Kromatografi

Dalam analisis kimia pada umumnya, komponen (zat) yang akan dianalisa harus dipisahkan
terlebih dahulu dari komponen lain atau zat pengganggu yang ada, lalu dipekatkan, kemudian
baru diidentifikasi atau diukur kuantitasnya. Banyak teknik pemisahan zat yang digunakan,
tetapi kromatografi adalah teknik yang paling banyak dipakai, terutama untuk campuran yang
kompleks. Suatu komponen campuran yang tidak mungkin dipisahkan

dengan cara yang lain, menggunakan kromatografi dapat diselesaikan dalam waktu yang
singkat dengan peralatan yang relatif sederhana. Lebih dari itu, karena sifat pemisahannya
yang spesifik, maka selain digunakan sebagai metode pemisahan, kromatografi juga
merupakan metode penentuan zat baik kualitatif maupun kuantitatif. Kromatografi dapat
didefinisikan sebagai suatu teknik pemisahan zat berdasarkan perbedaan kecepatan migrasi
yang berlangsung dalam suatu sistem yang terdiri dari dua macam fasa, dimana salah satu fasa
bergerak (fasa gerak) atas fasa lainnya (fasa diam). Kromatografi apapun bentuknya
mempunyai 2 macam fasa, yaitu fasa diam dan fasa gerak. Berdasarkan jenis fasa gerak yang
digunakan, kromatografi dibedakan atas 2 golongan besar yaitu kromatografi gas bila fasa
geraknya gas dan kromatografi cair bila fasa geraknya cairan. Pada kromatografi gas, fasa
diam selalu ditempatkan di dalam kolom. Fasa diam itu dapat berupa padatan atau cairan yang
diemban oleh butiran halus zat padat pendukung. Karena itu berdasarkan wujud fasa diamnya,
kromatografi gas dapat dibedakan atas kromatografi gas padat dan kromatografi gas cair. Pada
kromatografi cair, selain ditempatkan dikolom, fasa diam dapat pula ditebarkan berupa lapis
tipis diatas permukaan suatu pelat dari kaca yang disebut kromatografi lapis tipis. Selain itu
dapat pula menggunakan secarik kertas sebagai fasa diamnya yang disebut kromatografi
kertas. Kromatografi lapis tipis dan kromatografi kertas dilakukan untuk membedakannya dari
kromatografi yang dilakukan di dalam sebuah kolom, yang dinamakan kromatografi kolom.
Didalam kromatografi cair pun dikenal pula kromatografi cair-padat dan kromatografi cair-
cair, tergantung pada fasa diam yang digunakan. Selain berdasarkan wujud fasa gerak dan fasa
diam yang digunakan, kromatografi dapat dibedakan berdasarkan mekanisme interaksi yang
terjadi antara fasa diam dan komponen campuran yang dipisahkan. Maka dikenal kromatografi
adsorbsi, kromatografi partisi, kromatografi penukar ion dan kromatografi eksklusi atau
permiasi gel. Mekanisme interaksi yang paling banyak dijumpai dilaboratorium adalah
adsorbsi dan partisi. Pada proses adsorbsi, molekul pelarut dan molekul zat terlarut menempati
permukaan zat padat pengadsorbsi (adsorbent). Dalam kromatografi partisi, fungsi zat padat
pengadsorbsi sebagai fasa diam digantikan oleh zat cair. Distribusi komponen dalam fasa diam
itu karena daya larutnya. Pada kromatografi cair, misalnya Kromatografi cair Kinerja

Tinggi(KCKT), molekul senyawa yang digunakan sebagai fasa diam diikatkan secara kimia
pada permukaan pertikel pendukung, menghasilkan kromatografi fasa terikat. Berdasarkan
perbandingan polaritas antara fasa diam dan fasa geraknya dikenal kromatografi fasa normal
bila fasa diam lebih polar dari fasa geraknya, kromatografi fasa terbalik bila fasa gerak lebih
polar daripada fasa diamnya. Karena fasa diam yang digunakan tidak sebanyak pada
kromatografi gas, maka selektifitas pemisahan lebih mudah diperbaiki dengan merubah
komposisi fasa gerak. (Sudaryo, 2001).

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Kromatogarfi cair kinerja tinggi (KCKT) merupakan sistem pemisahan dengan kecepatan dan
efisiensi yang tinggi karena didukung oleh kemajuan dalam teknologi kolom, sistem pompa
tekanan tinggi, dan detektor yang sangat sensitif dan beragam sehingga mampu menganalisa
berbagai cuplikan secara kualitatif maupun kuantitatif, baik dalam komponen tunggal maupun
campuran (Depkes RI, 1995).
1.Komponen Kromatografi cair kinerja tinggi
2. Skema kerja alat Kromatografi cair kinerja tinggi 1.

1. Wadah Fase gerak

Wadah fase gerak terbuat dari bahan yang inert terhadap fase gerak. Bahan yang umum
digunakan adalah gelas dan baja anti karat. Daya tampung tandon harus lebih besar dari 500
ml, yang dapat digunakan selama 4 jam untuk kecepatan alir yang umumnya 1-2 ml/menit.
2.Pompa
Untuk menggerakkan fase gerak melalui kolom diperlukan pompa. Pompa harus mampu
menghasilkan tekanan 6000 Psi pada kecepatan alir 0,1–10 ml/menit. Pompa ada 2 jenis yaitu
pompa volume konstan dan pompa tekanan konstan. Pompa terbuat dari bahan yang inert
terhadap semua pelarut. Bahan yang umum digunakan adalah gelas baja antikarat dan teflon.
Aliran pelarut dari pompa harus tanpa denyut untuk menghindari hasil yang menyimpang pada
detektor.
3.Injektor
Cuplikan harus dimasukkan ke dalam pangkal kolom (kepala kolom), diusahakan agar
sesedikit mungkin terjadi gangguan pada kemasan kolom. Ada tiga jenis dasar injektor, yaitu:

a.Hentikan aliran/stop flow Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir, sistem
tertutup, dan aliran dilanjutkan lagi. Tehnik ini bisa digunakan karena difusi di dalam aliran
kecil dan resolusi tidak dipengaruhi.
b.Septum Injektor-injektor langsung ke aliran fase gerak umumnya sama dengan yang
digunakan pada kromatografi gas. Injektor ini dapat digunakan pada kinerja sampai 60-70
atmosfir. Tetapi septum ini tidak tahan dengan semua pelarut-pelarut kromatografi cair.
Disamping itu, partikel kecil dari septum yang terkoyak (akibat jarum injektor) dapat
menyebabkan penyumbatan.
c.Katup putaran (loop valve) ditunjukkan secara skematik dalam Gambar 6, tipe injektor ini
umumnya digunakan untuk menginjeksi volume lebih besar dari pada 10
µ
l dan sekarang digunakan dengan cara automatis (dengan adaptor khusus, volume-volume lebih
kecil dapat diinjeksikan secara manual). Pada posisi LOAD, sampel loop (cuplikan dalam
putaran) diisi pada tekanan atmosfir. Bila katup difungsikan, maka cuplikan di dalam putaran
akan bergerak ke dalam kolom.

4.Kolom

Kolom adalah jantung kromatografi. Berhasil atau gagalnya suatu analisis tergantung pada
pemilihan kolom dan kondisi percobaan yang sesuai. Ada 2 jenis kolom pada KCKT yaitu
kolom konvensional dan kolom mikrobor. Perbandingan antara 2 kolom tersebut :

Parameter Kolom konvensional Kolom mikrobor

Tabung Kolom
Stainless steel
Panjang 3,10,15,20 dan 25 cm. Diameter luar :0,25 inci; dalam : 4,6 mm
Stainless steel
Panjang 25 dan 50 cm Diameter luar : 0,25 inci; dalam : 2 mm Fase diam Porous, silica ukuran
kecil dan yang dimodifikasi secara kimiawi, polimer-polimer stiren/divinil benzene. Porous,
silica ukuran kecil dan yang dimodifikasi secara kimiawi, polimer-polimer stiren/divinil
benzene. Tekanan operasional 500-3000 psi (35-215 bar) 1000-5000 psi (70-350 bar) Fase
gerak Hidrokarbon + pelarut-pelarut terklorinasi atau alcohol untuk fase normal. Untuk fase
terbalik digunakan methanol atau asetonitril + air atau buffer. Kecepatan alir : 1-3 ml/menit
Hidrokarbon + pelarut-pelarut terklorinasi atau alcohol untuk fase normal. Untuk fase terbalik
digunakan methanol atau asetonitril + air atau buffer. Kecepatan alir : 10-100 µl/menit.
Kinerja Efisiensi meningkat dengan berkurangnya ukuran pertikel fase diam, tetapi umur
kolom dengan ukuran pertikel 3 µm lebih pendek Sangat efisien dan sensitive, tetapi lambat
Konsumsi fase gerak lebih hemat yaitu ¼ dari kolom konvensional. Beberapa keuntungan dari
kolom mikrobor :
󰀭

Kapasitas aliran fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil dibanding dengan
kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10 -
100
µ
l/menit).
Detektor
Detektor pada KCKT dikelompokkkan menjadi 2 golongan yaitu:
-

Detektor universal: Mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak
bersifat selektif, seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa.
-

Detektor spesifik: Hanya mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-
Vis, detektor fluoresensi dan elektrokimia (Rohman,2007).
Karakteristik suatu detector pada KCKT:
•
Mempunyai respon terhadap solute yang cepat dan reprodusibel.
•

Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar yang sangat kecil.
•

Stabil dalam pengopersiannya.

•

Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita. Untuk
kolom konvensional, selnya bervolume 8 µl atau lebih kecil, sedangkan kolom mikrobor
selnya bervolume 1 µl atau lebih kecil.
•

Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran yang luas
(kisaran dinamis linier).
•

Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.

Beberapa detector yang sering digunakan dalam KCKT :

Detektor Sensitifitas (g/ml) Kisaran Linear Karakteristik
Spektrofotometri UV-Vis 5 x 10
-
5 x 10
-10

˃
2 x 10
-10
10 10
5
10
5
Sensitifitas bagus, paling sering digunakan, selektif terhadap gugus dan struktur-struktur yang
tidak jenuh. Fluoresensi 10
-
10 Sensitifitas sangat bagus, tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir
fase gerak. Indeks bias 5 x 10
-
10 Hampir bersifat universal akan tetapi sensitivitasnya sedang. Sangat sensitive
terhadap suhu, dan tidak dapat digunakan pada elusi bergradien. Elektrokimia 10
-
10
-12
10 10
5
Peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak, tidak dapat digunakan pada elusi
bergradien. Hanya mendeteksi solute-solut ionic. Sensitifitas sangat bagus, selektif tetapi
timbul masalah dengan adanya kontaminasi elektroda 6.

Fase Gerak
Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang
secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini

Beberapa detector yang sering digunakan dalam KCKT :

Detektor Sensitifitas (g/ml) Kisaran Linear Karakteristik
Spektrofotometri UV-Vis 5 x 10
-
5 x 10
-10

˃
2 x 10
-10
10 10
5
10
5
Sensitifitas bagus, paling sering digunakan, selektif terhadap gugus dan struktur-struktur yang
tidak jenuh. Fluoresensi 10
-
10 Sensitifitas sangat bagus, tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir
fase gerak. Indeks bias 5 x 10
-
10 Hampir bersifat universal akan tetapi sensitivitasnya sedang. Sangat sensitive
terhadap suhu, dan tidak dapat digunakan pada elusi bergradien. Elektrokimia 10
-
10
-12
10 10
5
Peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak, tidak dapat digunakan pada elusi
bergradien. Hanya mendeteksi solute-solut ionic. Sensitifitas sangat bagus, selektif tetapi
timbul masalah dengan adanya kontaminasi elektroda 6.

Fase Gerak
Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang
secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini

ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-
komponen sampel (Johnson dan Stevenson, 1991; Munson, 1991 dan Rohman, 2007).
Terdapat keragaman yang luas dari solvent yang digunakan dalam semua mode Kromatografi
Cair Kinerja Tinggi, tetapi ada beberapa sifat yang diinginkan yang mana umumnya harus
dipenuhi oleh semua solven.
1.

Fase gerak harus: -

Murni; tidak ada pencemar/kontaminan

-

Tidak bereaksi dengan pengemas

-

Sesuai dengan detektor

-

Melarutkan cuplikan
-

Mempunyai viskositas rendah

-

Mudah rekoveri cuplikan, bila diinginkan

-

Tersedia diperdagangan dengan harga yang pantas (Putra, 2003)

2.
Elusi gradien dan isokratik
Elusi pada kromatografi cair kinerja tinggi dapat dibagi menjadi dua sistem yaitu: 1.

Sistem elusi isokratik. Pada sistem ini, elusi dilakukan dengan satu macam atau lebih fase
gerak dengan perbandingan tetap (komposisi fase gerak tetap selama elusi) 2.

Sistem elusi gradien. Pada sistem ini, elusi dilakukan dengan campuran fase gerak yang
perbandingannya berubah-ubah dalam waktu tertentu (komposisi fase gerak berubah-ubah
selama elusi). puncak yang secara keseluruhan disebut sebagai kromatogram.

Guna kromatogram: 1.

Kualitatif waktu retensi selalu konstan dalam setiap kondisi kromatografi yang sama. dapat
digunakan untuk identifikasi. 2.

Kuantitatif luas puncak proporsional dengan jumlah sampel yang diinjesikan dan dapat
digunakan untuk menghitung konsentrasi. 3.

Kromatogram dapat digunakan untuk mengevaluasi efisiensi pemisahan dan kinerja kolom 3.

Parameter Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Ada beberapa parameter yang perlu diperhatikan dalam memperoleh kondisi yang diinginkan
dalam kromatografi antara lain : a. Waktu Retensi Waktu yang dibutuhkan suatu komponen
untuk melewati suatu kolom disebut waktu retensi yang dapat didefinisikan sebagai waktu
yang diperlukan untuk membawa keluar suatu komponen dari dalam kolom, dihitung mulai
diinjeksikan hingga keluar kolom tepat pada saat konsentrasi maksimum. b. Faktor Selektifitas
Suatu kolom dinyatakan baik apabila kolom tersebut cukup selektif, dan dikatakan selektif
apabila kolom tadi mampu menahan berbagai komponen dengan kekuatan yang berbeda-beda.
c.

Efisiensi Kolom Jumlah plat teoritik dalam suatu kolom sebanding dengan panjang kolom.
Karena itu jumlah plat teoritik suatu kolom dapat ditingkatkan dengan memperpanjang
kolom. Makin panjang kolom makin banyak jumlah plat teoriti knya maka makin sempurna
pemisahan.
Resolusi Derajat pemisahan atau resolusi dari dua pita yang berdekatan didefinisikan
sebagai jarak antara puncak-puncak pita (atau pusat-pusat) dibagi dengan luas pita rata-rata.
Semakin tinggi harga N selalu memberikan resolusi yang membaik. Oleh karena itu resolusi
dapat diperbaiki dengan menambah panjang kolom. (Putra, 2003). e. Faktor Ikutan
Keasimetrisan puncak dinyatakan dengan faktor ikutan atau faktor asimetris. Pembentukan
puncak yang curam bagian depan tetapi landai bagian belakang disebut tailing, sebaliknya
puncak yang landai bagian depan dan curam bagian belakang disebut fronting. Keuntungan
analisis menggunakan KCKT :
•Dapat dilakukan pada suhu kamar.
•Kolom dapat digunakan berkali-kali atau berulang.
•Detector HPLC dapat divariasi dan tersedia dalam beberapa pilihan.
•Waktu analisis pada umumnya singkat.
•Ketepatan,kepekaan dan ketelitiannya yang relatif tinggi.
•Mudah dioperasikan secara otomatis.
•Pencuplikan sampel lebih akurat dan kuantitatif karena adanya autosampler.
•Resolusinya baik.
Kerugian analisis menggunakan KCKT :
•Harganya mahal sehingga penggunaannya terbatas
•Kompatibilitas antara pelarut, fase diam dan solute harus diketahui terlebih dahulu
•Menggunakan pelarut yang banyak