A.

Pendahuluans
1. Sejarah singkat
Tswett adalah penemu kromatografi pada tahun 1903.
Perkembangan kromatografi antara lain:
a. kromatografi cair-padat (KCP).
b. Kemudian, pada akhir tahun 1930an dan pada awal tahun 1940an, cara ini
mulai berkembang.Dasar kromatografi lapis tipis (KLT) diletakkan oleh
Izmailov.
c. Schraiber pada tahun 1938, dan kemudian diperhalus oleh Stahl pada
tahun 1958. Karya Martin dan Synge yang pada tahun 1041 membuahkan
hadian Nobel, tidak hanya merevolusikan kromatografi cair, tetapi juga
secara umum meletakkan landasan bagi perkembangan kromatografi gas
dan kromatografi kertas.
d. Pada tahun 1952, Martindan

James

mempublikasikan

makalah

pertamanya mengenaim kromatografi gas. Antara tahun 1952 dan akhir

tahun 1960 an kromatografi gas berkembang menjadi alat analisis yang
canggih.
e. Hal ini menjadi dasar ditemukannya kromatografi yang canggih yaitu
kromatografi cair kinerja tinggi (High Perfomance Liquid Chromatografi).
2. Pengertian kromatografi
Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan molekul berdasarkan perbedaan
pola pergerakan antara fase gerak dan fase diam untuk memisahkan komponen
(berupa molekul) yang berada pada larutan. Molekul yang terlarut dalam fase
gerak, akan melewati kolom yang merupakan fase diam.
3. Jenis-jenis kromatografi
Kromatografi dibedakan menjadi 2 jenis yaitu:
a. Kromatografi cair (Liquid Chromatography) merupakan teknik yang
tepat untuk memisahkan ion atau molekul yang terlarut dalam suatu
larutan. Terdapat beberapa jenis kromatografi cair, diantaranya: reverse
phase

chromatography, High

Chromatography (HPLC), size

Performance
exclusion

Liquid

chromatography,

serta supercritical fluid chromatography.

Reverse phase chromatography merupakan alat analitikal yang
kuat

dengan

memadukan

sifat hidrofobik serta

rendahnya polaritas fase stasioner yang terikat secara kimia

pada padatan inert seperti silika.

 High performance liquid chromatography (HPLC) mempunyai

prinsip yang mirip dengan reverse phase. Hanya saja dalam
metode ini, digunakan tekanan dan kecepatan yang tinggi.
Size exclusion chromatography atau yang dikenal juga
dengan gel permeation atau filtration chromatography biasa
digunakan untuk memisahkan dan memurnikan protein.
Kromatografi pertukaran ion (ion-exchange chromatography) biasa digunakan
untuk pemurnian materi biologis, seperti asam amino, peptida, protein.
4. Manfaat
a. Mengetahui teoriteori tentang HPLC (High Perfomance
Crhomatografi)
b. Mengetahui prinsip
Crhomatografi)
c. Mengetahui cara

dasar

Liquid

kerja

HPLC

(High

Perfomance

Liquid

mengoperasikan

HPLC

(High

Perfomance

Liquid

Crhomatografi)
5. Tujuan
a. Untuk mengetahui pengertian dan definisi kromatografi cair kinerja tinggi
b. Untuk memahami prinsip dasar kerja HPLC (High Perfomance Liquid
Crhomatografi)
c. Untuk mengetahui cara kerja HPLC (High Perfomance Liquid Crhomatografi)
untuk menerapkannya dalam analisis instrumental bahan anorganik
d. Mampu menggunakan HPLC (High Perfomance Liquid Crhomatografi) dalam
analisis bahan anorganik dalam laboratorium khusus instrumen.

B. Isi
1. Pengertian HPLC
Kromatografi

cair

berperforma

tinggi (high

performance

liquid

chromatography, HPLC) merupakan salah satu teknik kromatografi untuk zat cair
yang biasanya disertai dengan tekanan tinggi.
2. Jenis-jenis HPLC
Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal (jika fase
diamnya lebih polar dibanding dengan fase geraknya) atau fase terbalik (jika fase
diamnya kurang non polar dibanding dengan fase geraknya). Berdasarkan pada
kedua pemisahan ini, sering kali HPLC dikelompokkan menjadi HPLC fase normal

dan HPLC

fase

terbalik. Selain

klasifikasi

di

atas,

HPLC

juga

dapat

dikelompokkan berdasarkan pada sifat fase diam dan atau berdasarkan pada
mekanisme sorpsi solut, dengan jenis-jenis HPLC sebagai berikut:
e.
Kromatografi Adsorbsi
Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam
kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis. Pemisahan
kromatografi adsorbsi biasanya menggunakan fase normal dengan
menggunakan fase diam silika gel dan alumina, meskipun demikian
sekitar 90% kromatografi ini memakai silika sebagai fase diamnya.
Pada silika dan alumina terdapat gugus hidroksi yang akan berinteraksi
dengan solut. Gugus silanol pada silika mempunyai reaktifitas yang
berbeda, karenanya solut dapat terikat secara kuat sehingga dapat
f.

menyebabkan puncak yang berekor.

Kromatografi fase terikat
Kebanyakan fase diam kromatografi

ini adalah silika yang

dimodifikasi secara kimiawi atau fase terikat. Sejauh ini yang

digunakan untuk memodifikasi silika adalah hidrokarbon-hidrokarbon
non-polar seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau dengan fenil.
Fase diam yang paling populer digunakan adalah oktadesilsilan (ODS
atau C18) dan kebanyakan pemisahannya adalah fase terbalik.
Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan
air atau dengan larutan bufer. Untuk solut yang bersifat asam lemah
atau basa lemah, peranan pH sangat krusial karena kalau pH fase gerak
tidak diatur maka solut akan mengalami ionisasi atau protonasi.
Terbentuknya spesies yang terionisasi ini menyebabkan ikatannya
dengan fase diam menjadi lebih lemah dibanding jika solut dalam
bentuk spesies yang tidak terionisasi karenanya spesies yang
g.

mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat.

Kromatografi penukar ion
KCKT penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar
kation atau anion dengan suatu fase gerak. Ada banyak penukar ion
yang beredar di pasaran, meskipun demikian yang paling luas
penggunaannya

adalah

polistiren

resin. Kebanyakan

pemisahan

kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan media air karena

sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut campuran
misalnya air-alkohol dan juga pelarut organik. Kromatografi penukar

ion dengan fase gerak air, retensi puncak dipengaruhi oleh kadar garam
total atau kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak. Kenaikan kadar
garam dalam fase gerak menurunkan retensi solut. Hal ini disebabkan
oleh penurunan kemampuan ion sampel bersaing dengan ion fase gerak
h.

untuk gugus penukar ion pada resin.

Kromatografi Pasangan ion
Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan
sampel-sampel ionik dan mengatasi masalah-masalah yang melekat
pada metode penukaran ion. Sampel ionik ditutup dengan ion yang

i.

mempunyai muatan yang berlawanan.

Kromatografi Eksklusi Ukuran
Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan
dapat digunakan untuk memisahkan atau menganalisis senyawa
dengan berat molekul > 2000 dalton. Fase diam yang digunakan dapat
berupa silika atau polimer yang bersifat porus sehingga solut dapat
melewati porus (lewat diantara partikel), atau berdifusi lewat fase
diam. Molekul solut yang mempunyai BM yang jauh lebih besar, akan
terelusi terlebih dahulu, kemudian molekul-molekul yang ukuran
medium, dan terakhir adalah molekul yang jauh lebih kecil. Hal ini
disebabkan solut dengan BM yang besar tidak melewati porus, akan
tetapi lewat diantara partikel fase diam. Dengan demikian, dalam
pemisahan dengan eksklusi ukuran ini tidak terjadi interaksi kimia

j.

antara solut dan fase diam seperti tipe kromatografi yang lain.
Kromatografi Afinitas
Dalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi
biokimiawi yang sangat spesifik. Fase diam mengandung gugus-gugus
molekul yang hanya dapat menyerap sampel jika ada kondisi-kondisi
yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu pada sampel yang
sesuai (sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan antibodi).
Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein
(enzim) dari campuran yang sangat kompleks.

3. Komponen dasar dan bagian-bagian HPLC

Terdapat 5 komponen dasar HPLC yaitu:
a.
Wadah Fase gerak dan Fase gerak
Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah
pelarut kosong ataupun labu laboratorium dapat digunakan

sebagai wadah fase gerak. Wadah ini biasanya dapat

menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut. Fase
gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang
dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya
elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh
polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat
komponen-komponen sampel. Untuk fase normal (fase diam
lebih polar daripada fase gerak), kemampuan elusi meningkat
dengan meningkatnya polaritas pelarut. Sementara untuk fase
terbalik (fase diam kurang polar daripada fase gerak),
kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas
pelarut. Fase gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih
dahulu untuk menghindari partikel-partikel kecil ini. Selain itu,
adanya gas dalam fase gerak juga harus dihilangkan, sebab
adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama di
pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis. Elusi
dapat dilakukan dengan cara isokratik (komposisi fase gerak
tetap selama elusi) atau dengan cara bergradien (komposisi fase
gerak berubah-ubah selama elusi) yang analog dengan
pemrograman suhu pada kromatografi gas. Elusi bergradien
digunakan untuk meningkatkan resolusi campuran yang
kompleks terutama jika sampel mempunyai kisaran polaritas
yang luas. Fase gerak yang paling sering digunakan untuk
pemisahan dengan fase terbalik adalah campuran larutan bufer
dengan metanol atau campuran air dengan asetonitril. Untuk
pemisahan dengan fase normal, fase gerak yang paling sering
digunakan

adalah

campuran

pelarut-pelarut

hidrokarbon

dengan pelarut yang terklorisasi atau menggunakan pelarutpelarut jenis alkohol. Pemisahan dengan fase normal ini kurang
umum dibanding dengan fase terbalik
b.

Pompa
Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang
mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni:
pompa harus inert terhadap fase gerak. Bahan yang umum

dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, Teflon, dan
batu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu
memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan
fase gerak dengan kecepatan alir 3 mL/menit. Untuk tujuan
preparatif, pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan
fase gerak dengan kecepatan 20 mL/menit. Tujuan penggunaan
pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah untuk
menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara
tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan. Ada 2
jenis pompa dalam HPLC yaitu: pompa dengan tekanan
konstan, dan pompa dengan aliran fase gerak yang konstan.
Tipe pompa dengan aliran fase gerak yang konstan sejauh ini
lebih umum dibandingkan dengan tipe pompa dengan tekanan
c.

konstan.
Tempat penyuntikan sampel
Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke
dalam fase gerak yang mengalir di bawah tekanan menuju
kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari tembaga
tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk
sampel (sample loop) internal atau eksternal.

d.

Kolom dan Fase diam

Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan
kolom mikrobor. Kolom merupakan bagian HPLC yang mana
terdapat fase diam untuk berlangsungnya proses pemisahan
solut/analit.
Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama
dibanding dengan kolom konvensional, yakni:

 Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih

kecil dibanding dengan kolom konvensional karena pada
kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10
-100 l/menit).
Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat
kolom mikrobor lebih ideal jika digabung dengan
spektrometer massa.
Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih
pekat, karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika
jumlah sampel terbatas misal sampel klinis.
Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak
setahan kolom konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis
rutin.3]
Kebanyakan fase diam pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi
secara kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer
stiren dan divinil benzen. Permukaan silika adalah polar dan sedikit
asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH). Silika dapat
dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan reagen-reagen
seperti klorosilan. Reagen-reagen ini akan bereaksi dengan gugus
silanol dan menggantinya dengan gugus-gugus fungsional yang lain.
Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling
banyak digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa
dengan kepolaran yang rendah, sedang, maupun tinggi. Oktil atau
rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih sesuai untuk solut yang polar.
Silika-silika aminopropil dan sianopropil (nitril) lebih cocok sebagai
pengganti silika yang tidak dimodifikasi. Silika yang tidak
dimodifikasi akan memberikan waktu retensi yang bervariasi
e.

disebabkan karena adanya kandungan air yang digunakan.

Detektor HPLC
Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu:
detektor universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak
bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks bias

dan detektor spektrometri massa; dan golongan detektor yang spesifik

yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti
detektor

UV-Vis,

detektor

fluoresensi,

dan

elektrokimia.

Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai

berikut:
Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel.
Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi
solut pada kadar yang sangat kecil.
Stabil dalam pengopersiannya.
Mempunyai

sel

volume

yang

kecil

sehingga

mampu

meminimalkan pelebaran pita.

Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi
solut pada kisaran yang luas (kisaran dinamis linier).
Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase
gerak.

Beberapa detektor yang paling sering digunakan pada HPLC dengan

karakteristik detektor seperti berikut :

Detektor

Sensitifitas

Kisaran

(g/ml)

linier

5 x 10-10

104

-10

Karakteristik

Absorbansi Uv-vis
Fotometer filter

Sensitivitas bagus, paling sering

Spektrofotometer

5 x 10

10

digunakan,

selektif

spektrometerphoto-

> 2 x 10-10

105

gugus-gugus

diode array
Fluoresensi

10-12

104

struktur yang tidak jenuh.

Sensitifitas
sangat
bagus,

dan

terhadap
struktur-

selektif, Tidak peka terhadap

perubahan suhu dan kecepatan
Indeks bias

5 x 10-7

104

alir fase gerak.

Hampir bersifat universal akan
tetapi sensitivitasnya sedang.
Sangat sensitif terhadap suhu,
dan tidak dapat digunakan pada
elusi bergradien

Elektrokimia
Konduktimetri
Amperometri

10-8
-12

10

104

Peka terhadap perubahan suhu

dan kecepatan alir fase gerak,

10

tidak dapat digunakan pada

elusi

bergradien.

Hanya

mendeteksi solut-solut ionik.

Sensitifitas

sangat

bagus,

selektif tetapi timbul masalah

dengan

adanya

kontaminasi

elektroda.

4. Derivatisasi pada HPLC

Derivatisasi melibatkan suatu reaksi kimia antara suatu analit dengan suatu
reagen untuk mengubah sifat fisika-kimia suatu analit. Tujuan utama penggunaan
derivatisasi pada HPLC adalah untuk:
a. Meningkatkan deteksi.
b. Merubah struktur molekul atau polaritas analit sehingga akan
menghasilkan puncak kromatografi yang lebih baik.
c. Merubah matriks sehingga diperoleh pemisahan yang lebih baik.
d. Menstabilkan analit yang sensitif.
Detektor yang paling banyak digunakan dalam HPLC adalah detektor UV-Vis
sehingga banyak metode yang dikembangkan untuk memasang atau menambahkan

gugus kromofor yang akan menyerap cahaya pada panjang gelombang tertentu. Di
samping itu, juga dikembangkan suatu metode untuk menghasilkan fluorofor
(senyawa yang mamapu berfluoresensi) sehingga dapat dideteksi dengan
fluorometri.
Suatu reaksi derivatisasi harus mempunyai syarat-syarat sebagai berikut,
yakni: produk yang dihasilkan harus mampu menyerap baik sinar ultraviolet atau
sinar tampak atau dapat membentuk senyawa berfluoresen sehingga dapat dideteksi
dengan spektrofluorometri; proses derivatisasi harus cepat dan menghasilkan
produk yang sebesar mungkin (100 %); produk hasil derivatisasi harus stabil
selama proses derivatisasi dan deteksi; serta sisa pereaksi untuk derivatisasi harus
tidakmenganggu pemisahan kromatografi.
Berbagai macam bahan penderivat telah tersedia antara lain :

Derivatisasi ini dapat dilakukan sebelum analit memasuki kolom (pre-column

Gugus fungsional

Reagen untuk dapat dideteksi

Reagen

dengan UV-Vis

dideteksi

p-nitrobenzil-N,N-

Fluoresen
4-bromometil-7-

diisopropilisourea (PNBDI); 3,5-

asetoksikumarin;

kolom

asam lemak;asam-

dinitrobenzil-N,N-

4-bromometil-7-

column

asam fosfat

diisopropilisourea (DNBDI); p-

metoksikumarin;

Alkohol

bromofenasil bromida (PBPB)

3,5-dinitrobenzil
klorida

Asam-asam
kaboksilat;

asam-

(DNBC);

untuk

dapat
dengan

Aldehid; keton

hidroklorida

Prins
ip
dasar

Dansil hidrazin

(PNBA);

(post-

5.

1-

naftilisosianat (NIC-1).
p-nitrobenziloksiamin

setelah

derivatization).

4(Dabsyl-Cl);

atau

analit keluar dari

dimetilaminiazobenzen-4sulfinil

derivatization)

3,5-

dinitrobenziloksiamin
hidroklorida (DNBA);
Amin primer

Fluoresamin
o-ftalaldehid (OPA)
7-kloro-4-nitrobenzo-2-

Amin primer (1o)

3,5-dinitrobenzil

dan sekunder (2o)

(DNBC);N-suksinimidil-p-

oksa-1,3-diazol

nitrofenilasetat

Cl);

klorida
(SNPA);N-

(NBD-

7-fluoro-4-

suksinimidil-3,5-

nitrobenzo-2-oksa-1,3-

dinitrofenilasetat (SDNPA); 4-

diazol (NBD-F); Dansil

dimetilaminiazobenzen-4-

klorida

sulfinil

(Dabsyl-Cl);

1-

Asam-asam amino

naftilisosianat (NIC-1).
4-dimetilaminiazobenzen-4-

Fluoresamin

(peptida)

sulfinil (Dabsil-Cl)

o-ftalaldehid (OPA)
7-kloro-4-nitrobenzo-2oksa-1,3-diazol
Cl);

(NBD-

7-fluoro-4-

nitrobenzo-2-oksa-1,3diazol (NBD-F);

HPLC
Prinsip dasar dari HPLC adalah pemisahan analit-analit berdasarkan
kepolarannya. Adapun prinsip kerja dari alat HPLC adalah ketika suatu sampel
yang akan diuji diinjeksikan ke dalam kolom maka sampel tersebut kemudian akan
terurai dan terpisah menjadi senyawa-senyawa kimia ( analit ) sesuai dengan
perbedaan afinitasnya. Hasil pemisahan tersebut kemudian akan dideteksi oleh

detector (spektrofotometer UV, fluorometer atau indeks bias) pada panjang

gelombang tertentu, hasil yang muncul dari detektor tersebut selanjutnya dicatat
oleh recorder yang biasanya dapat ditampilkan menggunakan integrator atau
menggunakan personal computer (PC) yang terhubung online dengan alat HPLC
tersebut.
6. Prinsip kerja HPLC
Pada prinsipnya kerja HPLC adalah sama yaitu pemisahan analit-analit
berdasarkan kepolarannya, alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan
larutan tertentu sebagai fasa geraknya. Yang paling membedakan HPLC dengan
kromatografi lainnya adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk
mendorong fasa gerak. Campuran analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya
dan kecepatannya untuk sampai kedektetor (waktu retensinya) akan berbeda, hal
ini akan teramati pada spectrum yang puncak-puncaknya terpisah. Ukuran skala
polaritas : golongan fluorocarbon < golongan hidrokarbon < senyawa terhalogenasi
< golongan eter < golongan ester < golongan keton < golongan alcohol < golongan
asam.
a.

Injeksi sampel
Injeksi sample seluruhnya dilakukan secara otomatis sehingga
tidak bisa mengetahui yang terjadi pada keadaan tingkat dasar.
Karena proses ini meliputi tekanan, tidak sama halnya dengan

b.

kromatografi gas.
Waktu retensi
Waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui
kolom menuju detektor disebut sebagai waktu retensi.Waktu
retensi diukur berdasarkan waktu dimana sampel diinjeksikan
sampai

sampel

menunjukkan

ketinggian

puncak

yang

maksimum dari senyawa itu. Senyawa-senyawa yang berbeda

memiliki waktu retensi yang berbeda pula. Untuk beberapa
senyawa, waktu retensi akan sangat bervariasi dan bergantung
pada:
Tekanan yang digunakan (karena itu akan berpengaruh
pada laju alir dari pelarut).
Kondisi dari fase diam (tidak hanya terbuat dari
material apa, tetapi juga pada ukuran partikel).
Komposisi yang tepat dari pelarut.
Temperatur pada kolom

c.

Detector
Ada beberapa cara untuk mendeteksi substansi yang telah
melewati kolom. Metode umum yang mudah dipakai untuk
menjelaskan yaitu penggunaan serapan ultra-violet.Banyak
senyawa-senyawa organik menyerap sinar UV dari beberapa

panjang gelombang.
Jumlah cahaya yang diserap akan bergantung pada jumlah
d.

senyawa tertentu yang melewati melalui berkas pada waktu itu

Interpretasi output dari detector
Output akan direkam sebagai rangkaian puncak-puncak,
dimana masing-masing puncak mewakili satu senyawa dalam
campuran yang melalui detektor dan menerap sinar UV.
Sepanjang anda mengontrol kondisi kolom,dapat menggunakan
waktu retensi untuk membantu mengidentifikasi senyawa yang
diperoleh

.
Area yang berada dibawah puncak sebanding dengan jumlah X
yang melalui detektor, dan area ini dapat dihitung secara
otomatis melalui layar komputer.Area dihitung sebagai bagian
yang berwarna hijau dalam gambar (sangat sederhana).
7. Perawatan HPLC
Efisiensi pemisahan kolom HPLC tidak hanya tergantung pada kualitas kolom,
namun juga pada bagaimana kolom digunakan secara umum, kolom yang sering
digunakan adalah Silika. Kestabilan mekanik yang besar, sangat baik sifat

permukaan fisikokimia, berbagai ikatan kimia, dan kompatibel dengan berbagai

pelarut organik.
Berikut beberapa cara perawatan HPLC agar tetap dapat digunakan secara
efisien.
a. Stabilitas pH
kolom HPLC yang stabil dalam rentang pH 2 sampai 8. Jika
mengukur nilai pH, pengukuran harus dilakukan dalam media air
sebelum mencampur eluen dengan pelarut organik. HPLC kolom dapat
digunakan di luar rentang pH. Ikatan kimia baru yang memungkinkan
penggunaan sampai pH 1 untuk beberapa fasa diam. Fase stasioner
didasarkan pada silika gel ultra murni juga dapat digunakan pada
rentang pH yang lebih tinggi, sampai untuk pH 11, tergantung pada
sifat kimia pengubah yang digunakan dalam fase gerak. Basis Besar
(seperti Pyrolidine) tidak mampu menyerang permukaan silika dan
oleh karena itu dapat digunakan pada pH lebih tinggi.
b. Teknik Stabilitas
Fase stasioner didasarkan pada silika secara mekanik sangat
stabil, dikemas dalam kolom yang menunjukkan

tidak

ada

batas

tekanan, dan dapat digunakan di lebih dari 40 MPa (6000 psi)

tanpa masalah. Tekanan menyebabkan guncangan penyaluran dalam
kolom, yang menghasilkan puncak membelah pada kromatogram
c. Eluen
Penggunaan pelarut murni non HPLC menyebabkan adsorpsi
ireversibel dari kotoran pada kolom. Kotoran ini memblokir situs
adsorpsi, mengubah selektivitas kolom dan mengarah ke puncak
memisahkan di kromatogram tersebut.
d. Penyimpanan Kolom
Untuk penyimpanan

jangka

pendek,

kolom

dapat

disimpan dalam eluen yang digunakan dalam terakhir analisis.

Untuk penyimpanan jangka menengah, yaitu 2 hari atau selama
akhir pekan, kolom harus dibilas dengan air yang murni untuk
mencegah pertumbuhan mikroba.
Untuk penyimpanan jangka panjang, silika kolom tersebut
harus dapat disimpan dalam pelarut aprotik. Kandungan air

tidak boleh lebih tinggi dari 50%. Yang terbaik adalah

pelarut Asetonitril.

8. Kegunaan dari HPLC

Kegunaan HPLC antara lain:
a. HPLC dengan prinsip kromatografi banyak digunakan pada industri
farmasi dan pestisida.
b. Zat- zat dengan kepolaran berbeda yaitu antara sedikit polar sampai polar
dapat dipisahkan dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair.
c. Asam-asam nukleat dapat dipisahkan dengan kolom penukar ion yang
dikombinasikan dengan kolom butiran berlapis zat berpori.
d. Morfin, heroin dan semacamnya telah dapat dipisahkan dengan rezin ZipaxSAX.
e. Dapat memisahkan vitamin- vitamin yang larut dalam air.
f. Digunakan untuk menentukan berat molekul polimer dan masalah-masalah
biokimia.
g. Dapat digunakan untuk memurnikan dan mengidentifikasi suatu senyawa.

9. Kelebihan dan Kekurangan

Dengan adanya HPLC tentunya sangat membantu dalam proses
kromatografi.
a.
kelebihan dari alat HPLC antara lain:
Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran dengan
daya memisah yang tinggi.
Dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan analisis.
Dapat digunakan bermacan-macam detektor dengan kepekaan
yang tinggi.
Kolom dapat digunakan kembali.
Waktu analisa cukup singkat.
HPLC dapat digunakan untuk isolasi zat yang tidak mudah
menguap dan zat yang tidak stabil.
Dapat menganalisis sampel yang kecil kuantitasnya.
Teknik HPLC dapat dilakukan pada suhu kamar.
b.

Kelemahan dari alat HPLC antara lain:

Harga sebuah alat HPLC cukup mahal
Sering ada larutan standar yang tertinggal diinjektor.
Pada kolom dengan diameter rata-rata partikel fase diam dengan
ukuran 5 dan 3 mikrometer sela-sela partikel lebih mudah tertutup

oleh kotoran, jadi harus seringkali dicuci dan kemurnian larutan

harus dijaga.
C. Contoh Percobaan
1. Alat
a. High Perfomance Liquid Chromatograph (HPLC) Alliance 2695
b. Detector UV/VIS 2489 dilengkapi dengan kolom C-18, diameter 5 l,
ukuran 4,6 x 150 mm dan Detektor UV-VIS terhubung.
c. Labu ukur 10 ml dan 100 mL
d. Pipet otomatik
e. Pipet tetes
f. Tabung filter
g. Beker glass
h. Tissue
2. Bahan
a. Vitamin C berbagai merek dan berbagai kadar (Vitacimin dan Xon-ce)
b. Standar vitamin C
c. Aqua bidest
3. Cara kerja
a. Pembuatan larutan standart
1) Ambil dan timbang standar vitamin C sebanyak 0,005 gr
2) Encerkan dengan aquabidest sampai 100 ml. masukkan ke dalam
labu ukur 100 ml.
3) Kemudian ambil 10 ml dari larutan tersebut dan masukkan ke

1)
2)
3)
4)
5)

dalam labu ukur 10 ml

b. Pengujian sampel
Gerus halus masing-masing vitamin C yang tersedia (Vitacimin dan Xon-Ce).
Ambil dan timbang vitamin C sebanyak 300 mg dan larutkan dengan aquabidest.
Masukkan ke dalam labu ukur 100 mL
Ambil sebanyak 10 mL larutan dan encerkan sampai 100 mL dengan aquabidest.
Ambil sebanyak 10 mL dari larutan sebelumnya dan masukkan ke dalam labu ukur 10

mL
6) Masukkan larutan sampel dan larutan standart kedalam waterbath selama 5 menit dan
sempurna gelembung yang ada didinding tabung hilang.
7) Pindahkan larutan sampel dan larutan standart ke dalam tabung effendorf dengan
menggunakan spuit 5 cc.
8) Masukkan larutan sampel dan larutan standart kedalam alat HPLC ( High Perfomance
Liquid Chromatography).
9) Tunggu hasilnya yang akan di tampilkan oleh detektor.
4. Pembahasan
Dari hasil praktikum diatas di dapati hasil yang gagal karena tidak di dapati
persamaan linear yang akan digunakan untuk menghitung kadar sampel
vitamin C. Hal ini disebabkan karena kesalahan dalam melakukan
pengenceran (human error). Pada kurva yang di tampilkan di atas

menunjukkan peak kurva yang berbeda-beda di karenakan kadar vitamin C

yang diukur berbeda-beda.
5. Kesimpulan
a. Pengenceran merupakan faktor yang sangat penting karena mempengaruhi
kadar/konsentrasi vitamin C.
b. Seharusnya semakin tinggi peak dari kurva yang terlihat maka semakin
besar konsentrasi vitamin C.
c. HPLC merupakan suatu metode yang baik untuk menganalisa suatu produk
obat.