Dasar Teknik Amplifikasi DNA

http://fatchiyah.lecture.ub.ac.id/teachingresponsibility/general/bbbb/
Oleh: Fatchiyah
Universitas Brawijaya

Reaksi Polimerase Berantai atau dikenal sebagai Polymerase Chain Reaction

(PCR), merupakan suatu proses sintesis enzimatik untuk mengamplifikasi nukleotida secara in
vitro. Metoda PCR dapat meningkatkan jumlah urutan DNA ribuan bahkan jutaan kali dari
jumlah semula, sekitar 106-107 kali. Setiap urutan basa nukleotida yang diamplifikasi akan
menjadi dua kali jumlahnya. Pada setiap n siklus PCR akan diperoleh 2n kali banyaknya DNA
target. Kunci utama pengembangan PCR adalah menemukan bagaimana cara amplifikasi hanya
pada urutan DNA target dan meminimalkan amplifikasi urutan non-target.
Penggunaan PCR telah berkembang secara cepat seirama dengan perkembangan biologi
molekuler. PCR digunakan untuk identifikasi penyakit genetik, infeksi oleh virus, diagnosis dini
penyakit seperti AIDS, Genetic profiling in forensic, legal and bio-diversity applications, biologi
evolusi, Site-directed mutagenesis of genes dan mRNA Quantitation di sel ataupun jaringan.

1.1 Teknik Dasar Amplifikasi PCR

Penemuan awal dari teknik PCR didasarkan pada tiga waterbaths yang mempunyai temperatur
yang berbeda. Thermal-cycler pertama kali dipublikasikan pada tahun 1986, akan tetapi DNA
polymerase awal yang digunakan masih belum thermostable, dan harus ditambahkan disetiap
siklusnya. Kelemahan lain temperature 37C yang digunakan bias dan menyebabkan nonspecific priming, sehingga menghasilkan produk yang tidak dikehendaki. Taq DNA polymerase
yang diisolasi dari bakteri Thermus aquaticus (Taq) dikembangkan pada tahun 1988. Ensim ini
tahan sampai temperature mendidih 100C, dan aktifitas maksimal pada temperatur 92-95C.
Proses PCR merupakan proses siklus yang berulang meliputi denaturasi, annealing dan ekstensi
oleh enzim DNA polimerase. Sepasang primer oligonukleotida yang spesifik digunakan untuk
membuat hibrid dengan ujung-5 menuju ujung-3 untai DNA target dan mengamplifikasi untuk
urutan yang diinginkan. Dasar siklus PCR ada 30-35 siklus meliputi:

denaturation (95C), 30 detik

annealing (5560C), 30 detik

extension (72C), waktu tergantung panjang pendeknya ukuran DNA yang diinginkan
sebagai produk amplifikasi.
Peningkatan jumlah siklus PCR diatas 35 siklus tidak memberikan efek yang positif.

1.1.1 Denaturasi untai ganda DNA

Denaturasi untai ganda DNA merupakan langkah yang kritis selama proses PCR. Temperatur
yang tinggi pada awal proses menyebabkan pemisahan untai ganda DNA. Temperatur pada tahap
denaturasi pada kisaran 92-95C, suhu 94C merupakan pilihan standar.
Temperatur denaturasi yang tinggi membutuhkan kandungan GC yang tinggi dari DNA template,
tetapi half-life dari Taq DNA Polymerase menekan secara tajam pada temperatur sekitar 95C.

1.1.2 Primer Annealing

Primer Annealing, pengenalan (annealing) suatu primer terhadap DNA target tergantung pada
panjang untai, banyaknya kandungan GC, dan konsentrasi primer itu sendiri. Optimalisasi
temperatur annealing dimulai dengan menghitung Melting Temperature (Tm) dari ikatan primer
dan DNA template. Cara termudah menghitung untuk mendapatkan melting-temperatur yang
tepat menggunakan rumus Tm = {(G+C)x4} +{ (A+T)x2}. Rumus standar dapat dilihat di
subbab primer pada komponen PCR. Sedang temperatur annealing biasanya 5C ddibawah Tm
primer yang sebenarnya. Secara praktis, Tm ini dipengaruhi oleh komponen buffer, konsentrasi
primer dan DNA template.

1.1.3 DNA Polymerase extension

Pada tahap extension ini terjadi proses pemanjangan untai baru DNA, dimulai dari posisi primer
yang telah menempel di urutan basa nukleotida DNA target akan bergerak dari ujung 5 menuju
ujung 3 dari untai tunggal DNA. Proses pemanjangan atau pembacaan informasi DNA yang
diinginkan sesuai dengan panjang urutan basa nukleotida yang ditargetkan. Pada setiap satu
kilobase (1000bp) yang akan diamplifikasi memerlukan waktu 1 menit. Sedang bila kurand dari
500bp hanya 30 detik dan pada kisaran 500 tapi kurang dari 1kb perlu waktu 45 detik, namun
apabila lebih dari 1kb akan memerlukan waktu 2 menit di setiap siklusnya (lihat contoh pada
tabel 2). Adapun temperatur ekstensi berkisar antara 70-72C.
Tabel 1 Amplifikasi Geometrik (X=2 n)

Siklus PCR

Jumlah Relatif Molekul

16

32

64

10

1.024

20

1. 048.576

30

1.073.741.824

II. Komponen PCR

Pada reaksi PCR diperlukan DNA template, primer spesifik, ensim DNA polimerase yang
thermostabil, buffer PCR, ion Mg 2+, dan thermal cycler.

2.1 Template DNA

Ukuran target amplifikasi biasanya kurang dari 1000 pasangan basa (bp) atau 1KB, Hasil
amplifikasi yang efisien antara 100-400bp. Walaupun kemungkinan hasil amplifikasi lebih dari 1
kB tetapi prosesnya kurang efisien, karena produk yang panjang rentan terhadap inhibitor yang

mempengaruhi kerja ensim DNA polymerase dan waktu yang diperlukan lebih lama. Hal ini
dapat menyebabkan hasil amplifikasi yang tidak diinginkan.

2.2 Primers
Primer disusun dari sintesis oligonukleotida sepanjang 15-32bp dan primer ini harus mampu
mengenali urutan yang akan diamplifikasi. Untuk standar amplifikasi sepasang primer akan
mempunyai kisaran pasangan basa sekitar 20 basa panjangnya pada tiap primernya. Kandungan
GC harus antara 45-60%. Annealing temperatur antara primer yang digunakan harus berkisar
antara 1C. Ujung 3 dari setiap primer harus G atau C, akan tetapi hindari susunan nukleotida
G/C berturut-turut tiga pada ujung ini, misal CCG, GCG, GGC, GGG, CCC, GCC. Pada
penentuan atau penyusunan sepasang primer, penting diperhatikan urutan primer tidak saling
komplementer sehingga membentuk dimer-primers, berikatan satu sama lain, atau membentuk
hairpins. Hal lainnya hindari menyusun primer pada daerah DNA repetitif.

2.3 Taq DNA polymerase

Enzim ini bersifat thermostabil dan diisolasi dari Thermus aquaticus. Aktivitas polimerisasi
DNAnya dari ujung-5 ke ujung-3 dan aktivitas enzimatik ini mempunyai waktu paruh sekitar
40 menit pada 95C. Biasanya untuk setiap 100l volume reaksi ditambahkan 2.0-2.5 unit.

2.4 PCR buffer dan konsentrasi Mg2+

Buffer standar untuk PCR tersusun atas 50mM KCl, 10mM Tris-Cl (pH8.3) dan 1.5mM MgCl2.
Buffer standard ini akan bekerja dengan baik untuk DNA template dan primer dengan kondisi
tertentu, tetapi mungkin tidak optimum dengan kombinasi yang lain. Produk PCR buffer ini
terkadang dijual dalam bentuk tanpa atau dengan MgCl2.
Konsentrasi ion magnesium dalam PCR buffer merupakan faktor yang sangat kritikal, karena
kemungkinan dapat mempengaruhi proses annealing primer, temperatur dissosiasi untai DNA
template, dan produk PCR. Hal ini disebabkan konsentrasi optimal ion Mg2+ itu sangat rendah.
Hal ini penting untuk preparasi DNA template yang tidak mengandung konsentrasi chelating
agent yang tinggi, seperti EDTA atau phosphat. Ion Mg2+ yang bebas bila terlalu rendah atau
tidak ada, maka biasanya tidak menghasilkan produk akhir PCR, sedang bila terlalu banyak ion
Mg2+yang bebas akan menghasilkan produk PCR yang tidak diinginkan.

2.5 Nucleotides (dNTPs)

Konsentrasi yang biasanya digunakan untuk setiap dNTP adalah 200 M. Pada konsentrasi ini
penting untuk mengatur konsentrasi ke-empat dNTP pada titik estimasi Km untuk setiap dNTP.
50mM, harus selalu diatur pH7.0. Konsentrasi yang tinggi akan menimbulkan
ketidakseimbangan dengan enzim polymerase. Sedang pada konsentrasi rendah akan
memberikan ketepatan dan spesifitas yang tinggi tanpa mereduksi hasil akhir. Total konsentrasi
dNTP dan ion saling terkait dan tidak akan merubah secara bebas.

2.6 PCR Thermal Cycler

PCR thermal cycler pertama kali dikembangkan oleh perusahaan PerkinElmer sebagai pemegang
paten asli. Pada saat ini telah diproduksi berbagai macam tipe alat PCR thermal cycler ini dari
berbagai perusahaan yang bergerak dalam bioteknologi. Walaupun nama masing-masing alat itu

berbeda tetapi prinsip kerjanya sama.

Mengenal PCR (Polymerase Chain Reaction)

May16https://kenjiediary.wordpress.com/2011/05/16/mengenal-pcr-polymerase-chain-reaction/
Yukss. buat yang pengen tau apa sih PCR (Polymerase Chain Reaction) ini mungkin disini
bisa baca-baca dikit ya..
Waktu pertama kali dengar PCR dulu, langsung blink blonk blank ni kepala apa tuuu???, trus
coba buka buku, baca dikit.. makin puyeng.. gak kebayang, apaan sihhhh????
Nah, ternyata, PCR itu lebih gampang kalo di animasikan, kayak film kartun.. hehe. ga percaya?
APA SIH PCR??
PCR ini sebenarnya adalah metode penggandaan dari potongan DNA.

Nah, DNA itu apa ya?.

Tubuh manusia tersusun dari organ-organ, seperti darah, tulang, otot dan lain-lain. Organ
tubuh tersusun dari jaringan, seperi jaringan lemak, jaringan otot, jaringan hati, dan
sebagainya. Lebih kecil lagi, jaringan tubuh tersusun dari kumpulan sel-sel. Nah, didalam sel
ini ada banyak sekali organel/organ2 sel, juga ada inti sel/ nucleus. Didalam nucleus inilah
terdapat yang namanya DNA, atau Deoxy Ribonucleic Acid. Oya, selain di dalam nucleus, DNA
juga tersimpan di dalam organel lain didalam sel, yaitu

mitokondria
Gimana Sih Bentuknya DNA?, Buat apa sih DNA itu??
DNA itu dianimasikan seperti untaian 2 buah kalung mutiara yang dironce dari berbagai
macam warna. (pernah liat kan gelang atau kalung yang dironce terus diputar-putar?. kira2
bentuknya seperti itu). Tali atau benang yang mengikat mutiara itu adalah tali Sugar-Phosphate
Backbone , sementara mutiara-nya adalah Basa yang terdiri dari kombinasi Purin atau
Pirimidine. Kombinasi inilah yang akan membedakan warna dari mutiara-nya. Liat deh
gambar struktur DNA ini, cantik kan??. Secara umum, DNA ini membawa kode genetik masingmasing individu. DNA mempunyai kode-kode untuk menentukan warna kulit seseorang, seperti
warna bola mata, hidung mancung dan sifat-sifat fisik lainnya. Semua sel mempunyai DNA,

bukan cuma sel manusia tapi sel hewan dan tumbuhan termasuk bakteri. Sel normal, sel kanker,

sampai sel yang sudah mati juga masih mengandung DNA.

APA HUBUNGANNYA PCR DENGAN DNA??
Karena DNA membawa kode-kode genetik di setiap rangkaian kalung mutiara-DNA, para
ahli mencari cara untuk melihat kode-kode genetik tersebut. NAH, bayangkan aja gimana
caranya melihat sebuah sel. Kita harus mengintip dibalik mikroskop dengan mata setengah
juling..hihi., apalagi melihat kode genetik yang super duper halusssssssss. its
impossible Karena itulah metode PCR ini diciptakan, untuk menggandakan 1 set kode
genetik, menjadi milyaran set kode genetik (bukan semua kalung mutiaranya lho, tapi potongan
kecil dari kalung mutiara tadi). sehingga kadar / jumlah kode genetiknya bisa dideteksi.
APA GUNANYA PCR???
Secara garis besar, PCR ini bertujuan untuk mendeteksi satu jenis kode genetik yang kita
inginkan. Misalnya dalam deteksi penyakit, seorang dokter ingin mengetahui apakah pasiennya
terinfeksi oleh bakteri Tuberculosis (TBC) , maka akan dicari kode genetik dari DNA bakteri
TBC dari dalam darah pasien tersebut. Demikian juga untuk mendeteksi Virus HIV, Virus
Dengue dan Kuman Malaria. Mendeteksi adanya sel kanker juga merupakan salah satu
kegunaan PCR, dengan melihat apakah pada jaringan yang dicurigai terserang kanker terdapat
kode-kode genetik yang biasanya terdapat didalam DNA sel kanker. Selain itu, PCR banyak
digunakan sebagai metode penelitian-penelitian biologi molekuler.
BAGAIMANA CARA KERJA PCR???
Mesin PCR adalah mesin termosiklik yang mengatur kenaikan dan penurunan suhu secara
bertahap. DNA yang sudah diisolasi akan dicampur dengan reagen/cairan yang mengandung
enzim-enzim dan primer DNA. Yang dimaksud dengan primer adalah kode genetik/ potongan
DNA yang ingin kita lihat dari kumpulan DNA yang sudah diisolasi tadi. Primer ini dibuat oleh
pabrik, dan bisa kita pesan sesuai kebutuhan kita (kayak menjahit bajuhehe). Prinsip dasar
PCR adalah Replikasi DNA , dimana pada tahap awal, kedua kalung mutiara-DNA akan
dipisahkan oleh proses pemanasan (sampai 95C). Hal ini bisa terjadi karena DNA merupakan
molekul protein yang akan mengalami proses denaturasi apabila dipanaskan. Setelah kedua

rantai terlepas, maka suhu akan diturunkan sampai 60C untuk memulai proses penempelan
primer di bagian rantai DNA yang cocok (primer ini akan mencari kode genetik yang sesuai,
jadi gak akan nempel di tempat lain!). Setelah primer menempel di kedua rantai DNA, salah
satu enzim yang tadi juga ditambahkan kedalam larutan DNA yang bernama Tag
Polymerase juga ikut menempel disitu, enzim ini lah yang akan meronce untaian kalung mutiara
yang baru sebagai pasangan dari masing-masing kalung mutiara tadi. Jadi, pada akhir siklus
pertama ini, akan dihasilkan 2 buah kalung mutiara yang baru. Siklus ini akan terus diulangi
sampai 60 kali. dan.. kalau masih ada yang ingat teori eksponensial, berapa banyak kalung
mutiara yang didapat pada akhir siklus ke 60? hayoooo.. jawabannya ada
Setelah proses PCR selesai, maka bisa dilanjutkan dengan elektroforesa atau metode lain, untuk
mengukur atau melihat kadar potongan DNA yang sudah jadi bermilyar-milyar banyaknya
So mudah2an tulisan ini gak bikin puyeng ya, kalo udah puyeng coba aja liat gelang jni.
^_^, mirip ama DNA kan???

Polymerase Chain Reaction (PCR)

https://mahmuddin.wordpress.com/2010/08/31/polymerasechain-reaction-pcr/
Posted by Mahmuddin pada Agustus 31, 2010
A. Prinsip Kerja

Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah metode untuk amplifikasi (perbanyakan) primer
oligonukleotida diarahkan secara enzimatik urutan DNA spesifik. Teknik ini mampu
memperbanyak sebuah urutan 105-106-kali lipat dari jumlah nanogram DNA template dalam
latar belakang besar pada sequence yang tidak relevan (misalnya dari total DNA genomik).
Sebuah prasyarat untuk memperbanyak urutan menggunakan PCR adalah memiliki pengetahuan,
urutan segmen unik yang mengapit DNA yang akan diamplifikasi, sehingga oligonucleotides
tertentu dapat diperoleh. Hal ini tidak perlu tahu apa-apa tentang urutan intervening antara
primer. Produk PCR diamplifikasi dari template DNA menggunakan DNA polimerase stabilpanas dari Thermus aquaticus (Taq DNA polimerase) dan menggunakan pengatur siklus termal
otomatis (Perkin-Elmer/Cetus) untuk menempatkan reaksi sampai 30 atau lebih siklus
denaturasi, anil primer, dan polimerisasi. Setelah amplifikasi dengan PCR, produk ini dipisahkan
dengan elektroforesis gel poliakrilamida dan secara langsung divisualisasikan setelah pewarnaan
dengan bromida etidium.
PCR (Polymerase Chain Reaction) merupakan suatu teknik perbanyakan (amplifikasi) potongan
DNA secara in vitro pada daerah spesifik yang dibatasi oleh dua buah primer oligonukleotida.
Primer yang digunakan sebagai pembatas daerah yang diperbanyak adalah DNA untai tunggal
yang urutannya komplemen dengan DNA templatnya. Proses tersebut mirip dengan proses
replikasi DNA secara in vivo yang bersifat semi konservatif.
PCR memungkinkan adanya perbanyakan DNA antara dua primer, hanya di dalam tabung reaksi,
tanpa perlu memasukkannya ke dalam sel (in vivo). Pada proses PCR dibutuhkan DNA untai
ganda yang berfungsi sebagai cetakan (templat) yang mengandung DNA-target (yang akan
diamplifikasi) untuk pembentukan molekul DNA baru, enzim DNA polimerase,
deoksinukleosida trifosfat (dNTP), dan sepasang primer oligonukleotida. Pada kondisi tertentu,
kedua primer akan mengenali dan berikatan dengan untaian DNA komplemennya yang terletak
pada awal dan akhir fragmen DNA target, sehingga kedua primer tersebut akan menyediakan
gugus hidroksil bebas pada karbon 3. Setelah kedua primer menempel pada DNA templat, DNA
polimerase mengkatalisis proses pemanjangan kedua primer dengan menambahkan nukleotida
yang komplemen dengan urutan nukleotida templat. DNA polimerase mengkatalisis
pembentukan ikatan fosfodiester antara OH pada karbon 3 dengan gugus 5 fosfat dNTP yang
ditambahkan. Sehingga proses penambahan dNTP yang dikatalisis oleh enzim DNA polimerase
ini berlangsung dengan arah 53 dan disebut reaksi polimerisasi. Enzim DNA polimerase
hanya akan menambahkan dNTP yang komplemen dengan nukleotida yang terdapat pada rantai
DNA templat.
PCR melibatkan banyak siklus yang masing-masing terdiri dari tiga tahap berurutan, yaitu
pemisahan (denaturasi) rantai DNA templat, penempelan (annealing) pasangan primer pada
DNA target dan pemanjangan (extension) primer atau reaksi polimerisasi yang dikaalisis oleh
DNA polimerase.
B. Kegunaan
Polymerase Chain Reaction (PCR) dapat digunakan untuk:
1. amplifikasi urutan nukleotida.

2. menentukan kondisi urutan nukleotida suatu DNA yang mengalami mutasi.

3. bidang kedokteran forensik.
4. melacak asal-usul sesorang dengan membandingkan finger print.
C. Waktu yang Dibutuhkan
1. 1-2 hari
2. PCR: 3-6 jam atau semalam
3. Polyacrylamide gel electrophoresis using Mighty-small II gel apparatus: 2.5 hours
poliakrilamid gel elektroforesis menggunakan Mighty-small II bahan gel: 2,5 jam
4. Etidium bromide staining dan fotografi: 45 menit
D. Reagen Khusus
1. Pasangan primer oligonukleotida sintetik mengapit urutan yang akan diamplifikasi
2. Buffer PCR 5X (250 mM KCl, 50 mM Tris-HCl pH 8,3, 7,5 mM MgCl2)
3. Campuran dari empat dNTP (dGTP, dATP, dTTP, dCTP) masing-masing sebesar 2,5 mM
(ultra murni DNTP set, Pharmacia # 27-2035-01). DNTP campuran dibuat dengan
volume 10 mM larutan dari masing-masing empat dNTP terpisah yang digabung.
4. Taq DNA Polymerase (AmpliTaqTM, Perkin-Elmer/Cetus)
5. Minyak mineral ringan
6. Akrilamida (grade elektroforesis)
7. N, N-Methylenebisacrylamide (grade elektroforesis, Ultra-Pure/BRL, # 5516UB)
8. Amonium persulfat (Ultra-Pure/BRL, # 5523UA)
9. TEMED (N, N, NN Tetramethylethylenediamine, Ultra-Murni / BRL, # 5524UB)
E. Peralatan Khusus
1. Mighty-small II SE-250 vertical gel electrophoresis unit (Hoefer)
2. Perkin-Elmer/Cetus Thermal Cycler
3. Sterile Thin-wall 0.5 ml Thermocycler microfuge tubes: (TC-5, Midwest Scientific)

Komponen PCR lainnya:

1) Enzim DNA Polymerase
Dalam sejarahnya, PCR dilakukan dengan menggunakan Klenow fragment DNA Polimerase I
selama reaksi polimerisasinya. Enzime ini ternyata tidak aktif secara termal selama proses
denaturasi, sehingga peneliti harus menambahkan enzim di setiap siklusnya. Selain itu, enzim ini
hanya bisa dipakai untuk perpanjangan 200 bp dan hasilnya menjadi kurang spesifik. Untuk
mengatasi kekurangan tersebut, dalam perkembangannya kemudian dipakai enzim Taq DNA
polymerase yang memiliki keaktifan pada suhu tinggi. Oleh karenanya, penambahan enzim tidak
perlu dilakukan di setiap siklusnya, dan proses PCR dapat dilakukan dalam satu mesin
2) Primer
Primer merupakan oligonukleotida pendek rantai tunggal yang mempunyai urutan komplemen
dengan DNA templat yang akan diperbanyak. Panjang primer berkisar antara 20-30 basa. Untuk
merancang urutan primer, perlu diketahui urutannukleotida pada awal dan akhir DNA target.
Primer oligonukleotida di sintesis menggunakan suatu alat yang disebut DNA synthesizer.
3) Reagen lainnya
Selain enzim dan primer, terdapat juga komponen lain yang ikut menentukan keberhasilan reaksi
PCR. Komponen tersebut adalah dNTP untuk reaksi polimerisasi, dan buffer yang mengandung
MgCl2. Konsentrasi ion Mg2+dalam campuran reaksi merupakan hal yang sangat kritis.
Konsentrasi ion Mg2+ ini sangat mempengaruhi proses primer annealing, denaturasi, spesifisitas
produk, aktivitas enzim dan fidelitas reaksi.
F. Tahapan PCR
1) Denaturasi
Selama proses denaturasi, DNA untai ganda akan membuka menjadi dua untai tunggal. Hal ini
disebabkan karena suhu denaturasi yang tinggi menyebabkan putusnya ikatan hidrogen diantara
basa-basa yang komplemen. Pada tahap ini, seluruh reaksi enzim tidak berjalan, misalnya reaksi
polimerisasi pada siklus yang sebelumnya. Denaturasi biasanya dilakukan antara suhu 90 oC 95
o
C.
2) Penempelan primer
Pada tahap penempelan primer (annealing), primer akan menuju daerah yang spesifik yang
komplemen dengan urutan primer. Pada proses annealing ini, ikatan hidrogen akan terbentuk
antara primer dengan urutan komplemen pada template. Proses ini biasanya dilakukan pada suhu
50 oC 60 oC. Selanjutnya, DNA polymerase akan berikatan sehingga ikatan hidrogen tersebut
akan menjadi sangat kuat dan tidak akan putus kembali apabila dilakukan reaksi polimerisasi
selanjutnya, misalnya pada 72 oC.

3) Reaksi polimerisasi (extension)

Umumnya, reaksi polimerisasi atau perpanjangan rantai ini, terjadi pada suhu 72 oC. Primer yang
telah menempel tadi akan mengalami perpanjangan pada sisi 3nya dengan penambahan dNTP
yang komplemen dengan templat oleh DNA polimerase.
Jika siklus dilakukan berulang-ulang maka daerah yang dibatasi oleh dua primer akan
diamplifikasi secara eksponensial (disebut amplikon yang berupa untai ganda), sehingga
mencapai jumlah copy yang dapat dirumuskan dengan (2n)x. Dimana n adalah jumlah siklus dan
x adalah jumlah awal molekul DNA. Jadi, seandainya ada 1 copy DNA sebelum siklus
berlangsung, setelah satu siklus, akan menjadi 2 copy, sesudah 2 siklus akan menjadi 4, sesudah
3 siklus akan menjadi 8 kopi dan seterusnya. Sehingga perubahan ini akan berlangsung secara
eksponensial. PCR dengan menggunakan enzim Taq DNA polimerase pada akhir dari setiap
siklus akan menyebabkan penambahan satu nukleotida A pada ujung 3 dari potongan DNA yang
dihasilkan. Sehingga nantinya produk PCR ini dapat di kloning dengan menggunakan vektor
yang ditambahkan nukleotida T pada ujung-ujung 5-nya. Proses PCR dilakukan menggunakan
suatu alat yang disebut thermocycler.
G. Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (Rt-Pcr)
RT-PCR merupakan singkatan Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction. Seperti
namanya, proses RT-PCR merupakan bagian dari proses PCR biasa. Perbedaanya dengan PCR
yang biasa, pada proses ini berlangsung satu siklus tambahan yaitu adanya perubahan RNA
menjadi cDNA (complementary DNA) dengan menggunakan enzim Reverse Transkriptase.
Reverse Transcriptase adalah suatu enzim yang dapat mensintesa molekul DNA secara in vitro
menggunakan template RNA.
Seperti halnya PCR biasa, pada pengerjaan RT-PCR ini juga diperlukan DNA Polimerase,
primer, buffer, dan dNTP. Namun berbeda dengan PCR, templat yang digunakan pada RT-PCR
adalah RNA murni. Oleh karena primer juga dapat menempel pada DNA selain pada RNA, maka
DNA yang mengkontaminasi proses ini harus dibuang. Untuk proses amplifikasi mRNA yang
mempunyai poly(A) tail pada ujung 3, maka oligo dT, random heksamer, maupun primer
spesifik untuk gen tertentu dapat dimanfaatkan untuk memulai sintesa cDNA.
H. Metoda Deteksi Produk PCR
Produk PCR adalah segmen DNA (amplikon) yang berada dalam jumlah jutaan copy, tetapi tidak
dapat dilihat dengan mata telanjang. Oleh karena itu PCR perlu diikuti dengan suatu tahap akhir
yang bertujuan untuk memvisualisasikan produk PCR serta sekaligus bertujuan untuk
mengetahui ukuran produk PCR dan mengetahui apakah produk yang dihasilkan adalah benar
seperti yang diinginkan. Salah satu metoda deteksi yang umum dilakukan adalah elektroforesis
gen agarosa.