage laser
La microscopie confocale à balayage laser (MCBL) est une technique qui améliore la résolution
de la microscopie optique et a permis, par fixation de marqueurs fluorescents spécifiques, de
visualiser les protéines du lait ou des gels acides.
La lumière, apportée sous forme d’un rayonnement laser à une longueur d’onde donnée, est
focalisée sur une zone d’un plan donné de l’échantillon, appelé plan focal. La présence d’un
diaphragme permet de bloquer l’émission de fluorescence provenant des autres plans de l’échantillon.
La lumière émise par les marqueurs fluorescents est filtrée en fonction de leur longueur d’onde, puis
détectée par des photomultiplicateurs qui transforment le signal lumineux en signal électrique.
L’image est ainsi construite point par point par balayage (X, Y) du champ analysé à l’aide des miroirs
de déflection de la source lumineuse. Des observations suivant l’axe Z permettent de renseigner sur la
structure tridimensionnelle de l'échantillon en superposant les images obtenues (Figure 51).
74
Les images de MCBL ont été réalisées avec un microscope inversé Leica TCS SP2 AOBS
(Leica, Allemagne) équipé de trois lasers regroupant six raies : 458, 476, 488, 514, 543 et 633 nm.
Pour les observations, les objectifs de grossissement x10 et x40 à immersion dans l’eau ont été
utilisés.
Contrôler la température et la hauteur d’échantillon entre lame et lamelle s’avère primordial

pour observer les mélanges lait / polysaccharides, et plus particulièrement pour suivre la séparation de
phases dans ces systèmes. Ainsi, une cellule d’observation adaptée à la microscopie confocale, la
cellule RheOptiCAD (CAD Instruments, France) (Boitte et al., 2013), a été utilisée. Cette cellule a
été usinée de façon à s’adapter sur le bâti du microscope inversé utilisé tel que le porte-échantillon
classique (Figure 50).
Figure 50 : Photographie de la cellule RheOptiCAD positionnée sur le microscope confocal (Boitte et al., 2013)
Deux fonctions de la cellule ont permis une observation maîtrisée des systèmes :
− le contrôle de la température : un système Peltier combiné à la cellule d’observation

permet de chauffer par le plateau supérieur l’échantillon à observer. Par ailleurs, l’insertion d’une
sonde de température dans l’épaisseur du bâti supérieur permet son enregistrement lors des
observations.
− le contrôle de l’entrefer : dans le cas de systèmes présentant une séparation de phases, il

est important de pouvoir fixer une valeur d’entrefer, de manière à se localiser en Z de manière précise
et reproductible au sein de l’échantillon et ensuite, à comparer différents échantillons entre eux. Le
contrôle de l’entrefer est réalisé au moyen d’un moteur dont la résolution du pas est au micron près.
Par ailleurs, la planéité des deux lamelles entre lesquelles se trouve l’échantillon est assurée par un
système à dépression par aspiration via une pompe à vide (Figure 51).
75
Z Coupe en Z
X Lamelle supérieure
Y Coupe en X, Y
3 mm
Lamelle inférieure
MCBL
Figure 51 : Représentation schématique du dispositif d’observation des échantillons entre les deux lamelles
Les protéines ont été marquées par diffusion du DyLight 549 dont les maxima d’excitation et
d’émission se situent respectivement à 562 et 580 nm. Le DyLight 549 se fixe de façon covalente aux
protéines de lait. Le marquage des protéines a été réalisé par ajout direct de 20 µL de marqueur dans
1 g d’échantillon de lait ou de gel acide brassé enrichi en polysaccharides.
II.4.2.1. Observation des mélanges lait / polysaccharides
La cellule d’observation RheOptiCAD a été utilisée pour visualiser les mélanges lait / guar et
lait / xanthane : une température de 43°C et un entrefer entre les deux lamelles de 3 mm ont ainsi été
appliqués lors de l’observation (Figure 51). Les images ont été prises immédiatement après le dépôt
de l’échantillon entre les lamelles, de façon à limiter les effets de coalescence et de sédimentation.
Le mélange lait / kappa-carraghénane a été déposé entre lame et lamelle avec un écarteur de
250 µm d’épaisseur. L’observation a été faite à température ambiante (20°C), de manière à se situer
en dessous de la température de gélification du kappa-carraghénane.
II.4.2.2. Suivi de la séparation de phases de mélanges lait / guar en début de

gélification
Pour suivre les phénomènes de séparation de phases dans le mélange lait / guar, le mode XYZ a
été choisi, de manière à sonder l’échantillon dans les trois dimensions. Ainsi, une série d’images en Z
a été enregistrée par un balayage du bas vers le haut de l’échantillon à différents temps afin de suivre
l’évolution des systèmes.
Avant observation, les mélanges lait / guar ont été additionnés de GDL à 1,5% à température
ambiante. Ensuite, l’échantillon a été déposé dans la cellule d’observation RheOptiCAD entre les
76
lamelles dont l’entrefer a été fixé à 3 mm. Deux températures ont été appliquées lors des
observations : 43°C et 60°C. Les systèmes ont été observés immédiatement après leur mise en place,
afin de limiter l’évolution des mélanges avant enregistrement des images, puis au cours de leur
évolution.
II.4.2.3. Observation des gels acides brassés enrichis en polysaccharides
Les gels brassés enrichis en polysaccharides ont été déposés entre lame et lamelle avec un
écarteur de 250 µm d’épaisseur, de manière à éviter l’écrasement de l’échantillon. Les observations
ont été réalisées à température ambiante, après avoir laissé diffuser le marqueur dans l’échantillon
pendant 30 min environ.
II.5. Autres caractérisations

II.5.1. Mesure du potentiel zêta de solutions de polysaccharides
Le potentiel zêta est la charge de la surface de la couche d’hydratation qu’une particule acquiert
lorsqu’elle est mise en solution. Par conséquent, il ne correspond pas au potentiel de surface de la
particule, mais à la charge de la particule enveloppée par une double enveloppe ionique. La mesure
du potentiel zêta est basée sur une mesure de la vitesse des particules chargées soumises à un champ
électrique. La mobilité électrophorétique correspondant à la vitesse divisée par l’intensité du champ
électrique, est d’autant plus élévée que le potentiel zêta des particules est élevé en valeur absolue.
La mesure du potentiel zêta a été réalisée à l’aide du Zetasizer NanoZS (Malvern Instruments,
Ldt, UK). Les solutions de guar et de xanthane à 0,05% dans 0, 0,1 ou 0,3 M NaCl ont été analysées
sans dilution préalable, le signal étant de bonne qualité.
II.5.2. Etude des interactions protéines de lait / polysaccharides par une méthode
spectrophotométrique
Les interactions entre les protéines de lait et divers polysaccharides neutres ou chargés
négativement ont été étudiées en utilisant une méthode spectrophotométrique à l’aide du bleu de
méthylène. En solution aqueuse, le bleu de méthylène, colorant chargé positivement, présente un pic
maximal d’absorption à 664 nm et un épaulement à 610 nm (Gurov et al., 1988 ; Tafulo et al., 2009).
Dans le cas d’interactions associatives entre le bleu de méthylène et une molécule chargée
négativement telle que certains polysaccharides, des forces impliquant des molécules d’eau et les
molécules de bleu de méthylène interviennent, ce qui permet de maintenir les plans cationiques du
77
bleu de méthylène relativement proches les uns des autres (Figure 52). L’orientation particulière des
molécules de bleu de méthylène provoque une modification du spectre d’absorption et la formation de
complexes métachromatiques à 554 nm. La possibilité d’interaction dépend de la conformation et de
la densité de charges de la molécule chargée négativement, mais également des conditions
environnementales telles que la force ionique ou la température (Shirai et al., 1977).
Chaîne de
carraghénane
Complexe métachromatique
Molécule libre
Figure 52 : Représentation schématique des interactions bleu de méthylène / carraghénane (d’après Michon et al.,
2002)
Lorsque des protéines, interagissant de manière associative avec des polysaccharides chargés
négativement, sont introduites dans un mélange bleu de méthylène / polysaccharide anionique, une
compétition a lieu entre les plans cationiques du bleu de méthylène et les protéines pour les groupes
chargés du polysaccharide. Par conséquent, les protéines se lient préférentiellement aux
polysaccharides, ce qui entraîne la libération de molécules de bleu de méthylène en solution et ainsi
une augmentation du pic d’absorption à 664 nm.
Les protocoles de préparation des échantillons et des mesures spectrophotométriques sont

présentés dans le chapitre 4, I.
II.5.3. Détermination de la teneur en matière sèche des micro-gels
Pour la détermination de la teneur en matière sèche des micro-gels, 0,5 g de produit a été
déposé dans des coupelles en acier inoxydable, puis les échantillons ont été placés à l’étuve à 105°C
pendant 24 h jusqu’à poids constant.
78
II.5.4. Détermination de la concentration en protéines des micro-gels
Le dosage en azote total a été réalisé par la méthode de Kjeldahl. Cette méthode mesure la
somme de l'azote protéique et de l'azote non protéique qui représente entre 5 et 6% des protéines. Le
dosage se fait en deux étapes : la minéralisation de l’échantillon suivie de son dosage. Le coefficient
de 6,38 a été utilisé pour passer de la quantité d’azote à celle de protéines (Jones, 1941).
II.5.4.1. Minéralisation
La minéralisation consiste à transformer la totalité de l’azote organique en azote minéral sous

forme ammoniacale (NH4)2 SO4, par action d’acide sulfurique bouillant en présence d’un catalyseur.
L’ajout de sulfate de potassium K2SO4 permet d’augmenter la température de réaction et ainsi, de
diminuer sa durée.
La minéralisation a été réalisée à l’aide d’un appareil de type BlockDigest 12 (J.P. Selecta,
Espagne) équipé d’un thermostat. Les gels brassés enrichis en polysaccharides ont été centrifugés à
5000 g pendant 30 min (Centrifugeuse 3.18 K, Sigma GmbH, Allemagne) de manière à isoler les
micro-gels enrichis en protéines du surnageant riche en polysaccharides. Le culot contenant les
micro-gels a ensuite été récupéré pour analyse. 10 mL d’acide sulfurique ainsi qu’un mélange
catalytique composé de sulfate de potassium, de sulfate de cuivre pentahydraté et de dioxyde de
titane, ont été ajoutés à l’échantillon. Les tubes ont été chauffés sous une hotte 1 h à 190°C puis 4 h à
350°C.
II.5.4.2. Dosage indirect
L'ammoniac a été recueilli dans un volume connu et placé en excès d'une solution étalon de
HCl. L'excès d'acide a ensuite été dosé à l'aide d'une solution étalonnée de NaOH, en présence d'un
indicateur coloré.
Les tubes ont été refroidis à température ambiante et 20 mL d’eau distillée ont été ajoutés dans
chaque tube. 25 mL d'eau distillée dans le tube à distiller, 25 mL de HCl et 6 gouttes de rouge de
méthyle ont été introduits dans la fiole recueil du distillat. Après distillation à l’aide de l’appareil Pro-
Nitro M (J.P. Selecta, Espagne), la quantité de HCl n'ayant pas réagi a été dosée par une solution de
NaOH à 0,1 M de manière à déterminer la quantité d’ammoniac puis celle de protéines.
79
III. CARACTERISATION SENSORIELLE ET INSTRUMENTALE DES YAOURTS

ENRICHIS EN MICRO-GELS
III.1. Préparation des yaourts enrichis en micro-gels

III.1.1. Milieu de dispersion
Un yaourt brassé commercial contenant 0% de matière grasse, 5,5 g de glucides et 5,5 g de

protéines de lait (Cora, France) a été utilisé comme milieu de dispersion des micro-gels.
III.1.2. Micro-gels
Les micro-gels ont été fabriqués comme décrit dans le paragraphe I.3 de ce chapitre. Suite au
brassage des gels acides, les micro-gels enrichis en protéines ont été séparés de la phase continue
riche en guar ou xanthane et/ou lactosérum par centrifugation à 5000 g pendant 15 min à 20°C
(Centrifugeuse 3.18 K, Sigma GmbH, Germany).
Les déterminations de la teneur en matière sèche des différents micro-gels n’ont pas montré de
différences significatives entre les différents types de micro-gels qui contiennent 80 ± 2% de matière
sèche. De même, peu de différences de concentration en protéines sont observées entre les différents
micro-gels fabriqués à base des systèmes enrichis en guar acidifiés à l’aide de 1, 1,5 et 2,5% de GDL
qui contiennent respectivement 20,1, 20,1 ± 3,8 et 21,4% p/p de protéines.
L’hypothèse selon laquelle la différence de densité entre les types de micro-gels ne serait pas
significative a été émise. Partant de cette hypothèse, un même poids et non volume, de différents
types de micro-gels, a été introduit en proportions différentes, de 2,5 à 10% p/p, au milieu de
dispersion constitué de yaourt brassé à 0% de matière grasse. L’espace de produits était constitué de
14 yaourts enrichis en micro-gels de types et proportions variables.
III.2. Analyse sensorielle des yaourts enrichis en micro-gels

Afin d’établir un positionnement relatif de l’ensemble des produits, un profil flash a été réalisé.
Ce test sensoriel permet en effet de pouvoir interpréter rapidement la position relative des produits, en
apportant des éléments d’explication sémantique (Sieffermann, 2000). Par ailleurs, il ne nécessite pas
de phase préalable de familiarisation avec l’espace de produits et le vocabulaire sélectionné par les
juges n’est pas consensuel et défini.
80
Les produits ont été systématiquement présentés dans des pots en plastique transparents de
30 mL et codés. Le panel était constitué de 10 sujets (8 femmes et 2 hommes) recrutés au sein du
personnel de l’école AgroParisTech (Massy, France) dont 5 experts en analyse sensorielle. Les
dégustations ont eu lieu en cabines de dégustation individuelles au laboratoire de perception
sensorielle d’AgroParisTech. Généralement, la séance durait entre trente minutes et une heure.
Face à l’ensemble des produits présentés simultanément, les juges avaient pour consigne de se
limiter à l’évaluation de la texture, visuelle et en bouche, des produits. Ils ont alors généré les
descripteurs les plus discriminants pour décrire spécifiquement l’espace de produits et classé de
manière comparative les produits sur chacun des descripteurs.
Les produits classés ex-æquo étaient autorisés. Aucune contrainte n’a été donnée quant au
protocole de dégustation et aucune limite de temps n’a été imposée, chaque sujet pouvant faire autant
de pauses qu’il le désirait.
III.3. Caractérisation instrumentale des yaourts enrichis en micro-gels

III.3.1. Détermination de la distribution granulométrique
La distribution de taille des particules par diffraction de la lumière ou granulométrie laser est
déterminée, d’après les théories de Fraunhofer et de Mie, à partir des intensités reçues par des
détecteurs placés aux différents angles par rapport au rayon incident traversant l’échantillon de
particules.
La distribution de la taille des particules du yaourt brassé témoin ou enrichi en micro-gels a été
déterminée en utilisant un granulomètre laser MasterSizer 2000 (Malvern Instruments, Ldt, UK). Un
gramme de yaourt brassé (indice de réfraction de 1,5) a été préalablement dilué dans 50 mL d’eau
distillée environ. La mesure a été réalisée à température ambiante entre 4 et 12% d’obscuration sous
une agitation de 400 tr/min. Trois mesures successives ont été effectuées à deux minutes d’intervalle.
La distribution volumique a été caractérisée par la mesure du diamètre moyen d(4,3) (Figure 53).
81
10
d(4,3)
8
Volume (%) 6
0
1 10 100 1000
Taille des particules (µm)
Figure 53 : Exemple de distribution granulométrique obtenue à partir du yaourt brassé témoin
III.3.2. Propriétés rhéologiques
Un test de rétro-extrusion, consistant à forcer le passage du produit dans l’espace annulaire

entre un piston mobile et la paroi d’un récipient cylindrique, a été réalisé à l’aide du texturomètre
TAX-T2i (TA Instruments, Stable Micro Systems, UK). Trente grammes de yaourt brassé témoin ou
enrichi en micro-gels ont été préalablement introduits dans un récipient de 40 mL puis laissés 1 h à
4°C avant la réalisation du test. Un piston cylindrique en aluminium de 2 cm de diamètre et 2 mm
d’épaisseur a été utilisé. Lors du test, la vitesse d’enfoncement a été de 0,5 mm.s-1 et la profondeur
d’échantillon analysé de 30 mm. La valeur de la force a été calculée dans la zone de pseudo-plateau
comprise entre 5 mm et 25 mm de distance d’enfoncement pour laquelle la force varie peu et de façon
régulière. Dans cette zone, aucune évolution de la force en fonction de la distance d’enfoncement liée
à un effet de fond n’est perceptible.
Les mesures en écoulement ont été réalisées à l’aide du rhéomètre Carri-Med CSL²100 (TA
Instruments, UK) équipé d’une géométrie cône-plan de 6 cm de diamètre et 4° d’angle munie d’un
piège à solvant (Figure 47b). Une courbe d’écoulement « aller-retour » a été réalisée à l’aide d’un
balayage par paliers de 0,2 à 100 s-1 en 10 min à 4°C en mode logarithmique incluant 3 décades et
10 points par décade.
82
Le comportement à l’écoulement des yaourts brassés témoin et ceux enrichis en micro-gels a

été modélisé selon une loi en puissance (Eq. 16) et selon le modèle de Herschel-Bulkley (Eq. 17) :
•n
Loi de puissance : σ = k γ Eq. 16
où k est l’indice de consistance (Pa.sn) et n est l’indice de comportement du fluide.
•n
Modèle de Herschel-Bulkley : σ = σ s + K γ Eq. 17
où σs est le seuil de contrainte (Pa), K est l’indice de consistance (Pa.sn) et n est l’indice de
comportement du fluide.
Par ailleurs, les yaourts brassés témoin ou enrichis en micro-gels présentant un caractère
thixotrope plus ou moins prononcé, l’aire entre les courbes d’écoulement aller et retour a été calculée.
III.3.3. Observation microscopique
Les yaourts brassés témoin ou enrichis en micro-gels ont été observés entre lame et lamelle en
microscopie optique à l’aide d’un microscope Olympus BX 51 (Olympus, Japon) en mode contraste
de phase avec des objectifs de grossissement x10 et x40.
III.4. Analyses statistiques

L’ensemble des données sensorielles et instrumentales a été saisi et traité sous Microsoft
Excel et les traitements multidimensionnels ont été réalisés sous XLSTAT.
La répétabilité des juges a été vérifiée préalablement par une Analyse en Composantes
Principales (ACP). Un juge, considéré comme peu répétable, c’est-à-dire pour lequel les deux
répétitions de produits étaient positionnées de manière éloignée sur le plan 1-2 de l’ACP, a été écarté
pour la suite de l’analyse des données.
De manière préalable, une Classification Ascendante Hiérarchique (CAH), sur la base d’une
matrice de distance euclidienne et du critère de Ward, a été réalisée à partir des données du profil
flash dans l’objectif de constituer des groupes de produits et de termes générés par les juges. Une
Analyse Procrustéenne Généralisée (APG) a également été appliquée aux données du profil flash
pour établir une carte de consensus entre les juges. Les données instrumentales ont été analysées par
une Analyse en Composantes Principales (ACP). Afin de comparer la carte de consensus des données
sensorielles obtenue par APG et l’ensemble des données instrumentales, une seconde APG suivie
d’une CAH a été utilisée.
83
Afin d’établir une relation entre une variable réponse Y et un ensemble de variables explicatives
Xi indépendantes, une régression linéaire multiple a été utilisée. Le modèle s’écrit de la façon
suivante :
Y = a + b1X1 + b2X2 + b3X1X2 + e Eq. 18
où Y est la variable dépendante ; X1 et X2 sont les variables indépendantes ; a est l’ordonnée à

l’origine estimée ; b1, b2 et b3 sont les coefficients partiels de régression estimés et e est le terme
d’erreur (résidu de régression).
84
Chapitre 3 : Mélanges lait / guar avant et après gélification
L’objectif de ce chapitre est d’étudier les phénomènes de séparation de phases et de gélification

acide au sein de systèmes laitiers enrichis en polysaccharides. En s’appuyant sur les cinétiques de
séparation de phases, les propriétés rhéologiques et la microstructure des systèmes lait / guar en
milieux neutres et acidifiés, une discussion pourra être initiée sur la base de la compétition entre les
phénomènes de séparation de phases et de gélification. Pour réaliser cette étude, une large gamme de
concentrations en guar, comprises entre 0 et 0,5% p/p, a été utilisée.
I. PROPRIETES DES MELANGES LAIT / GUAR AVANT ET APRES GELIFICATION
I.1. Propriétés des mélanges lait / guar avant gélification

Avant d’étudier les systèmes lait / guar en milieu acidifié, il paraissait nécessaire de considérer
en premier lieu les mélanges à pH du lait. Ainsi, la microstructure et le comportement rhéologique
des mélanges lait / guar ont été étudiés en milieu neutre et à 43°C, de manière à se placer dans les
conditions de température de préparation des systèmes acidifiés.
Au-delà d’une certaine concentration en polymères, l’ajout de guar dans le lait donne lieu à la
formation d’un système biphasique (Bourriot et al., 1999b ; Tuinier et al., 2000). Il s’ensuit que la
caractérisation des systèmes lait / guar en milieu neutre doit être réalisée à différents stades
d’évolution de la séparation de phases : lorsque la séparation s’opère à l’échelle microscopique, lors
de l’évolution du système considéré comme étant hors équilibre, et en fin de séparation de phases
dans un état proche de l’équilibre thermodynamique.
I.1.1. Propriétés des mélanges lait / guar avant séparation de phases
Dans le cas de systèmes subissant un processus cinétique tel qu’une séparation de phases, il est
essentiel que la caractérisation, rhéologique notamment, s’effectue avant que la déstabilisation ne
survienne à l’échelle macroscopique. En pratique, une agitation magnétique à 500 rpm environ ou
manuelle a été appliquée avant analyse, de manière à ce que tous les mélanges, susceptibles ou non de
conduire à une séparation de phases, soient bien homogènes à l’échelle macroscopique au moins
pendant le temps de la mesure.
85
I.1.1.1. Microstructure des mélanges lait / guar avant séparation de phases
L’organisation d’un mélange de lait enrichi en guar à 0,3% a été étudiée par microscopie
confocale à balayage laser (Figure 54). Il est à noter que l’observation a été réalisée moins de 5 min
après la mise en place de l’échantillon, afin de limiter l’évolution de la structure dans le temps. Sur
l’image, les zones claires correspondent à la fluorescence du DyLight 549 et révèlent ainsi la présence
de protéines. Par contraste, les parties dépourvues de protéines sont localisées dans les zones
sombres.
50 µm
Figure 54 : Mélange lait / guar à 0,3% observé en microscopie confocale à balayage laser à 43°C immédiatement
après la mise en place de l’échantillon. La barre représente 50 µm.
Les protéines apparaissent concentrées dans des zones bien définies sous la forme de
gouttelettes sphériques de taille variable, comprise entre 10 et 100 µm. Puisque les protéines de lait,
et plus particulièrement les micelles de caséines d’un diamètre de 180 nm environ, ne sont pas
observables en tant qu’entités bien distinctes par cette technique, la concentration locale en protéines
ferait suite à un regroupement des protéines dans ces gouttelettes. Par ailleurs, la forme non
parfaitement sphérique des gouttelettes pourrait être attribuée à la coalescence des gouttelettes,
d’autant plus que ce phénomène concerne principalement les gouttelettes de taille importante. Après
leur coalescence, les gouttelettes ne se relaxeraient pas de manière instantanée sous une forme
sphérique, ce qui laisse supposer qu’elles sont entourées d’une phase continue d’une viscosité élevée
enrichie en guar (Bourriot, 1999).
Finalement, le mélange lait / guar à 0,3% aboutit à la formation de deux phases bien distinctes,
l’une enrichie en protéines et l’autre appauvrie en protéines et probablement enrichie en guar. Il
pourrait donc être intéressant d’étudier la cinétique d’évolution de ce système par l’intermédiaire
d’une technique d’interaction lumière-matière par exemple. Lorsqu’une microstructure sous forme de
gouttelettes liquides se forme, le système peut être considéré comme une émulsion eau dans eau
(Norton & Frith, 2001). Cette organisation est typique d’un effet de volume exclu dû à une floculation
par déplétion des caséines qui donne lieu à une séparation de phases de type ségrégatif. Ce
86
phénomène a précédemment été observé dans le cas de mélanges protéines de lait / galactomannanes
(Bourriot et al., 1999c ; Schorsch et al., 1999). Bien que le système apparaisse stable à l’échelle
macroscopique, la structuration en deux phases distinctes visibles à l’échelle microscopique pourrait
contribuer aux propriétés rhéologiques et plus particulièrement à une augmentation de la viscosité.
I.1.1.2. Propriétés rhéologiques des mélanges lait / guar avant séparation de phases
Immédiatement après mélange, les propriétés d’écoulement du lait à 4,6% de protéines, d’une
solution de guar à 0,3% ou d’un mélange lait / guar à 0,3%, ont été caractérisées à 43°C (Figure 55).
Classiquement, la courbe reliant la vitesse de cisaillement à la contrainte pour le lait est typique d’un
comportement Newtonien et sa viscosité particulièrement faible, de l’ordre de trois fois celle de l’eau
mesurée dans les mêmes conditions de température. En revanche, le guar seul montre des propriétés
rhéofluidifiantes typiques du comportement d’une solution macromoléculaire en régime non dilué.
Bien que le mélange lait / guar soit également rhéofluidifiant, la viscosité du milieu est plus élevée
que le guar seul sur toute la gamme de vitesse étudiée. Ainsi, la viscosité apparente du mélange est
supérieure à la somme des viscosités des composés individuels aux mêmes concentrations, ce qui
traduit un effet de synergie. Ce phénomène a précédemment été reporté par Bourriot et al.
(1999c) pour des mélanges de 3% de micelles de caséines et 0,2% de guar.
2,4
Lait
2,0 Solution G0,3%
Lait + G0,3%
Contrainte (Pa)
1,6
1,2
0,8
0,4
0,0
0 20 40 60 80 100
-1
Vitesse de cisaillement (s )
Figure 55 : Courbes d’écoulement du lait à 4,6% de protéines ( ), d’une solution de guar à 0,3% dans
0,1 M NaCl ( ) et d’un mélange lait / guar à 0,3% ( ) réalisées à 43°C
87
La Figure 56 illustre la viscosité apparente à 100 s-1 de solutions de guar ou de mélanges

lait / guar pour des concentrations en guar variables. La viscosité augmente de manière importante
lorsque la concentration en guar augmente, aussi bien dans le cas d’une solution de guar dans 0,1 M
de NaCl qu’en mélange dans le lait. Ce comportement est attribué au passage d’un régime dilué aux
très faibles concentrations en polymères, à un régime semi-dilué pour lequel un recouvrement des
chaînes de polymères a lieu puis à un enchevêtrement des chaînes en régime concentré à mesure que
la concentration en guar croît (De Gennes, 1979).
Solution G
Viscosité à 100 s (Pa.s)
Lait + G
-1
0,01
1E-3
0,01 0,1 1
Concentration en guar (%)
Figure 56 : Viscosité à 100 s-1 d’une solution de guar dans 0,1 M NaCl ( ) et des mélanges lait / guar ( ) en
fonction de la concentration en guar à 43°C
De la même manière que dans le cas du système lait / guar à 0,3% (Figure 55), un effet de
synergie à la suite du mélange des deux composés est constaté quelle que soit la concentration en
polysaccharides. Toutefois, cet effet est d’autant plus marqué que la concentration en guar est
importante. L’augmentation de la viscosité consécutive au mélange du lait et du guar correspondrait
davantage à une surconcentration de la phase continue enrichie en guar plutôt qu’à une organisation
particulière voire à une structuration du système. En effet, la faible viscosité de la phase riche en
protéines ainsi que l’absence de connexion entre les gouttelettes (Figure 54) influenceraient de
manière mineure la viscosité du système.
88
I.1.2. Suivi de la séparation de phases des mélanges lait / guar
Le système lait / guar à 0,3% est instable et une séparation de phases microscopique est
observable immédiatement après mélange, puis elle devient macroscopique suite à la sédimentation
des gouttelettes concentrées en protéines. De manière générale, les phénomènes de déstabilisation au
sein des émulsions suivent la loi de Stokes. Néanmoins, cette théorie n’est valable que dans le cas de
faibles fractions volumiques, généralement inférieures à 1%. Les particules peuvent alors être
considérées comme sédimentant de manière individuelle, en excluant toute interaction entre les
particules. Par ailleurs, l’hypothèse d’un phénomène de coalescence mis en évidence par microscopie
confocale (Figure 54) induirait une évolution de la taille des particules au cours du temps. Par
conséquent, dans le cas des mélanges lait / guar, une approche basée sur la théorie de la loi de Stokes
pour le calcul des vitesses de sédimentation serait peu réaliste. Toutefois, une réflexion fondée sur les
paramètres dictés par la loi de Stokes (viscosité de la phase continue, taille des gouttelettes, différence
de densité entre les deux phases et accélération de la pesanteur) (Eq. 2) pour interpréter la vitesse de
sédimentation a été réalisée.
Deux échelles d’observation ont été utilisées pour suivre le phénomène de séparation de phases
dans les mélanges lait / guar :
− une échelle microscopique par l’intermédiaire d’observations en microscopie confocale ;
− une échelle macroscopique à l’aide d’une technique d’interaction lumière-matière.
I.1.2.1. Suivi de la séparation de phases par microscopie confocale
Le comportement du mélange lait à 4,6% de protéines / guar à 0,3% a été suivi au cours du
temps à 43°C par microscopie confocale (Figure 57). Une coupe suivant l’axe Z a été réalisée à
intervalles de temps réguliers après la mise en place de l’échantillon dans un entrefer contrôlé de
3 mm (Chapitre 2, II.4.2). L’approche est davantage qualitative que quantitative et les temps inscrits
sur la Figure 57 sont donnés à titre indicatif en raison de la difficulté de maîtrise du temps entre la fin
du mélange et le début des enregistrements des coupes en Z.
De la même façon que précédemment, les zones claires permettent de localiser les protéines sur
les images. Sur le profil correspondant au temps initial, des domaines enrichis en protéines dans la
partie inférieure se sont formés. L’excitation moins efficace du laser à mesure qu’il s’éloigne de la
lamelle inférieure est responsable de la zone dépourvue de protéines en surface d’échantillon.
Contrairement aux observations faites sur la Figure 54, les gouttelettes apparaissent en zones diffuses
89
et sont de taille inférieure à 50 µm. Il est à noter que l’enregistrement d’un profil complet suivant
l’axe Z nécessite un temps d’environ deux minutes pendant lequel les structures peuvent évoluer. Or,
Schorsch et al. (1999) ont montré que les mélanges lait / caroube relevaient d’un processus cinétique
avec un phénomène de coalescence des gouttelettes détecté seulement une minute après mélange.
Sédimentation des gouttelettes Formation de la couche de sédiment
215
µm
50 µm
0 h (0 min) 0,03 h (2 min) 0,1 h (6 min) 0,2 h (12 min) 0,5 h (30 min)
Figure 57 : Suivi de la microstructure du mélange lait / guar à 0,3% dans le temps, indiqué en heures et en minutes,
en microscopie confocale à balayage laser à 43°C
Dès les premières minutes, des gouttelettes individualisées apparaissent dans la partie inférieure
de l’échantillon puis fusionnent en entrant en collision ou lorsqu’elles atteignent la lamelle inférieure.
Après 6 min environ, une couche de sédiment d’environ 100 µm riche en protéines se forme. Ainsi,
les gouttelettes ne maintiennent pas leur forme individuelle lors de la formation du sédiment, signe
d’une coalescence et vraisemblablement d’une faible tension interfaciale. Au fur et à mesure du
temps, la concentration en gouttelettes dans la partie inférieure augmente, ce qui génère une
augmentation de la probabilité de collision des gouttelettes, donc de leur coalescence, et par
conséquent une augmentation de la couche de sédiment.
I.1.2.2. Suivi de la séparation de phases par une technique d’interaction lumière-

matière
La deuxième approche utilisée pour suivre la séparation de phases de mélange lait / guar est
basée sur une technique d’interaction lumière-matière. A la différence d’autres techniques de
caractérisation, le Turbiscan permet de déterminer des cinétiques de déstabilisation, aussi bien de
suspensions diluées que concentrées, par un balayage régulier des échantillons sur toute leur hauteur.
Sachant que le principe de mesure est basé sur la diffusion multiple de la lumière, toute modification
de taille ou de concentration en particules est détectée. Ainsi, les suspensions stables sont
caractérisées par des valeurs de rétrodiffusion et transmission constantes au cours du temps et sur
toute la hauteur de l’échantillon. En revanche, les phénomènes de sédimentation ou crémage sont
détectables suite à une variation du niveau de rétrodiffusion et/ou transmission par rapport au profil
initial pris au temps de 0 h.
90
A titre d’exemple, les flux de rétrodiffusion et transmission du mélange lait / guar à 0,3% suivis
à 43°C pendant 1 h sont présentés dans la Figure 58.
0,10
Temps (h)
∆ Transmission (%)
0,05 0
0,1
0,00 0,2
0,5
-0,05 0,7
1
-0,10
20
∆ Rétrodiffusion (%)
15
10
5
0
-5
-10
-15
-20
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Hauteur (mm)
Sédiment Surnageant Air t:0h t:1h

Figure 58 : Suivi des profils de ∆transmission et de ∆rétrodiffusion dans le temps en fonction de la hauteur d’un
mélange lait / guar à 0,3% à 43°C. Les photos des tubes correspondent au temps initial et à 1 h. Les flèches grises
indiquent le sens d’évolution des valeurs de ∆transmission et de ∆rétrodiffusion dans le temps.
En comparaison avec le profil initial correspondant au temps de 0 h, une modification du

niveau de ∆rétrodiffusion apparaît dès les premières minutes après arrêt du mélange. Ce changement
se traduit par une augmentation de la valeur de ∆rétrodiffusion dans le bas du tube alors qu’elle
diminue dans la partie supérieure. Après 30 min, la valeur de ∆rétrodiffusion reste constante dans la
partie inférieure mais un second phénomène intervient avec la formation d’une couche de sédiment.
Au cours du temps, la hauteur de sédiment augmente jusqu’à atteindre environ 10 mm après 1 h.
Parallèlement, le niveau de ∆transmission tend à augmenter dans le haut du tube, traduisant un début
de clarification dans la partie supérieure de l’échantillon.
Un lien étroit entre les mesures de rétrodiffusion et les observations en microscopie confocale
(Figure 57) peut être établi. En effet, l’augmentation du niveau de rétrodiffusion dans le bas du tube
91
correspond à une augmentation de la concentration et probablement de la taille des gouttelettes suite à

leur coalescence et/ou leur sédimentation. Par la suite, les nombreuses gouttelettes tassées dans la
partie inférieure fusionnent pour former une couche de sédiment qui augmente en hauteur jusqu’à ce
que la concentration ou taille des gouttelettes soit insuffisante pour permettre leur sédimentation.
A partir des profils de rétrodiffusion, plusieurs cinétiques peuvent être calculées pour la
détermination de la vitesse de sédimentation. Il est à noter que le calcul de la vitesse de sédimentation
correspond en fait à une vitesse moyenne pour l’ensemble des gouttelettes. En effet, celle-ci ne tient
pas compte de la hauteur initiale des gouttelettes dans le tube après mélange et donc de leur distance à
parcourir avant d’atteindre le bas du tube. Deux cinétiques ont été sélectionnées comme étant les plus
pertinentes en considérant les profils de rétrodiffusion pour décrire les phénomènes physiques
(Figure 59) :
− la valeur maximale de ∆rétrodiffusion dans la partie inférieure de l’échantillon ;
− l’épaisseur relative du pic de rétrodiffusion, qui représente l’évolution du front de la

couche de sédiment à un quart de la valeur maximale de ∆rétrodiffusion dans la partie inférieure de
l’échantillon.
Valeur maximale de Temps (h)

20 ∆ Rétrodiffusion 0
0,1
15 0,2
0,5
0,7
10 1 Mesure de l’épaisseur
5 relative du pic de
∆ Rétrodiffusion
0
-5
-10
-15
-20
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Hauteur (mm)
Figure 59 : Détermination de la valeur maximale de ∆rétrodiffusion (flèches grises) et du niveau de ∆rétrodiffusion
pour lequel l’épaisseur relative en ∆rétrodiffusion est mesurée (ligne grise en pointillés) à partir des profils de
∆rétrodiffusion d’un mélange lait / guar à 0,3% à 43°C
92
La valeur de ∆rétrodiffusion dans le bas du tube reste constante jusqu’à 0,1 h après mélange.
En revanche, une augmentation significative du signal de rétrodiffusion apparaît au fur et à mesure
que les gouttelettes se concentrent au fond du tube. Par la suite, le plateau correspondant à une
stabilisation de la valeur de ∆rétrodiffusion peut être relié à la formation de la couche de sédiment,
pour laquelle la concentration et la taille de particules n’évoluent plus. Ainsi, deux paramètres
peuvent être extraits de cette cinétique : le début de la sédimentation des gouttelettes, correspondant
au temps pour lequel le signal de ∆rétrodiffusion au fond du tube augmente ; et le début de formation
de la couche de sédiment, détecté par le début du plateau de ∆rétrodiffusion mesuré dans la partie
inférieure de l’échantillon (Figure 60). Il est à noter que le début de sédimentation des gouttelettes
concerne principalement celles situées dans la partie inférieure du tube, ce qui ne provoque pas de
gradient de concentration en particules majeur dans la partie médiane de l’échantillon (Figure 58). Par
ailleurs, le décalage du temps de début de formation de la couche de sédiment observé entre la
microscopie confocale (Figure 57) et la technique d’interaction lumière-matière pourrait être dû à la
mesure effectuée uniquement tous les 40 µm au Turbiscan et/ou au fait que les images ne sont
acquises en microscopie confocale qu’après un temps d’environ 2 min correspondant à la mise en
place de l’échantillon, le temps étant par conséquent moins bien maîtrisé.
Sédimentation Formation de la
des gouttelettes couche de sédiment
25
20
15
10
0
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
Temps (h)
Figure 60 : Détermination du temps de début de sédimentation des gouttelettes et de formation de la couche de
sédiment à partir du suivi de la valeur maximale de ∆rétrodiffusion d’un mélange lait / guar à 0,3% à 43°C dans le
temps. Les barres d’erreur représentées correspondent à des mesures réalisées en triple sur des échantillons
différents.
93
Les cinétiques d’épaisseur relative du pic de rétrodiffusion sont représentées sur la Figure 61a
pour différentes concentrations en guar, de 0,1 à 0,4%. A partir de ces courbes de cinétique, la vitesse
moyenne de sédimentation est déterminée par la valeur de la pente (Figure 61a), indicateur de la
vitesse de formation du sédiment (Figure 61b).
a 12 b 20
Vitesse de sédimentation (mm.h )

-1
0,15% 18
10 0,2% 16
∆ Hauteur (mm)
8
14
0,25%
12
6 0,3% 10
8
4 0,1%
6
0,4%
2
Pente 4
2
0 0
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
Temps (h) Concentration en guar (%)
Figure 61 : (a) Cinétiques de l’épaisseur relative en ∆rétrodiffusion de mélanges lait / guar de 0,1% à 0,4% à 43°C.
Les concentrations en guar sont indiquées sur la figure ; (b) Vitesses de sédimentation, issues des pentes des
cinétiques de l’épaisseur relative en ∆rétrodiffusion, en fonction de la concentration en guar à 43°C
Deux comportements antagonistes sont observés lorsque la concentration en guar augmente.

D’une part, la vitesse de sédimentation augmente pour une concentration en guar comprise entre
0,05% et 0,15%. A l’origine de ce phénomène se trouve un mécanisme de déplétion-floculation dont
l’intensité s’accentue lorsque la concentration en polymères augmente (Asakura & Oosawa, 1958).
D’autre part, une corrélation négative entre la vitesse de sédimentation et la concentration en guar
intervient lorsque la concentration est supérieure à 0,2%. Dans ce cas particulier, les effets de
déplétion sont considérablement ralentis du fait de la viscosité élevée de la phase continue riche en
guar (Figure 56) (Syrbe et al., 1998), ce qui conduit même à une pseudo-stabilité sur l’échelle de
temps de 4 h considérée dans l’expérience pour une concentration supérieure ou égale à 0,5%.
I.1.3. Propriétés des mélanges lait / guar à l’équilibre
Après l’étude des mélanges lait / guar avant et lors de la séparation de phases, une dernière
approche consiste à étudier ces systèmes dans un état supposé proche de l’équilibre
thermodynamique. Ainsi, la fraction volumique des deux phases présentes en fin de sédimentation a
94
été évaluée pour différentes concentrations en guar, sachant que la phase inférieure est riche en
protéines alors que la phase supérieure est enrichie en guar (Figure 62).
1,0
0,8
0,6
H/H0
0,4
0,2
0,0
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4
Figure 62 : Hauteurs relatives de surnageant des mélanges lait / guar de 0% à 0,4% après 4 h à 43°C. Les barres
d’erreur représentées correspondent à des mesures réalisées en triple sur des échantillons différents.
Une concentration en guar aussi faible que 0,01% suffit à provoquer une séparation de phases.
La fraction de surnageant augmente de manière importante pour des concentrations inférieures à
0,15% mais un plateau apparaît aux concentrations élevées. Ce comportement est à mettre en lien
avec l’évolution de la vitesse de sédimentation en fonction de la concentration en guar (Figure 61b).
En effet, les viscosités des systèmes contenant des concentrations en guar élevées peuvent retarder la
séparation de phases de manière importante, voire l’empêcher sur l’échelle de temps considérée de
4 h.
En connaissant la viscosité des mélanges lait / guar ainsi que celle de solutions de guar de
différentes concentrations (Figure 56 et Figure 63a), il est possible d’estimer la concentration en guar
du surnageant par modélisation des courbes de viscosité de solutions de guar de différentes
concentrations. Par la suite, la fraction volumique correspondante peut être calculée à partir du
rapport de la concentration en guar dans le mélange initial sur celle de surnageant estimée. Ce calcul
théorique implique que le surnageant contienne uniquement du guar ainsi que la distribution du
solvant entre les deux phases se produise de manière égale.
95
0,0 1,0
a b Expérimentales
log (concentration en guar) (%)
Calculées
y1 = - 0,12 x2 - 0,09 0,8
-0,5 R2 = 1,00
0,6
H/H0
-1,0
0,4
y2 = 2,07 x + 4,75
-1,5 R2 = 0,98
0,2
-2,0 0,0
-3,5 -3,0 -2,5 -2,0 -1,5 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4
-1
log (η à 100 s ) (Pa.s) Concentration en guar (%)
Figure 63 : (a) Courbe étalon entre la viscosité mesurée à 100 s-1 et la concentration en guar d’une solution à
0,1 M NaCl à 43°C ; (b) Hauteurs relatives de surnageant des mélanges lait / guar de 0% à 0,4% obtenues
expérimentalement après 4 h à 43°C (ligne en pointillés) ou calculées à partir du rapport de la concentration en guar
dans le mélange initial sur celle de surnageant estimée à partir des gammes de concentrations d’une solution de guar
à 0,1 M NaCl (ligne pleine)
Les valeurs calculées des fractions volumiques de surnageant en fonction de la concentration en

guar sont reportées sur la Figure 63b, les valeurs obtenues expérimentalement étant rappelées en
pointillés. Pour une concentration en guar supérieure à 0,1%, les valeurs des hauteurs de surnageant
estimées à partir des gammes de concentrations sont superposées à celles déterminées en fin de
séparation de phases. Si l’augmentation de viscosité des mélanges lait / guar par rapport aux solutions
de guar seul est majoritairement due à un effet de concentration de la phase continue riche en guar,
alors la répartition des phases n’évoluerait pas de manière importante entre le début de formation des
gouttelettes et la fin de leur sédimentation. Dans ces conditions, la séparation des deux phases à
l’échelle microscopique se produirait de manière presque immédiate. En revanche, une légère
surestimation de la fraction volumique calculée est constatée pour des concentrations en guar
inférieures à 0,1%. Dans ce cas, deux hypothèses peuvent être émises pour expliquer ce décalage.
D’une part, la sédimentation des zones enrichies en protéines peut s’avérer être lente lorsque la force
de déplétion est peu importante, notamment en présence d’une faible concentration en polymères.
Une seconde explication pourrait rendre compte de ce comportement : l’estimation de la fraction
volumique par le calcul n’étant valable que dans le cas d’une phase continue enrichie en guar, les
systèmes contenant moins de 0,1% de guar présenteraient une phase continue protéique avec des
inclusions de guar. Cette hypothèse est appuyée par le fait qu’aucune augmentation de ∆rétrodiffusion
96
dans le bas du tube n’est constatée sur les profils obtenus au Turbiscan, alors qu’une clarification
lente survient dans la partie supérieure du tube (résultats non montrés).
A partir de la fraction volumique correspondant à la phase protéique, il est possible d’estimer la

concentration en protéines au sein des gouttelettes ou dans la couche de sédiment. Au-delà de 0,15%
de guar, une surconcentration en protéines des systèmes mixtes proche d’un facteur quatre, soit près
de 200 g/kg de protéines, s’établirait par rapport à la concentration du lait initial de 46 g/kg de
protéines.
I.2. Propriétés des gels acides enrichis en guar

Les résultats précédents concernant les mélanges lait / guar à pH du lait peuvent servir de base
à l’étude de ces systèmes après gélification. En effet, la gélification intervient comme un mécanisme
supplémentaire à la séparation de phases mise en évidence au sein de ces systèmes mixtes. Dans ce
cadre, la gélification des protéines de lait a été menée par acidification progressive des mélanges à
43°C à l’aide de GDL jusqu’à pH 4,6, mimant la gélification acide obtenue par l’action des ferments,
mais avec un temps de gélification plus court. De la même manière que dans l’étude précédente, les
propriétés macroscopiques et microscopiques ainsi que le comportement rhéologique des systèmes
mixtes contenant de 0 à 0,5% de guar ont été étudiés.
I.2.1. Comportement macroscopique des gels fermes acides avant brassage
Les hauteurs relatives de surnageant des gels fermes en fonction de la concentration en guar
ajoutée dans le lait avant acidification sont données dans la Figure 64, les valeurs obtenues dans les
mélanges lait / guar non acidifiés étant reprécisées pour comparaison. Aussi bien pour les mélanges
acidifiés que ceux à pH neutre, le surnageant se compose essentiellement de guar, de lactosérum ou
d’un mélange des deux composants, les protéines étant minoritaires.
Dès l’ajout de 0,05% de guar, une légère séparation de phases se forme dans la partie
supérieure du gel ferme, alors qu’une augmentation spectaculaire de la quantité de surnageant est
observée pour 0,1% de guar. Des niveaux de synérèse élevés ont également été observés dans des
systèmes lait / caroube à des concentrations inférieures ou égales à 0,1% en milieu acidifié (Sanchez
et al., 2000). Ce phénomène a été attribué à une micro-séparation de phases dans le réseau protéique,
contribuant à la porosité et à l’expulsion importante de lactosérum des gels acides mixtes.
97
1,0
0,8
0,6
H/H0
0,4
0,2
0,0
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
Figure 64 : Hauteurs relatives de surnageant des gels fermes contenant de 0% à 0,5% de guar acidifiés avec 1,5% de
GDL à 43°C (ligne pleine) et des mélanges lait / guar de 0% à 0,4% non acidifiés après 4 h à 43°C (ligne en
pointillés)
A la différence des gels enrichis en guar à des concentrations inférieures à 0,1%, une nette
diminution de la hauteur de surnageant des gels, composé vraisemblablement d’un mélange de guar et
de lactosérum, apparaît pour des concentrations en guar comprises entre 0,1 et 0,5%. Par ailleurs, le
comportement de phases de ces gels mixtes acidifiés ne suit pas la même tendance que celui des
mélanges non acidifiés. Alors que la quantité de surnageant des mélanges lait / guar à pH neutre reste
sensiblement stable à partir de 0,15% de guar, les systèmes acidifiés tendent vers une absence de
séparation de phases à mesure que la concentration en guar augmente.
Cette diminution de la phase de surnageant suite à la gélification des mélanges lait / guar peut
s’expliquer par la combinaison de deux phénomènes : un effet de viscosité élevée de la phase
continue ralentissant la séparation de phases et la présence du mécanisme de gélification. La première
hypothèse est appuyée par le fait que la viscosité des mélanges lait / guar augmente de manière
importante en fonction de la concentration en guar, notamment au-delà de 0,2% de guar, ce qui
limiterait considérablement la sédimentation des gouttelettes (Figure 61b).
98
I.2.2. Microstructure des gels acides brassés
Les différences de comportement de phases observées entre les mélanges lait / guar à pH neutre
ou acide peuvent être la conséquence de la mise en place d’une structure particulière suite à la
gélification des protéines. De manière à compléter les résultats de séparation de phases
macroscopique des gels mixtes acides, une étude de la microstructure de ces gels après brassage a été
menée par microscopie confocale.
Les images de microscopie confocale des gels acides brassés contenant de 0 à 0,5% de guar
sont présentées sur la Figure 65. Les zones claires correspondent à la fluorescence du DyLight 549 et
révèlent ainsi la présence de protéines. En absence de guar, la distribution du réseau protéique est
homogène. L’ajout d’une concentration en guar aussi faible que 0,05% modifie le réseau en le
densifiant et en générant des pores de taille importante entre les mailles du gel caséique. Lorsque la
concentration en guar est supérieure ou égale à 0,15%, un ensemble de morphologies très
particulières apparaît, avec la formation de longs filaments enchevêtrés puis de micro-gels allongés et
sphériques, à mesure que la concentration en polysaccharides augmente.
0% 0,05% 0,15% 0,3% 0,5%
100 µm
Figure 65 : Gels brassés contenant de 0% à 0,5% de guar et acidifiés avec 1,5% de GDL à 43°C observés en
microscopie confocale à balayage laser à 20°C. Les concentrations en guar sont indiquées sur la figure. La barre
représente 100 µm.
En s’appuyant sur les résultats obtenus par Sanchez et al. (2000), la densification du réseau, en
présence d’une concentration en galactomannanes inférieure ou égale à 0,1%, serait attribuée à un
équilibre entre la gélification de micelles de caséines concentrées et des effets de volume exclu. Une
des conséquences de ce phénomène est un tassement du gel qui résulte en une expulsion de
lactosérum et/ou de solution de guar importante. Ceci explique la quantité élevée de surnageant
contenue dans les gels fermes à base de guar à 0,1% (Figure 64).
Lorsqu’une concentration importante en polysaccharides neutres tels que le guar est introduite
dans le lait, le système se structure sous la forme d’une émulsion eau dans eau (Figure 54). Au sein de
cette émulsion, la phase ayant la plus grande fraction volumique à l’équilibre tend à former la phase
99
continue. Puisque les micro-gels sont de nature protéique, la phase continue des systèmes contenant
de 0,15 à 0,5% de guar est enrichie en guar. Au moment de l’agrégation acide au point isoélectrique
des protéines de lait, les gouttelettes passent par une transition sol-gel et se figent. Ainsi, ce
mécanisme aboutit à la formation de micro-gels compacts riches en protéines dispersés dans une
phase continue enrichie en guar. Par ailleurs, la question de la sphéricité plus ou moins parfaite des
micro-gels se pose. En effet, à notre connaissance, aucune étude portant sur les gels laitiers acides
enrichis en polysaccharides neutres ne rapporte de morphologies sous la forme de filaments ou de
micro-gels allongés. Ce point sera discuté plus largement dans le paragraphe II de ce chapitre.
I.2.3. Propriétés viscoélastiques des gels acides brassés
En complément des études du comportement de séparation de phases macroscopique et de la

microstructure, les propriétés viscoélastiques des gels acides brassés ont été analysées. Les spectres
viscoélastiques des gels brassés à base de lait additionné de 0 à 0,5% de guar sont représentés sur la
Figure 66.
0% 0,05% 0,15% 0,3% 0,5%

1000 1000 1000 1000 1000
100 100
G’, G’’ (Pa)
100 100 100
10 10 10 10 10
1 1 1 1 1
0,1 0,1 0,1 0,1 0,1
0,01 0,01 0,01 0,01 0,01

0,01 0,1 1 10 0,01 0,1 1 10 0,01 0,1 1 10 0,01 0,1 1 10 0,01 0,1 1 10
Fréquence (Hz)
Figure 66 : Spectres viscoélastiques à 4°C des gels brassés contenant de 0% à 0,5% de guar et acidifiés avec 1,5% de
GDL à 43°C (( ) G’, ( ) G’’). Les concentrations en guar sont indiquées sur la figure.
Une grande diversité de comportements est mise en évidence selon la concentration en guar.
Aux concentrations en guar inférieures à 0,15%, le spectre a une allure semblable à celui du gel
brassé sans guar, caractéristique d’un système structuré avec le module G’ supérieur à G’’ et peu de
dépendance à la fréquence. Cependant, un renforcement notable des propriétés viscoélastiques a lieu
pour une concentration en guar de 0,05% alors que les modules sont plus faibles dans le gel contenant
0,15% de guar. L’ajout d’une concentration supérieure ou égale à 0,3% de guar conduit à un
changement radical des propriétés viscoélastiques. En effet, les propriétés « solides » des systèmes
tendent à disparaître au profit des propriétés liquides. Celles-ci se manifestent par une dépendance des
modules sur tout le domaine de fréquence ainsi qu’un module visqueux supérieur au module élastique
aux faibles fréquences.
100
Une autre représentation des modifications rhéologiques spectaculaires ayant lieu pour ces gels
est illustrée par l’évolution de tan δ en fonction de la concentration en guar (Figure 67). Pour des
concentrations inférieures à 0,2% de guar, une valeur de tan δ stable d’environ 0,3, caractéristique de
systèmes très structurés, est relevée. En revanche, lorsque la concentration en guar augmente,
l’augmentation importante de tan δ est un signe de la transition vers un système moins structuré
typique d’une solution macromoléculaire. Cette transition se produit entre 0,25 et 0,3% de guar et est
suivie d’une légère baisse de tan δ pour des concentrations en guar supérieures à 0,35%.
2,00
1,75
1,50
tan δ (0,5 Hz)
1,25
1,00
0,75
0,50
0,25
0,00
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
Figure 67 : Evolution de tan δ à 0,5 Hz à 4°C des gels brassés contenant de 0% à 0,5% de guar et acidifiés avec
1,5% de GDL à 43°C
L’augmentation des modules viscoélastiques du gel à base de 0,05% de guar pourrait être liée à
un effet de synergie suite à un renforcement du gel lié à des effets d’exclusion de volume. Dans ce
cas, la concentration locale en protéines contribue à augmenter la connectivité du réseau caséique. Ce
phénomène a été largement illustré dans le cas de gels mixtes protéines sériques / polysaccharides
(Bryant & McClements, 2000 ; Ould Eleya & Turgeon, 2000 ; Simonet, 2000). A l’inverse, un effet
antagoniste produisant un affaiblissement puis une absence de connectivité du gel sont mis en
évidence pour une concentration en guar supérieure à 0,15%. Puisque les micro-gels riches en
protéines constituent la phase dispersée (Figure 65), une solution enrichie en guar correspond à la
phase majoritaire, à l’origine des spectres typiques d’une solution macromoléculaire observés dans
101
les gels à 0,3 et 0,5% de guar. La légère diminution de tan δ observée à des concentrations en guar
supérieures à 0,35% peut être attribuée à la haute viscosité de la phase continue et à la présence de
nombreux micro-gels sphériques, agissant comme une suspension concentrée de particules. Le gel
contenant 0,15% de guar constitue un cas particulier. Bien que la phase continue soit riche en guar,
les enchevêtrements des longs filaments solides contribuent à la structuration du système.
II. EFFET DE LA GELIFICATION AU REGARD DE LA CINETIQUE DE SEPARATION

DE PHASES
Lors d’une gélification en présence d’une séparation de phases, les mélanges faisant intervenir
des polysaccharides et des protéines peuvent donner lieu à un phénomène antagoniste ou de synergie,
se traduisant respectivement par un affaiblissement ou un renforcement des propriétés
viscoélastiques. A l’origine de ces phénomènes se trouve le processus de séparation de phases de type
ségrégatif qui n’aboutit pas à son stade ultime en raison de la formation du gel. Ceci met en lumière le
caractère primordial de l’aspect cinétique des deux événements se produisant parallèlement : la
séparation de phases et la gélification.
L’objectif de cette partie est en premier lieu de faire varier la cinétique de gélification lorsqu’un
phénomène de séparation de phases se passe conjointement. Il s’agira ensuite d’étudier l’effet d’une
accélération de la séparation de phases sur la structure des gels mixtes enrichis en guar.
II.1. Effet de la cinétique de gélification sur les propriétés des gels

acides brassés
II.1.1. Effet de la concentration en GDL sur la cinétique de gélification
Dans le cas d’une acidification chimique, la cinétique de formation du gel laitier peut être
contrôlée en faisant varier la concentration en GDL (Horne, 2001). La Figure 68 montre la diminution
du pH dans le temps, consécutive à l’ajout d’une concentration variable de GDL (1, 1,5 ou 2,5%)
dans le lait à 43°C.
102
6,4
6,2
6,0
5,8
5,6
pH
5,4
Formation
5,2 du gel
5,0
4,8
4,6 1%
2,5% 1,5%
4,4
0 1 2 3 4
Temps (h)
Figure 68 : Cinétiques de pH d’un lait acidifié avec 1%, 1,5% ou 2,5% de GDL à 43°C. Les concentrations en GDL
sont indiquées sur la figure. Le pH de 5,2 correspond à la formation du gel.
Le pH initial du lait d’environ 6,7 diminue jusqu’au pH de 4,6 après 2 h ou 50 min suite à un
ajout de 1,5% ou 2,5% de GDL respectivement, et jusqu’au pH de 4,7 après 4 h pour 1% de GDL. La
diminution du pH est très fortement ralentie par l’abaissement rapide de la température de 43°C à
20°C. Lors de la baisse du pH, les protéines de lait subissent un ensemble de modifications physico-
chimiques aboutissant à la mise en place d’un gel vers le pH 5,2 pour un lait ayant été traité
thermiquement (Chapitre 1, I.2 et I.3) (Lucey et al., 2001). A partir des cinétiques de pH, il en ressort
que la diminution de pH est plus rapide et le temps nécessaire à l’agrégation des protéines plus court
pour l’ajout d’une quantité de GDL importante. Ceci implique que le temps de gélification diminue
lorsque la concentration en GDL augmente. Comme l’illustre la Figure 68, le pH de 5,2 est atteint
après 0,7, 0,5 et 0,2 h (soit 42, 30 et 12 min) pour l’ajout d’une concentration en GDL de 1, 1,5 et
2,5% respectivement.
McMahon et al. (2009) et Jacob et al. (2011) ont montré que le pH de gélification n’était pas
modifié par la vitesse d’acidification. Cependant, le cas des mélanges protéines de lait /
polysaccharides est plus complexe. Ainsi, un effet de concentration locale en protéines intervient en
présence d’une séparation de phases, ce qui pourrait faciliter les points de connexion entre ces
protéines concentrées et mener à un pH critique de gélification plus élevé. Un phénomène
103
d’accélération de la gélification des protéines a été illustré pour les mélanges entre protéines sériques
et divers polysaccharides (Renard et al., 1998 ; Capron et al., 1999 ; Simonet, 2000). Celui-ci a été
attribué à un processus de déplétion-floculation entre les agrégats de protéines et les polysaccharides,
conduisant à des micro-séparations de phases et par conséquent à une surconcentration en protéines
dans les micro-domaines ainsi formés. Le pH de début d’agrégation des protéines n’a pas été étudié
de manière systématique pour les différents mélanges lait / guar de 0 à 0,5% dans le cadre de ce
travail. Néanmoins, l’étude des mesures de rétrodiffusion en lien avec le suivi de gélification réalisé à
l’aide d’un rhéomètre indique que le pH varierait de moins de 0,1 à 0,2 unité pH (résultats non
montrés). Par conséquent, le pH de 5,2 est pris arbitrairement comme pH critique de gélification pour
l’ensemble des systèmes.
II.1.2. Effet de la cinétique de gélification sur les propriétés des gels à 0,3% de
guar
Dans un premier temps, les mélanges lait / guar à 0,3% acidifiés à l’aide de trois concentrations
différentes en GDL ont été considérés. Ceci a permis d’examiner de plus près l’effet de la vitesse de
gélification sur les propriétés des gels, tout en maintenant une cinétique de séparation de phases fixe.
Dans le cas de systèmes mixtes gélatine / polysaccharides, un effet d’intensification de la séparation
de phases a été montré suite à la gélification de la gélatine pour laquelle le passage de la conformation
pelote à la conformation hélice augmente considérablement le volume hydrodynamique occupé par
les chaînes (Lundin et al., 2000). En revanche, les micelles de caséines ne subiraient pas de
changements suffisamment majeurs de leur volume hydrodynamique lors d’une acidification pour
modifier le phénomène de déplétion-floculation.
La compréhension de l’interaction entre les cinétiques de séparation de phases et de

gélification mérite d’être approfondie. Les deux paramètres issus de l’évolution de la ∆rétrodiffusion
dans le bas du tube (début de sédimentation des gouttelettes et début de formation de la couche de
sédiment, Figure 60) sont rappelés sur la Figure 69 dans laquelle les courbes d’abaissement du pH en
fonction du temps sont représentées en échelle semi-logarithmique afin de bien distinguer les trois
cinétiques.
104
Sédimentation Formation de la
des gouttelettes couche de sédiment
6,4
6,2
6,0
5,8
5,6
pH
5,4
Formation
5,2 du gel
5,0
4,8
1%
4,6
2,5% 1,5%
4,4
0,01 0,1 1
Temps (h)
Figure 69 : Cinétiques de pH d’un mélange lait / guar à 0,3% acidifié avec 1%, 1,5% ou 2,5% de GDL à 43°C. Les
concentrations en GDL sont indiquées sur la figure. Les lignes en pointillés correspondent au temps de début de
sédimentation des gouttelettes (0,1 h), de la formation de la couche de sédiment (0,5 h) et au pH de formation du gel
(pH 5,2).
La séparation de phases et la gélification des protéines à pH 5,2 constituent donc deux

événements survenant à des intervalles de temps différents ou parfois simultanément. Par exemple,
dans le cas du mélange acidifié avec 2,5% de GDL, seules quelques gouttelettes, probablement
situées dans la partie inférieure de l’échantillon, ont commencé à sédimenter lorsque la gélification a
lieu à pH 5,2. Le système contenant 1,5% de GDL constitue un cas particulier. En effet, la gélification
intervient exactement en même temps que le début d’apparition de la couche de sédiment. En
revanche, pour le mélange à base de 1% de GDL, il existe un intervalle de temps entre le moment
auquel la couche de protéines sédimentées apparaît et la formation du gel. Dans cette situation, le
début de la séparation de phases macroscopique a lieu avant la gélification.
Puisque les cinétiques relatives de gélification et de séparation de phases varient pour les
systèmes étudiés, des propriétés de gels différentes peuvent être attendues selon la concentration en
GDL. Les microstructures des gels mixtes brassés acidifiés à l’aide de 1, 1,5 ou 2,5% de GDL sont
montrées sur la Figure 70a.
105
1 % GDL 1,5 % GDL 2,5 % GDL
100 µm
100 100 100

b
10 10 10
G’, G’’ (Pa)
1 1 1
0,1 0,1 0,1
0,01 0,01 0,01

0,01 0,1 1 10 0,01 0,1 1 10 0,01 0,1 1 10
Fréquence (Hz)
Figure 70 : (a) Microstructure observée en microscopie confocale à balayage laser à 20°C ; (b) Spectres
viscoélastiques à 4°C des gels brassés contenant 0,3% de guar acidifiés avec 1%, 1,5% ou 2,5% de GDL à 43°C
(( ) G’, ( ) G’’). Les concentrations en GDL sont indiquées sur la figure. La barre représente 100 µm. Pour l’étape
de brassage, les gels acidifiés à 1% et 1,5% de GDL ont été brassés par passage à travers les deux tuyaux car ils
présentaient des structures fibrillaires de taille trop élevée.
Le gel préparé avec 1,5% de GDL présente les mêmes caractéristiques microstructurales que
celles de la Figure 65 : un mélange de micro-gels allongés et de filaments dispersés dans une phase
continue enrichie en guar. Au contraire, des micro-gels de forme sphérique, enrichis en protéines et
de faible taille apparaissent dans le système à base de 2,5% de GDL. Le mélange acidifié avec 1% de
GDL diffère des deux systèmes précédents, avec la formation de longs filaments légèrement
enchevêtrés. Particulièrement pour ce système, un gradient de concentration en protéines au sein des
micro-gels les plus allongés s’est mis en place, avec le corps du filament très étiré légèrement moins
riche en protéines que la zone terminale. Il est à noter que les morphologies de filaments et de micro-
gels existaient dans le gel ferme toutes orientées verticalement. A l’issue de l’étape de brassage, ces
structures n’ont pas été détruites et se trouvent non orientées.
Par ailleurs, les propriétés rhéologiques des gels sont à mettre en lien avec ces microstructures
particulières (Figure 70b). Ainsi, le spectre viscoélastique du gel acidifié avec 2,5% présente un
module visqueux supérieur au module élastique pour de faibles fréquences et une grande dépendance
106
à la fréquence, typique d’une solution macromoléculaire et cohérent avec la présence d’une phase
continue concentrée en guar. La présence de filaments ou de micro-gels allongés augmente
significativement les modules viscoélastiques dans les cas des systèmes préparés à l’aide de 1% et
1,5% de GDL, bien que comportant également une phase continue riche en guar. L’évolution des
spectres en fonction de la concentration en GDL permet donc de rendre compte de l’allongement des
micro-gels.
En s’appuyant sur la Figure 69 et sur la Figure 70, l’hypothèse selon laquelle les cinétiques
relatives de séparation de phases et de gélification détermineraient les propriétés des gels peut être
discutée. D’après les études du mélange lait / guar à 0,3% en milieu neutre, une structure sous la
forme d’une émulsion eau dans eau instable apparaît dès les premières minutes après arrêt du
mélange (Figure 54). Suite au mouvement brownien favorisant la collision des gouttelettes, celles-ci
coalescent et commencent à sédimenter (Foster et al., 1997 ; Schorsch et al., 1999). Néanmoins, dans
le système acidifié avec 2,5% de GDL, la gélification des protéines intervient avant le début de la
séparation de phases macroscopique. De ce fait, les gouttelettes liquides de petite taille ont été figées
par la formation du gel en une dizaine de minutes, avant que les phénomènes de coalescence et de
sédimentation ne se produisent de façon trop importante.
Dans le cas des mélanges acidifiés avec 1% et 1,5%, la compétition entre les processus de
gélification et de séparation de phases est à l’origine de la diversité de morphologies observées. Par
exemple, les gouttelettes contenues dans les systèmes préparés avec 1% et 1,5% de GDL ont eu le
temps de croître par coalescence avant que la gélification ait eu lieu. Le procédé de sédimentation
dépend entre autres de la différence de densité entre les deux phases et de la taille des particules. En
outre, les gouttelettes des émulsions eau dans eau sont facilement déformables en raison de leur faible
tension interfaciale (Tolstoguzov, 2003). Ces éléments contribuent à l’hypothèse selon laquelle les
gouttelettes seraient suffisamment grandes et denses pour sédimenter, mais se déformeraient
simultanément, sous l’action de la gravité et/ou de l’agitation thermique. Cette explication est
appuyée par le fait que la taille des filaments augmente lorsque le délai séparant le début de la
sédimentation et la gélification est élevé, tel que dans le cas du mélange acidifié avec 1% de GDL.
Finalement, cet intervalle de temps permet à la structure d’évoluer avant d’être figée au travers de la
gélification des protéines.
107
II.1.3. Effet de la cinétique de gélification sur les propriétés des gels à 0-0,5% de
guar
A partir de l’exemple du système lait / guar à 0,3% acidifié avec trois concentrations de GDL
différentes, une réflexion concernant l’effet de la vitesse de gélification en présence d’un phénomène
de séparation de phases a pu être initiée. Cette démarche a permis d’expliquer la mise en place de
structures particulières et de les relier à leurs propriétés rhéologiques (Figure 70a et b). En
complément, il convient de se questionner quant à l’éventuelle généralisation de ce phénomène à des
systèmes présentant des cinétiques de séparation de phases différentes de cet exemple. Ainsi,
l’influence de la vitesse de gélification a été étudiée dans les mélanges contenant différentes
proportions de guar, la gamme variant de 0 à 0,5%.
Avant d’étudier les propriétés des systèmes mixtes après gélification, les temps de début de
sédimentation des gouttelettes et de formation de la couche de sédiment sont précisés sur la
Figure 71. Pour rappel, ceux-ci ont été obtenus dans les mélanges non acidifiés à partir de la cinétique
de ∆rétrodiffusion dans le bas du tube (Figure 60). Par ailleurs, les temps correspondant à l’obtention
du pH de 5,2, suite à l’ajout de 1, 1,5 ou 2,5% de GDL dans le lait, sont représentés en pointillés. De
manière conjointe à ce qui avait été observé sur la Figure 61b, une nette diminution du temps de
sédimentation se produit entre 0,1% et 0,15% de guar et est attribuée à une intensification de la force
de déplétion-floculation. Cependant, les temps de sédimentation des gouttelettes et de formation de la
couche de sédiment tendent à augmenter significativement lorsque la concentration en guar est
supérieure à 0,2%. Ce résultat apparaît lui aussi en accord avec ce qui a été décrit auparavant et peut
être interprété par une augmentation de la viscosité des mélanges, freinant la séparation de phases à
mesure que la concentration en guar augmente.
108
1,4
Sédimentation des gouttelettes
Formation de la couche de sédiment
1,2
1,0
Temps (h)
0,8
pH 5,2
(1% GDL)
0,6
pH 5,2
(1,5% GDL)
0,4
pH 5,2
0,2 (2,5% GDL)
0,0
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4
Figure 71 : Temps de début de sédimentation des gouttelettes et de formation de la couche de sédiment de mélanges
lait / guar de 0,1% à 0,4%. Les temps de formation du gel à partir d’un lait acidifié avec 1%, 1,5% ou 2,5% de GDL
à 43°C sont précisés en pointillés.
En fonction du temps de gélification et donc de la concentration en GDL ajoutée au mélange,

trois cas sont à distinguer. La première situation concerne l’acidification menée avec 2,5% de GDL
pour laquelle aucun des mélanges n’a la possibilité de former une couche de sédiment avant
d’atteindre le pH critique de gélification. Seul un début de coalescence et de sédimentation de
quelques gouttelettes se situant dans la partie inférieure du tube peut se produire avant leur
gélification pour des concentrations comprises entre 0,15% et 0,3%. En revanche, l’acidification des
systèmes avec 1,5% constitue un cas plus complexe. En effet, aux extrêmes de concentration en guar,
la faible force de déplétion ou la viscosité élevée du mélange ne permettent pas la formation d’une
couche de sédiment avant la gélification. Pour des concentrations en guar intermédiaires, comprises
entre 0,15% et 0,3%, la sédimentation de nombreuses gouttelettes a débuté lorsque la gélification des
protéines intervient. Le dernier cas à considérer est mis en œuvre lors de l’utilisation de 1% de GDL.
Il conduit aux mêmes observations que le cas des mélanges acidifiés avec 1,5% de GDL, avec
toutefois une ampleur de sédimentation bien plus importante, en raison du temps plus élevé
nécessaire à la gélification.
109
De la même manière que dans le cas du mélange lait / guar à 0,3% acidifié à différentes
vitesses, l’effet d’une variation de la cinétique d’acidification au regard de la cinétique de
sédimentation peut conduire à des modifications des propriétés des gels fermes et brassés. La
Figure 72 présente l’évolution de la fraction de surnageant dans les gels fermes acidifiés avec 1, 1,5
ou 2,5% de GDL en fonction de la concentration en guar, les valeurs obtenues dans les mélanges lait /
guar non acidifiés étant rappelées en pointillés. Quelle que soit la concentration en GDL ajoutée et
donc la vitesse de gélification, une augmentation importante de la hauteur de surnageant suivie d’un
maximum local est mise en évidence dans les gels fermes contenant une concentration en guar
inférieure ou égale à 0,1%. Toutefois, des différences apparaissent lorsque la concentration en guar
est comprise entre 0,1 et 0,25%. D’une part, le maximum local de hauteur de surnageant observé pour
0,1% de guar est d’autant plus important que la concentration en GDL est faible. D’autre part, il
s’étend sur une gamme de concentrations en guar plus large pour une faible vitesse de gélification.
Aux concentrations en guar élevées, le comportement de séparation de phases est similaire pour les
trois concentrations en GDL et se caractérise par une diminution importante de la fraction de
surnageant à mesure que la concentration en polysaccharides augmente.
1,0
0% GDL
1% GDL
1,5% GDL
0,8 2,5% GDL
0,6
H/H0
0,4
0,2
0,0
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
Figure 72 : Hauteurs relatives de surnageant des gels fermes contenant de 0% à 0,5% de guar acidifiés avec 1%,
1,5% ou 2,5% de GDL à 43°C. Les hauteurs relatives de surnageant des mélanges lait / guar de 0% à 0,4% obtenues
après 4 h à 43°C sont rappelées en pointillés.
110
A partir de la Figure 71 indiquant les temps relatifs de séparation de phases et de gélification

des systèmes contenant de 0 à 0,5% de guar, il convient de rappeler que plus la concentration en GDL
augmente, donc plus le temps nécessaire à la gélification des protéines diminue, moins la
sédimentation peut s’opérer au sein des mélanges. Ce phénomène peut expliquer les différences du
pic de la fraction de surnageant à 0,1% de guar observées entre les diverses concentrations en GDL.
Ainsi, la micro-séparation de phases à l’origine de la synérèse serait de plus grande ampleur lorsque
la gélification interviendrait tardivement, tel que dans le cas des gels acidifiés avec 1% de GDL. En
revanche, le blocage de la séparation de phases constaté dans les gels contenant de 0,2% à 0,5% de
guar par rapport aux mélanges non acidifiés serait peu dépendant de la vitesse de gélification. Dans ce
cas, l’effet de la vitesse de gélification peut être masqué par le ralentissement de la sédimentation des
gouttelettes du fait de la viscosité importante de la phase continue riche en guar. Cette hypothèse
mérite toutefois d’être validée par une étude complémentaire des microstructures et des propriétés
rhéologiques des gels après brassage.
Les microstructures des gels brassés contenant de 0 à 0,5% de guar et acidifiés avec 1, 1,5 ou
2,5% de GDL sont montrées sur la Figure 73. Les protéines marquées avec le rouge de Nil
apparaissent dans les zones claires. Par contraste, les zones sombres permettent de localiser le guar
et/ou le lactosérum.
Les images correspondant aux systèmes acidifiés avec 1,5% de GDL peuvent être mises en lien
avec les images de microscopie confocale obtenues pour cette même vitesse d’acidification
(Figure 65). Elles constituent en effet une illustration de la transition, lorsque la concentration en guar
augmente de 0 à 0,5%, d’un système homogène à un réseau plus poreux, puis à un ensemble de
micro-gels allongés puis sphériques. Cette évolution des microstructures est également constatée dans
les mélanges contenant 1% et 2,5% de GDL. Toutefois cette transition a lieu avec un décalage à des
concentrations en guar de plus en plus faibles, lorsque la concentration en GDL augmente de 1% à
2,5%. A titre d’exemple, la morphologie sous forme de filaments apparaît dès l’ajout de 0,1% de guar
pour une concentration en GDL de 2,5%, alors qu’elle n’est observée qu’à partir de 0,15% pour des
concentrations en GDL plus faibles.
111
0% 0,05% 0,1% 0,15% 0,25% 0,3% 0,5%
1%
GDL
1,5%
GDL
2,5%
GDL 200 µm
Figure 73 : Microstructure observée en épifluorescence à 20°C des gels brassés contenant de 0% à 0,5% de guar acidifiés avec 1%, 1,5% ou 2,5% de GDL à
43°C. Les concentrations en guar sont indiquées sur la figure. La barre représente 200 µm. Les gels présentant des structures fibrillaires de taille trop élevée ont
été brassés par passage à travers les deux tuyaux.
112
Sur la base des images des gels acides brassés obtenues en microscopie optique, un calcul des
dimensions géométriques des micro-gels enrichis en protéines a été effectué. La longueur et le rapport
de la longueur sur la largeur ont ainsi été déterminés pour les systèmes acidifiés avec 1, 1,5 et 2,5%
de GDL, présentant des micro-gels sous la forme de gouttelettes, en fonction de la concentration en
guar (Figure 74a et b).
30
a 1% GDL b 1% GDL
400 1,5% GDL 1,5% GDL
25
2,5% GDL 2,5% GDL
Longueur (µm)
Rapport L / l
300 20
15
200
10
100
5
0 0
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
Concentration en guar (%) Concentration en guar (%)
Figure 74 : (a) Longueurs ; (b) Rapports de la longueur L sur la largeur l des micro-gels au sein des gels brassés
contenant de 0,1% à 0,5% de guar acidifiés avec 1%, 1,5% ou 2,5% de GDL à 43°C. Les barres d’erreur représentées
correspondent à des mesures réalisées en triple sur des échantillons différents.
De manière générale, la longueur des micro-gels protéiques et le rapport de la longueur sur la

largeur passent par un maximum (Figure 74a et b). Aux extrêmes de concentrations en guar, les
structures tendent vers une forme sphérique caractérisée par un rapport de la longueur sur la largeur
proche de 1 et ce, quelle que soit la concentration en GDL (Figure 74b). Entre 0,15% et 0,35% de
guar, les dimensions des structures analysées montrent des comportements différents selon la quantité
de GDL utilisée. Plus la vitesse de gélification est faible, plus la longueur maximale et le rapport L/l
augmente, ceci étant particulièrement vrai pour les gels acidifiés avec 1% de GDL pour lesquels les
micro-gels mesurent jusqu’à près de 350 µm. Par ailleurs, le décalage de la transition de micro-gels
allongés à sphériques observé en microscopie à épifluorescence à des concentrations en guar de plus
en plus faibles, lorsque la concentration en GDL augmente de 1% à 2,5%, est également constaté
pour l’évolution de la taille des micro-gels. Alors que la longueur maximale est observée à une
concentration en guar de 0,2% pour les gels acidifiés avec 1,5 et 2,5% de GDL, ce maximum apparaît
vers 0,3% de guar lorsque la vitesse de gélification est plus lente. Il est à noter que les écart-types
importants reflètent la grande polydispersité des micro-gels, ce qui est également observable sur les
113
images de microscopie confocale (Figure 70a). Au contraire, cet écart-type est très réduit aux
extrêmes de concentration en guar lorsque les micro-gels ont une forme plus sphérique.
En modifiant la vitesse de gélification, des microstructures diverses peuvent être obtenues.

D’une part, dans les systèmes pour lesquels un réseau protéique continu est maintenu, la micro-
séparation de phases, générant une porosité et une synérèse, est d’autant moins importante que la
gélification intervient rapidement. D’autre part, les phénomènes en jeu se complexifient lorsqu’une
structuration sous la forme de gouttelettes apparaît pour des concentrations en guar supérieures ou
égales à 0,15%. En effet, l’évolution des gouttelettes avant leur gélification dépend de plusieurs
paramètres, le plus souvent difficilement mesurables et contrôlables : la force de déplétion, la
viscosité de la phase continue ou encore la tension interfaciale. Ceux-ci dictent la taille et la
déformabilité des gouttelettes en favorisant leur coalescence et/ou leur sédimentation. La gélification
des protéines provoque un arrêt instantané de l’évolution des structures. Ce mécanisme suggère que
les morphologies sont gouvernées par la vitesse de gélification du mélange. Cependant, ce
phénomène n’est applicable que dans le cas de systèmes présentant une viscosité particulière,
permettant une évolution des structures. Ainsi, aucun effet de la vitesse de gélification n’est mis en
évidence dans les systèmes contenant des concentrations en guar supérieures à 0,4%.
De manière à compléter les observations microscopiques des gels mixtes acides, une étude des
propriétés rhéologiques de ces gels après brassage a été menée. La Figure 75 présente l’évolution de
tan δ à 0,5 Hz de gels brassés acidifiés avec 1, 1,5 ou 2,5% de GDL en fonction de la concentration
en guar. Pour les trois concentrations en GDL utilisées, la valeur de tan δ est proche de 0,3 aux faibles
concentrations en guar, mais augmente de manière significative entre 0,2% et 0,3% de guar, signe
d’une transition d’un système structuré vers un système possédant majoritairement des propriétés
liquides viscoélastiques. Lorsque la concentration en guar est supérieure à 0,3%, une légère
diminution de la valeur de tan δ est constatée. Il est à noter qu’aucune influence de la concentration
en GDL ne se dégage pour les systèmes contenant moins de 0,2% ou plus de 0,4% de guar.
Néanmoins, la transition de tan δ se produit pour une concentration en guar plus faible, lorsque la
concentration en GDL augmente de 1 à 2,5%.
114
2,50
1% GDL
2,25 1,5% GDL
tan δ (0,5 Hz) 2,00 2,5% GDL
1,75
1,50
1,25
1,00
0,75
0,50
0,25
0,00
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
Figure 75 : Evolution de tan δ à 0,5 Hz à 4°C des gels brassés contenant de 0% à 0,5% de guar acidifiés avec 1%,
1,5% ou 2,5% de GDL à 43°C
Ce décalage de tan δ peut s’expliquer par le même phénomène précédemment décrit pour
expliquer les évolutions des microstructures selon la vitesse d’acidification : la compétition entre la
sédimentation des gouttelettes et leur gélification. L’augmentation du temps nécessaire à la
gélification provoque un allongement des micro-gels contribuant, au travers de leur enchevêtrement, à
la faible valeur de tan δ. Au contraire, le blocage de l’évolution des gouttelettes à un stade précoce
génère la formation de petits micro-gels dispersés dans une phase continue riche en guar possédant
essentiellement des propriétés liquides.
115
Finalement, la variation de la vitesse de gélification contribue à modifier les propriétés des gels
fermes et brassés enrichis en guar dans deux cas particuliers. Lorsque le réseau protéique est continu,
les conséquences du phénomène de déplétion-floculation sont d’autant plus importantes que la
gélification est retardée. Ceci se traduit par une augmentation de la micro-séparation de phases à
l’origine d’une synérèse dans la matrice protéique. Le second cas concerne les systèmes structurés
sous la forme d’émulsions eau dans eau qui subissent un processus de gélification. Les conditions
permettant la sédimentation des gouttelettes sont dictées par les paramètres de la loi de Stokes, mais
aussi par les propriétés physiques des gouttelettes telles que leur tension interfaciale. La
microstructure résultante est issue d’un équilibre subtil entre le temps de sédimentation des
gouttelettes et leur gélification, l’allongement des gouttelettes étant vraisemblablement réalisé au
travers des forces de gravité et/ou de l’agitation thermique.
II.2. Effet de la cinétique de séparation de phases sur les propriétés

des gels acides brassés
En condition de repos, les gouttelettes des émulsions eau dans eau peuvent se relaxer
spontanément sous une forme sphérique. Seule l’application d’une déformation contrôlée permet
l’allongement des gouttelettes sans provoquer leur rupture (Frith, 2010 ; Tolstoguzov, 1986). Afin de
confirmer l’hypothèse selon laquelle la formation de micro-gels allongés relèverait essentiellement
d’un effet de la gravité, un mélange lait / guar à 0,3% a été acidifié au sein d’une centrifugeuse sous
un champ gravitationnel de 2,5 g, la gélification ayant donc eu lieu tout en maintenant la force
centrifuge. Le choix de l’intensité de la force centrifuge a été réalisé de manière à accélérer la vitesse
de sédimentation du système tout en limitant la formation d’une couche de sédiment.
La microstructure et les propriétés viscoélastiques du gel brassé fabriqué sous une force de
centrifugation constante de 2,5 g ont été comparées à celles du gel fabriqué sans application d’un
champ gravitationnel supplémentaire, les gels contenant tous deux 0,3% de guar et étant acidifiés
avec 1,5% de GDL à 43°C (Figure 76a et b).
116
1g 2,5 g
100 µm
1000 1000
b
100 100
G’, G’’ (Pa)

G’, G’’ (Pa)
10 10
1 1
0,1 0,1
0,01 0,01
0,01 0,1 1 10 0,01 0,1 1 10
Fréquence (Hz) Fréquence (Hz)
Figure 76 : (a) Microstructure observée en microscopie confocale à balayage laser à 20°C ; (b) Spectres
viscoélastiques à 4°C des gels brassés contenant 0,3% de guar acidifiés avec 1,5% de GDL à 43°C sous une force
centrifuge de 1 g ou 2,5 g (( ) G’, ( ) G’’). Les gels ont été brassés par passage à travers les deux tuyaux. La barre
De longs filaments compris entre 100 et 400 µm dispersés dans une phase continue enrichie en
guar sont produits sous une centrifugation à 2,5 g alors que de plus petits filaments en mélange avec
des micro-gels déformés sont observés en absence d’une accélération centrifuge supplémentaire (1 g).
Par ailleurs, le gel brassé fabriqué sans force centrifuge additionnelle présente des propriétés
intermédiaires entre un système liquide et solide. Au contraire, les propriétés viscoélastiques du gel
brassé produit au sein de la centrifugeuse sont typiques d’un système structuré, avec le module G’
supérieur au module G’’ sur l’ensemble de la gamme de fréquence étudiée. Ainsi, la présence de
longs filaments enchevêtrés contribue de manière significative aux propriétés viscoélastiques de ce
système.
Puisque les systèmes fabriqués en présence ou absence d’une force centrifuge possèdent les
mêmes concentrations en polymères, ces mélanges sont soumis à la même force de déplétion. En
revanche, l’ajout d’un champ gravitationnel de 2,5 g accélère de manière importante la vitesse de
sédimentation des gouttelettes avant leur blocage par gélification acide des protéines.
Lors de l’application d’un cisaillement, l’allongement des gouttelettes des émulsions eau dans
eau dépend, outre l’intensité de la déformation, d’un équilibre entre la coalescence des gouttelettes et
117
leur rupture par instabilité de Rayleigh (van Puyvelde et al., 2003 ; Butler & Heppenstall-Bultler,
2003). Dans les systèmes étudiés en l’absence de force centrifuge supplémentaire, la rupture des
gouttelettes semble minoritaire voire inexistante en raison de la viscosité élevée de la phase continue,
mais surtout du cisaillement infime généré par la sédimentation des gouttelettes. Comme observé
précédemment (Figure 65, Figure 70 et Figure 76), le corps des micro-gels les plus allongés apparaît
plus sombre que leur zone terminale en raison d’une concentration en protéines moins élevée. Ce
résultat appuie l’hypothèse selon laquelle chaque filament est issu d’une unique gouttelette originale
qui s’est allongée à différents degrés sous l’action d’une force de gravité naturelle ou accélérée par
centrifugation avant d’être figée en l’état par la gélification.
III. CONCLUSION
Le comportement des mélanges lait / guar a été étudié en premier lieu en conditions non
acidifiées. Sur la base d’études microscopiques et rhéologiques, il a été montré que l’ajout d’une
concentration en guar supérieure ou égale à 0,01% dans le lait conduit à un phénomène de déplétion-
floculation des protéines. Ce processus induit une structuration du système sous la forme d’une
émulsion eau dans eau, instable et conduisant à des systèmes à phases séparées macroscopiquement
dans un délai de 4 h pour des concentrations en guar inférieures ou égales à 0,4%. En milieu acidifié,
la gélification acide des protéines intervient comme un événement perturbateur de la séparation de
phases. Ainsi, une succession de microstructures de gels mixtes acides brassés a été observée pour
des concentrations en guar croissantes : un réseau protéique homogène qui se densifie, puis la
formation de longs filaments enchevêtrés, des micro-gels allongés et sphériques de nature protéique et
à l’état gélifié.
En outre, un mécanisme de compétition entre le phénomène de séparation de phases et de

gélification a été mis en évidence en modifiant la vitesse de gélification. Accélérer ou ralentir le
temps de gélification détermine la possibilité d’évolution des gouttelettes, avant que la gélification
acide des protéines ne fige le système. A l’aide de cette démarche, une variété de morphologies de
micro-gels avec des caractéristiques bien définies a pu être créée, allant de longs filaments d’une
taille proche de 400 µm à des micro-gels sphériques d’environ 20 µm. Une expérience
complémentaire de fabrication d’un gel au sein d’une centrifugeuse a permis de relier le degré
d’allongement des micro-gels à un effet de gravité, toutefois un effet de l’agitation thermique pourrait
également y contribuer. Ce point sera abordé en détail dans le chapitre 5.
118
Chapitre 4 : Mélanges lait / xanthane avant et après gélification
Chapitre 4 : Mélanges lait / xanthane avant et après

gélification
Les résultats précédents, concernant les systèmes lait / guar en milieu neutre ou acidifié,
peuvent servir de base à l’étude d’un mélange incluant un autre polysaccharide d’intérêt dans les
produits laitiers : la gomme xanthane. D’un point de vue physico-chimique, des différences
fondamentales existent entre ces deux polymères qui présentent entre autres, une structure primaire,
une masse moléculaire, mais également une densité de charges différentes (Tableau 9). L’ensemble
de ces paramètres physico-chimiques influence de façon majeure les phénomènes de séparation de
phases (Bourriot et al., 1999b ; Tuinier et al., 2000). Partant de ce constat, la Figure 77 illustre les
potentiels zêta, représentatifs de la charge globale des molécules, de solutions de guar et de xanthane
en fonction de la force ionique du milieu.
0
-10
-20
Potentiel zêta (mV)
-30
-40
-50
-60
-70
-80
-90
-100
0,0 0,1 0,2 0,3
Concentration en NaCl (M)
Figure 77 : Potentiel zêta de solutions à 0,05% de xanthane ( ) et de guar ( ) à pH 6,8 en fonction de la
concentration en NaCl à 25°C
Contrairement au guar, proche de la neutralité quelle que soit la force ionique du milieu, la
charge des molécules de xanthane dépend de la concentration en NaCl. En absence de sel, le xanthane
est nettement chargé négativement en raison de la présence de groupements carboxyliques. Toutefois,
une diminution importante du potentiel zêta de la solution de xanthane est mise en évidence lors de
l’ajout de sel, traduisant un effet notable, mais partiel, d’écrantage des charges dès 0,1 M de NaCl qui
correspond à la force ionique du lait. Ceci met en lumière le caractère anionique du xanthane qui pose
119
la question d’éventuelles interactions avec les protéines de lait, à la fois en milieu neutre et en milieu
acidifié, mais également d’un effet d’écrantage par la présence d’ions.
Par ailleurs, le volume occupé par les chaînes des polysaccharides peut largement moduler les
phénomènes de séparation de phases (Bourriot et al., 1999b ; Tuinier et al., 2000).
Huggins - Xanthane
Viscosité intrinsèque (dL.g )
-1
Eq.1
100 Eq.2
Eq.3
Huggins - Guar
10
1
0,0 0,1 0,2 0,3
Concentration en NaCl (M)
Figure 78 : Viscosité intrinsèque déterminée à l’aide de l’équation de Huggins d’une solution de xanthane ( ) et de
guar ( ) à 43°C en fonction de la force ionique. Les viscosités intrinsèques des solutions de xanthane ont également
été déterminées à l’aide des équations n°1, 2 et 3 de Tanglertpaibul et Rao (Figure 48b) (Tanglertpaibul & Rao,
1987)
L’échantillon de guar utilisé dans ce travail présente une viscosité intrinsèque d’environ
11 dL.g-1 à 0 M et 0,1 M NaCl (Figure 78) ce qui est très cohérent avec la littérature (Bourriot et al.,
1999b). La mesure de viscosité intrinsèque de l’échantillon de xanthane est plus compliquée à réaliser
en raison d’une augmentation du volume hydrodynamique occupé par les chaînes lorsque la solution
devient de plus en plus diluée. En utilisant l’équation de Huggins, une valeur d’environ 100 dL.g-1 a
été obtenue. Cependant, l’utilisation de l’équation de Huggins risque de conduire à une surestimation
de la viscosité intrinsèque à très faible force ionique. Trois équations proposées par Tanglertpaibul &
Rao (1987) ont donc été utilisées dans ces mêmes conditions de force ionique et donnent des valeurs
du même ordre de grandeur et dans tous les cas de 5 à 10 fois supérieures à celle du guar. A forte
force ionique, l’effet polyélectrolytique du xanthane est écranté et devient alors négligeable. La
valeur moyenne de viscosité intrinsèque de l’échantillon de xanthane utilisé dans ce travail a
néanmoins été calculée à 0,1 M NaCl afin de se placer dans les conditions de force ionique du lait.
Elle est de 70 dL.g-1 ± 10 à 0,1 M NaCl.
120
L’addition d’une faible quantité de sel provoque un effet d’écrantage des charges (Figure 77) et
une légère contraction de la molécule qui adopte une conformation de type semi-étendu (‘worm-like’)
(Higiro et al., 2007 ; Muller et al., 1986), ce qui explique cette diminution de viscosité intrinsèque. Il
est à noter que certains auteurs constatent à l’inverse une augmentation de la viscosité intrinsèque
quand la force ionique augmente, suite à la formation d’un grand nombre d’associations
intermoléculaires (Jamieson et al., 1982 ; Southwick et al., 1980).
La viscosité intrinsèque du xanthane est donc au moins 5 fois supérieure à celle du guar et ce,
quelle que soit la force ionique. Ces résultats, similaires à ceux rapportés dans la littérature pour des
solutions de xanthane et de galactomannanes (Cuvelier, 1988 ; Launay et al., 1997), traduisent le
grand volume hydrodynamique occupé par les chaînes de xanthane, conséquence de leur rigidité très
élevée liée à la conformation en hélice qu’elles sont capables d’adopter.
Finalement, la présence de charges négatives ainsi que la grande rigidité de la chaîne de

xanthane sont deux paramètres clés à prendre en considération pour la compréhension des
phénomènes de séparation de phases entre les protéines de lait et le xanthane.
L’objectif de ce chapitre est d’étudier le comportement de phases, la microstructure et les

propriétés rhéologiques des mélanges lait / xanthane en milieu neutre et en milieu acidifié.
L’ensemble des résultats présentés a fait l’objet de discussions sur la base de l’existence
d’interactions associatives entre le xanthane et les protéines de lait. Dans ce cadre, les iota- et kappa-
carraghénanes chargés négativement et le guar neutre ont été utilisés ponctuellement comme élément
de comparaison (Tableau 9).
I. EXISTENCE D’INTERACTIONS ASSOCIATIVES ENTRE PROTEINES DE LAIT ET

XANTHANE ?
Afin de mettre en évidence d’éventuelles interactions du xanthane avec les protéines de lait,
une méthode spectrophotométrique à l’aide du bleu de méthylène a été utilisée (Figure 52). La
comparaison du comportement des protéines en présence de deux autres polysaccharides, le guar non
chargé et le carraghénane chargé négativement, a permis d’étayer les hypothèses d’interactions. Par
ailleurs, l’intensité des interactions associatives dépend largement de certains facteurs tels que la
force ionique ou la densité de charges respective de chaque polymère susceptible d’interagir. Par une
modification du pH du milieu, un renforcement des attractions électrostatiques entre les protéines de
lait et les polysaccharides chargés peut avoir lieu, notamment au voisinage du point isoélectrique des
protéines.
121
Cette partie des résultats a fait l’objet d’un article soumis pour publication dans Food
Hydrocolloids.
Spectrophotometric analysis of polysaccharide / milk protein interactions with

methylene blue using Independent Components Analysis
Anne Rohart1,2,3, Delphine Jouan-Rimbaud Bouveresse1,2,3, Douglas N. Rutledge1,2,3, Camille
Michon1,2,3*
1
AgroParisTech, UMR1145 Ingénierie Procédés Aliments, F- 91300 Massy
2
INRA, UMR1145 Ingénierie Procédés Aliments, F- 91300 Massy
3
CNAM, UMR1145 Ingénierie Procédés Aliments, F- 75003 Paris
*Corresponding author. AgroParisTech, 1 avenue des Olympiades, F-91300 Massy, France. Tel.: +33 169 935 127;
fax: +33 169 935 005.
E-mail address: camille.michon@agroparistech.fr (C. Michon).
Abstract
Interactions between xanthan gum, carrageenan, guar gum and milk protein were studied under
various conditions of ionic strengths, temperature and pH. The proposed methodology was to
examine the associative interactions by using a methylene blue (MB) spectrophotometric method
combined with data analysis by a chemometric method. Independent Components Analysis (ICA)
simplified the interpretation of the spectrophotometric results by decomposing absorbance spectral
data into “pure signals” that could be related to chemical compounds. Addition of milk protein to
MB / xanthan gum or carrageenan solution gave rise to spectral changes indicating electrostatic
interactions between positively charged regions of milk protein and anionic polysaccharides at neutral
pH and low ionic strength. Thus, it has been shown that negative polysaccharides are able to interact
with milk proteins only in absence of NaCl. On the other hand, it was shown that no attractive
interactions were established in neutral guar gum / milk protein systems, which highlighted the
contribution of the charge density to the interactions. Through acidification, associative interactions
between xanthan gum and milk proteins were strongly enhanced as shown by changes in the IC
proportions. Therefore, ICA proved to be an efficient tool to facilitate interpretation of
spectrophotometric data and identify associative interactions.
Keywords: Chemical physics; Mixed systems; Independent Components Analysis; Methylene

blue
122
1. Introduction
The control of interactions between the different ingredients involved in formulated foods is a
key problem in regard to the overall texture and stability of the products. When proteins and
polysaccharides are mixed, the normal tendency for the two polymers is to demix. Depending on the
affinity between the different biopolymers and the solvent, the interactions can be segregative (the
biopolymers repel each other) or associative (the biopolymers attract one another) (Tolstoguzov,
1995; Syrbe et al., 1998; Doublier et al., 2000; de Kruif & Tuinier, 2001; Corredig et al., 2011).
Generally, associative interactions are the result of net electrostatic interactions between the polymers
carrying opposite charges and thus are strongly affected by the charge density of the two
biopolymers, the pH and the ionic strength (de Kruif, Weinbreck, & de Vries, 2004; Schmitt &
Turgeon, 2007).
At neutral pH, repulsive interactions between the globally negatively charged casein micelles
and negatively charged polysaccharides would be expected. However, associative interactions could
exist between a ‘‘positive patch’’, situated between residues 97 and 112 of the κ-casein and the
negative sulphated groups of carrageenan (Snoeren et al., 1975; Snoeren, 1976; Garnier et al., 2003).
In contrast, the mechanism classically described in the literature for low charged or neutral
polysaccharides / casein micelles mixtures is a segregative phase separation, thus involving no
electrostatic interactions (Bourriot et al., 1999b; Tuinier et al., 2000; Hemar et al., 2001; Bhat et al.,
2006; Aichinger et al., 2007).
Upon lowering the pH, the electrostatic repulsion of the less negatively charged casein micelles
is modified and their point of zero charge is reached close to pH 4.6. Therefore, adsorption of anionic
polysaccharides on casein micelles strongly depends on pH, as has been shown in the case of pectin
(Maroziene & de Kruif, 2000; Tuinier et al., 2002), carboxymethylcellulose (Du et al., 2007) or
xanthan gum (Kobori et al., 2009). Recent studies have shown the formation of soluble complexes
between whey proteins and anionic polysaccharides even when the pH is close to neutral (Benichou
et al., 2007; Koupantsis & Kiosseoglou, 2009). However, electrostatic interactions between casein
micelles and carboxylated polysaccharides such as xanthan gum above the isoelectric point of casein
micelles remain undetermined.
The interactions of proteins with polysaccharides in solution have been previously investigated
using visible absorption spectroscopy in a methylene blue (MB) solution (Snoeren, 1976; Michon et
al., 2002). In dilute aqueous solution, the absorption spectrum of planar cationic MB is characterized
123
by a sharp peak at 664 nm and a slight secondary shoulder at 610 nm (Gurov et al., 1988; Tafulo et
al., 2009). When an anionic polysaccharide is added to the MB solution, the peak at 664 nm decreases
and a new absorption band appears, which corresponds to metachromatic complexes (Schoenberg &
Moore, 1964; Shirai et al., 1977; Nandini & Vishalakshi, 2011). It should be noted that the spectral
changes are a consequence of a precise orientation of neighboring dye molecules and reflect the steric
arrangement of the polar residues on the macromolecule that are available for interaction with the
dye. Therefore, the binding process depends on polysaccharide conformation and charge density as
well as environmental conditions such as ionic strength or temperature (Shirai et al., 1977). When
increasing the temperature, and thus the thermal agitation, the lifetime of the long-range force
interactions with water molecules is higher, and statistically, a higher number of methylene blue
molecules are aligned and form metachromatic complexes (Michon et al., 2002).
If a protein, interacting associatively with polysaccharides, is introduced into a MB / anionic

polysaccharide solution, it will compete with the cationic MB molecules and bind preferably to
anionic polysaccharides. As a consequence, the release of the free MB molecules increases the peak
at 664 nm while the metachromatic peak decreases. Using this method, interactions between gelatin
or casein micelles and carrageenan (Michon et al., 2000; Michon et al., 2002; Garnier et al., 2003), or
whey protein / xanthan gum, carboxymethylcellulose or λ-carrageenan (Benichou et al., 2007;
Koupantsis & Kiosseoglou, 2009; Perez et al., 2009) have well been demonstrated.
The interpretation of spectrophotometric data is sometimes complex and is often more

qualitative than quantitative. Several chemometric tools can be used for the treatment of chemical
data such as Principal Components Analysis (PCA) or Independent Components Analysis (ICA).
Similarly to PCA, ICA is based on the construction of latent variables, called Independent
Components (ICs), which are linear combinations of the original variables. The main advantage of
this method compared with PCA is that it aims to extract “pure signals” and their proportions from
mixtures which means that the resulting latent variables are easier to interpret (Hyvärinen & Oja,
2000; Stone, 2004; Rutledge & Jouan-Rimbaud Bouveresse, 2013).
The objective of the current study was to use a chemometric tool to examine the interactions
between milk protein and different polysaccharides under various conditions on the basis of
spectrophotometric analysis. The first part of this paper focuses on the detection of interactions
depending on the type of polysaccharide. In the second part, ICA was performed to understand the
effect of various factors on interactions such as type of milk protein, ionic strength, temperature or
pH.
124
2. Materials and methods
2.1. Materials
Xanthan gum (Satiaxane), guar gum (Viscogum MP) and iota-carrageenan (HMR) were
supplied by Cargill (Baupte, France). The samples were used without purification. Methylene blue
was purchased from Merck (Darmstadt, Germany) and the glucono-δ-lactone (GDL) from Sigma (St
Louis, MO, USA). A methylene blue (MB) solution with a concentration of about 0.0008 wt% was
prepared by dissolving the correct amount in Milli-Q water (made by reverse osmosis followed by
filtration through a Milli-Q apparatus) and stirring for 1 h at room temperature. Its concentration was
adjusted so that its optical density at 664 nm was below 2. The same methylene blue solution was
used for all the results described in this paper.
Casein micelles (CM) were purified by tangential ultrafiltration followed by purification

through water diafiltration, and then freeze-dried (INRA Rennes, France). CM (1 wt%) was dispersed
in 0.1 M NaCl at 20°C and pH 7 under stirring for 5 min and then sonicated for 8 min at 50 W.
Low-heat skim milk powder was kindly provided by Ingredia (Arras, France). Skim milk
(3.3 wt% proteins) was prepared by dissolving skim milk powder in Milli-Q water using a magnetic
stirrer for 1 h at room temperature. The reconstituted skim milk was then left to fully hydrate
overnight in a refrigerator.
2.2. Methods
2.2.1. Preparation of biopolymer mixtures
Methylene blue (MB) / polysaccharide (xanthan gum (X), guar gum (G) or iota-carrageenan
(C)) solutions were prepared by adding the polysaccharide (0.002 wt%) to MB solutions under
stirring at 70°C for 30 minutes. The same thermal treatment was applied to the MB solution without
polysaccharide. Then, the pH value was adjusted to 7 using a 1 M NaOH solution.
Methylene blue (MB) / polysaccharide / casein micelles (CM) or milk protein (MP) were
prepared by adding casein micelles or milk protein to the MB / polysaccharide solutions at a final
protein concentration of 0.005 wt%. Ionic strength of all the mixtures was adjusted at 25°C in the
range of 0-0.1 M by addition of the required amount of NaCl under stirring for 5 minutes. Table 11
shows the experimental domain tested for each factor.
125
Glucono-δ-lactone (GDL) was added to some mixtures containing xanthan gum at 25°C to
lower the pH gradually, so as to mimic the fermentation process. During the acidification process, the
sample was transferred into a spectrophotometric cuvette and the pH of the sample was measured
during the corresponding spectrophotometric measurement.
The spectrophotometric measurements were performed with a Carry 100 spectrophotometer

(Varian, France) set at a spectral resolution of 2 nm and fitted with a multi-cuvettes Peltier block
thermostated at ±0.2°C. Optical density sweeps as a function of the wavelength in the range 450-
750 nm were performed at 25, 43 or 70°C after stabilising for 30 minutes at the chosen temperature.
All measurements were performed in the optical density range of 0-2 where a linear response was
obtained. The accuracy of the optical density measurements was 0.001.
2.2.2. Experimental design
Two different studies were conducted and analyzed separately by ICA. Five experimental
factors were evaluated for Study 1 and 2. Table 11 shows the experimental levels used for each factor
and study considered.
Table 11. Experimental domains for all the studied factors and for Study 1 or 2.
Experimental domains
Factors
Study 1 Study 2
Guar gum (G); Xanthan gum (X); Guar gum (G); Xanthan gum
Type of polysaccharide
Iota-carrageenan (C) (X); Iota-carrageenan (C)
Ionic strength (M NaCl) 0; 0.02; 0.1 0; 0.1
Temperature (°C) 25; 43; 70 25
Casein micelles (CM); Milk protein
Type of milk proteins Milk protein (MP)
(MP)
pH 7 4.3-7
2.2.3. Chemometric methods
The spectral data were analysed by Independent Components Analysis (ICA).This method aims
at extracting the pure spectra from a set of mixture spectra, as well as the proportions in which they
are mixed. It was developed in the field of signal treatment, but is now applied in other fields, such as
the chemometric analysis of spectral data. In principle, each extracted independent component (IC)
corresponds to the "pure signal" characterising an independent phenomenon. Therefore, the number
of ICs to extract is a crucial and critical choice. Two methods have been proposed recently to
determine the number of ICs in a given data set (Jouan-Rimbaud Bouveresse et al., 2012); The ICA-
126
by-Blocks method splits the data into 2 or more representative groups, and calculates several ICA
models in each block, with different number of ICs. For each model, the correlations between all ICs
of one block and all ICs of the other block(s) are calculated, and the model with the largest number of
ICs where all ICs of one block are highly correlated to another IC in the other block(s) is considered
as optimal; The method based on the Durbin-Watson criterion calculates different ICA model with
the whole data set, and reconstructs the spectra with each of them. These are then used to calculate
the residual matrices between the original data and the different reconstructed data sets. The largest
number of ICs for which the signal-to-noise ratio, as determined by the Durbin-Watson criterion
(Rutledge & Barros, 2002), in the residual matrices is high is considered as the optimal number. It
was shown that the two methods yield similar results, but they bring different (and thus additional)
information.
3. Results and discussion
3.1. Effect of type of polysaccharide on casein micelle / polysaccharide interactions
3.1.1. Type of polysaccharide and protein effects on methylene blue spectra
The absorption spectra of methylene blue (MB) and mixtures of MB with various
polysaccharides solutions are shown in Figure 79a.
1.4 1.4
Without PS MB
a 1.2 G
b 1.2 MB+CM
C MB+MP
Optical density
1.0 X 1.0
ODMB(+PS)
0.8 0.8
0.6 0.6
0.4 0.4
0.2 0.2
0.0 0.0
450 500 550 600 650 700 750 450 500 550 600 650 700 750
Wavelength (nm) Wavelength (nm)
Figure 79. Spectra of methylene blue (MB) solution (0.0008 wt%) at 25°C, 0 M NaCl, pH 7. (a) Without addition of
polysaccharides (Without PS), or effect of adding 0.002 wt% guar gum (G), carrageenan (C) or xanthan gum (X); (b)
Effect of adding 0.005 wt% casein micelles (CM) or milk protein (MP).
Addition of guar gum to MB solution was not accompanied by any noticeable changes in the
MB spectrum. It is clear that neutral guar gum did not interact with the cationic MB molecules. On
127
the contrary, when iota-carrageenan was introduced in the aqueous MB solution, the characteristic
MB peak at 664 nm almost disappeared and a new distinct peak at 554 nm formed. Consistent with
previous studies (Snoeren, 1976; Michon et al., 1997), the change in the spectra can be attributed to
the association of MB molecules with iota-carrageenan sulphated groups and the formation of
metachromatic complexes composed of bound dye molecules conjugated through links with
surrounding water molecules. Xanthan gum constituted an intermediate case with a noticeable
decrease of the absorbance peak at 664 nm and the presence of two shoulders at 567 nm and 610 nm.
The shoulder at 567 nm can be related to the formation of MB metachromatic complexes which
means that MB molecules may fix on xanthan gum chains through electrostatic interactions at this
low ionic strength. The remaining peak at 664 nm corresponded to free MB molecules in the solution
and/or non-conjugated bound MB molecules. As the saturation concentration of xanthan gum
molecules by the dye was determined to be around 0.005 wt% (Benichou et al., 2007), it seems that
the xanthan gum concentration was too low to fix all the MB molecules on the xanthan gum chains.
Therefore, the presence of two MB spectral forms could be accounted for by the lower charge density
of xanthan gum compared to carrageenan, but also by the different types of charge and the
accessibility of the interacting groups (Doublier et al., 2000).
The effect of casein micelles or milk proteins on MB spectra was also studied (Figure 79b). The
addition of 0.005 wt% casein micelles led to a decrease of 5% in the absorbance peak at 664 nm. The
contribution of milk proteins composed of 80% casein micelles and 20% whey protein to the MB
spectra was more important, with a significant decrease of absorbance at 664 nm and the appearance
of a small metachromatic peak at 554 nm. Since milk proteins are globally negatively charged
electrolytes at pH 7, they could therefore interact with the cationic MB molecules. Differences
between spectral changes upon addition of casein micelles or milk protein may be due to the greater
interaction of the whey proteins with MB compared to casein micelles which could be attributed to
differences in charge distribution.
3.1.2. Milk protein effects on MB spectra in the presence of polysaccharides
In order to determine whether protein / polysaccharide interactions took place, 0.005 wt%
casein micelles was introduced into a MB / 0.002 wt% polysaccharide solution as shown in
Figure 80a.
128
1.4 0.15
Without PS Without PS
a 1.2 G b G
ODMB+(PS)+CM-ODMB(+PS)
0.10
C C
1.0 X X
ODMB(+PS)+CM
0.05
0.8
0.00
0.6
-0.05
0.4
0.2 -0.10
0.0 -0.15
450 500 550 600 650 700 750 450 500 550 600 650 700 750
Figure 80. (a) Effect of CM addition on MB without polysaccharide (Without PS) or in mixture with 0.002 wt%
guar gum (G), carrageenan (C) or xanthan gum (X); (b) ∆OD for MB / 0.005 wt% CM / without polysaccharide
(Without PS) or 0.002 wt% guar gum (G), carrageenan (C) or xanthan gum (X) (∆OD = ODMB(+Polysaccharide)+CM –
ODMB(+Polysaccharide)) at 25°C, 0 M NaCl, pH 7.
Addition of casein micelles caused an increase of the peak at 664 nm for the MB / CM /
xanthan gum or carrageenan systems. However, spectral changes due to protein addition are difficult
to discriminate. Thus, an alternative representation of these data can be given by subtracting the
optical density spectrum obtained for MB / polysaccharides from that obtained upon addition of
0.005 wt% casein micelles (Michon et al., 2000; Garnier et al., 2003). ∆OD is defined as follows:
∆OD = ODMB(+Polysaccharide)+CM – ODMB(+Polysaccharide) (Figure 80b).
The presence of casein micelles in MB / xanthan gum solution led to a decrease of ∆OD554nm
corresponding to a disappearance of metachromatic complexes while ∆OD664nm increased due to a
release of free MB molecules. This behavior can be related to a dissociation of MB molecules from
MB / xanthan gum complexes, resulting from the competitive binding of positive “patches” of kappa-
casein to xanthan gum molecules. The same tendency was observed with carrageenan but to a smaller
extent. Thus both xanthan gum and carrageenan interact with casein micelles through electrostatic
interactions at this low ionic strength. It has to be noted that the difference spectra obtained for
carrageenan are slightly different from those reported previously (Garnier et al., 2003) where an
increase of the metachromatic complexes was observed, related to the increased rigidity of the
carrageenan chains in the helical conformation when casein micelles are present. However, this may
be explained by the temperature at which casein micelles were added to MB / polysaccharide systems
in this study: 25°C instead of 70°C (Garnier et al., 2003). Therefore carrageenan chains bound to
129
casein micelles at 25°C where they were already under a helical conformation led to a lower
stiffening effect and thus to a smaller number of metachromatic complexes. An opposite behaviour
was found for the MB / CM / guar or without polysaccharide, with an increase of ∆OD554nm while
∆OD664nm decreased. This is in good agreement with results shown in Figure 80, indicating a binding
of MB molecules on casein micelles. Moreover, this further supports the fact that the neutral guar
gum did not interact with proteins.
3.2. Chemometric methods applied to examination of associative interactions
3.2.1. Study 1: conditions for establishment of milk protein / polysaccharide interactions
The optimal number of independent components (ICs) was first calculated by ICA-by-Blocks
and the Durbin-Watson criterion. Two ICs were found to be optimal with those two methods.
Independent Components Analysis with 2 ICs was performed on the analytical data set of
60 difference spectra corresponding to the experimental design of Study 1 indicated in Table 11.
IC 1 IC 2
3 3
2 2
Optical density
Optical density
1 1
0 0
-1 -1
-2 -2
450 500 550 600 650 700 750 450 500 550 600 650 700 750
Figure 81. Signals corresponding to the 2 ICs of the ICA model obtained from difference spectra (∆OD =
ODMB(+Polysaccharide)+CM – ODMB(+Polysaccharide)) of Study 1.
Figure 81 shows the 2 “pure signals” calculated by ICA. Each IC signal plot presents specific
wavelength zones that could be associated with an individual chemical compound. It should be noted
that those “pure signals” actually correspond to spectral subtractions, and so correspond to the effects
of casein micelle addition to MB / polysaccharide mixtures. For example, IC1 reflects the presence of
metachromatic complexes with a positive ∆OD peak at 554 nm corresponding to this compound. On
the other hand, the IC2 signal is not well defined and shows two main peaks at 664 nm and 605 nm
but also a shoulder at 554 nm. IC2 would correspond to MB molecules either bound to the
polysaccharides or free in solution.
130
0.06 0.010
a 0M b 0M
0.04 0.02 M 0.02 M
0.005 0.1 M
Proportions of IC 2
0.1 M
Proportions of IC 2
0.02
0.000
0.00
-0.005
-0.02
-0.010
-0.04
-0.06 -0.015
-0.08 -0.04 0.00 0.04 0.08 -0.02 -0.01 0.00 0.01 0.02
Proportions of IC 1 Proportions of IC 1
Figure 82. (a) Projection of the proportions of the Independent Components of the difference spectra showing the
influence of ionic strength (0; 0.02 or 0.1 M NaCl); (b) Focus on the proportions corresponding to 0.02 and
0.1 M NaCl (Study 1).
A strong negative linear correlation between IC1 and IC2 is observed (Figure 82a). This
phenomenon may correspond to the conversion of one chemical compound into another. Indeed,
addition of casein micelles to the mixtures led either to the formation of metachromatic complexes or
to the release of free MB molecules (Figure 79b). Therefore, the interaction of casein micelles with
MB or polysaccharide would be likely to increase respectively either IC1 or IC2, and decrease either
IC2 or IC1.
In order to discuss the effects of the ionic strength on polysaccharide / milk protein interactions,
ICs proportions obtained for the 60 difference spectra were plotted (Figure 82a and b). It is noticeable
that projections of the IC proportions for the systems containing no added salt were far more spread
out than those obtained after addition of 0.02 M and 0.1 M, which were clustered near 0 values
(Figure 82b). Thus, interactions between casein micelles and MB or polysaccharides could only take
place when no salt was added. It is well established that the addition of NaCl has a strong screening
effect on charged groups such as those carried by anionic polysaccharides or milk proteins (Shirai et
al., 1977; Perez et al., 2009; Michon et al., 2000), which considerably reduces or even suppresses
electrostatic interactions.
131
0.08
Without PS
0.06 G
C
Proportions of IC1
0.04 X
0.02
0.00
-0.02
-0.04
-0.06
-0.08
25 30 35 40 45 50 55 60 65 70
Temperature (°C)
Figure 83. Proportions of IC1 of the difference spectra at 0 M NaCl and pH 7 as a function of type of polysaccharide
and temperature (casein micelles: filled symbols; milk protein: empty symbols) (Study 1).
Since electrostatic interactions only occurred near to 0 M NaCl, proportions of IC1 and IC2
were investigated more thoroughly at that very low ionic strength for each polysaccharide,
temperature and type of proteins (Figure 83). There is a clear separation as a function of the type of
polysaccharides: MB and guar gum showed positive proportions on IC1 similar to those from
difference spectra obtained without polysaccharides, whereas negative ones were found for xanthan
gum and carrageenan. This behavior is consistent with results shown in Figure 80a since the positive
∆OD peak at 554 nm, which is related to IC1, was detected only in the difference spectra of guar or
without polysaccharide. Moreover, it should be noted that temperature seems to have an effect on
interactions involving casein micelles with carrageenan or methylene blue molecules. Thus, the
values on IC1 decreased while IC2 increased with increasing temperature. For the carrageenan, this
behavior may be attributed to the helix to coil transition when temperature increased from 25°C to
70°C where the carrageenan chain is less rigid and a smaller number of metachromatic complexes are
formed for a given bound methylene blue molecules (Garnier et al., 2003). Therefore increasing the
temperature reduced the number of metachromatic complexes with carrageenan due to coil
conformation and thermal agitation. In MB / casein micelles or MB / casein micelles / guar gum
systems, thermal agitation may contribute to the displacement of MB molecules from the casein
micelles at 70°C. It should be pointed out that milk proteins interacted more strongly with MB
132
molecules than casein micelles at 25°C, as shown in Figure 79b. In contrast, no significant difference
in the interaction of carrageenan with casein micelles could be observed with respect to the type of
proteins. As 80% of milk proteins are casein micelles, these results confirmed that most of the
interactions between carrageenan and milk proteins took place with casein micelles. The evolution of
the proportions of IC1 and IC2 as a function of temperature for xanthan gum was more complex to
interpret, even if electrostatic interactions were identified at 25°C and 43°C. It has been demonstrated
that attraction between milk protein and polysaccharide could take place in solution depending
strongly on factors including ionic strength and charge density. Changes in pH could modify the
overall charge carried by one or both polymers, thus drastically influencing the strength of the
interactions.
3.2.2. Study 2: pH effects on milk protein / xanthan gum interactions
An Independent Components Analysis with 6 ICs, as determined by ICA-by-blocks and the

Durbin-Watson criterion, was applied to all the spectra and including data based on pH factor
(Study 2 in Table 11). Due to the impossibility to subtract spectra corresponding exactly to the same
pH value, ICA was performed on the spectra without subtraction for Study 2.
IC 1 IC 2 IC 3
5 5 5
4 4 4
3 3 3
Optical density
Optical density
Optical density
2 2 2
1 1 1
0 0 0
-1 -1 -1
-2 -2 -2
-3 -3 -3
-4 -4 -4
-5 -5 -5
450 500 550 600 650 700 750 450 500 550 600 650 700 750 450 500 550 600 650 700 750
Wavelength (nm) Wavelength (nm) Wavelength (nm)
IC 4 IC 5 IC 6
5 5 5
4 4 4
3 3 3
Optical density
Optical density
Optical density
2 2 2
1 1 1
0 0 0
-1 -1 -1
-2 -2 -2
-3 -3 -3
-4 -4 -4
-5 -5 -5
450 500 550 600 650 700 750 450 500 550 600 650 700 750 450 500 550 600 650 700 750
Wavelength (nm) Wavelength (nm) Wavelength (nm)
Figure 84. Signals corresponding to the 6 ICs of the ICA model of Study 2.
133
By examining the IC signals (Figure 84), it was possible to relate the “pure spectra” to signals
of known chemical compounds corresponding to specific wavelengths (Table 12) identified from
spectra in Figs. 1a and 2b. Most of the ICs were associated with the presence of free MB molecules as
detected by a peak near 610 nm and/or 664 nm (Gurov et al., 1988). Nevertheless, it may be assumed
that the main peak at 567 nm in the IC5 signal corresponds to metachromatic complexes formed by
association of xanthan gum to MB molecules, as seen in Figure 79a. Therefore IC5 was chosen to
interpret specifically xanthan gum / milk proteins interactions.
Table 12. Chemical compounds corresponding to specific wavelength zones identified on IC signals (wavelength
zones between parentheses are not well represented).
IC Wavelength zone (nm) Chemical compound

1 610; 664 Free MB molecules
2 610; 664; (554) Free MB molecules (metachromatic complexes)
3 664 Free MB molecules
4 610; (664) Free MB molecules
5 567; (664) Metachromatic complexes (free MB molecules)
6 534 Not well defined
The interactions between anionic polysaccharides such as xanthan gum and milk protein are
expected to be minimal at neutral pH (de Kruif et al., 2004). However, the analysis of MB absorption
spectra does show some significant interactions at low ionic strength conditions. Assuming that
electrostatic interactions are charge-dependent, and thus pH-dependent, experiments were carried out
by decreasing the pH. Figure 85 shows the effects of pH and milk protein addition on MB / xanthan
gum systems at various ionic strengths. Proportions of IC5 for MB / xanthan gum solution at
0 M NaCl were not significantly affected by the pH decrease. Thus, metachromatic complexes
formed between cationic MB molecules and anionic xanthan gum were stable whatever the pH.
Indeed, it is well known that xanthan gum is stable over a wide range of pH, from 2 to 12 (Katzbauer,
1998).
When ionic strength was ajusted to 0.1 M NaCl, proportions of IC5 of mixtures of MB /
xanthan gum / milk protein solutions were very low compared to systems without NaCl addition and
did not evolve over the studied pH range. It seems reasonable to suggest that no metachromatic
complexes were formed upon pH decrease in MB / xanthan gum mixtures and a fortiori in MB /
xanthan gum / milk proteins solutions at 0.1 M NaCl because of charge screening, as shown in
Figure 82a, occurring both at neutral and acidic conditions.
134
0.06
Proportions of IC5
0.04
0.02
0.00
4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0
pH
Figure 85. Proportions of IC5 of a MB / 0.0002 wt% xanthan gum at 0 M NaCl ( ), or MB / xanthan gum / MP at
0 (●) or 0.1 M NaCl ( ) at 25°C as a function of pH for Study 2.
On the contrary, a strong decrease in proportions of IC5 when decreasing the pH was observed
after addition of milk protein to MB / xanthan gum solution without NaCl, which could be attributed
to a drastic decrease in the number of metachromatic complexes. A decrease in pH could produce a
progressive release of the MB molecules due to fixation of milk protein on xanthan gum chains. In
consequence, interactions between milk protein and xanthan gum increased when acidification
proceeded. At pHs below 4.6 which is the casein isoelectric point, positively charged milk protein can
strongly interact with anionic polysaccharide, which could explaining the change in slope between
5.2 and 4.6. These results are consistent with those reported for whey protein /
carboxymethylcellulose interactions studied at pH 6.8 and 5.5 (Koupantsis & Kiosseoglou, 2009).
Thus, milk protein / xanthan gum electrostatic association could only take place at a very low ionic
strength and an important strengthening of the interactions was highlighted as the pH approached the
protein isoelectric point.
Conclusion
Electrostatic interactions between neutral or charged polysaccharides and milk protein were
studied by applying ICA to MB visible absorption spectra. ICA was shown to be an effective tool to
identify the specific chemical phenomena related to the detection of associative interactions and to
characterise the strength of these interactions. At neutral pH, xanthan gum and carrageenan appeared
135
to interact with milk protein whereas neutral guar gum did not associate with milk proteins. However,
these interactions could only take place under specific conditions, i.e., at very low ionic strength.
Investigation of the proportions obtained by ICA highlighted the enhancement of electrostatic
interactions between xanthan gum and milk protein when acidification proceeded. Knowledge of
associative interactions is crucial to formulate low pH foods, so further work should be carried out to
elucidate precise conditions for the establishment of such interactions.
Acknowledgements
The results were obtained in the context of Satiarome project which is supported by Vitagora
pole, DGCIS and local authorities with the financial support of Bpifrance and FEDER.
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Sur la base d’une méthode spectrophotométrique associée à une analyse des données par un
outil chimiométrique, les interactions associatives entre divers polysaccharides et les protéines de lait
ont été étudiées sous différentes conditions de force ionique, température et pH. Une analyse en
composantes indépendantes (ACI) a permis de simplifier l’interprétation des données
spectrophotométriques par décomposition des spectres en « signaux purs », pouvant être directement
reliés à des composés chimiques connus. Par une modification du spectre d’absorption suite à un
ajout de protéines de lait à un mélange de bleu de méthylène et de polysaccharides, des interactions
électrostatiques ont pu être mises en évidence. A la différence du guar, polysaccharide neutre, les
molécules de xanthane et de carraghénane chargées négativement s’associent aux micelles de
caséines par l’intermédiaire de régions positives situées sur les protéines. Cependant, ces interactions
n’interviennent qu’à faible force ionique. Dans ces conditions précises, un renforcement des
interactions associatives entre le xanthane et les protéines de lait a été mis en lumière lors d’une
acidification du milieu.
138
II. PROPRIETES DES MELANGES LAIT / XANTHANE AVANT GELIFICATION
II.1. Microstructure des mélanges lait / xanthane

Dans un premier temps, les mélanges lait / xanthane ont été étudiés au pH du lait. La
microstructure de mélanges lait / xanthane a été examinée par microscopie confocale et comparée à
celle de mélanges lait / guar ou carraghénane (Figure 86). Le choix des polysaccharides a été effectué
en fonction de leur densité de charges, allant d’un polysaccharide neutre pour le guar, à des
polymères de plus en plus chargés pour le xanthane puis les carraghénanes. Il est important de relever
que la concentration en polysaccharides des différents mélanges n’est pas identique puisque
l’intensité de la séparation de phases est fonction des caractéristiques physico-chimiques des
polymères, notamment de leur viscosité intrinsèque lorsqu’un phénomène de déplétion intervient et
de la charge lorsque qu’une association a lieu. Sur l’ensemble des images, les zones claires
permettent de localiser les protéines et par contraste, les zones sombres correspondent à des parties
dépourvues de protéines.
Densité de charges (mol de charge négative / mol de monosaccharide)

0 0,25 0,5 1
Guar Xanthane κ Carraghénanes ι
25 µm 50 µm 50 µm
25 µm
Concentration en
polysaccharides (%) 0,3 0,085 0,5 0,5
Viscosité intrinsèque
(dL.g-1) 11 ± 2 70 ± 10 7±1 Non précisé
Figure 86 : Effet de la densité de charges sur la microstructure de différents mélanges lait / polysaccharides (4,6%
protéines / 0,3% guar à 43°C ; 4,6% protéines / 0,085% xanthane à 43°C ; 4,6% protéines / 0,5% kappa-carraghénane
à 25°C). L’image du mélange 3% micelles de caséines / 0,5% iota-carraghénane est issue de Garnier et al. (2003)
L’effet de l’ajout de guar dans le lait sur la microstructure a été détaillé dans le chapitre 3 et
conduit à la formation de gouttelettes protéiques sphériques dispersées dans une phase continue riche
en guar. Contrairement au guar non chargé, les molécules de kappa- et iota-carraghénanes portent des
charges négatives grâce à leurs groupements sulfates (Tableau 9). Des microstructures variées
apparaissent dans les mélanges contenant 0,5% de carraghénane. Alors que le système lait / kappa-
carraghénane présente des zones irrégulières enrichies en protéines, une structure plus granuleuse
prédomine après un ajout de iota-carraghénane. L’absence d’une morphologie de gouttelettes
139
sphériques est attribuée à l’association du carraghénane avec les micelles de caséines au travers
d’interactions électrostatiques associatives entre ses groupes sulfates chargés négativement et une
région chargée positivement de la caséine κ (Snoeren et al., 1975 ; Dalgleish & Morris, 1988 ;
Langendorff et al., 1999 ; Garnier et al., 2003).
Dans le cas de polysaccharides légèrement chargés tels que le xanthane, la phase protéique se
structure sous la forme de domaines non sphériques, mais de taille comparable aux gouttelettes
obtenues pour le système à base de guar. Toutefois, les propriétés rhéologiques particulières de la
phase continue enrichie en xanthane pourraient ralentir la relaxation des domaines protéiques après la
coalescence de deux gouttelettes adjacentes et ainsi contribuer à l’absence de sphéricité. Par ailleurs,
l’étude spectrophotométrique (Chapitre 4, I) et les mesures du potentiel zêta de solutions de xanthane
(Figure 77) ont montré un effet d’écrantage des charges très important dès l’ajout de 0,02 M NaCl, et
a fortiori de 0,1 M NaCl, qui correspond à la force ionique du lait, limitant ainsi les éventuelles
interactions associatives entre le xanthane et les protéines de lait. Ainsi, de la même manière que pour
les mélanges lait / guar, et malgré la densité de charges non nulle de la molécule de xanthane en
absence de sel, un mécanisme de déplétion-floculation serait majoritairement à l’origine de la
microstructure des systèmes lait / xanthane (Hemar et al., 2001 ; Aichinger et al., 2007 ; Bhat et al.,
2006).
II.2. Propriétés rhéologiques des mélanges lait / xanthane

II.2.1. Propriétés d’écoulement
Compte tenu de la différence microstructurale entre les mélanges à base de guar ou de

xanthane, la question de la contribution de ces microstructures aux propriétés rhéologiques de ces
mélanges se pose. Les courbes d’écoulement du mélange lait / xanthane et de chaque composé
individuel sont présentées sur la Figure 87a.
140
0,1
a Lait b Solution X
Solution X Lait + X
Viscosité à 100 s (Pa.s)

Lait + X
Viscosité (Pa.s)
0,01
-1
0,01
1E-3
1E-3
1 10 100 1E-3 0,01 0,1 1
-1
Vitesse de cisaillement (s ) Concentration en xanthane (%)
Figure 87 : (a) Courbes d’écoulement du lait à 4,6% de protéines ( ), d’une solution de xanthane à 0,085% dans
0,1 M NaCl ( ), du mélange lait / xanthane à 0,085% () ; (b) Viscosité à 100 s-1 d’une solution de xanthane dans
0,1 M NaCl ( ) ou du mélange lait / xanthane () en fonction de la concentration en xanthane. Les mesures ont été
réalisées à 43°C.
A la différence du lait caractérisé par un comportement parfaitement Newtonien et une valeur

de viscosité légèrement supérieure à celle de l’eau dans les mêmes conditions de température, le
xanthane seul montre un caractère rhéofluidifiant marqué. Ces propriétés particulières peuvent
s’expliquer par la grande rigidité de la molécule de xanthane et la rupture des zones d’association des
chaînes sous l’effet du cisaillement (Rochefort & Middleman, 1987 ; Cuvelier, 1988). Le mélange
lait / xanthane présente également un comportement rhéofluidifiant mais moins prononcé que la
solution de xanthane. De plus, bien que la valeur de viscosité à 100 s-1 du mélange soit très proche de
celle de la solution de xanthane seule (Figure 87b), les viscosités aux faibles vitesses de cisaillement
sont très différentes. Ce résultat est surprenant puisque sur la base d’une hypothèse de la formation
d’une émulsion eau dans eau, la concentration en xanthane de la phase continue devrait être
supérieure à celle de la solution de xanthane seule et donc présenter un plateau Newtonien avec une
viscosité plus importante et un caractère rhéofluidifiant plus marqué. Un comportement similaire a été
décrit pour différents mélanges de protéines de lait et de xanthane par Hemar et al. (2001). Plusieurs
hypothèses peuvent être émises afin d’expliquer ce phénomène. Une destruction locale des
gouttelettes formerait une couche enrichie en protéines de lait au contact du corps de mesure,
contribuant ainsi à une baisse de la viscosité aux faibles vitesses de cisaillement. Une seconde
explication serait la présence de gouttelettes enrichies en protéines de lait jouant le rôle d’éléments
perturbateurs vis-à-vis des propriétés rhéologiques de la phase continue riche en xanthane,
notamment aux faibles vitesses de cisaillement.
141
Il est à noter qu’un ordre de grandeur de la concentration critique C* peut être déterminé au
niveau de la zone de transition du domaine dilué à semi-dilué pour une solution de xanthane ou de
guar dans 0,1 M NaCl (Figure 56 et Figure 87b). Bien que ces valeurs soient à prendre avec prudence
en raison de la viscosité prise dans la zone non Newtonienne aux hautes concentrations en
polysaccharides, la concentration critique C* de la solution de xanthane est environ 5 fois inférieure à
celle de la solution de guar, ce qui est très cohérent avec les mesures de viscosité intrinsèques
calculées (Figure 78).
II.2.2. Propriétés viscoélastiques
L’étude des propriétés viscoélastiques permet de fournir des éléments complémentaires par
rapport aux propriétés d’écoulement sur l’organisation des mélanges. Ainsi, des mesures en régime
harmonique ont été réalisées sur des mélanges contenant de 0% à 0,25% de xanthane (Figure 88).
0% 0,05% 0,085% 0,17% 0,25%

10 10 10 10 10
G’, G’’ (Pa)
1 1 1 1 1
0,1 0,1 0,1 0,1 0,1
0,01 0,01 0,01 0,01 0,01

0,1 1 10 0,1 1 10 0,1 1 10 0,1 1 10 0,1 1 10
Fréquence (Hz)
Figure 88 : Spectres viscoélastiques à 4°C de mélanges lait / xanthane (( ) G’, ( ) G’’). Les concentrations en
xanthane sont indiquées sur la figure.
Le spectre du lait présente une dépendance à la fréquence, caractéristique de solutions

macromoléculaires. Il est à noter que le module élastique n’a pas pu être mesuré pour le lait seul
puisqu’il est Newtonien. L’ajout de xanthane provoque un changement progressif des propriétés
viscoélastiques, avec l’apparition d’un plateau élastique lorsque G’ devient supérieur à G’’ sur une
partie de plus en plus importante du domaine de mesure. L’évolution des spectres viscoélastiques des
mélanges en fonction de la concentration en xanthane est comparable à celle qui pourrait être obtenue
à partir d’une solution de xanthane (Cuvelier & Launay, 1986). Par conséquent, le comportement du
xanthane domine au sein des différents mélanges. Un phénomène d’association des chaînes de
xanthane stabilisées par de nombreuses liaisons hydrogène contribuerait aux propriétés
viscoélastiques remarquables du xanthane et au pseudo-plateau élastique visible sur un large domaine
de fréquence (Morris et al., 1983). Par un effet d’exclusion de volume, les inclusions de protéines de
lait constitueraient une phase dispersée peu visqueuse dont la morphologie serait dominée par les
142
propriétés de la phase continue riche en xanthane et notamment par des temps de relaxation très
élevés.
L’analyse des propriétés rhéologiques a permis d’émettre des hypothèses complémentaires

quant à l’organisation particulière de la microstructure des mélanges lait / xanthane en milieu neutre.
Ainsi, sur la base des observations microscopiques et des mesures rhéologiques, et en s’appuyant sur
la connaissance des caractéristiques physico-chimiques des chaînes de xanthane, les domaines
enrichis en protéines du fait d’un phénomène de déplétion-floculation seraient contrariés par les
propriétés viscoélastiques remarquables de la phase continue constituée de xanthane. Une
acidification du milieu pourrait toutefois modifier ce comportement de manière majeure.
III. PROPRIETES DES GELS ACIDES BRASSES ENRICHIS EN XANTHANE
Etant donné que le pH contrôle la charge nette des polymères, une modification de pH peut
avoir un impact important sur la possibilité d’association. Ainsi, l’analyse des propriétés des gels
enrichis en xanthane obtenus à l’aide de deux méthodes d’acidification, l’une permettant une
acidification instantanée à l’aide de HCl et l’autre une acidification progressive à l’aide de GDL,
pourrait fournir des indications sur d’éventuelles interactions associatives.
III.1. Acidification à l’aide de HCl

Malgré une vitesse d’acidification très rapide s’éloignant des conditions de fabrication des gels
laitiers acides fermentés, l’utilisation de HCl permet de diminuer le pH du milieu en dessous du point
isoélectrique des protéines. Cependant, un cisaillement doit systématiquement être appliqué
conjointement à l’ajout d’acide afin de limiter une surconcentration locale en acide qui entraînerait un
abaissement du pH très localement. Par ailleurs, la protonation rapide des groupes phosphates ne
permet pas à la micelle de caséines de se réorganiser, ce qui empêche la formation d’un réseau gélifié
tel que présent dans les gels laitiers.
L’acidification à l’aide de HCl à 1 mol.L-1 d’un mélange lait / xanthane à 0,1% dilué à 1/10ème a
donné lieu à la formation de complexes fibreux (Figure 89). Détectables à l’échelle macroscopique et
de l’ordre de quelques centimètres en moyenne, les complexes se présentent sous une forme fibreuse
avec une partie opaque et un voile translucide en périphérie, probablement majoritairement constitué
de xanthane.
143
500 µm
Figure 89 : Complexe fibreux obtenu à partir d’un mélange lait / xanthane à 0,1% dilué à 1/10ème acidifié à l’aide de
HCl à 1 mol.L-1 jusqu’à pH 4,6 sous un cisaillement continu de 100 rpm observé en microscopie optique. La barre
Ces observations sont à mettre en lien avec les structures fibreuses obtenues par acidification à
l’aide de HCl de mélanges de protéines sériques et de xanthane par Laneuville et al. (2000). A pH
neutre et à force ionique du lait, des interactions de répulsion semblent principalement mises en
œuvre entre les protéines globalement chargées négativement et le xanthane polyanionique. A mesure
que l’acidification du milieu se produit, une interaction électrostatique peut être initiée entre des
régions des protéines chargées de plus en plus positivement et les groupements carboxyles du
xanthane. Par ailleurs, un second phénomène contribuerait à la mise en place de ces structures
fibreuses. Outre les capacités d’auto-association de la chaîne de xanthane, jouant un rôle de support
pour la formation du complexe fibreux, un phénomène de fixation coopérative des protéines semble
intervenir (Tolstoguzov, 1986). A l’approche du point isoélectrique des protéines, pour lequel les
interactions protéines-protéines sont maximales, les protéines se lieraient préférentiellement à
d’autres protéines déjà fixées sur le polysaccharide. Par conséquent, les interactions protéines-
protéines seraient favorisées aux dépens de la complexation protéines-polysaccharides.
Lors de l’acidification à l’aide de HCl, l’existence d’interactions associatives serait largement

dépendante du pH. Ainsi, dans les mélanges β-lactoglobuline / polysaccharides chargés, deux pH
critiques ont été définis : un pHc correspondant à la formation de complexes primaires solubles et un
pHφ pour lequel les complexes primaires s’agrègent en complexes interpolymères insolubles,
marquant ainsi le début d’une séparation de phases macroscopique (Girard et al., 2004 ; Sanchez et
al., 2006 ; Laneuville, 2004). Au sein du mélange lait / xanthane, seul le pHφ a été détecté par la
présence visuelle et macroscopique de complexes fibreux. Puisque la formation de complexes fibreux
nécessite la complexation rapide des protéines, l’effet d’un ajout en petite quantité de HCl de
différentes concentrations, et donc de la vitesse d’acidification locale, a été étudié (Figure 90).
144
7,0
6,5
6,0
pH
5,5
5,0
500 µm
4,5
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5
Quantité de HCl ajoutée (mL)
Figure 90 : Effet d’un ajout de HCl de différentes concentrations (( ) 0,05, (♦) 0,1, ( ) 1 mol.L-1) sur la vitesse
d’acidification de mélanges lait à 4,6% de protéines / 0,2% de xanthane dilués à 1/10ème acidifiés sous un cisaillement
continu de 200 rpm. Les cercles pleins représentent le pH auquel les premiers complexes fibreux sont détectables
visuellement mais resolubilisés sous cisaillement en quelques secondes alors que les cercles en pointillés indiquent
les complexes fibreux résistant au cisaillement. Images des complexes fibreux à pH 4,8 observés en microscopie
optique correspondant aux concentrations en HCl utilisées. Les barres représentent 500 µm.
Au cours de l’ajout progressif de HCl, deux pH clés ont été identifiés : le pH auquel les
premiers complexes fibreux sont ponctuellement détectables visuellement et disparaissent sous
agitation, et le pH à partir duquel la réversibilité des complexes devient impossible quel que soit le
temps de cisaillement appliqué. Alors que les premiers complexes fibreux apparaissent dès le pH de
6,4 pour un ajout de HCl à 1 mol.L-1, ils ne sont visibles qu’à partir de pH 6,15 et 6,1, respectivement
après un ajout d’une concentration en HCl de 0,1 et 0,05 mol.L-1. Il est important de noter que la
formation de ces structures semble réversible à ce pH puisqu’elles disparaissent visuellement après un
mélange. Ce comportement peut être attribué à une surconcentration locale en acide qui permet
l’augmentation immédiate de la charge des protéines en dessous de leur point isoélectrique et la
formation de complexes faiblement liés, qui se redispersent ensuite rapidement par une
réhomogénéisation du pH du milieu sous l’action du cisaillement (Laneuville, 2004). Cette hypothèse
est appuyée par le fait que ces complexes apparaissent à un pH plus élevé lorsque la concentration en
145
HCl augmente. Par ailleurs, la concentration en HCl n’a pas d’effet significatif sur la taille et sur la
forme des complexes, ainsi que sur le pH auquel se forment des complexes fibreux résistant au
cisaillement. De ce fait, ce pH d’environ 5,5 et donc proche du point isoélectrique des protéines de
lait, correspondrait au pH global de début de fixation des protéines sur la chaîne de xanthane qui
serait indépendant de la vitesse d’acidification locale.
A partir de ces résultats, il apparaît clairement que le cisaillement joue un rôle primordial sur la
formation des complexes fibreux. Partant de ce constat, des complexes fibreux ont été fabriqués sous
des conditions de vitesse de cisaillement variables (Figure 91). Globalement, la microstructure des
complexes formés sous un cisaillement inférieur ou égal à 300 rpm présente peu de différences en
fonction de la force de cisaillement appliquée, avec la présence d’une partie opaque et d’un voile
translucide. En revanche, une structure sous la forme d’un fil fin et dépourvu du voile translucide en
périphérie apparaît pour une vitesse de cisaillement de 500 rpm.
100 rpm 150 rpm 300 rpm 500 rpm
500 µm
Figure 91 : Effet de la vitesse de cisaillement (de 100 à 500 rpm) sur la microstructure des complexes fibreux
obtenus à partir d’un mélange lait / xanthane à 0,1% dilué à 1/10ème acidifié à l’aide de HCl à 1 mol.L-1 jusqu’à pH
4,6 et observés par microscopie optique. La barre représente 500 µm.
Deux forces antagonistes semblent intervenir lors de la formation des complexes sous
cisaillement. D’une part, l’augmentation des interactions associatives entre le xanthane et les
protéines de moins en moins chargées négativement à mesure que le pH décroît, favorise une
compaction progressive de la structure. D’autre part, les collisions générées par le cisaillement
provoquent des réarrangements protéiques et des ruptures sélectives et irréversibles de parties de
complexes plus faibles (Laneuville, 2004), probablement à l’origine de la diminution de taille
importante des complexes formés à 500 rpm. Finalement, la structure et la taille des complexes
fibreux sont déterminées par des processus de restructuration gouvernés par une compétition entre les
forces électrostatiques attractives et les forces de rupture générées par le cisaillement.
146
L’existence d’interactions associatives entre les protéines de lait et le xanthane en milieu

acidifié semble donc être confirmée par la formation de complexes fibreux incluant a priori les deux
polymères. Toutefois, ces structures fibreuses témoignant d’attractions électrostatiques n’ont été
mises en évidence que sous certaines conditions :
− un ratio protéines / xanthane particulier. En effet, il n’a pas été possible d’observer la
formation de complexes fibreux dans les mélanges dilués à 1/10ème à base de 4,6% de protéines de lait
et contenant moins de 0,05% de xanthane ;
− une diminution rapide et locale du pH par ajout d’acide concentré en présence d’un
mélange de protéines de lait et de xanthane. A titre d’exemple, l’ajout des protéines sous cisaillement
à une solution de xanthane préalablement acidifiée en dessous du point isoélectrique des protéines ne
conduit pas à la formation de complexes fibreux ;
− l’application d’un cisaillement adéquat, permettant l’orientation des chaînes de

xanthane dans le champ de cisaillement, tout en évitant des forces de rupture des complexes trop
importantes.
La discussion des microstructures obtenues par acidification à l’aide de HCl a permis

d’approfondir la réflexion autour de la question des interactions associatives entre le xanthane et les
protéines de lait. Puisqu’une acidification rapide et locale favoriserait les pontages protéiques par
fixation coopérative des protéines, la structuration des systèmes acidifiés plus lentement et sans
l’action du cisaillement pourrait être différente.
III.2. Acidification à l’aide de GDL

A la différence des structures formées par acidification à l’aide de HCl sous cisaillement,
l’utilisation de GDL comme agent acidogène du lait permet la mise en place d’un réseau gélifié. Il a
été montré qu’un ajout de 0,085% de xanthane dans du lait conduit à la formation de domaines
enrichis en protéines dispersés dans une phase continue riche en xanthane (Figure 86). En considérant
à la fois les phénomènes de séparation de phases et de gélification, les propriétés microstructurales et
rhéologiques de gels enrichis de 0 à 0,2% en xanthane ont été étudiées. Par ailleurs, les aspects
cinétiques de la déstabilisation du système et de la formation du gel ont été approfondis par l’étude de
l’effet de la vitesse d’acidification sur les microstructures des micro-gels formés.
147
Cette partie des résultats a fait l’objet d’un article accepté pour publication dans Innovative
Food Science & Emerging Technologies.
Designing microstructure into xanthan gum-enriched acid milk gels

Anne Rohart1,2,3 and Camille Michon1,2,3*
1
2
3
*Corresponding author. Tel.: +33 169 935 127; fax: +33 169 935 005.
Abstract
Designing various microstructures through the interplay between phase separation and acid-
induced gelation processes was investigated. Acid skim milk / xanthan gum mixed gels were prepared
at different xanthan gum and glucono-δ-lactone (GDL) concentrations in order to modulate the extent
of phase separation and the gelation rate, respectively. A gradual change in acid milk gel
microstructure was found by increasing xanthan gum concentration, from homogeneous protein
network, to fibrous structures and finally to isolaled protein-rich aggregates. Addition of xanthan gum
in the milk led to an apparent depletion-flocculation with protein-rich domains dispersed in a
continuous phase enriched in xanthan. The sedimenting denser protein-rich domains could be trapped
by protein gelation, forming specific fibrous structures at 0.05 wt% xanthan gum. Manipulating the
microstructure through modification of the gelation rate resulted in a design of a broad range of
fibrous morphologies varying from 20 to 400 µm long, which could be used to generate novel
textures for food products.
Keywords: Microstructure; Mixed system; Acid milk gel; Xanthan; Food design; Fibrous
structure.
1. Introduction
The last two decades have witnessed growing interest in developing novel acid milk gels with
different sensory properties or nutritional benefits. To improve the texture and increase the functional
properties of acid milk gels, polysaccharides such as xanthan gum, pectin or guar gum can be used in
acid milk gels (Sanchez et al., 2000; Everett & McLeod, 2005; Doublier et al., 2000).
148
At neutral pH, caseins exist in the form of micelles, which are stabilized by steric repulsion due
to the extended conformation of κ-casein present mainly on the surface of micelles (de Kruif, 1998;
Tuinier et al., 2002). Acid milk gels are produced by decreasing the pH of the milk from 6.8 to 4-4.5
using either bacterial cultures, which ferment lactose into lactic acid, or glucono-δ-lactone (GDL),
which mimics the bacterial fermentation. This process leads to the aggregation of casein micelles
mainly because of the collapse of the extended conformation of κ-caseins (Holt, 1992). A network of
three-dimensional casein strands is formed and can be broken apart by shearing, providing stirred
acid milk gels (Tamine & Robinson, 1999). Different acidification rates can be produced by varying
the GDL amount (Horne, 2001).
Xanthan gum is an anionic hetero polysaccharide produced by the microorganism

Xanthomonas campestris. Xanthan’s main backbone consists of (1-4) β-D-glucopyranosyl units and
is substituted at C-3 on every other glucose residue with a charged trisaccharide side chain (Jansson et
al., 1975). The negative charge is brought in the form of a carboxylic acid group and the charge
density of the molecule is relatively low (0.25 mol negative charge/mol of monosaccharide)
compared to the higher charged pectins and carrageenans (de Jong & van de Velde, 2007).
As xanthan gum is negatively charged in the usual range of pH of food, it could therefore
present electrostatic associative interactions with proteins at low pH (Narchi et al., 2009), as in the
case of pectin (Tuinier et al., 2002; Maroziene & de Kruif, 2000) or carboxymethylcellulose (Du et
al., 2007). At neutral pH, casein micelles being globally negatively charged, repulsive interactions are
suspected between anionic polysaccharides and casein micelles. Previous studies showed that an
addition of xanthan gum to skim milk resulted in the formation of two phases, one protein-rich and
another one xanthan-rich. The mechanism proposed was a segregative phase separation between the
casein micelles and xanthan gum which is described as depletion-flocculation (Hemar et al., 2001;
Aichinger et al., 2007; Bhat et al., 2006).
Whereas mixtures of milk and polysaccharides at the neutral pH have been frequently studied,
there is a limited number of studies in the literature concerning the use of polysaccharides such as
xanthan gum during the acid-induced gelation. When acidified with a low xanthan gum concentration
(typically around 0.01 wt%), the acid mixed systems showed a more compact structure and were
highly organized into fibrous structures at increasing xanthan gum concentration (Sanchez et al.,
2000). With higher concentrations, aggregated caseins are trapped within a viscous polysaccharide
solution (Everett & McLeod, 2005). Moreover, the acidification rate plays a major role in the final
149
macro- and microstructure in biopolymer mixtures that undergoes both phase separation and gelation
process (Lorén & Hermansson, 2000; Perrechil et al., 2009).
The main objective of this work was to improve the understanding of the respective effect of
phase separation and acid gelation kinetics on microstructure morphologies of stirred acid milk gels
containing xanthan gum. This was then used to design a wide range of microstructures, considering
the competition between phase separation and gel formation.
2. Material and methods
2.1. Mixed Gels Manufacture
Skim milk at 46 g.kg-1 of proteins was prepared with low-heat skim milk powder (33 wt%
protein) (CH low heat, Ingredia, Arras, France) dispersed in Milli-Q water using a magnetic stirrer for
1 h at room temperature. Higher protein content than conventional milk was used as it is mostly
applied for industrial low fat yoghurts in order to avoid syneresis. The reconstituted skim milk was
then left to fully hydrate overnight in a refrigerator. The milk was heat-treated at 80°C during 7 min
using a thermostatically-controlled water bath in order to partially denaturate whey proteins. The
level of whey protein denaturation was not measured but the milk preparation was standardized and it
must be noted that the total pre-heat-treatment of the milk was medium. Milk was cooled down to
60°C and xanthan gum (Satiaxane, Cargill, USA) was dispersed under stirring. The mixture was
stirred 30 min at 60°C and finally cooled down to 43°C. Xanthan gum concentrations from 0 to
0.2 wt% were studied.
Different amounts (1, 1.5 or 2.5 wt%) of GDL (Sigma Chemical Co., St Louis, MO, USA) were
added to preheated skim milk that was then incubated at 43°C until a pH of 4.60 (±0.05) for 1.5 and
2.5 wt% GDL and pH of 4.7 (±0.05) for 1 wt% GDL, respectively, was obtained. The change in pH
with time was monitored with a pH-meter Consort D130 multiparameter analyzer (Turnhout,
Belgium). The acidified milk, in the form of a gel, was then immediately cooled down in cold water
bath to 20°C in order to slow down drastically the pH decrease.
All the set gels were maintained at 20°C for one hour before to be sheared with a standardized
process. During this step, a Masterflex® peristaltic pump (Cole Parmer, Vernon Hills-USA)
(380 mL.min-1) pushed the gel through two successive plastic pipes (length: 40 cm and internal
diameter: 7 mm; length: 100 cm and internal diameter: 3 mm) with a mesh of 500 µm holes at the
end. This shearing process was applied to all gels excepted the strongest ones, typically those with
150
fibrous-like structure containing 0.05 wt% xanthan (1, 1.5, 2.5 % GDL), 0.085 wt% xanthan (1, 1.5 %
GDL) and 0.1 wt% xanthan (1 % GDL), that were mechanically sheared by passing through the two
pipes to obtain a homogeneous gel in a standardized shearing process but without the mesh at the end
of the second pipe in order to not break the separated micro-gels. Stirred acid milk gels were
immediately stored at 4°C during 1 day before analysis to avoid extensive post-acidification (a
variation of pH lower than 0.1 was estimated).
2.2. Instrumental characterization
The phase separation process was observed using a Turbiscan LAB (Formulaction, France). A
non-acidified skim milk / xanthan gum mixture was poured in glass tubes (diameter 27.5 mm).
Backscattering values at 880 nm were acquired along a 40 mm height of tube with one acquisition
every 40 µm. Scans were carried out at different time intervals.
Confocal laser scanning microscopy (CLSM) and epifluorescence microscopy were used to
visualize the microstructure of the stirred mixed gels. CLSM was performed using a Leica TCS
AOBS SP2 microscope (Leica, Germany). Proteins were stained by addition of DyLight 549 (20 µL
in 1 g of sample) that was excited using a helium-neon laser with wavelength 543 nm and the
fluorescence was detected with a photomultiplier. Epifluorescence microscopy was performed using
an Olympus BX51 microscope (Olympus America, Lake Success, NY). Proteins were stained with
Nile Red that was dispersed in the samples (25 µL in 1 g of sample). The samples were placed on a
microscope slide with a glass coverslip on the surface.
To characterize the morphology of the structures obtained, their lengths and widths were
measured manually and repeated 10 times for each image. Depending on the image magnification, the
smallest particle dimension in the measurements was 15-20 µm. Along the particle length short
straight lines were drawn, each length was then individually measured and summed up to give a value
for the length.
A stress-controlled rheometer (Carri-Med CSL2100, TA Instruments, UK), fitted with a

stainless steel plate and cone (diameter 60 mm, 4° angle) geometry, was used to characterize the
rheological properties of stirred acid milk gels. Frequency sweep tests were performed within the
linear domain in the range of 0.01-10 Hz. All measurements were carried out 1 day after mixed gels
manufacture.
151
3. Results and discussion
3.1. Phase separation in xanthan gum / milk mixtures
When mixing 0.05 wt% xanthan gum into the milk, a visual phase separation was observed
with the formation of two phases, one top phase enriched in xanthan gum and a bottom white phase
enriched in proteins. As the evolution of the phase separating system is a kinetic process (Schorsch et
al., 1999; Turgeon et al., 2003), the phase separation kinetics of a 0.05 wt% xanthan gum / skim milk
mixture was studied using a light multi-scattering technique. Figure 92a shows the variation of the
delta backscattering for this non-acidified mixture over different times compared to the control
(time = 0 h).
Droplet Sediment
sedimentation layer
10 10
a b
∆ Backscattering (%)
5
8
0
6
-5 Time (h)
0 4
-10 0.1
0.4
-15 0.7 2
1
-20 0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
Sample height (mm) Time (h)
Figure 92. (a) Delta backscattering values of non-acidified 0.05% xanthan gum / skim milk mixture along its height
in a glass tube over the time at 43°C; (b) Maximum value of delta backscattering at the bottom of the tube as a
function of time. Dotted lines correspond to the time of the beginning of the sedimentation of the protein-rich
domains (0.1 h) and apparition of continuous sediment layer (0.4 h).
A modification of backscattered intensity profiles appeared from 0.1 h (Figure 92a). An

increase of delta backscattering level was observed at the bottom of the tube corresponding to an
increase in protein concentration (Figure 92a and b). The first sedimented protein-rich domains have
reached the bottom of the tube. The backscattering signal measured at the bottom of the tube (0-
5 mm) increased continuously to reach a maximum level after 0.4 h. This maximum of delta
backscattering corresponded to the formation of a continuous protein-rich layer at the bottom of the
tube. Then the height of the sedimented layer increased continuously up to 23 mm after 1 h
(Figure 92a).
152
The phase separation process occurring in milk protein / xanthan gum mixtures is now widely
recognized and is attributed to a depletion-flocculation mechanism (Hemar et al., 2001; Aichinger et
al., 2006; Bhat et al., 2006). Demixing of systems is caused by the formation of a depleted layer
around the casein micelles excluding the xanthan molecules which gives rise to an osmotic pressure
gradient and drives the casein micelles to attract one another (Asakura & Oosawa, 1958). However,
very few researches have focused on the study of the demixing kinetics. In the case of a combined
phase separation and gelation process, knowledge of the phase separation kinetics is required.
3.2. Influence of xanthan gum concentration on microstructure and rheological

properties of the xanthan gum / acid milk gels
The microstructure of stirred acid milk gels with fixed amount of GDL (1.5 wt%) and
increasing concentrations of xanthan gum is shown in Figure 93a. Proteins stained by DyLight 549
were represented in white. The dark areas corresponded to zones devoid of protein, thus containing
mostly xanthan gum.
(a) 0% 0.01% 0.05% 0.085% 0.2%
(b)
10000 10000 10000 10000 10000
G’, G’’ (Pa)
1000 1000 1000 1000 1000
100 100 100 100 100
10 10 10 10 10
1 1 1 1 1
0.01 0.1 1 10 0.01 0.1 1 10 0.01 0.1 1 10 0.01 0.1 1 10 0.01 0.1 1 10
Frequency (Hz)
Figure 93. (a) Confocal micrographs; (b) Mechanical spectra of acid milk / xanthan gum gels with 1.5 wt% GDL
and containing various xanthan gum concentrations (0-0.2 wt%) indicated in the figure (G’, filled symbols; G’’,
empty symbols). Scale bars indicate 100 µm.
Acid milk gels without xanthan gum displayed a homogeneous casein network. However, with
addition of only 0.01 wt% xanthan gum, the network tended to form denser casein aggregates with
large dark voids, indicating a microscopic phase separation (Figure 93a). This evolution of the casein
aggregates morphology when a very small concentration of xanthan gum was added is in good
accordance with the hypothesis of local electrostatic associations that were reinforced while
decreasing the pH. Those gels exhibited a solid-like behavior: G’ values were higher than G’’ ones
153
and both dynamic moduli showed little dependence on frequency (Figure 93b). For 0.05 and
0.085 wt% xanthan gum, the gel structures changed drastically with the formation of fibrous
structures exhibiting a macroscopic aspect similar to mozzarella cheese one. Interestingly the high
connectivity of the fibrous structures increased by 100 to 1000 times the elastic response of the
system (Figure 93b). It should be noted that oriented fibrous structures existed before stirring the set
gels and were not oriented after stirring. At high xanthan gum concentration (0.2 wt%), isolated
protein-rich aggregates dispersed in a xanthan gum-rich continuous phase appeared, resulting in the
complete loss of the network-like structure. This was supported by the rheological data, which
showed the weakening of the network in the presence of high xanthan gum concentrations
(Figure 93a and b).
Increasing amounts of xanthan gum into acid skim milk gels induced the creation of different
microstructures. At low xanthan gum concentrations the stirred gel microstructures were
characterized by a micro-phase separation into the protein network. During milk acidification, the
combination of acid-induced aggregation of casein micelles and volume exclusion effects resulted in
a compaction of the casein network (Sanchez et al., 2000; Aichinger et al., 2007; Everett & McLeod,
2005).
At high xanthan gum concentrations (i.e. 0.2 wt%), casein aggregates were trapped within the
increasingly viscous xanthan gum-rich solution (Everett & McLeod, 2005) that slowed down
considerably the phase separation phenomenon. In this case, the mechanical properties were
dominated by the xanthan gum continuous phase. Therefore small protein aggregates were frozen by
protein gelation before coalescence and sedimentation occurred.
However, for intermediate xanthan gum concentrations (between 0.05 and 0.085 wt%), the
viscosity of the continuous phase was not sufficient to inhibit protein-rich aggregates’ mobility
(Figure 92a and b). Specific fibrous-like structures were already observed in the case of acidic
skimmed milk / xanthan gels at pH 4.6 (Sanchez et al., 2000) and β-lactoglobulin / native xanthan
acidified with HCl while applying a shear (Laneuville et al., 2000). The fibrous complexes formation
was attributed to non-specific interactions between the polyanionic xanthan gum and the less
negatively charged proteins near their isoelectric point. Therefore, a side-by-side aggregation of
concentrated casein micelles domains along the xanthan gum chains could occur when acidification
proceeds towards pH 4.6 and thus lead to fibrous complexes (Kobori et al., 2009). Meanwhile both
gravitational force and thermal agitation contributed to the sedimentation of the mixed aggregates,
thus orienting vertically the sedimenting structures. Then the gelation process froze the sedimentation
154
of the aggregates at an intermediate state, depending on the gelation rate, which made it possible to
form the protein-enriched fibrous structures.
3.3. Influence of gelation rate on microstructure of the xanthan gum / acid milk gels
The pH decrease of skim milk as a function of time is shown in Figure 94 for three amounts of
GDL. The initial pH of the sample was 6.8. It reached a value of 4.6 after 2 h or 50 min with addition
of 1.5 or 2.5 wt% GDL, respectively and a value of 4.7 after 4 h with addition of 1 wt% GDL. With a
decrease in pH, the casein micelles became unstable and flocculation took place around pH 5.2 for
heated milk (Horne, 2001). With an increase of the GDL concentration, the pH decreased faster and
the gelation time was shorter. Indeed the pH value of 5.2 was reached after 0.7 h, 0.5 h and 0.2 h with
addition of GDL amount of 1, 1.5 and 2.5 wt%, respectively.
First sedimentation of Sediment

protein-rich domains layer
6.4
6.0
5.6
pH
pH of gel
5.2
formation
4.8
1%
2.5% 1.5%
4.4
0.01 0.1 1
Time (h)
Figure 94. Effect of GDL concentration on pH kinetic after various amounts of GDL addition (1, 1.5, 2.5 wt%).
Values are means from triplicate experiments. Dotted lines correspond to the pH of gel formation (pH 5.2) and the
time of the beginning of protein-rich domains sedimentation (0.1 h) and apparition of continuous sediment layer
(0.4 h) for the non-acidified 0.05% xanthan gum / skim milk mixture as determined from Figure 92b.
By reporting the time of first sedimentation of protein-rich domains and the time of continuous
sediment layer formation obtained for the non-acidified mixture (Figure 92b) in Figure 94, it is
possible to point out the importance of the interplay between phase separation and gelation kinetics.
For instance, in the case of 0.05% xanthan gum / skim milk mixture acidified with 2.5 wt% GDL,
155
some protein-rich domains began to sediment before pH of gel formation was reached but no
continuous layer was formed at the bottom of the tube. With addition of 1.5 wt% GDL the gelation
occurred nearly at the same time as the apparition of the continuous sediment layer. On the contrary,
using 1 wt% GDL, gelation occurred after 0.8 h whereas a continuous sediment layer began to form
only after 0.4 h. In that case the phase separation kinetics was quicker than the network formation
kinetics.
Figure 95 illustrates the change in microstructure with increasing levels of xanthan gum at three
different GDL concentrations (1, 1.5 and 2.5 wt%). Epifluorescence micrographs at 1.5 wt% GDL
revealed the same features as CLSM for increasing xanthan gum concentration, i.e. a transformation
of the structure from homogeneous to fibrous structures and finally to isolated aggregates dispersed in
a xanthan gum-rich continuous phase. Microstructures of the gels acidified with 1 or 2.5 wt% GDL
were comparable to those observed for 1.5 wt% GDL concentration, although they were shifted from
fibrous structures to isolated protein-rich aggregates at higher xanthan gum concentration with
increasing GDL concentration. For instance isolated aggregates appeared from 0.2 wt% for low GDL
concentrations whereas it was observed from 0.1 wt% xanthan gum for 2.5 wt% GDL.
156
0% 0.01% 0.05% 0.085% 0.1% 0.2%
1%
GDL
1.5%
GDL
2.5%
GDL
200 µm
Figure 95. Microstructure of acid milk/xanthan gum gels at pH 4.6 containing various xanthan gum concentrations (0-0.2 wt%) as determined by epifluorescence
microscopy at three different GDL concentrations (1, 1.5, 2.5 wt%). Scale bar indicates 200 µm.
157
400
1%
1.5%
300 2.5%
Length (µm)
200
100
Width
0
0.00 0.05 0.10 0.15 0.20
Xanthan gum concentration (%)
Figure 96. Lengths of the protein-enriched structures as a function of xanthan gum concentration for three GDL
concentrations (1, 1.5 and 2.5 wt%). The mean width of the structures is represented in the grey zone. The lines are
drawn to guide the eye.
Based on microstructure observations, the various morphologies of protein-enriched structures

were characterized (Figure 96). An addition of a very low xanthan gum concentrations (<0.03 wt%)
changed the protein network microstructure (Figure 93a and Figure 95) but no separated protein-rich
micro-gels could be identified. In those cases, no length and width of separated protein-rich micro-
gels determination could be done. At 0.05 wt% xanthan gum, the length of protein-rich micro-gels
reached a maximum value, which corresponded to the elongated fibrous structures (Figure 93a and
Figure 96). However, the length decreased significantly when microstructure shifted to isolated
protein-enriched aggregates, with presence of structures with a length about 5 times smaller than the
fibrous one. It is worth noting that at high xanthan gum concentrations the length of the structures
tended to reach the width value, meaning that no structure elongation was obtained for the isolated
protein-enriched aggregates that became more spherical.
The trend of an initial increase and a subsequent decrease in structures length with increasing
xanthan gum concentration appeared whatever the GDL concentration. However, stirred gels
acidified with 1 wt% GDL had the most elongated fibrous structures whereas 4 times smaller
structures were found in systems prepared with 2.5 wt% GDL, i.e. with the highest gelation rate.
158
These differences in microstructures could be attributed to the time delay for milk protein gelation
(Figure 95) which allowed the microstructure to evolve before triggered freezing through protein
gelation. As a consequence, for lower gelation rate, the structures were sedimenting to a large extent
before being kinetically trapped by gelation. On the contrary, smaller fibrous structures were found in
the system containing 2.5 wt% GDL where sedimentation of protein-rich domains competed
drastically with the gelation process.
Finally, understanding the interplay between phase separation and gelation made it possible to
design a wide range of morphologies with lengths varying from 20 to 400 µm.
Conclusion
The present study showed how various gel microstructures could be designed by acquiring a
better understanding of the combined xanthan gum / milk protein phase separation and gelation
process. Microscopy in combination with rheological experiments was used to understand the
mechanisms involved in acidified milk containing varying concentrations of xanthan gum and GDL.
Starting with a casein network, the microstructure transformed into a fibrous structure and isolated
protein-rich aggregates dispersed in a xanthan gum-rich continuous phase, depending on xanthan gum
concentration. Although a depletion-flocculation phenomenon in xanthan gum / skim milk mixture
was described, a side-by-side aggregation of concentrated casein micelles domains along the xanthan
gum chains could occur when acidification proceeded leading to a reinforcement. Gelation can then
be used to trap kinetically the sedimenting aggregates, leading to specific fibrous structures. The
potential to design different types of morphologies by controlling the gelation rate gives a way to
manipulate textures. Therefore this study could be complemented by sensory analysis in order to see
if interesting novel textures could be created by addition of such microgels with various shapes.
Acknowledgements
pole, DGCIS and local authorities with the financial support of OSEO and FEDER. The authors
would like to thank Gabrielle Moulin for her assistance with the confocal microscopy experiments.
159
References
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La compréhension de la compétition entre les phénomènes de séparation de phases et de

gélification a conduit à formuler une large gamme de morphologies de gels acides enrichis en
xanthane. La microscopie associée à des mesures rhéologiques a permis d’interpréter les mécanismes
impliqués dans la formation des gels acides contenant différentes concentrations en xanthane et en
GDL. Ainsi, une modification progressive de la microstructure en fonction de la concentration en
xanthane, en évoluant d’un réseau gélifié homogène à des structures fibreuses et enfin à des micro-
gels riches en protéines dispersés dans une phase continue enrichie en xanthane, a pu être mise en
évidence. Bien que l’ajout de xanthane dans le lait aboutisse à un phénomène de déplétion-
floculation, les domaines riches en protéines pourraient s’agréger le long des chaînes de xanthane lors
de l’acidification, formant ainsi des structures fibreuses à 0,05% de xanthane. Modifier la vitesse
d’acidification constitue une approche particulièrement intéressante pour créer une large gamme de
microstructures variant de 20 à 400 µm, et pour générer de nouvelles textures.
161
III.3. Mécanismes de formation des structures fibreuses

A partir des observations microscopiques des structures obtenues après acidification d’un lait
enrichi en xanthane à l’aide de HCl ou GDL, il apparaît clairement que les deux méthodes
d’acidification utilisées conduisent, sous certaines conditions, à la formation de structures fibreuses
(Figure 89 et Figure 93a). Dans le cas de l’utilisation de HCl sous cisaillement, un phénomène
d’association semble intervenir, tout au moins partiellement, dans la mise en place de ces structures.
En revanche, il n’a pas été possible de confirmer la présence de xanthane dans les structures gélifiées
par l’action de la GDL sur la base des observations microscopiques et rhéologiques.
Une approche par dosage indirect basé sur des mesures viscosimétriques a permis d’estimer la
quantité de xanthane contenue dans les structures fibreuses. La concentration en xanthane des
surnageants après centrifugation a été calculée à partir de courbes étalon reliant la viscosité apparente
à 100 s-1 et la concentration d’une solution de xanthane (Figure 97a). En connaissant les fractions
volumiques des deux phases en présence, la quantité de xanthane incorporée dans les structures
fibreuses a été déduite (Figure 97b). Une valeur de 1 correspondrait donc à un emprisonnement de la
totalité des chaînes de xanthane dans les structures gélifiées alors qu’une exclusion du xanthane des
complexes fibreux serait caractérisée par une valeur proche de 0.
-0,5 1,0
log (concentration en xanthane) (%)
a b
Quantité de xanthane (%)
-1,0 y1 = - 0,37 x2 - 0,75 x - 0,94 0,8

R2 = 1,00
-1,5 0,6
-2,0 0,4
y2 = 4,36 x + 11,01
R2 = 0,97 0,2
-2,5
-3,0 0,0
-3,5 -3,0 -2,5 -2,0 -1,5 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20
-1
log (η à 100 s ) (Pa.s) Concentration initiale en xanthane (%)
Figure 97 : (a) Courbe étalon entre la viscosité à 100 s-1 et la concentration en xanthane d’une solution de xanthane à
0,1 M NaCl à 43°C ; (b) Evolution de la quantité de xanthane dans les structures gélifiées à l’aide de HCl à 1 mol.L-1
à 25°C sous cisaillement ( ) ou de GDL à 1,5% à 43°C ( ) en fonction de la concentration en xanthane
initialement présente dans le lait
Les complexes fibreux formés suite à une acidification à l’aide de HCl contiennent du xanthane
à partir d’un ajout initial supérieur ou égal à 0,05% de xanthane, et ce phénomène s’accentue à
162
mesure que la concentration initiale en xanthane dans le lait augmente. Ce résultat tend non seulement
à confirmer des phénomènes de formation de complexes entre le xanthane et les protéines de lait,
mais aussi le rôle des propriétés rhéologiques particulières du xanthane. En effet, l’augmentation de la
quantité de xanthane dans les structures fibreuses aux concentrations élevées en xanthane peut être
interprétée comme la conséquence de l’alignement d’un nombre croissant de chaînes de xanthane
dans le champ de cisaillement, permettant des interactions et un piégeage plus efficace des protéines.
Dans le cas d’une acidification lente à la GDL, une exclusion presque totale du xanthane et partielle
du xanthane dans les structures gélifiées a été observée pour une concentration initiale en xanthane
respectivement de 0,05% et 0,2%. Ainsi, l’effet éventuel des interactions entre le xanthane et les
protéines de lait dans ces conditions d’acidification ne semble pas être prédominant lorsque le
système a été acidifié à l’aide de GDL.
IV. CONCLUSION
Une distinction au niveau de la structuration des gels en fonction de la méthode d’acidification

utilisée doit être envisagée (Figure 98). D’une part, les complexes fibreux créés suite à une
acidification à l’aide de HCl sous cisaillement sont structurés par un support à base de xanthane,
détectable par un voile translucide en microscopie, sur lequel se fixeraient les protéines. D’autre part,
l’acidification lente à base de GDL favorise certes la formation d’un réseau gélifié, mais permet
également à la séparation de phases par déplétion-floculation entre le xanthane et les micelles de
caséines de s’opérer. Dans cette situation, les molécules de xanthane auraient le temps de se
regrouper dans une même phase en début d’acidification, limitant ainsi les possibilités d’interaction
avec les protéines de lait lorsque le pH s’approche du point isoélectrique des protéines. Cette
hypothèse est appuyée par le phénomène d’exclusion presque totale du xanthane des micro-gels.
Toutefois, quelques chaînes de xanthane pourraient interagir de manière isolée avec les protéines de
lait en milieu acidifié, même si ce phénomène reste à confirmer par des expériences complémentaires.
163
Méthode Mésoscopique Microscopique

d’acidification ∼ mm - cm ∼ nm - µm
Cisaillement
mécanique
HCl
Gravité
GDL
Micro-gel protéique Agrégat de caséines

Légende acides
Phase riche en xanthane Chaîne de xanthane
Figure 98 : Représentation schématique des structures fibreuses formées par acidification à l’aide de HCl ou GDL
aux échelles mésoscopique et microscopique
Hormis d’éventuelles interactions associatives entre le xanthane et les protéines de lait, les
analyses rhéologiques et microscopiques ont permis de mettre en évidence l’intervention d’autres
forces dans la structuration des gels acidifié à l’aide de HCl ou de GDL sous une forme fibreuse
(Tableau 13).
Tableau 13 : Niveau de contribution des différentes forces à la microstructure des gels acides enrichis en xanthane à
pH inférieur ou égal au point isoélectrique des protéines et acidifiés à l’aide de HCl ou GDL
Interactions Niveau de Niveau de

Acidification par HCl Acidification par GDL
macromoléculaires contribution contribution
Interactions
Complexation + Complexation (+/-) ?
protéines-xanthane
Gélification acide
Interactions Gélification acide
+++ Regroupement dû à la +++
protéines-protéines Fixation coopérative
déplétion
Association des chaînes
stabilisées par des liaisons
Interactions Liaisons inter-chaînes
- hydrogène ++
xanthane-xanthane rompues par le cisaillement
Temps de relaxation des
enchevêtrements important
Forces externes Cisaillement mécanique ++ Cisaillement lié à la gravité +++
164
Dans le cas d’une acidification brutale à l’aide de HCl, les chaînes de xanthane orientées par
l’action du cisaillement forment un support fortifié par la fixation électrostatique et coopérative des
protéines. Il est à noter qu’une gélification acide par GDL, ayant lieu dans des conditions identiques à
celles permettant la formation des complexes fibreux par HCl, conduirait à la formation de complexes
particulaires et non fibreux (Laneuville, 2004). Même si la présence d’interactions associatives n’a
pas été confirmée au sein des gels acidifiés par la GDL, les analyses rhéologiques des laits enrichis en
xanthane et l’étude des cinétiques relatives de la séparation de phases et de gélification ont permis
d’apporter certaines clés de compréhension vis-à-vis des forces mises en jeu dans la formation des
structures fibreuses. Un parallèle entre la possibilité d’allongement des gouttelettes contenues dans
les systèmes lait / guar acidifiés sous l’action de la gravité (Chapitre 3, II.2) et les structures fibreuses
observées après acidification par la GDL peut être établi. En effet, l’orientation verticale des
structures fibreuses laisse supposer que les domaines enrichis en protéines ont été figés par la
gélification alors qu’ils sédimentaient sous une forme non sphérique, ceci en raison des propriétés de
la phase continue riche en xanthane, et notamment des temps de relaxation très élevés. Augmenter ou
diminuer l’intensité des forces externes, dont le cisaillement mécanique ou la gravité, constituerait
donc une stratégie intéressante pour jouer sur le degré d’allongement des structures fibreuses.
165
Chapitre 5 : Effet de l’histoire thermomécanique sur les propriétés des gels acides enrichis en polysaccharides
Chapitre 5 : Effet de l’histoire thermomécanique sur les

propriétés des gels acides enrichis en polysaccharides
Dans le cas des mélanges lait / guar ainsi que lait / xanthane acidifiés à l’aide de GDL, des
structures filamenteuses ont été obtenues. L’allongement des micro-gels au sein de systèmes enrichis
en guar ou la formation de structures fibreuses des systèmes riches en xanthane semblent être
majoritairement attribués à un effet de sédimentation des domaines enrichis en protéines par gravité.
L’hypothèse d’un rôle de l’agitation thermique dans la mise en place de ces structures reste en
question. Par ailleurs, l’action d’un cisaillement constitue un paramètre clé pour la création de
complexes fibreux élaborés à partir de mélanges lait / xanthane acidifiés par HCl. L’ensemble des
résultats décrits dans les chapitres 3 et 4 conduit à l’hypothèse selon laquelle les concentrations en
polymères seraient certes à prendre en considération dans l’obtention de morphologies variées de
gels, mais les paramètres de procédé y contribueraient également de manière significative.
L’objectif de ce chapitre est de modifier les traitements thermiques et mécaniques de systèmes

lait / guar avant et pendant la gélification acide. A partir des observations macroscopiques,
microscopiques et rhéologiques, il s’agira ensuite de relier les conditions de procédé appliquées aux
propriétés des gels acides brassés.
I. EFFET DE L’HISTOIRE THERMIQUE
Dans un premier temps, la température a été maintenue constante avant et pendant la

gélification du système. Ensuite, les mélanges lait / guar ont subi des histoires thermiques variées,
construites à l’aide de différentes étapes de température avant que la formation du gel n’ait lieu. Afin
de pouvoir mieux généraliser les phénomènes observés en fonction des modifications des paramètres
de procédé, la composition initiale en polymères des systèmes lait / guar a été fixée à un
enrichissement de 0,3% de guar et celle en GDL à 1,5%.
I.1. Effet de la température d’acidification

Lorsqu’une séparation de phases au sein d’un système mixte a lieu, la gélification intervient
comme un événement perturbateur en ralentissant voire en bloquant ce phénomène. Par conséquent,
la compréhension de l’aspect cinétique de ces deux événements se produisant conjointement est
cruciale. Modifier la température d’acidification de systèmes lait / guar additionnés de GDL permet à
166
la fois de moduler la vitesse de séparation de phases et celle de la gélification acide. Un suivi de la

séparation de phases a tout d’abord été réalisé par microscopie confocale et par une méthode
d’interaction lumière-matière. Ensuite, les différentes microstructures des gels brassés acidifiés à des
températures variant de 30°C à 60°C ont été discutées en s’appuyant sur la connaissance des
cinétiques respectives de séparation de phases et de gélification acide des protéines.
Cette partie des résultats a fait l’objet d’un article publié dans Biopolymers.
Interplay between phase separation and gel formation in stirred acid

milk/guar gum gels: effect of acidification rate
Anne Rohart1,2,3, Gabrielle Moulin1,2,3 and Camille Michon1,2,3*
1
2
3
*Corresponding author. AgroParisTech, 1 rue des Olympiades, F-91300 Massy. Tel.: +33 169 935 127; fax:
+33 169 935 005.
Abstract
The possibility of designing various microstructures through the interplay between phase
separation due to depletion mechanisms and acid-induced protein gelation was investigated. In order
to modify the phase separation and gelation kinetics, guar gum / acid milk mixtures were acidified
using glucono-δ-lactone (GDL) at temperatures varying from 30°C to 60°C. The microstructures of
the stirred mixed gels were then discussed in light of the knowledge of the phase separation and
gelation timescales. Small spherical protein-enriched micro-gels dispersed in a guar gum-enriched
continuous phase were found at high acidification temperatures, suggesting that the protein acid
gelation kinetics was quicker than an extensive droplet growth through phase separation. For lower
acidification temperatures, a region where droplet coalescence and sedimentation competed with gel
formation was identified. Thus, depending on the residence time in that temperature domain, the
resulting microstructures varied from spherical to extended filaments of more than 100 µm length.
The results demonstrated that a broad range of defined microstructures can been created by triggered
arrest through gelation of the phase-separating structure.
Keywords: Chemical physics; Microstructure; Mixed systems; Interaction; Biopolymers
167
1. Introduction
Polysaccharides and proteins are present together in many kinds of food systems and are
largely responsible for the texture and stability due to their own functional properties but also to their
interactions. Actually, these two macromolecules are usually incompatible, showing spontaneous
phase separation (Doublier et al., 2000; de Kruif & Tuinier, 2001; Corredig et al., 2011). Exceeding a
certain polysaccharide concentration, the phase-separating system can be considered as a water-in-
water emulsion with some particularities (Frith, 2010; Turgeon et al., 2003): (1) owing to their low
interfacial tension, droplets can greatly deform, orient and coalesce (Tolstoguzov, 1991; Tolstoguzov,
2007; Norton & Frith, 2001) and (2) the emulsion destabilization follows Stokes’ law (Foster et al.,
1997; Foster et al., 1996; Schorsch et al., 1999) only with small density differences resulting in slow
creaming or sedimentation rates.
Previous studies have shown that mixtures of milk proteins and galactomannan such as guar
gum result in a segregative phase separation attributed to a depletion-flocculation mechanism
(Bourriot et al., 1999; Tuinier et al., 2000). Depending on the mixture composition position in the
phase diagram, phase volume ratios can be changed as well as the type of polymer constituting the
continuous and the dispersed phases (Schorsch et al., 1999; Spyropoulos et al., 2010). Under non-
equilibrium conditions, droplets behave as conventional emulsions and can evolve through
coalescence and sedimentation (Foster et al., 1997). For instance, it has been established that in the
case of 10 wt% skim milk powder/0.32 wt% locust bean gum, demixing occurs only 1 minute after
ending stirring at the microscopic scale (Schorsch et al., 1999).
A second event that can interfere with phase separation is the gelation of one or both phases.
Generally gelation is governed either by temperature as for example in the case of heat-treated whey
proteins or cold setting gels of carrageenan and gelatin, or by acidification of the proteins (Renard et
al., 2006; Michon et al., 2010). In that specific case, the process of protein acid-induced gelation leads
to a network of casein strands aggregated through iso-electric precipitation. The pH kinetics decrease
can be controlled by GDL addition, the progressive hydrolysis of which highly depends on
temperature (Heertje et al., 1985; Lucey et al., 1997; Lee & Lucey, 2004) and mimics the
acidification kinetics obtained by a bacterial culture.
Recently, emphasis has been put on the understanding of the interplay that occurs between the
thermodynamic driving force of the phase separation and the kinetics of gelation (Norton & Frith,
2003; Lundin et al., 2000). Indeed, most of the systematic studies concerning kinetical trapping of
168
phase separation by gelation process have involved whey protein (de Jong et al., 2009; Rediguieri et
al., 2007; Syrbe et al., 1998) or gelatin or carrageenan gelation (Lorén & Hermansson, 2000; Lorén &
Hermansson, 2003; Wolf et al., 2001). Working on gelatin / maltodextrin mixtures, Lorén et al.
(1999) and Lundin et al. (2000) showed that the residence time in the temperature domain where the
phase separation competed with the gel formation determined the morphology of the resulting
microstructure.
On the contrary, relationship between acid-induced gelation and phase separation processes
going on in a neutral polysaccharide / casein mixture, and the ultimate morphology of the gelled
phase, has received less attention. While concentrations of polysaccharides as low as 0.1 wt%
affected the microstructure of mixed acid milk gels with a compaction of the network (Sanchez et al.,
2000; Aichinger et al., 2007), addition of high concentrations led to trapped compact micellar
aggregates dispersed in a polysaccharide-enriched continuous phase (Everett & McLeod, 2005;
Perrechil et al., 2009). To our knowledge, the effects of the combined phase separation and gelation
kinetics on stirred guar gum / acid milk gels have so far never been investigated and therefore merit
further attention.
The objective of the current study was to illustrate how, by changing the acidification
temperature, and thus the acidification rate, it is possible to play on the relative phase separation and
gelation kinetics which led to design a wide range of morphologies in stirred guar gum / acid milk
gels. For this purpose, phase separation process was followed using confocal microscopy and a light
backscattering technique. Moreover, gels prepared at various acidification temperatures were
characterized based on microstructure. The morphologies were discussed on the basis of the
understanding of the interplay between phase separation and gelation.
2. Materials and methods
2.1. Preparation of the mixed gels
Skim milk with 46 g.kg-1 protein was reconstituted by dispersing low-heat skim milk powder
(CH low heat, Ingredia, Arras, France) in Milli-Q water under continuous stirring for 1 h at room
temperature. Higher protein content than conventional milk was used as it is mostly applied for
industrial low-fat yoghurts in order to avoid syneresis. To ensure complete hydration, skim milk was
kept overnight at 4°C. Then, milk was heated at 80°C for 7 min in water baths. After cooling down to
60°C, dry powdered guar gum (Viscogum MP, Cargill, USA) was added to the milk to a final
concentration of 0.3 wt%. The mixture was stirred for a further 30 min at 60°C in order to completely
169
solvate guar gum. Then, the temperature was adjusted to the acidification temperature, ranging from
30°C to 60°C. Before acidification, all the mixtures were at a pH of around 6.7.
Gelation of the mixed systems was induced by the addition of glucono-δ-lactone (GDL) (Sigma
Chemicals, St Louis, MO, USA). This lactone hydrolyses slowly in aqueous solution and thereby
gradually reduces the pH of the milk. Skim milk was acidified by addition of 1.5 wt% GDL to the
milk while kept at a temperature of 30°C to 60°C. Immediately after the GDL addition, 30 mL of the
mixture was poured into plastic cylinders (30 mm diameter X 65 mm height) and placed in an
incubator. The pH was measured in the meantime with a pH-meter Consort D130 multiparameter
analyzer (Turnhout, Belgium). When a pH value of 4.6 (±0.05) was obtained, the set acid milk gels
were immediately stored at 4°C overnight until required analysis. For stirred acid milk gels
preparation, the set gels were quickly cooled down in cold water bath to 20°C in order to slow down
drastically the pH decrease. Then, the gels were sheared by passing through two successive plastic
pipes (length: 40 cm and internal diameter: 7 mm; length: 100 cm and internal diameter: 3 mm) with
a mesh of 500 µm holes at the end while pushed by a Masterflex® peristaltic pump (Cole Parmer,
Vernon Hills, USA) at 380 mL.min-1. Gels containing large particles were stirred in the two pipes
without the final mesh to obtain a homogeneous stirred gel but to avoid the disruption of big protein-
enriched micro-gels. After stirring, stirred gels were immediately stored at 4°C overnight to avoid
post-acidification.
2.2. Instrumental characterization
The phase separation was followed using a Turbiscan LAB® (Formulaction, France). A non-
acidified 0.3 wt% guar gum / skim milk mixture was poured in glass tubes (diameter 27.5 mm) at a
temperature varying from 30 to 60°C. Backscattering values at 880 nm were acquired every 40 µm
along a 40 mm height of sample at different time intervals.
For phase separation observations, milk samples (4 mL) were poured in glass tubes (inner
diameter 6.1 mm). The milk was either left to phase separate for 5 h for the non-acidified mixture, or
it was acidified at temperature ranging from 30°C to 60°C until a pH of 4.60 (±0.05). Then the
samples were stored at 4°C overnight before analysis. The values of height fractions of supernatant
were calculated as the ratio of the height of top layer (H) to the total height of the sample (H0).
Sample heights were detected using a Turbiscan Classic MA 2000® (Formulaction, France).
Confocal microscopy was used to observe the phase separation process along the time in a
0.3 wt% guar gum / milk mixture at 60°C after addition of 1.5 wt% GDL. A rheo-optical device
170
(RheOptiCAD®, CAD Instruments, France) (Boitte et al., 2013) was fitted on an inverted confocal
laser scanning microscope (CLSM) (Leica TCS AOBS SP2 (Leica, Germany)). By using this device,
parallelism and planarity of the slides were ensured, as well as a defined gap width of sample of
3 mm. Stacks in the Z direction were performed at different time intervals and an image profile was
then reconstituted from each stack. It allowed observing settling droplets with elongated profiles.
Proteins were stained by addition of DyLight 549 (20 µL in 1 g of sample) which was excited using a
helium-neon laser with wavelength 543 nm and the fluorescence was detected with a photomultiplier
ranging from 570 to 620 nm.
Epifluorescence microscopy was used to visualize the microstructure of the stirred mixed gels.
Nile Red was dispersed in the samples (25 µL in 1 g of sample) in order to stain the proteins. Then
the samples were placed on a microscope slide with a glass coverslip on the surfaces. Images were
acquired using an Olympus BX51 microscope (Olympus America, Lake Success, NY).
To characterize the morphology of the structures obtained, their length and width were
measured manually from optical microscopy images and repeated 10 times for each image.
Depending on the image magnification, the smallest particle dimension in the measurements was 15-
20 µm. When the width was not constant along the whole particle length, mean was performed. Care
was taken to ensure that the preparation of the microscope slides had not damaged the particles.
3. Results
3.1. Phase separations in guar gum / milk mixtures at neutral pH and depending on
temperature
A 0.3 wt% guar gum / milk mixture was examined prior to acidification, with the aim of
characterizing the phase separation kinetics and the resulting phase volumes. The phase diagram
established by Bourriot et al. (1999) showed that addition of 0.3 wt% guar gum in casein micelles
dispersions induced phase separation by depletion-flocculation effects. Consistent with this study, our
visual observations indicated that, at this concentration of guar gum, a two-phase system formed, one
top phase enriched in guar gum while the bottom phase was enriched in proteins.
To examine the microstructure during the demixing process confocal microscopy was used.
Previous studies have shown the rapid evolution of phase separation of a mixture of two incompatible
biopolymers just after the mixing of the system (Nono et al., 2011; Schorsch et al., 1999; Foster et al.,
171
1997). However, images were performed in the X and Y plane which means that the coalescence
process could be followed but not the sedimentation phenomenon.
160 µm
0h 0.03 h 0.1 h 0.2 h 0.5 h

Figure 99. CLSM images profiles in Z-direction along a 160 µm height from the bottom slide of a 0.3 wt% guar
gum / milk mixture just after GDL addition at 60°C. The evolution of the system from left to right took around 0.5 h.
Times given on the figure are indicative.
Figure 99 depicts the sedimenting process of a 0.3 wt% guar gum / milk mixture with 1.5 wt%
GDL at 60°C during 30 min after ending stirring. Proteins appear in white owing to the fluorescence
of DyLight 549 while the dark areas correspond to zones devoid of protein, thus containing mostly
guar gum. The laser excitation decreased as it got away from the bottom cover slide, which was
responsible for the appearance of a protein-depleted zone at the top of the sample. Therefore,
emphasis has been put on the description of the lower part of the sample. As previously reported in
the case of skim milk / guar gum systems (Bourriot et al., 1999b; Tuinier et al., 2000; Spyropoulos et
al., 2010), a water-in-water emulsion system was observed with protein-enriched droplets dispersed
in a guar gum continuous phase. At initial time, rather small droplets are concentrated near the bottom
slide while the top of the sample is much less concentrated in protein. However, after few minutes,
noticeable signs of coalescence appeared as the droplet sizes strongly increased to reach around
100 µm. Moreover, the non-spherical shape of the droplets provides evidence of a non-equilibrium
state resulting from recent coalescence. Then, the concentrated packed bed of protein-enriched
droplets are coalescing to form a sediment layer, thus not maintaining their individual droplet shapes.
As new droplets approached the packed sediment layer, they collided and coalesced which
contributed to increase the sediment layer along the time. Therefore, microstructural observations
during sedimentation of protein-enriched droplets confirmed that phase separation is a kinetic process
and that it could be followed in experimental time scale.
172
Droplet Sediment
sedimentation layer
25 25
a 20
Time (h) b
0
0.1 20
15
0.2
10 0.4
0.5 15
5 1
0
10
-5
-10 5
-15
-20 0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
Figure 100. (a) ∆ Backscattering values of a non-acidified 0.3% guar gum / skim milk mixture along its height in a
glass tube over the time at 60°C; (b) Maximum value of ∆ Backscattering at the bottom of the tube as a function of
time. Dotted lines correspond to the time of the beginning of droplet sedimentation (0.12 h) and appearence of
continuous sediment layer (0.4 h).
Another way of studying the phase separation kinetics is to use a light backscattering technique.
Figure 100 shows the variation of ∆ Backscattering for a non-acidified 0.3 wt% guar gum / skim milk
with 46 g.kg-1 of protein mixture along the height of the sample, at 60°C, over different times.
Profiles were compared to the control corresponding to time 0 h. From the first minutes of
measurements, the ∆ Backscattering level decreased at the top of the sample (right part of the graph)
while it increased drastically at the bottom of the sample (left part of the graph) (Figure 100a).
However, after 0.4 h, the ∆ Backscattering intensity at the bottom reached a maximum value of
approximately 23% and remained constant with time (Figure 100b). This steady value can be
attributed to the formation of a sediment layer at the bottom of the sample, the height of which
increased up to 7.5 mm after 1 h.
By using multi-scale techniques, the macroscopic phase separation kinetics can be related to a
microstuctural change. It should be noted that a modification in backscattering may be due to either a
change in droplet size or protein concentration. It seems reasonable to suggest that the increase in
backscattering intensity at the bottom may be consecutive to a protein concentration increase due to
droplet sedimentation and coalescence. This is in good agreement with the confocal images profiles
showing a gradient of protein-enriched droplet concentration a few minutes after mixing. The
sedimentation process follows Stokes’ law and therefore depends on droplet size and density and on
continuous phase viscosity. Moreover the formation of the sediment layer is driven by the possibility
173
of coalescence of the droplets (Foster et al., 1997). Due to the very low interfacial tension of the
water-in-water emulsion systems (Frith, 2010; Tolstoguzov, 2003) and the high probability of
collision of the packed droplets, the droplets can easily coalesce to form the sediment layer.
Consequently, two key times for phase separation process can be identified: the beginning of the
droplet sedimentation (time 1) and the beginning of the formation of the sediment layer defined at the
time where the ∆ Backscattering level varied less than 10% (time 2), that is to say 0.12 h and 0.4 h,
respectively, in the example presented in Figure 100b.
3.2. Interplay between phase separation and gelation
Although the phase separation process in guar gum / milk mixture has received attention in the
last years (Bourriot et al., 1999b; Tuinier et al., 2000), little is known about the use of polysaccharides
such as guar gum during the acid-induced gelation. Indeed, gelation could interfere with the ongoing
phase separation process and produce different microstructures depending on their relative kinetics.
Acid milk gels were prepared at temperatures ranging from 30°C to 60°C in order to modify the
gelation kinetics for a given guar gum / milk mixed system.
The effects of the temperature on phase separation were studied by determining the
∆ Backscattering variations of a 0.3 wt% guar gum / milk mixture at neutral pH and during gel
formation (Figure 101). For the non-acidified mixtures, the ∆ Backscattering kinetics showed the
same profiles for temperatures varying from 35°C to 60°C with a sharp increase in ∆ Backscattering
intensity followed by a constant value (thin black curves, Figure 101a-d). As shown in Figure 100b,
the phase separation kinetics was defined with the times where the first signs of droplet sedimentation
and formation of a sediment layer were observed. Those two times determined for the non-acidified
mixtures at various temperatures were reported in Figure 101 (arrows 1 and 2, respectively). When
increasing the temperature from 35°C to 60°C (Figure 101a to d, respectively), a shift of the phase
separation kinetics to shorter times was detected. One explanation of this behavior could be the
decrease in viscosity of the mixture at higher temperatures. Moreover, it is likely that the increasing
thermal agitation from 35°C to 60°C may also accelerate the frequency of droplet collision and
therefore promoted coalescence and sedimentation. Thus, it is important to note that following
Stokes’ law, the sedimentation rate depends on the viscosity of the continuous phase as well as the
droplet size.
174
30 6.5 30 6.5
a c
2
25 2 25
6.0 6.0
20 20
pH
pH
15 5.5 15 5.5
1
10 10
1 5.0 5.0
5 5
0 4.5
b d 0
2
4.5
25 2 25
6.0 6.0
20 20
pH
pH
15 5.5 15 5.5
1 1
10 10
5.0 5.0
5 5
0 4.5 0 4.5
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6
Time (h) Time (h)
Figure 101. Variation of maximum value of ∆ Backscattering at the bottom of the tube as a function of the time in
guar gum / milk mixtures at neutral pH (thin curves) or after GDL addition (bold curves) and pH kinetics (dotted
curves) at (a) 35°C; (b) 43°C; (c) 47°C; (d) 60°C. The first arrow indicates the time of beginning of droplet
sedimentation and the second one the beginning of the formation of the sediment layer refering to the mixture at
neutral pH. The dotted line corresponds to the time of gel formation at pH 5.2.
On addition of GDL to the milk, the pH decreased progressively (dotted curves, Figure 101a-d),
which led to a destabilization of the casein micelles in the form of a continuous gel network
classically defined around pH 5.2 ± 0.1 (Lucey et al., 1997). Dotted lines in Figure 101a-d exhibit the
time needed for the mixture to reach this pH and thus to gel. A clear decrease in gelation time was
observed when the acidification temperature increased from 35°C to 60°C. For instance, the pH of gel
formation was reached after 0.8 h at 35°C while gelation needed only 0.12 h to occur at 60°C. It is
well established that GDL hydrolysis strongly depends on temperature and that the rate of hydrolysis
increases at higher temperatures (Lucey et al., 1997).
The values of ∆ Backscattering at the bottom of the sample were acquired during acidification
of a 0.3 wt% guar gum / milk mixture at temperatures ranging from 35°C to 60°C (bold curves,
Figure 101a-d). Though initial ∆ Backscattering profile of the guar gum / milk system acidified at
175
35°C shows similar features as the same mixture at neutral pH, a progressive increase in intensity
appeared after 0.8 h (Figure 101a). On the contrary, the profiles acquired for the mixtures acidified at
43°C, 47°C and 60°C were only superimposed to the non-acidified mixture at the initial stages of the
phase separation process (Figure 101b, c and d). For those three acidification temperatures, a
maximum of ∆ Backscattering intensity followed by a subsequent decrease was observed. The higher
the acidification temperature, the lower the increase of ∆ Backscattering values. At all studied
temperatures, a clear modification of the ∆ Backscattering slope appeared at the gel point indicated by
the dotted lines corresponding to pH 5.2. Thus, gelation is responsible for the alteration of the
∆ Backscattering intensity. The subsequent decrease in ∆ Backscattering values after the onset of
gelation may be due to the presence of a guar gum-enriched continuous phase surrounding the micro-
gels during and/or after the network formation, resulting in a different interaction of the system with
light and therefore contributing to a decrease in backscattering value.
In order to discuss the variation of ∆ Backscattering obtained for various acidification

temperatures, it is important to understand the interplay between phase separation and gelation
process. Therefore, the key times corresponding to the beginning of phase separation and gel
formation were reported in Figure 102 as a function of the acidification temperature. Using the
relative timescales for phase separation and gel formation, three kinetic zones were determined.
1.2
Zone I Zone II Zone III Gel formation
Sep > Gel Sep ∼ Gel Sep < Gel Droplet sedimentation
1.0 Sediment layer
0.8
Time (h)
0.6
0.4
0.2
0.0
30 35 40 45 50 55 60
Acidification temperature (°C)
Figure 102. Kinetics of gel formation, droplet sedimentation and formation of the sediment layer of a 0.3 wt% guar
gum / milk mixture acidified at acidification temperature varying from 30°C to 60°C. Dotted lines delimited the three
different zones of kinetics of phase separation in connection with gel formation. Lines are drawn to guide the eyes.
Standard deviations are obtained from triplicate.
176
The first zone comprises mixtures acidified at temperatures below approximately 43°C. From
the ∆ Backscattering profiles at 35°C (Figure 101a), it is possible to notice that in case of addition of
GDL or at neutral pH, a sediment layer formed after 0.5 h as illustrated by a stationary
∆ Backscattering level. As a consequence, the phase separation occurs long before and independently
of the gel formation. On the contrary, in the third zone above 50°C, gelation proceeds faster than
extensive droplet sedimentation and sediment layer formation. However, a slight increase in
∆ Backscattering intensity up to 0.12 h was observed in the mixture acidified at 60°C (Figure 101d).
Therefore, there was a short time delay for the droplets to begin to coalesce and sediment before the
gelation occurred. This is consistent with the confocal microscopy observations (Figure 99), since
only some droplets located on the lower part of the sample could coalesce and sediment. The very
beginning of the sediment layer formation was detected earlier at the microscopic scale due to the
40 µm accuracy of the light backscattering technique. In between, an intermediate temperature zone
including mixtures prepared from 43°C to 50°C can be defined. Acidification at 43°C constituted a
particular case where the time of gel formation corresponded exactly to the beginning of the
apparition of the sediment layer (Figure 101b and Figure 102). Then, as the acidification temperature
went up, the increase in ∆ Backscattering was arrested at different stages by the onset of gelation
(Figure 101b and c). As a result, for the systems belonging to this second zone, the sedimentation of
the droplets competes with the gel formation.
3.3. Properties of set and stirred guar gum / acid milk gels
3.3.1. Phase separation behavior
Evidence of phase separation at the macroscopic level was clearly seen in non-acidified
mixtures and gels prepared at different temperatures. Figure 103a and b report the phase volume of
the different phases. Using a light backscattering technique, sample heights could be detected more
precisely than with visual observations with an accuracy of 0.5 mm. In the case of non-acidified
mixtures, two distinct phases were formed after 4 h at temperatures varying from 30°C to 60°C
(Figure 103a). The top guar gum-enriched phase occupied a significantly higher volume than the
bottom protein-enriched one. It is important to state that the temperature had only a slight effect on
the height fraction of supernatant. Thus, similar values of top phase around 0.7 were found for all the
temperatures which shows that all the systems had reached their thermodynamic equilibrium after 4h.
Whatever the temperature, depletion effects between non-acidified milk proteins and guar gum gave
177
rise to the formation of a protein-enriched sediment layer near the equilibrium conditions (Bourriot et
al., 1999b; Tuinier et al., 2000).
1.0 1.0 Supernatant

a b Droplets
0.8 0.8 Sediment layer
0.6 0.6
H/H0
H/H0
0.4 0.4
0.2 0.2
0.0 0.0
30 35 40 45 50 55 60 30 35 40 45 50 55 60
Temperature (°C) Acidification temperature (°C)
Figure 103. Height fraction of the phases analyzed after storage at 4°C overnight of (a) a non-acidified 0.3 wt% guar
gum / milk mixture; (b) 0.3 wt% guar gum / milk acid milk gels acidified at temperatures varying from 30°C to
60°C. The three different zones of kinetics of phase separation in connection with gel formation are shown.
Figure 103b shows the different phase volume fractions of set guar gum / acid milk gels
acidified at temperatures ranging from 30°C to 60°C. In comparison to the systems at neutral pH,
three distinct phases were detected in systems acidified at temperatures below 43°C. Moreover, set
mixed gels prepared above 43°C were biphasic with a mix of whey and guar gum-enriched top phase
and a bottom phase corresponding to the gelled protein-enriched phase. However, it should be noted
that this bottom phase exhibited a different aspect from the sediment layer detected in the non-
acidified mixtures. Those phase behaviors have to be related to the phase separation phenomenon
observed during acidification in non-equilibrium conditions (Figure 101a-d and Figure 102). For the
acidified mixtures belonging to the first zone at temperatures below 43°C (Figure 102), a large
number of droplets had time to grow by coalescence and sediment to form a bottom protein-enriched
layer before gelation occurred. In contrast, the formation of the sediment layer was prevented by the
early gelation of the protein-enriched droplets in set gels acidified at temperatures above 43°C. This
result is clearly consistent with the sudden arrest of the increase of ∆ Backscattering at gel point
previously shown in Figure 101b, c and d. Therefore, gelation had the effect of stopping the
formation of the sediment layer and the droplet sedimentation and thus froze the evolving system at
an intermediate stage.
178
3.3.2. Microstructures of stirred acid skim milk / guar gum gels
The knowledge of the relative kinetics of gelation and phase separation is of critical importance for
the determination of the microstructure of mixed systems (Doublier et al., 2000; Lorén &
Hermansson, 2000; de Jong et al., 2009). Figure 104 illustrates the changes in microstructure of
stirred guar gum / acid milk gels acidified at temperatures ranging from 30°C to 60°C to a final pH of
4.6. The bright areas correspond to the protein phases whereas the dark background is enriched in a
mix of guar gum and whey. At low acidification temperatures (i.e. 30°C and 35°C), long protein-
enriched filaments of around 400 µm were dispersed in a guar gum continuous phase. However, as
the temperature of gel preparation increased, the sizes of the filaments decreased and small spherical
droplets appeared. High acidification temperatures such as 55°C and 60°C produced significant
changes in the morphology of the stirred gels with the aggregation of small droplets, giving an aspect
of a connected organization at this observation scale. It should be noted that micro-gels morphologies
were already formed in set gels and the subsequent stirring did not break or orient specifically the
micro-gels.
30°C 35°C 43°C
47°C 50°C 60°C
250 µm
Figure 104. Epifluorescence micrographs of stirred guar gum / acid milk gels acidified at various temperatures as
indicated in the figure until a pH of 4.6 and stored at 4°C overnight after stirring. Bars represent 250 µm.
To go further into detail, the droplet size characteristics expressed as mean length and width
were analyzed for stirred guar gum / acid milk gels prepared at temperatures varying from 30°C to
179
60°C (Figure 105). There was a clear tendency towards a decrease in droplet dimensions with
increasing acidification temperature, the length going from ca. 100 µm at 30°C and 35°C, to 50 µm at
temperatures higher than 47°C. The droplet geometry of the gel acidified at 43°C constituted an
intermediate case with a wide variety of micro-gels shapes, which is further supported by the error
bars reflecting the high variation of the particle lengths.
200
Length
Droplet dimension (µm)
Width
150
100
250 µm
50
0
30 35 40 45 50 55 60
Acidification temperature (°C)
Figure 105. Droplet length and width of guar gum / stirred acid milk gels acidified at temperatures varying from
30°C to 60°C to a final pH of 4.6 and morphology of the droplets as determined by optical microscopy. Error bars
represent the repetability over the analysis of a number of 10 particles. Experiments at 43°C were performed in
triplicate. Bars represent 250 µm.
This result, however, should not be over interpreted since the underlying image analysis data
are based on a limited number of particles. Therefore, the morphology of gelled droplets acidified at
different temperatures is visualized in Figure 105. Consistent with the high variation of the droplet
dimensions, it became clear that several categories of particle morphologies, from spherical to
filamentous, were identified. As the acidification temperature increased, smaller but much more
abundant spherical droplets appeared. This evolution of the spherical droplet dimension with the
acidification temperature is in good agreement with the time delay for the gelation to occur
(Figure 102). Indeed, the early gelation of the systems acidified at high temperatures prevented an
extensive droplet growth and coalescence.
Another droplet population comprises long filamentous morphology but a distinction

180
depending on the acidification temperature can be made. At high acidification temperatures (47°C
and 55°C), the elongated droplets appeared very thin but with a uniform width along the particle
length. On the contrary, the microstructures detected at 30°C showed larger gelled droplets with
asymmetric morphologies, i.e. rather thin main droplet bodies with a very large protein-enriched end.
High temperatures promoted thermal agitation and thus increased coalescence rates which
probably made the droplets spin more easily. In fact, creation of anisotropic gel structures including
ellipsoidal morphologies and long extended fibres in water-in-water emulsions has previously been
reported (Tolstoguzov, 1991; Wolf et al., 2001; Norton & Frith, 2001). However, in those studies,
deformation was obtained by applying a controlled shear flow superimposed on gelation of the
dispersed phase. In the 0.3 wt% guar gum / milk mixtures studied here, dispersed protein-enriched
droplets can greatly deform to an extent which depends on the stresses such as thermal agitation, the
properties of the two phases and the interface, as illustrated by the non-spherical droplets in
Figure 99.
The asymmetry of the droplet morphologies produced at low acidification temperatures may be
mainly attributed to the effect of gravity. For those systems, the droplet evolution through
coalescence and sedimentation prior to protein gelation is evident (Figure 101a). Thus, if droplet
gelation occurs in a non-equilibrium state, the unstable morphology is kinetically trapped while
maintaining its shape. Moreover, it has been shown that increasing the gravitational force produced
enough energy to distort the droplets, which had the effect of making the droplets spin by increasing
particle deformation, without promoting break-up or coalescence (Rohart & Michon, 2014). Finally,
heterogeneity of the droplet morphologies for different acidification temperatures originates not only
from the relative timescale of phase separation and gelation, but also probably from the effect of
thermal agitation and/or gravitational forces.
Conclusion
The present study was undertaken to gain a better understanding of the combined effects of
phase separation and gelation on the structure of a water-in-water emulsion. Confocal microscopy and
a light backscattering technique were found to be useful in determining the kinetics of phase
separation and gel formation. By changing the acidification temperature, and thus acidification rate of
a guar gum / milk mixture, three kinetic zones were defined based on a comparison of time between
phase separation and gelation. High acidification temperatures gave rise to small protein-enriched
droplets that were trapped by the early acid-induced protein gelation. On the contrary, there was a
181
time delay for the droplets in the systems acidified at low temperatures to coalesce and sediment.
Then, gelation can stop the sedimentation process in a non-equilibrium state. However, a gradient in
the vertical direction is formed and long protein-enriched filaments can be created. The two
mechanisms inferred to explain the droplet extension are thermal agitation and the effect of gravity.
Knowledge of the relative phase separation and gelation kinetics allows the design of a wide range of
morphologies, from spherical to elongated, which could be linked to sensory perception.
Acknowledgements
pole, DGCIS and local authorities with the financial support of OSEO and FEDER.
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Par un effet combiné d’une séparation de phases et de la gélification acide des protéines de lait,
différentes morphologies de gels brassés ont pu être créées. Sur la base d’une variation de la
température d’acidification, la cinétique de sédimentation de gouttelettes riches en protéines a pu être
modifiée et a été suivie au moyen de la microscopie confocale et d’une technique de rétrodiffusion de
la lumière. En confrontant les temps respectifs de sédimentation des gouttelettes et de formation du
gel acide, trois zones cinétiques ont été délimitées en fonction de la température d’acidification. La
morphologie des gels brassés acidifiés à différentes températures a été discutée en fonction de ces
cinétiques relatives. Ainsi, des micro-gels sphériques d’une taille inférieure à 50 µm dispersés dans
une phase continue riche en guar ont été obtenus aux températures d’acidification élevées, ce qui
laisse supposer que la gélification a eu lieu avant que les phénomènes de coalescence et de
sédimentation des gouttelettes ne prennent de l’ampleur. Au contraire, de faibles températures
d’acidification favorisent une coalescence et une sédimentation des gouttelettes et donnent naissance
à de longs filaments d’environ 100 µm. A l’origine de l’allongement des structures se trouve
vraisemblablement un effet de gravité, mais aussi d’agitation thermique. Un ensemble de
microstructures composées de micro-gels de forme sphériques à filamenteuses a été élaboré par un
effet de compétition entre les phénomènes de séparation de phases et de gélification. Ces
morphologies originales pourraient non seulement générer des propriétés rhéologiques particulières,
mais également modifier de façon majeure la perception sensorielle de ces produits.
184
I.2. Modification de l’histoire thermique avant gélification

Les résultats précédents ont permis d’illustrer la manière dont la température et le procédé de
gélification modifient le comportement de séparation de phases de biopolymères. En effet, l’influence
de la température est à prendre en considération lors de l’évaluation de la vitesse de sédimentation des
gouttelettes avant leur gélification. Par ailleurs, il est important de rappeler que la vitesse d’hydrolyse
de la GDL est très dépendante de la température du milieu.
L’élaboration de différents cycles thermiques permet d’une part de modifier la vitesse de

séparation de phases et d’autre part, de décaler le moment de formation du gel acide. Dans ce cadre,
des mélanges lait / guar à 0,3% additionnés de 1,5% de GDL ont subi une succession d’étapes de
températures différentes. A titre d’exemple, la Figure 106a présente les cycles thermiques appliqués à
un système donné : après ajout de la GDL à 22°C, la température a rapidement été diminuée jusqu’à
8°C puis le mélange non acidifié a été maintenu à cette température de 0 h à 4 h. Suite à ce stockage à
faible température d’une durée variable, la température des mélanges a été augmentée jusqu’à 43°C.
Parallèlement aux transitions de température, le pH des mélanges a évolué. Lors du maintien

des systèmes à 8°C, la chute du pH a été considérablement ralentie avec moins de 0,5 unité pH de
variation en près de 4 h. En revanche, le passage de 8°C à 43°C a contribué à une diminution
soudaine du pH, responsable de la formation du gel vers le pH de 5,2. Les profils de température et
d’acidification indiquent que le stockage des systèmes à basse température constitue une approche
particulièrement intéressante pour décaler le point de gélification. Ainsi, la formation du gel se
produit après un peu plus d’une heure lors d’un maintien de 30 min à 8°C alors que plus de 4 h 30
sont nécessaires pour atteindre le pH critique de gélification du système ayant séjourné 4 h à 8°C.
185
7,0 45 Temps à 8°C (h)

a 0 min
40
30 min
6,5
Température (°C)
35 1h
30 2h
6,0 3h
25 4h
pH
20
5,5
15
5,0 10
5
4,5 0
0 1 2 3 4 5 6 7
Temps (h)
b 0h 0,5 h 1h 2h 3h 4h
500 µm
Figure 106 : (a) Cinétiques de pH (en noir) et cycles de température (en gris) de mélanges lait / guar à 0,3%
additionnés de 1,5% de GDL ; (b) Aspects macroscopiques des différentes phases des gels à pH 4,6 avant leur
brassage (les pointillés gris délimitent la zone riche en guar de la zone riche en micro-gels, les pointillés noirs, la
zone riche en micro-gels de la couche de sédiment) ; (c) Gels brassés acides enrichis en guar à 0,3% à pH 4,6
correspondant à un temps de 0, 1, 2 ou 4 h passé à 8°C observés en microscopie optique. Les barres représentent
500 µm. Les gels présentant des structures fibrillaires de taille trop élevée ont été brassés par passage à travers les
deux tuyaux.
En fonction des cinétiques de température et de pH appliquées aux différents systèmes, les

propriétés des gels acides avant et après leur brassage varient. A l’échelle macroscopique, l’ensemble
des gels non brassés est composé de trois phases : une phase inférieure riche en protéines, une phase
supérieure riche en guar et une phase intermédiaire constituée principalement de micro-gels enrichis
en protéines (Figure 106b). Cependant, une évolution de la fraction des phases en présence peut être
mise en évidence en fonction du cycle thermique appliqué. Alors que la phase intermédiaire riche en
micro-gels protéiques tend à diminuer, le sédiment riche en protéines et le surnageant de guar
186
augmentent de manière importante, lorsque le temps passé à 8°C avant gélification est élevé.
L’ensemble des mélanges ayant subi la même étape d’augmentation de la température jusqu’à 43°C,
les différences observées s’expliqueraient donc par le temps de maintien des mélanges à 8°C. Quelle
que soit l’histoire thermique, la coalescence et la sédimentation des gouttelettes n’ont pas pu être
évitées, en raison de l’évolution de l’émulsion eau dans eau et de la séparation de phases
microscopique très rapide. Puisque le temps de formation du gel a été décalé du fait du stockage à
8°C, l’intervalle de temps entre le début de la séparation de phases et la gélification a été augmenté.
Dans cette situation, un nombre plus important de gouttelettes a eu la possibilité de sédimenter et de
former la couche de sédiment avant que la gélification acide ne fige le système.
La morphologie des gels acides brassés obtenus après les différents cycles thermiques est
présentée sur la Figure 106c. De longs filaments mélangés à des micro-gels sphériques de taille plus
petite sont visibles dans les systèmes ayant séjourné de 0 à 1 h à 8°C. Néanmoins, plus le temps de
stockage à basse température augmente, plus l’allongement des structures semble s’atténuer et des
zones sombres, correspondant au sédiment riche en protéines, apparaissent. Deux explications
peuvent rendre compte de ces observations microscopiques. D’une part, la vitesse de gélification
détermine le moment auquel les microstructures ont été piégées par la formation du gel. D’autre part,
malgré une mobilité des constituants réduite par une haute viscosité et une faible agitation thermique,
le maintien à 8°C pendant un temps long a contribué à la coalescence des gouttelettes riches en
protéines. Ensuite, l’étape de montée en température à 43°C a conduit à une diminution de la
viscosité du milieu avant la formation du gel, favorisant la sédimentation des gouttelettes de grande
taille sous la forme de filaments par un effet de gravité et d’agitation thermique. Ainsi, la possibilité
d’évolution des microstructures avant leur gélification dépend non seulement de l’intervalle de temps
disponible entre le début de la séparation de phases et de la formation du gel, mais également de
l’histoire thermique subie par le système.
Afin d’illustrer de manière plus exhaustive l’effet de l’histoire thermique sur le comportement
de phases, un ensemble de gels mixtes acidifiés à l’aide de 1,5% de GDL a subi différentes étapes
thermiques : soit un stockage à 8°C ou 22°C pendant un temps allant de 0 h à plusieurs heures puis
une montée à 43°C permettant la formation du gel, soit un maintien pendant toute la durée de
l’acidification à une température fixe d’une gamme comprise entre 30°C et 60°C. Les hauteurs
relatives des phases de ces différents gels ont été regroupées sur la Figure 107a et b.
187
a 1,0 Surnageant b 0,30 Histoire thermique

Micro-gels 8°C puis 43°C
Sédiment 0,25 22°C puis 43°C
0,8 30 et 35°C
H/H0 (sédiment)
43°C
0,20 47 et 60°C
0,6
H/H0
0,15
0,4
0,10
0,2
0,05
0,0 0,00
0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5
Temps de gélification (h) Temps de gélification (h)
Figure 107 : (a) Hauteurs relatives de chaque phase ; (b) Hauteurs relatives de sédiment de gels acides enrichis en
guar à 0,3% à pH 4,6 avant leur brassage ayant subi différentes histoires thermiques lors de leur acidification. Le
temps de gélification correspond au temps nécessaire pour atteindre un pH de 5,2.
Les hauteurs de sédiment, de micro-gels et de surnageant semblent varier relativement

linéairement en fonction du temps de gélification. Ainsi, l’augmentation du temps nécessaire à la
formation du gel permet aux gouttelettes de sédimenter et de former une couche inférieure riche en
protéines. La quantité de protéines disponible pour la formation et la coalescence des gouttelettes tend
à diminuer aux temps de gélification longs, expliquant ainsi la diminution de la phase riche en micro-
gels et l’augmentation du surnageant enrichi en guar. Toutefois, une différence de l’évolution de la
couche de sédiment en fonction du temps écoulé avant la formation du gel peut être observée selon
les cycles thermiques (Figure 107b). Lorsque les systèmes ont été maintenus à une faible température
de 8°C ou 22°C avant l’augmentation de la température jusqu’à 43°C, la hauteur de sédiment formé
diminue, et cette tendance est d’autant plus prononcée que la température de stockage est basse. Ce
comportement peut être attribué à un effet combiné du décalage de la gélification vers des temps plus
longs et à la faible vitesse de sédimentation en lien avec une viscosité de la phase continue plus
élevée lors d’un temps passé à basse température avant la gélification.
En complément de l’étude du comportement macroscopique des phases, les microstructures ont

été caractérisées (Figure 108). En se basant sur la mesure de la longueur des micro-gels et sur les
observations microscopiques, une différence d’évolution des microstructures en fonction du temps de
gélification est mise en évidence selon les histoires thermiques subies par les systèmes. Comme
discuté dans le paragraphe I.1 de ce chapitre, un allongement des micro-gels a été observé lorsque la
température d’acidification diminue de 60 à 30°C, en raison de l’augmentation du temps de
gélification permettant une plus grande évolution des structures avant leur gélification. Par ailleurs,
l’application d’un cycle thermique incluant un passage à basse température à 8°C ou 22°C aboutit à
188
une taille de micro-gels très élevée, pouvant atteindre près de 250 µm. Cependant, un temps de
gélification supérieur à 1,25 h conduit à une diminution progressive de la longueur moyenne des
structures et à l’apparition de zones sombres dans les images de microstructure des gels brassés
correspondant à des morceaux de la couche de sédiment fragmentée par le brassage.
Sur la base des longueurs de micro-gels calculées en fonction du temps nécessaire à la

formation du gel, trois zones peuvent être délimitées. La première zone, comprenant des temps de
gélification entre 0 et 0,5 h, intègre les gels acidifiés aux hautes températures pour lesquels les
gouttelettes ont été figées par la gélification sous une forme sphérique et de petite taille. Au contraire,
des structures de taille supérieure à 100 µm apparaissent pour des temps de gélification compris entre
0,5 h et 1,25 h. Dans cette seconde zone, l’effet de l’histoire thermique est primordial et
l’allongement des structures est réalisé au travers de forces de gravité mais également de l’agitation
thermique, notamment lors de la montée en température à 43°C pour les mélanges ayant passé au
préalable un temps inférieur à 1,5 h environ à 8°C ou 22°C. Au-delà de 1,25 h de temps de
gélification, la taille des micro-gels tend à diminuer, ce qui laisse supposer qu’une quantité non
négligeable de protéines a sédimenté avant que les gouttelettes ne puissent être piégées par la
gélification acide. L’ensemble de ces résultats confirme qu’un équilibre subtil entre les débuts de
coalescence et de sédimentation des gouttelettes et la formation de la couche de sédiment est à trouver
afin de contrôler la morphologie des structures obtenues.
Finalement, la connaissance des cinétiques de températures et de gélification appliquées aux

différents systèmes permet d’expliciter en partie les propriétés des gels acides avant et après leur
brassage. En faisant varier les histoires thermiques appliquées aux mélanges avant et pendant leur
gélification, les effets de l’agitation thermique et de l’intervalle de temps compris entre le début de
sédimentation des gouttelettes et la formation du gel sur les microstructures ont pu être mis en
évidence. Outre le décalage du moment de formation du gel, la modification de la vitesse de
sédimentation des gouttelettes provoquée par un changement de température est également à prendre
en considération, la combinaison de ces deux paramètres sera abordée dans le chapitre 7.
189
250 µm
300
Histoire thermique
8°C puis 43°C
250 22°C puis 43°C
30 et 35°C
Longueur (µm) 200 43°C

47 et 60°C
150
100
50
0
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0
Temps de gélification (h)
Figure 108 : Longueurs des micro-gels au sein des gels brassés acides enrichis en guar à 0,3% à pH 4,6 ayant subi différentes histoires thermiques lors de leur
acidification. Les images ont été obtenues en microscopie optique. Le temps de gélification correspond au temps nécessaire pour atteindre le pH de 5,2. Les
barres représentent 250 µm. Les lignes en pointillés à 0,5 h et 1,25 h délimitent trois zones de longueur de micro-gels.
190
II. EFFET D’UN TRAITEMENT MECANIQUE
La modification de l’histoire thermique a mis en lumière que des niveaux de cisaillement aussi
faibles que ceux générés par des phénomènes de gravité ou d’agitation thermique permettaient une
déformation des gouttelettes. Par conséquent, la question de l’effet d’un cisaillement aux grandes
déformations sur les propriétés des gels mixtes acides se pose. Cette problématique a été traitée à
partir de mélanges lait / guar acidifiés à l’aide de l’utilisation de deux types de ferments. Après une
étude concernant l’influence de la concentration en guar sur la macrostructure des gels fermes
acidifiés à l’aide de ferments, l’effet du cisaillement sur les macro- et microstructures et les propriétés
rhéologiques des gels mixtes a été étudié en utilisant une concentration en guar fixe de 0,25%.
En comparaison avec une acidification à l’aide de GDL, les cinétiques de pH obtenues lors de
l’acidification du lait par des ferments à 43°C présentent un temps de latence pendant lequel la faible
production d’acide lactique par les bactéries n’engendre pas de changement majeur de pH (Figure 109
et Figure 68). A travers les variations de souches bactériennes, l’activité acidifiante des ferments peut
être modifiée. A titre d’illustration, le temps de latence particulièrement élevé du ferment 1 conduit à
un décalage de la gélification vers 4 h alors que moins de 3 h sont nécessaires à la formation du gel
laitier acidifié par le ferment 2. Il est à noter que les ferments 1 et 2 utilisés dans le cadre de cette
étude produisent peu ou pas d’exopolysaccharides, les différences entre ferments liées à cet effet ne
seront donc pas discutées ici.
7,0
Ferment 1
Ferment 2
6,5
6,0
pH
5,5
5,0
4,5
0 1 2 3 4 5 6
Temps (h)
Figure 109 : Cinétiques de pH des mélanges lait / guar à 0,25% acidifiés à l’aide du ferment 1 ou 2 à 43°C. Le pH de
gélification de 5,2 est rappelé par la ligne grise.
191
La méthode d’acidification utilisée influence non seulement la cinétique de diminution de pH,

mais aussi les propriétés macroscopiques des gels mixtes avant leur brassage (Figure 110). A la
différence des gels acidifiés à l’aide de GDL, la hauteur de surnageant des gels obtenus par l’action
du ferment 1 suit une évolution très proche du système non acidifié lorsque la concentration en guar
augmente. Ce comportement peut s’expliquer par le temps nécessaire à la formation du gel d’environ
4 h, qui est donc du même ordre de grandeur que celui laissé au mélange lait / guar pour que les
gouttelettes riches en protéines coalescent et forment la couche de sédiment. Par conséquent, la
gélification tardive du système acidifié par les ferments, en raison de la présence d’un temps de
latence élevé, favorise la formation d’une couche de sédiment avant le piégeage des structures.
1,0
0% GDL
1% GDL
1,5% GDL
0,8 2,5% GDL
Ferment 1
0,6
H/H0
0,4
0,2
0,0
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
Figure 110 : Hauteurs relatives de surnageant des gels fermes à pH 4,6 contenant de 0% à 0,5% de guar acidifiés
avec 1%, 1,5%, 2,5% de GDL ou avec le ferment 1 à 43°C. Les hauteurs relatives de surnageant des mélanges lait /
guar de 0% à 0,4% sans ajout de GDL obtenues après 4 h à 43°C sont rappelées en pointillés.
De manière à écourter le temps disponible à la sédimentation des gouttelettes riches en

protéines, un cisaillement à 500 rpm sous agitation magnétique a été appliqué en continu jusqu’à un
pH déterminé au cours de l’acidification du système lait / guar à 0,25% additionné du ferment 1 ou 2.
Même si l’application d’un cisaillement continu peut considérablement affecter voire empêcher
l’action de certains ferments, les cinétiques d’acidification des ferments 1 et 2 utilisés dans le cadre
de cette étude ne semblent pas avoir été modifiées de façon majeure (résultats non montrés). L’aspect
macroscopique des gels mixtes acides avant leur brassage est présenté sur la Figure 111a.
192
Cisaillement jusqu’au pH indiqué

puis fin d’acidification jusqu’à pH 4,6
a
6,7 5,8 5,5 5,4 5,3 5,2 5,0
Ferment 1
6,7 5,7 5,5 5,4 5,3 5,2 5,0
Ferment 2
b 1,0 Sédiment
Micro-gels
0,8
0,6
H/H0
0,4
0,2
0,0
7,00 6,75 6,50 6,25 6,00 5,75 5,50 5,25 5,00
pH de fin de cisaillement
Figure 111 : (a) Aspects macroscopiques des différentes phases des gels acides enrichis en guar à 0,25% à pH 4,6
acidifiés à 43°C à l’aide du ferment 1 ou 2 et ayant été cisaillés jusqu’au pH indiqué sur la figure (les pointillés gris
délimitent la zone riche en guar de la zone riche en micro-gels, les pointillés noirs, la zone riche en micro-gels de la
couche de sédiment) ; (b) Hauteurs relatives de chaque phase (symboles pleins : ferment 1 ; symboles vides :
ferment 2). Le pH de gélification de 5,2 est rappelé par la ligne grise.
Quel que soit le ferment utilisé, plus le cisaillement a été conduit jusqu’à un pH bas, plus le
sédiment, partie inférieure blanche riche en protéines, diminue. Toutefois, cette observation n’est
valable que pour des pH de fin de cisaillement supérieurs à 5,2, correspondant à la formation du gel.
Un système homogène en apparence et monophasique apparaît lorsque le cisaillement a été appliqué
continûment tout au long de l’acidification y compris à des pH inférieurs au pH de gélification. Pour
faciliter l’interprétation, les hauteurs relatives de la phase de sédiment, de la phase riche en micro-
gels et par déduction celle de surnageant, ont été reportées sur la Figure 111b. Bien que suivant une
évolution similaire en fonction du pH de fin de cisaillement, la hauteur de la couche de sédiment des
systèmes acidifiés par le ferment 1 est supérieure à celle formée dans les gels obtenus par l’action du
ferment 2 et ce, pour l’ensemble des pH de fin de cisaillement. Ce résultat apparaît en accord avec les
193
cinétiques d’acidification décrites précédemment et s’explique par un temps de gélification plus élevé
pour le ferment 1, bloquant la séparation de phases plus tardivement que dans le cas du ferment 2. Le
comportement de la phase riche en micro-gels en fonction du pH de fin de cisaillement semble plus
complexe à interpréter, probablement en raison de la variabilité du réarrangement de la phase riche en
micro-gels dont la compaction dépend en partie de leur taille et de leur forme.
A l’échelle macroscopique, le cisaillement du système lors de l’acidification du lait a

effectivement eu pour effet de diminuer voire de bloquer de manière significative la formation de la
couche de sédiment. Afin de compléter ces observations, une étude des propriétés microstructurales et
rhéologiques de ces gels après brassage a été menée (Figure 112a et b).
6,7 5,9 5,4 5,0
500 µm
b 1000 1000 1000 1000

G’, G’’ (Pa)
100 100 100 100
10 10 10 10
1 1 1 1
0,1 0,1 0,1 0,1

0,01 0,1 1 10 0,01 0,1 1 10 0,01 0,1 1 10 0,01 0,1 1 10
Fréquence (Hz)
Figure 112 : (a) Gels acides brassés enrichis en guar à 0,25% à pH 4,6 acidifiés à 43°C à l’aide du ferment 2 et ayant
été cisaillés jusqu’au pH indiqué sur la figure, observés en microscopie en épifluorescence. Les barres représentent
500 µm ; (b) Spectres viscoélastiques à 4°C des gels brassés enrichis en guar à 0,25% à pH 4,6 acidifiés à 43°C à
l’aide du ferment 2 et ayant été cisaillés jusqu’au pH indiqué sur la figure
Les images obtenues en microscopie en épifluorescence des gels acides brassés ayant été
cisaillés jusqu’à un pH de 6,7 à 5 sont présentées sur la Figure 112a. Les zones claires révèlent la
présence de protéines et par contraste, les zones sombres permettent de localiser le guar et/ou le
lactosérum. En absence d’un cisaillement lors de l’acidification, des agrégats de taille variable
dispersés dans une solution riche en guar apparaissent. En revanche, l’application d’un cisaillement
jusqu’à un pH de 5,9 donne lieu à la formation de très longs filaments de l’ordre du centimètre plus
ou moins enchevêtrés et à des micro-gels de plus petite taille. Lorsque le cisaillement a été conduit
194
jusqu’au pH de 5,4, soit juste avant le point de gélification, les gels brassés se présentent sous la
forme de micro-gels de taille moyenne et agrégés entre eux pour certains. La morphologie du gel
cisaillé en continu, y compris après que le pH critique de gélification ait été atteint, diffère
radicalement des microstructures décrites précédemment, avec l’apparition d’un ensemble de très
petits agrégats protéiques.
Les propriétés rhéologiques des gels brassés peuvent être mises en lien avec les microstructures
(Figure 112b). Ainsi, le spectre viscoélastique du système n’ayant pas été cisaillé lors de
l’acidification est typique d’un système peu structuré, ce qui peut être attribué à l’absence de
connexion entre les agrégats protéiques. La présence de longs filaments dans le gel ayant été cisaillé
jusqu’au pH de 5,9 contribue de manière importante aux propriétés viscoélastiques du gel. En effet, la
valeur élevée des modules viscoélastiques et leur très faible dépendance à la fréquence indiquent la
présence de propriétés solides. Celles-ci sont d’ailleurs plus prononcées lorsque le cisaillement a été
mené jusqu’au pH de 5,4, en raison de la forte connexion entre les micro-gels. Même si le spectre
viscoélastique du système ayant été cisaillé jusqu’au pH de 5 se rapproche de celui d’un système
structuré, les valeurs de G’ et G’’ sont relativement faibles. Dans ce cas, les petits agrégats protéiques
agissent comme une suspension de particules concentrées mais non connectées entre elles.
L’ensemble des propriétés macrostructurales, microstructurales et rhéologiques peut être

discuté à la lumière des cinétiques d’acidification et de séparation de phases. En absence de
cisaillement lors de l’acidification, la majorité des gouttelettes a eu la possibilité de sédimenter par
effet de gravité pour former la couche de sédiment avant que la gélification n’ait lieu, le brassage
ayant eu pour effet de fragmenter les agrégats protéiques gélifiés en diverses tailles.
Lorsque le mélange lait / guar est soumis à un cisaillement, un équilibre entre la coalescence
des gouttelettes riches en protéines et leur rupture par instabilité de Rayleigh est mis en place, ce qui
conduit à un système homogène macroscopiquement (van Puyvelde et al., 2003 ; Butler &
Heppenstall-Bultler, 2003 ; Foster et al., 1996). Toutefois, l’arrêt du cisaillement provoque une
séparation de phases presque instantanée, tout au moins à l’échelle microscopique (Figure 54).
Ensuite, la vitesse de coalescence des gouttelettes dépend de la force et de la fréquence de collision,
de l’état liquide ou solide de la gouttelette, du temps de contact ou encore des propriétés interfaciales
(Foster et al., 1997). Sur la base de ces connaissances, l’action du cisaillement à 500 rpm lors de
l’acidification du lait aboutit à un phénomène de rupture des gouttelettes prédominant sur leur
coalescence. Ainsi, le temps d’évolution des gouttelettes correspondrait uniquement à l’intervalle de
temps disponible entre la fin du cisaillement et le début de la formation du gel. Par conséquent, les
195
longs filaments ou micro-gels présents dans les gels brassés ayant été cisaillés jusqu’au pH
respectivement de 5,9 et 5,4 seraient à l’origine d’un phénomène de coalescence puis de
sédimentation des gouttelettes après arrêt du cisaillement et avant leur gélification. La différence de
taille des structures entre ces deux gels brassés pourrait être expliquée par un temps d’évolution des
gouttelettes élevé dans le cas du système cisaillé jusqu’au pH de 5,9, ce qui justifierait également la
présence d’une couche de sédiment importante (Figure 111b).
Si le cisaillement se produit lors de l’acidification, l’effet du cisaillement continu sur les

micelles de caséines, et sur leur modification induite par le changement de pH, est à prendre en
considération. A la différence du gel brassé ayant été cisaillé jusqu’au pH de 5,9, celui ayant été
cisaillé jusqu’au pH de 5,4 a vraisemblablement subi des mécanismes de dissociation de certaines
caséines et surtout de solubilisation du phosphate de calcium colloïdal pendant l’application du
cisaillement (Dalgleish & Law, 1988). L’aspect relativement agrégé des micro-gels de ce gel brassé
pourrait être interprété comme la conséquence d’une augmentation de l’adhérence des micro-gels
gélifiés entre eux suite à l’application du cisaillement lors des modifications physico-chimiques des
micelles de caséines et/ou aux forces de collision non nulles lors de la formation du gel.
L’effet d’un cisaillement pendant la gélification peut conduire à une inversion de phases suite à
une augmentation de la rigidité des gouttelettes liée à leur gélification (Foster et al., 1997).
Cependant, dans le cas des gels laitiers acides, seule une cinétique lente associée à une absence
d’agitation lors de la transition sol-gel permet d’obtenir un réseau gélifié. Contrairement à la
possibilité de formation d’un micro-gel lors de la gélification de gouttelettes riches en protéines,
l’action du cisaillement lors de la gélification empêche le regroupement des protéines sous la forme
de gouttelettes. De ce fait, les protéines de lait gélifient probablement de manière isolée mais peuvent
se réassocier sous forme d’agrégats, notamment lorsque les répulsions électrostatiques sont
minimales. La taille des agrégats présents dans le système ayant été cisaillé jusqu’au pH de 5
dépendrait essentiellement de la vitesse de cisaillement ainsi que du temps d’agitation (Pacek et al.,
2003 ; van Marle, 1998). Il est à noter que les conditions de cisaillement choisies ont permis d’obtenir
des agrégats suffisamment petits et nombreux, tels une suspension concentrée en particules, pour
éviter une décantation ultérieure dans un délai de plusieurs jours (Figure 111a). Par ailleurs, les
propriétés d’écoulement de ce gel brassé s’apparentent tout à fait à un produit laitier de type yaourt à
boire, avec toutefois une concentration en guar dans la phase continue de près de 0,25%.
196
Finalement, le choix de l’application d’un cisaillement a été motivé par la possibilité que
présente cette démarche de bloquer l’évolution de l’émulsion eau dans eau. En effet, il semble que la
rupture des gouttelettes en une taille inférieure domine sur leur coalescence tant que l’agitation est
mise en œuvre. Par un arrêt du cisaillement du système additionné de ferments à un pH déterminé,
des longs filaments, similaires à ceux précédemment décrits dans des mélanges acidifiés par la GDL,
ont pu être créés. La compréhension des modifications physico-chimiques subies par les micelles de
caséines lorsque l’acidification est combinée à un cisaillement resterait toutefois à approfondir.
III. CONCLUSION
La modification de l’histoire thermique et mécanique avant, pendant et après la gélification de

mélanges lait / guar a permis de mettre en évidence l’importance du temps dont dispose le système
pour évoluer avant sa gélification. Ainsi, l’intervalle de temps entre le début de la séparation de
phases et la gélification a été modulé par un stockage à basse température qui a eu pour effet, non
seulement de ralentir la séparation de phases, mais aussi de décaler le point de gélification. La
deuxième approche a reposé sur l’application d’un cisaillement en continu jusqu’à un pH précis,
bloquant de cette manière la séparation de phases.
Un lien étroit entre les conditions de procédé et la microstructure du gel brassé acide obtenu a
pu être établi. L’allongement des structures se réalisant au travers de forces de gravité et de l’agitation
thermique, la taille des micro-gels enrichis en protéines dépend largement de l’histoire thermique et
mécanique appliquée avant la formation du gel. Par conséquent, la maîtrise des conditions
thermomécaniques garantit la possibilité de créer des microstructures à façon, composées de micro-
gels variant d’une forme sphérique à filamenteuse.
197
Chapitre 6 : Influence de la microstructure sur la perception sensorielle de yaourts brassés enrichis en micro-gels
Chapitre 6 : Influence de la microstructure sur la

perception sensorielle de yaourts brassés enrichis en
micro-gels
En modifiant le type de polysaccharides et le procédé utilisé, il a été possible de créer une

variété de microstructures de gels acides brassés sur la base d’une compétition entre une séparation de
phases et la gélification acide des protéines. Dans le cadre de cette étude, le terme de « micro-gel » a
été utilisé pour désigner les gouttelettes gélifiées ou les structures fibreuses, obtenues respectivement
à partir de systèmes enrichis en guar et en xanthane, et séparées de leur phase continue riche en
polysaccharides. Une démarche d’incorporation de ces micro-gels au sein d’une matrice de type
yaourt brassé a été menée pour appréhender l’impact de ce type de particules sur la texture sensorielle
et instrumentale des produits.
De nombreux systèmes alimentaires intègrent la présence de particules telles que des granules
d’amidon, des fibres insolubles (Bayarri et al., 2011 ; Dello Staffolo et al., 2004) ou des agrégats
protéiques (Cayot et al., 2008 ; Langton et al., 1997). Néanmoins, les particules en apportant
potentiellement une sensation de granuleux en bouche, peuvent nuire à l’acceptabilité de certains
produits alimentaires. Dans le cas du yaourt, la présence de particules ou grains peut être considérée
comme un défaut pour des consommateurs qui recherchent majoritairement des produits lisses et
uniformes.
L’objectif de ce chapitre est d’évaluer si les différences de morphologie des micro-gels sont
perceptibles par des sujets sur le plan sensoriel, puis de déterminer les caractéristiques sensorielles
apportées par ces micro-gels incorporés dans un yaourt sans matière grasse. Outre une modification
de la morphologie des particules par un changement des paramètres de composition et de procédé, la
concentration en particules constitue un second facteur de variation.
I. STRATEGIE EXPERIMENTALE
Afin de faire varier la forme et la taille des micro-gels, le type de polysaccharides et la vitesse
d’acidification ont été modifiés sur la base des comportements décrits dans les chapitres précédents.
Les micro-gels ont été obtenus par un effet de compétition entre la séparation de phases de mélanges
lait / guar à 0,3% ou xanthane à 0,05% et la gélification acide des protéines. Par ailleurs, l’utilisation
198
d’une concentration en GDL de 1, 1,5 ou 2,5% a donné lieu à une variation de la morphologie des
micro-gels fabriqués à base de systèmes enrichis en guar.
Deux paramètres ont été modifiés pour obtenir un espace de produits varié : le type de micro-
gels et la concentration en micro-gels. A l’aide de la modification de ces paramètres, un ensemble de
14 produits a été préparé, dont un échantillon correspondant une répétition (fabriqué à l’aide de
l’enrichissement du yaourt brassé avec 2,5% de micro-gels obtenus à partir du système lait / guar
acidifié avec 1% de GDL), et le yaourt témoin ne contenant pas de micro-gels. Sur les images en
microscopie à contraste de phase (Figure 113), les micro-gels fabriqués à partir du système enrichi en
guar ressortent en zones claires alors que ceux élaborés à partir du système riche en xanthane
apparaissent dans les domaines sombres.
Guar Guar Guar Xanthane

Témoin
GDL 1% GDL 1,5% GDL 2,5% GDL 1,5%
1 x2 1,5 2,5 1,5
2,5%
1 1,5 2,5 1,5
5%
1 1,5 2,5 1,5
10%
Figure 113 : Plan expérimental des 14 produits élaborés à partir des deux paramètres (type de micro-gels fabriqués à
partir du système enrichi en guar ou en xanthane et concentration en micro-gels de 2,5%, 5% ou 10%) et symboles
correspondants. Microstructures des 14 produits observés en microscopie optique à contraste de phase. Les barres
représentent 100 µm.
199
II. PROPRIETES SENSORIELLES
La classification ascendante hiérarchique réalisée sur les produits en se basant sur l’ensemble
des descripteurs utilisés par les juges a donné lieu à des regroupements schématisés sous la forme du
dendrogramme présenté sur la Figure 114. Celui-ci a permis de visualiser les distances entre produits
et de relier les produits les plus proches. La coupure en deux classes dissocie deux groupes. Le
premier groupe contient les produits avec des micro-gels en faible concentration (2,5%) fabriqués à
partir du système riche en guar, le témoin ainsi que deux produits contenant 5% de micro-gels
obtenus par les systèmes à base de guar avec les deux extrêmes de concentration en GDL. Tous les
produits fabriqués par le système à base de xanthane et ceux contenant 5 à 10% de micro-gels obtenus
par les systèmes à base de guar sont inclus dans le deuxième groupe. Une dichotomie peut être
effectuée sur ce deuxième groupe, permettant d’isoler les deux produits contenant 5 et 10% de micro-
gels fabriqués à base du système riche en xanthane. Toutefois, l’analyse du dendrogramme ne permet
pas d’identifier clairement de regroupement selon la composition ou la concentration en GDL, même
si les produits de concentration en micro-gels élevée se situent majoritairement dans le deuxième
groupe.
1 1 1 1,5 2,5 2,5 1,5 1 1,5 2,5 1,5 1,5 1,5
Figure 114 : Dendrogramme issu de la classification ascendante hiérarchique des produits lors du profil flash
(témoin () ; micro-gels fabriqués à partir du système enrichi en guar ( ) ou xanthane ( ) acidifié avec 1, 1,5 ou
2,5% de GDL ; concentration en micro-gels : 2,5% ( ) ; 5% ( ) ; 10% ( ))
En complément de la classification ascendante hiérarchique sur les produits, des regroupements

basés sur l’ensemble des descripteurs sensoriels du profil flash ont été réalisés (Figure 115).
200
Lisse
“Lisse, liquide” Homogénéité de la surface (visuel)
Liquide
Lisse (x2) Homogénéité de la texture
Lisse (en bouche)
Homogénéité (x2) Onctuosité (en bouche)
Epais (visuel)
Liquide Goût métallique (en bouche)
Tenue cuillère dans pot
Sensation d’eau Farineux (en bouche)
Sensation d'eau (en bouche)
Surface non lisse (visuel)
Grains en surface (visuel)
Gros grumeaux, grumeleux
Morceaux (en bouche)
“Granuleux” Hétérogène (en bouche)
Fluide en bouche (liquide)
Granuleux / Râpeux
Granuleux (x8) Granuleux (visuel)
Taille des particules (visuel)
Particules (x4) Hétérogénéité (visuel)
Epais (cuillère)
Hétérogénéité (x3) Acidité
Nappant (en bouche)
Râpeux Hétérogénéité de taille de particules (visuel)
Grains Granuleux
Astringent
Morceaux Particules, granuleux
Nappant
Farine Granulosité (bouche)
Granuleux (visuel)
Grumeaux Viscosité grasse (non aqueuse)
Impression de farine (en bouche)
Granuleux (en bouche)
Granuleux (visuel)
S'écoule (cuillère)
Farineux/Sableux, granuleux (en bouche)
Onctueux
Consistance (en bouche)
Fluidité (cuillère)
“Consistant” Onctuosité (cuillère)
Consistant (x4) Consistant
Pénétration de la cuillère
Ecoulement (x2) Colle au palais
Grumeleux
Onctuosité (x2) Râpeux après avoir avalé
Viscosité
Viscosité Fermeté
Granuleux (en bouche)
Epais Morceaux (en bouche)
Granuleux (visuel)
Filant Epais (en bouche)
Ecoulement (cuillère)
Consistant (cuillère)
Filant (cuillère)
Figure 115 : Dendrogramme issu de la classification ascendante hiérarchique des descripteurs sensoriels générés par
le panel lors du profil flash. Les notions sémantiques proposées à partir des groupes de termes ainsi que les termes
les plus fréquemment cités sont reportés à gauche du dendrogramme.
Les juges ont utilisé chacun entre 3 et 10 descripteurs, soit un total de 56 termes exploités pour
le panel. Ces termes concernent en majorité la texture visuelle, en bouche et en cuillère. Le
dendrogramme issu de la classification ascendante hiérarchique permet de distinguer trois groupes
principaux de termes. Le premier groupe intègre un nombre important de termes relatifs au caractère
lisse, homogène et liquide. Le second regroupe des termes relatifs au caractère granuleux, hétérogène
et à la présence de particules ou morceaux. En revanche, le troisième groupe comprend des termes
liés à la consistance, à l’écoulement et à l’onctuosité, mais également d’autres termes faisant
référence à d’autres propriétés comme « morceaux », « granuleux » ou « filant ». Ainsi trois notions
sémantiques relatives à la texture peuvent être respectivement proposées pour ces trois groupes :
« lisse-liquide », « granuleux » et « consistant ». Il est à noter que la notion de « lisse-liquide » est
plus séparée des deux autres que ne le sont celles de « granuleux » et « consistant ». De plus, les deux
notions de « lisse » et « liquide » ne semblent pas être différenciées par les juges.
201
Une analyse procrustéenne généralisée a été appliquée aux données individuelles générées par
chaque juge afin d’obtenir une carte sensorielle consensuelle. Le premier plan du consensus de l’APG
est représenté sur la Figure 116. Ces deux premiers axes expliquent 78% de la variance totale.
L’examen des autres plans (non représentés) ne permet pas de mettre en évidence une répartition des
produits en groupes distincts.
La représentation des descripteurs individuels sur la Figure 116a montre une opposition sur la
première composante de l’APG, portant 65% de la variance, entre les descripteurs relatifs à un
caractère lisse et homogène et ceux liés à une perception de granuleux visuelle et en bouche. Si une
notion d’hétérogénéité semble ressortir majoritairement de ce premier axe, une distinction entre les
termes positionnés dans le premier quartile se référant à une perception de « granuleux en bouche »,
« sableux » ou encore « râpeux après avoir avalé », et ceux situés dans le deuxième quartile liés à une
perception de « granuleux visuel », peut être mise en évidence. Bien que n’expliquant que 13% de la
variance, le deuxième axe regroupe majoritairement des descripteurs relatifs à la consistance, ce
groupe de termes étant toutefois également corrélé à la première composante de l’APG.
Les produits ont été positionnés par rapport au cercle des corrélations (Figure 116b). Il est à
noter que les deux produits fabriqués de manière identique à partir de 2,5% de micro-gels à base du
système enrichi en guar acidifié avec 1% de GDL sont relativement proches dans ce plan, ce qui est
satisfaisant du point de vue de la cohérence des résultats du groupe. Les produits contenant peu ou
pas de particules sont opposés majoritairement selon l’axe 2 de l’APG aux yaourts incluant une
quantité importante de micro-gels. Une séparation des produits en fonction de la concentration en
micro-gels est donc mise en évidence. La position relative des produits peut être analysée grâce aux
éléments d’explication sémantique apportés par le cercle des corrélations de la Figure 116a. Ainsi, les
produits contenant une concentration en particules élevée sont caractérisés par des termes sensoriels
relatifs à la notion de consistance, ce qui est particulièrement observable pour les produits incluant
des micro-gels fabriqués à base du système riche en guar.
Par ailleurs, les yaourts à base de micro-gels préparés par le système enrichi en xanthane,
notamment aux hautes concentrations en micro-gels, se distinguent nettement de ceux fabriqués à
partir du système riche en guar sur la première composante de l’APG. Ces produits sont reliés aux
termes, en majorité évalués visuellement, d’« hétérogénéité », de « granuleux » ou encore de
« particules ».
202
a 1
“Consistant”
Râpeux après avoir avalé
Pénétration de la cuillère
Colle au palais
Granuleux (visuel)
0,5 Onctueux Ecoulement (cuillère) Grumeleux
Filant (cuillère) Farineux/Sableux (en bouche)
Consistant (cuillère)
Homogénéité de la texture Fluidité (cuillère) Epais (en bouche)
Axe 2 (12,9 %)
Nappant
Lisse Granuleux (en bouche)
Onctuosité (cuillère) Granulosité (bouche)
Acidité
Homogénéité de la surface (visuel) Consistance (en bouche)
Epais (visuel) Morceaux (en bouche)
Onctuosité (en bouche) Impression de farine (en bouche)
Fermeté Viscosité Granuleux (visuel)
S'écoule (cuillère)
0 Astringent Granuleux (en bouche)
Granuleux
Lisse (en bouche) Hétérogénéité Consistant Particules, granuleux
Hétérogénéité (visuel) Granuleux (visuel)
Viscosité grasse (non aqueuse)
Fluide en bouche (liquide)
“Lisse, Tenue cuillère dans pot Taille des particules (visuel)
Granuleux (visuel)
Granuleux / Râpeux
Farineux (en bouche) Hétérogénéité de taille de particules (visuel)
liquide” Morceaux (en bouche)
nce
Surface non lisse (visuel)
Gros grumeaux, grumeleux
Liquide Goût métallique (en bouche) Grains en surface (visuel)
-0,5 Nappant (en bouche)
ista Epais (cuillère) Hétérogène (en bouche)
“Granuleux”
Sensation d'eau (en bouche)
s
Con
-1
-1 -0,5 0 0,5 1
Axe 1 (65,3 %)
b 6
4 1,5
2,5
1
2,5
2
Axe 2 (12,9 %)
1 1
1,5
0
2,5 1,5
-2 1
1,5 1,5
-4
1,5
-6
-10 -5 0 5 10 15
Axe 1 (65,3 %)
Figure 116 : Plan 1-2 de l’APG (78% de la variance totale) sur les données sensorielles issues du profil flash : (a)
Corrélations des descripteurs avec les axes principaux 1 et 2 du consensus procrustéen ; (b) Carte des produits
2,5% de GDL ; concentration en micro-gels : 2,5% ( ) ; 5% ( ) ; 10% ( ))
III. CARACTERISATION INSTRUMENTALE
L’étude instrumentale globale a été conduite par les réalisations d’une classification ascendante
hiérarchique et d’une analyse en composantes principales sur les produits en prenant en compte
l’ensemble des paramètres structuraux et rhéologiques.
203
La classification ascendante hiérarchique menée sur les résultats instrumentaux permet de

distinguer trois groupes de produits qui sont différents de ceux obtenus à partir des données
sensorielles (Figure 117). A la différence d’un groupe n’incluant que le produit contenant 10% de
micro-gels à base du système enrichi en guar acidifié avec 1% de GDL, ou d’un second ne
comportant que les deux produits contenant 5 et 10% de particules à base du système riche en
xanthane, le dernier groupe rassemble un grand nombre de produits. Toutefois, une coupure en quatre
classes permettrait d’isoler de ce grand groupe, les produits fabriqués à partir de micro-gels acidifiés à
l’aide de 2,5% de GDL ou sans particules. Les mesures instrumentales permettraient donc de classer
les produits, mais seraient moins discriminantes et différentes dans leur caractérisation de la texture
que celle issue de l’étude sensorielle.
2,5 2,5 2,5 1 1,5 1,5 1 1 1,5 1,5 1 1,5 1,5
Figure 117 : Dendrogramme issu de la classification ascendante hiérarchique de la caractérisation instrumentale des
produits (témoin () ; micro-gels fabriqués à partir du système enrichi en guar ( ) ou xanthane ( ) acidifié avec 1,
1,5 ou 2,5% de GDL ; concentration en micro-gels : 2,5% ( ) ; 5% ( ) ; 10% ( ))
Les deux premières dimensions de l’analyse en composantes principales expliquent 73% de la

variance apportée par les caractérisations instrumentales (Figure 118). La projection des résultats
instrumentaux sur le plan 1-2 de l’ACP permet de distinguer un premier axe portant les paramètres
issus de la modélisation des propriétés d’écoulement par la loi de Herschel-Bulkley opposant l’indice
de consistance K à l’indice de comportement n (Figure 118a). Les paramètres structuraux liés à la
taille des micro-gels, le diamètre moyen d(4,3) et la longueur L, semblent également être relativement
bien corrélés à ce premier axe. Par ailleurs, la viscosité à 100 s-1 ainsi que les indices de consistance k
et de comportement n issus de la loi de puissance sont bien représentés sur la deuxième dimension de
204
l’ACP. Les paramètres « aire », correspondant au caractère thixotropique et « force », mesuré par un
test de rétro-extrusion sont corrélés à la fois à l’axe 1 et 2 de l’ACP de façon relativement
équivalente.
Comme précédemment observé sur le dendrogramme de la classification ascendante

hiérarchique (Figure 117), les produits semblent globalement moins discriminés par les mesures
instrumentales que sensorielles (Figure 118b). Seuls trois voire quatre produits se détachent de
l’ensemble des autres produits. D’une part, les produits incluant 5% et 10% de particules fabriquées à
base du système enrichi en xanthane sont caractérisés par un indice de consistance K et une longueur
L élevés, ce qui est en accord avec la présence de grandes particules visibles sur les images en
microscopie (Figure 113). D’autre part, les produits incluant 5% et surtout 10% de micro-gels
préparés à partir du système riche en guar acidifié avec 1% de GDL sont bien représentés sur la
première dimension de l’ACP, liée à une viscosité à 100 s-1 et un indice de consistance k élevés. La
présence de longs filaments gélifiés et enchevêtrés pourrait être à l’origine d’une viscosité importante,
y compris aux vitesses de cisaillement élevées et d’un caractère rhéofluidifiant marqué qui est
inversement corrélé à n.
1 4
a η (100 s-1) k (puissance) b
Aire
3 1
Force
0,5 Seuil (HB) L/l 2
Axe 2 (32,7 %)
Axe 2 (32,7 %)
1 1
K (HB)
d(4,3) L 1,5
0 0 1 2,51,5
2,5 1,5
n (HB) 2,51,5
-1 1,5 1 1
1,5
-0,5 -2
n (puissance) -3
-1 -4
-1 -0,5 0 0,5 1 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4
Axe 1 (39,8 %) Axe 1 (39,8 %)
Figure 118 : Plan 1-2 de l’ACP (73% de la variance totale) sur les données de la caractérisation instrumentale : (a)
Corrélations des paramètres instrumentaux avec les axes principaux 1 et 2 ; (b) Carte des produits (témoin () ;
micro-gels fabriqués à partir du système enrichi en guar ( ) ou xanthane ( ) acidifié avec 1, 1,5 ou 2,5% de GDL ;
concentration en micro-gels : 2,5% ( ) ; 5% ( ) ; 10% ( ))
205
IV. RELATION ENTRE DONNEES SENSORIELLES ET INSTRUMENTALES
Les réalisations d’une analyse procrustéenne généralisée et d’une classification ascendante

hiérarchique ont permis d’analyser conjointement l’ensemble des données sensorielles et
instrumentales. Le dendrogramme issu de la classification ascendante hiérarchique permet d’isoler un
groupe comprenant les produits caractérisés de manière instrumentale et sensorielle incluant
différentes concentrations de micro-gels fabriqués à base du système enrichi en xanthane
(Figure 119). Une coupure en trois classes dissocie deux groupes supplémentaires. Un groupe
contient majoritairement le yaourt témoin et ceux intégrant une faible concentration en micro-gels,
alors que l’autre groupe est moins distinct. Ainsi, la classification des produits à partir des données
sensorielles et instrumentales permet de distinguer les produits en fonction de la nature du
polysaccharide utilisé pour l’élaboration des micro-gels et de la concentration en particules
incorporées.
2,5 1 1,5 1 1,5 2,5 1,5 1,5 1 2,5 1 2,5 1 1,5 1,5 1 1 2,5 2,5 1 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5
Figure 119 : Dendrogramme issu de la classification ascendante hiérarchique des produits de deux premières
dimensions des configurations instrumentales et sensorielles de l’APG (témoin () ; micro-gels fabriqués à partir du
système enrichi en guar ( ) ou xanthane ( ) acidifié avec 1, 1,5 ou 2,5% de GDL ; concentration en micro-gels :
2,5% ( ) ; 5% ( ) ; 10% ( ))
Le premier plan de l’APG, représenté sur la Figure 120 explique 89% de la variance totale. Sur
le cercle des corrélations, les axes 1 et 2 définis par le consensus sensoriel sont bien représentés sur
les première et deuxième dimensions de l’APG respectivement (Figure 120a). En comparant ces axes
206
aux paramètres issus de la caractérisation instrumentale, l’axe 1 du consensus sensoriel est lié à une
longueur L et un diamètre moyen d(4,3) importants, et donc une taille de particules élevée, alors que
l’axe 2 est associé à une viscosité à 100 s-1 et un indice de consistance k élevés. Ainsi, l’espace de
produits étudié se différencierait selon deux dimensions principales, déterminées par les paramètres
instrumentaux et les descripteurs sensoriels et qui sont reliées aux notions de « consistance » et
« granulosité ». Ce résultat est tout à fait cohérent avec d’autres études sensorielles et rhéologiques de
produits de type semi-liquide incluant des particules ou morceaux de gels dispersés dans une phase
continue (Espinosa-Munoz et al., 2012 ; Tarea, 2005 ; Matignon, 2013).
Il semble donc exister un lien entre la consistance perçue en bouche et la viscosité à 100 s-1
mesurée instrumentalement. Dans le cas de produits rhéofluidifiants tels que les yaourts, la question
des conditions de cisaillement est à considérer. Ainsi, une mesure de viscosité à une vitesse de
cisaillement comprise entre 10 et 100 s-1 a été admise comme permettant d’obtenir une bonne
corrélation avec la « consistance » perçue à la cuillère ou en bouche (Cutler, 1983 ; Shama &
Sherman, 1973), ce qui est en accord avec les résultats obtenus dans le cadre de cette étude.
1 7
S- Axe 2 I- η (100 s-1)
a b 1
I- k (puissance)
I- Seuil (HB) 5
I- Force
0,5
I- Aire 1,5
3 2,5
Axe 2 (21,3 %)
Axe 2 (21,3 %)
I- L/l 2,5 1 1
I- n (HB)
1,5 2,5
S- Axe 1 1 2,51
0 1 1,5
I- d(4,3) 1,5
I- K (HB) 1,5
2,5 1,5 2,5
I- n (puissance) I- L
-1
1 1 1 1,5
-0,5 1,5
1,5
-3 1,5
1,5
1,5
-1 -5
-1 -0,5 0 0,5 1 -8 -5 -2 1 4 7 10
Axe 1 (67,6 %) Axe 1 (67,6 %)
Figure 120 : Plan 1-2 de l’APG (89% de la variance totale) sur les données du plan 1-2 de l’APG de la configuration
sensorielle consensuelle et les données de la caractérisation instrumentale : (a) Corrélations des descripteurs
sensoriels et instrumentaux avec les axes principaux 1 et 2 du consensus procrustéen ; (b) Carte des produits
2,5% de GDL ; concentration en micro-gels : 2,5% ( ) ; 5% ( ) ; 10% ( ) ; configuration instrumentale en
pointillés et sensorielle en ligne pleine)
207
Le positionnement des produits du consensus sensoriel est relativement proche de celui de la

configuration instrumentale pour la majorité des produits, en particulier pour les doublons
(Figure 120b). L’axe 1 de l’APG oppose les yaourts contenant des micro-gels à base du système
enrichi en guar et contenant peu ou pas de particules à ceux à base du système enrichi en xanthane ou
en guar contenant une concentration en micro-gels élevée. La répartition des produits suivant l’axe 2
est moins claire, même si les produits incluant 10% de micro-gels à base des systèmes enrichis en
guar acidifiés avec différentes concentrations en GDL sont assez bien représentés sur cette dimension.
Par ailleurs, la répartition des produits de la configuration sensorielle est plus vaste dans l’espace de
produits que celle de la configuration instrumentale pour laquelle seuls trois produits se distinguent
majoritairement, ce qui est cohérent avec les analyses sensorielles et instrumentales présentées
séparément précédemment. Ainsi, pour la caractérisation de la texture de cet espace de produits, les
mesures instrumentales permettent certes de positionner les produits, mais elles ne sont pas
suffisantes pour les discriminer aussi efficacement que le font les juges.
L’analyse du positionnement des produits sur la carte de l’APG conduit à formuler l’hypothèse
selon laquelle les paramètres de structure (longueur des micro-gels et concentration en micro-gels)
auraient un rôle clé dans la perception sensorielle mal caractérisée par les mesures instrumentales
effectuées dans cette étude.
V. RELATION ENTRE LES PARAMETRES DE STRUCTURE ET LES DONNEES

SENSORIELLES
Une régression linéaire multiple a été utilisée afin de fournir des modèles permettant d’établir
des relations entre les paramètres structuraux (taille des micro-gels évaluée par la longueur L et
concentration en micro-gels) et les notions sémantiques de « consistant » et « granuleux ». Il est à
noter que ces notions sensorielles sont calculées par la somme de la classification des descripteurs par
produit inclus dans le groupe obtenu par la classification ascendante hiérarchique appliquée à
l’ensemble des descripteurs sensoriels visuels, en bouche et en cuillère issus du profil flash
(Figure 115). Par conséquent, les valeurs correspondant à ces notions sémantiques reflètent une
notion globale qui a été interprétée à partir de descripteurs proches et elles sont à prendre avec
prudence. Les modèles sont significatifs et présentent un bon ajustement (R2 > 0,8) (Tableau 14).
208
Tableau 14 : Valeurs des coefficients du modèle de la régression linéaire multiple (Eq. 18) pour les notions
sensorielles de « consistant » et de « granuleux »
a Concentration L Concentration*L R²
« Consistant » 110 8,4 0,02 0,004 0,81
« Granuleux » 52 11,3 0,68 -0,009 0,80
Des surfaces de réponses ont été tracées à partir des modèles obtenus par la régression linéaire
multiple, permettant ainsi de prédire la perception sensorielle à partir des paramètres structuraux
(taille et concentration en micro-gels) (Figure 121).
- +
a
“Consistant”
220
200
180
160
140
120 300
200
100 100 Longueur (µm)
0 2,5 0
5 10
Concentration (%)
- +
b
“Granuleux”
350
300
250
200
150
100
50
300
0 200
0
2,5 100 Longueur (µm)
5 0
10
Concentration (%)
Figure 121 : Surfaces de réponses des notions sémantiques sensorielles de (a) « consistant » et (b) « granuleux » en
fonction de la concentration en micro-gels et de la longueur des micro-gels, variant selon six niveaux (du plus clair
au plus sombre en niveaux de gris)
209
En émettant l’hypothèse que tous les types de particules présentent un coefficient d’absorption
d’eau similaire et sont inertes vis-à-vis de la phase continue, la phase dispersante constituée du yaourt
brassé peut être considérée comme identique pour l’ensemble des produits. L’étude de l’effet de
l’ajout de particules de taille, forme, concentration ou encore dureté variables sur la perception
sensorielle est alors possible.
L’analyse de la surface de réponses de la notion sémantique « consistant » obtenue à partir de la

régression linéaire multiple permet de mettre en évidence un effet positif notable de la concentration
en micro-gels sur la perception sensorielle liée à la consistance (Figure 121a). Une explication liée à
l’intégration des particules dans la phase continue pourrait rendre compte de ce comportement. Alors
qu’en faible concentration, les particules peuvent être qualifiées de négligeables vis-à-vis de la
perception sensorielle, elles deviendraient dérangeantes à une concentration élevée en interférant par
friction entre elles et avec les fragments de gel caséique du yaourt brassé (Houzé et al., 2005),
augmentant ainsi la viscosité globale. En revanche, une modification de la taille des particules a un
rôle mineur sur la notion sémantique de « consistant ». En effet, l’incorporation en poids égal entre
les différents types de micro-gels impliquerait l’ajout d’un nombre important de micro-gels pour des
particules de petite taille et au contraire, peu de micro-gels pour les particules de grandes dimensions.
Ainsi, le volume de micro-gels inclus dans le yaourt brassé, pour une même concentration en
particules, serait sensiblement identique quelle que soit la longueur des particules, ce qui diminuerait
son impact sur les propriétés rhéologiques.
La notion sémantique associée au « granuleux » dépend à la fois de la longueur des micro-gels

et de leur concentration (Figure 121b). Ces deux paramètres structuraux influencent de manière
presque égale la perception du granuleux. Des résultats similaires ont été rapportés dans la littérature
lors de l’étude du caractère sableux (« grittiness ») généré par l’ajout de cellulose microcristalline à
diverses matrices alimentaires (Imai et al., 1995). Bien que la longueur des particules ait un rôle
majeur dans la perception du « granuleux », il serait difficile d’établir un seuil de perception dans le
cadre de cette étude en raison de la grande polydispersité des micro-gels fabriqués. En effet, il a été
montré que la présence de grandes particules, même en faible proportion par rapport aux petites
particules, par exemple 8% de particules de 200 µm, pouvait contribuer à la perception du granuleux
(Cayot et al., 2008).
Par ailleurs, le type de micro-gels, non seulement de taille, mais aussi de forme et dureté
variables, pourrait avoir un effet sur la perception du « granuleux » (Tyle, 1993 ; Imai et al., 1999 ;
Engelen et al., 2005). Ainsi, l’incorporation de micro-gels élaborés à partir du système enrichi en
210
xanthane reflèterait une hétérogénéité liée à leur taille, détectée en particulier visuellement. Les
micro-gels fabriqués à partir du système enrichi en guar, notamment ceux acidifiés avec 2,5% de
GDL de forme parfaitement sphérique, pourraient davantage contribuer à un effet « râpeux », à une
« impression de farine » ou de « sableux » comme les ont décrits certains juges. Partant de ce constat,
une réflexion concernant l’effet de la dureté des particules peut être introduite. Puisque les fragments
de gel caséique du yaourt brassé sont de taille sensiblement identique voire légèrement supérieure à
celle des particules issues du système enrichi en guar acidifié avec 2,5% de GDL (Figure 113), la
grande dureté de ces micro-gels, provoquant un grand contraste de fermeté avec la phase continue,
serait à l’origine de leur détection sensorielle, particulièrement en bouche.
VI. CONCLUSION
Dans une démarche exploratoire du positionnement de l’espace de produits créé par des micro-
gels de morphologies et concentrations variables, un profil flash a été mis en œuvre conjointement à
une caractérisation instrumentale. Les corrélations instrumentales et sensorielles mises en évidence
viennent confirmer la présence de deux dimensions principales : la consistance et la granulosité. Il est
possible de relier la morphologie des micro-gels à ces dimensions. D’une part, la taille élevée des
micro-gels préparés par le système enrichi en xanthane conduit à une hétérogénéité importante.
D’autre part, la présence de nombreux enchevêtrements des micro-gels élaborés à partir du système
enrichi en guar et acidifié avec 1% de GDL contribue à une augmentation de la consistance
instrumentale et sensorielle.
De manière générale, les paramètres structuraux, constitués de la longueur des micro-gels et de

leur concentration, ont un rôle clé dans la perception sensorielle. Alors que la notion sémantique
sensorielle de « granuleux » est influencée à la fois par la taille et la concentration en particules, seule
la concentration a un effet de premier ordre sur la notion de « consistant ».
D’un point de vue nutritionnel, l’incorporation de ces micro-gels, environ quatre fois plus
concentrés en protéines qu’un gel laitier standard, constitue une approche particulièrement
intéressante. En effet, l’ajout de 2,5%, 5% et 10% de ces micro-gels permet de passer d’une
concentration en protéines de 5,5% p/p du yaourt brassé utilisé comme base, à respectivement 6%,
6,5% et 7,5% p/p de protéines.
Les micro-gels protéiques pourraient également être utilisés dans le but de se substituer à la
matière grasse au sein de produits allégés. Par un effet de roulement à billes, les particules pourraient,
211
dans une certaine mesure, donner une sensation glissante du produit sur la langue. La taille trop
élevée des micro-gels utilisés dans le cadre de cette étude n’a pas permis de s’approcher de la
dimension des globules gras. Toutefois, une stratégie consisterait à diminuer la taille des particules
fabriquées à partir du système enrichi en guar en modifiant les paramètres de procédé, par exemple en
augmentant la vitesse d’acidification par un changement de la température d’acidification ou de la
concentration en GDL.
Une piste de réflexion concernant l’inclusion de particules au sein d’un produit laitier de type
yaourt brassé et la perception du caractère granuleux résultante peut être menée. En effet, à l’exemple
de l’incorporation de morceaux de fruits dans un yaourt, même si les sujets perçoivent des particules
de grande taille, ils ne considéreront vraisemblablement pas qu’elles contribuent à une augmentation
de la granulosité du produit. En revanche, il existerait une taille, une dureté et une concentration
critiques de particules à partir desquelles les particules ne seraient plus considérées comme faisant
partie intégrante du milieu. Ces paramètres critiques pourraient dépendre notamment des habitudes
alimentaires des sujets, mais également de leur seuil de détection individuel.
212
Chapitre 7 : Discussion générale et conclusion
I. DISCUSSION GENERALE
L’ensemble des résultats décrits dans les chapitres précédents peut être discuté sur la base
d’une compétition entre les processus de gélification et de séparation de phases. En considérant les
démarches mises en œuvre pour moduler le moment de gélification acide des protéines et/ou la
vitesse de sédimentation des domaines enrichis en protéines, il a été possible d’identifier un ensemble
de facteurs clés déterminant la microstructure des gels acides. Toutefois, la question se pose de la
généralisation, par rapport à ces facteurs, des phénomènes aboutissant à différents types de
microstructures. Par ailleurs, l’influence de la morphologie particulière des micro-gels sur les
caractéristiques sensorielles permettra d’apporter des pistes de réflexion sur la problématique de la
perception du caractère granuleux des produits semi-liquides incluant des particules.
Au sein de systèmes mixtes comportant au moins un polymère gélifiant, l’ensemble des

phénomènes se produisant avant la formation du gel a un rôle crucial dans la mise en place de la
microstructure finale. La gélification peut être gouvernée par différents facteurs tels que la
température avec la formation d’un réseau tridimensionnel d’un certain nombre de polymères à
chaîne étendue, ou l’acidification du milieu permettant aux protéines de lait de s’agréger. Même si la
formation du gel intervient comme un élément perturbateur de la séparation de phases pour ces deux
modes de gélification (Lorén et al., 1999 ; Norton & Frith, 2001 ; Aichinger et al., 2007), une
distinction de l’évolution du comportement rhéologique avant et après le point de gel en fonction du
type de gélification peut être établie.
La Figure 122 présente le schéma théorique de l’évolution de la viscosité apparente, ηapp, avant
la formation du gel et du module élastique relaxé, G∞, mesuré après le point de gel et aux temps
d’observation infiniment longs en fonction de l’avancement de la réaction. Lorsque le polymère
gélifiant est de type polymère à chaîne étendue tel que la gélatine ou les carraghénanes, la transition
sol-gel s’opère progressivement et la viscosité diverge au point critique de gel, pc, en raison des
nombreuses interactions intramoléculaires et intermoléculaires. Au-delà du point de gel, le module
élastique relaxé n’est mesurable expérimentalement qu’après un certain temps et l’évolution de ce
module se produit de manière progressive. En revanche, le comportement rhéologique de micelles de
caséines gélifiant sous l’action d’une diminution de pH diffère. En effet, la viscosité est maintenue
presque constante avant que la transition sol-gel n’ait lieu. Au point de gel, la gélification se produit
213
de manière presque instantanée, faisant tendre la viscosité vers l’infini. Le module élastique relaxé
peut être mesuré rapidement et il tend vers un niveau constant au bout d’un temps relativement court.
Ajouter un polymère de chaîne étendue aux micelles de caséines permet à la fois d’augmenter la
viscosité, qui est maintenue constante jusqu’au point de gel, et de provoquer une séparation de
phases. Par ailleurs, une modification de la température conduit également à un changement de la
viscosité de la phase continue, mais en ayant un impact négligeable sur la force de déplétion.
Etat sol Etat gel

log ηapp, G∞
G∞
ηapp
ηapp
pc
Paramètre d’avancement de la réaction
Figure 122 : Schéma théorique représentant l’évolution de la viscosité apparente ηapp avant le point de gel (pc) et du
module élastique relaxé G∞ après le point de gel en fonction de l’avancement de la réaction (adapté de Michon,
1995) (en gris : cas théorique des polymères à chaîne étendue, en noir : cas théorique de la gélification des protéines
de lait lors de l’acidification). Les pointillés en noir indiquent la variation possible de viscosité du lait enrichi en
polysaccharides avant sa gélification.
A la différence des systèmes incluant des polymères de chaîne étendue gélifiant, la mobilité des
molécules au sein des mélanges mixtes à base de lait gélifiant par acidification est peu modifiée par le
processus de gélification avant que le point de gel ne soit atteint. Dans cette situation, l’évolution du
comportement de phases se produisant dans l’intervalle de temps entre le début de la séparation de
phases et la formation du gel n’est pas altérée par une gélification progressive du milieu telle que
celle des polymères à chaîne étendue. Il est alors possible de modifier de façon contrôlée ce
comportement par un changement de la composition en polysaccharides ou du procédé avant la
gélification.
Au sein des différents mélanges lait / guar étudiés dans ce travail, des histoires
thermomécaniques différentes ont été appliquées avant la gélification du système à pH 5,2
(Figure 123a). Alors qu’un système enrichi en guar à 0,25% a été acidifié à l’aide du ferment 1 ou 2
et cisaillé jusqu’à un certain pH afin de limiter la sédimentation, un autre mélange à base de 0,3% de
214
guar et acidifié avec 1,5% de GDL a été maintenu 2 h ou 4 h à 8°C avant une augmentation jusqu’à
43°C permettant au gel de se former. Un parallèle entre les cinétiques d’acidification d’un lait acidifié
par les ferments 1 et 2 et celles obtenues en modifiant l’histoire thermique des systèmes peut être
établi (Figure 123a). En effet, le maintien à 8°C pendant 2 h et 4 h des laits acidifiés avec 1,5% de
GDL a permis de limiter la diminution du pH jusqu’à l’augmentation à 43°C, simulant ainsi les
cinétiques d’acidification respectives des ferments 2 et 1. Malgré une histoire thermomécanique très
différente, les deux systèmes présentent des temps de gélification comparables. Ainsi, l’approche
consistant à maintenir les systèmes à basse température, utilisée dans l’objectif de décaler le point de
gélification vers des temps plus longs, est tout à fait cohérente avec l’utilisation d’un système réel
utilisé industriellement intégrant les ferments.
a 7,0 Ferment 1 b
Ferment 2
6,5 2 h à 8°C
4 h à 8°C
6,0
pH
5,5
5,0
4,5
0 1 2 3 4 5 6 7 500 µm
Temps (h)
Figure 123 : (a) Cinétiques d’acidification de mélanges lait / guar à 0,25% acidifiés à 43°C à l’aide du ferment 1
ou 2 et cisaillés lors de l’acidification, ou de mélanges lait / guar à 0,3% acidifiés avec 1,5% de GDL et maintenus
2 h ou 4 h à 8°C avant une augmentation de la température à 43°C. Le pH de gélification de 5,2 est rappelé par la
ligne grise ; (b) Aspects macroscopiques des gels fermes à pH 4,6 et microstructure observée en microscopie en
épifluorescence des gels brassés à pH 4,6 enrichis en guar à 0,3%, acidifiés avec 1,5% de GDL et maintenus 2 h à
8°C (en haut) ou enrichis en guar à 0,25%, acidifiés à 43°C à l’aide du ferment 2 et ayant été cisaillé jusqu’à pH 5,7
(en bas). Sur les photos des gels fermes, les pointillés gris délimitent la zone riche en guar de la zone riche en micro-
gels et les pointillés noirs, la zone riche en micro-gels de la couche de sédiment. Les barres représentent 500 µm.
Il apparaît pertinent de comparer les propriétés de systèmes présentant un même temps de

gélification et donc pour lesquels seul le comportement des mélanges avant la formation du gel
diffère. A titre d’exemple, les macrostructures et microstructures d’un système enrichi en guar à
215
0,25% acidifié à l’aide du ferment 2 et cisaillé jusqu’au pH de 5,7, et celles d’un mélange à 0,25% de
guar acidifié avec 1,5% de GDL et maintenu 2 h à 8°C sont montrées sur la Figure 123b. Avant
brassage, les gels fermes issus de ces deux mélanges ayant subi une histoire thermomécanique
différente avant gélification, présentent tous deux des fractions volumiques similaires composées
d’une phase inférieure de protéines sédimentées, d’une phase riche en micro-gels et d’une phase
supérieure appauvrie en protéines. Toutefois, à l’échelle microscopique, quelques différences de
morphologie des gels acides brassés sont mises en évidence. Sur les images de la Figure 123b, les
zones claires révèlent la présence de protéines alors que les zones sombres permettent de localiser le
guar et/ou le lactosérum. Même si les micro-gels apparaissent sous la forme de filaments allongés
dans les deux systèmes, le mélange ayant passé 2 h à 8°C présente des micro-gels de longueurs et
largeurs moyennes supérieures à ceux du système acidifié à 43°C par le ferment 2 et cisaillé jusqu’à
pH 5,7. Ces différences peuvent être expliquées non seulement par la composition des mélanges, mais
également par une histoire thermomécanique différente.
L’augmentation de la concentration en guar contribue certes à augmenter le phénomène de

déplétion-floculation, mais elle aboutit également à une augmentation importante de la viscosité de la
phase continue riche en guar, diminuant ainsi la vitesse de sédimentation des gouttelettes (Figure 61).
Par conséquent, les gouttelettes riches en protéines du système lait / guar à 0,3% auraient davantage le
temps de croître par coalescence avant de former la couche de sédiment que le mélange contenant
0,25% de guar. Par ailleurs, l’évolution des structures du système cisaillé jusqu’à pH 5,7 se produit à
43°C uniquement pendant l’intervalle de temps de moins d’une heure compris entre la fin de la mise
en œuvre du cisaillement et le début de la formation du gel. Au contraire, le passage à 8°C pendant
2 h favoriserait un début de coalescence et de sédimentation des gouttelettes avant une accélération
importante de cette évolution lors de l’augmentation de la température à 43°C avant la gélification.
L’ensemble de ces conditions thermiques et mécaniques, mais aussi les différences de viscosité de la
phase continue seraient à l’origine des différences microstructurales observées. Outre le temps de
gélification, des facteurs supplémentaires gouvernent la microstructure de ces systèmes et sont donc à
prendre en compte pour la compréhension des phénomènes.
Puisque le temps de gélification apparaît être un facteur important, mais non suffisant, pour la
structuration des gels mixtes acides, le phénomène de séparation de phases constitue un deuxième
paramètre à maîtriser. Ainsi, une démarche d’ajustement des cinétiques relatives de séparation de
phases et de gélification a été mise en place au sein de systèmes enrichis en guar à 0,3% (Figure 124a
et b).
216
25 2,0
a 60°C b 30°C
Temps de gélification (h)

43°C
20
30°C 1,5
60°C
15
1,0
10 43°C
0,5
5
0 0,0
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 0 1 2 3 4 5
Temps (h) Concentration en GDL (%)
Figure 124 : (a) Valeur maximale de ∆rétrodiffusion dans la partie inférieure de l’échantillon de mélanges lait / guar
à 0,3% non acidifiés à 30°C, 43°C et 60°C en fonction du temps ; (b) Temps de gélification correspondant au temps
nécessaire pour atteindre un pH de 5,2 en fonction de la concentration en GDL ajoutée à un mélange lait / guar à
0,3% à 30°C, 43°C ou 60°C. Les lignes en pointillés gris correspondent au temps de début de formation de la couche
de sédiment sur les figures a et b.
La technique d’interaction lumière-matière utilisée tout au long de ce travail (Figure 58) a

permis d’identifier le temps de début de formation de la couche de protéines sédimentées dans des
mélanges lait / guar à 0,3% à une température de 30°C, 43°C et 60°C (Figure 124a), soit
respectivement 0,7 h, 0,5 h et 0,25 h. Ensuite, de manière à ce que le moment de gélification
intervienne juste avant le début de la formation du sédiment, la concentration en GDL a été ajustée à
une concentration de 2,5%, 1,5% et 1,13% pour des températures d’acidification respectivement de
30°C, 43°C et 60°C (Figure 124b). Modifier la température a permis d’une part d’ajuster les temps de
gélification par une connaissance de la vitesse d’hydrolyse de la GDL, et d’autre part de moduler la
vitesse de séparation de phases par un changement de viscosité (Figure 122). A titre d’exemple, un
changement de température de 60°C à 30°C diminue d’environ un facteur deux la viscosité du
mélange (résultats non montrés).
A partir de l’étude des cinétiques d’acidification obtenues expérimentalement suite à un ajout

d’une concentration en GDL déterminée selon la Figure 124b combinée à l’évolution de
∆rétrodiffusion en fonction du temps, il est possible de vérifier si les temps de gélification et de début
de sédimentation coïncident (Figure 125a). Alors qu’une concordance parfaite entre ces deux temps
est mise en évidence dans les systèmes acidifiés à 30°C et 43°C, une légère sous-estimation du temps
de gélification a lieu dans le mélange acidifié à 60°C par rapport au temps d’apparition de la couche
de sédiment. L’hydrolyse de la GDL particulièrement rapide en début d’acidification à 60°C, et donc
217
plus difficilement contrôlable, est responsable de ce léger décalage. Dans cette situation, la
sédimentation des gouttelettes riches en protéines a été bloquée par le phénomène de gélification juste
avant d’avoir atteint la partie inférieure de l’échantillon.
a 25 6,5 b
60°C
43°C 60°C
20 30°C 6,0
15
pH
5,5
10 43°C
5,0
5
0 4,5 30°C
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
Temps (h) 250 µm
Figure 125 : (a) Valeur maximale de ∆rétrodiffusion dans la partie inférieure de l’échantillon de mélanges lait / guar
à 0,3% non acidifiés à 30°C, 43°C et 60°C en fonction du temps (lignes épaisses) et cinétiques d’acidification de ces
mélanges additionnés de 2,5%, 1,5% et 1,13% de GDL à respectivement 30°C, 43°C et 60°C (lignes fines). Les
lignes en pointillés gris correspondent au temps de début de formation de la couche de sédiment à 30°C, 43°C et
60°C. Le pH de gélification de 5,2 est rappelé par la ligne noire épaisse ; (b) Gels brassés enrichis en guar à 0,3% à
pH 4,6 ayant été acidifiés à l’aide de 1,13%, 1,5% et 2,5% de GDL à respectivement 60°C, 43°C ou 30°C (de haut en
bas) observés en microscopie optique. Les barres représentent 250 µm.
Les morphologies des gels brassés obtenus après une acidification à 30°C, 43°C ou 60°C
montrées sur la Figure 125b peuvent être comparées sur la base des cinétiques de sédimentation et de
gélification. Le système acidifié à 60°C ayant gélifié juste avant que la couche de sédiment ne se
forme, apparaît sous la forme de micro-gels d’une taille d’environ 30 µm, légèrement agrégés entre
eux et en mélange avec de fins filaments. En revanche, des micro-gels plus volumineux sont présents
dans les gels brassés fabriqués à 30°C et 43°C. Bien que les temps de gélification et de début de
formation du sédiment soient parfaitement ajustés dans le cas de ces deux gels, les micro-gels du
système préparé à 30°C apparaissent moins sphériques et sont environ deux fois plus grands que ceux
formés par une acidification à 43°C. Ces différences de morphologie pourraient s’expliquer par un
effet d’agitation thermique. Celle-ci permettrait dans le cas d’une acidification à 60°C, d’allonger
certaines gouttelettes de manière très fine, et au contraire, à 30°C, elle favoriserait la coalescence des
gouttelettes par une diminution du mouvement des molécules, et un début de sédimentation après
218
avoir atteint une taille et une densité critiques. Ainsi, l’ajustement des temps de gélification par
rapport aux temps de séparation de phases ne permet d’expliquer que partiellement les différences de
microstructures des gels acides brassés. L’agitation thermique constitue en effet un second facteur
essentiel à prendre en considération.
Dans le but d’étudier l’effet combiné de l’agitation thermique et de l’intervalle de temps entre
les débuts de la sédimentation et de gélification, la Figure 126 illustre un ensemble de morphologies
de gels brassés enrichis à 0,3% de guar acidifiés de 30°C à 60°C à l’aide de concentrations en GDL
variables. Il est à noter que la fabrication de gels brassés à haute température et avec un intervalle de
temps faible n’est pas réalisable dans ces conditions en raison de la sédimentation rapide des
gouttelettes riches en protéines. Toutefois, comme illustré dans le chapitre 5, II, un levier de
formulation consisterait à appliquer un cisaillement avant la formation du gel dans l’objectif de
limiter considérablement l’évolution du système.
A basse température d’acidification et quel que soit l’intervalle de temps entre les débuts de la
sédimentation et de gélification, une microstructure sous la forme de micro-gels très allongés
apparaît. Cependant, il semble que plus cet intervalle de temps augmente, plus la largeur des
filaments augmente. Les gouttelettes dispersées auraient davantage le temps d’évoluer par
coalescence et sédimentation au sein d’une phase continue de haute viscosité avant la formation du
gel. A la différence des gels formés à 30°C et 35°C, les gels acidifiés à une température supérieure à
47°C se présentent sous la forme de micro-gels de petite taille et de plus en plus agrégés entre eux à
mesure que la température d’acidification augmente. Pour l’ensemble de ces gels, la gélification
intervient avant que la séparation de phases ne se produise, ce qui masquerait un éventuel effet de
l’intervalle de temps entre les débuts de la sédimentation et de la gélification. Une très large variation
de morphologies de micro-gels du système acidifié à 43°C est mise en évidence en fonction du temps
disponible pour l’évolution des gouttelettes avant leur gélification. Ainsi, une acidification à 43°C
semble être une température intermédiaire pour laquelle la viscosité de la phase continue favorise la
coalescence et la sédimentation des gouttelettes tout en limitant un effet d’agitation thermique
excessif qui produirait un mélange de petits micro-gels et de fins filaments. Par conséquent, ces
conditions thermiques apparaissent être optimales pour créer une variété de morphologies au sein de
mélanges lait / guar à 0,3% en modifiant l’intervalle de temps entre les débuts de la sédimentation et
de la formation du gel.
219
60 Domaine non exploitable

(sédimentation excessive)
Température (°C)
55
Effet dominant de
l’agitation thermique
50
45
40
Effet dominant de tsép-tgél
35
30 250 µm
-0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4

tsép-tgél (h)
Figure 126 : Gels brassés enrichis en guar à 0,3% à pH 4,6 ayant été acidifiés à l’aide de différentes concentrations en GDL à des températures allant de 30°C à
60°C observés en microscopie optique présentant des intervalles de temps entre le début de la sédimentation (tsép) et de gélification (tgél) variables. tgél correspond
au temps nécessaire pour atteindre un pH de 5,2. Les barres représentent 250 µm.
220
En complément de l’étude de la microstructure des gels acides brassés, une analyse rhéologique
aux petites déformations de gels présentant un intervalle de temps variable entre les débuts de
sédimentation et de gélification a été menée (Figure 127).
8
G' (Pa) (0,5 Hz)
0
-0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4
tsép-tgél (h)
Figure 127 : Modules élastiques G’ à 0,5 Hz de gels brassés enrichis en guar à 0,3% à pH 4,6 ayant été acidifiés à
l’aide de différentes concentrations en GDL à des températures allant de 30°C à 60°C en fonction de l’intervalle de
temps entre le début de la sédimentation (tsép) et de gélification (tgél). tgél correspond au temps nécessaire pour
atteindre un pH de 5,2.
Malgré les différences importantes de morphologies mises en lumière à l’échelle microscopique

(Figure 126), aucune tendance claire de l’évolution de G’ en fonction du temps disponible pour
l’évolution des gouttelettes avant leur gélification ne se dégage. En effet, la contribution des micro-
gels dispersés dans une phase riche en guar aux propriétés rhéologiques est variable selon la longueur,
la largeur ou encore la dureté de ces particules qui peuvent être présentes de manière isolée, agrégée
ou enchevêtrée. L’ensemble de ces différences structurales implique une complexité d’interprétation
vis-à-vis des propriétés rhéologiques et établir un lien entre ces structures et les propriétés
rhéologiques devient alors difficile.
II. CONCLUSION GENERALE
Sur la base des observations microscopiques, les différences de morphologie des gels mixtes
brassés peuvent s’inscrire dans le cadre d’un schéma général d’interprétation faisant appel à un effet
de compétition entre les processus de gélification et de séparation de phases. Par ailleurs, la création
de ces microstructures originales servira de levier d’action pour orienter les propriétés rhéologiques et
sensorielles (Figure 128).
221
Facteurs clés déterminant la morphologie des micro-gels
• Caractéristiques des polymères (structure chimique, masse moléculaire,

conformation, charge…)
Paramètres de • Concentration en polymères
composition et • Force ionique
de procédé • pH
• Température
• Force externe (cisaillement, force de gravité)
Séparation de Compé
Compétition
Cinétiques Gélification
phases
INGENIERIE INVERSE
Microstructure
Taille, forme
Concentration
Dureté
Phase continue
Propriétés rhé
rhéologiques Propriétés sensorielles
Figure 128 : Schéma récapitulatif des paramètres déterminant la microstructure de gels laitiers acides enrichis en
polysaccharides
A travers les variations de paramètres de composition et de procédé, les facteurs clés

déterminant la morphologie des micro-gels ont été identifiés. Ces facteurs modifient de manière
majeure les trois phénomènes participant à la structuration des gels brassés enrichis en
polysaccharides : la force de déplétion, l’agitation thermique et l’intervalle de temps entre les débuts
de sédimentation et de gélification. Par la représentation d’un espace tridimensionnel (Figure 129a), il
est possible d’isoler trois plans correspondant à une force de déplétion faible, moyenne ou élevée
(Figure 129b). La force de déplétion peut varier en fonction de la concentration et de la viscosité
intrinsèque du polymère, mais également de la force ionique ou du pH.
222
a Force de
déplétion
Elevée
Moyenne
Agitation
thermique
Faible tsép-tgél
b
Agitation Agitation Agitation
thermique thermique thermique
Faible Moyenne Elevée
tsép-tgél tsép-tgél tsép-tgél

Figure 129 : (a) Représentation schématique en trois dimensions des facteurs déterminant la microstructure de
systèmes acidifiés lait / polysaccharides ; (b) Représentation schématique de la morphologie des gels acides brassés
en fonction de l’agitation thermique et de l’intervalle de temps entre le début de la sédimentation (tsép) et de la
gélification (tgél) pour les trois plans correspondant à une force de déplétion faible, moyenne et élevée. Sur les
schémas, les parties grises correspondent à des zones riches en protéines, celles blanches à une phase de lactosérum
comprenant ou non des polysaccharides.
A faible force de déplétion, les gels acides brassés se présentent sous la forme d’une suspension
concentrée d’agrégats protéiques de taille variable dispersés dans du lactosérum en mélange ou non
avec une solution de polysaccharides. Une illustration de ce type de microstructure concerne les
systèmes intégrant une quantité inférieure ou égale à 0,05% de guar ou 0,01% de xanthane. Pour ces
gels brassés, une modification de l’agitation thermique ou un décalage des temps de sédimentation ou
de gélification ne contribue pas de manière majeure à un changement de morphologie puisque la
micro-séparation de phases est suffisamment lente à s’établir et de faible ampleur.
223
En condition de force de déplétion élevée, l’utilisation d’une concentration importante en

polysaccharides dans un système laitier conduit à une inversion de phases et à la formation de micro-
gels riches en protéines dispersés dans une phase continue riche en polysaccharides. En raison de la
haute viscosité de la phase continue, les domaines enrichis en protéines sont peu sensibles à une
variation de l’agitation thermique et peu enclins à croître par coalescence ou à sédimenter quel que
soit le temps disponible avant leur gélification. Les gels acides brassés à base d’une concentration en
guar supérieure ou égale à 0,4% ou en xanthane supérieure à 0,2% constituent des exemples de ce
type de microstructures.
Seul le plan intermédiaire de l’espace tridimensionnel, caractéristique des systèmes à force de

déplétion moyenne, présente des variations importantes de microstructure en fonction de l’agitation
thermique et de l’intervalle de temps entre les débuts de sédimentation et de gélification. Par des
phénomènes de coalescence et de sédimentation liés à un effet de gravité et/ou d’agitation thermique,
une large gamme de morphologies de micro-gels peut être créée, allant de longs filaments
enchevêtrés, à des micro-gels déformés et sphériques. Ainsi, augmenter ou diminuer les temps de
sédimentation et de gélification détermine la possibilité d’évolution des domaines enrichis en
protéines avant que la gélification acide des protéines ne fige le système (Chapitre 3). Ceci peut être
mis en œuvre par une modification de la méthode d’acidification, par l’action de forces externes telles
que l’application d’un cisaillement ou d’une force centrifuge, ou encore par un changement de la
température. Dans ce dernier cas, l’agitation thermique intervient de manière prépondérante en
augmentant le mouvement des particules, ce qui conduit à la formation de micro-gels de petite taille
et de filaments très fins et allongés dans les systèmes enrichis en guar à 0,3% (Chapitre 5). En
revanche, la compréhension des structures fibreuses, mises en évidence dans les mélanges lait /
xanthane en milieu acidifié dans ces conditions intermédiaires de force de déplétion, relève d’une
complexité supplémentaire en raison de la participation de nombreuses forces intermoléculaires
(Chapitre 4).
A partir de la connaissance des facteurs déterminant la morphologie des gels mixtes brassés, la
maîtrise de la structure des micro-gels permet de concevoir la construction de nouvelles textures
instrumentales et sensorielles. Alors que la taille importante des micro-gels élaborés à partir d’un
système enrichi en xanthane conduit à la perception d’un caractère granuleux prononcé, les longs
filaments fabriqués à base du mélange lait / guar contribuent davantage, par leurs nombreux
enchevêtrements, à des consistances instrumentales et sensorielles élevées (Chapitre 6). Par
conséquent, l’ensemble des paramètres structuraux, tels que la taille, la forme ou encore la dureté des
224
particules est à prendre en considération dans la perception sensorielle de produits composés de

particules. Dans l’objectif de diminuer la perception de granuleux des micro-gels, un levier de
formulation consisterait à modifier le contraste de fermeté entre la phase continue et les particules. A
la différence d’un changement de la viscosité de la phase continue mise en œuvre par exemple par
l’ajout d’un épaississant ou d’un gélifiant, la variation de la dureté des micro-gels implique une
réflexion plus complexe qui ouvre de nouvelles perspectives quant à la formulation de ces particules.
La transposition de la démarche adoptée pour la création des micro-gels à d’autres systèmes

laitiers mixtes pose la question de la validité de la théorie pour des polymères autres que le guar et le
xanthane. L’ensemble des résultats obtenus en utilisant deux polymères de chaîne étendue et de
volume hydrodynamique connu pourrait servir de base pour prédire, à travers une stratégie
d’ingénierie inverse, le comportement d’autres macromolécules dans des systèmes laitiers acidifiés
afin de créer des micro-gels de morphologie souhaitée. Cette approche intégrant des mélanges
binaires de polymères variés pourrait donc conduire à élargir la gamme de morphologies et de texture
des micro-gels, et de manière d’autant plus importante dans le cas de systèmes ternaires. Ainsi,
certains polysaccharides chargés interagissant par pontage avec les micelles de caséines tels que les
carraghénanes ou les pectines, pourraient être utilisés en combinaison avec le guar dans le but de
diminuer une agrégation dense des caséines et par conséquent, la dureté des micro-gels.
Puisque la morphologie des micro-gels est gouvernée en partie par les propriétés interfaciales
particulières de l’émulsion eau dans eau, le rôle de l’interface et notamment des protéines sériques au
sein de ces systèmes nécessiterait une étude plus détaillée. Par ailleurs, l’ajout de tensio-actifs
spécifiques ou de microparticules solides telles que des nanocristaux de cellulose dans le cas des
émulsions de Pickering, agissant en tant que nouveaux modificateurs des propriétés de l’interface,
ouvre la voie à de nouvelles recherches.
Un autre axe de développement consisterait à exploiter l’effet du cisaillement pour la création

de micro-gels de morphologies contrôlées. En constante progression depuis quelques années, les
techniques de microfluidiques pourraient servir de base à l’étude du comportement des émulsions eau
dans eau en conditions gélifiantes, afin non seulement de maîtriser l’intensité du cisaillement
appliqué, mais aussi de produire des structures davantage monodisperses.
La mise en place de l’évaluation sensorielle de tels produits a permis de mettre en lumière les
éléments de structure à prendre en compte pour modifier la perception sensorielle, et notamment le
niveau d’allongement des particules. A travers la diversité des conditions explorées dans ce travail,
225
les connaissances ont pu être mises en pratique pour générer une variété de morphologies de micro-
gels. Sur cette base, les impacts de la morphologie des particules, mais également de leur fermeté et
de leur état de surface sur la perception du caractère granuleux ou râpeux mériteraient d’être
approfondis.
Les perspectives de transfert au plan des applications sont prometteuses, en particulier d’un
point de vue de l’innovation produit. Présentant un intérêt nutritionnel grâce à leur teneur en protéines
élevée, les micro-gels pourraient être utilisés en tant qu’analogues de fibres protéiques ou substituts
de matière grasse. Des ajustements dans la morphologie et la texture des micro-gels permettraient
d’augmenter l’acceptabilité de ces produits innovants par les consommateurs. Ainsi, l’étendue du
champ des applications serait principalement déterminée par deux facteurs : une connaissance
approfondie de ces systèmes complexes et notre créativité.
226
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242
ACTE DE CONFÉRENCES
InsideFood Symposium, 9-12 April 2013, Leuven, Belgium
Designing microstructure into acid skim milk/guar gum gels

a,b,c a,b,c
Anne Rohart and Camille Michon
a
AgroParisTech, UMR1145 Ingénierie Procédés Aliments, 1 avenue des Olympiades, F- 91300 Massy, France
b
INRA, UMR1145 Ingénierie Procédés Aliments, 1 avenue des Olympiades, F- 91300 Massy, France
c
CNAM, UMR1145 Ingénierie Procédés Aliments, 292 rue Saint-Martin, F- 75003 Paris, France
ABSTRACT
The possibility of designing various microstructures through the interplay between phase
separation due to depletion mechanisms and gelation process due to acid-induced casein micelles
aggregation was investigated. Acid skim milk/guar gum gels were prepared at different guar gum and
glucono-δ-lactone (GDL) concentrations in order to be able to modulate the extent of phase
separation and the gelation rate. Results obtained by using microscopy and rheological measurements
indicated that at low guar gum concentrations a denser network was formed whereas higher guar gum
concentrations lead to filamentous or protein-rich droplets in a guar gum continuous phase with fluid-
like properties. Changing GDL concentration, i.e. gelation rate, provoked a shift in microstructure and
rheological properties of the mixed gels. It suggested that milk gelation process had the effect of
stopping phase separation at some intermediate state, generating controlled microstructures varying in
size and shape from elongated to droplet-like.
1 INTRODUCTION
During the production of acid milk gels, the pH of the milk is lowered from 6.8 to 4-4.5 using
either bacterial cultures, which ferment lactose into lactic acid, or using glucono-δ-lactone (GDL),
which mimics the bacterial fermentation. This process leads to a network of three-dimensional casein
strands aggregated through iso-electric precipitation. The casein strands can be broken apart by
shearing, providing stirred acid milk gels (Tamime & Robinson, 1999). The kinetics and the
dynamics of the formation of casein gels can be controlled by varying the glucono-δ-lactone (GDL)
amount to produce different acidification rates (Horne, 2001). Whereas the aggregation and gelation
of casein micelles as a result of acidification have frequently been studied (Lucey, 2002), the
presence of polysaccharides during the acid-induced gelation leads to another degree of complexity of
milk protein systems. Polysaccharides such as guar gum, locust bean gum, xanthan gum or pectin can
be used in acid milk gels to modify the rheological properties (Sanchez et al., 2000; Everett &
McLeod, 2005; Doublier et al., 2000). It has been shown that the addition of guar gum to the skim
milk at the natural pH of the mixtures results in a segregative phase separation between the micellar
casein and guar gum described by a depletion-flocculation mechanism (Bourriot et al., 1999; Tuinier
et al., 2000). When acidified with a low guar gum concentration, the acid mixed systems showed a
more compact aggregate structure. With higher concentrations, aggregated caseins are trapped within
a viscous polysaccharide solution (Everett & McLeod, 2005). Thus gelation of one phase appears as a
competing event and will arrest the process of the phase separation at some intermediate state. This
phenomenon was well illustrated using mixtures of gelatin and dextran or maltodextrin (Lorén &
Hermansson, 2000; Norton & Frith, 2001; Van Puyvelde et al., 2003).
The main objective of this work was to illustrate how the microstructure and rheological
behaviour of food material can be designed, considering the competition between phase separation
and gel formation. For this purpose, the effect of guar gum on the microstructural and rheological
properties of stirred acid skim milk gels was investigated.
2 MATERIAL AND METHODS
2.1 Mixed gels manufacture
Skim milk with 46 g.kg-1 of proteins was prepared with low-heat skim milk powder (CH low
heat, Ingredia, Arras, France) dissolved in Milli-Q water (made by reverse osmosis followed by
filtration through a Milli-Q apparatus) using a magnetic stirrer for 1 h at room temperature. The
reconstituted skim milk was then left to fully hydrate overnight in a refrigerator. The milk was heat-
treated in a thermostatically controlled water bath at 80°C for 7 min, and cooled to 60°C for dry
powdered guar gum addition. The mixture was stirred for a further 30 min at 60°C and finally cooled
to 43°C. Skim milk/guar gum mixed solutions were prepared at guar gum concentrations from 0 to
0.5 wt%.
The acidification of the milk was obtained by addition of different levels (1, 1.5 or 2.5 wt%) of
GDL (Sigma Chemical Co., St Louis, MO, USA) at 43°C under stirring for 1 min. Immediately after
the GDL addition, the milk was poured into plastic cylinders (30 mm diameter X 65 mm height) and
placed in an incubator at 43°C until a pH of 4.60 (±0.05) for 1.5 and 2.5 wt% GDL or pH of 4.7
(±0.05) for 1 wt% GDL was reached. The pH was measured in parallel with a pH meter Consort
D130 multiparameter analyzer (Turnhout, Belgium). Acid milk gels were stored at 4°C for 1 day until
required analysis. For stirred gels preparation, after cooling down to 20°C for 1 h in tap water, the
gels were broken and stirred by forcing the gels with a peristaltic pump through two successive
plastic pipes (length: 40 cm and internal diameter: 7 mm; length: 100 cm and internal diameter:
3 mm) with a mesh of 500 µm holes at the end. Strongest gels, typically those with strand-like
structure, could not be forced through the filter and were only stirred in the pipes to obtain a
homogeneous gel.
For phase separation observations, milk samples (4 mL) were poured and let acidify in glass
tubes (inner diameter 6.1 mm) and then stored at 4°C overnight after reaching a pH of 4.60 (±0.05)
for 1.5 and 2.5 wt% GDL or pH of 4.7 (±0.05) for 1 wt% GDL or 5 h for the non acidified mixture.
The value of height fraction of supernatant enriched in guar gum and/or whey was calculated as the
ratio of the height of top layer (H) to the total height of the sample (H0).
2.1 Instrumental characterization (microstructure and rheological measurements)
Epifluorescence microscopy was used to visualize the microstructure of the stirred mixed gels
using an Olympus BX51 microscope (Olympus America, Lake Success, NY). Nile Red was dispersed
in the samples (25 µL in 1 g of sample) in order to stain the proteins. Confocal laser scanning
microscopy (CLSM) was performed with a Leica TCS AOBS SP2 microscope (Leica, Germany).
Proteins were labelled by addition of DyLight 549 (20 µL in 1 g of sample). DyLight 549 was excited
using a helium-neon laser with wavelength 543 nm and the fluorescence was detected with a
photomultiplier. The samples were placed on a microscope slide with a glass coverslip on the surface.
All measurements were carried out 1 day after mixed gels manufacture.
Rheological measurements of stirred acid milk gels were performed using a stress-controlled
rheometer (Carri-Med CSL2100, TA Instruments, UK). Stainless steel plate and cone (diameter
60 mm, 4° angle) geometries were used to this measurement. The frequency sweep measurements
were performed within the linear domain, in the range of 0.01-10 Hz. The tan δ (=G’’/G’) was
calculated at the frequency of 0.5 Hz.
3 RESULTS
3.1 Phase separation behaviour of set acid skim milk/guar gum gels
Fig. 1a shows the pH decrease as a function of time after adding various amounts of GDL to
skim milk. The initial pH of the sample was 6.8 and dropped to approximately 4.6 after 2 h or 50 min
with addition of 1.5 or 2.5 wt% GDL respectively and to 4.7 after 4 h with addition of 1 wt% GDL.
With a decrease in the pH, the casein micelles become unstable and flocculation takes place around
pH 5.2 for heated milk (Lucey, 2002). From the pH decrease kinetics it is possible to notice that the
reduction of pH was faster and the time needed for the casein micelles to flocculate was lower for
higher GDL concentrations. This implies that the gelation time decreased with increasing amount of
GDL. Thus these curves can be used to identify the amount of GDL required for a certain
acidification rate.
a 6.4 b 1.0
6.0 0.8
5.6 0.6
H/H0
pH
5.2 0.4
4.8 0.2
2.5% 1.5% 1%
4.4 0.0
0 1 2 3 4 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
Time (h) Guar gum concentration (%)
Fig. 1 Effect of GDL concentration on: a pH kinetic after various amounts of GDL addition (1, 1.5, 2.5 wt%). Values are
means from triplicate experiments; b macroscopic phase separation of the gels formed at 43°C until pH 4.6 for acidified gels
from skim milk + various concentrations (wt%) of guar gum observed 24 h after GDL addition (1 ( ), 1.5 ( ) and 2.5 wt%
( )) or non-acidified mixtures kept 5 h at 43°C ( )
The height fraction of supernatant in acid skim milk/guar gum gels is shown in Fig. 1b for the
three GDL concentrations studied and in non-acidified skim milk/guar gum mixture. The drawn lines
serve to guide the eye. Only 0.01 wt% guar gum is required to induce phase separation in guar
gum/skim milk at pH 6.8. The supernatant is composed of a whey or guar gum solution or both of
them. There is a clear increase in height fraction of supernatant up to 0.15 wt% guar gum followed by
a stabilization for higher guar gum concentrations. Working on casein micelles/guar gum mixtures,
Bourriot, Garnier & Doublier (1999) showed that phase separation was due to a phenomenon of
depletion. The stabilization of height fraction of supernatant for guar gum concentration above
0.2 wt% behaviour can be attributed to the high viscosity of mixed systems that hinders phase
separation. Thus the phase separation may be severely retarded. Phase separation was not observed
for more than 0.5 wt% guar gum on the experimental time.
When acidified with 1, 1.5 or 2.5 wt% GDL, the height fraction of supernatant of the mixed
gels showed a characteristic maximum between 0.1 and 0.2 wt% guar gum and then decreased. These
observations are in agreement with those obtained with locust bean gum at 0.1 wt% by Sanchez et al.,
2000. They reported an increase of the porosity of the acid skim milk/locust bean gum gels leading to
apparent whey off. No phase separation appeared above 0.4 wt% guar gum. This behaviour is similar
for the three GDL concentrations. As the GDL concentration increased, the extent of phase separation
was lower for guar gum concentrations higher than 0.1 wt%. Thus a faster gelation rate, determined
by the GDL concentration, reduces phase separation. As a result, a quick or retarded gelation of the
proteins allowed or not the phase separation process before the formation of the protein network.
3.2 Microstructure of stirred acid skim milk/guar gum gels
0% 0.05% 0.15% 0.3% 0.5%
Fig. 2 Microstructure of acid milk/guar gum gels at pH 4.6 containing various guar gum concentrations (0-0.5 wt%)
indicated in the figure as determined by CLSM at a fixed amount of GDL (1.5 wt%). Scale bars indicate 100 µm.
The microstructure of stirred acid milk gels with fixed amount of GDL (1.5 wt%) and
increasing concentrations of guar gum are shown in Fig. 2. The white areas indicate the protein
stained by DyLight 549, while the dark areas correspond to zones devoid of protein, thus containing
whey or exuded guar gum. Acid milk gels with no added guar gum were homogeneous, but when
0.05 wt% guar gum was added, the casein micelles tended to form a denser network with larger dark
voids in between. With further addition of guar gum (0.15, 0.3 wt%) the area of protein network
decreased. Filamentous morphology appeared for 0.15 wt% of guar gum while a mix of filamentous
structures and deformed droplets (from 10 to more than 100 µm) dispersed in a continuous guar gum-
rich phase was found for 0.3 wt% guar gum concentration. The protein-rich droplets became smaller
and more spherical as guar gum concentration continues to increase up to 0.5 wt%. It should be noted
that filamentous structures and droplets existed before stirring the acid gels and were not oriented
after stirring. As far as we know, such microstructures have never been reported previously for acid
skim milk/guar gum gels.
0% 0.05% 0.1% 0.15% 0.25% 0.3% 0.5%
1%
GDL
1.5%
GDL
2.5%
GDL
Fig. 3 Microstructure of acid milk/guar gum gels at pH 4.6 containing various guar gum concentrations (0-0.5%) indicated in
the figure in wt% as determined by epifluorescence microscopy at three different GDL concentrations (1, 1.5, 2.5 wt%).
Scale bar indicates 100 µm.
Fig. 3 illustrates the change in microstructure with increasing levels of guar gum at three
different GDL concentrations. Epifluorescence micrographs at 1.5 wt% GDL revealed the same
features as CLSM, i.e. a transformation of the structure from an homogeneous to very porous
network, then into organized filamentous structures and finally into protein-rich droplets depending
on the guar gum concentration. The microstructure of the gels acidified with 1 or 2.5 wt% GDL is
comparable to those observed for 1.5 wt% GDL concentration, although it was shifted from
homogeneous protein network to protein-rich droplets at lower guar gum concentration when GDL
concentration increased from 1 to 2,5 wt%. For instance filamentous morphology appeared from
0.1 wt% guar gum for 2.5 wt% GDL whereas it is observed from 0.15 wt% for lower GDL
concentrations.
3.3 Rheological properties of stirred acid skim milk/guar gum gels
Fig. 4a shows the viscoelastic behaviour of stirred milk protein/guar gum gels acidified with
1.5 wt% GDL by means of the mechanical spectra (G’ and G’’ as a function of frequency) measured
at 4°C. The gels without guar gum or with low guar gum concentration (below 0.3 wt% guar gum)
exhibited a solid-like behaviour with the G’ values higher than G’’ values, and both G’ and G’’
showing little dependence on frequency. Adding a high guar gum concentration yielded a dramatic
change in the viscoelastic properties of the system. This is clearly illustrated for 0.3 and 0.5 wt% guar
gum. The solid-like behaviour of the systems tends to disappear with a loss of connectivity in the
network. Instead, a strong frequency dependence of dynamic moduli (G’ and G’’) was observed for
those samples with the viscous component exceeding the elastic one for frequency values lower than
2.5 Hz and 1.5 Hz respectively, indicating a fluid-like behaviour. Therefore, when guar gum was
added to the skim milk system, the mechanical spectra changed significantly, indicating the transition
from a structured system to an entangled polymer solution. The variation of tan δ as a function of
guar gum concentration in Fig. 4b for 1.5 wt% GDL illustrates this clear change in rheological
properties of mixed gels. As the GDL concentration increased, the transition from a structured system
to an entangled solution occurred for lower guar gum concentrations (Fig. 4b). In the case of 2.5 wt%
GDL tan δ began to increase from 0.2 wt% guar gum whereas it was stable until 0.25 wt% guar gum
for 1 wt% GDL addition. However it is worth noting that the value of tan δ was similar for the three
GDL concentrations studied for low guar gum concentrations (below 0.2 wt%) and high
concentrations (above 0.4 wt%).
1000 2.00
a b
1.75
100
1.50
tan δ (0.5 Hz)
G', G'' (Pa)
10 1.25
1.00
1 0.75
0.50
0.1
0.25
0.01 0.00
0.01 0.1 1 10 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
Frequency (Hz) Guar gum concentration (%)
Fig. 4. a Mechanical spectra of stirred acid milk gels with different guar gum concentrations (0 ( ), 0.05 ( ), 0.15 ( ), 0.3 ( )
or 0.5 wt% ( ) acidified with 1.5 wt% GDL (G’, filled symbols; G’’, empty symbols). b Variation of tan δ values at 0.5 Hz of
stirred acid milk gels with different guar gum concentrations acidified with 1 ( ), 1.5 ( ) and 2.5 wt% ( ) GDL.
4 DISCUSSION
The mixed acid skim milk/guar gum gels showed different behaviours exhibiting distinctive
microstructures and mechanical properties. The microstructures resulted from the competition
between the gel formation of the protein and the phase separation process between protein and guar
gum. Phase separation in skim milk/guar gum is likely to be due to flocculation of casein micelles by
depletion mechanisms (Bourriot et al., 1999; Tuinier et al., 2000). However, acidification of milk
leads to a gelation phenomenon. In a complex biopolymer mixture that undergoes phase separation
and gelation at the same time, the later arrests the phase separation (Norton & Frith, 2001;
Tolstogunov, 2003). Playing on the gelation rate but also on the phase separation extent allows
obtaining various final macro- and microstructures. Adding increasing amounts of guar gum to acid
skim milk gels induced the creation of different microstructures. At low guar gum concentrations the
stirred gel microstructures are characterized by a micro-phase separation into the protein network
explaining the high porosity and the high level of syneresis. During milk acidification, the balance
between aggregation of concentrated casein micelles and volume exclusion effects results in
compaction of the casein network and thus to stronger stirred gels (Sanchez et al., 2000; Everett &
McLeod, 2005). Exceeding a certain polymer concentration leads to phase separation into a protein-
enriched and a polysaccharide-enriched phase coexisting in the form of a water/water emulsion
(Norton & Frith, 2001; Tolstoguzov, 1991; Schorsch et al., 2000). When gelation occurs, the system
is trapped at some intermediate state of phase separation and the morphology obtained is influenced
by the droplet dynamics. Both gravitational force and thermal agitation contributes to the extension of
the droplet, which allows obtaining filamentous microstructures or elongated droplets when the
system is “frozen” by the protein gelation. This change in microstructure of the stirred gels in turn
explains their rheological properties with the apparition of liquid-like behaviour. At higher guar gum
concentrations (i.e. 0.35 wt%), guar gum may form a viscous continuous phase containing trapped
compact micellar droplets (Everett & McLeod, 2005). In this case, macroscopic phase separation does
not occur because of the high viscosity of the matrix. Varying the amount of GDL can be used to
modulate the microstructure of the gels. The competition between gelation and phase separation is
affected by the rate of gelation, which in turn is determined by the GDL concentration. A faster
gelation leads to a shift in the microstructure of the gels at lower guar gum concentrations. This
change in microstructure is accompanied by a clear modification of the rheological properties of the
mixed gels. Thus the gelation process has the effect of stopping the development of a two-phases
structure at some intermediate state which slows down the phase separation (Frith, 2010).
The morphologies of the stirred acid skim milk/guar gum gels at high guar gum concentrations
(above 0.15 wt%) can be explained by an incomplete phase separation, since the formation of the
protein network occurred before total phase separation process of systems (Perrechil et al., 2009).
Thus the gel microstructure can be designed by triggerred arrest of the phase-separating structure
through acid-induced particle aggregation (Aichinger et al., 2006). A good knowledge of the phase
separation kinetics and particle dynamics as a function of the acidification kinetics imposed can
therefore be used to produce new structures varying in size and shape from elongated to droplet-like
structures.
5 CONCLUSIONS
The present study showed how the combined phenomenon of phase separation and gelation in
acid skim milk/guar gum gels can be used to design a wide range of microstructures. Microscopy in
combination with rheological experiments was used to understand the mechanisms involved in
acidified milk containing varying concentrations of guar gum and GDL. Interpreting the
microstructure and rheological properties allows interesting conclusions to be drawn regarding the
competition between phase separation and gel formation. Thus gelation can be used to trap kinetically
microstructures and allows the production of controlled structures and morphologies, generating
novel textures for the food products. However, a phenomenological understanding of how different
microstructures can be designed using various guar gum concentrations and gelation rates is not
sufficient to be able to identify which of these mechanisms are dominant in controlling the dynamics
of these mixed gels. Thus, ongoing work is focused on influencing phase separation kinetics using
appropriate acceleration fields and therefore particle dynamics.
ACKNOWLEDGEMENTS
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PHASE SEPARATION AND GEL FORMATION IN KINETICALLY-TRAPPED

GUAR GUM/ACID MILK GELS
A. Rohart1,2,3 and C. Michon1,2,3

1
2
3
ABSTRACT
Phase separation and gel formation kinetics of acid skim milk / guar gum mixtures were
investigated. Due to biopolymer incompatibility, adding specific amount of guar gum to skim milk
created emulsion-like microstructures, which could then be trapped through acid-induced gelation. A
better knowledge of the phase separation and gel formation kinetics allowed choosing accurate
gelation rates. Hence, a surprising spinning of the protein-enriched droplets was observed for low
gelation rates where droplet sedimentation competes with the gelation process. Another way of
playing on particle dynamics was to speed up the phase separation process by using appropriate
acceleration field. Following Stokes’ law, additional gravitational forces contributed to the production
of very long protein-enriched filaments whereas smaller deformed droplets were obtained under
quiescent conditions. Thus a broad range of systems with defined microstructures and mechanical
properties was created by using acid-induced protein gelation to freeze the phase separation process at
the chosen state.
1 INTRODUCTION
Polysaccharides such as guar gum, locust bean gum, xanthan gum or pectin are often used in
acid milk gels to modify the rheological properties.1,2,3 However it has been shown that the addition
of guar gum to skim milk at the natural pH of the mixture results in a segregative phase separation
between the casein micelles and guar gum which is described as a depletion-flocculation
phenomenon.4,5 Exceeding a given polysaccharide concentration, the phase-separated biopolymer
solutions have emulsion-like properties and can be treated as ‘water-in-water emulsions’, each phase
being enriched in one of the two polymers.6,7 When the produced emulsion is under non-equilibrium
conditions, emulsion droplets can evolve through coalescence and sedimentation. Following Stokes’
law, factors determining emulsion instability are the density differences between the two phases, the
mean droplet size, the viscosity of the continuous phase and the gravitation acceleration.8
In order to ‘freeze’ the droplet evolution at an intermediate state of phase separation, gelation
can be used: the gelation process freezes the development of the two-phase structure far from the
thermodynamic equilibrium conditions.9 Using a mixture of gelatin and guar, Wolf et al. (2000 and
2002)10,11 have shown that under specific conditions of applied shear and controlled gelatin gelation
temperature, it was possible to use gelation to trap the dispersed phase in an anisotropic morphology.
Gelation can also be achieved through acid-induced protein gelation.12 During the production of acid
milk gels, the pH of the milk is lowered from 6.8 to 4-4.5 using glucono-δ-lactone (GDL). This leads
to a network of three-dimensional casein strands aggregated through iso-electric precipitation. The
kinetics of the formation of casein gels can be controlled by varying the glucono-δ-lactone (GDL)
amount to produce different gelation rates.13
A good knowledge of the phase separation kinetics and particle dynamics as a function of gel
formation kinetics is therefore crucial to kinetically trap various morphologies. The main objective of
this work was to explore more precisely various conditions of phase separation and gelation kinetics
and gain knowledge on the most important factors influencing particle dynamics.
2 MATERIALS AND METHODS
2.1 Mixed Gels Manufacture
Skim milk with 46 g.kg-1 of proteins was prepared with low-heat skim milk powder (CH low
heat, Ingredia, Arras, France) dissolved in Milli-Q water (made by reverse osmosis followed by
filtration through a Milli-Q apparatus) using a magnetic stirrer for 1 h at room temperature and kept
overnight in a refrigerator in order to let proteins fully hydrate. The milk was then heat-treated at
80°C during 7 min using a thermostatically-controlled water bath. It was cooled down to 60°C and
guar gum (Viscogum, Cargill, USA) was dispersed under stirring. The mixture was stirred 30 min at
60°C and finally cooled to 43°C. Guar gum concentrations from 0 to 0.5 wt% were studied.
Milk was acidified by addition of different levels (1, 1.5 or 2.5 wt%) of GDL (Sigma Chemical
Co., St Louis, MO, USA) at 43°C under stirring during 1 min. Immediately after the GDL addition,
the milk was poured into plastic cylinders (30 mm diameter, 65 mm height) and placed in an
incubator at 43°C until a pH of 4.60 (±0.05) for 1.5 and 2.5 wt% GDL and pH of 4.7 (±0.05) for
1 wt% GDL, respectively. The pH was measured in the meantime with a pH-meter Consort D130
multiparameter analyzer (Turnhout, Belgium). After cooling down to 20°C during 1 h at room
temperature, the gels were sheared using of a peristaltic pump; the product passed through two
successive plastic pipes (length: 40 cm and internal diameter: 7 mm; length: 100 cm and internal
diameter: 3 mm) with a mesh of 500 µm holes at the end while pushed by a Masterflex® peristaltic
pump (Cole Parmer, Vernon Hills-USA) (380 mL.min-1). Stirred acid milk gels were stored at 4°C
during 1 day before analysis.
In order to speed up the macroscopic phase separation, some mixtures were transferred prior to
gelation in centrifuge tubes (25 mL) and centrifuged in a 3.18 K centrifuge (Sigma, Munich,
Germany) with a centrifuge force of 2.5 g at a temperature of 43°C until pH 4.6 was reached.
2.2 Instrumental Characterization
For phase separation observations, a non-acidified guar gum / skim milk mixture was poured in
glass tubes (diameter 27.5 mm). Backscattering values at 880 nm were acquired every 40 µm along a
40 mm height of tube using a Turbiscan LAB (Formulaction, France) at different time intervals.
Systems were observed using a Leica TCS AOBS SP2 (Leica, Germany) confocal laser
scanning microscope (CLSM). Proteins were labelled by addition of DyLight 549 (20 µL in 1 g of
sample) that was excited at 543 nm using a helium-neon laser. Fluorescence was detected with a
photomultiplier. The samples were placed on a microscope slide under a glass coverslip.
Rheological measurements of stirred acid milk gels were carried out in a stress-controlled
rheometer (Carri-Med CSL2100, TA Instruments, UK), using a stainless steel plate and cone
geometry (60 mm diameter, 4° angle). The frequency sweep measurements were performed from 0.01
to 10 Hz within the linear domain. Tan δ corresponds to the ratio of viscous to elastic properties. All
measurements were carried out 1 day after stirred acid milk gels manufacture.
3 RESULTS AND DISCUSSION
3.1 Acid Skim Milk / Guar Gum Gels: Microstructure and Rheological Properties
Figure 1 shows the microstructure and the rheological properties of stirred acid milk gels with
1.5 wt% of GDL and increasing concentrations of guar gum (0-0.5 wt%). The white areas indicate the
protein stained by DyLight 549, while the dark areas correspond to zones devoid of protein, thus
containing whey and exuded guar gum.
0% 0.05% 0.15% 0.3% 0.5%

(a)
1000 1000 1000 1000 1000

(b)
G’, G’’ (Pa)
100 100 100 100 100
10 10 10 10 10
1 1 1 1 1
0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
0.01 0.01 0.01 0.01 0.01

0.01 0.1 1 10 0.01 0.1 1 10 0.01 0.1 1 10 0.01 0.1 1 10 0.01 0.1 1 10
3.0 3.0 3.0 3.0 3.0

(c) 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5
2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
tan δ
1.5 1.5 1.5 1.5 1.5

1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
0.0 0.0 0.0 0.0 0.0

0.01 0.1 1 10 0.01 0.1 1 10 0.01 0.1 1 10 0.01 0.1 1 10 0.01 0.1 1 10
Frequency (Hz)
Figure 1 (a) Microstructure; (b) Mechanical spectra (G’ (line) and G’’ (dotted line));
(c) Variation of tan δ values with frequency of stirred acid milk / guar gum gels at pH 4.6
containing various guar gum concentrations (0-0.5 wt%) indicated in the figure acidified
at a fixed amount of GDL (1.5 wt%). Microstructure was determined by CLSM. Scale
bars indicate 100 µm
Acid milk gels with no added guar gum were homogeneous. When 0.05 wt% guar gum was
added, the casein micelles tended to form a denser network with larger dark voids in between
(Figure 1a). Those gels exhibited a solid-like behaviour with the G’ values higher than G’’ ones, and
both G’ and G’’ showing little dependence on frequency (Figure 1b). Although filamentous
morphology appeared for 0.15 wt% of guar gum, the G’, G’’ and tan δ spectra shown in figure 1b
and 1c respectively were still that of a typical structured system but with lower G’ et G” values and
slightly higher tan δ values than those obtained for a non-enriched guar gum gel. Increase of guar
gum concentration lead to dramatic changes in stirred gels microstructure and rheological properties.
A mix of filamentous structures and deformed droplets (from 10 to more than 100 µm length)
dispersed in a continuous guar gum-rich phase was found for 0.3 wt% guar gum. By adding a large
amount of guar gum to the system (0.5 wt%), protein-rich spherical droplets were observed. This
change in microstructure is accompanied by a clear modification of the rheological properties of the
mixed gels. The solid-like behaviour of the systems tended to disappear with a loss of connectivity in
the network. Instead, a strong frequency dependence of the dynamic moduli (G’ and G’’) was
observed for those samples indicating a fluid-like behaviour. Therefore, when increasing guar gum
concentrations were added to the skim milk system, the mechanical spectra changed significantly
with a transition from a structured system to an entangled polymer solution.
Adding increasing amounts of guar gum to acid skim milk gels induced the creation of different
microstructures. At low guar gum concentrations the stirred gel microstructures are characterized by a
micro-phase separation in the protein network explaining the high porosity of the network. During
milk acidification, the balance between aggregation of concentrated casein micelles and volume
exclusion effects results in compaction of the casein network and thus to stronger stirred gels.2
Exceeding a given polymer concentration leads to a phase separation into a protein-enriched phase
and a polysaccharide-enriched phase coexisting in the form of a water-in-water emulsion.7,14,15 At
higher guar gum concentrations (i.e. 0.3 wt%), guar gum forms a viscous continuous phase (as shown
in figure 1b and 1c) containing trapped compact micellar droplets.3
However, for intermediate guar gum concentrations (between 0.15 and 0.3 wt%), the viscosity
of the continuous phase is not sufficient to inhibit droplet mobility. According to Stokes’ law, a lower
continuous phase viscosity will accelerate the phase separation process. Therefore the protein-
enriched droplets will tend to sediment in mixed gels containing between 0.15 and 0.3 wt% guar gum,
which can explain the elongated and deformed droplets that were obtained. We will discuss this point
more thoroughly below.
3.2 Influence of Phase Separation and Gelation Kinetics on Microstructure of Acid Skim
Milk / Guar Gum Gels
Addition of guar gum to skim milk results in a phase separation beyond a given biopolymer
concentration.4,5 This process is highly dependent on experimental time because of a non-
thermodynamic equilibrium. Therefore, the phase separation kinetics of a 0.3 wt% guar gum / skim
milk mixture was studied using light backscattering technique. Figure 2a shows the variation of the
delta backscattering for this mixture over different times compared to the control (time = 0 h).
A modification of backscattered intensity profiles appeared from 0.1 h compared to the initial
time with a decrease in backscattering level at the top while it increased at the bottom of the tube
(Figure 2a). However, after 0.5 h, the delta backscattering level remained constant at the bottom
wheareas the height of sedimented layer increased and reached 10 mm after 1 h (Figure 2a and b). It
was shown that in the case of a 75/25 volume ratio locust bean gum / skim milk protein mixture, the
phase separation was observable less than 1 min after mixing.7
Droplet Sediment
(a) (b) sedimentation layer
25 25
Time (h)
20 0
20
15 0.1
0.5
10 0.7 15
1
5
0 10
-5
5
-10
-15 0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
Figure 2 (a) Delta backscattering values of non-acidified 0.3% guar gum / skim milk mixture
along its height in a glass tube over the time at 43°C; (b) Maximum value of delta
backscattering at the bottom of the tube as a function of time. Dotted lines correspond to
the time of the beginning of droplet sedimentation (0.1 h) and apparition of continuous
sediment layer (0.5 h)
When a mixed biopolymer solution phase separates, the two phases will form a droplet
structure, similar to that of an emulsion.9 A change in backscattering is mainly related to a change in
particle size or concentration. Thus the increase in backscattering level at the bottom after 0.1 h may
be consecutive to an increase in droplet concentration due to sedimentation. According to Stokes’
law, the larger droplets migrate to the bottom of the tube first, which contributes to the increase in
delta backscattering up to 0.5 h. Then, the packed bed of droplets is coalescing to form the broken
sedimented layer at the bottom of the tube.
Figure 3 shows the pH decrease as a function of time after adding various amounts of GDL to
skim milk. The initial pH of the sample was 6.8 and dropped to approximately 4.6 after 2 h or 50 min
with addition of 1.5 or 2.5 wt% GDL respectively and to 4.7 after 4 h with addition of 1 wt% GDL.
With a decrease in pH, the casein micelles become unstable and flocculation takes place around pH
5.2 for heated milk.16 From these pH decrease kinetics it is possible to notice that the reduction of pH
was faster and the time needed for the casein micelles to flocculate was lower for higher GDL
concentrations. This implies that the gelation time decreased with increasing amount of GDL. Indeed
the pH of 5.2 was reached after 0.7, 0.5 and 0.2 h with addition of GDL amount of 1, 1.5 and 2.5 wt%
respectively.
Droplet Sediment
sedimentation layer
6.4
6.0
pH 5.6
pH of gel
5.2
formation
4.8
1%
2.5% 1.5%
4.4
0.01 0.1 1
Time (h)
Figure 3 pH kinetics of 0.3 wt% guar gum / milk mixture after various amounts of GDL addition
(1, 1.5, 2.5 wt%). Dotted lines correspond to the time of the beginning of droplet
sedimentation (0.1 h) and apparition of continuous sediment layer (0.5 h) and the pH of
gel formation (pH 5.2) as indicated in the figure. Values are means from triplicate
experiments
It seems important to understand the interplay between phase separation and gelation kinetics
(Figures 2 and 3). For instance, in the case of 0.3% guar gum / skim milk mixture acidified with
2.5 wt% GDL, only a few droplets began to sediment before pH of gel was reached. It should also be
noted that with addition of 1.5 wt% GDL the gelation occurred at the same time as the apparition of
the sediment layer. On the contrary there is a time delay for the system containing 1 wt% GDL to
begin phase separation, suggesting that the phase separation kinetics was quicker than the network
formation kinetics.
1 % GDL 1.5 % GDL 2.5 % GDL
Figure 4 Microstructure of stirred acid milk / guar gum gels at pH 4.6 containing 0.3 wt% guar
gum acidified with three different GDL concentrations as indicated in the figure (1, 1.5,
2.5 wt%). Scale bars indicate 100 µm
Relative kinetics of gelation and phase separation seem to govern the morphology of the mixed
systems. The CLSM micrographs in figure 4 show the microstructure of acid milk / guar gum stirred
gels containing 0.3 wt% guar gum and acidified with three different amounts of GDL (1, 1.5 or
2.5 wt%). Gels prepared with 1.5 wt% GDL exhibited the same microstructural features as those
visualized in figure 1a, composed of a mix of filamentous structures and deformed droplets dispersed
in a continuous guar gum-enriched phase. On the contrary, small spherically-shaped protein-enriched
droplets were found in the system containing 2.5 wt% GDL, while filamentous structures appeared in
the mixed gel acidified with 1 wt% GDL, i.e with the lowest gelation rate. It should be noted that
filamentous structures and droplets existed before stirring the acid gels and were not oriented after
stirring. As far as we know, such microstructures have never been reported previously for acid skim
milk / guar gum gels.
Upon mixing, the guar gum / skim milk mixture formed an unstable water-in-water
emulsion.7,15 Induced by Brownian motion giving rise to droplet collision, those spherical domains
can either continue to grow through coalescence or/and sediment following Stokes’ law.7 However, in
the case of mixed gels acidified with 2.5 wt% GDL, the gelation rate was faster than the formation of
the sediment layer (Figure 3). Therefore, the small droplets shown in figure 4 were “frozen” before
complete coalescence mechanism and sedimentation occurred. Then the gelation process has the
effect of freezing the evolution of the droplets at an intermediate state, far from the thermodynamic
equilibrium conditions, thus hindering additional phase separation process.
For lower gelation rates (addition of 1 or 1.5 wt% GDL to the system), the gelation process
competes with droplet sedimentation and the apparition of a sedimented layer. For instance, the
droplets composing the gel prepared with 1.5 wt% GDL probably had already grown and coalesced
when gelation occurred. However, the sedimentation process is greatly influenced by the relative
densities of the phases, as well as droplet size. Moreover, owing to very low interfacial tension
typical of water-in-water emulsions, droplets are easily deformable.15 Thus it can be suggested that
some droplets are large enough to sediment, and the initially spherical dispersed droplets can greatly
deform with gravitation and/or thermal agitation, leading to a mix of filamentous structures and
deformed droplets. This phenomenon appeared in a greater extent for the system containing 1 wt%
GDL, where gelation occurred just after the beginning of the apparition of sedimented layer
(Figure 3). This delay in time to phase separate allowed the microstructure to evolve before triggered
freezing through protein gelation. As a consequence, the extension of the droplets formed long
protein-enriched filaments, which were kinetically trapped by gelation.
3.3 Influence of Acceleration Field on Microstructure of Acid Skim Milk / Guar Gum Gels
As previously demonstrated from the microscopic results, it appeared that the dynamics of
protein-enriched droplets in a form of water-in-water emulsion followed Stokes’ law. Hence, the
parameters that contribute to droplet sedimentation are not only the density difference between the
two phases, the mean droplet size or the viscosity of the continuous phase, but also gravitation. In
order to explore more precisely possible reasons for droplets extension, guar gum / acid milk gels
were prepared in a temperature-controlled centrifuge using additional acceleration field (2.5 g).
a b
Figure 5 Microstructure of stirred acid milk / guar gum gels at pH 4.6 containing 0.3 wt% guar
gum acidified at a fixed amount of GDL (1.5 wt%) while an acceleration field of (a) 1 g
or (b) 2.5 g was applied. Scale bars indicate 100 µm
Evidence of droplet spinning due to higher acceleration field is shown in figure 5b in

comparison to figure 5a. Very long protein-enriched filaments (between 100 and 400 µm) dispersed
in a guar gum continuous phase were produced upon centrifugation at 2.5 g (Figure 5b) whereas
smaller filamentous and deformed droplets (between 20 and 100 µm) were found in absence of
additional acceleration field (Figure 5a). Therefore, increasing the acceleration field produced enough
energy to distort the droplets, which had the effect of making the droplets spin by increasing particle
deformation, without promoting break-up or coalescence. Such structures have been produced in the
past using extensional or orifice flows17, or using appropriate shear flows.14,15 With increasing shear
stress, particle deformation increases which offers a broad flexibility to generate different extents of
anisotropy from deformed droplets to the formation of a string phase.11
As soon as the applied deformation is stopped, the droplet can easily relax to the equilibrium
condition in a spherical form.9 However, if droplet gelation occurs in a non-equilibrium state, the
unstable morphology is trapped by gelation. This phenomenon was well illustrated using mixtures of
gelatin and maltodextrin or dextran14,18,19 for which the system gelation was induced by decreasing
the temperature of the gelatin continuous phase. In the case of acid skim milk / guar gum gels, the
triggered freezing of the phase-separating structure was governed by acid-induced protein
aggregation. Thus gelation can be used to kinetically trap various morphologies created by controlling
the particle dynamics, using modification of the gelation rate (gel formation kinetics) or the
acceleration field (droplet deformation extent).
4 CONCLUSION
The present study has shown how the combined parameters of particle dynamics and gelation
kinetics in acid skim milk / guar gum mixtures can be used to design a wide range of microstructures.
Adding specific amounts of guar gum into skim milk gave rise to a droplet-like morphology which
can be trapped by acid-induced gelation.
A more in-depth experimental investigation of the combined gelation time-phase separation

process was carried out by changing the gelation rate and using appropriate acceleration field. The
potential to generate different types of morphologies, by controlling the gelation rate and the
acceleration field to obtain different droplet deformation extents, gives a way to manipulate textures.
Therefore, future works should focus on quantifying the droplet dynamics more precisely, which
could be achieved through rheo-optical processes for instance.
Acknowledgements
References
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Mélanges lait / polysaccharides : création de microstructures par effet de compétition
entre gélification acide et séparation de phases
Résumé :
La microstructure et les propriétés rhéologiques de systèmes laitiers enrichis en polysaccharides (guar et
xanthane) ont été décrites avant et après acidification (gels fermes et brassés). Au sein des mélanges lait /
polysaccharides, une structure sous la forme d’une émulsion eau dans eau instable est rendue possible par
un mécanisme de déplétion-floculation conduisant à une séparation de phases. La gélification acide des
gouttelettes riches en protéines a pour conséquence de bloquer l’évolution de la coalescence et de la
sédimentation des gouttelettes qui se figent alors qu’elles ont une forme allongée. Une approche basée sur
l’étude des cinétiques de séparation de phases et de gélification a permis de mettre en évidence un
phénomène de compétition entre ces deux processus.
Une large gamme de morphologies de micro-gels aux caractéristiques bien définies a pu être créée, variant
de longs filaments d’une taille proche de 400 µm à des micro-gels sphériques d’environ 20 µm.
L’allongement des structures dans les systèmes lait / guar se réalise au travers de forces de gravité et de
l’agitation thermique. Par conséquent, la taille des micro-gels enrichis en protéines dépend largement des
traitements thermique et mécanique appliqués avant et pendant la formation du gel. Il apparaît clairement
que d’autres forces interviennent également dans la mise en place de la structure sous la forme de
structures fibreuses dans les gels brassés enrichis en xanthane, l’hypothèse de la présence d’interactions
électrostatiques associatives étant discutée. La création de ces microstructures originales a servi de levier
d’action pour orienter les propriétés rhéologiques et la perception sensorielle des gels brassés.
Mots clés : microstructure, système mixte, séparation de phases, gélification acide, polysaccharide,
lait, rhéologie, sensoriel.
Milk / polysaccharides mixtures: designing microstructure through the competition

between acid gelation and phase separation
Abstract:
Microstructure and rheological properties of milk / polysaccharides (guar gum and xanthan gum) mixtures
were studied before and after acidification (set and stirred gels). Milk / polysaccharides mixtures formed
an instable water-in-water emulsion due to depletion flocculation which led to phase separation. Acid-
induced protein-enriched droplet gelation stopped droplet coalescence and sedimentation which trapped
the droplets in an elongated form. In-depth investigation of the combined phase separation and gelation
kinetics was used to highlight competition between those two processes.
A wide range of micro-gel morphologies with defined properties was designed, from very long protein-
enriched filaments of around 400 µm to spherical micro-gels of 20 µm. Droplet spinning in milk / guar
gum systems originated from the effect of gravitational forces and thermal agitation. Therefore protein-
enriched micro-gel size greatly depends on the thermomechanical treatment applied before and during gel
formation. In the case of xanthan gum-enriched acid milk gels, specific fibrous-like structures may be
generated by other forces including electrostatic associative interactions. Design of original
microstructures was used to modify rheological properties and sensory perception of stirred gels.
Keywords: microstructure, mixed system, phase separation, acid gelation, polysaccharide, milk,
rheology, sensory.

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Mélanges lait / polysaccharides : création de

microstructures par effet de compétition entre

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HAL is a multi-disciplinary open access L’archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est

L’Institut des Sciences et Industries

présentée et soutenue publiquement par

Mélanges lait / polysaccharides :

Directrice de thèse : Camille MICHON

ainsi qu’à ceux qui ont accepté de le juger.

CHAPITRE 1 : ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE ....................................................................................................... 3

I. FORMATION DES GELS LAITIERS ACIDES ....................................................................................... 3

I.1. LE LAIT ..................................................................................................................................................... 3

II. STABILITE DES MELANGES DE BIOPOLYMERES ....................................................................... 20

II.1. LES PHENOMENES DE SEPARATION DE PHASES ....................................................................................... 20

III. GELIFICATION EN PRESENCE D’UNE SEPARATION DE PHASES.......................................... 42

III.2.1. Propriétés des gels acides en présence d’une séparation de phases............................................ 53

CHAPITRE 2 : MATERIELS ET METHODES .................................................................................................... 61

I. FABRICATION DES GELS LAITIERS ENRICHIS EN POLYSACCHARIDES .............................. 61

I.1. LES MATIERES PREMIERES ....................................................................................................................... 61

II. CARACTERISATION DES MELANGES ET DES GELS ACIDES ENRICHIS EN

II.1. COMPORTEMENT DE SEPARATION DE PHASES DANS LES MELANGES LAIT / POLYSACCHARIDES EN

II.2. MESURE DU PH ...................................................................................................................................... 67

III. CARACTERISATION SENSORIELLE ET INSTRUMENTALE DES YAOURTS ENRICHIS EN

III.1. PREPARATION DES YAOURTS ENRICHIS EN MICRO-GELS ....................................................................... 80

III.1.2. Micro-gels .................................................................................................................................... 80

CHAPITRE 3 : MELANGES LAIT / GUAR AVANT ET APRES GELIFICATION........................................ 85

I. PROPRIETES DES MELANGES LAIT / GUAR AVANT ET APRES GELIFICATION ................. 85

I.1. PROPRIETES DES MELANGES LAIT / GUAR AVANT GELIFICATION ............................................................. 85

II. EFFET DE LA GELIFICATION AU REGARD DE LA CINETIQUE DE SEPARATION DE

III. CONCLUSION....................................................................................................................................... 118

CHAPITRE 4 : MELANGES LAIT / XANTHANE AVANT ET APRES GELIFICATION........................... 119

I. EXISTENCE D’INTERACTIONS ASSOCIATIVES ENTRE PROTEINES DE LAIT ET

II.1. MICROSTRUCTURE DES MELANGES LAIT / XANTHANE.......................................................................... 139

III.1. ACIDIFICATION A L’AIDE DE HCL ....................................................................................................... 143

IV. CONCLUSION....................................................................................................................................... 163

CHAPITRE 5 : EFFET DE L’HISTOIRE THERMOMECANIQUE SUR LES PROPRIETES DES GELS

I. EFFET DE L’HISTOIRE THERMIQUE............................................................................................... 166

I.1. EFFET DE LA TEMPERATURE D’ACIDIFICATION ...................................................................................... 166

II. EFFET D’UN TRAITEMENT MECANIQUE ..................................................................................... 191

III. CONCLUSION....................................................................................................................................... 197

CHAPITRE 6 : INFLUENCE DE LA MICROSTRUCTURE SUR LA PERCEPTION SENSORIELLE DE

I. STRATEGIE EXPERIMENTALE ......................................................................................................... 198

II. PROPRIETES SENSORIELLES........................................................................................................... 200

III. CARACTERISATION INSTRUMENTALE ...................................................................................... 203

IV. RELATION ENTRE DONNEES SENSORIELLES ET INSTRUMENTALES .............................. 206

V. RELATION ENTRE LES PARAMETRES DE STRUCTURE ET LES DONNEES

VI. CONCLUSION....................................................................................................................................... 211

CHAPITRE 7 : DISCUSSION GENERALE ET CONCLUSION ...................................................................... 213

I. DISCUSSION GENERALE ..................................................................................................................... 213

II. CONCLUSION GENERALE ................................................................................................................. 221

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ............................................................................................................... 227

• Publications dans des revues internationales à comité de lecture

• Publications dans des actes de conférences

Rohart A. et Michon C. Effet de la taille et de la forme de micro-gels laitiers sur la perception

Rohart A. et Michon C. Utilisation de mesures rhéologiques comme outil de sélection de formules de

La consommation de produits laitiers frais, et particulièrement des laits fermentés, représente

L’objectif de cette étude a été de contribuer à une meilleure compréhension de la structuration

Le manuscrit est composé de sept chapitres.

Chapitre 1 : Etude bibliographique