PANDUAN PRAKTIKUM

GENETIKA BAKTERI DALAM PRAKTIK

(BIO 517)

KLONING GEN 16S rRNA

Escherichia coli pada plasmid pGEMT-Easy

Dr.Rika Indri Astuti, M.Si

Departemen Biologi
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Pertanian Bogor
2018

  1  

 
 DAFTAR ISI

1. ISOLASI DNA GENOM................................................................ 5

2. ELEKTROFORESIS DAN KUANTITASI DNA GENOM ............. 10
2.1. Elektroforesis DNA Genom .................................................. 10
2.2. Kuantifikasi DNA dan Kemurnian DNA genom .................... 11
3. POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) ................................ 13
4. PURIFIKASI DAN VISUALISASI PRODUK PCR ...................... 17
4.1. Purifikasi produk PCR (Gel extraction) ................................ 17
4.2 Elektroforesis DNA Hasil PCR .............................................. 18
5. SUB-KLONING (TA CLONING)................................................. 20
5.1 Ligasi .................................................................................... 22
5.2 Penyiapan sel kompeten Escherichia coli DH5α .................. 23
5.3. Transformasi plasmid rekombinan ke dalam E. coli DH5a. . 24
6. ISOLASI DNA PLASMID ............................................................ 25
7. DIGESTI PLASMID..................................................................... 30
7.1. Restriksi Plasmid rekombinan ............................................. 33
7.2. Visualisasi hasil restriksi dengan elektroforesis gel agarosa.
.................................................................................................... 35

  2  

 
 PENDAHULUAN

Bakteri merupakan bagian dari Domain Prokariot, menurut

klasifikasi Woese, yang membagi makhluk hidup ke dalam tiga
domain utama yakni Prokariot, Eukariot dan Arkaea berdasarkan
gen 16S-rRNA. Kelompok bakteri tidak memiliki nukleus sehingga
DNA bebas berada di sitoplasma. Genom atau kandungan genetika
total yang dimiliki bakteri terdiri dari kromosom dan plasmid (jika
ada). Genom bakteri umumnya berbentuk kromosom sirkular,
walalupun telah dijumpai beberapa spesies bakteri yang memiliki
genom linear seperti Borrelia burgdorferi serta beberapa genus
Streptomyces. Kromosom bakteri terkondensasi dengan cara
supercoiling dan looping membentuk badan nukleoid yang sangat
rapat. Umumnya, bakteri memiliki satu kromosom sirkular, namun
demikian saat ini telah dijumpai spesies bakteri yang memiliki lebih
dari satu kromosom seperti Rhodobacter sphaeroides. Ukuran
genom bakteri jauh lebih kecil dari makhluk hidup kompleks, yakni
berkisar 4 Mpb. Untuk sel E.coli ukuran genom berkisar 4.6 Mpb.
Sedangkan untuk Pseudomonas sp. ukuran genomnya berkisar 6-
7.5 Mbp.

Ribosomal RNA (rRNA) merupakan salah satu jenis

molekul RNA yang unik, selain RNA duta (mRNA) dan RNA transfer
(tRNA). rRNA berperan dalam pembentukan kerangka ribosom
yang merupakan organel penting dalam proses translasi RNA
menjadi asam amino. Seluruh jenis molekul RNA ini terlibat dalam
proses translasi. Saat ini, rRNA terutama komponen 16S rRNA telah
banyak dijadikan sumber analisis filogeni dan pengklasifikasian dan
identifikasi bakteri. Hal ini disebabkan molekul 16S-rRNA bersifat
homolog baik secara fungsional ataupun evolusinya pada
organisme yang berbeda dan merupakan molekul yang strukturnya
terkonversi. Semua rRNA identik secara fungsional yakni terlibat
dalam sintesis protein, namun sekuen-sekuen dibagian tertentu
terus berevolusi dan mengalami perubahan struktur primer tetapi
tetap mempertahankan struktur sekunder dan tersier yang homolog.

Dalam kloning gen 16-rRNA pada plasmid pGEMT-Easy

diperlukan beberapa tahapan yakni:
  3  

 
 (1) Isolasi DNA genom,
(2) Amplifikasi gen 16S-rRNA
(3) Purifikasi dan visualisasi produk PCR
(4) Konstruksi plasmid rekombinan (ligasi fragmen gen insert
ke dalam plasmid pGEMT-Easy)
(5) Transformasi plasmid rekombinan ke dalam sel E. coli
(6) Konfirmasi sel transforman melalui tahapan: Isolasi plasmid
rekombinan dan digesti plasmid rekombinan dengan enzim
restriksi.

  4  

 
 1. ISOLASI DNA GENOM
DNA genom bakteri dapat diisolasi dengan beberapa
metode yang disesuaikan dengan jenis bakteri yang akan diisolasi
DNA genomnya. Dalam praktikum ini, digunakan bakteri E. yang
merupakan bakteri gram negatif. Metode umum yang sering
digunakan untuk mengisolasi DNA genom bakteri gram negative
adalah metode CTAB (Cetyl trimetil ammonium bromide). Dalam
metode ini terdapat tiga tahapan penting yakni (1) pelisisan sel, (2)
pemurnian DNA, dan (3) pengendapan DNA.

Pada tahap lisis sel digunakan beberapa jenis enzim untuk

memecah komponen utama dinding sel yakni proteinase dan
lysozim, selain itu proses lisis sel juga dibantu dengan larutan
sodium dodesil sulfat dan CTAB yang merupakan senyawa
detergen kationik yang berperan dalam lisis lipid dan polisakarida.
Pada tahap pemurnian DNA digunakan larutan campuran kloroform,
fenol dan isoamil alkohol untuk memisahkan DNA dengan debris
sel. Sedangkan pada tahap pengendapan DNA digunakan larutan
sodium asetat dan etanol. Seluruh tahapan harus dilakukan dengan
baik dan hati-hati mengingat genom bakteri hanya memiliki bobot
sekitar 2-3% dari bobot kering satu sel sehingga kemungkinan gagal
diperolehnya genom saat proses isolasi sangat mungkin terjadi.

Proses isolasi DNA genom sebaiknya dilanjutkan dengan

verifikasi keberhasilan isolasi dengan melakukan elektroforesis dan
kuantifikasi konsentrasi DNA berserta tingkat kemurniannya.
Elektoroforesis merupakan teknik pemisahan DNA berdasarkan
bobot molekul pada gel agarosa atau poliakrilamida dengan
menggunakan muatan listrik. DNA akan terpisahkan oleh arus listrik
dari arah kutub negatif ke kutub positif. Pada elektroforesis genom,
pita DNA akan mengumpul pada baian atas gel karena ukuran
genom yang relative besar.

Tujuan Praktikum

Mengisolasi DNA genom bakteri E. coli. Dengan

menggunakan metode CTAB (Cetyl Trimethyl Amonium Bromida)

  5  

 
Alat dan Bahan

Berikut adalah alat dan bahan yang harus disiapkan untuk

melakukan isolasi DNA genom bakteri:

Alat
0 0
1. Inkubator (siapkan pada suhu 37 C, 65 C)
2. Inkubator bergoyang (shaker)
3. Tabung mikro 1.5 ml
4. Erlenmeyer 125 ml
5. Pipet mikro 1000µl, 20-200 µl, 2-20 µl dan 2 µl.
6. Tips pipet mikro
7. Alat sentrifugasi
8. Piranti elektroforesis dan power supply
9. Spektrofotometer UV

Bahan

1. Kultur bakteri E. coli pada media NB

2. Buffer Tris EDTA 1X pH 7.6 (TE)
3. Lisozim
4. Proteinase K
5. NaCl 5M
6. CTAB 10%
7. Larutan fenol:kloroform:isoamil alkohol (25:24:1)
8. Larutan kloroform:isoamilalkohol (24:1)
9. Etanol absolut
10. Sodium asetat 3M
11. Etanol 70%
12. Aqabides steril
13. RNAse
14. Agarosa
15. Buffer elektroforesis : Tris-EDTA-asam asetat glasial (TAE)
atau Tris-asam Borat-EDTA (TBE)
16. Pewarna DNA (loading dye)
17. Larutan EtBr 0.01%
18. Aquades

  6  

 
Cara Kerja Isolasi Genom Bakteri:
1. Isolat E. coli yang akan diisolasi DNA genom-nya
ditumbuhkan pada medium NB dan diinkubasi selama 24
0
jam pada suhu 37 C
2. Setelah 24 jam,sebanyak 1.5 ml kultur Pseudomonas
dipindahkan ke dalam tabung mikro 1.5 ml secara aseptik
3. Suspensi kemudian di sentrifugasi selama 10 menit pada
kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit. Tahap ini diulang
2-3 kali,
4. Pelet yang didapat kemudian diresuspensi dengan 250 µl
bufer TE (1X), dan dipindahkan ke dalam tabung mikro 1.5
mL steril.
5. Suspensi kemudian ditambahkan 5 µL lisozim, lalu
dicampur merata dengan cara membolak-balikkan tabung
mikro hingga larutan menjadi berlendir dan bening
0
kemudian diinkubasi pada suhu 37 C selama 30 menit.
6. Proses lisis sel dilanjutkan dengan menambahkan 500 µL
(Sodium Dodecyl Sulfate) SDS 10% dan proteinase K
sebanyak 10 µL, tabung mikro 1.5 mL kemudian dibolak-
0
balik. Suspensi diinkubasi pada suhu 37 C selama 60
menit. Setiap 15 menit, tabung dijentik-jentikan untuk
mempermudah lisis sel.
7. Sebanyak 80 µL NaCl dan 100 µL CTAB 10%
ditambahkan ke dalam suspensi, kemudian diinkubasi
0
pada suhu 65 C selama 20 menit, tabung kembali dibolak-
balik.
8. Purifikasi DNA dan pengendapan debris sel dilakukan
dengan menambahkan 650 µL fenol : kloroform :
isoamilalkohol (25:24:1). Tabung kemudian di kocok kuat
hingga berwarna putih susu.
9. Suspensi di sentrifugasi selama 10 menit pada kecepatan
maksimum
10. Pada tabung kemudian akan terbentuk dua lapisan yang
terpisah, dengan segera pindahkan lapisan atas ke dalam
tabung mikro yang baru dan steril dengan hati-hati tanpa
menyertakan larutan di lapisan bawah yang merupakan
endapan debris sel (Gambar 1).

  7  

 
 Lapisan  atas,  mengandung  DNA  

Lapisan  bawah,  mengandung  debris  sel  

Gambar 1. Dua lapisan yang terbentuk setelah perlakuan

PCI (25:24:1).

11. Purifikasi dilanjutkan dengan menambahkan 650 µL

kloroform:isoamil alkohol (24:1)
12. Suspensi kembali disentrifugasi 10 menit pada kecepatan
maksimum
13. Lapisan bagian atas yang kembali terbentuk dipindahkan
ke dalam tabung mikro yang baru dan steril.
14. Untuk pengendapan DNA, larutan yang diperoleh
ditambahkan etanol absolut sebanyak 2 kali volume
supernatan dan sodium asetat 3M 10 % volume.
15. Pengendapan dibantu dengan inkubasi di dalam mesin
0
pembeku (-20 C) selama 60 menit dan kemudian dilakukan
sentrifugasi pada kecepatan maksimum selama 10 menit.
Untuk pengendapan optimum, inkubasi dapat dilakukan
semalam (overnight).
16. Supernatan yang diperoleh kemudian di buang
17. Pelet yang didapatkan ditambahkan 70% etanol dingin
untuk mengikat air.
18. Suspensi kembali disentrifugasi (kecepatan maksimum; 10
menit),
19. Fase supernatan dibuang sedangkan pelet dikering
udarakan dengan cara membuka tutup tabung mikro 1.5
mL dan dibiarkan selama beberapa jam (2-3 jam) pada
suhu ruang.

  8  

 
 20. Pelet DNA dilarutkan dalam 20 µL ddH2O steril atau buffer
TE steril .
21. Tambahkan 15 µl RNAse (10mg/ml), kemudian diinkubasi
0
pada 37 C selama 30 menit.
22. Larutan disentrifugasi kembali pada 12.000 rpm selama 5
menit.
23. Pelet yang diperoleh kemudian dicuci kembali dengan
larutan etanol 70%, dan dibiarkan kering udara seperti
langkah sebelumnya.
24. Pelet DNA dilarutkan dalam 20 µL ddH2O steril atau buffer
0
TE steril dan disimpan pada suhu -20 C (freezer).
25. DNA genim kemudian di elektroforesis dan dikuantitasi
konsentrasinya.

  9  

 
2. ELEKTROFORESIS DAN KUANTITASI DNA
GENOM
  Kegiatan in bertujuan untuk mengetahui kosentrasi DNA
genom yang telah diisolasi serta menganalisis tingkat
kemurniannya. Konsentrasi dan kemurnian DNA genom sangat
menentukan kondisi PCR yang akan dilakukan kemudian.

2.1.  Elektroforesis  DNA  Genom    

1. Elektroforesis dilakukan dengan menggunakan gel agarosa
sebagai media pemisah. Gel agarosa untuk verifikasi
genom umumnya memiliki konsentrasi 0.8-1%.
2. Agarosa dilarutkan dengan menggunakan buffer yang sama
untuk proses elektroforesis. Buffer yang umum digunakan
TAE dan TBE. Larutan agarosa dipanaskan hingga
mendidih dan seluruh bubuk agaorsa larut sempurna
(hindari menggunakan pengocok magnetik untuk
menghindari buih yang berlebihan)
3. Tuang larutan agarosa pada cetakan gel lalu berikan sisir
sumur dan diamkan memadat dan dingin pada suhu ruang
4. Setelah gel memadat, ambil gel beserta cetakan dengan
hati-hati dan letakkan ke dalam piranti eleltroforesis yang
telah berisi buffer elektroforesis
5. Masukkan sampel, dengan cara menginjeksikan sampel
DNA genom hasil isolasi yang telah dicampurkan dengan
pewarna DNA (loading dye) pada lubang sumur dengan
hati-hati.
6. Aktifkan power supply elektorofresis dan atur waktu, daya,
kuat arus serta tegangan untuk proses elektorforesis.
Umumnya elektroforesis DNA genom dapat dilakukan pada
kondisi kuat arus 4mA, 3W, 70 volt selama 30 menit.
7. Setelah proses elektoroforesis selesai, DNA kemudian
diwarnai (gel staining) dengan menggunakan larutan
etidium bromide 0. 1 % (EtBr) selama 5-10 menit.
8. Gel kemudian di de-staining dalam larutan aquades selama
5-10 menit.

  10  

 
 9. Gel kemudian diamati dengan menggunakan alat UV
transiluminator. DNA genom akan berada pada bagian atas
gel dekat dengan sumur tempat injeksi sampel (Gambar 2).
     1                    2                    3                      4                

Gambar 2. Hasil elektroforesis dari DNA genom total (anak

panah) isolat Pseudomonas sp. pada gel agarosa 1%.

2.2.  Kuantifikasi  DNA  dan  Kemurnian  DNA  genom  

Kuantifikasi DNA dilakukan dengan metode spektroskopi
menggunakan spektrofotometer UV/ mesin nanodrop.

1. Masukkan larutan DNA yang telah diencerkan ke dalam

mesin nanodrop dan kemudian diukur pada panjang
gelombang 260 nm.
2. Larutan DNA yang sama juga diukur pada panjang
gelombang 280 nm.
3. Catat nilai konnsentrasi DNA dan kemurnian DNA.
4. Jika menggunakan spektrofotometer UV, encerkan
suspensi DNA terlebih dahulu (dengan melarutkan 2µl DNA
dengan 988µl pelarut), lalu suspensi dibaca pada panjang
gelombang 260 nm dan 280 nm.
Secara umum pembacaan OD 1 pada panjang gelombang
260 nm setara dengan konsentrasi DNA 50µg/ml.
Konsentrasi DNA dilakukan dengan menggunakan rumus
berikut:

  11  

 
 Konsentrasi DNA = OD 260 x faktor
pengenceran x nilai standar (50µg/ml)
1000

Kemurnian DNA dilakukan dengan membandingkan

konsentrasi DNA dengan konsentrasi protein. Kemurnian
DNA dihitung dengan rumus berikut:
Kemurnian DNA = OD260/OD280

Rasio antara 1.8-2 mengindikasikan DNA cukup murni dan

dapat digunakan untuk analisis berikutnya, rasio kemurnian
DNA kurang dari 1.8 mengindikasikan adanya kontaminasi
protein atau senyawa lain yang dapat diserap UV (UV
absorbers), sedangkan rasio kemurnian lebih dari 2
mengindikasikan adanya kontaminasi kloroform atau fenol.

5. Jika pembacaan melebihi konsentrasi DNA 1ug/ul maka

larutan DNA perlu diencerkan terlebih dahulu.

  12  

 
 3. POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)
 

Tujuan Praktikum

Mengamplifikasi gen 16S-rRNA dari bakteri E. coli Dengan

teknik Polymerase Chain Reaction (PCR)

Pendahuluan

Prinsip utama dari teknk PCR adalah memperbanyak DNA

dengan replikasi secara in vitro. PCR pertama kali dikembangkan
oleh Karry Mullis di tahun 1980-an. Dengan menggunakan PCR,
proses memperbanyak DNA atau gen tertentu dilakukan di dalam
tabung dengan campuran utama enzim DNA polymerase, primer,
nukleutida dan DNA cetakan (DNA genom). Selayaknya pada
proses replikasi di dalam sel (in vivo), DNA polymerase berperan
dalam proses sintesa utas DNA baru yang komplementer terhadap
DNA cetakan. Karena, DNA polymerase hanya dapat
menambahkan nukleotida pada ujung 3-OH maka digunakan
primer, sebagai tempat penambahan nukleotida pada awal reaksi.
DNA polymerase yang digunakan dalam PCR umumnya adalah Taq
Polimerase yang bersifat termofil dan optimum pada suhu tinggi.
Primer yang digunakan harus juga bersifat spesifik untuk gen
tertentu, dalam hal ini gen 16S-rRNA sehingga hasil amplifikasi
yang diperoleh (amplikon) adalah spesifik gen yang sama.

Proses PCR terdiri dari lima tahapan utama yakni: pre-

denaturasi, denaturasi, annealing, polimerisasi dan post-PCR
(Gambar 3). Pada tahap pre-denaturasi dan denaturasi terjadi
pemutusan rantai hydrogen pada utas ganda DNA sehingga
menjadi utas tunggal. PAda tahap annealing terjadi penempelan
primer pada utas tunggal DNA. Pada tahap polimerisasi, enzim DNA
polimerase akan menambahkan nukleotida pada ujung 3-OH pada
primer, komplementer terhadap DNA cetakan. Pada tahap post
PCR terjadi penyelesaian reaksi akhir polimerisasi.

  13  

 
 Gambar 3. Proses PCR yangmeliputi tahapan denaturasi,
annealing dan polimerisasi.

Alat dan Bahan

Alat dan bahan yang diperlukan untuk PCR adalah sebagai berikut:

Alat

1. Tabung PCR
2. Pipet mikro 1000µl, 20-200 µl, 2-20 µl dan 2 µl.
3. Tips pipet mikro
4. Sarung tangan
5. Mesin PCR

Bahan

1. Komponen PCR yang terdiri dari

a. LA Taq DNA polymerase (Takara)

  14  

 
 b. Dua pasang primer: forward primer 63f (5’-CAG
GCC TAA CAC ATG CAA GTC-3’) dan reverse
primer 1387r (5’- GGG CGG WGT GTA CAA GGC-
3’)
c. Buffer PCR
d. ddNTPs (ddATP, ddGTP, ddCTP dan ddTTP)
e. Air bebas nuklease (ddH2O)
2. Es batu (seluruh komponen PCR hendaknya diletakkan di
dalam kotas berisi es untuk mempertahankan kondisi
dingin)

Cara Kerja

1. Buat campuran PCR, (di sesuai dengan manual produk

komponen PCR) yakni
Untuk satu reaksi PCR (25µL) dibutuhkan:
2+
-­‐ 10× LA PCR Buffer II (bebas Mg ) : 12.5 µL
-­‐ dNTP : 4 µL (2.5 mM tiap
dNTP)
-­‐ LA taq Polimerase (Takara) : 0.25 µL (5
units/µl)
-­‐ Primer 63f : 1 µL (0.2-1.0 µM)
-­‐ Primer 1387r : 1 µL (0.2-1.0 µM)
-­‐ DNA genom (DNA cetakan) : 3 µL (< 1 µg)
Tera dengan ddH2O hingga volume akhir campuran 25
µL
Jadi volume ddH2O yang ditambahkan 3.25 µL

Catatan: untuk reaksi PCR lebih dari dua reaksi, sebaiknya

dibuat campuran (mixed PCR) terlebih dahulu untuk
memudahkan pengambilan komponen PCR dengan pipet.
Selain itu diperlukan penambahan satu reaksi untuk
mengantisipasi kesalahan pemipetan. Apabila DNA cetakan
yang digunakan berbeda, maka DNA cetakan tidak
diberikan ke dalam campuran PCR namun ditambahkan
setelah campuran PCR dibagi-bagi ke dalam tabung PCR.

  15  

 
 2. Masukkan tabung PCR ke dalam mesin PCR, dan jalankan
kondisi PCR seperti berikut:
Tahap pra-denaturasi pada suhu 94°C selama 2 menit,
denaturasi pada suhu 92°C selama 30 detik, annealing
pada suhu 55°C selama 30 detik, dan polimerasi pada suhu
75°C selama 1 menit, serta post-PCR pada suhu 72°C
selama 10 menit. Penggunaan kondisi post PCR pada suhu
72 72°C selama 10 menit, akan memberikan ujung poly-A
pada fragmen hasil PCR.
3. Setelah proses PCR selesai, ambil tabung dan lanjutkan
pada tahap purifikasi dan visualisasi produk PCR dengan
elektroforesis pada gel agarosa.

  16  

 
 4. PURIFIKASI DAN VISUALISASI PRODUK
PCR
Tujuan Praktikum

Melakukan purifikasi (pemurnian) dan visualisasi produk

hasil PCR gen 16S-rRNA dengan metode elektroforesis pada gel
agarosa.

Pendahuluan

Purifikasi hasil PCR merupakan tahapan yang cukup

penting untuk proses sekuensing (pembacaan sekuen DNA).
Proses purifikasi dapat dilakukan dengan menggunakan campuran
PCI (pheol, chloroform dan isoamilalkohol) atau produk kit PCR
clean up yang saat ini tersedia. Purifikasi produk PCR dapat
dilakukan langsung apabila hasil PCR sudah spesifik tanpa adanya
pita tidak sesifik. Namun apabila produk PCR tidak spesifik dan
ditemukannya pita DNA yang tidak dinginkan. Maka, diperlukan
purifikasi produk PCR dengan memotong langsung pita DNA yang
diinginkan dari gel agarosa (Gel extraction method). Dalam praktik
ini dibahas purifikasi produk PCR dari hasil elektorforesis.

Alat dan Bahan

1. Hasil elektroforesis gen 16S-rRNA pada gel agarosa

®
2. Perangkat Wizard SV Gel & PCR Clean-up System
(Promega, USA).
3. Alat sentrifuse untuk volume 1.5 ml
4. Pipet mikro dan tips pipet
5. Tabung mikro steril 1.5 ml
o
6. Incubator, atur pada suhu 50-65 C

Cara Kerja

4.1.  Purifikasi  produk  PCR  (Gel  extraction)  

1. Gel agarosa yang berisi pita DNA yang dikehendaki
dipotong dengan menggunakan cutter dan hasil cacahan
  17  

 
 dari gel tersebut dimasukkan ke dalam tabung mikro 1.5
mL.
2. Tambahkan 10 µL membrane binding solution per 10 mg
o
cacahan gel, lalu dikocok dan diinkubasi pada suhu 50-65 C
sampai gel benar-benar larut.
3. Setelah gel benar-benar larut, dilakukan pengikatan DNA
ke mebran dengan cara memasukkan campuran gel ke
dalam tabung penampung yang dilengkapi dengan
minikolom dan diinkubasi pada suhu ruang selama 1 menit.
4. Tabung penampung kemudian disentrifugasi pada
kecepatan 10.000 rpm selama 1 menit, cairan yang
melewati minikolom dibuang dan minikolom
dimasukkan kembali pada tabung penampung.
5. Selanjutnya proses pencucian, dilakukan dengan
menambahkan 700 µL membrane wash solution yang
mengandung etanol dan disentifugasi pada kecepatan
10.000 rpm selama 1 menit.
6. Cairan yang tertampung dibuang dan minikolom
dimasukkan kembali pada tabung penampung.
7. Tahap pencucian diulang dengan menambahkan 500 µL
membrane wash solution dan disentrifugasi kembali pada
kecepatan yang sama selama 5 menit.
8. Untuk proses elusi, minikolom dipindahkan dengan hati-hati
pada tabung mikro 1.5 mL yang baru dan ditambahkan 50
µL air bebas nuklease pada minikolom.
9. Tabung lalu diinkubasi pada suhu ruang selama 1 menit
dan disentrifugasi pada kecepatan 10000 g selama 1 menit.
10. Minikolom dibuang dan DNA akan tertampung pada tabung.

4.2  Elektroforesis  DNA  Hasil  PCR  

1. Elektroforesis dilakukan dengan menggunakan gel agarosa
sebagai media pemisah. Gel agarosa untuk verifikasi
genom umumnya memiliki konsentrasi 0.8-1%.
2. Lakukan tahapan seperti Anda melakukan elektroforesis
DNA genom.
3. Visualisasi produk PCR (Gambar 4)

  18  

 
 pb M        1              2                3                      4                5            

10.000 __

3000 __

2000 __
       
1500 ---

1000 __

Gambar 4. Elektroforesis gel agarosa 1% dari gen 16S-

rRNA yang berukuran ~1.300 pb (anak panah). M: marker 1
kb DNA ladder, sumur 1-5: amplikon gen 16S-rRNA (~1300
pb).

  19  

 
 5. SUB-KLONING (TA CLONING)

Tujuan : Melakukan sub-kloning DNA/gen penyandi 16S-rRNA

menggunakan plasmid vector pGEM-T Easy

Pendahuluan
DNA hasil PCR atau DNA produk PCR, untuk analisis
kegiatan lebih lanjut sering DNA atau fragmen DNA tersebut
disisipkan ke dalam plasmid vector, seperti pGEM-T Easy, pCR2.1,
pTOPO10 (TA cloning) atau plasmid lain sejenis untuk diamplifikasi
di dalam sel E. coli. DNA hasil PCR umumnya menghasilkan ujung
3’ yang ditambah A (adenin), dan ini akan dapat dicapai jika pada
post PCR (pada siklus terakhir PCR) diberikan waktu minimal 7
menit untuk memberi kesempatan penambahan A pada reaksi PCR.
Sedangkan plasmid pGEM-T Easy atau sejenisnya yang lain, pada
ujung 5’-nya adalah T (sudah didesain dari perusahaan
pembuatnya) (Gambar 5). Kloning dengan cara menggabungkan
DNA hasil PCR dengan plasmid-plasmid vektor semacam itu
disebut TA cloning atau yang sering dinamakan sub-kloning. Hal ini
relatif mudah dilakukan karena ligasi antara ujung 3’ pada DNA
produk PCR akan sangat efisien bergabung dengan ujung 5’ pada
plasmid vektor secara komplementer dan DNA ligase akan
menyambungkannya dengan kuat.
DNA rekombinan (DNA hasil ligasi antara DNA hasil PCR
dengan DNA plasmid) dapat diamplifikasi/ digandakan in vivo
dengan menggunakan E. coli. Hal ini dapat dilakukan dengan cara
mentransformasi DNA rekombinan tersebut ke dalam sel E. coli
yang sudah dibuat kompeten, artinya sel bakteri E. coli tersebut siap
dan mampu mengambil/menerima DNA yang ditransformasikan.
Transformasi DNA plasmid rekombinan dapat dilkukan dengan
metode renjatan panas (heat shock) atau dengan menggunakan
metode elektroforasi (electrophoration). Tentu saja efisiensi dari
kedua metode ini sangat berbeda. Jika menggunakan metode heat
shock tekniknya mudah dan sangat sederhana, namun efisiensinya
rendah. Untuk mentransformasi DNA rekombinan hasil TA cloning
menggunaan metode heat shock sudah cukup dapat dilakukan. Jika

  20  

 
DNA rekombinan bukan dari hasil TA cloning, apabila efisiensi ligasi
antara DNA atau gen yang akan diligasikan dengan plasmid vektor
(missal pUC19, pBR322, atau yang lain) rendah (misalnya
pemotongan DNA/gen dan plasmid vektor menggunakan enzim
restriksi tunggal misalnya dengan EcoRI saja), maka cara heat
shock kurang disarankan. Cara lain yang sangat efisien yaitu
dengan menggunakan metode elektroforasi yaitu suatu metode
transformasi DNA denngan menggunakan alat elektroforator
mengunakan tenaga listrik. DNA atau plasmid rekombinan yang sulit
ditransformasi dengan metode heat shock, metode elektroforasi
merupakan solusi yang tepat untuk mengatasinya. Pada kegiatan ini
sebagai model akan dilakukan kloning gen penyandi 16S rRNA ke
dalam plasmid vektor pGEM-T Easy. Metode dapat diterapkan pada
gen atau fragmen DNA yang lain yang merupakan hasil PCR.

Alat dan Bahan

Berikut adalah alat dan bahan yang harus disiapkan untuk
melakukan sub-kloning gen 16S rRNA ke dalam pGEM-T Easy (TA
Cloning).

Alat
0 0
1. Inkubator (siapkan pada suhu 37 C, 65 C)
2. Inkubator bergoyang (shaker)
3. Tabung mikro 1.5 ml
4. Erlenmeyer 100 ml
5. Pipet mikro 1000 µl, 20-200µl, 2-20 µl dan 2µl.
6. Tips pipet mikro berbagai volume
7. Alat sentrifugasi
8. Piranti elektroforesis dan power supply
9. Spektrofotometer UV
10. UV traniluminator

Bahan

1. Sel kompeten Escherichia coli DH5α.

2. Plasmid vektor pGEM-T Easy kit (Promega) (Gambar 5.1)
o
3. Water bath suhu 42 C
  21  

 
4. Luria Agar + ampisilin 50 µg/ml
5. Enzim restriksi EcoRI atau yang lainnya
6. X-Gal dan IPTG
7. Gel agarosa 1% dalam buffer TE atau TBE
8. Buffer elektroforesis: Tris-EDTA-asam asetat glasial (TAE) atau
Tris-Borat-EDTA (TBE)
9. Loading dye atau blue juice
10. Larutan Etidium Bromida 0.01%

Gambar 5. Peta plasmid vektor pGEM-T Easy (3.015 kb,

Promega)
Cara Kerja :

5.1  Ligasi    
Buat reaksi ligasi dengan mencampurkan bahan-bahan berikut :
Total volume 10 µL.
- 5 µL 2 x Rapid ligasi buffer (promega)
- 1 µL vektor cloning pGEM®-T Easy (50 ng),
- 1 µL T4 DNA ligase ( unit/ µ L)
- 1 µL DNA insert (gen 16S rRNA ~ 1.3 kb)
- 2 µL ddH2O

  22  

 
 Catatan : Kedalam campuran tersebut dimasukkan larutan insert
dalam ddH2O yang dihitung berdasarkan konsentrasi DNA insert
yang diperoleh. Perhitungan konsentrasi DNA insert dapat
dilakukan dengan menggunakan rumus sebagai berikut :

I = 50 ng x 1.3 kb x 3 = 65 ng
3,015 kb

Dimana I adalah konsentrasi DNA insert, 50 ng adalah

konsentrasi vektor kloning (pGEM-T Easy) yang digunakan, 1.3
kb adalah panjang DNA insert yang akan disisipkan ke pGEM-T
Easy, 3 adalah faktor pengali (koefisien 3:1; dapat juga dibuat
perbandingan yang lain), dan 3.015 kb adalah panjang vektor
yang digunakan. Jika hasil isolasi dan purifikasi DNA insert (gen
16S rRNA) diperoleh 65 ng/ml, maka cukup 1 ml DNA insert
ditambahkan ke dalam reaksi ligasi. Inkubasi campuran reaksi
o
pada suhu 10 C semalaman (overnight).

5.2  Penyiapan  sel  kompeten  Escherichia  coli  DH5α  

1. Tumbuhkan 200 µl biakan E. coli DH5α yang berumur 24
jam dengan OD (Optical Density) ~ 0.46 ke dalam 50 mL
media LB (Luria Bertani), kemudian diinkubasi selama 2-3
0
jam pada 37 C yang dishaker pada kecepatan 150 rpm.
2. Sebanyak 2 mL dimasukkan kedalam tabung mikro dan
diinkubasi dalam es selama 1 menit.
3. Kultur disentrifugasi selama 10 menit, kecepatan 5000 rpm
0
pada suhu 4 C. Pelet yang terbentuk ditambah 1 mL TFB
(Transformation Buffer) (Tris-Cl 5 mM pH 7, MgCl2 5 mM,
CaCl2 0.1 mM) dan diresuspensikan dengan hati-hati.
4. Inkubasi dilakukan kembali dalam es selama 20 menit
kemudian disentrifugasi dengan kondisi yang sama dengan
sebelumnya.
5. Pelet ditambahkan 250 µL TFB, kemudian diresuspensikan
kembali. Hasil resuspensi kemudian diinkubasi pada es
selama 10 menit.

  23  

 
5.3.  Transformasi  plasmid  rekombinan  ke  dalam  E.  coli  DH5a.  
1. Masukkan 10 µL plasmid rekombinan (plasmid pGEM-T
Easy+ gen 16S rRNA) ke dalam 250 µL suspensi sel
kompeten.
2. Sebagai kontrol positif dibuat dengan menambahkan
plasmid tanpa insert ke dalam sel kompeten. Masing-
masing perlakuan tersebut diresuspensikan dan diinkubasi
dalam es selama 45 menit.
0
3. Heat shock dilakukan pada suhu 42 C selama 45 detik,
kemudian diinkubasi selama 15 menit dalam es.
0
4. Tambahkan 500 µL media LB dan diinkubasi pada 37 C
selama 1 jam dan dishaker pada 120 rpm.
5. Hasil inkubasi kemudian disentrifugasi selama 5 menit
pada kecepatan 5000 rpm.
6. Pelet yang terbentuk ditambah dengan 200 µL LB, dan
diresuspensi secara perlahan.
7. Masing-masing suspensi kemudian diambil sebanyak 100
µL dan ditumbuhkan dalam media agar LB (Luria Bertani
Agar) yang ditambah 50 µg/ml ampisilin, X-gal (5-bromo-4-
chloro-3-indolyl-b-D-galactopyranosida) dengan metode
sebar (spread plate).
o
8. Kultur diinkubasi pada suhu 37 C selama 24 jam.
9. Koloni yang tumbuh di cawan agar LA + ampisilin 50 ml+ X-
Gal yang berwarna putih (diduga mengandung plasmid
rekombinan) selanjutnya diambil dan dikulturkan pada
medium cair LB+ampisilin 50 µg/ml+X-Gal selama 24 jam
o
pada suhu 37 C yang dishaker pada 120 rpm.
10. Plasmid rekombinan diisolasi dan dipotong/didigesti
dengan EcoRI dan dielektroforesis untuk mengetahui
kehadiran plasmid vector pGEM-T Easy dan DNA insert
(gen penyandi 16S rRNA), seperti telah dijelaskan pada
percobaan sebelumnya.

  24  

 
 6. ISOLASI DNA PLASMID

Tujuan
Tujuan dari praktikum ini adalah untuk mengisolasi DNA
plasmid rekombinan sel bakteri Escherichia coli transforman
dengan metode lisis alkalin.

Pendahuluan
Plasmid merupakan DNA ekstrakromosom yang berukuran
kecil dan berbentuk sirkular. Selain itu mekanisme replikasinya
bersifat otonom sehingga tidak bergantung pada kromosom. Tidak
semua bakteri mempunyai plasmid indigenous, namun demikian
banyak prokariot (bakteria dan arkhaea) yang mempunyai plasmid.
Keberadaan plasmid di dalam sel bakteri bersifat non-esensial
terutama terhadap sistem metabolisme sel utama. Umumnya
plasmid memiliki gen resistensi terhadap antibiotik atau gen-gen lain
yang tidak beperan dalam metabolism utama sel, dengan variasi
jumlah kopi yang beragam. Karakter-karakter inilah yang membuat
plasmid sering digunakan sebagai alat utama dalam teknik rekayasa
genetika terutama sebgai vektor kloning.

Plasmid
Plasmid merupakan suatu elemen genetik, dalam hal ini
DNA ekstrakromosom yang umumnya berbentuk sirkuler (lingkaran)
yang dapat bereplikasi sendiri, artinya tidak bergantung pada
kromosom. Banyak plasmid dapat berpindah dari satu sel ke sel
yang lain melalui suatu proses yang dinamakan konjugasi.
Beberapa plasmid juga mempunyai kemampuan dapat menjadi
terintegrasi ke dalam kromosom, dalam kondisi ini replikasinya akan
dikontrol oleh kromosom.
Plasmid dapat membawa bermacam-macam gen, sebagai
contoh gen yang mengontrol produksi toksin maupun resistensi
terhadap antibiotik, logam berat, dan senyawa inhibitor yang lain.
Selain itu, beberapa plasmid membawa gen-gen untuk katabolisme
substrat yang tidak umum seperti senyawa aromatik dan pestisida.

  25  

 
Banyak plasmid juga membawa gen-gen yang mengontrol proses
konjugasi seperti gen-gen yang mengubah permukaan sel yang
memungkinkan untuk kontak antar sel dan gen-gen yang berperan
untuk transfer DNA dari satu sel ke yang lain. Plasmid yang dapat
dipindahkan ke sel yang lain ditentukan oleh sistem transfernya
sendiri melalui kontak antar sel yang dinamakan plasmid konjugatif.
Namun demikian, tidak semua plasmid bersifat konjugatif.
Pemindahan plasmid melalui konjugasi dikontrol oleh seperangkat
gen dalam plasmid itu sendiri yang dinamakan daerah transfer (tra
region). Kehadiran tra region pada plasmid mempunyai peran
penting yaitu apabila plasmid pembawa tra ini terintegrasi ke dalam
kromosom, maka akan dapat memindahkan/ mentransfer kromosom
(umumnya sebagian kromosom) tersebut ke sel bakteri yang lain.
Walaupun demikian, plasmid yang digunakan dalam kegiatan
kloning ataupun rekayasa genetik biasanya sudah dibuat/
dikonstruksi sedemikian rupa sehingga memudahkan penelitinya
dalam mempelajari DNA/gen yang disisipkannya dalam kegiatan
kloning DNA maupun rekayasa genetika.
Plasmid umumnya mempunyai ukuran kurang dari 1/20
ukuran dari kromosom. Plasmid yang biasanya diisolasi, merupakan
DNA utas ganda yang berbentuk sirkular. Ketika DNA plasmid
diisolasi bentuk sirkuler utas ganda akan melipat hingga membentuk
superkoil. Isolasi DNA plasmid umumnya dapat dikerjakan dengan
mudah yang berdasarkan pada sifat fisik dari molekul DNA superkoil
itu sendiri. Jika mengisolasi plasmid, selain superkoil, bentuk
plasmid yang lain yang sering akan diperoleh adalah plasmid bentuk
linier dan sirkuler yang terbuka pada satu utas DNA (open circular).
Ketiga bentuk ini akan menentukan kecepatan migrasinya dalam
elektroforesis gel agarosa. Molekul DNA plasmid dari ukuran yang
berbeda dapat dipisahkan dengan mudah menggunakan
elektroforesis gel agarosa. Teknik ini merupakan cara yang baik
untuk menganalisis kerja enzim endonuklease dan enzim-enzim lain
pada DNA plasmid.
Selain menggunakan metode lisis alkalin, saat ini telah
berkembang berbagai produk kit (perangkat) untuk mengisolasi
DNA plasmid. Namun demikian, prinsip utama dari perangkat
tersebut sama dengan perlakuan tanpa kit, hanya waktu kerja yang
  26  

 
dibutuhkan umumnya lebih singkat. Untuk mengetahui keberhasilan
isolasi plasmid diperlukan visualisasi dengan elektroforesis gel
agarosa. Plasmid akan lebih baik tervisualisasi setelah dilakukan
pemotongan (digesti) dengan menggunakan enzim restriksi tertentu.
Dengan melakukan digesti/ pemotongan, ukuran serta konsentrasi
plasmid dapat diketahui dengan membandingkannya terhadap DNA
penanda (DNA marker).

DNA$insert$
Recombinant+
pGEMT+

Gambar 6. Peta plasmid rekombinan pGEMT-Easy yang telah

menampung DNA insert.

Alat dan Bahan

Alat dan bahan yang digunakan untuk mengisolasi plasmid
dari sel Escherichia coli adalah:

Alat

1. Tabung mikro (1.5 ml)

2. Pipet mikro 20-200 µl, 2-20 µl dan 0.5-2 µl.
3. Tips pipet mikro
4. Kotak tabung mikro
5. Erlenmeyer 250 ml
6. inkubator bergoyang (shaker)
7. vortex
8. pH meter
9. Neraca analitik

  27  

 
Bahan
R
1. Sel E. coli yang membawa plasmid pUC19 (Ap ) E. coli
R
yang membawa plasmid pGEMT-Easy+insert (Ap ).
2. Agarosa 1%
3. Loading dye dan DNA penanda (DNA marker 1 Kb)
4. Larutan I (glukosa 50 mM, Tris-Cl [pH 8], EDTA 10 mM [pH
8])
5. Larutan II (0.2 M NaOH; 1% (b/v) SDS)
6. Larutan III (CH3COOK 5M, asam asetat glasial, akuades)
7. Sodium asetat 3M
8. ddH2O atau Buffer TE 1X (10mM Tris pH 7.5-8.0; 1mM
EDTA)
9. Etanol absolut
10. Etanol 70%

Cara Kerja

1. Tumbuhkan masing-masing E. coli DH5a (pGEMT-Insert) di

dalam media kaldu Luria Bertani (tripton 10 g/l, ekstrak
khamir 5g/l dan NaCl 10 g/l) yang ditambah ampisilin 50
0
ug/ml, inkubasi selama semalam pada suhu 37 C, hingga
8
jumlah sel 10 sel/ml.
2. Transfer 1.5 ml kultur E. coli ke dalam tabung mikro dan
sentrifugasi pada kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit.
Buang supernatan.
3. Masukkan 100 µl larutan I kemudian divorteks untuk
homogenisasi
4. Tambahkan 125 µl larutan II lalu bolak-balik tabung
perlahan untuk mempercepat lisis sel (jangan divorteks).
Inkubasi pada suhu ruang selama lima menit.
5. Tambahkan 350 µl larutan III, bolak-balik tabung perlahan
sebanyak 5-7 kali.
6. Suspensi kemudian disentrifugasi pada kecepatan 12.000
rpm selama 10 menit.
7. Pindahkan supernatant yang terbentuk ke dalam tabung
mikro yang baru dan bersih dengan sangat hati-hati. Hindari
mengambil bagian bawah/debris sel.
  28  

 
 8. Tambahkan 1 ml etanol absolut dingin dan 0.1% sodium
asetat 3M untuk proses presipitasi plasmid, dan inkubasi
0
suspensi selama 3 jam (atau semalam) pada suhu -30 C.
9. Suspensi kemudian disentrifugasi pada kecepatan 12.000
rpm selama 10 menit. Buang supernatan.
10. Tambahkan 1 ml etanol 70% untuk mencuci pelet,
resuspensi dengan menggunakan pipet mikro.
11. Sentrifugasi suspensi pada kecepatan 12.000 rpm selama
10 menit. Buang kembali supernatant yang terbentuk.
12. Keringudarakan pelet plasmid dengan cara membuka tutup
tabung mikro pada suhu ruangan selama 3 jam (atau
semalam), atau pellet dikeringkan dengan menggunakan
evaporator.
13. Elusi/larutkan plasmid dengan menambahkan 20-30 µl
o
larutan buffer TE atau ddH2O dan simpan pada suhu -30 C
hingga digunakan.

  29  

 
 7. DIGESTI PLASMID
Tujuan

Melakukan digesti atau pemotongan DNA plasmid

(pGEMT+insert) dengan menggunakan beberapa enzim rekstriksi.

Pendahuluan

Dalam teknik rekayasa genetika, plasmid merupakan

bagian penting yang menunjang berbagai analisis. Plasmid
seringkali dikonstruksi dan direkayasa agar sesuai dengan tujuan
dari analisis yang sedang dikerjakan. Karakteristik plasmid yang
merupakan DNA ekstra kromosomal berukuran kecil (~ plasmid F
sekitar 94.5 kpb) serta dapat bereplikasi sendiri di dalam sel
menjadi keuntungan dimanfaatkannya plasmid dalam teknik
rekayasa genetika. Saat ini, plasmid juga telah diproduksi secara
komersial terutama untuk digunakan sebagai vektor kloning dan
vektor untuk ekspresi gen. Beberapa syarat utama pemanfaatan
plasmid sebagai vektor diantaranya berukuran kecil, memiliki jumlah
kopi yang tinggi (high copy number), memiliki gen penanda (marker)
dan memiliki situs pemotongan enzim restriksi untuk keperluan
penyisipan DNA/gen ke dalam plasmid tersebut.
Digesti atau pemotongan plasmid merupakan tahapan yang
umum dilakukan dalam teknik rekayasa genetika. Reaksi digesti
akan mengubah DNA plasmid yang berbentuk sirkular ke bentuk
linear. Umumnya digesti plasmid dilakukan untuk proses penyisipan
DNA maupun untuk pemetaan. Reaksi digesti plasmid dilakukan
oleh enzim rekstriksi yang merupakan enzim endonukelase yang
bersifat spesifik dan hanya memotong utas DNA pada situs
pemotongan tertentu saja. Reaksi digesti dapat digolongkan ke
dalam dua tipe pemotongan, yakni rekasi ujung mencuat/lancip
(sticky end atau cohesive end) dan ujung tumpul (blunt end)
(Gambar 2). Beberapa contoh enzim rekstriksi yang memotong
DNA dengan tipe pemotongan sticky end diantaranya HindIII,
BamHI, EcoRI, dan PstI. Sedangkan untuk tipe pemotongan blunt
end diantaranya EcoRV, AluI, dan HaeIII. Pemotongan plasmid
dapat dilakukan oleh satu enzim (single cutting) atau oleh beberapa
  30  

 
enzim (multi cutting). Reaksi digesti untuk pemotongan oleh
beberapa enzim dapat berlangsung sekaligus (satu kali) atau
bertahap tergantung dari jenis enzim restriksi yang digunakan
beserta kondisi inkubasi yang diperlukan oleh tiap enzim, maupun
perusahaan yang memproduksinya.
Dalam praktikum ini digunakan beberapa enzim untuk
memotong utas DNA plasmid. Salah satu contoh enzim restriksi
yaitu EcoRI, merupakan enzim endonukelase yang diisolasi
pertama kali oleh Herbert Boyer pada tahun 1969 dari bakteri
Escherichia coli. Situs pengenalan dari enzim EcoRI adalah urutan
nukeotida GAATTC dengan situs pemotongan pada nukleotida G
dan A sehingga menghasilkan hasil pemotongan bertipe mencuat/
lancip (Gambar 7). Hal penting yang perlu diperhatikan dalam
melakukan digesti adalah waktu inkubasi, konsentrasi DNA plasmid,
kompatibilitas buffer restriksi dan performa enzim tiap unit-nya.

Gambar 7. Tipe pemotongan DNA plasmid oleh enzim rekstriksi (a)

EcoRI yang menghasilkan tipe pemotongan sticky end dan (b) SmaI
yang menghasilkan tipe pemotongan blunt end.

Untuk mengetahui keberhasilan pemotongan DNA plasmid

oleh enzim restriksi perlu dilakukan elektotroforesis. Elektroforesis
dapat dilakukan pada gel agarosa atau gel poliakrilamid. Akibat
reaksi pemotongan oleh enzim restriksi, DNA plasmid akan
terpotong menjadi beberapa utas linier yang jumlahnya tergantung
banyaknya situs pengenalan enzim pada DNA plasmid. Dengan
menggunakan elektroforesis juga dapat diestimasi/ diperkirakan
ukuran plasmid berdasarkan utas DNA yang terpotong serta dapat
  31  

 
dilanjutkan untuk pemetaan plasmid. Beberapa enzim restriksi dan
situs pemotongannya disajikan pada Tabel 1.

Tabel 1. Beberapa enzim restriksi dan situs pemotongannya

Ezim Situs Sumber Organisme

Restriksi Pemotongan
EcoRI GAATTC Escherichia coli
HindIII AAGCTT Haemophilus influenzae
HhaI GCGC Haemophilus
haemolyticus
TaqI TCGA Thermus aquaticus
BsuRI GGCC Bacillus subtilis

BalI TGGCCA Brevibacterium albidum

NotI GCGGCCGC Nocardia otidiscaviarum

BamHI GGATCC Bacillus amyloliquefacien

SmaI CCCGGG Serratia marescens

Sumber : Brock and Madigan (2003)

Alat dan Bahan

Berikut ini adalah alat dan bahan yang digunakan untuk

percobaan digesti/pemotongan plasmid dan elektroforesis DNA:

Alat

1. Inkubator
2. Tabung mikro 0.5 ml
3. Pipet mikro 20-200 µl, 2-20 µl dan 2 µl.
4. Tips pipet mikro
5. Seperangkat alat mini gel elektroforesis

Bahan

  32  

 
 1. Enzim restriksi beserta komponen restriksi lain seperti buffer
restriksi dan bovine serum albumine (BSA)
2. pGEMT-Easy + DNA sisipan (~ 4.0 kb) (Gambar 8)
3. Agarosa
4. Buffer elektroforesis (TE atau TBE)
5. Etidium Bromida (EtBr) 0.1%
6. Aquades

Cara Kerja

7.1.  Restriksi  Plasmid  rekombinan  

1. Buat campuran reaksi digesti dalam tabung mikro dengan
komposisi:

plasmid DNA (pGEMT-insert) 1 µg

enzim restriksi 1 µl
10X buffer restriksi 2 µl
Bovine serum albumin (10 µg/µl) 0.2 µl
Air bebas nuklease (sebagai penera) 20 µl

Kemampuan enzim tiap unit reaksi adalah tiap 1 µl enzim

restriksi mampu memotong 1 µg DNA pada situs
pengenalannya selama 5-15 menit pada volume total reaksi
20 µl yang diinkubasi pada kondisi standar.
o
2. Inkubasi reaksi pada suhu 37 C selama 3 jam.

  33  

 
Gambar 8. Peta plasmid pGEM-T Easy dengan berbagai situs
pemotongan dengan enzim restriksi, dan B) plasmid
rekombinan pGEM-T Easy+insert yang digunakan
dalam percobaan ini.

3. Penghentian reaksi restriksi dilakukan dengan cara heat-

inactivated dengan menginkubasi reaksi pada suhu 65°C
selama 15 menit.

  34  

 
  

7.2.  Visualisasi  hasil  restriksi  dengan  elektroforesis  gel  agarosa.    

1. Buat gel agarosa dengan konsentrasi 1% dengan

menggunakan buffer elektroforesis (TE atau TBE) sebagai
pelarut agarosa dan didihkan hingga seluruh bubuk
agarosa larut.
2. Tuang agarosa diatas cetakan gel secara hati-hati jangan
sampai ada gelembung. Tambahkan sisir pencetak sumur
dan biarkan gel memadat pada suhu ruang (Gambar 2.3).

Gambar 2.3. Piranti elektroforesis yang terdiri dari a) tangki buffer,

b) tempat gel, c) sisir, d) power supply dan e) tutup tangki buffer
yang memiliki sambungan kabel listrik dengan dua kutub yakni
kutub negatif dan positif.

3. Setelah gel padat, lepas sisir sumur dan pindahkan DNA

cetakan pada piranti elektroforesis.
4. Tambahkan buffer elektroforesis, sehingga gel terendam
sempurna
5. Masukkan sampel berupa DNA hasil digesti/ pemotongan
dan marker (penanda) DNA pada sumur dengan terlebih
dahulu menambahkan pewarna DNA (loading dye atau
blue juice) pada tiap sampel dengan perbandingan 1

  35  

 
 volume loading dye untuk 10 volume DNA ( 1 mL
loadingdye dalam 10 mL total reaksi).
6. Tutup piranti elektoroforesis dengan benar agar elektroda
tersambung dengan baik pada power supply. Kutub
negatif berada pada bagian dekat sumur sampel.
7. Atur power supply piranti elektroforesis pada kondisi 4W, 4
mA, 70 volt dengan waktu elektroforesis selama 50 menit,
atau dengan mengatur kondisi yang lain.
8. Setelah elektoforesis selesai, angkat gel dan dilanjutkan
dengan pewarnaan gel agarosa. Proses pewarnaan
dilakukan hati-hati dan harus mengenakan sarung tangan.
9. Rendam gel pada larutan EtBr selama 5-10 menit
10. Angkat gel dan pindahkan ke larutan akuades untuk
proses de-staining guna menghilangkan kelebihan EtBr
yang menempel pada gel.
11. Pindahkan gel di atas alat UV transiluminator, dan amati
pita DNA yang terbentuk. Dengan adanya marker DNA,
ukuran DNA hasil restriksi dapat ditentukan ukurannya.

  36