LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER

Analisa Polimorfisme Gen CYP1A2 Dengan Teknik DNA Fingerprinting

Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)

KP A

Kelompok 9

Leonardo T. G. P. H. / 7131011
Maria Rosari D.U. / 7131005

Dosen :

Dr. Dra. Mariana Wahjudi, M.Si.

Ruth Chrisnasari, S.TP., M.P.

Asisten :

Samuel Stefanus Widodo

Yoko Brigitte Wang

FAKULTAS TEKNOBIOLOGI

UNIVERSITAS SURABAYA

2016
 Analisa Polimorfisme Gen CYP1A2 Dengan Teknik DNA Fingerprinting Restriction
Fragment Length Polymorphism (RFLP)

I. Tujuan
Menganalisis polimorfisme gen CYP1A2 dari sampel darah manusia dengan
menggunakan teknik DNA Fingerprinting Restriction Fragment Length
Polymorphism (RFLP).
II. Metode Kerja
DNA template Sampel Manusia

Dipindahkan dalam tabung PCR, ditambah dengan GoTaq

Master Mix 2X , Primer (Forward dan Reverse), ddH2O dengan
komposisi pada Tabel 2.1.

Campuran reaksi PCR dalam tabung PCR

Dimasukkan ke dalam mesin PCR dengan pengaturan sesuai pada Tabel 2.2.

Hasil amplifikasi reaksi PCR (20μl)

14,5 μl Sampel 5,5 μl Sampel

Ditambahkan enzim
restriksi ApaI 0,5μl

Diinkubasi 37℃ 2 jam

Diinkubasi 65℃ 15 menit

Divisualisasikan pada gel agarosa 2% Divisualisasikan pada gel agarosa 1%

Gambar 2.1. Skema proses amplifikasi, restriksi dan visualisassi gen CYP1A2 dari
sampel manusia

Tabel 2.1. Komponen reaksi PCR untuk analisa fingerprinting RFLP dan kontrol negatif
Campuranreaksi Konsentrasi Sampel Kontrol
akhir negatif
GoTaq Master Mix 2X 1X 10μL 5 μL
Primerforward CYP1A2*1F (10 μM) 1 μM 2μL 1μL
Primerreverse CYP1A2*1F (10 μM) 1 μM 2μL 1μL
Template (DNA genom) 10ng/10 μL 2μL 0 μL
ddH2O disesuaikan 4μL 3μL
Volume akhir 20 μL 10 μL
 Tabel 2.2. Pengaturan mesin PCR
Proses Sampel dan kontrol negatif
Pre-denaturation 94oC/5 menit
Siklus 30 siklus
Denaturation 94oC/1 menit
Annealing 55oC/30detik
Elongation 72oC/30 detik
Post-elongation 72oC/4 menit

III. Hasil
1 2 3 4 5 6
M S K- S K- S K- S K- S K- S K-

300 bp
200 bp

7 8 9 10 11 12
M S K- S K- S K- S K- S K- S K-

300 bp
200 bp

Gambar 3.1. Hasil visualisasi elektroforesis sampel hasil amplifikasi pada gel
agarosa 1%. M = marker NEB 100 bp ; S = sampel hasil amplifikasi uncut ; K-
= kontrol negatif ; 1-12 = sampel milik kelompok 1-12
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

300 bp
200 bp
100 bp
Gambar 3.2. Hasil visualisasi elektroforesis sampel hasil restriksi pada gel
agarosa 2%. M = marker NEB 100 bp ; 1-12 = sampel milik kelompok 1-12
 Pada Gambar 3.1., untuk sampel amplifikasi dan kontrol negatif, sampel dari
semua kelompok menunjukkan satu pita pada ukuran ~250 bp. Sampel pada
kelompok 1, 2, 5, dan 6 terlihat tidak sejajar jika dibandingkan dengan marker. Ada
perbedaan intensitas yang terlihat, seperti pada sampel kelompok 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10,
dan 12, sedangkan pita pada sampel kelompok 5, 1, dan 11 tervisualisasi lebih tipis
intensitasnya. Kontrol negatif pada sampel kelompok 1, 2, 3, 4, 5, dan 6 menunjukkan
adanya smear yang tipis berukuran <100 bp, namun kontrol negatif pada kelompok 5
menunjukkan adanya pita tipis pada ukuran ~250 bp.
Gambar 3.2., menunjukkan visualisasi hasil elektroforesis sampel setelah
direstriksi. Sampel semua kelompok menghasilkan pita berukuran ~250 bp.
Sedangkan sampel kelompok 3, 6, 7, 11, dan 12 menghasilkan dua pita berukuran
~250 bp dan ~100 bp. Semua sampel memiliki intensitas pita yang kira-kira sama
secara kasat mata, kecuali sampel kelompok 11 yang intensitas pitanya jauh lebih tipis
dibandingkan kelompok lainnya.

IV. Pembahasan
Pada praktikum kali ini, praktikan akan menganalisis adanya polimorfisme
pada gen CYP1A2 dari sampel manusia. Primer yang digunakan pada praktikum
adalah primer yang spesifik untuk mendeteksi adanya polimorfisme gen tersebut,
dalam hal ini varian CYP1A2*1F. Pada hasil visualisasi gel elektroforesis untuk
sampel hasil amplifikasi dan kontrol negatif (Gambar 3.1.), dapat dilihat bahwa
nampak 1 band pada ukuran ~250bp. Band berukuran ~250bp tersebut kemungkinan
besar adalah fragmen DNA yang mengkode gen CYP1A2*F, yang memilkiki ukuran
243 bp (Hamdy et.al.,2003).
Pada sampel kelompok 5, terdapat band yang tipis pada kontrol negatif,
sehingga dapat diduga bahwa adanya kontaminasi DNA pada saat preparasi sampel
ataupun masuknya sampel hasil amplifikasi dari well lain yang tidak sengaja masuk
ke well kontrol negatif kelompok 5. Adanya band yang muncul pada kontrol negatif
menyebabkan tidak validnya data untuk sampel 5. Pada hasil amplifikasi kelompok
11, band yang muncul memiliki intensitas yang lebih rendah daripada band pada well
lain. Hal tersebut dapat diduga karena konsentrasi DNA yang lebih rendah, sehingga
dengan proses amplifikasi yang jumlah siklusnya sama, intensitas yang ditunjukkan
juga lebih rendah. Terjadinya band yang memiliki kemiringan dibandingkan band
lain dapat disebabkan karena kurang homogennya gel agarosa sehingga laju migrasi
dari tiap bagian tidak bisa sama. Smear juga terlihat pada hasil visualisasi, hal tersebut
dapat dikarenakan adanya mispriming ataupun dimer. Optimasi pada proses PCR
dapat diakukan untuk mengurangi timbulnya mispriming, seperti pengingkatan suhu
annealing, atau pengurangan siklus PCR (Chou et.al., 1992).
Pada visualisasi sampel amplifikasi yang telah diberi enzim restriksi ApaI
(Gambar 3.2.), terlihat bahwa ada sampel yang menampakkan 1 band (~250bp) dan
ada yang menampakkan 2 band (~250bp dan ~100bp). Penggunaan enzim restriksi
ApaI dikarenakan pada gen CYP1A2*1F, situs pengenalan enzim restriksi ApaI tidak
deikenali dikarenakan terjadinya mutasi titik (C A) pada intron 1 downstream 734
(Chida et.al., 1999 & Hamdy et.al.,2003). Pada tipe CYP1A2 wild-type, fragmen
DNA akan terpotong menjadi 2 bagian dengan ukuran 124bp dan 119bp. Pada gen
CYP1A2*1F yang homozigot, kedua alel tidak mengalami mutasi, yang berarti tidak
ada satupun situs pengenalan enzim restriksi ApaI, sehingga band yang tampak akan
berukuran ~250bp seperti pada visualisasi fragmen uncut. Pada gen CYP1A2*1F
dengan alel heterozigotik, satu alel akan membawa sifat wild-type, sehingga akan
terjadi pemotongan karena adanya situs yang dikenali enzim restriksi ApaI, sehingga
akan muncul band pada ukuran ~119bp dan ~243bp. Hasil visualisasi (Gambar 3.2.)
kemudian dapat diartikan bahwa terdapat sampel dengan alel homozigot dan
heterozigot (Tabel 4.1.). Hasil visualisasi elektroforesis sudah cukup sesuai jika
dibandingkan dengan data prediksi ukuran produk untuk primer yang digunakan pada
situs NCBI, yaitu dengan ukuran 242bp.

Tabel 4.1. Jenis Alel Sampel berdasar Hasil Visualisasi Elektroforesis

Jenis Alel Sampel Kelompok Persentase (%)
Homozigotik 1, 2, 4, 8, 9, 10 54,5
Heterozigotik 3, 6, 7, 11, 12 45,5
Wild-type - 0
V. Kesimpulan
Dari hasil amplifikasi dan restriksi dengan enzim ApaI yang kemudian
divisualisasikan dengan elektroforesis, dapat disimpulkan bahwa polimorfisme gen
CYP1A2*1F dapat ditentukan dengan teknik DNA Fingerprinting RFLP dengan hasil
yaitu :
 Alel homozigot : Sampel kelompok 1, 2, 4, 8, 9, 10
 Alel heterozigotik : Sampel kelompok 3, 6, 7, 11, 12
VI. Daftar Pustaka

Brown, T.A., 2010. Gene Cloning and DNA Analysis: An Introduction Sixth Edition.
West Sussex: Wiley-Blackwell.

Chida, M., Yokoi, T., Fukui, T., Kinoshita, M., Yokota, J., Kamataki, T. (1999).
Detection of Three Genetic Polymorphisms in the 5′-Flanking Region and Intron 1
of Human CYP1A2 in the Japanese Population. Jpn. J. Cancer. Res. 90: 899-902.

Hamdy, S., Hiratsuka, M., Narahara, K., Endo, N., El-Enany, M., Moursi, N., Ahmed,
M., Mizugaki, M. (2003). Genotyping of four genetic polymorphisms in the
CYP1A2 gene in the Egyptian population. Br J Clin Pharmacol 55: 321-324.

Kennedy, S., & Oswald, N. 2011. PCR Troubleshooting and Optimization: The
Essential Guide. Horizon Scientific Press
LAMPIRAN

Lampiran 1. Ukuran produk amplikon gen CYP1A2 yang didapat dari NCBI oleh software
BLAST.
Sumber : http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-
blast/primertool.cgi?ctg_time=1458358747&job_key=5e868lx-
UdZ26FTtWY1w3yOWYe0OhXrwDw&CheckStatus=Check, diakses pada 20 Maret 2016