Praktikum Mikrobiologi

Pewarnaan Bakteri

Disusun oleh :
Yuni Asrianti Rusmina Yusni Mardiana Nur Fadillah Muhammad Rusli Tahir Rezky Amaliah Rafid Putri Amaliah Alyani Sundarika Nastitin

POLITEKNIK KESEHATAN KEMENKES MAKASSAR JURUSAN FARMASI 2011

BAB I PENDAHULUAN A. Latar Belakang

Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), kokus, dan spirilum. Bakteri yang berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa macam. Pada bentuk basil pembagiannya yaitu basil tunggal, diplobasil, dan tripobasil. Sedangkan pada kokus dibagi monokokus (satu buah bakteri berbentuk kotak), diplococcus, sampai staphylococcus (bentuknya mirip buah anggur). Khusus pada spirul hanya dibagi 2 yaitu setengah melengkung dan tidak melengkung. Bakteri yang hidup sangat sukar untuk dilihat dan diamati karena selain bakteri itu tidak berwarna, juga transparan dan sangat kecil. Bertolak dari hal tersebut maka dikembangkanlah suatu teknik pewarnaan sel bakteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Oleh karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi. Beberapa macam cara pewarnaan bakteri diantaranya : 1. pewarnaan sederhana 2. pewarnaan diferensial 3. pewarnaan struktural 4. pewarnaan untuk komponen-komponen tertentu Beberapa zat yang digunakan untuk mewarnai bakteri juga dapat digunakan untuk mengamati struktur bagian dalam sel. Dengan adanya pewarnaan terutama bakteri yang mempunyai sel dengan ukuran yang relatif kecil akan lebih mudah terlihat di bawah mikroskop dengan menggunakan lensa objektif minyak imersi yang mempunyai tingkat pembesaran yang relatif tinggi. Sebenarnya, teknik pewarnaan bukan pekerjaan yang sulit tapi perlu ketelitian dan kecermatan bekerja serta mengikuti aturan dasar yang berlaku, yakni sebagai berikut: 1. Mempersiapkan objek gelas. Objek gelas ini harus bersih dan bebas lemak untuk membuat apusan dari bakteri yang diwarnai. 2. Dalam mempersiapkan apusan juga perlu ketelitian. Apusan yang baik adalah yang tipis dan kering, terlihat seperti lapisan yang tipis.

B. Tujuan Praktikum
1. Mengamati morfologi bakteri dengan menggunakan metode pewarnaan sederhana dan pewarnaan gram 2. Menentukan penggolongan bakteri dengan metode pewarnaan gram

3. Mempelajari proses pewarnaan struktur sel bakteri yang sekaligus menunjukkan sifat bakteri tersebut. 4. Mengamati, mempelajari, dan membedakan bentuk-bentuk dan struktur sel bakteri.

C. Prinsip Praktikum
Melakukan pewarnaan bakteri (dalam hal ini pewarnaan sederhana dan pewarnaan gram) untuk mengidentifikasi bakteri

D. Manfaat Praktikum
Mampu mengamati morfologi bakteri dengan menggunakan metode pewarnaan sederhana dan pewarnaan gram

BAB II TINJAUAN PUSTAKA A. Dasar Teori

Bakteri hidup sulit untuk dilihat dengan mikroskop cahaya terang biasa karena bakteri itu tampak tidak berwarna jika diamati secara sendiri, walaupun biakannya secara keseluruhan mungkin berwarna. Bakteri sering diamati dalam keadaan olesan terwarnai daripada dalam keadaan hidup. Yang dimaksud dengan bakteri terwarnai adalah oganisme yang telah diwarnai dengan zat pewarna kimia agar mudah dilihat dan dipelajari (Volk dan Whleer, 1998). Pada umumnya, olesan bakteri terwarnai mengungkapkan ukuran, bentuk, susunan dan adanya struktur internal seperti spora dan butiran zat pewarna khusus diperlukan untuk melihat bentuk kapsul ataupun flagella, dan hal-hal terperinci tertentu di dalam sel. Sel bakteri dapat teramati dengan jelas jika digunakan mikroskop dengan perbesaran 100x10 yang ditambah minyak imersi. Jika dibuat preparat ulas tanpa pewarnaan, sel bakteri sulit terlihat. Pewarnaan bertujuan untuk memperjelas sel bakteri dengan menempelkan zat warna ke permukaan sel bakteri. Zat warna adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang salah satu ionnya berwarna. Garam terdiri dari ion bermuatan positif dan ion bermuatan negatif. Senyawa-senyawa kimia ini berguna untuk membedakan bakteri-bakteri karena reaksinya dengan sel bakeri akan memberikan warna berbeda. Perbedaan inilah yang digunakan sebagai dasar pewarnaan bakteri (Sutedjo, 1991). Zat warna dapat mengabsorbsi dan membiaskan cahaya, sehingga kontras sel bakteri dengan sekelilingnya ditingkatka. Zat warna yang digunakan bersifat asam atau basa. Pada zat warna basa, bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut kromofor dan mempunyai muatan positif. Sebaliknya pada zat warna asam bagian yang berperan memberikan zat warna memiliki muatan negatif. Zat warna basa lebih banyak digunakan karena muatan negatif banyak banyak ditemukan pada permukaan sel. Contoh zat warna asam antara lain Crystal Violet, Methylene Blue, Safranin, Base Fuchsin, Malachite Green dll. Sedangkan zat warna basa antara lain Eosin, Congo Red dll (Irawan, 2008). Langkah-langkah utama dalam persiapan spesimen mikroba untuk pemeriksaan mikroskopik adalah (Pelczar, 1986) : Penempatan olesan atau lapisan spesimen pada kaca objek. Fiksasi olesan pada kaca objek. - Aplikasi pewarna tunggal (pewarnaan sederhana) atau serangkaian larutan pewarna atau reagen (pewarnaan diferensial).

Pengecatan Gram Pewarnaan ini mula-mula dikembangkan oleh Christian Gram (1884). Pengecatan gram meliputi 4 tingkat:

1. 2. 3. 4.

pemberian cat utama (larutan kristal violet yang berwarna ungu) pengintensifan pemberian cat utama dengan pemberian mordant (larutan lugol) pencucian dengan larutan alkohol pemberian cat penutup (caunterstain) dengan larutan safranin.

Pengecatan gram termasuk pengecatan diferensial karena dapat membedakan bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. 1. Bakteri gram positif adalah bakteri yang mengikat cat utama dengan kuat sehingga tidak dapat dilunturkan dengan peluntur cat dan tidak dapat diwarnai lagi oleh cat lain. Pada pengamatan mikroskop, bakteri- bakteri ini tampak berwarna ungu. 2. Bakteri gram negatif adalah bakteri yang mengikat cat utama tidak begitu kuat sehingga dapat dilunturkan oleh peluntur cat dan dapat diwarnai oleh cat lawan. Pada pengamatan mikroskop, bakteri- bakteri ini berwarna merah.

BAB III METODE KERJA

A. Alat dan Bahan

1. Alat Objek gelas Objek dek gelas Tabung reaksi Rak tabung reaksi Jarum ose bulat Lampu spiritus Pipet tetes Mikroskop manual Mikroskop binokuler

2. Bahan Bakteri : Staphylococcus aureus, Escherichia coli, dan Salmonella Typhi Zat warna : Metil biru, kristal violet, larutan lugol, larutan safranin Alkohol Minyak imersi Aquadest Sarung tangan Korek api Tissue Label

B. Cara Kerja
1. Pewarnaan Sederhana Terlebih dahulu sterilkan alat yang akan dipakai ( gelas objek,jarum ose,dan mulut tabung reaksi ) Buatlah sediaan di atas kaca objek, keringkan pada suhu kamar, lalu fiksasi dengan cara melewatkan di atas nyala api bunsen, dinginkan Letakkan sediaan di atas rak pewarnaan Teteskan larutan metilen biru hingga menutup sediaan. Diamkan satu menit Buang larutan dengan mencucinya hingga warna hilang dan meninggalkan bakteri yang masih melekat, kemudian keringkan Lihat di bawah mikroskop dengan pembesaran 100x menggunakan minyak imersi Hasil semua bakteri akan berwarna biru, bentuknya akan terlihat jelas

2. Pewarnaan Gram Terlebih dahulu sterilkan alat yang akan dipakai ( gelas objek,jarum ose bulat,dan mulut tabung reaksi ) Buatlah sediaan di atas kaca objek, keringkan pada suhu kamar, lalu fiksasi dengan cara melewatkan di atas nyala api bunsen, dinginkan Letakkan sediaan di atas rak pewarnaan Sediaan yang telah jadi tetesi dengan kristal violet, diamkan selama satu menit, dicuci dengan air mengalir, dan dikeringkan Lakukan hal yang sama pada pewarna lainnya ( larutan lugol, alkohol, dan larutan safranin ) Amati dengan mikroskop dengan pembesaran 100x ( menggunakan minyak imersi )

BAB IV HASIL PEMBAHASAN A. Hasil Pengamatan

Gambar Bakteri dengan Pewarnaan Sederhana 1. Staphylococcus aureus

2. Escherichia coli

3. Salmonella typhi

 Gambar bakteri dengan Pewarnaan Gram 1. Staphylococcus aureus

2. Escherichia coli

3. Salmonella typhi

B. Pembahasan
Pada praktikum kali ini, praktikan melakukan teknik pewarnaan sedehana dan pewarnaan gram. Istilah pewarna sederhana dapat diartikan dalam mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja (Gupte, 1990). Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif). Pewarnaan gram ditujukan untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, gram-positif dan gram-negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Yang menjadi bakteri sebagai bahan uji pada praktikum kali ini adalah Staphylococcus aereus, Escherichia coli, dan Salmonella typhi . Pewarnaan gram ini menggunakan 4 macam pewarna dengan fungsi yang berbeda. Proses perwarnaan itu sendiri dilakukan dengan membersihkan gelas objek dan gelas penutup dengan alkohol 70% untuk sterilisasi agar tidak terkontaminasi. Kemudian meletakkan bakteri dan membuat preparat apusan ( sediaan ) dari biakan miring agar mudah diamati dan difiksasi. Sampel disuspensikan sampai homogen agar bakteri dapat menyebar di gelas objek dan tidak menumpuk. Kemudian difiksasi di atas api yang bertujuan untuk membunuh bakteri secara cepat dengan tidak merubah bentuk dan struktur bakteri, melekatkan bakteri di atas objek gelas dan meningkatkan sifat salinitas pewarna (Tortora, 2002). Proses pewarnaan bakteri diawali dengan kristal violet dan didiamkan selama satu menit. pewarnaan dilakukan 1 menit agar cat ini dapat melekat sempurna pada dinding bakteri sehingga pengikatan warna oleh bakteri menjadi lebih kuat. Setelah perlakuan pewarnaan, preparat selalu dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan,setelah itu ditetesi dengan lugol dan tetesi dengan preparat dengan alkohol 96%, tetes demi tetes. Hal ini dimaksudkan karena alkohol dapat membuat bakteri tidak berwarna dan berfungsi untuk melunturkan cat sebelumnya, dilakukan selama 1 menit agar cat dapat luntur secara sempurna dan tidak ada yang tersisa. dikeringanginkan bertujuan agar warna melekat pada bakteri dan segera kering sehingga bila diwarnai lagi warna sebelumnya tidak tercampur dengan warna yang baru. Kemudian dilihat di bawah mikroskop dengan perbesaran 100 x agar dapat mengamati bentuk dan warna sel bakteri. Bakteri gram positif akan berwarna ungu, sedangkan bakteri gram negatif akan berwarna merah.

Sesuai dengan tujuan pewarnaan gram tersebut praktikan mendapatkan hasil bahwa terdapat perbedaan antara kedua bakteri tersebut setelah diwarnai, yaitu pada: - Kriteria Warna Staphylococcus aureus Ketika warna bakteri menjadi ungu setelah diwarnai, bakteri mengindikasikan bahwa bakteri Staphylococcus aureus termasuk ke dalam golongan gram positif karena berdasarkan literatur, bakteri gram positif akan mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol. - Kriteria warna Escherichia coli Bakteri Escherichia coli setelah diwarnai menunjukkan warna keunguan yang hampir menyerupai merah muda. Berdasarkan literatur hal ini menandakan bahwa bakteri Escherichia coli merupakan bakteri dengan gram negatif karena gram negatif tidak mempertahankan zat warna metil ungu. Pewarna penimbal setelah diberikan metil ungu membuat semua bakteri gram negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. - Kriteria warna Salmonella Typhi Setelah diwarnai, bakteri ini menunjukkan warna merah yang berarti bahwa Salmonella typhi dikelompokkan ke dalam gram negatif. Karakter warna yang berbeda ini terjadi karena terdapatnya perbedaan struktur dinding sel masing-masing bakteri dan responnya terhadap sifat asam-basanya. Karena pada dasarnya pewarnaan ini melibatkan adanya ion antara komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna. Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna basa.Pewarna asam dapat tejadi karena bila senyawa pewarna bermuatan negatif. Dalam kondisi pH mendekati netral dinding sel bakteri cenderung bermuatan negatif, sehingga pewarna asam yang bermuatan negatif akan ditolak oleh dinding sel, maka sel tidak berwarna. Sementara Pewarnaan basa bisa terjadi bila senyawa pewarna bersifat positif, sehingga akan diikat oleh dinding sel bakteri dan sel bakteri jadi terwarna dan terlihat. Selain digunakan untuk mengelompokkan bakteri gram positif dan bakteri gram negatif , percobaan ini juga ditujukkan untuk mengamati morfologi, baik bentuk maupun susunan sel. Berdasarkan hasil pengamatan, didapat bahwa :

-Staphylococcus Aureus Berbentuk bulat-bulat (coccus) yang berkoloni membentuk kumpulan anggur tetapi tidak beraturan, sesuai dengan karakteritik Staphlococcus aereus berdasarkan literatur yang berkarakter sebagai bakteri Gram-positif yang berbentuk bola. Bakteri ini ada yang berkoloni dan berbentuk seperti buah buah anggur sama seperti yang terlihat di kaca preparat dengan pembesaran. Peranannya adalah dapat menghasilkan racun sebagai penyebab sindrom trauma yang diderita oleh pria, wanita dan anak-anak. Sindrom racun trauma tersebut berupa kejang, pingsan, turunnnya tekanan darah (Textbook, 2008). - Escherichia coli Berbentuk lonjong panjang (bacillus) yang terbentuk dengan jumlah cukup banyak dan intens tetapi terpisah-pisah seperti rantai yang panjang, sesuai dengan karakteritik Escherichia coli berdasarkan literatur yang berkarakter sebagai bakteri yang termasuk gram negatif dan berbentuk batang yang fermentatif (kenneath, 2008) Koloninya tersusun seperti rantai memanjang. E. coli hidup dalam jumlah besar di dalam usus manusia, yaitu membantu sistem pencernaan manusia dan melindunginya dari bakteri patogen. Akan tetapi pada strain baru dari E.coli merupakan patogen berbahaya yang menyebabkan penyakit diare dan sindrom diare lanjutan serta hemolitik uremic (hus). Peranan yang mengguntungkan adalah dapat dijadikan percobaan limbah di air, indikator pada level pencemaran air serta mendeteksi patogen pada feses manusia yang disebabkan oleh Salmonella typhi. (Mikrolibrary, 2008).

- Salmonella Typhi Berbentuk basil (batang) seperti tongkat pendek dalam jumlah yang banyak. Berdasarkan literatur, bakteri ini tergolong gram negatif. Salmonella typhi bergerak dengan flagel peritrich (flagel yang menempel pada seluruh permukaan bakteri), mudah tumbuh pada perbenihan biasa dan tumbuh baik pada perbenihan yang mengandung empedu. Pada manusia, bakteri jenis ini dapat menimbulkan penyakit typhus abdominalis. Bakterinya masuk ke dalam aliran darah.

BAB IV PENUTUP

A. Kesimpulan Pewarnaan bakteri dengan menggunakan satu macam zat warna saja disebut pewarnaan sederhana. Sedangkan pengelompokan bakteri berdasarkan reaksinya terhadap warna dapat dilakukan dengan teknik pewarnaan yang disebut pewarnaan gram. Dengan pewarnaan gram bakteri dibedakan menjadi dua kelompok, yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Bakteri gram positif setelah dilakukan pewarnaan gram akan berwarna ungu. Bakteri gram negatif setelah dilakukan pewarnaan gram akan barwarna merah.Dengan pewarnaan gram ini juga dapat membedakan bentuk-bentuk bakteri. Ada yang berbentuk bola (coccus) dan ada juga yang berbentuk batang/ silinder (bacillus). Dalam teknik pewarnaan gram ini dilakukan dengan : 1. Pewarnaan primer menggunakan kristal violet. 2. Pengikatan warna dengan cara didiamkan. 3. Pencucian warna menggunakan air. 4. Pengintensifan cat warna utama menggunakan larutan lugol.

B. Saran
Sebaiknya pada saat praktikum, prosedur pewarnaan benar-benar diperhatikan terutama pada lama waktu dan urutan pewarnaan agar tidak terjadi kesalahan dan warna yang terlalu tebal. Selain itu, pembuatan apusan atau sediaan juga perlu ketelitian, apusan yang baik adalah yang tipis dan kering. Alat-alat yang digunakan juga perlu dijaga kebersihannya, karena ini merupakan salah satu faktor yang menentukan berhasil tidaknya eksperimen yang dilakukan.

DAFTAR PUSTAKA
1. Pakadang, Sisilia R. 2011. Buku Penuntun Praktikum Mikrobiologi Farmasi.Makassar 2. http : //ruddy-pharmacy.blogspot.com/2000/12/pewarnaan-gram.html 3. http : //www.google.co.id/search?q=pewarnaan+sederhana+bakteri 4. http : //qi206.wordpress.com/2008/10/17mikroumpewarnaan-gram 5. http ://Wikipedia/2008/06/pewarnaan-bakteri 6. http ://floatshaker.blogspot.com/2009/04/pewarnaangram.html

Praktikum Mikrobiologi
Pewarnaan Bakteri

Disusun oleh :
Yuni Asrianti Rusmina Yusni Mardiana Nur Fadillah Muhammad Rusli Tahir Rezky Amaliah Rafid Putri Amaliah Alyani Sundarika Nastitin

POLITEKNIK KESEHATAN KEMENKES MAKASSAR JURUSAN FARMASI 2011